PT950096E - Fragmentos de urocinase anti-invasivos e anti-angiogénicos e a sua utilização - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
FRAGMENTOS DE UROCINASE ΑΝΤΙ-INVASIVOS E ΑΝΤΙ-ANGIOGÉNICOS E A SUA UTILIZAÇÃO Âmbito da invenção A presente invenção, nos domínios da bioquímica, química orgânica e da medicina, tem por objecto compostos de péptidos e processos para a sua utilização para tratar doenças e condições associadas com o movimento, a migração e a adesão de células incluindo doenças que envolvem angiogénese tal como a invasão pelo tumor e metástases.
Descrição da técnica anterior Já foi demonstrado que vários processos de doenças requerem a invasão ou a migração de células como parte da sua patologia. Esses processos incluem a invasão pelo tumor, as metástases do tumor, a angiogénese patológica, a inflamação e a endometriose (Liotta et al. , 1991; Fox et al. , 1996; Osborn, 1990; Mareei et al., 1990; Aznavoorian et al., 1993; Lennarz & Strittmatter, 1991; Fernandez-Shaw et al. , 1995).
No caso da angiogénese de tumor, as células endoteliais quiescentes podem adquirir motilidade em resposta a uma variedade de factores de crescimento angiogénico assim como a alterações na membrana de base induzidas pelas células de tumor e várias células acessórias encontradas dentro de um tumor (Blood & Zetter, 1990; Liotta et al. , 1991; Odedra & Weíss, 1991). A neovascularização de um tumor permite a difusão de metástases de células agressivas de tumor (1) providenciando uma via de escape das células de metástases, assim como (2) alimentando o tumor providenciando um ambiente que leva ao seu crescimento (Cornelius et al., 1995; Blood & Zetter, 1990; Weaver et al. , 1997; Weinstat-Saslow & Steeg, 1994; Leek et al., 1994). O processo das metãstases dos tumores pode ser visto como bi-direccional, compreendendo as seguintes etapas: (1) as células endoteliais migram para dentro de um tumor em resposta ao gradiente quimiotáctico produzido pelas células do tumor ou por células acessórias (células do estroma, leucócitos, etc.); e (2) as células agressivas do tumor invadem, concomitantemente, o que leva ao desenvolvimento de nova vascularização. O processo de invasão pode ainda alimentar a angiogénese por meio da libertação proteolítica de factores de crescimento / angiogénicos ligados à matriz extracelular (MEC), incluindo o factor básico de crescimento do fibroblas-to (FbCF), o factor de crescimento vascular endotelial (FCVE) e o factor de crescimento de hepatócitos (FCH), assim como de outros factores incluindo interleucina-8 (IL-8) e factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (FEC-GM). Também se geram fragmentos proteolíticos da MEC que são eles próprios quimiotácticos tanto para as células do tumor como para as células endoteliais (Fox et al., 1996; Leek et al. , 1994; Vlodavski et al., 1990; Sweenei et al., 1991; Talpale & Keski-Oja, 1997).
Tem sido sugerido que apenas 1-2 % do total das células de um tumor são capazes de gerar metástases. Como esta afirmação se baseia numa visão estática do fenotipo do tumor, não 2 é provavelmente precisa. Na realidade, as metástases parecem depender do facto de as células do tumor que se disseminam estarem expostas a um ambiente que suporta a sua difusão e sobrevivência (Weaver et al. , 1997). Na maioria dos pacientes que se apresentam com um tumor primário detectável sob o ponto de vista clínico, as metástases já ocorreram (Welch, 19 97) . As doenças metastásicas ocorrem quando os focos de disseminação das células de tumores se semeiam num tecido que suporta o seu crescimento e propagação e esta propagação secundária das células de tumor é responsável pela morbidez e pela mortalidade associadas à maioria dos cancros. A gestão clínica de doenças com metástases, utilizando terapias citotóxicas convencionais, muitas vezes não tem sucesso. As metástases diferem muitíssimo do crescimento do tumor primário pelo facto de envolverem o crescimento externo simultâneo de muitos focos que são semelhantes, sob o ponto de vista fenotípico, do ponto de vista da sua agressividade. Este crescimento externo depende da capacidade das células que foram metastisadas de invadirem localmente e de recrutarem novos vasos.
Evitando a interacção das moléculas de adesão, o processo importante de migração /invasão das células e da angiogénese pode ser diminuído ou parado, com um número importante de consequências para essas doenças e condições que são causadas, em parte, pela migração e invasão indesejáveis de células e pela angiogénese. Para além do fenómeno vascular, essa migração e invasão de células é importante em metástases de tumores que podem ser suprimidas pelas composições e processos descritos aqui. A administração de quantidades efectivas destas composições irão romper as interacções moleculares necessárias à angiogénese. 3 A técnica reconhece a necessidade de novos tratamentos para indivíduos com cancro, em particular pacientes com cancro com metãstases que têm o prognóstico mais reservado. Esses tratamentos devem ser tão isentos quanto possível de efeitos colaterais indesejados tal como os associados à quimioterapia convencional e a algumas bioterapias experimentais. A presente invenção também tem este objectivo. A inibição da invasão das células de tumor e da migração das células endoteliais (uma componente importante do processo angiogé-nico) providencia uma nova abordagem ao tratamento de indivíduos com cancro com metãstases. Inibindo a difusão local das células de tumor e a angiogénese de sítios metastá-sicos, os focos metastãsícos devem ser induzidos a regredir devido à privação do seu fornecimento de sangue, encorajando assim a expressão subsequente do programa apoptótico endógeno das células.
Além disso, a inibição da invasão de tecidos por meio de leucócitos e a concomitante angiogénese seria útil para o tratamento de inflamação e de outros processos de doenças em que a invasão celular faz parte do processo patogénico. A inflamação e a invasão pelo tumor e as metãstases e a angiogénese são conhecidas por envolverem mecanismos similares e factores extracelulares (Liotta el al. , 1991; Fox et al., 1996; Osborn, 1990; Mareei et al. , 1990; Aznavoorian et al, 1993; Lennarz e Strittmatter, 1993).
Blasi et al. (patente de invenção norte-americana U.S. 5.416.006) descrevem activadores do plasminogénio e a sua modificação química, em particular APu e APt fosforilados como agentes trombolíticos. Estes técnicos examinaram APu fosforilado gerando os correspondentes fosfopéptidos trípticos e notaram a existência de KPSSPPEELK [SEQ ID NO: 1] (correspondente às posições 136-145 de APu). Este decapéptido 4 não foi ensaiado em relação a nenhuma função, nem lhe foram atribuídas quaisquer propriedades de relevância funcional. Mais importante do que isso, tal como se descreve aqui, este péptido (não fosforilado), rematado ou não rematado, está inactivo num ensaio in vitro de invasão de células. A citação dos documentos anteriores não pretende ser uma admissão de que qualquer das citações anteriores seja técnica anterior pertinente. Todas as afirmações até à data ou a representação dos conteúdos destes documentos baseia-se na informação disponível para o requerente e não constitui qualquer admissão da correcção dos dados ou dos conteúdos destes documentos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO 0 presente pedido de patente de invenção descreve processos e composições para o tratamento de doenças e processos de medicação de invasão de células e/ou de angiogénese não desejadas ou incontroladas, por meio da administração, a um animal, de uma composição que compreende um oligopéptido ou um derivado químico, numa dose suficiente para inibir a invasão e/ou a angiogénese. Isto é particularmente útil para o tratamento ou para a supressão do crescimento de tumores. A administração da composição a um ser humano ou a um indivíduo com tumores metastisados pré-vascularizados evitará o crescimento ou a expansão destes tumores.
Assim, a presente invenção tem por objecto um composto de péptidos que tem a sequência Lis-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu (também abreviada com o código de uma única letra dos aminoácidos como KPSSPPEE) [SEQ ID NO: 2] ou um seu derivado químico. 0 péptido ou o derivado estão "bloqueados" nas 5 terminações de amino e/ou de carboxilo, em que (a) o grupo acetilo (abreviado como "Ac" está ligado ao átomo de N na terminação amino e (b) um grupo amido (abreviado como "Am") está ligado ao grupo carboxilo da terminação C. Em geral, este péptido "rematado" será escrito como "Ac-KPSSPPEE-AmM ao longo deste documento utilizando o código de uma única letra do aminoácido e indicando os grupos de bloqueio como Ac e Am. O péptido ou o derivado da presente invenção tem uma ou mais das seguintes actividades: (a) pelo menos cerca de 20 % da actividade biológica de Ac-KPSSPPEE-Am em um ou mais dos seguintes ensaios in vitro: invasão num ensaio de Matrigel®; (ii) formação de tubo endotelial em Matrigel® ou (iii) formação de tubo endotelial numa matriz de fibra na presença de factor básico de crescimento de fibroblasto e factor de crescimento vascular; ou (b) actividade de ligação tal como a que concorre com Ac-KPSSPPEE-Am marcado para ligação a uma célula ou uma molécula que tem um sítio de ligação para Ac-KPSSPPEE-
Am .
Num enquadramento preferido, o péptido ou a variante de péptido está bloqueado em ambas as extremidades com um grupo acetil da terminação N e um grupo amido na terminação C. A presente invenção tem ainda por objecto uma composição farmacêutica útil para a inibição da invasão de células de tumores ou angiogénese, compreendendo (a) qualquer um dos péptidos ou derivados químicos anteriores e (b) um veículo ou excipiente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. 6
Também tem por objecto um processo para a inibição da invasão de células de tumor que compreende o contacto das células com uma quantidade efectiva de um péptido ou derivado de péptido, conforme mencionado antes.
Também tem por objecto um processo para a inibição da invasão do tumor ou metástases num indivíduo que compreende a administração ao indivíduo de qualquer uma das composições farmacêuticas anteriores.
Também tem por objecto um processo para a inibição da migração de células, invasão, proliferação de células induzida pela migração ou angiogénese num indivíduo que tenha uma doença ou condição associada com a migração de células, invasão, proliferação de células induzida pela migração ou angiogénese indesejadas, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade efectiva de uma composição farmacêutica tal como se descreveu antes.
Em qualquer um dos processos anteriores, a doença ou condição a ser tratada pode ser o crescimento do tumor primário, a invasão pelo tumor ou metástases, a ateroesclerose, a restenose vascular de angioplastia após o balão, a formação da neoíntima no seguimento de trauma vascular, a restenose de enxerto vascular, a fibrose associada com uma condição inflamatória crónica, a fibrose dos pulmões, a fibrose induzida pelq quimioterapia, a cura de feridas com escaras e fibrose, a psoríase, a trombose de veias profundas ou outras doenças ou condições em que a angiogénese é patogénica. Os processos de tratamento são os mais preferidos para o crescimento do tumor, a invasão ou as metástases. 7
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 representa um gráfico que mostra o efeito inibidor de Ac-Lis-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Am (5 μΜ) na invasão in vitro tanto nas linhas de células de tumor (PC-3) humanas como nas linhas de células de tumor de rato (Mat BIII) num sistema de Matrigel®, conforme descrito nos exemplos. A barra esquerda de cada par é o grupo de controlo e a barra da direita representa as células que respondem na presença do péptido. A figura 2 representa um gráfico que mostra o efeito de vários péptidos na invasão in vitro das células PC-3 ) num sistema de Matrigel®, conforme descrito nos exemplos. Todos os compostos foram ensaiados a uma concentração de 5 μΜ. Examinaram-se os seguintes péptidos: Ac-Lis-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Am (Ac-KPSSPPEE-Am) (SEQ ID NO: 2) , também designado por A6 e as variantes seguintes: Ac-Lis-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Am (Ac-KPSSPPE-Am), Ac-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Am (Ac-PSSPPEE-Am) assim como a SEQ ID NO: 1 (Lis-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Leu-Lis) quer bloqueada (Ac-KPSSPPEELK-Am) ou não bloqueada (KPSSPPEELK). A figura 3 representa um gráfico que mostra o efeito de péptidos adicionais na invasão in vitro das células PC3, tal como se mencionou antes, a duas concentrações diferentes. Para além de (Ac-KPSSPPEE-Am) que tem uma actividade inibidora marcada, outros péptidos adicionais ensaiados foram à 13 (KPSSPPEE, não bloqueado) e à 14 (Ac-KPPSSPPEEL-Am), nenhum deles com actividade inibidora e Á 15, (GGKPPSSPPEE-Am, bloqueado apenas na terminação C), que tem uma actividade inibidora baixa na 8 concentração mais alta. Comparam-se os péptidos com com um controlo negativo de factor básico de crescimento de fibroblasto (FbCF). A figura 4 representa um gráfico que mostra a inibição da proliferação de células endoteliais humanas in vitro por meio de Ac-KPSSPPEE-Am (Ã6) durante um período de ensaio de três dias. Verificou-se o crescimento normal das células na presença de 2 ng/mL FbCF como o controlo negativo, em que não ocorreu nenhuma proliferação significativa de células na presença de péptido Á 6 a 50 μΜ. A figura 5 representa um gráfico que mostra a inibição relacionada com a dose da migração de células endoteliais humanas in vitro por meio de Ac-KPSSPPEE-Am (Ã6). FbCF é o controlo negativo. A figura 6 representa um gráfico que mostra a inibição da progressão (crescimento) do tumor em ratos da linha de cancro da mama de rato singeneico MatBIII por meio do tratamento com o péptido À 6. A figura 7 representa um gráfico que mostra que o péptido à 6 inibe as metástases das células de cancro da mama MatBIII para os nódulos linfáticos de ratos singeneicos. A figura 8 representa um gráfico que mostra que o péptido à 6 pára o crescimento das células humanas de cancro da mama (linha (MCA-MB-231) in vivo, num modelo de xeno-enxerto de ratos pelados. 9 A figura 9 representa um gráfico que mostra que o péptido à 6 inibe a difusão das metástases de células humanas de cancro da mama para os nódulos linfáticos em ratos pelados. Os ratos tratados com este péptido não têm metástases macroscópicas detectáveis nos pulmões ou nos nódulos linfáticos.
DESCRIÇÃO DOS ENQUADRAMENTOS PREFERIDOS
Os requerentes descobriram um novo péptido e os seus derivados que actuam como inibidores da angiogénese e da invasão e descortinaram vários processos para utilizar este péptido para o diagnóstico, terapia e identificação do receptor. 0 péptido é um inibidor potente e específico de (a) invasão das células, (b) angiogénese em sítios do tumor incluindo sítios de metástases e (c) respostas inflamatórias.
Além disso, o péptido e os seus derivados são preparados de modo a serem altamente solúveis em tampão aquoso e fluidos do corpo mas não em lípidos. Esta propriedade limita a repartição não específica dentro das membranas. A repartição não específica de compostos dentro e através das membranas é uma causa frequente de toxicidade. Os compostos da presente invenção têm uma toxicidade mínima, possuindo a sua carga de Colômbica, não se espera que se reparta nas células. Os alvos das composições são extracelulares e os processos da presente invenção são predicativos nas composições que actuam primeiro no espaço extracelular.
Obtém-se uma vantagem farmacológica adicional devido ao elevado limite de solubilidade dos compostos, permitindo a sua libertação em concentrações elevadas na ausência de co-dissolventes ou excipientes extraordinárias. 10
Os requerentes demonstraram que os compostos da presente invenção (ver exemplo II) bloqueiam a invasão tanto de células de tumor humanas como de rato, in vitro, no sistema de Matrigel®.
Além disso, bloqueiam a formação do tubo de células endoteliais em resposta ao FbCF e ao FCVE quer numa matriz de fibrina ou quando as células endoteliais são colocadas em
Matrigel®.
Os compostos da presente invenção também inibem metástases experimentais num modelo de xeno-enxerto em ratos nu/nu utilizando a linha de células do carcinoma prostático humano, PC-3, transfectada com a proteína fluorescente verde (PFV) como repórter. Finalmente, os compostos também inibem a progressão do tumor, as metástases espontâneas e a angiogénese num modelo singeneico de rato de cancro da mama.
As composições de péptidos
Os péptidos inibidores originais, bloqueados, descobertos pelos requerentes têm 8 resíduos de aminoácidos com um peso molecular de 9-11 Da. Este péptido preferido é caracterizado pela sequência: CH3CO-Lis-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-NH2 [SEQ ID NO: 2]
Os terminais de amino e de carboxilo são preferencialmente bloqueados ou "tapados" com grupos acetilo (CH3CO-, ligado ao átomo de N da terminação amino; também abreviado como "Ac") e amido (-NH2 ligado ao grupo carboxilo da terminação C; também abreviado como "Am"), respectivamente. Este péptido também vai ser referido a seguir com o código de uma 11 única letra indicando os grupos de bloqueio como grupos Ac e Am: Ac-KPSSPPEE-Am. A função de bloqueio da terminação de N está preferencialmente numa ligação com o grupo amino terminal e pode ser seleccionado no grupo que consiste em: formilo; alcanoílo comportande de 1 a 10 átomos de carbono, tal como acetilo, propionilo, butirilo; alcenoí-lo, comportando de 1 a 10 átomos de carbono, tal como hex-3-enoílo; alcinoílo, comportando de 1 a 10 átomos de carbono, tal como hex-5-inoílo; aroílo, tal como benzoílo ou 1-naftoílo,- heteroaroílo, tal como 3-pirroílo ou 4-quinoloílo : alquilosulfonilo, tal como metano-sulfonilo; arilosulfonilo, tal como benzeno-sulfonilo ou sulfanili-lo; heteroarilsulfonilo, tal como piridino-4-sulfonilo; alcanoílo substituído, comportando de 1 a 10 átomos de carbono, tal como 4-aminobutirilo; alcenilo substituído, comportando de 1 a 10 átomos de carbono, tal como 6-hidroxi-hex-3-enoílo ; alcinilo substituído, comportando de 1 a 10 átomos de carbono, tal como 3-hidroxi~hex-5-inoílo; aroílo substituído, tal como 4-clorobenzoílo ou 8-hidroxi-naft-2-oílo; heteroarilo substituído, tal como 2,4-dioxo-l,2,3,4-tetra-hidro-3-metilo-quinazolin-6-oílo; alquilsulfonilo substituído, tal como 2-aminoetano-sulfonilo; arilsulfonilo substituído, tal como 5-dimetil-amino-l-naftaleno-sulfonilo; heteroarilsulfonilo substituído, tal como l-metoxi-6-isoquinolino-sulfonilo; carba-moílo ou tiocarbamoílo; carbamoílo substituído (R'-NH-CO) ou tiocarbamoílo substituído (R'-NH-CS) em que o símbolo R' representa um grupo alquilo, alcenilo, alcinilo, ari-lo, heteroarilo, alquilo substituído, alcenilo substituído, alcinilo substituído, arilo substituído ou heteroarilo substituído; carbamoílo substituído (R'-NH-CO) e 12 tiocarbamoílo substituído (R'-NH-CS) em que o símbolo R' representa um grupo alcanoílo, alcenilo, alcinilo, arilo, heteroarilo, alcanoilo substituído, alcenilo substituído, alcinilo substituído, aroílo substituído ou heteroarilo substituído, todos tal como se definiu antes;
Lis-(Gli)n em que η = 1 4; ou Tir- (Gli)n em que η = 1 4. A função de bloqueio da terminação de C pode ser quer na ligação da amida com o carboxilo terminal ou numa ligação de éster com o carboxilo terminal. As funções de bloqueio que se providenciam para uma ligação de amida são designadas por NR1R2 em que os símbolos RI e R2 podem ser desenhados, independentemente a partir do grupo seguinte: átomos de hidrogénio; grupos alquilo, comportando, preferencialmente, de 1 a 10 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, isopropilo; alcenilo, comportando, preferencialmente, de 1 a 10 átomos de carbono, tal como prop-2-enilo; alcinilo, comportando, preferencialmente de 1 a 10 átomos de carbono, tal como prop-2-inilo; alquilo substituído comportando de 1 a 10 átomos de carbono, tal como hidroxialquilo, alcoxialquilo, mercaptoalquilo, alquilotioalquilo, halogenoalquilo, cianoal-quilo, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, dialquilamino-alquilo, alcanoilalquilo, carboxialquilo, carbamoilalquilo; alcenilo substituído comportando de 1 a 10 átomos de carbono, tal como hidroxialcenilo, alcoxialcenilo, mercaptoalcenilo, alquiltioalcenilo, halogenoalcenilo, cianoalcenilo, aminoal-cenilo, alquiloaminoalcenilo, dialquilaminoalcenilo, alCa-noilalcenilo, carboxialcenilo, carbamoilalcenilo; alcinilo substituído comportando de 1 a 10 átomos de carbono, tal como hidroxialcinilo, alcoxíalcinilo, mercaptoalcinilo, alquil-tioalcinilo, halogenoalcinilo, cianoalcinilo, aminoalcinilo, alquilaminoalcinilo, dialquilaminoalcinilo, alcanoilalcinilo, carboxialcinilo, carbamoilalcinilo; aroilalquilo comportando 13 até 10 átomos de carbono, tal como fenacilo ou 2-benzoil-etilo; arilo, tal como fenilo ou l-naftilo ; heteroarilo, tal como 4-quinolilo; alcanoílo comportando de 1 a 10 átomos de carbono, tal como acetilo ou butirilo; aroílo, tal como benzoilo; heteroaroilo, tal como 3-quinoloilo; OR' ou NR'R" em que os símbolos R' e R" representam, independentemente, átomos de hidrogénio, grupos alquilo, arilo, heteroarilo, acilo, aroílo, sulfonilo, sulfinilo, ou grupos de fórmula geral S02-R'" ou SO-R" ' em que o símbolo R'77 representa um grupo alquilo, arilo, heteroarilo, alcenilo, ou alcinilo substituído ou insubstituído.
As funções de bloqueio que se providenciam para uma ligação de éster são designadas pela fórmula geral OR, na qual o símbolo R pode representar um grupo: alcoxi; ariloxi; heteroariloxi; aralquiloxi; heteroaralquiloxi; alcoxi substituído; ariloxi substituído; heteroariloxi substituído; aralquiloxi substituído; ou heteroaralquiloxi substituído.
Quer a função de bloqueio do terminal de N como do terminal de C ou ambas, podem ser de uma estrutura tal que as funções da molécula bloqueada como um pró-fármaco (um derivado inactivo sob o ponto de vista famacológico da molécula do fármaco parental) sofrem transformação espontânea ou enzimática dentro do corpo de modo a libertar o fármaco activo e melhoram assim as propriedades de libertação em relação à molécula do fármaco parental (Bundgaard, 1985). A escolha judiciosa dos grupos de bloqueio permite a adição de outras actividades no péptido. Por exemplo, a presença de um grupo sulfidrilo ligado ao bloco terminal de ou de C- permitirá a conjugação do péptido derivado com outras moléculas. 14
Produção de péptidos e de derivados
Processos gerais de síntese química
Os péptidos da presente invenção podem ser preparados utilizando a tecnologia do ADN recombinante. Contudo, dado o seu comprimento, preparam-se, preferencialmente, utilizando as sínteses de fase sólida, tal como as que estão descritas de uma forma geral por Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. , 85: 2149-54 (1963), embora outras sínteses químicas equivalentes conhecidas na técnica sejam também úteis. A síntese de péptidos em fase sólida pode ser iniciada a partir da terminação C do péptido por meio de acoplamento de um a-aminoácido protegido com uma resina apropriada. Esse material pode ser preparado ligando um aminoácido protegido em a-amino por uma ligação de éster, a uma resina cromometilada ou a uma resina hidroximetilada ou por meio de uma ligação de amida com uma resina BHA ou uma resina MBHA. A preparação da resina de hidroximetilo está descrita por Bodanski et al. , 1966. As resinas clorometiladas estão comercialmente disponíveis nos BioRad Laboratories, Richmond, Calif. e na Lab.Sistems, Inc. A preparação dessas resinas está descrita por Stewart et al. , 1969. Os suportes das resinas BHA e MBHA estão comercialmente disponíveis e são utilizados, geralmente, apenas quando o polipéptido que se deseja sintetizar tem uma amida insubstituída na terminação de C- .
Os aminoácidos podem ser acoplados à cadeia de crescimento do péptido utilizando técnicas bem conhecidas na técnica para a formação das ligações de péptidos. Por exemplo, um dos processos envolve a conversão do aminoácido num derivado que vai tornar o grupo carboxilo do aminoácido 15 mais susceptível a reagir com o grupo amino da terminação N da cadeia de crescimento do péptido. Especificamente, a terminação de C da cadeia de crescimento do péptido pode ser convertida num anidrido misto por meio da reacção da terminação C com cloroformato de etilo, cloroformato de fenilo, cloroformato de sec-butilo, cloroformato de isobutilo ou cloreto de pivaloílo ou os cloretos de ácidos semelhantes. Alternativamente, a terminação C do aminoãcido pode ser convertida num éster activo tal como um éster de 2,4,5-triclorofenilo, um éster de pentaclorofenilo, um éster de pentafluorofenilo, um éster de p-nitrofenilo, um éster de N-hidroxisuccinimida, ou um éster formado a partir de 1-hidroxibenzotriazole. Outro processo de acoplamento envolve a utilização de um agente de acoplamento apropriado, tal como uma N,N'-diciclo-hexilcarbodi-imida ou N,N'-di-isopropil-carbodi-imida. Outros agentes de acoplamento apropriados, evidentes para os especialistas na matéria, estão descritos em Gross et al. 1979, que se incorpora aqui como referência. O grupo α-amino de cada aminoácido utilizado na síntese do péptido deve ser protegido durante a reacção de acoplamento para prevenir as reacções colaterais que envolvem a sua função activa α-amino. Alguns aminoãcidos contêm grupos funcionais de cadeia lateral, reactivos (por exemplo, sulfidrilo, amino, carboxilo e hidroxilo) e esses grupos funcionais podem também ser protegidos com grupos de protecção apropriados para prevenir que ocorra uma reacção química quer (1) no sítio do grupo α-amino ou (2) um sítio de uma cadeia lateral reactiva durante quer a etapa inicial, quer a etapa subsequente de acoplamento.
Na selecção de um grupo de protecção particular, a ser utilizado na síntese dos péptidos, seguem-se normalmente as seguintes regras gerais. Especificamente, um grupo de 16 protecção de α-amino (1) deve tornar a função α-amino inerte nas condições utilizadas na reacção de acoplamento, (2) devem ser facilmente elimináveis depois da reacção de acoplamento, em condições que não eliminarão os grupos de protecção das cadeias laterais e não alterarão a estrutura do fragmento de péptido e (3) devem reduzir substancialmente a possibilidade de racemização após activação, imediatamente antes do acoplamento.
Por outro lado, um grupo de protecção da cadeia lateral (1) deve tornar inerte a função α-amino nas condições utilizadas na reacção de acoplamento, (2) deve ser estável nas condições utilizadas na eliminação do grupo de protecção de α-amino e (3) deve ser facilmente eliminável a partir do péptido desejado, completamente unido, em condições de reacção que não alteram a estrutura da cadeia de péptido.
Será evidente para os especialistas na matéria que os grupos de protecção conhecidos como sendo úteis para a síntese de péptidos variam na capacidade de reacção com os agentes utilizados para a sua eliminação. Por exemplo, alguns grupos de protecção, tais como trifenilmetilo e 2-(p-bifenil)-isopropiloxicarbonilo, são mais lábeis e podem ser clivados em condições de acidez média. Outros grupos de protecção, tais como t-butiloxicarbonilo (BOC), t-amil-oxicarbonilo, adamantil-oxicarbonilo, e p-metoxibenzil-oxicarbonilo, são menos lábeis e requerem ácidos moderadamente fortes para a sua eliminação, tal como ácidos trifluoroacético, clorídrico ou trifluoreto de boro no seio de ácido acético. Ainda outros grupos de protecção, tal como benziloxicarbonilo (CBZ ou Z), halogenobenziloxicarbonilo, p-nitrobenziloxicarbonilo, cicloalquiloxicarbonilo e isopropiloxicarbonilo são menos lábeis e requerem mesmo ácidos mais fortes, tais como ácido fluorídrico, ácido bromídrico ou 17 trifluoroacetato de boro no seio de ácido trifluoroacético, para a sua eliminação. Os grupos de protecção apropriados, conhecidos na técnica, estão descritos em Gross et al. 1981.
Entre as classes de grupos de protecção de aminoácidos para a protecção do grupo α-amino ou de protecção do grupo da cadeia lateral estão incluídos nos seguintes: (1) Para um grupo α-amino, três classes típicas de grupos de protecção são: (a) grupos de protecção de aromáticos do tipo de uretano, tais como fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), CBZ e CBZ substituído, tal como, p-clorobenzil-oxicarbonilo, p-nitrobenziloxicarbonilo, p-bromoben-ziloxicarbonilo e p-metoxibenziloxicarbonilo, o-clo-robenziloxicarbonilo, 2,4-diclorobenziloxicarbonilo, 2,6-diclorobenziloxicarbonilo e similares; (b) grupos de protecção de alifáticos do tipo de uretano, tais como BOC, t-amiloxicarbonilo, isopro-piloxicarbonilo, 2-(p-bifenil)-isopropiloxicarbonilo, aliloxicarbonilo e similares; e (c) grupos de protecção de cicloalquilo, do tipo de uretano, tais como ciclopentiloxicarbonilo, adaman-tiloxicarbonilo e ciclo-hexiloxicarbonilo.
Os grupos de protecção de α-amino preferidos são BOC e FMOC. (2) Para o grupo amino de cadeia lateral presente em Lis, a protecção pode ser feita por qualquer um dos 18 grupos mencionados antes em (1) tal como BOC, 2-clorobenziloxicarbonilo e similares. (3) Para o grupo guanidino de Arg, a protecção pode ser feita por grupos nitro, tosilo, CBZ, adamantil-xicarbonilo, 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo, 2,3,6-trimetil-4-metoxifenilsulfonilo ou BOC. (4) Para o grupo hidroxilo de Ser ou Tre, a protecção pode ser feita, por exemplo, por t-butilo; benzilo (BZL) ; ou BZL substituído, tal como p-metoxibenzilo, p-nitrobenzilo, p-clorobenzilo, o-clorobenzilo e 2,6-diclorobenzilo. (5) Para o grupo carboxilo de Asp ou Glu, a protecção pode ser feita, por exemplo, por esterificação utilizando grupos como BZL, t-butilo, ciclo-hexilo, ciclopentilo e similares. (6) Para o átomo de azoto de His, aplica-se. apropriadamente como grupo de protecção o benziloximetilo (BOM) ou a parte de tosilo. (7) Para o grupo fenólico do hidroxilo de Tir, pode-se utilizar, apropriadamente um grupo de protecção tal como tetra-hidropiranilo, terc-butilo, tritilo, BZL, cloro-benzilo, 4-bromobenzilo e 2,6-diclorobenzilo. O grupo de protecção preferido é o bromobenziloxicarbonilo. (8) Para o grupo amino da cadeia lateral de Asn ou Gin, utiliza-se, preferencialmente, o grupo xantilo (Xan). (9) Para Met, deixa-se, preferencialmente, o aminoácido desprotegido. 19 (10) Para o grupo tio de Cis, utiliza-se normalmente o grupo p-metoxibenzilo. O primeiro aminoácido de terminal C da cadeia de crescimento do péptido, por exemplo, Glu, está normalmente protegido na posição de α-amíno por meio de um grupo de protecção apropriadamente seleccionado tal como BOC. O BOC-Glu- (γ-ciclohexilo)-OH pode ser acoplado primeiro a uma resina de benzil-hidrilamina utilizando isopropilcarbodi-imida a cerca de 2 5 °C durante duas horas com agitação ou a uma resina clorometiladade acordo com o processo estabelecido em Horiki et al. , 1978. No seguimento do acoplamento do aminoácido protegido por BOC com o suporte de resina, o grupo de protecção de α-amino é normalmente eliminado, normalmente utilizando ácido trifluoroacético (ATFA) no seio de cloreto de metileno ou ATFA sozinho. A reacção de desprotecção do grupo α-amino podem ocorrer numa vasta gama de temperaturas, mas realiza-se normalmente a uma temperatura entre cerca de 0 °C e a temperatura ambiente.
Outros reagentes padrão de desprotecção dos grupos examino, tal como HC1 no seio de dioxano e as condições para a eliminação de grupos de protecção específicos de a-amino estão dentro das competências dos especialistas na matéria, tal como os descritos em Lubke et al., 1975. No seguimento da eliminação do grupo de protecção específico de α-amino, o grupo de α-amino desprotegido, geralmente ainda protegido na cadeia lateral, pode ser acoplado em etapas na sequência pretendida.
Uma alternativa à abordagem em etapas é o processo de condensação do fragmento em que os péptidos pré-formados de comprimento curto, cada um representando parte da sequência 20 desejada, são acoplados a uma cadeia de crescimento de aminoácidos ligados a um suporte de fase sólida. Para esta abordagem em etapas, um reagente de acoplamento particularmente apropriado é a N,N'-diciclo-hexilcarbodi-imida ou di-isopropilcarbodi-imida. Também para a abordagem do fragmento, a selecção do reagente de acoplamento, assim como a escolha do modelo de fragmentação necessário para acoplar fragmentos da natureza e dimensão desejadas são importante para o sucesso e são conhecidas dos especialistas na matéria.
Cada aminoácido ou sequência de aminoácidos protegidos é normalmente introduzido num reactor de fase sólida em quantidades em excesso de quantidades estequeométricas e o acoplamento é realizado, apropriadamente no seio de um dissolvente orgânico, tal como dimetilformamida (DMF), CH2C12 ou as suas misturas. Se ocorre um acoplamento incompleto, o processo de acoplamento repete-se normalmente antes da eliminação do grupo de protecção do N-amino na preparação para o acoplamento com o aminoácido seguinte. No seguimento da eliminação de um grupo de protecção de α-amino, o a-amino remanescente e os aminoácidos de cadeia lateral protegidos podem ser acoplados por etapas na sequência pretendida. 0 sucesso da reacção de acoplamento em cada etapa da síntese pode ser monitorizado. Um processo de monitorização preferido para a síntese é por meio da reacção com ninidrina, tal como descrito por Kaiser et al., 1970. As reacções de acoplamento podem ser realizadas automaticamente utilizando processos comerciais e dispositivos bem conhecidos, por exemplo, um sintetizador de péptidos da Beckman, modelo 990.
Quando a sequência de péptidos desejada está completa, os péptidos protegidos podem ser clivados a partir do suporte de resina e todos os grupos de protecção podem ser eliminados. A reacção de clivagem e de eliminação dos grupos de protecção 21 realiza-se, apropriadamente, concomitantemente ou em sequência com as reacções de desprotecção. Quando a ancoragem da ligação do péptido à resina é uma ligação de éster, pode ser clivada por qualquer reagente que seja capaz, de quebrar uma ligação de éster e de penetrar na matriz de resina. Um processo especialmente útil realiza-se pelo tratamento com ácido fluoridrico anidro, líquido. Este reagente normalmente não vai clivar o péptido da resina, mas também irá eliminar todos os grupos de protecção lábeis de ácidos e assim providenciará, directamente o péptido completamente desprotegido. Quando estão presentes grupos de protecção adicionais que não são lábeis para ácidos, devem realizar-se etapas de desprotecção adicionais. Estas etapas podem realizar-se quer antes ou depois do tratamento com ácido fluoridrico descrito antes, de acordo com as necessidades e as circunstâncias específicas.
Quando se utiliza uma resina clorometilada, o tratamento de clivagem/desprotecção com ácido fluoridrico geralmente resulta na formação dos ácidos de péptidos livres. Quando se utiliza uma resina de benzidrilamina, o tratamento com ácido fluoridrico geralmente resulta em amidas de péptidos livres. A reacção com ácido fluoridrico na presença de anisole e de sulfureto de dimetilo, a 0 °C, durante uma hora, eliminará normalmente os grupos de protecção da cadeia lateral e, concomitantemente, liberta o péptido da resina.
Quando se deseja clivar o péptido sem eliminar os grupos de protecção, a resina do péptido protegido pode ser submetida a metanólise, originando assim um péptido protegido em que o grupo carboxilo da terminação C está metilado. Este éster de metilo pode ser em seguida hidrolisado em condições medianamente alcalinas para se obter o grupo carboxilo do terminal C livre. Os grupos de protecção na cadeia de péptido 22 podem então ser eliminados por meio do tratamento com um ácido forte, tal como um ácido fluorídrico livre. Uma técnica particularmente útil para a metanólise é a de Moore et al. , 1977, em que a resina do péptido protegido é tratada com metanol e cianeto de potássio na presença de um éter de coroa.
Outros processos para a clivagem de um péptido protegido a partir de uma resina quando se utiliza uma resina clorometilada incluem (1) aminólise e (2) hidrólise. Se se desejar, a amida ou a hidrazida de terminação C resultante pode ser hidrolisada com uma parte do carboxilo livre de terminação C e os grupos de protecção podem ser eliminados convencionalmente. O grupo de protecção presente no grupo examino de terminal N pode ser eliminado quer antes quer depois de o péptido protegido ser clivado do suporte. A purificação dos péptidos da presente invenção consegue-se normalmente utilizando técnicas cromatográficas, tal como a CLER preparativa (incluindo a CLER de fase reversa), a permeação de gel, a permuta iónica, a cromatografia de partição, a cromatografia de afinidade (incluindo as colunas de anticorpos monoclonais) e similares ou outras técnicas convencionais tais como a distribuição em contra-corrente ou similar.
Substituição do aminoácido e variantes por adição
Também se descrevem aqui péptidos em que pelo menos um resíduo de aminoácido e preferencialmente apenas um tenha sido eliminado e um resíduo diferente tenha sido inserido no seu lugar. Para a descrição detalhada da química das proteínas e a sua estrutura, ver Schulz, G. E. et al. , Principies of Protein Structure, Springer-Verlag, New Iork, 1979, e Creighton, T. E., Proteins: Structure and Molecular 23
Principies, W. H. Freeman & Co. , San Francisco, 1984. Os tipos de substituições que podem ser feitas na molécula do péptido da presente invenção são substituições conservadoras e são definidas aqui como permutas dentro dos seguintes grupos: 1. Resíduos alifáticos pequenos, não polares ou ligeiramente polares: por exemplo, Ala, Ser, Tre, Gli; 2. Resíduos polares, carregados negativamente e as suas amidas; por exemplo, Asp, Asn, Glu, Gin; 3. Resíduos polares, carregados positivamente; por exemplo, His, Arg, Lis;
Pro, por causa da sua geometria rara, constrange forte-mente a cadeia. Fazem-se alterações substanciais nas propriedades funcionais seleccionando substituições que são menos conservadoras, tal como entre mais do que dentro os grupos anteriores (ou dois outros grupos de aminoácidos não mostrados antes), que diferirão mais significativamente no seu efeito na manutenção de (a) a estrutura do péptido na área da substituição (b) a carga ou a hidrofobicidade da molécula do sítio alvo ou (c) o volume da cadeia lateral. A maior parte das substituições, de acordo com a presente invenção, são aquelas que não produzem alterações radicais nas características da molécula do péptido. Mesmo quando é difícil prever o efeito exacto de uma substituição antes de a fazer, um especialista na matéria compreenderá que o efeito pode ser avaliado por ensaios de avaliação de rotina, preferencialmente os ensaios biológicos descritos a seguir. As modificações das propriedades do péptido incluindo a estabilidade de redox ou térmica, a 24 hidrofobicidade, a susceptibilidade à degradação proteo-lítica ou a tendência para agregar com veículos ou em multímeros são avaliadas por processos bem conhecidos pelos especialistas na matéria.
Um grupo de variantes de substituição de KPSSPPEE tem o Glu na posição 7 ou 8 (ou ambos) da SEQ ID NO: 2 substituído por um ou qualquer dos dois Gin, Asp ou Asn.
Outros derivados podem ainda incluir a substituição de Ser na posição 3 ou 4 (ou em ambas) da SEQ ID NO: 2 com um ou qualquer dos seguintes: Tre, Ala, Gli, Serh ou Val30H.
Além disso, a Lis na posição 1 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituída por His, Arg, Gin, Orn, Cit ou Hei.
Outros derivados têm Pro na posição 2, 5 ou 6 substituído por Hip (hiroxiprolina).
Também se descrevem aqui variantes de adição em que se adicionam dois ou mais resíduos à terminação de C depois de Glu (ou depois de qualquer um dos substituintes anteriores) na SEQ ID NO: 2. Estes resíduos podem ser Leu- (Gli) n, Ile-(Gli)n, Val-(Gli)n, Nva- (Gli) n, ou Nle- (Gli)n, em que Nva representa norvalina, Nle representa norleucina e n = 1-10.
Também se descrevem aqui variantes de adição em que se adiciona um ou mais resíduos adicionados à terminação N antes de Lis (ou qualquer um dos substituintes anteriores) na SEQ ID NO: 2. Estes resíduos podem ser Gli, Lis- (Gli)n, Tir- (Gli)n, ou Gli- (Gli)n, em que n = 1-10.
Um outro derivado é uma variante de adição de 9-mer em que se adiciona qualquer um dos aminoácidos que se segue à 25 terminação C depois de Glu (ou qualquer um dos substituintes anteriores) na SEQ ID NO: 2: Leu, Ile, Vai, Nva, Nle, Met,
Ala ou Gli.
Os péptidos não bloqueados de qualquer uma das sequências anteriores comportando terminais N- ou C-, por exemplo, NH2-KPSSPPEE-OH não bloqueada [SEQ ID NO: 2].
Derivados químicos
Os "derivados químicos" de KPSSPPEE [SEQ ID NO: 2] contêm partes químicas adicionais normalmente que não são, normalmente, uma parte do péptido. As modificações covalentes do péptido estão incluídas no âmbito da presente invenção. Essas modificações podem ser introduzidas na molécula por meio da reacção com os resíduos de aminoácidos alvo do péptido com um agente orgânico de derivação que é capaz de reagir com as cadeias laterais seleccionadas ou os resíduos terminais.
Os péptidos bloqueados discutidos antes são exemplos de derivados químicos preferidos dos péptidos "naturais" não bloqueados.
Seguem-se outros exemplos de derivados químicos do péptido. 0 lisinilo e resíduos de terminal amino são derivados com ácido succínico ou outros anidridos de ácidos carboxílicos. A derivação com um anidrido de ácido carboxílico cíclico yem o efeito de reverter a carga dos resíduos de lisinilo. Outros reagentes apropriados para a derivação de resíduos contendo α-amino incluem imido-ésteres tais como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; 26 píridoxal, hidreto de cloro e boro; ácido trinitrobenzeno-sulfónico; O-metilisoureia; 2,4-pentanodiona; e reacção com glioxilato catalisada com transaminase.
Os grupos laterias de carboxilo, aspartilo ou glutamilo, podem ser modificados selectivamente por reacção com carbodi-imidas (R-N=C=N-R') tal como l-ciclo-hexil-3-(2-morfolínil-(4-etil) carbodi-imida ou l-etil-3- (4-azonia-4,4-dime-tilpentil) carbodi-imida. Além disso, os resíduos de aspartilo e de glutamilo podem ser convertidos em resíduos de asparaginilo e glutaminilo por reacção com amónia.
Outras modificações incluem a hidroxilação de prolina e de lisina, fosforilação de grupos hidroxilo de resíduos de serilo ou de treonilo, metilação do grupo amino de lisina (Creighton, supra, pp. 79-86), acetilação da amina do terminal de N- e amidação dos grupos carboxilo do terminal de C- .
Para cada sequência única de péptido aqui descrita, a presente invenção inclui a sequência retro-inversa correspondente em que a direcção da cadeia do péptido tenha sido invertida e em que todos os aminoácidos pertencem à série D. Por exemplo, o análogo retro-inverso do péptido KPSSPPEE da série L natural é o EEPPSSPK que é composto por aminoácidos da série D em que E representa a terminação de N- e o símbolo K representa a terminação de C-. Por exemplo, o análogo retro-inverso do péptido Ac-KPSSPPEE-Am natural, da série L, bloqueado, é o Ac-EEPPSSPK-Am que é composto por aminoácidos da série D e em que E representa a terminação de N- acetilada e o símbolo K representa a terminação de C- amidada. A gama completa dos grupos bloqueados do terminal N e a gama completa dos grupos bloqueados do terminal C especificadas 27 para os péptidos das séries L são também válidos para os péptidos das séries D.
Também estão incluídos os péptidos em que um ou mais D-aminoácidos foram substituídos por um ou mais L-aminoácidos. Adicionalmente, os aminoácidos modificados ou os derivados químicos dos aminoácidos podem ser providenciados de tal modo que o péptido contém mais partes químicas ou aminoácidos modificados que normalmente não são uma parte de uma proteína natural. Essas partes derivadas podem melhorar a solubilidade, a absorção, o semi-período de vida biológico e similares. As partes capazes de mediar esses efeitos estão descritas, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Péptidos multiméricos
Podem-se produzir péptidos mais longos em que a sequência peptídica básica, de cerca de 7-9 aminoácidos, repete-se desde cerca de duas a cerca de 100 vezes, com ou sem a intervenção de espaçadores ou de ligantes. Um multímero do péptido KPSSPPEE é indicado pelas fórmula seguinte (KPSSPPEE-XJ n-KPSSPPEE em que m= 0 ou 1, n =1-100. X representa um grupo espaçador, preferencialmente alquilo Ci-C20, alcenilo Ci-C20, alcinilo Ci-C20, poliéter Ci-C20, contendo até 9 átomos de oxigénio ou Gliz. (z=l-10).
Entende-se que esses multímeros podem ser produzidos a partir de qualquer um dos péptidos descritos aqui. Além disso, um péptido multímero compreende diferentes combinações dos monómeros de péptidos, tanto KPSSPPEE como as suas variantes descritas. Esses péptidos oligoméricos ou multiméricos podem ser produzidos por síntese química ou por técnicas de ADN recombinante tal como se discute aqui. Quando 28 produzidos quimicamente, os oligómeros têm, preferencialmente, de 2-8 repetições da sequência básica de péptido. Quando produzidos de forma recombinante, os multímeros podem ter tantas repetições quantas o sistema de expressão permite, por exemplo de dois a cerca de 100 repetições.
Todos os péptidos e derivados químicos anteriores devem ter a actividade biológica e/ou a actividade de ligação de KPSSPPEE como se segue: pelo menos cerca de 20 % da actividade de Ac-EEPPSSPK-Am num ensaio in vitro da invasão das células ou num ensaio in vitro da formação do tubo endotelial e/ou da angiogénese. Estas actividades são caracterizadas em maior detalhe a seguir. Alternativamente ou para além disso, o péptido ou os derivados químicos devem concorrer com Ac- KPSSPPEE-Am marcado para a ligação a um ligando ou ligação de parceria para Ac-KPSSPPEE -Am, se este for um receptor celular (ensaiado num ensaio de ligação com células inteiras ou as suas fracções) , um receptor isolado ou qualquer outra molécula de ligação de Ac-KPSSPPEE-Am.
Além disso, os péptidos ou derivados da presente invenção não têm actividades biológicas previamente associadas com um activador do plasminogénio de urocinase (APu). Isto é, não bloqueiam a laigação de APu ao receptor de APu. Estes péptidos não têm uma actividade trombolítica, uma imagem de marca do APu.
COMPOSIÇÕES DE DIAGNÓSTICO E DE PROGNÓSTICO
Além disso, os péptidos podem ser marcados para a sua detecção e podem ser utilizados, por exemplo, para detectar um sítio de ligação para o péptido na superfície ou no interior de uma célula. Assim, o destino do péptido pode ser 29 seguido in vitro ou in vivo utilizando o processo apropriado para detectar o marcador. O péptido marcado pode ser também utilizado in vivo para diagnóstico e prognóstico, por exemplo para evidenciar focos metastásicos ocultos ou para outros tipos de avaliações in si tu.
Exemplos de marcadores apropriados, detectáveis, são marcadores fluorogénicos, cromogénicos radioactivos ou outros marcadores químicos. Os rádio-marcadores úteis, que são detectados por um contador de radiações gama ou um contador de cintilação ou por auto-radiografia incluem 3H, 125I, 131l, 35S e 14C. Além disso, o 131I é também útil como isótopo terapêutico (ver a seguir).
Os marcadores fluorescentes comuns incluem fluoresceína, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, alofico-cianina, o-ftaldeído e fluorescamina. O fluoróforo, tal como o grupo dansilo, deve ser excitado pela luz de um comprimento de onda particular para o fluoresco. Ver, por exemplo, Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, sexta Edição, Molecular Probes, Eugene, OR., 1996). Em geral, um reagente fluorescente selecciona-se com base na sua capacidade para reagir rapidamente com uma função amino. Exemplos dessas sondas fluorescentes incluem o Bodipy (4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno), fluoróforos que varrem o espectro visível (patentes de invenção norte-americanas US 4.774.339; US US 5.248.782; US 5.433.896; US 5.451.663). Um elemento preferido deste grupo é o ácido 4,4-difluoro-5,7—dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propiónico. A fluoresceína, os derivados de fluoresceína e as moléculas semelhantes a fluoresceína tais como Oregon Green™ e os 30 seus derivados, Rhodamine Green™ e Rhodol Green™, são acoplados a grupos amina utilizando o isocianato, éster succinímidilo ou grupos que reagem com diclorotriazinilo. Os comporímentos de onda das rodaminas, que são basicamente derivados de Rhodamine Green™ com substituintes nos átomos de azoto, estão entre os reagentes conhecidos de marcação fluorescente, foto-estável. Estes espectros não são afectados pelas alterações no pH entre 4 e 10, uma vantagem importante sobre as fluoresceínas para muitas aplicações biológicas. Este grupo inclui tetrametilrodaminas, X-rodaminas e derivados de Texas Red. Outros fluoróforos preferidos para a derivação do péptido de acordo com a presente invenção são os que são excitados pela luz ultra-violeta. Os exemplos incluem azul em cascata, naftalenos derivados de coumarina (dos quais o cloreto de dansilo é um dos elementos), pirenos e derivados de piridiloxazoles.
Ainda numa outra abordagem, faz-se reagir um ou mais grupos de amino com reagentes que produzem produtos fluorescentes, por exemplo, fluorescamina, dialdeídos tais como o-ftaldialdeído, naftaleno-2,3-di-carboxilato e antrace-no-2,3-dicarboxilato. Os derivados de 7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazole (NBD), tanto cloretos como fluoretos, são úteis para modificar aminas para se obter produtos fluorescentes.
Os especialistas na matéria reconhecem que os reagentes fluorescentes conhecidos modificam grupos diferentes de aminas, tais como tiois, álcoois, aldeídos, cetonas, ácidos carboxílicos e amidas. Por isso os substratos fluorescentes podem ser facilmente desenhados e sintetizados utilizando estes outros grupos reactivos. O péptido pode também ser marcado para detecção utilizando metais que emitem fluorescência tal como 125Eu ou 31 outros da série dos lantanídeos. Estes metais podem ser ligados ao péptido utilizando esses grupos de quelação de metal como ácido dietilenotriaminopenta-acético (DAPT) ou ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA). O péptido pode tornar-se detectável por meio do seu acoplamento a um composto quimioluminescente. A presença do péptido quimio-luminescente marcado é então determinada por meio da detecção da presença de luminescência que aparece durante o decurso de uma reacção química. Exemplos de substâncias quimiolumi-nescentes particularmente úteis são luminol, isoluminol, éster teromático de acridínio, imidazole, sal de acridínio e éster de oxalato. Do mesmo modo, um composto bioluminescente pode ser utilizado para marcar o péptido. Ã bioluminescência é um tipo de quimioluminescência encontrado em sistemas biológicos em uma proteína catalítica aumenta a eficiência da reacção quimioluminescente. A presença da proteína bioluminescente é determinada pela detecção da presença da luminescência. Compostos bioluminescentes importantes para fins de marcação são luciferina, luciferase e equorina.
Ainda numa outra abordagem, pode-se utilizar uma detecção colorimétrica, com base em compostos cromogénicos (cromóforos) com elevados coeficientes de extinção. A detecção in si tu do péptido marcado pode ser conseguida eliminando um espécimen histológico de um indivíduo e examinando-o por microscopia em condições apropriadas para detectar o marcador. Os especialistas na matéria perceberão rapidamente que qualquer um de uma variedade de processos histológicos (tal como processos de coloração) podem ser modificados de modo a conseguir-se essa detecção in situ. 32 A expressão "marcado sob o ponto de vista do diagnóstico" significa que o péptido tem ligado a ele um marcador detectável sob o ponto de vista do diagnóstico. Há muitos marcadores e processos diferentes conhecidos pelos especialistas na matéria. Exemplos dos tipos de marcadores que podem ser utilizados na presente invenção incluem isótopos radioactivos, isótopos paramagnéticos e compostos que podem ser visualizados por tomografia de emissão do positrão (TEP, PET na terminologia inglesa). Os especialistas na matéria conhecem outros marcadores apropriados para a ligação aos péptidos utilizados na presente invenção ou serão capazes de acertá-los por experimentação de rotina. Além disso, a ligação destes marcadores ao péptido ou a um derivado pode ser feita utilizando técnicas normalizadas conhecidas pelos especialistas na matéria.
Para a visualização in vivo, para fins de diagnóstico, o tipo de instrumentos de detecção disponíveis são um dos factores principais para seleccionar um dado radionuclídeo. O radionuclídeo escolhido deve ter um tipo de desintegração que é detectável por um dado tipo de instrumento. Em geral, qualquer processo convencional para a visualização de imagens de diagnóstico pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. Um outro factor na selecção de um radionuclídeo para um diagnóstico in vivo é o facto de o semi-período de vida de um radionuclídeo ser suficientemente longo de modo a ser ainda detectável no momento da absorção máxima pelo elemento alvo, mas suficientemente curto de modo que a radiação danosa do hospedeiro seja minimizada. Num enquadramento preferido, um radionuclídeo utilizado in vivo para a visualização de imagens não emite partículas, mas produz um grande número de fotões numa gama de 140-200 keV, que podem ser prontamente detectados por câmaras gama convencionais. 33
Para o diagnóstivo in vivo, os radionuclídeos podem estar ligados ao péptido quer directamente quer indi-rectamente, utilizando um grupo funcional intermédio. Os grupos funcionais intermédios são muitas vezes utilizados para ligar radioisótopos, que existem como iões metálicos, aos péptidos, são os agentes de quelação, DAPT e EDTA. Exemplos de iões metálicos que se podem ligar aos péptidos são "Tc, 123I, lxlIn, 131I, 97Ru, 87Cu, 67Ga, 125I, S7Ga, 72As, 89Zr e 201TI. Geralmente, a dosagem do péptido marcado para o diagnóstico por detecção variará consoante algumas considerações tais como idade, condição física, sexo e extensão da doença no paciente, contra-indicações, se houver alguma e outras variáveis, a serem ajustadas pelo médico, individualmente. A dosagem pode variar de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg.
Numa outra abordagem, os péptidos ou derivados da presente invenção podem ser utilizados como ligandos de afinidade para a ligação do receptor do péptido em ensaios, cromatografia preparativa de afinidade ou separação de fase sólida. Essas composições podem também ser utilizadas para enriquecer, purificar ou isolar células às quais o péptido ou um seu derivado se liga, preferencialmente através de uma interacção específica de receptor - ligando. O péptido ou derivado é imobilizado utilizando processos comuns conhecidos na técnica, por exemplo, ligação a Sepharose® activada por CNBr ou Agarose®, NHS-Agarose® ou Sepharose® activada por epoxi, Sepharose® ou Agarose® activadas por epoxi, EAH-Sepharose® ou Agarose®, estreptavidina - Sepharose® ou Agarose® em conjunto com péptidos ou os seus derivados biotinilados. Em geral, os péptidos ou os seus derivados da presente invenção podem ser imobilizados por qualquer processo que seja capaz de imobilizar estes compostos numa fase sólida para os fins indicados. Ver, por exemplo. 34
Affinity Chromatography; Principies and Methods (Pharmacia LKB Biotechnology) . Assim, uma composição pode compreender qualquer um dos péptidos ou os seus derivados aqui descritos, ligados a um suporte sólido ou a uma resina. O composto pode ser ligado directamente ou por via de um espaçador, preferencialmente uma cadeia alifãtica comportando cerca de 2-12 átomos de carbono.
Por "fase sólida" ou "suporte sólido" ou "veículo" entende-se qualquer suporte ou veículo capaz de ligar péptidos ou os seus derivados. Suportes ou veículos bem conhecidos, para além da Sepharose® ou Agarose® descritos antes são vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilases, celuloses naturais e modificadas tais como nitrocelulose, poliacrilamidas, difluoreto de polivinilideno, outras agaroses e magnetite, incluindo pérolas magnéticas. O veículo pode ser totalmente insolúvel ou parcialmente solúvel. O suporte material pode ter qualquer configuração estrutural possível desde que a molécula acoplada seja capaz de se ligar ao material receptor. Assim, a configuração do suporte pode ser pode ser esférica, como numa pérola ou cilíndrica, como na superfície interior de um tubo de ensaio ou num microtubo de microplaca ou na superfície externa de uma barra. Alternativamente, a superfície pode ser plana tal como uma folha, uma fita de ensaio, a superfície de fundo de um microtubo de uma microplaca, etc.
Anticorpos e as suas utilizações
Podem-se produzir anticorpos que são específicos de um epitopo definido pela sequência de péptido KPSSPPEE ou específicas para um seu derivado químico. Esses anticorpos podem ser policlonais, monoclonais, bi-específicos, quiméri- 35 cos ou anti-idiotípicos e incluem os seus fragmentos de ligação do antigénio. Qualquer imuno-ensaio conhecido na técnica pode ser utilizado para detectar a ligação desse anticorpo a um péptido, a um seu derivado químico ou a um oligómero de péptido de acordo com a presente invenção. Os ensaios preferidos são os imuno-ensaios com enzimas ou os rádio-imunoensaios. As referências que se seguemdescrevem a produção, purificação, ensaio e utilização de anticorpos: Hartlow, E. et al. , Antibodies.- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988; Campbell, A., em: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Bíology, Volume 13 (Burdon, R. , et al., eds.), Elsevier, Amsterdam (1984)); trabalho de T. S. et al., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, NY, 1978; Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Março, 1986; Butler, J. E. (ed.),Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, 1991; Butler, J. E., em: STRUCTURE OF ANTIGENS, Vol.l, Van Regenmortel, M., ed., CRC Press, Boca Raton 1992, pp. 209-259; Butler, J. E., em: van Oss, C. J. et al., (eds), IMMUNOCHEMISTRY, Mareei Dekker, Inc., New York, 1994, pp. 759-803; Voller. A. et al. (eds)., Immunoassays for the 1980 's, University Park Press, Baltimore, 1981.
Esses anticorpos podem ser utilizados para detector a presença ou para medir a quantidade de epitopo do péptido num material biológico ou noutra amostra por imuno-ensaio directo ou em concorrência. Os anticorpos podem ser acoplados a um suporte sólido e utilizados em cromatografia de afinidade para isolar e purificar material contendo o epitopo do péptido. Inversamente, tal como se descreveu antes, o péptido ou o seu derivado químico da presente invenção, ligados a um 36 suporte sólido, podem ser utilizados para enriquecer ou para purificar anticorpos específicos. Os anticorpos anti-idiotípicos podem ser utilizados para ganhar conhecimento sobre a estrutura de um péptido, variante ou derivado químico da presente invenção, quando ligados a um seu receptor.
Ensaio biológico da actividade anti-invasiva
As composições da presente invenção são ensaiadas quanto à sua capacidade anti-invasiva num sistema de ensaio de invasão Matrigel®, tal como descrito em detalhe por Kleinman et al., 1986 e Parish et al. . 1992. O ensaio realiza-se com uma linha de células, mais preferencialmente com uma linha de células de tumor, mais preferencialmente ainda com uma linha de células de cancro da mama de rato (Mat BIII) ou uma linha de células de cancro humano da próstata (PC-3) (Xing e Rabbani, 1996; Hoosein et al., 1991).
Matrigel® é uma membrana de base reconstituída contendo colagénio do tipo IV, laminina, sulfato de heparina, protepglicanos tal como perlecan, que se liga e localiza
FbCF, vitronectina assim como o factor β de crescimento e transformação (FCTP), activador de plasminogénio do tipo da urocinase (APu), activador de plasminogénio de tecido (APt) e a serpina, conhecida como inibidor do activador do plasminogénio do tipo 1 (IAP-1) (Chambers et al. , 1995). É aceite na técnica que os resultados obtidos neste ensaio para compostos que atingem os receptores e ;< t r acelulares ou as enzimas indiciam a eficácia desses compostos in vivo (Rabbani et al., 1995). 37
Ensaio biológico da actividade anti-angiogénica
Os compostos da presente invenção são ensaiados quanto à sua actividade anti-angiogénica num dos dois sistemas diferentes de ensaio in vitro.
As células endoteliais, por exemplo, as células endoteliais da veia umbilical humana (CEVUH) ou as células endoteliais microvasculares humanas (CEMVH) que podem ser preparadas ou obtidas comercialmente, misturam-se a uma concentração de 2 x 10 células/mL com fibrinogénio (5 mg/mL em solução salina tamponada com fosfato (STF) numa relação de 1:1 (v/v). Adiciona-se trombina (5 unidades/ mL de concentração final) e a mistura é imediatamente transferida para uma placa de 24 microtubos (0,5 mL por microtubo) . Deixa-se formar o gel de fibrina e depois adiciona-se FCVE e FbCF aos microtubos (5 ng/mL de concentração final em cada um) em conjunto com o composto de ensaio. As células são incubadas a a 3 7 °C, em atmosfera de C02 a 5 %, durante 4 dias, período ao fim do qual se contam as células em cada tubo e se classificam como arredondadas, alongadas sem ramificações, alongadas com um ramo ou alongadas com 2 ou mais ramos. Os resultados são expressos como a média de 5 microtubos diferentes para cada concentração de composto. Normalmente, na presença de inibidores angiogénicos, as células permanecem quer arredondadas ou sob a forma de tubos indiferenciados (por exemplo 0 ou 1 ramo).
Este ensaio é reconhecido na técnica como sendo indiciador da eficácia angiogénica (ou anti-angiogénica) in vivo (Min et al., 1996).
Num ensaio alternativo, observa-se a formação de tubos de células endoteliais quando as células endoteliais são 38 postas em cultura em Matrigel® (Schnaper et al. 1995). As células endoteliais (1 x 104 células/microtubo) são transferidas para placas de 24 microtubos revestidas com Matrigel® e quantifica-se a formação de tubos passadas 48 horas. Os inibidores são ensaiados por meio da sua adição, ao mesmo tempo que as células endoteliais ou em vários momentos posteriormente.
Este ensaio modela a angiogénese apresentando às células endoteliais um tipo particular de membrana de base, nomeadamente a camada da matriz que migra e é possível verificar a primeira diferenciação das células endoteliais. Além disso, para a ligação dos factores de crescimento, os componentes da matriz encontrados no Matrigel® (e na membrana básica in situ) ou os seus produtos proteolíticos podem também ser estimuladores da formação dos tubos de células endoteliais que tornam este modelo complementar do modelo de angiogénese com gel de fibrina previamente descrito (Blood e Zetter, 1990; Odedra e Weiss, 1991). Os compostos da presente invenção inibem a formação dos tubos de células endoteliais em ambos os ensaios, que sugerem que os compostos também terão actividade anti-angiogénica.
Ensaios in vivo das composições, em modelos animais, de tumores humanos
Os péptidos, pêptidos simulados e conjugados foram ensaiados quanto à eficácia terapêutica em vários modelos de roedores bem estabelecidos que são considerados altamente representativos de um largo espectro de tumores humanos. As abordagens estão descritas em detalhe em Geran, R. I. et al., "Protocols for Screening Chemical Agents and Natural Products Against Animal Tumors and Other Biological Systems (terceira edição)", Canc.Chemother. Reports, Part 3, 3: 1- 39 112. Todos os processos gerais de avaliação e ensaios, as medições e os cálculos são realizados de acordo com esta referência, incluindo o tempo médio de sobrevivência, o tempo mediano de sobrevivência, o cálculo do peso aproximado do tumor a partir da medição dos diâmetros do tumor com paquímetros; cálculo dos diâmetros do tumor: cálculo do peso médio do tumor a partir de tumores excisados de indivíduos; e as relações entre grupos tratados e grupos de controlo para qualquer medida (relações entre T/C). A. Modelo em rato da progressão do tumor
Faz-se o ensaio dos efeitos dos compostos na progressão do tumor num modele singeneico de rato de cancro da mama (Xing e Rabbani, 1996) . A linha de células Mat BIII é uma linha de células de tumor altamente agressiva que expressa níveis elevados de ACu e de RAPu e leva a metástases macroscópicas nos nódulos linfáticos quando inoculados in vivo.
As células de tumor da mama de rato Mat BIII, por exemplo 105 -106 células em STF, 0,1 - 0,2 mL por rato, são inoculadas nas almofadas de gordura mamária de ratos fêmea da raça Fisher. Dissolvem-se os compostos de ensaio no seio de STF (concentração de 200 mM), filtra-se em ambiente esterilizado e distribui-se, in vivo, numa dose até cerca de 100 mg/kg/dia), preferencialmente através de uma mini-bomba osmótíca de Alza de 14 dias implantada intraperitonealmente no momento da inoculação. Os animais de controlo recebem veículo (STF) isolado. Alternativamente, administra-se o composto de ensaio por injecção sistémica, preferencialmente intraperitoneal (IP) . Faz-se a eutanásia dos animais no dia 14 e examinam-se quanto a metástases no baço, pulmões, fígado, rim e nódulos linfáticos, preferencialmente por 40 contagem de lesões macroscópicas. Os tumores primários e as metástases podem estar embebidos em parafina e serem tratados por análise histológica ou imuno-histoquímica, por meios convencionais. A dimensão do tumor primário pode ser medida com calibradores. B. Carcinoma do pulmão de Lewis 3LL: crescimento do tumor primário
Esta linha de tumor aparece espontaneamente em 1951 como carcinoma do pulmão num rato C57BL/6 {Câncer Res 15: 39,1955. Ver também Malave, I. et al., J. Nat'l. Canc. Inst. 62: 83-88 (1979)). Propaga-se pela passagem em ratos C57BL/6 por inoculação subcutânea (sc) e faz-se o ensaio em ratos C57BL/6 x DBA/2 F semi-alogeneicos ou em ratos C3H alogeneicos. Normalmente utilizam-se seis animais por grupos para o implante subcutâneo (sc) ou dez para o implante intramuscular (im). Podem implantar-se tumores sc como fragmentos de 2-4 mm ou im ou sc como um inoculo de células suspensas de cerca de 0,5 - 2 x 106 células. O tratamento começa 24 horas após o implante ou é atrasado até se poder palpar um turnos de uma determinada dimensão (normalmente aproximadamente 400 mg). Administra-se o composto de ensaio ip diariamente durante 11 dias.
Faz-se o acompanhamento dos animais pesando-os, por palpação e medindo a dimensão do tumor. O peso normal do tumor nos receptores de controlo não tratados 12 dias após a inoculação im é de 500-2500 mg. O tempo mediano de sobrevivência típico é de 18-28 dias. Utiliza-se um composto de controlo positivo, por exemplo ciclofosfamida a 20 mg/kg/inj ecção por dia nos dias 1-11. Os resultados registados em computador incluem o peso médio do animal, a dimensão do tumor, o peso do tumor, o tempo de sobrevivência. 41
Para confirmar a actividade terapêutica, a composição de ensaio deve ser ensaiada em dois ensaios de doses múltiplas. C. Carcinoma do pulmão de Lewis 3LL: modelo de crescimento primário e de metástases
Este modelo tem sido utilizado por um certo número de investigadores. Ver, por exemplo, Gorelik, E.et al., J.
Nat'l. Canc. Inst. 65: 1257-1264 (1980); Gorelik, E.et al. , Rec. Results Canc. Res. 75: 20-28 (1980); Isakov, N.et al., Invasion Metas. 2: 12-32(1982) ; Talmadge J. E. et al. , J. Na t ' 1. Canc. Inst. 69: 975-980 (1982); Hilgard, P. et al. , Br. J. Câncer 35: 78-86 (1977)). Os ratos de ensaio são ratos machos C57BL/6, com 2-3 meses de idade. No seguimento da implantação sc, im ou intra-plantar, este tumor produz metástases preferencialmente nos pulmões. Com algumas linhas de tumor, o tumor primário exerce efeitos anti-metastásicos e deve ser primeiro excisados antes de se estudar a fase das metástases (ver também a patente de invenção americana U.S. 5.639.725) .
As suspensões unicamente de células são preparadas a partir de tumores sólidos por meio do tratamento de tecido do tumor esmagado com uma solução de tripsina a 0,3 %. Lavam-se as células 3 vezes com STF (pH 7,4) e fez-se a sua suspensão em STF. A viabilidade das células 3LL preparadas desta maneira normalmente é de cerca de 95-99 % (por meio de exclusão do corante azul de tripano). Fez-se uma suspensão das células de tumor viáveis (3 x 104- 5 x 106) no seio de 0,0 5 mL de STF e injectou-se subcutaneamente, quer na região dorsal ou numa sola da pata de ratos C57BL/6. Os tumores visíveis aparecem passados 3-4 dias depois da injecção dorsal sc de 106 células. No dia em que aparece o tumor medem-se os 42 diâmetros dos tumores estabelecidos por meio de calibradores de dois em dois dias. Dá-se o tratamento em uma ou duas doses de péptido ou do seu derivado por semana. Num outro enquadramento, o péptito liberta-se por meio de uma mini-bomba osmótica.
Em experiências que envolvem a excisão do tumor de tumores dorsais, quando os tumores atingem cerca de 1500 mm3 de dimensão, os ratos são divididos aleatoriamente em dois grupos: (1) o tumor primário é completamente excisado; ou (2) realiza-se uma simulação de cirurgia e deixa-se o tumor intacto. Embora os tumores de 500-3000 mm3 inibam o crescimento de metástases, 1500 mm3 é a maior dimensão de tumor primário que pode ser ressecada de forma segura com uma sobrevivência elevada e sem um recrudescimento local. Passados 21 dias, todos os ratos foram sacrificados e autopsiados.
Os pulmões são retirados e pesados. Os pulmões são fixados em solução de Bouin e regista-se o número de metástases visíveis. Também se mediram os diâmetros das metástases utilizando um estereoscópio binocular equipado com uma ocular contendo um micrómetro, com um aumento de 8X. Com base nos diâmetros registados, é possível calcular o volume de cada metástase. Para determinar o volume total das metástases para cada pulmão, multiplica-se o número médio de metástases visíveis pelo volume médio das metástases. Para determinar ainda o crescimento das metástases, é possível medir a incorporação de 125IdUrd nas células do pulmão (Thakur, M. L. et al. . J. Lab. Clin. Med. 89: 217-228 (1977). Dez dias após a amputação do tumor, inocula-se 25 pg de fluorodesoxiuridina no peritoneu dos ratos que comportavam tumores (e, se utilizados, ratos a que se ressecaram os 43
IdUrd tumores) . Passados 30 min, dá-se aos ratos 1 pCI de 125 (iododesoxiuridina). Um dia mais tarde, removeram-se os pulmões e o baço e pesaram-se e mede-se o grau de incorporação de 125IdUrd utilizando um contador de radiação gama.
Em ratos com tumores nas plantas das patas, quando os tumores atingem cerca de 8-10 mm de diâmetro, os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos: (1) as pernas com tumores foram amputadas depois da ligação acima da articulação do joelho; ou (2) deixam-se os ratos intactos como controlos portadores de tumores e não amputados. (A amputação de uma perna sem tumor num rato portador de um tumor não tem nenhum efeito conhecido nas metástases subsequentes, regulando possíveis efeitos da anestesia, stress ou cirurgia). Mataram-se os ratos 10-14 dias após a amputação. Avaliaram-se as metástases tal como se descreveu antes.
Estatística: Os valores representam a incidência das metástases e o seu crescimento nos pulmões de ratos portadores de tumores não se distribuem de uma forma normal. Por isso, pode-se utilizar para análise estatística não paramétrica como o teste U de Mann-Whitney. O estudo deste modelo por Gorelik et al. (1980, supra) mostrou que a dimensão do inoculo das células de tumor determinou a extensão do crescimento das metástases. A taxa de metástases nos pulmões dos ratos operados foi diferente da dos ratos portadores de tumores primários. Assim, nos pulmões de ratos em que o tumor primário tenha siso induzido por inoculação de doses maiores de células 3 LL (1-5 x 106) seguida de remoção cirúrgica, o número de metástases foi inferior ao dos ratos portadores de tumores e não operados, 44 embora o volume de metástases fosse meia elevado do que nos controlos não operados. Utilizando a incorporação de 125IdUrd como uma medida das metástases dos pulmões, não se encontraram diferenças significativas entre os tumores de ratos a que se excisaram os tumores e ratos portadores de tumores originalmente inoculados com 1 x 106 células 3LL. A amputação dos tumores no seguimento da inoculação de lx 105 células de tumor acelerou dramaticamente o crescimento das metástases. Estes resultados estavam de acordo com a sobrevivência dos ratos após a excisão dos tumores locais. 0 fenómeno de aceleração do crescimento das metástases no seguimento da excisão dos tumores locais tinha sido observada repetidamente (por exemplo, ver a patente de invenção norte-americana U.S. 5.639.725). Estas observações têm implicações para o prognóstico de pacientes que sofrem cirurgia do cancro. D. Modelos experimentais de metástases
Os compostos da presente invenção são também analisados quanto à inibição posterior de metástases utilizando um modelo experimental de metástases (Crowley et al., 1993). As metástases tardias envolvem as etapas de ligação e de extravasão de células de tumor, invasão local, sementeira, proliferação e angiogénese.
As células de carcinoma prostático humano (PC-3) transfectadas com um gene repórter, preferencialmente o gene da proteína fluorescente verde (PFV), mas como uma alternativa com um gene que codifica as enzimas cloranfenicol acetil-transferase (CAT), luciferase ou LacZ. Isto permite a utilização quer destes marcadores (detecção da fluorescência de PFV ou da detecção colorimétrica histoquímica da actividade enzimática) para seguir o destino destas células. 45
As células são injectadas, preferencialmente iv e as metástases identificadas depois de cerca de 14 dias, particularmente nos pulmões mas também em nódulos linfáticos regionais, fémures e cérebro. Isto simula o tropismo do órgão das metástases de ocorrência natural do cancro da próstata. Por exemplo, as células PC-3 que expressam PFV (1 x 10e células por rato) são injectadas iv nas veias da cauda de ratos pelados (nu/nu). Também se implantam nos animais mini-bombas (sub-dermicamente na cauda) dispensando quer o composto do ensaio (pelo menos cerca de 100 mg/kg/dia) ou veículo. Fez-se a eutanásia aos animais após 14 dias e prepararam-se os animais para o exame histológico. Apenas as células das metástases e os focos foram visualizados e quantificados por microscopia de fluorescência ou histoquímica de microscópio de luz ou por moagem do tecido e ensaio de quantificação colorimétrica do marcador detectável. E. Xeno-enxerto de tumor humano em ratos pelados
Um modelo preferido utiliza uma linha de células de cancro da mama humano, agressiva, MDA-MB-231. Esta linha é altamente invasiva in vitro e expressa níveis muito elevados de APu e RAPu. Apesar do seu fenotipo agressivo in vitro, esta linha de células, tal como a maior parte de outras linhas de células de cancro da mama humano, cresce pouco e não origina metástases reprodutíveis quando inoculada subcutaneamente em ratos pelados. Quando as MDA-MB-231 são co-inoculadas com Matrigel ou fibroblastos na almofada de gordura mamária de um rato pelado, o crescimento do tumor e as metástases aumentam significativamente resultando num modelo útil (Price(1996) Breast CancerResearch and Treatment 39: 93-102) .
Inoculam-se células MDA-MB-231, por exemplo, 1 x 105 46 células em 0,2 mL de Matrigel frio na almofada de gordura mamária de um rato fêmea Balb/C (nu/nu) e deixaram-se implantar e crescer durante um período, normalmente cerca de 25-30 dias consoante a dose das células. 0 tratamento com um composto de ensaio é iniciado por meio de uma injecção IP, b.i.d. (no exemplo a seguir, deu-se 77 mg/kg/dia do péptido Ã6) . Examinaram-se os animais 2-4 semanas depois quanto às metástases macroscópicas. Além disso, retiraram-se os tumores primários e pesam-se e podem ser embebidos em parafina para a avaliação histológica. As metástases ocorrem normalmente nos nódulos linfáticos e são quantificadas por contagem das lesões macroscópicas.
Para um composto ser útil, de acordo com a presente invenção, tem que demonstrar actividade anti-tumor nos modelos anteriores, por exemplo, bloqueio da progressão do tumor, angiogénese e/ou metástases.
Angiogénese
Mede-se a angiogénese por meio da determinação da densidade de micro-vasos utilizando a imuno-coloração para CD31 (também conhecida como a molécula de adesão das células endoteliais das plaquetas ou MACEP). Os resultados estão relatados como a densidade média dos micro-vasos de 5 campos, cada um deles de 5 secções diferentes (Penfold et al., 1996). Normalmente, faz-se a excisão de todo o tumor, secciona-se e examinam-se as secções sob o ponto de vista histológico no que respeita à densidade dos micro-vasos utilizando corantes ou marcadores apropriados para outras produções. A formação do tubo endotelial é um outro ensaio que está relacionado com a angiogénese e está descrito nos exemplos.
Composições farmacêuticas e terapêuticas e a sua administração
Os compostos que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem todos os compostos descritos antes, assim como os sais destes compostos, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Os sais de adição de ácidos destes compostos da presente invenção, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico que contêm um grupo básico são formados, quando apropriado, com ácidos fortes ou moderadamente fortes, mão tóxicos, orgânicos ou inorgânicos, na presença de uma amina básica, por processos conhecidos na técnica. Exemplos de sais de adição de ácidos que estão incluídos na presente invenção são os sais maleato, fumarato, lactato, oxalato, metano-sulfonato, etano-sulfonato, benzeno-sulfonato, tartrato, citrato, cloridrato, bromidrato, sulfato, fosfato e nitrato.
Os sais de adição de bases destes compostos da presente invenção, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico que contêm um grupo ácido são preparados por processos conhecidos a partir de bases orgânicas e inorgânicas e incluem, por exemplo, bases não tóxicas de metais alcalinos e alcalino-terrosos, tais como cálcio, sódio, potássio e hidróxido de amónio; e bases orgânicas não tóxicas tais como trietilamina, butilamina, piperazina, e tri (hidroximetil) metilamina.
Tal como se estabeleceu antes, os compostos da presente invenção possuem a capacidade de inibir a invasão ou a angiogénese, propriedades que são exploradas no tratamento de cancro, em particular o cancro com metástases. Uma composição da presente invenção pode ser activa per se ou podem actuar 48 como um "pró-f ãrmaco" que é convertido in vivo na forma activa.
Os compostos da presente invenção, assim como os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, podem ser incorporados em formas de dosagem convenientes, tais como cápsulas, bolachas impregnadas, comprimidos ou preparações para injecções. Podem utilizar-se veículos sólidos ou líquidos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.
Preferencialmente, os compostos da presente invenção são administrados sistemicamente, por exemplo, por injecção. Quando utilizada, a injecção pode ser por qualquer via conhecida, preferencialmente pela via intravenosa, subcutânea, intramuscular, intracraniana ou intraperitoneal. Os injectáveis podem ser preparados em formas convencionais, quer como soluções ou suspensões, formas sólidas apropriadas para soluções ou suspensões em líquidos antes da injecção ou emulsões.
Os veículos sólidos incluem amido, lactose, di-hidrato de sulfato de cálcio, terra alba, sacarose, talco, gelatina, agar, pectina, acácia, estearato de magnésio e ácido esteárico. Os veículos líquidos incluem xarope, óleo de amendoim, azeite, solução salina água, dextrose, glicerol e similares. Do mesmo modo, o veículo ou diluentepode incluir qualquer material de libertação prolongada, tal como mono-estearato de glicerilo ou di-estearato de glicerilo, isoladamente ou com uma cera. Quando se utiliza um veículo líquido, a preparação pode estar sob a forma de um xarope, elixir, emulsão, cápsula de gelatina mole, líquido esterilizado injectável (por exemplo, uma solução), tal como uma ampola ou uma suspensão líquida aquosa ou não aquosa. Um resumo dessas composições farmacêuticas pode ser encontrado, 49 por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (Janeiro, 18a ed. 1990) .
As preparações farmacêuticas são feitas seguindo técnicas convencionais da química farmacêutica envolvendo etapas tais como a mistura, a granulação e a compressão, quando necessário para formar comprimidos ou mistura, enchimento e dissolução de ingredientes, conforme apropriado, para se obter os produtos desejados para administração oral, parentérica, tópica, transdérmica, intravaginal e rectal. As composições farmacêuticas podem também conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas tais como agentes de molhagem ou de emulsão, agentes de tamponamento do pH, etc.
Embora a via de administração preferida seja a sistémica, as composições farmacêuticas podem ser administradas topicamente ou transdermicamente, por exemplo, como uma pomada, um creme ou um gel; oralmente; rectalmente; por exemplo como supositórios, parentericamente, por injecção ou continuamente por infusão; intravaginalmente; intranasal-mente; intrabronquicamente, intracranianamente; intra-aural-mente; ou intra-ocularmente.
Para aplicação tópica, o composto pode ser incorporado em veículos aplicados topicamente tais como pomada. O veículo para o ingrediente activo pode estar sob uma forma pulverizãvel ou não pulverizável. As formas não pulverizáveis podem ser formas semi-sólidas ou sólidas compreendendo um veículo local para aplicação tópica e com uma viscosidade dinâmica preferencialmente maior do que a da água. As formulações apropriadas incluem, mas não se limitam a soluções, suspensões, emulsões, cremes, pomadas, pós, lini- 50 mentos e similares. Se se desejar, podem ser esterilizadas ou misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, conservantes, estabilizantes, agentes de molhagem, tampões ou sais para influenciar a pressão osmótica e similares. Os veículos preferidos para as preparações tópicas não pulverizáveis incluem bases de pomadas, por exemplo, polietileno-glcol 1000 (PEG 1000) ; cremes convencionais tal como creme de HEB; feles; assim como gel de petróleo e similares.
Também apropriadas para aplicação tópica são as preparações de aerossóis pulverizáveis em que o composto, preferencialmente em combinação com um material veicular inerte sólido ou líquido, é embalado num frasco com rosca ou misturado com um propelente normalmente gasoso, volátil quando pressurizado. As preparações de aerossol podem conter dissolventes, tampões, tensioactivos, perfumes e/ou anti-oxidantes, para além dos compostos da presente invenção.
Para as aplicações tópicas preferidas, especialmente para os seres humanos, é preferível administrar uma quantidade efectiva do composto a uma área infectada, por exemplo, a superfície da pele, a membrana mucosa, os olhos, etc. Esta quantidade variará, geralmente, entre cerca de 0,001 mg até cerca de 1 g por aplicação, consoante a área a ser tratada, a severidade dos sintomas e a natureza do veiculo tópico utilizado.
As composições da presente invenção podem ainda compreender um ou mais compostos adicionais que são agentes anti-tumor, tal como inibidores mitóticos, por exemplo, vinblastina; agentes de alquilação, por exemplo, ciclofos-famída; inibidores de folato, por exemplo, metotrexato, piritréxio ou trimetrexato; anti-metabolitos, por exemplo, 5-fluorouracilo e citosina arabinósido; antibióticos de 51 intercalação, por exemplo, adriamicina e bieomicina; enzimas ou inibidores de enzimas, por exemplo, asparaginase; inibidores de topoisomerase, por exemplo, etopósido; ou modificadores de respostas biológicas, por exemplo, interferão. De facto, as composições farmacêuticas que compreendem qualquer agente terapêutico de cancro conhecido, em combinação com os péptidos descritos aqui, estão dentro do âmbito da presente invenção. A composição da presente invenção pode também compreender um ou mais de outros medicamentos, preferencialmente anti-infecciosos tais como agentes antibacterianos, anti-fúngicos, antiparasíticos, anti-virais e anti-coccidiais. Exemplos de agentes antibacterianos indluem, por exemplo, sulfonamidas, tais como aulfametoxazole, sulfadiazina ou sulfadoxina; inibidores de DHFR tais como trimetoprim, bromodiaprim ou trimetrexato; penicilinas; cefaloesporinas; aminoglicósidos; inibidores bacteriostáticos da síntese de proteínas; os ácidos quinolonercaboxílicos e os seus análogos de isotiazole fundidos; e similares.
Outras composições terapêuticas
Os compostos da presente invenção podem ser "conjugados sob o ponto de vista terapêutico" e utilizados para libertar um agente terapêutico no sítio onde os compostos de alojam e se ligam tal como sítios de metástases de tumores de focos de infecção/inflamação. A expressão "conjugados sob o ponto de vista terapêutico" significa que o composto, preferencialmente um péptido, um derivado de péptido ou um simulacro de péptido está conjugado com um agente terapêutico. Os agentes terapêuticos utilizados desta forma actuam directa-mente quer na causa subjacente ou as componentes dos processos da invasão do tumor, angiogénese ou inflamação. 52
Exemplos de agentes utilizados para tratar a inflamação são fármacos esteroidais e não esteroidais anti-inflamatórios, muitos dos quais inibem a síntese da prostaglandina.
Outros agentes terapêuticos que podem ser acoplados aos compostos de acordo com o processo da presente invenção são fármacos, rádio-isótopos, lectinas e outras toxinas. As doses terapêuticas administradas numa quantidade que é efectiva sob o ponto de vista terapêutico são conhecidas dos especialistas na matéria. A dose também depende da idade, saúde e peso do receptor, tipo de tratamento concorrente, de houver algum, frequência do tratamento e a natureza do efeito desejado, tal como, por exemplo, efeitos anti-inflamatórios ou efeito anti-bacteriano.
As lectinas são proteínas, normalmente derivadas de plantas, que se ligam a hidratos de carbono. Entre outras actividades, algumas lectinas são tóxicas. Algumas das substâncias mais tóxicas conhecidassão toxinas de proteínas de origem bacteriana e de plantas (Frankel, A. E. et al. , Ann. Rev. Med. 37: 125-142 (1986)). Estas moléculas ligam-se à superfície das células e inibem a síntese das proteínas celulares. As toxinas de plantas mais vulgarmente utilizadas são a ricina e a acrina; as toxinas bacterianas mais vulgarmente utilizadas são a toxina da difteria e a exotoxina A de Pseudomonas. Na ricina e na abrina, a ligação e as funções tóxicas estão contidas em duas sub-unidades separadas das proteínas, as cadeias A e B. A cadeia B da ricina liga-se aos hidratos de carbono da superfície das células e promove a absorção da cadeia A na célula. Uma vez dentro da célula, a cadeia A da ricina inibe a síntese da proteína por inactivação da sub-unidade 6OS do ribosoma eucariótico Endo, Y. et al., J. Biol.Chem. 262: 5908-5912 (1987)). Outras toxinas derivadas de plantas, que são cadeias simples de 53 proteínas inibidoras do ribosoma, incluem a proteína antiviral da erva-dos cancros, a proteína do gérmen de trigo, a gelonina, a diantina, as momorcarinas, tricossantina e muitas outras (Strip, F. et al. , FEBS Lett. 195: 1-8 (1986)). A toxina da difteria e a exotoxina A de Pseudomonas são também proteínas de cadeia simples e a sua ligação e as funções de toxicidade residem em domínios separados da mesma cadeia de proteína com toda a actividade da toxina requerendo clivagem proteolítica entre os dois domínios. A exotoxina A de Pseudomonas tem a mesma actividade catalítica que a toxina de difteria. A ricina tem sido utilizada em terapêutica por meio da ligação da sua cadeia α tóxica às moléculas alvo tal como anticorpos para permitir a libertação específica do sítio do efeito tóxico. As toxinas bacterianas têm também sido utilizadas como conjugados anti-tumor. Tal como se pretende aqui, uma cadeia ou um domínio de péptido tóxico liga-se a um composto da presente invenção e liberta-se de uma forma específica do sítio num sítio alvo em que a actividade tóxica é desejada, tal como um foco de metástases. A conjugação de toxinas com a proteína tal como com anticorpos ou outros ligandos são conhecidas na técnica (Olsnes, S. et al., Immunol. Today 10: 291-295 (1989);
Vitetta, E. S. et al., Ann. Rev. Immunol. 3: 197-212 (1985)).
Exemplos de rádio-isótopos terapêuticos que se podem ligar aos composto para serem utilizados de acordo com os processos da presente invenção, são 125I, 131I, 90Y, 67Cu, 217Bí, 211At, 212Pb, 47Sc e 109Pd.
Os fármacos citotóxicos que interferem com processos celulares críticos incluindo ADN, ARN e a síntese das proteínas tinham sido conjugados com anticorpos e em seguida foram utilizados in vivo para a terapia. Esses fármacos, incluindo, mas não se limitando a daunorubicina, 54 doxorubicina, metotrexato e mitomicina C são também acoplados aos compostos da presente invenção e são utilizados para fins terapêuticos nesta forma.
Processos terapêuticos
Descrevem-se aqui processos para a inibição da invasão celular, principalmente por células de tumor ou angiogénese, primeiramente induzidas pelas células de tumor num indivíduo. Inibindo a invasão por meio de células ou de angiogénese, o processo resulta na inibição de metástases de tumor. Neste processo, administra-se a um indivíduo vertebrado, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um ser humano, uma quantidade do composto efectiva para inibir a invasão ou a angiogénese. O composto ou o seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico é administrada, preferencialmente, sob a forma de uma composição farmacêutica, tal como se descreveu antes.
As doses dos compostos incluem, preferencialmente, unidades de doses farmacêuticas, compreendendo uma quantidade efectiva do péptido. Por uma quantidade efectiva entende-se uma quantidade suficiente para se alcançar uma concentração no estado estacionário in vivo que resulta numa redução mensurável em qualquer parâmetro relevante da doença e podem incluir o crescimento de do tumor primário ou das metástases, qualquer índice aceite de reactividade inflamatória ou um prolongamento mensurável do intervalo isento de doença ou de sobrevivência. Por exemplo, uma redução do crescimento do tumor em 2 0 % dos pacientes é considerada eficaz Frei III, E., The Câncer Journal 3: 127-136 (1997)). Contudo, um efeito desta dimensão não é considerado como sendo eficaz, de acordo com a presente invenção. 55
Num enquadramento, uma dose efectiva é pelo menos igual a, preferencialmente 10 vezes mais elevada e mais preferencialmente 100 vezes mais elevada do que a concentração inibidora de 50 % (CI50) do composto num ensaio in vivo, tal como se descreve aqui. A quantidade de composto activo a ser administrada depende do péptido preciso ou do derivado seleccionado, da doença ou da condição, da via de administração, da saúde e do peso do receptor, da existência de outros tratamentos concorrentes, se houver algum, da frequência do tratamento, da natureza do efeito desejado, por exemplo, a inibição das metástases do tumor e do julgamento do médico competente. A dose preferida para o tratamento de um indivíduo, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um ser humano, com um tumor, é uma quantidade até cerca de 100 miligramas de composto activo por quilograma de peso do corpo.
As dosagens únicas típicas do péptido estão entre cerca de 1 yg e cerca de 100 mg/kg de peso do corpo. Para a administração tópica, sugerem-se as dosagens no intervalo de concentração de cerca de 0,01-20 % de concentração do composto, preferencialmente 1-5 %. Uma dose diária total no intervalo de cerca de 10 miligramas até cerca de 7 gramas é preferida para administração oral. Contudo, os intervalos anteriores são sugestões, dado que o número de variáveis, no que respeita a um regime de tratamento individual, é grande e são esperadas alterações consideráveis destes valores recomendados.
Uma quantidade ou dose efectiva do péptido para a inibição da invasão in vitro está no intervalo de cerca de 1 56 picograma até cerca de 0,5 nanogramas por célula. As doses efectivas e os intervalos de doses óptimas podem ser determinados in vitro utilizando os processos aqui descritos.
Os compostos da presente invenção podem ser ainda caracterizados pelo facto de produzirem um efeito inibidor na migração e na invasão das células, na angiogénese, nas metástases do tumor ou nas reacções inflamatórias. Os compostos são especialmente úteis na produção de um efeito anti-tumor num hospedeiro mamífero, preferencialmente um ser humano portador de um tumor.
As composições anteriores e os processos de tratamento são úteis para inibir a migração e a invasão das células induzidas pela proliferação das células num indivíduo com uma condição associada com uma invasão de células indesejada, uma proliferação induzida pela migração, angiogénese ou metástases. Essas doenças ou condições podem incluir o crescimento primário ou tumores sólidos ou leucemias e linfornas metástases, invasão e/ou crescimento das metástases do tumor, ateroesclerose, angiogénese miocárdica, restenose vascular da angioplastia post-balão, formação da neoíntima no seguimento de trauma vascular, restenose de enxerto vascular, formação coronária colateral, trombose venosa profunda, angiogénese isquémica de um membro, telangiectasia, granuloma piogênico, doenças da córnea, rubeose, glaucoma neo-vascular, retinopatia diabética e outras, fibroplasia retrolenticular, neovascularização diabética, degeneração macular, endometri-ose, artrite, fibrose associada com condições inflamatórias crónicas, condições inflamatórias incluindo psoríase da escleroderma, fibose pulmonar, fibrose induzida pela quimioterapia, cura de feridas com escaras e fibrose; úlceras pépticas, fracturas, quelóides e distúrbios de génese vascular, hematopoiese, ovulação, menstruação, gravidez e 57 placentação ou qualquer outra doença ou condição em que a invasão ou a angiogénese são patogénicas.
Tendo sido descrita de uma forma genérica a presente invenção, ela será mais facilmente compreendida através da referência aos exemplos que se seguem que são dados a título de ilustração e não pretendem ser limitativos da presente invenção, a menos que especificado. EXEMPLO 1 Síntese de acetil-Lis-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-NH2 O material inicial foi resina de p-metil-benzildrilamina a um nível de 0,70 mEq por grama de resina. Adicionou-se em sequência cada um dos L-aminoácidos, a começar pelo ácido glutâmico, num ciclo de síntese que consiste em três etapas de desprotecção de ATF, acoplamento e bloqueio. O péptido completo foi submetido a clivagem de HF e depois foi purificado.
1. Desprotecção de ATF A resina inicial foi acondicionada antes de adicionar o primeiro ácido glutâmico ou, no caso dos ciclos subsequentes, o grupo de protecção BOC foi eliminado do átomo de azoto do grupo α-amino do material inicial por tratamento da resina com ácido trif luoroacético (ATF) a 50 % no seio de diclorometano (DCM) (dois a três volumes por volume de resina). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos e depois fez-se a drenagem. Lavou-se então a resina uma vez com um volume igual de isopropanol durante um minuto e lavou-se duas vezes com um volume igual de metanol, levando cada lavagem um minuto. 58 2 . Acoplamento
Lavou-se a resina desprotegida duas vezes com um volume igual de trietilamina a 10 % no seio de DCM, levando cada lavagem um minuto e lavou-se duas vezes com um volume igual de metanol, levando cada lavagem um minuto e lavou-se duas vezes com um volume igual de DCM, levando cada lavagem um minuto. Adicionou-se à resina um aminoãcido protegido com BOC (três equivalentes, dissolvidos no seio de DCM ou numa mistura de DCM e N,N'-dimetilformamida (DMF) e 1-hidroxi-banzotriazole (solução 1 M no seio de DMF, três equivalentes) e agitou-se a mistura durante alguns segundos. Adicionou-se então diciclo-hexilcarbodi-imida (DCC) (solução 1 M no seio de DCM, três equivalentes) e agitou-se toda a mistura durante 60-120 minutos. Lavou-se a resina duas vezes com um volume igual de metanol e depois lavou-se duas vezes com um volume igual de metanol e depois lavou-se duas vezes com um volume igual de DCM. Retirou-se uma pequena amostra para um ensaio de ninidrina para avaliar se o acoplamento está completo. Geralmente, se estiver incompleto, repete-se a etapa de acoplamento 2. Se estiver completo, a síntese continua com o a etapa de bloqueio 3.
Todos os aminoácidos foram utilizados como derivados de α-BOC. Os referidos grupos de protecção das cadeias laterais foram os seguintes:
Aminoácido Histidina Asparagina Glutamina Serina Treonina Tirosina
Grupo de protecção
Benziloximetilo
Xantilo
Xantilo O-benzilo O-benzilo
2 -Bromo-Z 59
Aminoácido
Grupo de protecção
Lisina Ácido glutâmico Ácido aspártico 2-Bromo-Z Ciclo-hexilo Ciclo-hexilo 3. Bloqueio
Agitou-se a resina com um volume igual de anidrido acético (solução a 20 % no seio de DCM) durante 5 minutos à temperatura ambiente. Lavou-se a resina duas vezes com um volume igual de metanol e depois lavou-se duas vezes com um volume igual de DCM.
4. Clivagem de HF A resina que comporta a sequência de aminoácidos desejada (1,0 grama) foi colocada num reactor de Teflon e adicionou-se anisol anidro (1 mL) . Arrefeceu-se o reactor com N2 liquido e destilou-se HF anidro nele (10 mL). Fez-se subir a temperatura com água gelada até 0 °C. Ahitou-se a mistura a esta temperatura durante uma hora e depois destilou-se o HF a 0 ° C. Lavou-se o resíduo com éter anidro e extraiu-se o péptido com uma mistura 1:1 de CH3CN : H20. 5. Purificação
Dissolveu-se o pó liofilizado no seio de um tampão de ATF a 0,1 % e aqueceu-se numa coluna preparativa C18 da Waters (2 polegadas de diâmetro, dimensão de partícula de 15-20 pm, dimensão do poro de 300 Â). Eluiu-se a coluna carregada com um eluente de dois componentes aplicado como um gradiente linear, começando com uma solução A a 0 % numa solução B e acabando com 4 0 % de solução A na solução B. A solução A era de ATF a 0,1 % no seio de H20 e a solução B era 60 ATF a 0,1 % no seio de CH3CN. As fracções exibiram uma pureza igual ou maior do que o desejado quando se juntaram e liofilizaram-se para tornar o produto final purificado sob a forma de sal de trifluoroacetato.
EXEMPLO II
Actividade anti-invasiva de KPSSPPEE bloqueada e péptidos relacionados
Analisaram-se vários péptidos quanto à sua capacidade anti-invasiva num sistema de ensaio de invasão de Matrigel® como se indicou antes (Kleinman et al., supra; Parish et al., supra) .
Utilizaram-se as linhas de células de cancro da mama de rato MatBIII e as linhas de células de cancro da próstata humano PC-3. Adicionaram-se as células de tumor (5 x 105/mL, num volume de 200 pL) em meio RPMI 1640 isento de soro a uma câmara de invasão descartável revestida com Matrigel® (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) . As câmaras de invasão foram colocadas em placas de cultura de tecido de 24 micro-tubos cheios com RPMI 1640 isento de soro e colocaram-se as placas numa atmosfera de C02 a 5 % em ar humidificado a 3 7 °C, durante 48-72 horas. Retiraram-se então as câmaras, inverteram-se e as células que estavam invadidas (e que agora apareciam na face do fundo da câmara de invasão), fixaram-se e coraram-se utilizando Diff-Quik® (Scientific Products). Contaram-se as células em 10 campos diferentes em cada filtro e obteve-se uma média. Normalmente fez-se 3-5 replicações para cada concentração de composto ensaiado.
Como se mostra na figura 1, o octapéptido bloqueado, Ac-KPSSPPEE-Am (também designado por Ã6), inibiu a invasão tanto 61 das linhas de células de tumor de rato como humano. Este péptido não era tóxico para as células nem inibiu a proliferação das células. Assim, o efeito observado não foi um efeito colateral de citotoxicidade e podia ser atribuído a um mecanismo de acção distinto do dos agentes citotóxicos e citoestáticos.
Também se realizaram ensaios em péptidos relacionados, bloqueados, mais curtos com a sequência Ac-PSSPPEE-Am (uma variante de eliminação da SEQ ID NO: 2a que faltava a Lis da terminação N) e Ac-KPSSPPE-Am (uma variante de eliminação da SEQ ID NO: 2 a que faltavam os resíduos de Glu da terminação C) . Também se fez o ensaio de um péptido semelhante mais comprido, KPSSPPEELK (SEQ ID NO: 1) (Blasi et al., patente de invenção norte-americana US 5. 416.006) e a sua contra-parte bloqueada Ac-KPSSPPEELK-Am).
Vale a pena notar que todos os péptidos à excepção de Ac-KPSSPPEE-Am mostratam nenhuma ou pouca actividade neste ensaio, indicando que a SEQ ID NO: 2 era a dimensão mínima necessária para a actividade (fig. 2) . Os resultados também indicaram que a adição de Leu e de Lis na terminação C de KPSSPPEE ab-rogou a sua actividade biológica, independentemente do facto de as terminações estarem bloqueadas ou não bloqueadas.
Mostram-se resultados adicionais na figura 3 para os péptidos designados por Á 13 (KPSSPPEE, não bloqueado), à 14 (Ac-KPPSSPPEEL-Am), e À 15, (GGKPPSSPPEE-Am, apenas bloqueado na terminação C) . Nem Á 13 nem à 14 foram inibidores, enquanto que quando se ensaiaram concentrações mais elevadas, Á 15 mostrou a mesma actividade. 62
EXEMPLO III
Inibição da proliferação e da migração das células endote-liais
Realizaram-se estudos para avaliar a actividade do péptido Ã6 como um inibidor da proliferação e da migração das células in vitro. Esses formatos de ensaio podem ser utilizados quer para as células de tumor quer para as células endoteliais. Neste caso, semearam-se as células (20.000 por microtubo) numa placa de 24 micro-tubos. O crescimento das células pode ser estimulado utilizando soro, citocinas ou componentes da matriz que revestem as placas antes da adição das células. Todos os ensaios de proliferação são realizados durante o crescimento da fase logarítmica (normalmente < 70 % de células confluentes) que é estabelecido por determinação das curvas de crescimento para cada linha de células. O volume típico em cada microtubo é de 0,5 mL e muda-se este meio de 48 em 48 horas (incluindo a substituição de quaisquer inibidores que estiverem a ser ensaiados) . No fim do ensaio, lavou-se cada microtubo 3x com STF (0,5 mL por microtubo durante 5 minutos) e determina-se o número de células utilizando um ensaio colorimétrico, tal como o ensaio MTS (Promega) ou CyQuant (Pierce) , de acordo com as instruções do fabricante. Cada condição (concentração de inibidor, dia do ensaio, etc.) ensaiado em triplicado e mostram-se as médias dos microtubos em triplicado.
Neste estudo, as células foram estimuladas com 2 ng/mL de factor básico de crescimento de fibroblasto (FbCF). Os resultados, mostrados na figura 4, indicam que À6 era um inibidor potente da proliferação das células. 63
Os ensaios de migração foram semelhantes aos descritos no exemplo II anterior. As câmaras Transwelle (Costar, dimensão de poro de 8,0 μΜ) foram revestidas com colagénio do tipo I (50 pg/mL) por meio da adição de 200 pL da solução de colagénio por cada "transwell" (um tipo de câmara de invasão) e depois faz-se a incubação durante a noite a 37 °C. Juntaram-se os "transwells" numa placa de 24 microtubos e adicionou-se um agente de quimio-atracção, no caso o FbCF à câmara do fundo num volume total de 0,8 mL em meio F12K complementado com SBF a 10 % e antibióticos. Este é o meio apropriado para as células endoteliais vasculares humanas, mas podem variar para outros tipos de células. As células endoteliais, quando foram destacadas da mono-camada de cultura utilizando tripsina, foram diluídas com meio isento de soro até a uma concentração final de 1 xlO6 células/mL e adicionou-se 0,2 mL desta suspensão à câmara superior de cada "transwell" . Os inibidores de ensaio e o péptido Á 6 foram adicionados tanto às câmaras superior como à inferior e deixou-se a migração prosseguir durante 5 horas numa atmosfera húmida a 37 °C. Retiraram-se os "transwells" da placa e a câmara superior foi limpa e enxuta com um esfregão de algodão. Adicionou-se fixador à câmara superior durante 5 minutos seguido de lavagem (3x5 minutos por lavagem) com STF. Coraram-se as células com Azul de toluidina e contaram-se sob um forte campo energético (400 x) para determinar o número de células que tinham migrado.
Os resultados (figura 5) mostram que, comparados com os controlos de FbCF, a adição de à 6, a concentrações entre 1 e 1000 μΜ, causou de 20-80 % de inibição da migração. 64
EXEMPLO IV
Inibição de angiogénese in vivo por meio de KPSSPPEE bloqueado (o péptido Á 6) e compostos relacionados
Examina-se a angiogénese induzida pelo crescimento do tumor e pelas metãstases in vivo em sistemas de modelos descritos antes. Injectaram-se ratos com células 3 LL, tratados quer com péptidos ou com veículo e sacrificaram-se em diferentes momentos. Avalia-se a angiogénese por determinação da densidade dos micro-vasos (DMV) utilizando um anticorpo específico para o endotélio microvascular ou outros marcadores do crescimentos de vasos sanguíneos, tais como PECAM (CD31). Utiliza-se esse anticorpo em processos imuno-histológicos convencionais para imuno-corar secções de tecido tal como descrito por Penfold et al., supra. Um grande número desses anticorpos está comercialmente disponível, por exemplo, o Acm JC70. A DMV está correlacionada com outras medições do comportamento do tumor incluindo o estado dos nódulos linfáticos e a dimensão do tumor primário e a taxa de crescimento. Nos seres humanos, tal como relatado por Penfold et al. , supra, a DMV do tumor está correlacionada com as metástases dos nódulos linfáticos e é independente da dimensão do tumor, da taxa de crescimento do tumor ou do tipo de diferenciação histológica. Apenas a SMV mostrou uma associação significativa com as metástases dos nódulos linfáticos.
Os compostos são dados i.v., i.p. ou por míni-bomba osmótica. As doses típicas são de 100-250 mg/kg/dia. Em diferentes momentos, sacrificaram-se dois animais e preparou-se o tecido do tumor e o tecido circundante para o exame histológico. Os resultados são reportados como a densidade média dos microvasos de 5 campos, cada um deles de 5 secções 65 diferentes. Ensaiaram-se os sete compostos que se seguem: Ac-KPSSPPEE-Am (SEQ ID NO: 2) , Ac - KPTTPPEE - Am (variante de di-substitutição nas posições 3 e 4), Ac-KPSSPPDD-Am (variante de di-substitutição nas posições 7 e 8), Ac-RPSSPPEE-Am (variante de substitutição na posição 1) , Ac-PSSPPEE-Am (variante de eliminação, posição 1 da SEQ ID NO: 2 eliminada), Ac-KPSSPPE-Am (variante de eliminação, posição 8 da SEQ ID NO: 2 eliminada) , e Ac-KPPSSPPEELK-Am (SEQ ID NO: 1) ·
Obtiveram-se os resultados seguinte. Nos ratos tratados com Ac-KPSSPPEE-Am, Ac-KPTTPPEE-Am, Ac-KPSSPPDD-Am e
Ac-RPSSPPEE-Am, há uma redução significativa no número de micro-vasos na região do tumor primário no sítio de inoculação subcutânea quando comparado com os. Os péptidos Ac-PSSPPEE-Am, Ac-KPSSPPE-Am e Ac-KPPSSPPEELK-Am não têm efeito significativo na angiogénese. Por isso, os quatro compostos indicados têm actividade anti-angiogénica que é responsável, pelo menos em parte, pela sua eficácia como agentes anti-tumor.
EXEMPLO V
Inibição do crescimento do tumor e metástases in vivo por meio de KPSSPPEE bloqueado (o péptido Ã6 e compostos relacionados) 0 sistema de cancro da mama singeneico de ratos utiliza as células de cancro da mama de rato MatBIII. Inoculou-se 1 x 106 células de tumor no seio de 0,1 mL de STF nas almofadas de gordura mamárias de 10 fêmeas de ratos Fisher. No momento da inoculação, implantou-se intraperitonealmente uma mini-bomba osmótica da Alzaq, de 14 dias, para libertar o péptido. Dissolve-se o péptido no seio de STF (concentração de 200 66 mM9, filtrou-se em ambiente esterilizado e colocou-se na mini-bomba para se conseguir a taxa de libertação de cerca de 100 mg/kg/dia. Os animais de controlo receberam apenas veículo (STF) na mini-bomba. Os animais foram sacrificados no 14° dia.
No presente estudo, inocularam-se células MatBIII (Xing ed Rabbani, 1996) (1 xlO5 células no seio de 0,2 mL de STF esterilizado) nas almofadas de gordura mamárias de fêmeas de ratos Físher. Ã6 foi libertado por via de uma infusão contínua utilizando mini-bombas implantadas cirurgicamente ou, numa segunda experiência, por via de administração IP. A dose total (77mg/kg/dia) foi identical em ambos os estudos embora no estudo de IP, os animais receberam metade da dose total em cada injecção IP b.i.d. Os ratos foram sacrificados no 15° dia e examinou-se para avaliar se tinham metástases macroscópicas. Estas metástases, assim como os tumores resultantes da inoculação primária, foram embebidos em parafina e preparam-se secções para análises histológicas e imuno-histoquímica. Os tumores resultantes da inoculação primária foram avaliados utilizando calibradores e as metástases foram avaliadas por simples contagem.
Os resultados do crescimento do tumor primário estão indicados na figura 6. O péptido À6 originou uma inibição altamente significativa do crescimento local do tumor da mama como se pode ver em três momentos. A figura 7 mostra que a disseminação do tumor pelos nódulos linfáticos foi completamente inibida pelo péptido. A análise histológica mostrou que o tratamento com Ã6 induziu a apoptose massiva do tumor, provavelmente através do mecanismo de acção anti-angiogénico, que vai desprover as células de tumor de factores sobrevivência por meio da 67 inibição da formação de novos vasos. Isto é suportado pelo facto de o péptido Á6 não ser citotóxico nem induzir apoptose em células de tumor in vivo.
Noutros estudos ezperam-se os resultados que se seguem. Em ratos tratados com Ac-KPSSPPEE-Am, Ac-KPTTPPEE-Am, Ac-KPSSPPDD-Am e Ac-RPSSPPEE-Am, hã uma redução significativa na dimensão do tumor primário e no número de metástases no baço, pulmões, fígado, rim e nódulos linfáticos (enumerados como focos discretos). De acordo com as análises histológicas e imuno-histológicas, verifica-se que nos animais tratados há um aumento da necrose e de sinais de apoptose. Vêem-se grandes áreas de necrose a que falta a neo-vascularização.
Pelo contrário, o tratamento com os péptidos Ac-PSSPPEE-Am, Ac-KPSSPPE-Am e Ac-KPPSSPPEELK-Am não causou uma alteração significativa na dimensão do tumor ou nas metástases.
EXEMPLO VI
Inibição do crescimento e metástases de células de tumor humanas xeno-enxertadas
Utilizando o modelo descrito antes (ver também Price, supra), inocularam-se células MDA-MB-231 (1 x 105 células no seio de 0,2 mL de Matrigel frio) nas almofadas de gordura mamárias de fêmeas de ratos Balb/C (nu/nu). Deixou-se as células de tumor implantarem-se e crescerem durante 27 dias. No 28° dia começou o tratamento com o péptido Á6. O péptido foi dado b.i.d. por meio de uma injecção IP numa dose de 75 mg/kg/dia. Mediu-se o crescimento do tumor primário de 2 em 2 dias. Sacrificaram-se os ratos no 50° dia e examinaram-se quanto às metástases macroscópicas. Removeram-se os tumores 68 primários e pesaram-se, depois embeberam-se em parafina para avaliação histológica. Observaram-se metástases nos nódulos linfáticos e quantificaram-se por contagem das lesões macroscópicas.
Os resultados estão indicados nas figuras 8 e 9. 0 péptido Ã6 foi altamente efectivo na paragem do crescimento destas células de tumor agressivo (figura 8). Os ratos tratados com o péptido Á6 não tinham metástases macroscópicas em nenhum dos sítios examinados. A quantificação das metástases dos nódulos linfáticos está indicada na figura 9.
Tal como no modelo de ratos, a análise histológica mostrou que o tratamento com Á6 induziu a apoptose massiva das células do tumor que foi mediada por um mecanismo anti- angíogénico.
Assim, concluiu-se que o péptido Ac-KPSSPPEE-Am é um agente anti-cancro potente ao nível do tumor primário e, o que é mais importante para seres humanos, suprime o desenvolvimento de metástases.
EXEMPLO VIII
Inibição de metástases experimentais de células de tumor in vivo
Os compostos de péptidos aqui descritos nos exemplos anteriores são ensaiados para avaliar a sua eficácia in vivo no modelo de 3LL (também descrito antes).
Num outro modelo, as células PC-3 transfectadas com o gene que codifica a enzima cloranfenicol acetil-transferase (CAT) são inoculadas em ratos i.v. em doses de 1 x 69 10e células por rato. Implantam-se mini-bombas nestes ratos, tal como antes, que dispensam 100 mg/kg/dia do péptido ou de veículo durante um período de 14 ou 21 dias. No fim do tratamento, os animais são eutanizados e avalia-se a sonda marcadora do tumor em nódulos linfáticos regionais, fémures, pulmões e cérebro.
Obtiveram-se os resultados que se seguem. Nos ratos tratados com Ac-KPSSPPEE-Am, Ac-KPTTPPEE-Am, Ac-KPSSPPDD-Am e Ac-RPSSPPEE-Am, as metastases foram marcadamente inibidas. Estes resultados indicam que estes compostos interferem com o processo de formação de metastases. Pelo contrário, os ratos tratados com os péptidos Ac-PSSPPEE-Am, Ac-KPSSPPE-Am e Ac-KPPSSPPEELK-Am não reduziram as metástases.
EXEMPLO IX O péptido Ã6 inibe a formação de tubos endoteliais in vitro
Para este ensaio, adicionou-se Matrigel (0,375 mg/mL; 250 gL/microtubo) a uma placa de cultura de tecidos de 24 microtubos e deixou-se gelificar durante 30 min. a 37 °C. Adicionaram-se as células endoteliais a 20.000/micro-tubo em meio F12K/STF a 10 %/antibiótico (ver antes) a estes microtubos revestidos. Adicionou-se um estimulador angiogénico, neste caso o FbCF, a alguns dos micro-tubos do ensaio. Adicionou-se o composto a ser ensaiado quanto à sua actividade inibidora no momento 0 ou pode-se adicionar em qualquer momento posterior. Substituiu-se o meio e os inibidores de 24 em 24 horas se o ensaio durou muito tempo. A formação de tubos foi quantificada pela medição do comprimento total do tubo em cada micro-tubo, utilizando a detecção microscópica.
Os resultados indicaram que o péptido Á6 bloqueou significativamente a formação do tubo endotelial e também promoveu a dissociação dos tubos formados. Isto é mais uma evidência da potência deste péptido e de outros péptidos da presente invenção como agentes anti-angiogénicos.
Documentos citados
No texto anterior cita-se apenas um certo número de documentos (referência completa). Outros, citados abreviadamente no texto, são citados a seguir na sua totalidade.
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Tendo agora descrito completamente a presente invenção, será evidente para os especialistas na matéria que a mesma pode ser realizada dentro de uma vasta gama de parâmetros, concentrações e condições equivalentes sem sair do espírito e do âmbito da presente invenção e sem experimentação desnecessária.
Embora a presente invenção tenha sido descrita em ligação com os seus enquadramentos específicos, deve entender-se que é possível que tenha outras modificações. Este pedido de patente de invenção cobre também quaisquer variações, utilizações ou adaptações da presente invenção seguindo, em geral, os princípios da presente invenção e incluindo as suas variações a partir da presente descrição, desde que esteja dentro das práticas conhecidas e usuais dentro da técnica à qual pertence a presente invenção e como tal pode ser aplicada com as características essenciais 75 estabelecidas aqui antes, tal como se segue no âmbito das reivindicações em anexo.
Lisboa, 16 de Janeiro de 2007 76
Claims (6)
- REIVINDICAÇÕES 1. Péptido de ocorrência não natural caracterizado pelo facto de consistir na sequência Lis-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu (SEQ ID NO: 2), que está bloqueada na terminação N e/ou na terminação C, em que o referido péptido tem uma ou mais das seguintes activi-dades; (a) pelo menos cerca de 20 % da actividade biológica de Ac-Lís-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Am em um ou mais dos seguintes bio-ensaios in vitro: (i) ensaio de invasão io em Matrigel®; (ii) formação de tubo endotelial em Matrigel® ou (iii) formação de tubo endotelial numa matriz de fibrina na presença do factor básico de crescimento do fibroblasto e factor de crescimento endotelial vascular; ou (b) concorre com Ac-Lis-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Am para a ligação a uma célula ou a uma molécula que tem um sítio de ligação para Ac-Lis-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro- Glu-Glu-Am.
- 2. Péptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ser acetilado na terminação amino e amidado na terminação carboxi.
- 3. Péptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o referido péptido ser marcado.
- 4. Péptido de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido péptido se seleccionar entre 1 marcadores radioactivos, fluorogênicos, cromogénicos ou outros marcadores químicos.
- 5. Péptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de o referido péptido estar conjugado com um agente terapêutico.
- 6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender o péptido de acordo com uma qualquer das reivindicações precedentes. Lisboa, 16 de Janeiro de 2007 2
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