NO334974B1 - Keratinocyter, produkt, fremgangsmåte for frysekonservering av keratinocytter, samt anvendelse av keratinocytter - Google Patents

Abstract

Det beskrives nye keratinocytter som kan dyrkes in viti-o, samt den fordelaktige anvendelse av disse til fremstilling av et produkt som kan benyttes for behandlingen av akutte og kroniske sår.

Description

Oppfinnelsen vedrører nye in vitro dyrkbare keratinocytter og deres fordelaktige anvendelse til fremstilling av et produkt som kan brukes til behandling av akutte og kroniske sår. Oppfinnelsen er således gjort på det medisinske området, spesielt området sårbehandling, ved hjelp av Tissue Engineering.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for frysekonservering av de ovennevnte keratinocytter.

Allogene keratinocytter har med hell lenge vært benyttet til behandling av sår, særlig av byller og/eller forbrenninger (Maier, 1993; Schonfeld er al., 1993). Sår som over lengre tid viser seg motstandsdyktige overfor behandling med vanlige terapier, lar seg meget ofte behandle ved anvendelse av allogene keratinocytter (Phillips & Gilchrest, 1993; Beele et al, 1991; Leigh et al., 1991; Lindgren er al., 1998). Til å begynne med var oppmerksomheten ved anvendelsen av allogene keratinocytter i første rekke rettet mot huderstatninger, dvs. regenereringen av den transplanterte epidermis. Det viste seg imidlertid snart at hell med terapien primært beror på stimuleringen av kroppens egen reepitelialisering og ikke på en «tilvoksing» av det allogene celletransplantat i såret. Tallrike undersøkelser har vist at de transplanterte keratinocyttene bare forblir i såret en bestemt tid og deretter elimineres usynlig fra kroppen (Kawai er al., 1993). Stimuleringen av kroppens egen sårtilheling skjer også primært via en romlig og tidsmessig optimal frigjøring av en rekke ulike vekstfaktorer, cytokiner, ekstracellulær matriks (ECM), små molekyler og proteaser, gjennom de allogene keratinocyttene (Lang et al., 1996; Marcusson et al., 1992). Kompleksiteten og de mange frigjorte faktorer er grunn til den terapeutiske fordel fremfor vanlige enkeltterapier, f.eks. med isolerte vekstfaktorer. Ved siden av hovedeffekten ved reepitelialiseringen opptrer det ved behandling med keratinocytter imidlertid også makroskopisk og mikroskopisk påvisbare endringer i granulasjonsvevet (Lang er al., 1996). En ytterligere, for pasienten velgjørende og ofte beskrevet effekt ved keratinocyttene, er den utpregede analgesi etter transplantasjon (Schonfeld et al., 1993).

For sårbehandlingen er anvendelsen av udifferensierte, delingsaktive keratinocytter fordelaktig, idet delingsaktive keratinocytter synes å råde over en kompleks utsondringsprofil som begunstiger sårtilheling. Med unntak av stamcellene taper udifferensierte keratinocytter in vivo deres proliferasjonspotensiale i løpet av den naturlige differensiering allerede etter noen får celledelinger, en prosess som hittil alltid har vært iakttatt ved in vitro dyrkningen av keratinocytter (Barrandon & Green, 1987). Følgelig lar de delingsaktive keratinocytter som hittil har vært særlig egnet for sårtilhelingen seg bare dyrke in vitro, noe som gjør deres medisinske anvendelse krevende og kostbar.

De allogene keratinocyttene benyttes enten direkte i form av såkalte «keratinocytt-folier», som består av en flersjiktet, enzymatisk løsnet celleansamling eller sammen med bioforlikelige bærere under betegnelsen «biologisk aktive sårtilhelingskompresser». Sistnevnte har den fordel at cellene ikke må forbehandles enzymatisk, idet de før anvendelse løsnes fra kulturskålsubstratet. Dessuten muliggjør anvendelsen av bioforlikelige membraner som bærere til dyrkning av keratinocytter (EP 0 462 462, US 5.658.331; US 5.693.332; EP 0518 920) en tidsmessig tidligere klarering av de biologisk aktive sårtilhelingskompresser, siden cellene ikke lenger må danne noen sluttet celleaggregat. Det kan allerede benyttes subkonfluent bevokste bærere til cellebehandlingen. Foruten en tidligere tilgjengelighet har anvendelsen av subkonfluente celleaggregater dessuten den fordel at tilsvarende dyrkede keratinocytter er mindre sterkt differensiert og således er fordelaktig for behandling av sår.

Keratinocytter kan uten uheldig effekt for sårtilhelingen frysekonserveres direkte eller i forbindelse med bioforlikelige bærermaterialer ved temperaturer mellom -30 og -196°C, men fortrinnsvis mellom -70 og -90°C (De Luca er al., 1992; Teepe er al., 1993). Dette har forbedret deres terapeutiske anvendelighet ytterligere, idet biologisk aktive sårtilhelingskompresser til en viss grad lar seg fremstille som forråd.

Som kjent teknikk skal det også nevnes DE 19917532 og PELLEGRINI G. et al, Location and Clonal Analysis of Stem Cells and Their Differentiated Progeny in the Human Ocular Surface, The Journal of Cell Biology, 1999, Vol. 145 (4), side 769-782.

De hittil kjente keratinocytter så vel som biologisk aktive sårtilhelingskompresser som er fremstillet av disse, har så langt hatt visse ulemper, og formålet med foreliggende oppfinnelse har vært å overvinne disse.

En åpenbar ulempe ved de hittil kjente keratinocytter av primær opprinnelse består i at de nevnte celler ved in vitro cellekulturmetoder bare tillater fordobling av noen får cellegenerasjoner uten derved å tape deres høye delingsaktivitet og dermed deres foretrukne egnethet til fremstilling av biologisk aktive sårtilhelingskompresser. I henhold til teknikkens stand er det for fagmannen kun mulig å øke celleantallet ved hjelp av in vitro dyrkning med ca. 10<3>til 104 ganger (Tanczos er al., 1999).

En ytterligere ulempe som forårsakes av dette er at den begrensede dyrkbarhet in vitro gjør en hyppig og krevende ny isolering av de nevnte keratinocytter nødvendig, hvilket igjen medfører at det oppnådde og formerte cellematerialet ikke er enhetlig og de sårtilhelingskompressene som er fremstillet av disse vil derfor med høy sannsynlighet oppvise, eller kan i det minste oppvise, kvalitetsforskjeller.

En ytterligere ulempe er at nyisoleringen av keratinocyttene fra forskjellige donorer utgjør en øket infeksjonsrisiko for mottageren av sårtilhelingskompressen. Eksempelvis tenkes det her på en høyere HIV- og hepatittrisiko.

Gjenstand for oppfinnelsen er keratinocytter som er kjennetegnet ved at de ikke er immortalisert og kan replikeres minst 150 ganger ved in vitro cellekulturmetoder og at de er celler fra kulturen KC-BI-1 (DSM ACC 2514), eller keratinocytter avledet derfra, hvor nevnte keratinocytter

a. ikke kan replikeres i fravær av føtalt kalveserum og/eller

b. i fravær av mateceller og/eller

c. i fravær av epidermal vekstfaktor (EGF), og hvor telomeraseaktiviteten av nevnte keratinocytter er lavere enn den til cellelinjen HaCaT med en faktor på minst 2, og hvor avledede keratinocytter er celler og kulturer som er og/eller kan dannes ved sub-passering og/eller sub-kloning av den originale kulturen KC-BI-1 (DSM ACC 2514).

Dette resulterer i en celleformering på omtrent 10<44>ganger. De tilsvarende keratinocytter beholder herunder deres fordelaktige egenskaper for behandlingen av sår.

For keratinocyttene ifølge oppfinnelsen dreier det seg primært om in vitro dyrkbare keratinocytter isolert fra en donor, hvor isoleringen og den første dyrkning kan foretas av fagmannen, for eksempel i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Rheinwald & Green 1975.

Oppfinnelsen vedrører keratinocytter som isoleres fra den epidermale del av en forhud. Keratinocytter av human opprinnelse av kulturen KC-BI-1 ,ble deponert 27. juni, 2001, ved

DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Tyskland, under tilgangsnummer DSM ACC2514, i henhold til Budapestavtalen. Oppfinnelsen omfatter også slike keratinocytter som er avledet av kulturen KC-BI-1 (DSM ACC2514). Gjenstand for oppfinnelsen er således alle celler og kulturer som ved subpassasje og/eller subkloning utvikler og/eller kan utvikle den opprinnelige kultur KC-BI-1.

Dyrkningen av keratinocyttene i henhold til oppfinnelsen er eksemplifisert for keratinocyttene KC-BI-1 (Eksempel 1). For dyrkningen er anvendelsen av det komplekse medium som er angitt i Eksempel 1, samt anvendelsen av mateceller (feeder cells) fordelaktig, fortrinnsvis anvendelsen av letalt bestrålte murine 3T3 fibroblaster. Andelen føtalt kalveserum bør utgjøre mellom 2 og 10%. Fremstillingen av matecellene vil være kjent for fagmannen, og kan f.eks. foretas i henhold til fremgangsmåten angitt i Eksempel 2. Særlig fordelaktig er i så henseende sub-kultiveringen av keratinocyttene ifølge oppfinnelsen ved en maksimal konfluens på 80%. Keratinocyttene lar seg dyrke ved 35 til 38°C, fortrinnsvis ved 37°C, en luftfuktighet på >90%, fortrinnsvis 95% og en C02-metning på 5 til 9%.

Ved fremgangsmåten angitt under Eksempel 1 utgjør fordoblingstiden av keratinocyttene, mellom 1 og 2 dager (Figur 1). Cellene kan derved dyrkes over adskillige passasjer med tilnærmet konstant fordoblingshastighet (Figur 2). Foreliggende oppfinnelse er imidlertid ikke begrenset utelukkende til keratinocyttene KC-BI-1, tvert i mot er det for fagmannen mulig å gjennomføre oppfinnelsen under tilsvarende betingelser med alle keratinocytter i henhold til patentkrav 1.

Uttrykket «ikke immortalisert» betyr i sammenheng med foreliggende oppfinnelse at primært isolerte keratinocytter så vel som de keratinocytter som her holdes i kultur, ikke spontant er transformert og/eller transformert gjennom molekylærbiologiske, kjemiske og fysikalske fremgangsmåter kjent fra dagens forskning. Sistnevnte betyr at cellene ikke er behandlet verken ved anvendelse av f.eks. virale faktorer eller sekvenser, kjemisk mutagene substanser, eller f .eks. ved bestråling eller en kombinasjon av forskjellige fremgangsmåter.

Keratinocytter som «ikke er immortalisert» betyr også at de nevnte keratinocytter sammenlignet med transformerte tumorcellelinjer (Hårle-Bachor & Boukamp, 1993) eller sammenlignet med immortaliserte cellelinjer, fortrinnsvis til cellelinjen HeLa, oppviser ingen eller en vesentlig mindre telomeraseaktivitet (sml. Figur 3). Dette gjelder særlig også sammenlignet med den immortaliserte keratinocytt-cellelinjen HaCat.

Uttrykket «ikke immortalisert» betyr videre at de nevnte keratinocytter ikke kan fordobles i fravær av føtalt kalveserum og/eller ikke i fravær av mateceller og/eller ikke i fravær av epidermal vekstfaktor (EGF, epidermal growth factor) slik som eksempelvis mulig for immortaliserte keratinocytter (Schoop et al., 1999).

Uttrykket «ikke immortalisert» betyr også at de nevnte keratinocytter ikke endrer deres karakteristiske fenotype med tiltagende cellefordobling (sml. Figur 4).

Videre betyr «ikke immortalisert» også at de nevnte keratinocytter etter transplantasjon på nakne mus, fortrinnsvis BALB/c-mus, oppviser en normal differensieringsprofil. «Normal differensieringsprofil» betyr her keratinocyttenes evne til å utvikle seg til terminalt differensierte keratinocytter og suprabasale epidermale sjikt, samt å danne autologe keratinocytter tilsvarende stratum corneum. Gjenstand for oppfinnelsen er også slike keratinocytter som ikke er immortalisert og som lar seg fordoble minst 200 ganger gjennom in vitro cellekultur. Oppfinnelsen vedrører videre keratinocytter som ikke er immortalisert og som lar seg fordoble minst 250 ganger gjennom in vitro cellekultur. Oppfinnelsen vedrører dessuten også slike keratinocytter som ikke er immortalisert og som lar seg fordoble minst 300 ganger gjennom in vitro cellekultur.

Foreliggende oppfinnelse muliggjør den fordelaktige formering av nevnte keratinocytter ved å gå ut fra kun én donor. Ved å gå ut fra én donor kan det eksempelvis etter 150 cellefordoblinger, fremstilles 10<44>, etter 250 cellefordoblinger 10<77>og etter 300 cellefordoblinger fremstilles 1090celler. Derved gjør oppfinnelsen det for første gang mulig å stille til disposisjon store mengder standardisert cellemateriale for fremstilling av biologisk aktive sårtilhelingskompresser med uforanderlig og kontrollerbar kvalitet. En tilsvarende mengde standardisert cellemateriale lar seg f.eks. formere ved å gå ut fra en frysekonservert cellebank, som igjen fremstilles av keratinocytter som har egenskapene ifølge oppfinnelsen.

Med anvendelsen av standardisert cellemateriale som utgangsmateriale for fremstillingen av biologisk aktive sårtilhelingskompresser minskes også infeksjonsrisikoen for den eventuelle mottager, siden isoleringen av keratinocyttene begrenser seg til én donor.

Dermed unngår man ved den foreliggende oppfinnelse vesentlige ulemper som for tiden består i den begrensede passeringsmulighet av de hittil kjente keratinocytter.

Gjenstand for oppfinnelsen er dessuten et produkt som består av en bærer som er belagt med keratinocyttene ifølge oppfinnelsen, hvor bæreren er delvis bevokst med keratinocytter, eller hvor bæreren er fullstendig bevokst med keratinocytter. En delvis bevokst bærer er særlig egnet, siden det trengs en kortere dyrkningstid før nevnte bærer kan anvendes til sårbehandling.

En egnet bærer i henhold til oppfinnelsen kjennetegnes ved at det dreier seg om bioforlikelig bærermateriale som kan benyttes til fremstilling av et legemiddel. Slike er for eksempel hydrofobe bioforlikelige bærermaterialer, som f.eks. de som er beskrevet i WO 91/13638. Det kan imidlertid også benyttes bærermaterialer med overveiende hydrofile egenskaper.

En foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelsen av bærermaterialer som består av en polymer av forestret hyaluronsyre. Ved en særlig foretrukket utførelsesform er det tale om en polymer av forestret hyaluronsyre som består av en perforert polymerfolie med definert geometri. Polymerfolien har eksempelvis en tykkelse på 10 til 500 |am og er gjennomhullet av hull med en størrelse på mellom 10 og 1000 |am, hvor hullene har en definert og konstant størrelse og danner en ordnet rekke, hvor de er adskilt fra hverandre ved en konstant avstand på 50 til 1000 |j.m. En tilsvarende folie er beskrevet i EP 0 462.426. Perforerte bærermaterialer er særlig godt egnet siden de ikke fordrer noen rettet pålegging av den biologisk aktive sårforbinding på såret. I Eksempel 3 beskrives fremstillingen av en perforert bærermatriks av forestret hyaluronsyre med definert geometri som er bevokst med keratinocytter ifølge oppfinnelsen. Med bærermatriks er det tale om et produkt som i Tyskland omsettes under produktnavnet «Laserskin» fra firma Fidia Advanced Biopolymers Ltd., Abano Terme, Italia.

De særlig foretrukne forutsetninger av dette bærermaterialet til fremstilling av en biologisk aktiv sårkompress i kombinasjon med keratinocytter er allerede påvist på en dyremodell (Lam er al., 1999) og på mennesker (Harris er al., 1999). Ved siden av en forbedret migrasjon og differensiering av de epiteliale cellene har matriksen som består av hyaluronsyreester, en positiv effekt på angiogenesen og kollagenproduksjonen. De sårkompresser med hyaluronsyreester som matriks som for tiden benyttes, er imidlertid belagt med autologe keratinocytter og/eller komplekst - oppbygde hudekvivalenter av keratinocytter og fibroblaster. For disse gjelder således de ovenfor beskrevne ulemper ved teknikkens stand. Disse ulempene kan særlig overvinnes gjennom anvendelsen av de fordelaktige allogene keratinocyttene ifølge oppfinnelsen.

En ytterligere foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er et produkt som består av keratinocyttene ifølge oppfinnelsen sammen med resorberbare polymerer bestående av polyester, polykarbonater, polyanhydrider, polyortoester, polydepsipeptid, polyeterester, polyaminosyrer eller polyfosfazen, særlig av poly(L-laktid), poly(D,L-laktid), poly(L-laktid-co-D,L-laktid), poly(glykolid), poly(L-laktid-co-glykolid), poly(L-laktid-co-trimetylenkarbonat) eller poly(dioksanon). De nevnte polymerer er så vel perforerte som uperforerte.

Foreliggende oppfinnelse vedrører likeledes en fremgangsmåte for frysekonservering av keratinocyttene ifølge oppfinnelsen ved en temperatur på -20°C til -196°C, foretrukket ved en temperatur på -60°C til -80°C. De nevnte keratinocyttene lar seg innfryse etter standardiserte fremgangsmåter alminnelig kjent for fagmannen. Som kryoprotektant kan bl.a. DMSO benyttes. I tillegg er anvendelsen av andre kryoprotektanter, som f.eks. glycerol, hydroksyetylstivelse eller en kombinasjon av disse to, samt en kombinasjon av disse med DMSO, mulig. Tilsvarende fremgangsmåter er angitt i WO 96/24018, US 5.891.617 eller også i US 5.298.417.

Gjenstand for foreliggende oppfinnelse erogsåfrysekonserveringen av bæreren belagt med keratinocyttene i henhold til oppfinnelsen, som kjennetegnes ved at keratinocyttene med tilsvarende bærer frysekonserveres ved en temperatur på -20°C til -196°C, fortetrukket ved -60°C til -80°C. Frysekonserveringen har den fordel at det i store mengder fremstilte produkt kan lagres og før dets medisinske anvendelse, stikkprøvemessig kan undersøkes med henblikk på jevn kvalitet. Endelig gjør lagringen det også mulig å stille de nevnte sårtilhelingskompresser til disposisjon for medisinske formål i løpet av kort tid.

Som kryoprotektant for produktet ifølge oppfinnelsen er eksempelvis hydroksyetylstivelse i en konsentrasjon på 7-13 vekt% egnet. Det er imidlertid også mulig å benytte DMSO eller glycerol i likhet med en kombinasjon av forskjellige kryoprotektanter, spesielt av hydroksyetylstivelse, DMSO og/eller glycerol. Dessuten er også anvendelsen av trehalose som kryoprotektant mulig.

Etter en hurtig temperatursenkning fra 37°C til -5 til -10°C, fortrinnsvis -6 til -8°C, i løpet av 2-5 minutter, ekvilibreres produktet av bærer og keratinocytter ifølge oppfinnelsen ved tilsvarende temperatur i 15-30 minutter, fortrinnsvis i 23-26 minutter. Deretter avkjøles produktet med en innfrysningshastighet på <1°C/minutt, fortrinnsvis fra 0,2 til 0,6°C/minutt, særlig foretrukket fra 0,4°C/minutt, til en temperatur på f.eks. -60 til -80°C.

Eksempel 4 beskriver frysekonserveringen av en bærermatriks av hyaluronsyreester belagt med KC-BI-1. Det er imidlertid også mulig at andre fremgangsmåter for frysekonservering kan benyttes, f.eks. fremgangsmåten beskrevet i WO 95/707611, WO 96/24018, EP 0 296 475, hvor denne oppregning ikke er å forstå som fullstendig, men bare peker på at fremgangsmåten for frysekonservering av produkter bestående av bioforlikelige bærere og keratinocytter tilhører teknikkens stand.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også den medisinske anvendelse av de her beskrevne keratinocytter ifølge oppfinnelsen og/eller det beskrevne produkt av nevnte keratinocytter og en bærer, særlig anvendelsen til behandling av sår. En utførelsesform av oppfinnelsen utgjør anvendelsen av keratinocytter i henhold til oppfinnelsen og/eller produktet av nevnte keratinocytter og en bærer, ved behandlingen av forbrenninger og/eller ulcus. Når det gjelder forbrenninger som kan behandles dreier det seg fortrinnsvis om forbrenninger av andre grad, når det gjelder ulcus, fortrinnsvis om kroniske vanskelig tilhelende skinneleggssår av typen ulcus cruris, fortrinnsvis ulcus cruris venosum, eller også om diabetiske ulcerasjoner i tillegg til liggesår.

Den medisinske anvendelse omfatter også en kombinert og/eller supplerende anvendelse av de nevnte keratinocytter og/eller produktet av keratinocytter og bærer ifølge oppfinnelsen av klassiske kjente terapier med positiv effekt på sårtilhelingen. Med dette menes en kombinert og/eller supplerende anvendelse av ett eller flere andre stoffer med positiv virkning for sårtilheling. Eksempelvis kan det her nevnes den supplerende og/eller kombinerte behandling av ulcus cruris venosum med hydrokolloidkompresser og/eller en supplerende anvendelse av antimikrobielle substanser, eksempelvis administrering av antibiotika.

Gjenstand for oppfinnelsen er likeledes anvendelsen av keratinocyttene og/eller produktet av en bioforlikelig bærer og de nevnte keratinocytter ifølge oppfinnelsen til fremstilling av et medikament til behandling av sår, særlig til behandling av forbrenninger og/eller ulcus, som f.eks. til behandling av forbrenninger av andre grad, ulcus cruris ( venosum), diabetiske ulcerasjoner eller liggesår.

Til behandling av nevnte sår, hvor keratinocyttene ifølge oppfinnelsen og/eller produktet av keratinocytter og bærer ifølge oppfinnelsen pålegges de sår som skal behandles, kan nevnte keratinocytter og nevnte produkt kan enten benyttes friskt eller etter frysekonservering. En tilsvarende fremgangsmåte for sårbehandling er beskrevet under Eksempel 5.

Beskrivelse av figurene

Fig. 1: Cellefordoblirtg av keratinocyttene KC-BI-1 i avhengighet av dyrkningstiden. Antall cellefordoblinger (CPD=Cumulative Population Doublings) av keratinocyttene KC-BI-1 over en dyrkningstid på 94 dager er angitt. I løpet av de observert 94 dager fordobler cellene seg omtrent 75 ganger. Det tilsvarer en midlere fordoblingstid på 1,25 dager per cellefordobling, eller 12,5 per 10 dager. Fig. 2: Fordobling av keratinocyttene KC-BI-1 over et tidsrom på 10 måneder. Cellefordoblingen av keratinocyttene KC-BI-1 over 10 måneder, angitt som populasjonsfordoblinger (PD) i avhengighet av cellepassasjene 1-67, er angitt.

Fig. 3: Bestemmelse av den relative telomeraseaktivitet.

Den relative telomeraseaktivitet for keratinocyttene KC-BI-1 etter passasje 1,12,18, 40 og 57 sammenlignet med aktiviteten av cellelinjen HeLa, er angitt. Figuren viser for keratinocyttene KC-BI-1 nesten ingen, resp. kun en svak, telomeraseaktivitet sammenlignet med den immortaliserte cellelinje HeLa.

Fig. 4: Morfologi av keratinocyttene KC-BI-1 etter passasjen 5 og 60.

Keratinocyttene KC-BI-1 viser i lysmikroskopbildet, ingen morfologiske forskjeller mellom cellepassasje 5 (dyrkningstid 25 dager) og cellepassasje 60 (dyrkningstid 300 dager).

Utførelseseksempler

Eksempel 1: Fremgangsmåte for dyrkning av keratinocyttene ifølge oppfinnelsen med kultur KC-BI-1 (DSM ACC 2514) som eksempel

1. Materiale

Keratinocytter KC-BI-1; bestrålte 3T3-musefibroblaster (mateceller, for fremstilling

se Eksempel 2); cellekulturmedium KM (for sammensetning se nedenfor); EDTA (0,02%); trypsin/EDTA (0,05%/0,01%); cellekulturflasker (T-flaske); 25 cm<2>, 80 cm<2>,175 cm<2>.

2. Opptining av cellene

2.1 Opptining av matecellene

Cellene opptines løpende og tilsettes til 5-10 mL forvarmet K/1-medium. En tilsvarende mengde mateceller overføres til en egnet cellekulturflaske og tilsettes K/1-medium:

25 cm<2>T-flaske 0,5x10<6>celler; sluttvolum av medium: 5-6 mL

80 cm<2>T-flaske 1,5x10<6>celler; sluttvolum av medium: 20 mL

175 cm<2>T-flaske 3,5x10<6>celler; sluttvolum av medium: 50 mL

Matecellene kan benyttes umiddelbart eller innen 24 timer.

2.2 Opptining av keratinocyttene

Cellene opptines løpende og tilsettes til 5-10 mL forvarmet K/1-medium. En tilsvarende mengde celler tilsettes til cellekulturflaskene forberedt med mateceller og oppfylles med friskt medium:

25 cm<2>T-flaske 0,15x10<6>celler; sluttvolum av medium: 6-10 mL

80 cm<2>T-flaske 0,4x10<6>celler; sluttvolum av medium: 20 mL

175 cm<2>T-flaske 1x10<6>celler; sluttvolum av medium: 50 mL

3.0 Dyrkning

Inkubering av cellene skjer ved 35-39°C, fortrinnsvis ved 37°C. Luftfuktigheten utgjør

>90%, fortrinnsvis 95%, og C02-konsentrasjonen 5-9%. Keratinocyttene dyrkes i subkultur til en maksimal konfluens på 80%.

I den anledning kasseres cellesupematanten. Matecellene løses etter 2 gangers spyling med 0,02% EDTA (2-10 mL) og en inkubasjon i 5-10 minutter ved 37°C, ved påfølgende avbanking (eller ved risting) av cellekulturflasken. Deretter løses keratinocyttene etter en trypsin/EDTA-behandling (0,05%/0,01%, 1-6 mL) i 5-10 minutter ved 37°C, forsiktig ved avbanking. Om nødvendig løsnes de øvrige cellene forsiktig med en celleskrape. Trysin/EDTA-løsningen nøytraliseres ved tilsetning av K/1-medium, og cellene isoleres ved forsiktig opp- og ned-pipettering. Celleutsåingen foretas med det celleantall som er angitt under 2.2. Cellekulturmediet K/1 skiftes fra dag 3 og deretter annenhver dag.

4.0 Fremstilling av K/1-mediet

Alle komponenter samt stamløsninger tilsettes etter hverandre i henhold til rekkefølgen angitt i Tabell 1. Porsjonen fylles opp til 1 liter med WFI ( water for injection). Deretter innstilles pH med NaOH eller HCI på 7,0 til 7,2. Osmolariteten bør utgjøre mellom 320-400 mOsm/kg. Til slutt sterilfiltreres mediet K/1.

4.1 Fremstilling av stamløsningene

Trijodthyronin

13,6 mg trijodthyronin løses i 1 mL 0,1 M NaOH og tilsettes 99 mL PBS. Den bruksferdige løsning fortynnes 1:100 i PBS. Per liter medium trenger man 1 mL av denne løsning.

EGF

1 mg EGF løses i 100 mL WFI. Per liter medium trenger man 1 mL av denne løsning.

rh-insulin (bare løselig ved pH <4,0)

5 g rh-insulin tilsettes til 0,9 L WFI og pH innstilles på 2,5 med 6M HCI. Etter at rh-insulinet har løst seg, innstilles pH på 8,0 med 1M NaOH. Denne porsjon fylles opp til 1 liter med WFI. Per liter medium trenger man 1 mL av denne løsning. 4.2 Mediesammensetning

Dyrkingen av cellene kan imidlertid også skje ved å gå ut fra et ferskt biopsimateriale, eksempelvis ved å gå fra den epidermale del av en forhud. Primærisoleringen av de udifferensierte, prolifererende keratinocyttene kan herunder foretas etter fremgangsmåten beskrevet av Rheinwald & Green 1975.

Som mateceller kan de cellene som er beskrevet under Eksempel 2 benyttes. Dessuten kan det tenkes benyttet andre, letale fibroblaster, fortrinnsvis anvendelsen av andre murine fibroblaster, særlig foretrukket, avkom av cellelinjen 3T3.

Eksempel 2: Fremstilling av bestrålte 3T3 mateceller til dyrkning av keratinocytter

1. Materiale

Murine 3T3 fibroblaster (f.eks. ATCC CCI 92, 3T3- Swiss albino, contact- inhibited fibroblasts) kan anskaffes fra American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USA, DMEM + 10% føtalt kalveserum (FCS); PBS; 0,2% trypsin-løsning; 0,04% EDTA-løsning; cellekulturflasker (T-flasker): 25 cm<2>, 80 cm<2>,175 cm<2>.

2. Opptining av cellene

Celler opptines løpende og tilsettes til 5-10 mL forvarmet medium. DMSO-holdig medium fjernes etter sentrifugering. Celler suspenderes i 5-10 mL medium. Etter bestemmelse av celleantallet utsås cellene i en tetthet på 10<3>til 104 celler/cm<2>i egnede cellekulturflasker. Inkuberingen skjer ved 35-39°C, fortrinnsvis ved 37°C. Luftfuktigheten utgjør >90%, fortrinnsvis 95%, og C02-konsentrasjonen ligger ved 5-9%.

3. Dyrkning av cellene

Cellene undersøkes daglig med henblikk på vekst. Celletettheten bør Ikke overskride en maksimal konfluens på 70-80%. Dyrkningen i subkultur skjer erfaringsmessig fra annenhver til fjerdehver dag. I den anledning kasseres mediet og cellene vaskes med en passende mengde av en 1:2 blanding av EDTA og trypsin (0,5-5 mL). Deretter tas de fraløste celler opp i 3,5-20 mL medium. Cellene utsåes på nytt i en tetthet på 10<3>til 104 celler/cm<2>.

4. Bestråling av matecellene

Bestrålingen av matecellene skjer med en dose på ca. 60 Gy (6000 rad i en<137>Cs-kilde). Så vel de bestrålte som de ubestrålte cellene kan i henhold til standardprotokoller, frysekonserveres i flytende nitrogen og oppbevares over lengre tid.

Eksempel 3: Fremgangsmåte for belegging av en bærermatriks; her Laserskin,

med keratinocytter av kulturen KC-BI-1 (DSM ACC 2514)

I det følgende beskrives som eksempel fremstillingen av biologisk aktive sårtilhelingskompresser i henhold til oppfinnelsen. Den her beskrevne sårtilhelingskompress består av keratinocyttene KC-BI-1 ifølge oppfinnelsen og Laserskin, en bioresorberbar bærermatriks av hyaluronsyreester.

Oppfinnelsen er ikke begrenset til den her beskrevne kombinasjon. Tvert i mot kan det til beleggingen benyttes alle keratinocytter som har egenskapene ifølge patentkrav 1.

Dessuten kan anvendelsen av andre egnede bærermatrikser tenkes, forutsatt at det er tale om et bioforlikelig bærermateriale som kan benyttes til fremstilling av et legemiddel. For eksempel kan hydrofobe bioforlikelige bærermaterialer som f.eks. beskrevet i WO 91/13638, anvendes. Dessuten kan imidlertid også bærermaterialer med hovedsakelig hydrofile egenskaper benyttes.

En ytterligere foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er anvendelsen av keratinocyttene ifølge oppfinnelsen sammen med resorberbare polymerer bestående av polyester, polykarbonater, polyanhydrider, polyortoester, polydepsipeptid, polyeterester, polyaminosyrer eller polyfosfazen, særlig av poly(L-laktid), poly(D,L-laktid), poly(L-laktid-co-D,L-laktid), poly(glykolid), poly(L-laktid-co-glykolid), poly(L-laktid-co-trimetylenkarbonat) eller poly(dioksanon), samt anvendelsen av perforerte folier som består av de nevnte polymerer.

1. Materiale

K/1-medium (sml. Eksempel 1); PBS, 0,04% EDTA (fortynnes med PBS til 0,02%); trypsin/EDTA (0,05%/0,01%); sterile Roux-skåler (T 25 cm<2>, T 80 cm<2>, T 175 cm<2>), Laserskin (Fa. Fidia Advanced Biopolymers sr1, Abano Terme, Italia) i 144 x 21 petriskåler (145 cm<2>areal); 3T3-mateceller; keratinocytter ifølge oppfinnelsen, som for eksempel KC-BI-1.

2. Dyrkning av den biologisk aktive sårtilhelingskompress

2.1 Materiale

Bestrålte mateceller, f.eks. de under Eksempel 2 nevnte murine 3T3 fibroblastene; keratinocytter ifølge oppfinnelsen fra stamløsningen; 8,5 cm x 8,5 cm store Laserskin-stykker i en petriskål (ferdigprodukt); K/2-medium.

2.2 Utsåing av 3T3 matecellene

Matecellene fremstillet i henhold til Utførelseseksempel 2, anbringes i en utsåingstetthet på 15.000 til 25.000 celler/cm<2>(tilsvarer ca. 3 x 106 celler/petriskål) på Laserskin. Petriskålen inkuberes deretter ved >90% luftfuktighet og 5-11% C02, fortrinnsvis 7-9%, i et 37°C varmeskap ved 35 til 37°C. Keratinocyttene utsåes enten samme dag eller senest neste dag (etter 24 timer) på matecelleplenen.

2.3 Utsåing og dyrkning av keratinocyttene

Den biologisk aktive sårtilhelingskompress fremstilles med keratinocyttene ifølge oppfinnelsen. Dyrkningen i subkultur av keratinocyttene kan eksempelvis foretas som beskrevet i det følgende: De subkonfluente kulturene spyles én gang med 0,02% EDTA (80 cm<2>Roux-skål: 8 mL; 175 cm<2>Roux-skål: 10 mL). Deretter inkuberes matecellene med 0,02% EDTA i 5-10 minutter ved 37°C (80 cm<2>Roux-skål: 8 mL; 175 cm<2>Roux-skål: 10 mL) og løsnes ved forsiktig risting.

Keratinocyttene løses deretter i henhold til Utførelseseksempel 1 med en trypsin/EDTA-blanding (0,05%/0,01%) (80 cm<2>Roux-skål: 2-3 mL; 175 cm<2>Roux-skål: 5-6 mL), tas deretter opp i cellekulturmedium (80 cm<2>Roux-skål: 7-8 mL; 175 cm<2>Roux-skål: 14-15 mL) og isoleres ved forsiktig opp- og ned-pipettering.

Keratinocyttene ifølge oppfinnelsen anbringes i en utsåingstetthet på ca. 15.000 til 25.000 celler/cm<2>(tilsvarer ca. 3 x 106 celler/petriskål) på Laserskin-folien preparert med matecellene. Deretter inkuberes cellene til en konfluens på 30-100%, fortrinnsvis 80-100%, ved 35-39°C, fortrinnsvis ved 37°C. Luftfuktigheten utgjør >90%, fortrinnsvis 95%, og C02-konsentrasjonen ligger ved 5-9%.

Eksempel 4: Fremgangsmåte for frysekonservering av den biologisk aktive sårtilhelingskompress ifølge oppfinnelsen

Etter en tilvoksing av keratinocyttene til bærermatriksen med en konfluens på 30-100%, fortrinnsvis 80-100%, kan produktet ifølge oppfinnelsen innfryses i egnede beholdere, f.eks. sveisbare PP-poser. I den anledning fjernes kulturmedium forsiktig og byttes ut med 20 mL 2-6°C kaldt innfrysingsmedium K/2. Produktet pakkes deretter sterilt og innfryses i henhold til det etterfølgende program:

Etter en hurtig temperatursenkning til -5 til -10°C, fortrinnsvis -6 til -8°C, i løpet av 2-

5 minutter, ekvilibreres produktet ved tilsvarende temperatur i 15-30 minutter, fortrinnsvis i 23-

25 minutter. Deretter avkjøles produktet med en innfrysningshastighet på <1°C/minutt, fortrinnsvis på 0,2 til 0,6°C/minutt, særlig foretrukket 0,4°C/minutt, til en temperatur på f.eks. -60 til -80°C. Lagringen av produktet skjer ved -60 til -80°C.

K/2-innfrysningsmedium:

K/1-vekstmedium (sml. Eksempel 1) tilsatt 7-13 vekt% hydroksyetylstivelse.

Eksempel 5: Eksempel på anvendelse av en bærermatriks bevokst med

keratinocytter ifølge oppfinnelsen til å dekke sår, med

ulcus cruris venosum som eksempel

1. Transport av friskt fremstilte sårtilhelingskompresser

Etter vekst av keratinocytter til 30-100%, fortrinnsvis 80-100% konfluens på Laserskin, spyles kulturen med en egnet mengde, fortrinnsvsi 30 mL, K/3-transportmedium én eller flere ganger. Den biologisk aktive sårtilhelingskompress transporteres i egnet mengde, fortrinnsvis i 20 mL K/3-tramsportmedium. Tomrommet av petriskålen spyles en liten stund med en luftblanding med 5-10% C02, lukkes med et klebebånd, f.eks. Parafilm, og bringes omgående til klinikken i en transportboks.

K/3-transportmedium:

Vekstmedium K/1 (sml. Eksempel 1) uten føtalt kalveserum (FCS). Også anvendelsen av en enkel fysiologisk saltløsning, f.eks. på fosfat-borat-basis, f.eks. PBS eller også på HEPES- (N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etansulfonsyre) eller MES-basis ([2-N-morfolino]etansulfonsyre), kan også tenkes.

2. Transport av frysekonserverte sårtilhelingskompresser

Frysekonserverte sårtilhelingskompresser kan typisk leveres til klinikkene på tørris. Det kan imidlertid også tenkes en annen transportform, så lenge sårtilhelingskompressene transporteres ved en temperatur på under -60°C. Den frysekonserverte sårtilhelingskompress opptines løpende. Deretter fjernes innfrysningsmediet og kompressen med K/3-transportmedium (sml. ovenfor) eller en annen egnet fysiologisk løsning, f.eks. Ringerløsning, spyles én eller flere ganger.

3. Terapeutisk anvendelse

Kompressen legges deretter på såret. Ved anvendelsen av ikke perforerte bærermaterialer trengs en korrekt pålegging av sårtilhelingskompressen med cellene i retning av såret. Anvendelsen av perforerte bærere som muliggjør en bærer bevokst på begge sider med keratinocytter (f.eks. Laserskin) fordrer ingen korrekt pålegging av sårtilhelingskompressen på det sår som skal behandles. Alt etter behandlingsresultatet kan behandlingen gjentas flere ganger.

Eksempel 6: Genetisk karakterisering av keratinocytt- cellen KC-BI-1 (DSM ACC 2514)

KC-BI-1-celler ble dyrket i subkultur over flere passasjer etter den ovenfor beskrevne fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen. Celler fra passasje 4,13 og 121 ble deretter underkastet en genetisk analyse, hvor lengdepolymorfismen av 15 forskjellige loci ble undersøkt (CSF1PO, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, FGA, Penta D, Penta E, TH01, TPOX og vWA). Analysen ble foretatt i henhold til kjent teknikk. I den forbindelse ble de tilsvarende alleler amplifisert under anvendelse av en test til farskapsbestemmelse (PoewerPlex® 16 System) fra firma Promega (Mannheim, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Allelene kan identifiseres ved bestemmelse av fragmentlengden (lengdestandard ILS 600 er bestanddel av de ovennevnte sett). Angivelser av allelhyppigheten i befolkningen finnes i de tilsvarende tabeller. Analysen har gitt en overensstemmelse av samtlige alleler på samtlige loci for alle analyserte cellepassasjer. Dataene muliggjør således en genetisk klassifiserin av KC-BI-1-cellene. Utfra allelhyppigheten ble det fastslått en klassifiserings-sannsynlighet på >99,999%.

Bestemmelse av DNA-lengde polymorfismen:

Litteratur:

Beele H; Naeyaert JM; Goeteyn M; De Mil M; Kint A (1991): Repeated cultured epidermal allografts in the treatment of chronic leg ulcers of various origins. Dermatologica, 183(1)31-5.

De Luca M; Albanese E; Cancedda R; Viacava A; Faggioni A; Zambruno G; Giannetti A (1992): Treatment of leg ulcers with cryopreserved allogeneic cultured epithelium. A multicenter study. Archives of Dermatology, 128 (5) 633-8.

Hårle-Bachor C; Boukamp P (1993) Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes. PNAS 93; 6476-6481

Falanga V et al. (1998): Rapid Healing of venous ulcers and lack of clinical rejection with an allogeneic cultured human skin equivalent. Archives of Dermatology, 134, 293-300

Harris PA; Di Franncesco F; Barisoni D; Leigh IM; Navasaria (1999): Use of hyaluronic acid and cultured autologous keratinocytes and fibroblasts in extensive burns. Lancet, 353, 35-36

Kswai K, Ikarashi Y et al. (1993): Rejection of cultured keratinocyte allografts in persensitized mice.

Transplantation 56: 265-269

Lam PK; Chan ESY; Edward WH et al. (1999): Development and evaluation of a new composite Laserskin graft. J. of Trauma: Injury, Infection and Critical Care, 47; 918-922

Lang E; Schåfer BM; Eickhoff U; Hohl HP; Kramer, M D; Maier-Reif K (1996): Rapid Normalization of epidermal integrin expression after allografting of human keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology, 107, 423-427

Leigh IM; Navsaria H; Purkis PE; McKay I (1991): Clinical practice and biological effects of keratinocyte grafting. Annals of the Academy of Medicine, 20 (4)

Lindgren C; Marcusson JA; Toftgard R (1998): Treatment of venous leg ulcers with cryopreserved cultured allogeneic keratinocytes: a prospective open controlled study. British Journal of Dermatology, 139 (2) 271-5.

Maier K (1993): Transplantation von in vitro Epidermis - Chancen and Risiken. Quintessenz 3:289-304

Phillips TJ; Gilchrest BA (1989): Cultured allogenic keratinocyte grafts in the management of wound healing: prognostic factors. Journal of Dermatologic Surgery and Oncology, 15 (11) Reinwald, JG and Green (1975): Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell 6, 331-344.

Schonfeld M; Moll I; Maier K; Jung EG (1993): Keratinozyten aus der Zellkultur zur Therapie von Hautdefekten. Hautarzt, 44:281-289

Schopp VM; Mirancea N; Fusenig NE.(1999): Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human dermal Fibroblasts. J. Invest. Dermatology 112.343-353

Tanczos E; Horch RE; Bannasch H; Andree C; Walgenbach KJ; Voigt M; Stark GB (1999): Keratinozytentransplantation and Tissue Engineering. Neue Ansatze in der Behandlung chronischer Wunden. Zentralbl Chir 124 Suppl 1 , 81-86

Teepe RGC; Roseeuw Dl; Hermans J.; Koebrugge EJ; Altena T; De Coninck A; Ponec M; Jan Vermeer B (1993): Randomized trial comparing cryopreserved cultured epidermal allografts with hydrocolloid dressings in healing chronic venous ulcers. Journal of the American Academy of Dermatology, 29/6 (982-988).

Wagner G; Horch R; Debus M; Tanczos E; Jiao XJ; Saied S; Stark G.B. (1997): Human keratinocytes cultured subconfluent on esterified hyaluronic acid membranes for resurface full thickness nude mice wounds. European Journal of Cell Biology, 74, No.47, pp. 61.

Claims (18)

1. Keratinocytter,karakterisert vedat at de ikke er immortalisert og kan replikeres minst 150 ganger ved in vitro cellekultur metoder og at de er celler fra kulturen KC-BI-1 (DSM ACC 2514), eller keratinocytter avledet derfra, hvor nevnte keratinocytter a. ikke kan replikeres i fravær av føtalt kalveserum og/eller b. i fravær av mateceller og/eller c. i fravær av epidermal vekstfaktor (EGF), og hvor telomeraseaktivitet av nevnte keratinocytter er lavere enn den til cellelinjen HaCaT med en faktor på minst 2, og hvor avledede keratinocytter er celler og kulturer som er og/eller kan dannes ved sub-passering og/eller sub-kloning av den originale kulturen KC-BI-1 (DSM ACC 2514).

2. Produkt,karakterisert vedat det består av en bærer som er belagt med keratinocytter ifølge krav 1, a. hvor bæreren er delvis bevokst med keratinocytter; eller b. hvor bæreren er fullstendig bevokst med keratinocytter.

3. Produkt ifølge krav 2, hvor bæreren er et biokompatibelt bærermateriale som kan anvendes for å fremstille et farmasøytisk preparat.

4. Produkt ifølge krav 3, hvor bærermaterialet er en hydrofob eller hydrofil bionedbrytbar membran.

5. Produkt ifølge krav 3 eller 4, hvor bæreren er en polymer av forestret hyaluronsyre, foretrukket en perforert polymerfilm med definert geometri, hvor polymerfilmen har en tykkelse fra 10 til 500 um og er perforert med hull som måler mellom 10 og 1000 um, hvor hullene har en definert, konstant størrelse og danner en ordnet rekke, hvor de er adskilt fra hverandre med en konstant avstand på 50 til 1000 um.

6. Produkt ifølge krav 3 eller 4, hvor bærermaterialet er polyester, polykarbonater, polyanhydrider, polyortoestere, polydepsipeptider, polyeterestere, polyaminosyrer eller polyfosfazener, a. særlig poly(L-laktid), poly(D,L-laktid), poly(L-laktid-ko-D,L-laktid), poly(glykolid), poly(L-laktide-ko-glykolid), poly(L-laktid-ko-trimetylen- karbonat) eller poly(dioksanon), b. hvor nevnte polymerer er perforert eller c. er ikke perforert.

7. Fremgangsmåte for frysekonservering av keratinocytter ifølge krav 1 eller et produkt ifølge krav 2 til 6,karakterisert vedat keratinocytter eller produktet frysekonserveres ved en temperatur fra -20°C til -196°C, foretrukket ved -60 til -80°C.

8. Keratinocytter ifølge krav 1 eller produkt som omfatter keratinocytter og bærer ifølge krav 2-6, som har eller som har blitt behandlet ved fremgangsmåten ifølge krav 7.

9. Keratinocytter ifølge krav 1 og 8 eller produkt ifølge krav 2-6 for medisinsk anvendelse.

10. Anvendelse av keratinocytter ifølge krav 1 og 8 eller produkt ifølge krav 2-6 for fremstilling av et medikament for behandling av sår.

11. Anvendelse ifølge krav 10, hvor sårene foretrukket er forbrenningen og/eller ulcus.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvor sårene foretrukket er andre grads forbrenninger.

13. Anvendelse ifølge krav 11, hvor sårene foretrukket er kroniske, vanskelige å hele, skinnleggssår av typen Ulcus cruris, foretrukket Ulcus cruris venosum.

14. Anvendelse ifølge krav 11, hvor sårene foretrukket er ulcus bevirket ved diabetes.

15. Anvendelse ifølge krav 11, hvor sårene foretrukket er liggesår.

16. Anvendelse ifølge krav 11-15 som et supplement til eller i forbindelse med anvendelsen av en eller flere andre substanser med en fordelaktig effekt på sårheling.

17. Anvendelse ifølge krav 16, hvor den andre substansen er en hydrokolloid kompress.

18. Anvendelse ifølge krav 16, hvor den andre substansen er en antimikrobiell substans slik som for eksempel et antibiotikum.