PT91971A - Metodo para a producao de camadas epidermicas de cultura - Google Patents

Description

ga«*P.P.....do_jLnvento

Este invento situa—se no campo da cultura de células,, liais especificamente este inventa consiste num método para a cultura de células a fim de formar camadas de epiderme enxertáveis e congelação dessas camadas epidérmicas para utilização posterior»

Fundamentas

Desde tempos imemoriais as feridas da pele graves têm constituído um problema médica importante» Na maior parte dos casos essas feridas sao causadas por queimaduras r, do segundo e terceiro grau» Um problema principal para estas vitimas de feridas da pele consiste em como proteger as áreas lesadas e em como ajudá—las a cicatrizar» Estas feridas podem deixar o doente em estado de choque,, sujeito a insuficiência renal» s altamente suscepiivel a infseção=

Nas vitimas de queimaduras com queimaduras graves frequentemente n'!o subsiste pele suficiente para se conseguir a cicatrização» A pele que subsiste pode ela própria estar lesada sendo por esse motivo incapaz de crescer ràpitíamente = Além disso o organismo pode não ser capaz de sobreviver um período de tempo suficientemente longo sem a protecção proporcionada pela pele tempo esse que permita que a pele se regenere» As vitimas da queimaduras são sspecialments susceptíveis à infecçlos visto que a pele proporciona normalmente a primeira camada de defesa contra os organismos invasivos» Este aspecto pode também constituir um problema noutros tipos de feridas onde a pele é destruída»

Historicamente3 as vitimas dessas feridas devem ser cobertas com ligaduras para ajudar as feridas a fechar e manter

afastados os agentes infecciosos. Contudo, esses processos nunca foram completamente coroados de fxito. Para além disso as ligaduras pedem atrasar o processa de cicatrizaçSo.

Mais rscentefnente, os cirurgiões retiraram porções de pele de porco fazendo enxertos sobre essas feridas. Essas aplicações revelaram-se de certo modo eficazes, mas criaram problemas de rejeição5 porque o organismo humano reage à pele de porco como constituindo imaterial estranho invasor. Mos doentes em que subsistem quantidades de pele suficientes, os chamados enxertos de espessura-fendida podem ser feitos a partir de secções da pele saudável do doente. Contudo, esta técnica cria feridas adicionais ao doente. Também acontece que em muitos doentes com queimaduras a pele saudável que subsista é insuficiente para esse processo.

Mais ou menos nos últimos dez anos, desenvolveu-se a cultura de pele humana para utilização em enxertos. Nos processos conhecidos até ao presente invento, foram submetidas a cultura in vitro pequenas porções de pele a fim de fazer aumentar essas porções até um tamanho necessário para a sua utilização como enxertos. i-ste processo apresenta contudo uma complicação importante., pelo facto das porções as pele deverem ser recolhidas dos doentes em que se pretende realizar os enxertos. Por outras palavras, utilizando esses tecidos apenas se podem realizar auto-enxertos. A razão para esta limitação reside no facto do organismo montar uma resposta imunitária em relação aos alo-en™ xertos (onde a fonte de tecido não pertence ao doente ao qual se vão -aplicar as enxertos), o que leva o organismo do doente a rejeitar o enxerto.

Isto constitui unia limitação importante da. utilidade deste processo de cultura» Em primeiro lugar, muitas vítimas que necessitam de enxertos apresentam grandes pardas de pele na superfície do corpo não tendo por essa razão uma grande fonte de tecido a ser usado cama ponto de partida para o processo» Canse™ quentemente» o tecido disponível deve ser expandido em cultura por este processo, sendo então fragmentado de novo a fim de criar mais material de partida» Esta técnica aumenta o tempo de espera» e desse modo aumenta o risco do doente, antes da realicação dos enxertos»

Além disso, como estes doentes sofreram um grande traumatismo corporal ele necessitam urgentemente de enxertos da pele - quanto mais cedo a pele se encontrar disponível para enxertos, tanto melhor» 0 processo antigo requere par vezes meses antes de se sncontsr disponível suficiente pele para os enxertos» Entretanto, alguns doentes podem morrer devido ao traumatismo corporal ou a infecçoes que se possam instalar»

Um problema adicional com a técnica de cultura de pele existente consiste no facto da pele crescer geralmente não muito uniformemente» Com efeito, essa pele é granulosa e cheia de buracos» Sendo cosméticamente indesejável essa pele é também potencialmente perigosa para o doente» Os buracas proporcionam sítios para infecção por organismos estranhos» Além disso, a pele granulosa é mais susceptivel a rasgar--se por pressão ou extensão»

Um processo utilizado para fazer crescer tecido uniforme consiste em fazer crescer células da pele no topo da matriz da células 3T3» Rheinwald and Green (1975)» As células 3T3 aciuam coma uma causada, para alimentação das células da pele» As células da pele são capazes de crescer até formarem uma mono-camada 9 confluente no topo das células 3Tá, as quais passam a. fazer parte do tecido cutâneo.

Este processo contudo não pode ser utilizado com segurança para. os enxertos da pele» As células 3T3 slo parcial-mente transformadas em células» Isto significa que ela.s são ma.is •susceptiveis a material carcinogénica do que as células não transformadas, podendo mais rápidamente tornar-se cancerosas» Como a pele se encontra constantemente exposta a muitos factorss carcínogénicos, tais como a luz ultravioleta dos raios solares, a presença de células 3T3 nos enxerta de pele pode constituir um real risco de cancro para os doentes»

Outros métodos potencialmente perigosos foram desenvolvidos num esforço para fazer crescer camadas de epiderme macias, uniformes» Foi adicionada toxina da cólera ao meio de cultura dos tecidos a fim de promover o crescimento de queratinocitos (células de queratina)» Green (1978)= Compreensívelmente isto constitui um perigo para os doentes que receberam estes enxertos visto que qualquer toxina residual no tecida quando ele é enxertado pode revelar-se letal, ou pelo menos perniciosa, para o recipiente»

Actua1mente, existe a necessidade de um método para a cultura de camadas de pele que tenha uma textura uniforme e que não leve a uma rejeição por parte do sistema imunitário do doente» Este processo não deve depender de agentes promotores da cancro, tais como células 3T3, nem de agentes químicos perigosos, tais como a toxina da cólera» Seria também desejável -ser possível armazenar essas camadas de pele de modo a se encontrarem disponíveis ao ser necessário realizar enxertos em feridas» Um tal método diminuiria grantíemente o risco dos doentes, potencialmente \ \

salvando muitas vidas ds vítinsas de queimaduras e de outras feridas graves da peie*

Resumo do Invento

Este invento proporciona um método para a cultura e armazenamento de camadas ds epiderme a serem utilizadas em enxertos ds pele» Apresenta várias vantagens em relação aos métodos descritos anteriormente» Neste método as células podem ser feitas crescer até se obter uma camada relativamente uniformes sem buracos nem grânulos» Assim este método proprociona uma camada protectora de pele ma is duradoura e mais protectora do que as anteriormenie disponíveis»

Este método também não utiliza qualquer matriz suhdsr-mica* tal como uma camada que proporcione alimento de células 3T3» Conssqusntemente,: este método cria um risca muito menor de formação de cancro em comparação com os outros processos descritos» Este método também não se apoia em agentes químicos perigo-soss tais como a toxina da cólera» apresentando desse modo um menor risco de doença ou ds morte para o doente»

Este método também ultrapassa a possibilidade de rejeição do enxerto pelo sistema imunitário do doente» Consequsn-temente» camadas de epiderme podem ser feitas crescer a partir de tecidos a partir ds fontes diferentes do recipiente do enxerto» Isto permite um tremendo aumento no material de partida* e consequentements um tremendo aumento no fornecimento de camadas epidérmicas para enxertos»

Este método proporciona um meio para armazenamento prolongado das camadas de epiderme» Consequentemente* as camadas ds epiderme encontram-se ràpidamente disponíveis para utilização imediata eia vítimas necessitando de enxertos de pele» Essa disponibilidade rápida vai diminuir o traumatismo nas vitimas protegendo-as também contra a infecção» Conseguir-se-á uma cicatrizaçlo muito mais rápida das feridas da pele»

Descrido Detalhada

Este invento tem sete passos» Mo passo 1» as células são preparadas para cultura primária» Mo passo 2 as culturas primárias são subdivididas (são feitas passagens). Mo passo 3 estas sub-cu1turas são feitas crescer até se obter monocamadas confluentes na presença de FCE ífactor de crescimento da epiderme)» Mo passo 4 o meio é removida? e a monocamada cresce obtendo--se múltiplas camadas de epiderme» No passo 5 as camadas de epiderme resultantes são congeladas e armazenadas» No passo 6 α tecido congelado é descongelado» No passo 7 o tecido de epiderme cultivado é utilizado num doente como enxerto de pele» Os passos um a quatro constituem modificaçSes do processo de Pittslkow and Scott (1986), cuja apresentação ê aqui incorporada como referência»

No passo um? o material de partida é obtido para crescimento das camadas de epiderme» Serve qualquer fonte de tecido epidérmico» tal como pele não danificada que subsista do doente que vai receber o enxerto» No exemplo, são u.sadas peles dos prapúcios ds seres humanos do sexo masculino adultos saudáveis, â medida em que se vão tornando disponíveis» é importante notar que a fonte do tecido não necessita de ser o doente que vai receber o enxerto de camadas epidérmicas cultivadas» 0 tecido da pele é então separado nos seus dois componentes» epiderme e derme, incubando o tecido numa solução digestiva» A derme é eliminada» As células da epiderme são então

separadas umas das outras» Isto pode ser realizado por maio da qualquer processo convencional para o início de culturas primárias» tal como digestão posterior do tecido» No exemplo5 o tecido é pcsteriormente digeridof sendo então separado etn células únicas por meio de cisalharoento numa pipeta»

Um importante elemento deste invento é constituído por um método para a preparação de recipientes para a cultura de tecidos a serem usados para o crescimento de queratinocitos» Tal como foi indicado anteriormente? muitos investigadores tentaram técnicas para ajudar os queratinocitos a ligarem-se às placas de cultura e a crescerera, com um 'êxito apenas parcial» Nalguns casos as camadas não eram uniformes% noutros casos foram usados materiais perigosos»

Este invento utiliza um processo de revestimento dos recipientes de cultura com colagénio do tipo I para auxiliar a aderência e o crescimento» Uma solução estéril de colagénio do tipo I ê colocada na placa de cultura e é em seguida vaporizada» dando origem a um revestimento de colagénio do tipo I sobre a superfície de crescimento» As placas são então reesteriliçadas por irradiação antes da utilização»

As células separadas são então cultivadas em HCDB Í53 ou em qualquer outro meio de cultura celular apropriado sem soro» Isto permite que as células da cultura, primária se dividam e se multipliquem » 0 passo dois permite uma posterior amplificação do número de células» Este passo não é necessário para o crescimento de placas epidérmicas» mas permite que as células formem uma pequena porção de tecido a ser usado para produção de um grande número de camadas epidérmicas» Neste segundo passo» as células *

s!g armazenadas a partir d-s cultura primaria» Isto pode ser realizado por métodos normalizados» No exemplo, as células são digeridas s em seguida pipetadas a fim de formarem suspensões de células únicas» Estas células são então divididas de modo a. que as células de uma placa de cultura primária possam agora semear muitas placas para. crescerem até à conflufncia»

Este processa de divisão é chamado uma passagem celular» Diferentes tipos de células primárias podem ser submetidas a passagem várias vezes sem morrerem» No exemplo, queratinocitos de prepucios humanos podem ser submetidos a passagens até quatro vezes a fim de aumentar o material de partida para o crescimento d e mon oc am ad a»

No passo trás do invento» células primárias ou submetidas a passagem são feitas crescer a partir de suspensões de células únicas até se obter monoeamadas confluentes nas placas de cultura» Estas células são feitas crescer na presença do (FCE) factor de crescimento epidérmico e na ausáncia de 5orD5 em qualquer meio de cultura celular apropriado» Na exemplo^ utili-zou-se meio MCDB 153 completo,! contendo níveis elevados de vários amino ácidos» 0 meio é suplementado com FCE entre õnq/ml s 5Θ ng/ml„ No exemplo usou-se 1Φ ng/ml, 0 FCE permite que as células continuem a dividir-se para além do ponto em que elas deixariam de se dividir na ausência de FCE» Assim» cresce uma monocamada uniforme de células na presença de FCE»

Neste passo5 as- células são feitas crescer de até cerca de 80% de confluência até trás dias após a confluência» No exemplo,, o período de tempo preferido é aquele em que as células atingem 100% de confluência» Quanto menor for a conflufncia da monocamada.! maior será a probabilidade do tecido resultante se rasgar. Depois das células atingirem a conflufncia elas podem ser mantidas durante alguns dias. Em seguida as células começarão a isarrsr, ciando pontos fracos na lonocaiiiada.

Realiza-se então o passo quatro. 0 meio é desviado para meio de cultura contendo soro, com ou ssm FCE. No exemplo, utilizou-se meio de Eagle modificado por Dulhecco <DMEM) suplementado com soro de vitelo fetal (SVF) a 10%. Serve qualquer meio de cultura de células apropriado. A concentração do soro de vitelo fetal pode ter um valor tio baixo como 5%^ contudo as células nesse caso vão crescer muito lentamente. Acima de 2w% o custo do soro de vitelo fetal torna-se um factor inibitório. 'Neste passo a monocamada de células cresce até uma camada de células epidérmicas, com uma espessura de cerca de seis a doze camadas, Este crescimento leva quatro a cinco dias num meio com 10% de SVF. Esta camada epidérmica tem uma espessura uniforme e é capaz de imitar a pele nativa quando usada como enxerto.

Quando examinada com o microscópio electrónico, a camada epidérmica tinha α aspecto da tecida normal. As estruturas celulares nas trãs ou. quatro camadas inferiores pareciam normais. Os elementos celulares*. tais como ribosomas livres, tonofibri-lhas, e mitocondrias encontravam—se espalhados pelo citoplasma. Os núcleos das células apresentavam um formato ovoide com membranas lisas do contorno nuclear. Desmosomas com estrutura regular entre as junções célula a célula encontravam-se também presentes tal como na pele nativa. Mas duas camadas de topo de células, distribuiam-se irregularmente no citoplasma estruturas fibrilares normais.

Foram também coradas s visualizadas pelo microscópio óptico células das camadas epidérmicas. Este teste revelou que as células apresentavam um número normal de cromosamas (,í3 pares nas células humanas)*

Amostras de camadas epidérmicas feitas crescer deste modo foram testadas quanto a carcinoganicidade em ratinhos nús. Os ratinhos nús apresentavam sistemas imunitários comprometidos sendo assim especiaimente susceptiveis aos agentes carcinogáni-eos, Ratinhos que receberam injecçSes de células dastas camadas epidérmicas não revelaram qualquer evidência de tumores após cinco meses, 0 tecido foi ainda examinado quanto ao tipo celular em vários estádios de crescimento. As células foram coradas com marcadores fluorescentes de anticorpo a fim de detectar proteinas produzidas especificamente por vários tipos de células da pele, As células foram entSCo examinadas num microscópio de fluorescência, Este revelou que as camadas apresentavam cerca de 99% de pureza, contendo o tipo de célula isolada para o crescimento-inicial, No exemplo o tecido tinha cerca de 99% de queratinoci-tos,

Esta pureza celular constitui um factor importante para a eliminação da rejeição imunitária do tecido num doente que recebeu um enxerto de pele. Isto deve-se provávelmente ao facto dos queratinocitos nao expressarem o principal complexo humano da histocompatibilidade. Consequentemente, os queratinocitos não são reconhecidos pela organismo do doente como material estranho, e o sistema imunitário- do doente não é chamado a lutar contrai novas células.

Este- invento reconhece pela primeira vez esta falta de resposta imunitária. Consequentemente, este invento -permite que o tecido em cultura seja usado como aloenxerto em doentes que não sejam os indivíduos dos quais se colheu o tecido original* Este invento permite assim a cultura cie quaisquer células epidérmicas que não expressem o principal complexo de histocompatibilidada, tais como os melariocitos» 0 passo cinco do invento proporciona uma maneira de armazenar camadas epidérmicas de modo a se encontrarem disponíveis para utilização imediata quando surge a necessidade de aplicar enxertos de pele* Neste passo o tecido é libertado da placa de cultura» Primeiro o meio de cultura é retirado das camadas de células e é substituída com soluto de digestão #3» Esta soluto é constituído por aproximadamente 1-1&% de Dispase em solução salina ou maio tamponados com fosfato (PBS). 0 tampo de incubação dependerá do grau de concentração e do elemento no qual Dispase astâ dissolvido* Uma concentração demasiadamente elevada cu uma incubação demasiadamente prolongada levarão as ligações interceiulares a quebrarem-se, dissolvendo o tecido em células individuais» Mo exemplo, Dispase é dissolvido numa concentração de 1¾ em PBS, e α tecido ê incubado durante uma a duas horas» Isto liberta o tecido da placa de cultura»

Após esta digestão a solução de digestão á eliminada e substituída com solução para congelação» A finalidade desta solução consiste em proteger o tecido de lesões que poderiam ser causadas por cristais de gelo nas células» Assim utiliza-se uma solução que não forme esses cristais» As soluções para congelação utilizadas para suspensões- celulares podem ser usadas- para congelar o tecido» A solução para congelação pode conter dimetil sulfóxido CDHSO) numa concentração de 3-10%, de preferência 5%, e qlicerol numa concentração de 5-20%, de preferência 20%» Estes- são dissolvidos no meio de cultura recente (fresco)» A solução da congelação é então adicionada ao tecido lavado na placa de cultura, e a placa é selada para evitar derramamento e/ou contaminação» Om método para selar consiste em envolver a placa com uma película de parafina» A placa é então submetida a uma diminuição gradual na temperatura desde a temperatura ambiente até -I35C» Isto pode ser realizado incrementadamente, por SKemplo colocando a placa num congelador a -2£C durante várias horas, seguindo-se um congelador a -70C durante a noite, e por último transierindo a placa para um congelador a -Í35C» Um método melhor consiste em colocar a placa num congelador que começará è temperatura ambiente s que diminuirá 1 C por minuto até se atingir -135 C= Esta diminuição gradual da temperatura ajuda a evitar a formação de cristais de gelo*

As camadas de epiderme congeladas podem ser armazenadas a -135 C durante pelo menos dois anos» Quando descongeladas estas camadas são tão funcionais como as camadas feitas crescer recen-tsmente» 0 passo seis do invento é realizado por meio de descongelação rápida das camadas epidérmicas congeladas» As placas de cultura seladas são transferidas do congelador para um banho de água a 37 Cs na apresentação preferida do invento» Também serve um incubador, ou de ar ou de água, entre 3© C e 4® C= Contudo, os incubadores de ar não conduzem o calor tão rápidamente como os banhos de água, e os incubadores abaixo de 37 C também vão descongelar o tecido mais lentamente» Um incubador que esteja demasiadamente quente (acima de 4Θ C) pode sobreaqaseer as células»

Quando a solução para da cultura fundiu, as camadas congelação no interior da placa de tecido estão descongeladas» *

Estas camadas flutuaria na solução para congelação* Esta solução é então substituída por meio de cultura fresco» e em seguida por solução salina tamponada com fosfato <PB3)» As camadas epidérmicas encontram-se agora prontas para o passo sete*

Mo passo sete as camadas de epiderme são usadas para enxertos de pele no espaço de vinte e quatro horas após terem sido descongeladas* 0 meio é removido por um processo estérily tal como por sucção* Coloca-se então gaze esterilizada sobre a camada? a qual vai aderir à gaze* 0 tecido é então colocado» com o lado da gaze voltado para cima5 sobre a ferida* 0 tecido irá enxertar-se automáticamente na pele adjacente*

Estas camadas epidérmicas podem ser usadas para auto— enxertos ou aloenxertos* Testes em seres humanos revelaram até agora uma completa ausfncia de rejeição quando usados como aloenxertos* Pensa-se que este invento proporciona pela primeira vez uma solução completamente coroada de ©xito para o problema da rejeição imunitária dos aloenxertos*

Exemplo

Este invento usa o método tíe Pittelko^ and Scott C198Ó) tal como é aqui modificado*

Os prepúcios foram obtidos a partir de seres humanos do sexo masculino adultos jovens por circuncisão* Os espécimes foram completamente esterilizados s em seguida cortados em pequenas porções numa placa de petri em condições de esterilidade* As porções das amostras foram tripsinizadas com tripsina a ©»17% durante 1.©—12 horas a 4°C» A ' epiderme delgada.;, translúcida foi separada da sua derme subjacente levantando a epiderme com uma pinça estéril* A epiderme foi pósteriormente tratada com tripsina a ô,/5 % durante 1-2 horas a 3/°C e pipetada para uma suspensão de células isoladas* As células viáveis da epiderme foram contadas com um hemocitorneiro»

As placas ds cultura ds tecido foram revestidas com colagénio do tipo I» Meio milímetro de uma solução a ®?1% foi __ 2 colocado em cada placa de /'o cm » A solução foi saca por evaporação da água durante tr?s dias numa cobertura ds fluxo laminar* As placas foram então resterilicadas por irradiação numa fábrica especialisada neste processo» ã o

As células foram semeadas a 5x10 ‘ células viávsis/cm'~ em ífisio MCDB 153 completo» Este meio é idêntico ao usado por Pitielkow and Scott excsptuando o facto de se ter substituída a extracto de glandula pituitária porcina <140-160 mg proteina/ml) por extracto de glandula pituitária bovina» 0 restante processo de cultura é igual ao de Pittslkow and Scott»

Depois do tecido ter sido libertado da placa da cultura com Dispases uma parte dele foi congelada» 0 tecido a ser congelado foi lavada com DMEM frescas e a meia de cultura foi substituído com DtlEM contendo DMBO a 5¾ s glicerol a 20%» A placa foi selada com película de parafina e colocada num congelador especial » 0 tecido foi arrefecido de um modo incrementado numa taxa da -1C por minuto até atingir -135°C= 0 tecido foi então armazenado durante dois anos a -Í35°C»

As placas de cultura foram removidas do congelador e α tecido foi rápidamente descongelado colocando placas seladas num banho de água a 37°C» Quando o meio funde e o tecida flutua9 a descongelação está completa» A solução para congelação foi então eliminada do tecido com DMEM fresco» s substituída com PBS» 0

tecido foi então incubado a 3/°C até ser utilizado* o que aconteceu antes das 24 horas após a descongelação* A gaze esterilizada foi aplicada à superfície da tecido5 e o tecido foi transferido directamente para uma ferida desbridada5 limpa* 0 tecido aderiu automàticamente à ferida* Tr@s dias mais tarde a gaze foi removida* 0 tecido passou então a fazer parte da ferida em cicatrização* Qualquer tecida ultrapassando a pele nativa secou e caiu? não deixando qualquer marca na beira da ferida* Doze meses mais tarde ainda nlo havia sinais de rejeição*

Deve ser compreendido que o presente invento não se limita às apresentações especificas indicadas anteriormente=, mas abrange todo o âmbito das reivindicações apensas*

Claims (9)

1. :ac 1Ê- — Método oara a cultura de csx u 1 as- epidérmica^ iTiõiiT: IL t* (5 r”C?S 3.0 I*~Q priaoas para aloenxsrtos c :aractsr i· ρΟι prsend&r os pa ssos ds g «·*< n d e 5s n v o 1 v imento das células sm rsci pientes tra com colaçénio do tipo I na ausência de SQrO :: na presenç factor de crs sc x nisn c o epidérmico U-uE)3 _ Λ. . cá Ler cíp roKimadamen confluência? d» Deslocação do meio para meio contendo soros c = dssenvo 1 vimento do tecido at# uun cirande nómsr caisiaua®; '3 — Método ds acordo com a. reivindicação 1 >dc 3 por -as cêiu1as serem q ygf\£. ti. nQC i toS ( cé 1 u 1 q u e r a ε i n a.)« icordc 2-sdo por a fonte de células ser constituída pela ds 1 e humana
2. 41 - Método ds acordo com a reivindicação 1 carac zada por a fonte de células ser constituída por prepúcios nos = Método de acordo com a reivindicação zadu pur o Kt variar sn tr entre 1 © no/mi e 40 n g / m 1, e O ’ iQ/ffi «. S ·_<%? siy/ίΐιΐ j Ge Laf «aU or&f&r com a maior orsfsrfncis 1© nq/mI= ψ \

   6ã ~ Método de acordo com a reivindicação i caracteri-zado por o colagénio revestir os recipientes ds cultura a cerca _ O ds mg e mg por /5 cm"" ds recipiente5 de preferencia a ©»5 __ 7 mg por /o cm „ 7â - Método de acordo com a reivindicação i carseieri— zado por o meio ds crescimento sem soro ser iiCDB 153 modificado,, 8â - Método de acordo com a reivindicação 7 caracteri-zado par a extracta da glandula pituitária porcina substituir o entracto da glandula pituitária bovina» 9â - Método para armazenar camadas epidérmicas de cultura de acordo com o processo da reivindicação 1 para enxertos de pele caracterizado por compreender os passos dsg a» libertação das camadas epidérmicas de cultura dos recipientes de culturas b- ·„ c on. g e 1 aç ão 5 c» armazenamento durante um certo período de tempo§ s d. descongelação rápida» !0â - Método de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por as camadas epidérmicas de cultura serem submetidas a digestão com Dispase a fim de as libertar do recipiente» 1lã - Método de acordo com a reivindicação 1® caracterizado por a Dispase ser usada a 1-1β% durante 1-2 horas» 12* - Método de acordo com a reivindicação 9 csrsctsri-zado por as camadas epidérmicas de cultura serem colocadas numa solução de congelação sendo em seguida expostas a diminuições i n cremsn tad as da temperatura«
3. 131 - Má todo de acorda cam a reivindicação 12 caracte-rizado por a solução de congelação ser o meio ds cultura de tecidos contendo 3-1θ% de sulféxido de dimetila CDM80>3 ds preferencia DMSO a 5%? e contendo 5~2Θ% de glicerol? de preferencia 20% de glicerol*
4. 141 - Método de acordo com a reivindicação 12 caracte— risada por as casadas epidérmicas de cultura serem colocadas a aproximadamente -2@°C durante um certo período de tempo? ds preferência 1-2 horas? e em seguida a aproximadamsnte -7©C'C durante um certo período de tempo? de preferência durante a noite? sendo então transferidas para aproKimadamente ”135°C.
5. 151 - Método de acordo com a reivindicação 12 caracte-risada por as camadas epidérmicas serem colocadas num congelador cuja temperatura desce aproximadamente 1°C por minuto? até aprox iroadamen te -135C'C
6. 161 - Método de acordo com a reivindicação 9 caracteri-zado por as camadas epidérmicas de cultura congeladas serem armazenadas desde i hora até pelo menos 2 anos»
7. 171 - Método ds acordo com a reivindicação 9 caracteri-zado por as camadas epidérmicas de cultura congeladas serem descongeladas a de preferência a 37°CS
8. 181 - Método de acordo com a reivindicação 9 caracteri-zado por as camadas epidérmicas de cultura congeladas sarem descongeladas num incubador de ar ou de água? de preferência um incubador de água»
9. 191 - Método para usar camadas epidérmicas de cultura preparadas de acordo com o processa da reivindicação 1? ψ

   caractsrizado por as referidas camadas serem transferidas para feridas como enxertos de pele, 2®â - Método de acordo com a reivindicação Í9 csracte-rizado por o meio de cultura do tecido ser meio de Eagle modificada por Dulbecco COMEM) =, 2iê — Método de acordo com a reivindicação i caracteri-zado par as células serem feitas crescer até cerca da 8©% de confluência e 3 dias de pós—conflufncia? de preferência até i®@% de confluência» 22S - nétodo de acordo com a reivindicação i caracteri-zado por o segundo meio de crescimento ser qualquer meio normalizado contendo soro tal como DMEML 23ã - Camadas epidérmicas da cultura caracterizadas por serem produzidas de acordo com o método da reivindicação 1= 24â - Camadas epidérmicas de cultura caracterizadas por serem usarias para enxertos de pele no método descrito na reivindicação 19 = 25S - Método de acordo com reivindicação 19 caracteri-zado par a referida enxerto sre um alaenxerta» 2&S - Método de acordo com a reivindicação 19 caracts-rizado por a referida camada epidérmica ser congelada s descongelada = ψ

   V .·' Método ds acordo com a reivindicação 19 csracts- . yDí ocar uãcs ssobre a reter ida (.amada para a rsnr ao mexo para a tsritía, 5 *L iwi eJ I- í-/ (

   J. PEREIRA DA CRUZ Agonie Oílsiá da PrsprMasu hvàistriíl I RUA VICTOH CGíffi®N, 10-A, 1.» 1200 USBGA