PT90750B - APPRECIATIONS IN SEPARATION PROCESSES OF AFFINITY CELLS - Google Patents
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Abstract
Description
APERFEIÇOAMENTOS EM PROCESSOS DE SEPARAÇÃO DEIMPROVEMENTS IN SEPARATION PROCESSES OF
CÉLULAS POR AFINIDADEAFFINITY CELLS
Âmbito da InvençãoScope of the Invention
Esta invenção refere-se a um método para aperfeiçoar processos de selecção por afinidade para seoaração de células biolõ gicas específicas a partir de uma mistura de células.This invention relates to a method for improving affinity selection processes for seoaration of specific biological cells from a mixture of cells.
Antecedentes da InvençãoBackground of the Invention
A separação de células por afinidade refere-se a conhecidas técnicas de processo em que um sub-conjunto particular de uma mistura ou de umapopulação de células biológicas se liga a suoerfí cies de apoio por meio de ligantes com afinidade específica para moléculas ou estruturas nas membranas das células do sub-conjunto. As células que carecem de estruturas ou moléculas da mernbr^ na não estão ligadas ã superfície de apoio e podem ser retiradas da população para se efectuar uma seoaração destas células a par tir das células ligadas ou vice-versa.Affinity cell separation refers to known process techniques in which a particular subset of a mixture or population of biological cells binds to their supporting surfaces by means of ligands with specific affinity for molecules or structures in membranes of the cells in the subset. Cells lacking structures or molecules of the membrane are not attached to the support surface and can be removed from the population to seoarate these cells from the attached cells or vice versa.
Os processos de separação por afinidade são vulgarmente utilizados quer Dara eliminar um sub-conjunto a partir de uma mis tura desejada (depleção) quer para preparar um sub-conjunto esoe cífico desejado a partir de uma mistura (selecção positiva). 9 processo de depleção é muito mais simples porque as células ligaAffinity separation processes are commonly used either to remove a subset from a desired mixture (depletion) or to prepare a desired specific subset from a mixture (positive selection). 9 depletion process is much simpler because the cells bind
das são simplesmente rejeitadas deixando as células desejadas atras. A selecção positiva e muito mais difícil quer porque as células desejadas estão ligadas a base e devem ser retiradas sem as danificar, quer porque uma certa prooorção das células não-de sejãveis podem e ligam-se mesmo de modo não-específico a suoerfí cie de afinidade e contaminam as células colhidas.are simply discarded leaving the desired cells behind. Positive selection is much more difficult either because the desired cells are attached to the base and must be removed without damaging them, or because a certain proorection of non-desirable cells can and do bind even in a non-specific way to their surface. affinity and contaminate the harvested cells.
As técnicas de separação de células possuem aplicação dotencial importante nas terapias do cancro, terapias de doenças auto-imunológicas e diagnósticos melhorados. Por exemplo, podem utilizar-se dispositivos de afinidade de células em terapias extracorporeas que podem envolver o isolamento selectivo, o aumento e a reintrodução no hospedeiro de uma população de um sub-coji junto específico de células.Cell separation techniques have important potential applications in cancer therapies, autoimmune disease therapies and improved diagnostics. For example, cell affinity devices can be used in extracorporeal therapies that may involve selective isolation, augmentation, and reintroduction into the host of a population of a specific subcook with specific cells.
As técnicas de afinidade de células tem sido amplamente utilizadas desde a descrição de tal processo oor Wigzell em 1969 (Wigzell e Andersson; J. Exp. Med.11; 129; 1969; n. 23-36). Separaram-se as células utilizando anticorpos imobilizados oara pérolas (Wigzell e Andersson J. Exp. Med129; 1969; d. 23-36, para fibras (Rutishauser et al. Proc. Natl . A c a d. Sei. 70 , 1973), para placas de Petri (Mage et al. 11J. Immunol . .Me th.; 1£ , 1 977) e para gotas líquidas (patente de invenção norte-americana n9 4 619 904). 0 processo de separação envolve basicamente por em contacto misturas de células e uma base revestida de ligante, permitindo que as células se liguem, e oosteriormente lavando as células não-aderentes.Cell affinity techniques have been widely used since the description of such a process by Wigzell in 1969 (Wigzell and Andersson; J. Exp. Med. 11 ; 129; 1969; n. 23-36). Cells were separated using immobilized antibodies to beads (Wigzell and Andersson J. Exp. Med129; 1969; d. 23-36, for fibers (Rutishauser et al. Proc. Natl. A ca d. Sei. 70, 1973), for Petri dishes (Mage et al. 11 J. Immunol.. Me th .; 1 £, 1,977) and for liquid drops (U.S. Patent No. 4,619,904). The separation process basically involves contact mixtures of cells and a base coated with ligand, allowing the cells to bind, and subsequently washing the non-adherent cells.
Durante os anos 70 apareceram vários relatórios de técnicasDuring the 1970s, several technical reports appeared
-3- ( v-3- (v
de separação por afinidade de células para uma variedade de cél£ las, bases e ligantes (Wysocki e Sato Proc. Natl, Acad. Sei.; 75; 1978; 2844-2848; Wigzell Scand. J. Immunol . ( 5; 1976, p. 23-30; Antoine et al.; Immunochem.; 1 5, 1937; Edelman e Rutishamer ; Meth. Enzvmol.; 34; 1974, p. 195-225). Várias patentes descreveram uma variedade de técnicas e dispositivos oara separa^ ções de células por afinidade (patentes de invenção norte-americanas n9s 4 035 316, 3 970 518, 3 843 324, 4 230 685, 4 363 634). Com exceoção do peneiramento e de certos processos que envolvem a utilização de partículas magnéticas, as técnicas provaram ser difíceis de reproduzir. Além disso, as múltiplas tentativas nara utilizar estes processos em larga escala têm sido causa de muito desapontamento.affinity separation cells for a variety of cells, bases and ligands (Wysocki and Sato Proc. Natl, Acad. Sci .; 75; 1978; 2844-2848; Wigzell Scand. J. Immunol. (5; 1976, p. 23-30; Antoine et al .; Immunochem .; 15, 1937; Edelman and Rutishamer; Meth. Enzvmol .; 34; 1974, p. 195-225). Several patents have described a variety of techniques and devices to separate cell affinities (US Patent Nos. 4,035,316, 3,970,518, 3,843,324, 4,230,685, 4,363,643), with the exception of screening and certain processes involving the use of magnetic particles , the techniques proved to be difficult to reproduce, and the multiple attempts to use these processes on a large scale have been the source of much disappointment.
As técnicas de depleção de células por afinidade encontraram algumas aplicações importantes. Os investigadores prenaram sub-oopulações de células específicas para estudo nor denle ção de modo sistemático de uma mistura de várias sub-populações de células. Por exemplo, Treleavan et al. (Treleaven et al. Lancet; 1; 1984, p. 70-73) mostraram que a concentração de células de neuroblastoma numa preoaração de medula Óssea pode ser reduzida por meio de um factor de cerca de 10®, utilizando deple ções múltiplas com pérolas magnéticas revestidas de anticoroos.Affinity cell depletion techniques have found some important applications. The investigators impregnated specific cell sub-populations for systematic normalization of a mixture of various sub-populations of cells. For example, Treleavan et al. (Treleaven et al. Lancet; 1; 1984, p. 70-73) showed that the concentration of neuroblastoma cells in a bone marrow preoaration can be reduced by a factor of about 10®, using multiple pearl depletions magnetic coated with anti-chlorine.
Dois exemplos de técnicas de selecção nositiva são as des^ critas por Berenson et al . (J. Immunol. Methods; 9Jj 1986; o. 11-19) e por Gaudernack et al . (J. Immunol. Methods·, 90; 1 986 ; p. 179-187). Berenson et al. ligaram anticornos bioestanhados a células alvo e passaram-nas através de uma coluna carregada comTwo examples of noisy selection techniques are those described by Berenson et al. (J. Immunol. Methods; 9Jj 1986; o. 11-19) and by Gaudernack et al. (J. Immunol. Methods ·, 90; 1 986; p. 179-187). Berenson et al. linked bio-tinned antlers to target cells and passed them through a column loaded with
-4- / pérolas revestidas de avidina, recuperando deste modo 64% de uma população de células de medula óssea humana numa concentração nal de 73% quando a concentração inicial era de 7%. Gaudernack et al. utilizaram pérolas magnéticas revestidas de anticorpos oa_ ra colher um dado sub-conjunto de células T. A concentração ini ciai foi de 30% e a população seleccionada de modo positivo foi de 96%; não e mencionado o rendimento. Estas purezas não são adequadas para um grande numero de aplicações atractivas, como os transplantes de células originais ou para a preparação de sub-populações para estudos imunolõgicos ou de biologia da célula.-4- / avidin-coated beads, thereby recovering 64% of a population of human bone marrow cells at a final concentration of 73% when the initial concentration was 7%. Gaudernack et al. they used magnetic beads coated with antibodies to harvest a given subset of T cells. The initial concentration was 30% and the population selected positively was 96%; income is not mentioned. These purities are not suitable for a large number of attractive applications, such as the transplantation of original cells or for the preparation of sub-populations for immunological or cell biology studies.
Muitas tentativas para aumentar a escala de processos de separação de células por afinidade, para além da escala laborato rial, envolveram colunas de afinidade carregadas com oérolas revestidas com anticorpos, lectinas, ou proteina de estafi1ococo.Many attempts to increase the scale of affinity cell separation processes, in addition to the laboratory scale, have involved affinity columns loaded with beads coated with antibodies, lectins, or staphylococcal protein.
A. Soluções contendo misturas de células fluem através da carga da coluna e, de modo ideal, os ligantes ligam as células especificas desejadas. Na pratica, contudo, uma grande fracção de células não-desejadas ligaram-se de modo não-esnecffico ãs co lunas de modo que a pureza e o rendimento das células selecciona das é extremamente baixo. Por exemplo, numa tentativa recentemente relatada para separar linfócitos T a nartir de linfócitos de sangue periférico utilizando pérolas de Sefarose, revestidas de aglutinina de feijão-soja, numa coluna, Hertz et al. concluíram que podiam reter 90% de linfócitos T, mas também concluíram que 80% de outros linfócitos se ligaram de modo não-esoecifico. (Hertz et al. Biotechnol oge and Bioengineering · 27; 1 985; o. 603-612). Os processos para a purificação de células que emnre-5guem a afinidade extremamente elevada da biotina e da avidina produziram os melhores resultados em larna escala utilizando colunas carregadas (Berenson et al . ; 11J . Cel 1 Bi ochem;11 1_OD_^ 1986,A. Solutions containing mixtures of cells flow through the column load and, ideally, the ligands bind the desired specific cells. In practice, however, a large fraction of unwanted cells have bound non-synectically to the columns so that the purity and yield of the selected cells is extremely low. For example, in a recently reported attempt to separate T lymphocytes from peripheral blood lymphocytes using Sepharose beads, coated with soybean agglutinin, in a column, Hertz et al. concluded that they could retain 90% of T lymphocytes, but also concluded that 80% of other lymphocytes were non-esoecifically bound. (Hertz et al. Biotechnol oge and Bioengineering · 27; 1 985; o. 603-612). Processes for the purification of cells that exhibit the extremely high affinity of biotin and avidin produced the best results on a large scale using loaded columns (Berenson et al.; 11 J. Cel 1 Bi ochem; 11 1_OD_ ^ 1986,
p. 239). Berenson et al. relataram a concentração de 2,5 x 10’ células alvo a partir de 14% a 73% de pureza com um rendimento de 43%.P. 239). Berenson et al. reported the concentration of 2.5 x 10 'target cells from 14% to 73% purity in 43% yield.
A tentativa de maior sucesso para senarações por afinidade de células, em larga escala, envolveu a utilização de partículas magnéticas. As partículas magnéticas tem sido clinicamente utilizadas para eliminar neuroblastomas ou células T de transplan^ tes de medula õssea. 99,97% ou mais de células não desejadas são eliminadas de transplantes que contêm inicial mente para cima de ΊΟ^θ células, mas mais de metade de outras células são retiradas de modo não-específico pelo processo. (Vartdal et al.; J. Cel1 . Bioch., Sup.; 10D, 1986; p. 252).The most successful attempt at cell affinity senations on a large scale involved the use of magnetic particles. Magnetic particles have been clinically used to eliminate neuroblastomas or T cells from bone marrow transplants. 99.97% or more of unwanted cells are eliminated from transplants that initially contain up to ΊΟ ^ θ cells, but more than half of other cells are removed in a non-specific manner by the process. (Vartdal et al .; J. Cel1. Bioch., Sup .; 10D, 1986; p. 252).
Devido a dificuldades na execução e no aumento de escala das separações por afinidade de células, esta técnica promissora encontrou muito pouca aplicação pratica. Permanece anui a nece£ secidade de se ser capaz de recuperar células com maior rendimen, to e maior pureza.Due to difficulties in the execution and scaling up of cell affinity separations, this promising technique found very little practical application. The need remains to be able to recover cells with higher yield and greater purity.
Resumo da InvençãoSummary of the Invention
Muitas destas dificuldades referentes aos rendimentos e ou rezas inerentes aos processos da técnica ant-erior, são suplantados pelos processos da presente invenção. IJm processo para a separação de uma fracção alvo de células biológicas a partir de umaMany of these difficulties regarding the yields and or prayers inherent in the prior art processes are overcome by the processes of the present invention. A process for separating a target fraction of biological cells from a
mistura de células num meio que consiste em fazer contacto entre as células numa mistura e uma superfície que contacta as células possuindo um ligante com uma afinidade esoecífica oara as células alvo e separação da superfície de contacto e o meio é a ner *e i çoa^ do de acordo com a presente invenão por passos de execução de mo vimento relativo entre a mistura do meio e a superfície que contacta as células para proporcionar o contacto entre as células e a superfície que as contacta, formando uma ligação de afinidade entre as células e a superfície, enquanto se mantém a força de corte na superfície que contacta num valor inferior ao da for ça de ligação que se desenvolve entre as células alvo e o ligante sobre a superfície que as contacta. A força de corte dividida pelo quadrado do tempo de contacto mantêm-se de oreferênciamixture of cells in a medium that consists of making contact between the cells in a mixture and a surface that contacts the cells having a binder with a specific affinity for the target cells and separation from the contact surface and the medium is the nerfection according to the present invention by steps of relative motion between the mixture of the medium and the surface that contacts the cells to provide contact between the cells and the surface that contacts them, forming an affinity bond between the cells and the surface, while maintaining the shear force on the contacting surface below the bonding force that develops between the target cells and the binder on the contacting surface. The cutting force divided by the square of the contact time remains in reference
- 9 9 2 entre o 2 x 10 e 0,02 dines/(cm~.seg ).- 9 9 2 between 2 x 10 and 0.02 dynes / (cm ~ .sec).
Como alternativa ou em combinação com este processo, node incluir-se o passo de reabastecimento contínuo da superfície que contacta as células. Ainda num outro nrocesso alternativo, ou em combinação com os passos anterioremente referidos, node incluir-se o passo de fluxo da mistura de células do meio oara con tactar a superfície que contacta as células ou vice-versa numa proporção variável. Cada um destes processos,isolados ou combinados, aumentam a pureza e o rendimento da senaração.As an alternative or in combination with this process, we will include the step of continuous replenishment of the surface that contacts the cells. In yet another alternative process, or in combination with the steps mentioned above, we will include the flow step of the mixture of cells in the medium to contact the surface contacting the cells or vice versa in a variable proportion. Each of these processes, isolated or combined, increases the purity and yield of the senaration.
Os processos podem incluir, isoladamente ou em combinação, o passo de ajustamento da ãrea da superfície de contacto nara vaThe processes can include, alone or in combination, the step of adjusting the area of the natural contact surface
O lores inferiores a lOcm /ml de meio. Determinada como alternati va, a concentração dos locais de ligação das células na superfície de contacto é mantida em valores inferiores a dez vezes a con ζLess than 10 cm / ml of medium. Determined as an alternative, the concentration of cell binding sites on the contact surface is maintained below ten times the con con
centração das células alvo. Isto conserva o ligante e reduz a li_ gação não especifica. Cada processo ou combinação de processos pode ser utilizado quando o meio é sangue completo ou sangue com pleto diluído. Estes processos proporcionam rendimentos mais elevados bem como purezas mais elevadas de células desejadas do que tem sido possível até agora.concentration of target cells. This conserves the binder and reduces non-specific binding. Each process or combination of processes can be used when the medium is whole blood or diluted full blood. These processes provide higher yields as well as higher desired cell purities than has been possible up to now.
Descrição do DesenhoDrawing Description
A única figura é uma representação da velocidade de colisão das células com a superfície de contacto, representada graf£ camente como ordenada, versus a força de corte dividida pelo qua drado do tempo de contacto, graficamente representada como abeis sa, para diversas técnicas de separação por afinidade.The only figure is a representation of the speed of collision of the cells with the contact surface, represented graphically as ordered, versus the shear force divided by the contact time square, graphically represented as abis sa, for different separation techniques by affinity.
Descrição Detalhadada Realização PreferidaDetailed Description Preferred Achievement
A presente invenção proporciona processos oara efectuar aperfeiçoamentos em separações de células por afinidade nara pre paração de fraeções de elevada pureza de células biológicas a Dar tir de misturas de células por contacto das células com as super ficies revestidas com ligantes imobilizados com afinidade especí fica para a desejada sub-população de células. Estes processos incluem quer os processos de depleção de células em que um sub-conjunto de células é retirado a partir de uma mistura de células, quer os processos de selecção positiva em que se prepara um sub-conjunto especifico a partir da mistura de células. As célu las, tal como o termo é aqui utilizado, podem incluir células bio lógicas de qualquer origem, incluindo organismos eucariõticos e •J procariõticos. Por ênfase, as partículas não-celulares, incluin do vírus, micoplasma e partículas em geral, podem ser purificadas utilizando o processo de separação por afinidade da presente invenção.The present invention provides processes for making improvements in cell separations by affinity for the preparation of high-purity fractions of biological cells from cell mixtures by contacting cells with surfaces coated with immobilized ligands with specific affinity for the desired sub-population of cells. These processes include both cell depletion processes in which a subset of cells is taken from a mixture of cells, or positive selection processes in which a specific subset is prepared from the mixture of cells. Cells, as the term is used herein, can include biological cells of any origin, including eukaryotic and prokaryotic organisms. By emphasis, non-cellular particles, including viruses, mycoplasma and particles in general, can be purified using the affinity separation process of the present invention.
Um processo de separação de células por afinidade utiliza dispositivos de separação de células por afinidade com superfícies de contacto por afinidade. As células que se ligam ãs superfícies de contacto por afinidade, conforme se pretende, desi£ nam-se por células alvo. Os dispositivos de senaração, como se sabe, podem incluir colunas de pérolas, placas de Petri, pero las magnéticas, fibras, membranas porosas, fibras ocas, frascos de rotação, emulsões, lamas .e substâncias análogas. As superfícies de contacto por afinidade nos dispositivos podem ser constj tuídas por quaisquer materiais conhecidos, úteis para este fim e incluem geles (como a poli-acri1amida ou a agarose), polímeros (como ooliestireno, poliacroleína, poliaminas, poliarilatos, poliésteres, poli-aramidas, poli-acrilonitrilos, oolissulfonas, no límeros, celulósicos, ionõmeros e f1uoro-polímeros), proteínas, lípidos, agentes tensio-activos, vidros e cerâmicas.An affinity cell separation process uses affinity cell separation devices with affinity contact surfaces. The cells that bind to the contact surfaces by affinity, as desired, are called target cells. Senating devices, as is known, may include pearl columns, Petri dishes, magnetic beads, fibers, porous membranes, hollow fibers, spin bottles, emulsions, sludge and the like. The affinity contact surfaces in the devices can be made up of any known materials, useful for this purpose and include gels (such as polyacrylamide or agarose), polymers (such as polystyrene, polyacrylic, polyamines, polyarylates, polyesters, poly- aramides, poly-acrylonitriles, oolysulfones, non-polymers, cellulosic, ionomers and fluoro-polymers), proteins, lipids, surfactants, glass and ceramics.
Seiecciona-se a superfície de qualquer dispositivo , por exemplo, o fundo de um recipiente de ooliestireno , reveste-se com um elemento, o ligante imobilizado, de um par de ligação específico, i. e, ligante e receptor, em que os recentores são para ser separados nas suas sub-nonulações. 0 ligante imobilizado possui afinidade para a sub-população de células (as células alvo) que se deseja isolar e liga a referida sub-população com afi_ nidade específica. 0 ligante imobilizado pode ser, por exemplo, uma molécula de anticorpo que reconheça um antigénio específico sobre a superfície da célula. 0 ligante imobilizado pode também ser uma molécula de ligante específico, como um lectina, corante ou um substrato receptor , que é ligado por um receptor ou uma molécula de ligação de ligante sobre a superfície da célula a ser purificada. 0 ligante de afinidade pode também ser, por exem pio, biotina, avidina, proteína A, uma enzima, um substrato de enzima ou um receptor. Podem utilizar-se camadas ou combinações de ligantes e moléculas de ligação de ligantes. Por exemplo, po de reter-se células portadoras de utilizando um anticorpo monoclonal desenvolvido em murganho, específico para 1/, e um ant/ corpo imobilizado específico oara imunoglobulina de murganho; i. é, o anticorpo desenvolvido em murganho. Pode utilizar-se Dontes ou espaçadores moleculares para facilitar a interacção do ligante e das moléculas para ligação do ligante.The surface of any device is selected, for example, the bottom of a polystyrene container, coated with an element, the immobilized binder, of a specific bonding pair, i. and, ligand and receptor, in which the recenters are to be separated in their subnonulations. The immobilized ligand has affinity for the subpopulation of cells (the target cells) to be isolated and binds said subpopulation with specific affinity. The immobilized ligand can be, for example, an antibody molecule that recognizes a specific antigen on the cell surface. The immobilized ligand can also be a specific ligand molecule, such as a lectin, dye or a receptor substrate, which is attached by a receptor or ligand-binding molecule on the surface of the cell to be purified. The affinity linker can also be, for example, biotin, avidin, protein A, an enzyme, an enzyme substrate or a receptor. Layers or combinations of ligands and ligand binding molecules can be used. For example, carrier cells can be retained using a mouse-specific monoclonal antibody for 1 /, and a specific immobilized antibody for mouse immunoglobulin; i. that is, the antibody developed in mice. Molecular braces or spacers can be used to facilitate the interaction of the ligand and the molecules for ligand binding.
Os ligantes de afinidade oodem ser ligados ã superfície que contacta as células por qualquer uma das técnicas bem conhecidas. Por exemplo, pode utilizar-se adsorção física, química covalente, atracção física, interacções hidrofobas, ou interacções de Van der Waals. As técnicas usuais oara a ligação de oro teínas a bases solidas são revistas em Affinitv Chromotography and Related Techniques, editado por T. C. J. Gribnau, J. Vissen e R. J. F. Nivand, Elsevier, 1982.Affinity binders can be attached to the surface that contacts cells by any of the well-known techniques. For example, physical adsorption, covalent chemistry, physical attraction, hydrophobic interactions, or Van der Waals interactions can be used. The usual techniques for linking gold orines to solid bases are reviewed in Affinitv Chromotography and Related Techniques, edited by T. C. J. Gribnau, J. Vissen and R. J. F. Nivand, Elsevier, 1982.
Coloca-se a mistura de células em vários meios para tran_s porte, manuseamento, etc. Os meios podem ser quaisquer meios apropriados que não sejam prejudiciais oara as células, para o ligante, ou para a molécula para ligarão do ligante. Os meios vulgarmente utilizados incluem soluções salinas equilibradas deThe cell mixture is placed in various media for transport, handling, etc. The media can be any appropriate media that are not harmful to the cells, the ligand, or the ligand binding molecule. Commonly used media include balanced salt solutions of
Hanks, RPMI 1640, solução salina tamponada de fosfato, meios essenciais mínimos de Dubbeco ou de Eagle, Outros aditivos ou meios vulgares encontram-se descritos em American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 5 . edição, 1985, pp. 263-273 (American Type Culture Collection, Rockville, MO).Hanks, RPMI 1640, phosphate buffered saline, Dubbeco's or Eagle's minimum essential media, Other additives or common media are described in the American Type Culture Collection Catalog of Cell Lines and Hybridomas, 5. edition, 1985, pp. 263-273 (American Type Culture Collection, Rockville, MO).
Os processos de purificação por afinidade de células incluem, como anteriormente referido, os processos depleção bem como a selecção positiva. Estes processos de selecção positiva envolvem a localização de uma mistura de células, contendo uma desejada sub-população de células a ser separada, num meio de tal modo que as células contactem com a suoerfície de contacto e as células desejadas se liguem aí aos ligantes. As células que não se unam aos ligantes da superfície são lavadas da superfície por meios adicionais e rejeitadas. As células a ser colhidas que estão ligadas ou aderem a superfície por afinidade são eliminadas por qualquer método bem conhecido incluindo raspagem, agitação, corte de fluido, utilização de um tampão de eluição, ou por desabsor ção natural. (H. Wigzell; Scand. J. Immunology; 5(55), 1976, p. 23-30).Cell affinity purification processes include, as noted above, depletion processes as well as positive selection. These positive selection processes involve locating a mixture of cells, containing a desired sub-population of cells to be separated, in a medium such that the cells contact the contact surface and the desired cells bind there to the ligands. Cells that do not bind to the surface binders are washed from the surface by additional means and discarded. The cells to be harvested that are bound to or affixed to the surface by affinity are eliminated by any well known method including scraping, shaking, cutting fluid, using an elution buffer, or by natural desorption. (H. Wigzell; Scand. J. Immunology; 5 (55), 1976, p. 23-30).
De acordo com a presente invenção, as purezas e os rendimentos dos sub-conjuntos de células obtidos por muitos orocessos de separação de células por afinidade conhecidos podem ser aperfeiçoados mesmo quando se trabalha com grandes volumes ou elevado número de células. No passado, o plano e o aumento de escala foram efectuados fazendo variações empíricas em orocessos desenvolvidos para outros sistemas de separação de células ou aumentando os volumes e as ãreas dos processos o que resultou com suAccording to the present invention, the purities and yields of cell subsets obtained by many known affinity cell separation processes can be improved even when working with large volumes or high number of cells. In the past, the plan and scale-up were carried out by making empirical variations in orocesses developed for other cell separation systems or by increasing the volumes and areas of the processes which resulted in su
-11cesso à escala laboratorial. 0 insucesso frequente destas tenta^ tivas empíricas pode evitar-se tomando em consideração as seguiji tes variáveis que regulam a interacção entre a célula e a superfície de contacto por afinidade: (1) a velocidade de contacto ou taxa de colisão, (2) o tempo de contacto, (3) a força de ligação, (4) a força de corte e (5) a constante de equilíbrio de ligação.-11 access on a laboratory scale. The frequent failure of these empirical attempts can be avoided by taking into account the following variables that regulate the interaction between the cell and the contact surface by affinity: (1) the contact speed or collision rate, (2) the contact time, (3) the bonding force, (4) the shearing force and (5) the bonding equilibrium constant.
De acordo com os processosda presente invenção, utilizam-se ãreas da superfície de afinidade óptimas juntamente com técnicas para aumentar bastante a eficiência do contacto da superai cie por afinidade com as células. Seleccionam-se as ãreas da su perfície tendo em conta as constantes da ligação de equilíbrio. A eficiência do contacto aumenta quando aumenta a velocidade de colisão e se mantém a força de corte abaixo de certos limites de terminados pelo tempo de contacto. A identificação, medição e optimização destas variáveis chave proporeio na novos processos de separação de células por afinidade para seoaração de células específicas a partir de meios fluidos, incluindo sangue completo ou em condições estáticas com uma eficiência muito maior do que os processos anteriores.According to the processes of the present invention, optimal areas of affinity surface are used together with techniques to greatly increase the efficiency of contact of the surface by affinity with cells. The areas of the surface are selected taking into account the constants of the equilibrium connection. The efficiency of the contact increases when the speed of collision increases and the cutting force is maintained below certain limits of terminated by the time of contact. The identification, measurement and optimization of these key variables will propose new processes of separation of cells by affinity for seoaration of specific cells from fluid media, including whole blood or in static conditions with a much greater efficiency than previous processes.
Um processo especial de senaração de células oor afinidade requer uma definição geral das propriedades do orocesso de se paração a ser utilizado para a aplicação. Esta definição inclui a pureza e o rendimento da célula alvo que se deseja, a técnica de imobilização do ligante de afinidade e do ligante de afinidade, a composição da mistura de células de oartida e as suas propriedades, as limitações reguladoras ou biológicas, a densidade de sítios de ligação das células ã superfície por afinidade, a u·/ constante de equilíbrio da ligação (ou avidez) para liqação da célula ã superfície de afinidade e a força de ligação para liga ção da célula ã superfície de afinidade.A special process of senating cells or affinity requires a general definition of the properties of the separation orocess to be used for the application. This definition includes the desired cell purity and yield, the affinity ligand and affinity ligand immobilization technique, the composition of the oartite cell mixture and its properties, regulatory or biological limitations, density binding sites of affinity for cell surface, · u / binding equilibrium constant (or avidity) to liqação cell surface affinity and bonding strength binds to the cell surface affinity dog.
Taxa de contactoContact fee
A seguir utiliza-se um sistema que proporciona uma taxa a propriada de contacto entre a célula e a suoerXcie de afinidade. A ligação ã superfície de afinidade não Dode ocorrer se a célula não estiver em contacto com o ligante da superfície de afinidade. A proporção a que as células contactam a suoerfície de afinidade e dominada por três processos: sedimentação, renova ção da superfície e intercepção. A taxa de difusão para células e insignificantemente pequena 10 cm /seg) e pode ionorar-se. A sedimentação refere-se a localização das células numa superfície devido a forças de gravidade ou de aceleração como a transm/ tida por um dispositivo do tipo centrifugador, por exemplo.Next, a system is used that provides a proper rate of contact between the cell and its affinity. Bonding to the affinity surface cannot occur if the cell is not in contact with the affinity surface binder. The proportion at which cells contact their affinity surface is dominated by three processes: sedimentation, surface renewal and interception. The diffusion rate for cells is negligibly small (10 cm / sec) and can be ionized. Sedimentation refers to the location of cells on a surface due to forces of gravity or acceleration such as that transmitted by a centrifuge-type device, for example.
A renovação da superfície ê o processo de eliminação da camada fina do meio na superfície de afinidade e a troca com meio fresco (que contenha células) a partir de uma solução inicial . 0 mergulho repetido de uma base nummeioque contenha células e a drenagem posteriordo meio a partir da superfície, ê um exemplo de um processo de renovação da superfície. (G, Astarita, Mass Transfer with Chemical Reaction, Elsevier Publ . Co., 1 967) , Exemplos de dispositivos de renovação de superfícies conhecidos incluem os cilindros rotativos parcial mente cheios com inversores de fluxo do meio como os misturadores de kenics, dispositivos de contacto de películas finas e dispositivos de Taylor-Couette.Surface renewal is the process of removing the thin layer of the medium on the affinity surface and exchanging it with fresh medium (containing cells) from an initial solution. The repeated dip of a base in a medium containing cells and the subsequent drainage of the medium from the surface is an example of a surface renewal process. (G, Astarita, Mass Transfer with Chemical Reaction, Elsevier Publ. Co., 1 967), Examples of known surface renewal devices include rotary cylinders partially filled with medium flow inverters such as kenic mixers, contact of thin films and Taylor-Couette devices.
-13A intercepção é ο Drocesso pelo qual as células são compri midas contra uma superfície pelo fluxo do meio. As forças nece£ sarias para a intercepção eficiente das células são geralmente demasiado elevadas para permitir a ligação das células ã superfí cie após terem sido estabelecidos perfis de fluxo estável devido à força de corte exceder a força de ligação oara a ligação da cé lula à superfície de afinidade. Contudo, de acordo com a preseji te invenção, podem alcançar-se elevadas taxas de intercepção com baixo corte utilizando fluxo instável, que inclui fluxo oscilatõ rio ou de vibração ou movimento instável da base de afinidade re lativa ãs células. Quando o fluxo ou o movimento da base através do meio é estável desenvolvem-se camadas ligadas ou perfis de cor te que tendem a impedir as células de contactarem normalmente a superfície. Pode encontrar-se uma descrição deste tipo de compor tamento em M. Duszy, K. J .Doroszewski , Progress in Surface Science; 1 5, 1984; p. 369-399. Exemplos de dispositivos de fluxo não estacionário incluem fluxo de vibração através de uma coluna de pérolas convencional ou de um conjunto de fibras, ou movimento oscilatório da superfície de afinidade na mistura de células.-13The interception is ο Drocess by which cells are compressed against a surface by the flow of the medium. The forces required for efficient cell interception are generally too high to allow the cells to bind to the surface after stable flow profiles have been established due to the shear force exceeding the binding force for the cell to bind to the surface. of affinity. However, according to this invention, high interception rates with low shear can be achieved using unstable flow, which includes oscillatory or vibration flow or unstable movement of the cell-related affinity base. When the flow or movement of the base through the medium is stable, connected layers or color profiles develop which tend to prevent cells from normally contacting the surface. A description of this type of behavior can be found in M. Duszy, K. J. Doroszewski, Progress in Surface Science; 15, 1984; P. 369-399. Examples of non-stationary flow devices include vibration flow through a conventional bead column or a set of fibers, or oscillatory movement of the affinity surface in the cell mixture.
Os processos de seoaração de células por afinidade do pa£ sado basearam-se na sedimentação. A velocidade de colisão ou a taxa de contacto entre a célula e a superfície de afinidade (i. é a velocidade da colisão das células contra a suoerfície de afi_ nidade) por sedimentação é a velocidade final de deposição das células multiplicada pela concentração de células, multiplicada pela área da superfície de afinidade projectada num plano Derpeji dicular a direcção da força de aceleração (vulgarmente apenas de signada por gravidade).The processes of cell seoaration by affinity of the patient were based on sedimentation. The rate of collision or the rate of contact between the cell and the affinity surface (i.e. it is the rate at which the cells collide against their affinity surface) by sedimentation is the final rate of cell deposition multiplied by the concentration of cells, multiplied by the area of the projected affinity surface in a Derpeji plane, dictating the direction of the acceleration force (usually only by gravity).
A velocidade de deposição final oor sedimentação pode calcular-se utilizando a Lei de Stokes:The final deposition rate or sedimentation can be calculated using Stokes' Law:
vt - 2 r2 9 (1)vt - 2 r2 9 (1)
V em que Vt = velocidade de deposição final (cm/seg), r = raio da célula (cm), g = aceleração gravitacional (980 cm/seg^)V where Vt = final deposition speed (cm / sec), r = cell radius (cm), g = gravitational acceleration (980 cm / sec ^)
Pc = densidade das células (gm/cm ),Pc = cell density (gm / cm),
P = densidade do meio (gm/cm ), μ = viscosidade do meio (gm/cm.seg)P = density of the medium (gm / cm), μ = viscosity of the medium (gm / cm.seg)
Assim, a velocidade de sedimentação para linfócitos em meio aquoso é de cerca de 4 x 10 cm/seg. A taxa de colisão das células contra a superfície para 10? celulas/ml no fundo de uma placa de Petri é deThus, the sedimentation rate for lymphocytes in aqueous media is about 4 x 10 cm / sec. The rate of collision of cells against the surface to 10? cells / ml at the bottom of a petri dish is
Λ 7 O x 10 cm/seg x 10' células = 4000 cêlulas/seq cm ,(2)Λ 7 O x 10 cm / sec x 10 'cells = 4000 cells / seq cm, (2)
Em alguns formatos,a superfície de afinidade encontra-se também em deposição. Nestes casos, a velocidade de deposição diferencial é o parâmetro importante. Utilizaram-se muitas vezes pérolas magnéticas, conforme se descreveu antes, oara retençãoIn some formats, the affinity surface is also in deposition. In these cases, the differential deposition speed is the important parameter. Magnetic beads have often been used, as described above, for retention
de células. As pérolas Dynal M450, vulgarmente utilizadas, instalam-se mais depressa do que as células. A velocidade líquida de sedimentação ou a velocidade diferencial de deposição é a di- -4 ferença entre a velocidade das pérolas medida de 8 xlO cm/segof cells. Dynal M450 beads, commonly used, install faster than cells. The net settling speed or the differential deposition speed is the difference between the measured pearl speed of 8 x 10 cm / sec
- -4 -r e a velocidade das células, 4 x 10 cm/seg. A velocidade liqu/ da de cloisão das células contra a superfície ê, assim, a mesma da equação (2), em que a ãrea é a área orocurada pelas pérolas.- -4 -r and the cell speed, 4 x 10 cm / sec. The liquid velocity of the cells' cloning against the surface is, therefore, the same as in equation (2), where the area is the area healed by the beads.
De acordo com a presente invenção, também a renovação da superfície pode aumentar a taxa de contacto das células acima re feridas, daquela que é proporei onada apenas pela sedimentação. A taxa maior pode ser calculada a partir da razão a que a superfície é humedecida e da concentração das células:According to the present invention, the renewal of the surface can also increase the contact rate of the cells referred to above, from that which is provided only by sedimentation. The higher rate can be calculated from the reason that the surface is moistened and the concentration of the cells:
SR = - x 2r x C, (3) tSR = - x 2r x C, (3) t
em que SR = taxa de contacto das células devida à renovação da superfície (cêlulas/seg) ,where SR = contact rate of cells due to surface renewal (cells / sec),
A _ velocidade a que a superfície é humedecida (cm /seg) , t r = raio da célula (cm), βA _ speed at which the surface is moistened (cm / sec), t r = cell radius (cm), β
C = concentração de células (/£/cnr).C = concentration of cells (/ £ / cnr).
As taxas de contacto das células contra a superfície, aumentadas devido a intercepção e fluxo instável, podem calcular-se de modo similar utilizando cálculos de engenharia clássica para fluxos de duas fases (Bird et al . : Transport Phenomena'1,The rates of contact of cells against the surface, increased due to interception and unstable flow, can be calculated in a similar way using classical engineering calculations for two-phase flows (Bird et al.: Transport Phenomena ' 1 ,
John Wiley and Sons, NY , o. 3-243, 1960), A taxa de contacto das células contra a superfície de afinidade pode ser aumentada muitas vezes utilizando dispositivos o que inclui os fenómenos de renovação da superfície e fenômenos de fluxo não estacionários.John Wiley and Sons, NY, o. 3-243, 1960), The rate of contact of cells against the affinity surface can be increased many times using devices which include surface renewal phenomena and non-stationary flow phenomena.
A maior razão para o desempenho relativamente pobre de dis positivos ou processos anteriores de separação de células nor afi nidade é o de serem planeados para optimizar a transferéncia da massa de difusão (por exemplo, maximização da ãrea da suoerfície) em vez destes mecanismos de contacta mais relevantes. No exemplo 5, a utilização de um frasco rotativo (tentativa de renovação da superfície) proporciona duas vezes a velocidade de colisão do me lhor processo corrente (partículas magnéticas em suspensão; Kem^ Aead et al., Advances in Neuroblastoma Research, slam R. Liss, Inc. p. 413-423, 1985) e 10 vezes a velocidade de colisão da técnica mais vulgar (sedimentação) quando se retêm células a partir de sangue completo. 0 processo utilizado por Kemshead et al . proporciona cerca de 8 x 10® colisões/seg./ml que e o mais elevado de todos os relatos oara o qual se pode calcular uma velocidade de colisão. Utilizando processos de renovação da superfície e fluxo instável, consegue-se uma taxa de contacto entre 10 e 10 colisoes/seg./ml, excedendo de longe os processos correntes .The biggest reason for the relatively poor performance of devices or previous cell separation processes is to be designed to optimize the transfer of the diffusion mass (for example, maximizing the area of your surface) instead of these contact mechanisms most relevant. In example 5, the use of a rotating flask (attempt to renew the surface) provides twice the collision speed of the best current process (magnetic particles in suspension; Kem ^ Aead et al., Advances in Neuroblastoma Research, slam R. Liss, Inc. pp. 413-423, 1985) and 10 times the collision speed of the most common technique (sedimentation) when cells are retained from whole blood. The process used by Kemshead et al. provides about 8 x 10® collisions / sec / ml which is the highest of all reports for which a collision speed can be calculated. Using surface renewal processes and unstable flow, a contact rate between 10 and 10 collisions / sec / ml is achieved, far exceeding current processes.
Por causa das forças e taxas de contacto da superfície contra as células o processo da presente invenção retirou com su cesso 70% das células alvo, a partir de uma amostra de sangue hu mano completo, não diluído, numa hora. As células alvo estavam gBecause of the forces and rates of surface contact against the cells, the process of the present invention successfully removed 70% of the target cells from a sample of whole human, undiluted, in one hour. Target cells were g
presentes numa concentração inicial de 10 /ml o que era 0,02% dopresent in an initial concentration of 10 / ml which was 0.02% of the
total de células sanguíneas. As células retidas eram 95% viáveis e incluíam menos de 7% de células sanguíneas.total blood cells. The retained cells were 95% viable and included less than 7% blood cells.
Força de corteCutting force
Além disso, de acordo com a presente invenção, as rorças de corte nas células ligadas ã superfície de afinidade mantiveram-se inferiores ã força da ligação que se desenvolve entre a célula e a superfície de afinidade, A força de ligação inicial, seguindo o contacto entre a célula e a superfície de afinidade, e relativamente baixa e as células podem ser retiradas pelas fo ças de corte causadas pelo fluxo de fluido. A maioria dos processos que produzem elevadas taxas de contacto das células também produzem corte elevado. 0 objectivo é, por consequência, ma^ ximizar a eficiência do contacto de ligação das células com a s u perfTcie de afinidade, proporcionando elevadas taxas de contacto enquanto se mantêm as forças de corte de modo que não excedam a força de ligação ou a resistência da ligação segurando a célula ã superfície de afinidade.Furthermore, according to the present invention, the cutting Orca r cells attached to the surface affinity remained lower than the strength of the bond that develops between the cell and the affinity surface, the initial bond strength, following the contact between the cell and the affinity surface, and relatively low and the cells can be removed by the cutting forces caused by the fluid flow. Most processes that produce high cell contact rates also produce high shear. The aim is, therefore, to maximize the efficiency of cell contact binding with their affinity perfection, providing high contact rates while maintaining shear forces so that they do not exceed the binding force or the bond strength. holding the cell to the affinity surface.
De acordo com a presente invenção, faz-se uso da determina ção que a força de ligação entre a célula e a superfície de afinidade e uma função do tempo de contacto e pode ser descrita pela seguinteequação:In accordance with the present invention, it is used to determine that the bonding force between the cell and the affinity surface is a function of the contact time and can be described by the following equation:
força da ligação = factor de velocidade x (temno de contacto) (4)bond strength = speed factor x (contact time) (4)
Podem utilizar-se as seguintes unidades com esta equaçao:The following units can be used with this equation:
força da ligaçao (dines/cm ), factor de velocidade (di2 2 nes/(cm .seg )), tempo de contacto = t (seg).bond strength (dynes / cm), speed factor (di2 2 nes / (cm. sec)), contact time = t (sec).
factor de velocidade da equação acima, que determina a velocidade a que se desenvolve a força da ligação, e uma função das seguintes variáveis: densidade do receptor, estabilidade e mobilidade do receptor; temperatura; afinidade do ligante; densidade e mobilidade do ligante; técnica de imobilização do ligaji te; composição do meio; e o comportamento mediador das células como o desprendimento do receptor. Por exemplo, para a ligação de células T de murganho ao anticorpo 7D4 imobilizado (um anticorpo monoclonal de IgM especifico para uma sub-unidade recepto _ g ra IL2), o factor de velocidade determina-se para 5,6 x 10 di_ nes/(cm2.seg2) a 4°C e 1,4 x 10 4 dines/(cm2.seg2) a 37°C, nas condições descritas no exemplo 2.speed factor of the above equation, which determines the speed at which the bond strength develops, and a function of the following variables: receiver density, receiver stability and mobility; temperature; binder affinity; ligand density and mobility; ligation immobilization technique; composition of the medium; and the mediating behavior of cells such as detachment from the receptor. For example, for the binding of mouse T cells to the immobilized 7D4 antibody (an IgM monoclonal antibody specific for a subunit received - for IL2), the rate factor is determined to be 5.6 x 10 days / (cm 2 .sec 2 ) at 4 ° C and 1.4 x 10 4 dynes / (cm 2 .sec 2 ) at 37 ° C, under the conditions described in example 2.
A literatura publicada contém muitos exemplos de senarações por afinidade em que não ha essencialmente corte e as célu las são postas em contacto apenas via sedimentação (p. exemolo , peneiramento, pérolas magnéticas). Hã relativamente noucos exem pios de processos que melhorem a taxa de contacto para além da simples sedimentação (p. exemolo, fibras, colunas de gel de péro las) e estes envolvem velocidades de corte elevadas. por exemplo, a teoria corrente relativa ã força das ligações ligante: célula levou Hertz et al . , op. ci t. a realizar a sua coluna a um debito em que a força de corte dividida pelo quadrado do tempo de contacto foi de 7 vezes mais elevada do que os valores utilizados no exemplo 2 (a seguir). Nestas condições, as células ligar-se-iam apenas em poucas regiões isoladas de baixo débito da coluna em que a força de corte fosse reduzida e inferior a força da ligação.The published literature contains many examples of affinity senations in which there is essentially no cut and the cells are brought into contact only via sedimentation (eg, sieving, magnetic beads). There are relatively few examples of processes that improve the contact rate beyond simple sedimentation (e.g. fibers, leather gel columns) and these involve high cutting speeds. for example, the current theory regarding the strength of ligand: cell bonds led Hertz et al. , op. ci t. performing its column at a rate in which the cutting force divided by the square of the contact time was 7 times higher than the values used in example 2 (below). Under these conditions, the cells would bind only in a few isolated low-output regions of the column where the cutting force was reduced and less than the binding force.
A figura 1 ilustra as características de realização dos métodos correntes e alguns dos métodos aperfeiçoados aqui descri^ tos. Embora a quantidade de corte tolerada pelas células durante a ligação inicial seja muito inferior a vulgarmente conhecida, hã processos com baixo corte que nodem ser utilizados nara obter uma eficiência de muito mais elevada taxa de contacto das células de eficiência de separação das células do que os métodos correntes. A força de corte durante o contacto deve ser mantida ahaixo de cerca de 0,02 dines/cm.seg , que ê o limite mãximo dos índices das forças de ligação observadas.Figure 1 illustrates the realization characteristics of the current methods and some of the improved methods described here. Although the amount of shear tolerated by cells during initial binding is much less than commonly known, there are low shear processes that can be used to achieve much higher cell contact efficiency than cell separation efficiency than current methods. The shear force during contact must be maintained below about 0.02 dynes / cm.sec, which is the maximum limit of the observed bonding force indices.
A quantidade de ligação de células não específicas ã superfície de afinidade pode ser grandemente reduzida realizando processos a um nível de corte correcto. Movimentando o meio em relação ã superfície de afinidade de modo a que a força de corte seja intermediária entre a força que liga as células que se unem de modo específico e as que são ligadas de modo não esoecífico, reduz-se a ligação não específica significativamente. 'Jma outra técnica de interesse para redução da ligação não específica e permitir que as células se liguem e desenvolvam uma elevada força de ligação com baixo corte, gerando posteriormente um corte elevado para desalojar e remover as células ligadas de modo não esoecífico que não desenvolvem uma força de ligação tão forte co mo as das células que se unem de modo específico.The amount of binding of non-specific cells to the affinity surface can be greatly reduced by carrying out processes at the correct cutting level. By moving the medium relative to the affinity surface so that the shear force is intermediate between the force that connects the cells that specifically join and those that are not specifically connected, the non-specific bond is significantly reduced . Another technique of interest for reducing non-specific binding and allowing cells to bind and develop a high binding force with a low cut, subsequently generating a high cut to dislodge and remove non-specifically linked cells that do not develop a binding strength as strong as that of cells that unite in a specific way.
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-20- \-20- \
Area da Superfície de AfinidadeAffinity Surface Area
Os processos de separação das células podem também ser me lhorados, de acordo com a presente invenção, por selecção da ãrea de superfície de afinidade apropriada no dispositivo de separação das células. Esta selecção baseia-se na constante de equilíbrio da ligação Keq (avidez) para a ligação das células ã suoerfície de afinidade:Cell separation processes can also be improved, according to the present invention, by selecting the appropriate affinity surface area in the cell separation device. This selection is based on the equilibrium constant of the Keq bond (avidity) for the binding of cells to their affinity surface:
Keq _ ____[células ligadas ]__________ [células livres] x [sítios livres] Keq _ ____ [linked cells] __________ [free cells] x [free sites]
As tentativas para ligar todas as células alvo numa mistura num tratamento são inúteis devido ao fenômeno de equilíbrio da ligação. Uma vez que uma grande proDorção de células tenha s_£ do ligada, proporciona um aumento muito grande dos sítios de ligação por afinidade (ou ãrea) para ligar mais células. Contudo, utilizando grandes areas de superfície de afinidade, aumenta-se em proporção a ligaçao não-esnecífica, Por exemplo, se 10 cm de ãrea de afinidade ligaram 90% de células alvo com 2% de ligação não esoecífica, então seriam necessários 100 cm da mesma area de afinidade para proporcionar 99% de ligação de células alvo e a ligação não-específica seria de cerca de 20%,Attempts to bind all target cells in a mixture in a treatment are useless due to the phenomenon of binding balance. Once a large proportion of cells have been bound, it provides a very large increase in affinity (or area) binding sites to bind more cells. However, using large areas of affinity surface, non-nonspecific binding is increased in proportion. For example, if 10 cm of affinity area bound 90% of target cells with 2% nonspecific binding, then 100 cm would be required. from the same area of affinity to provide 99% target cell binding and non-specific binding would be about 20%,
A constante de equilíbrio da ligação varia entre 10^θ e 10^8 M'1 dependendo do tiDO de células, do ligante de afinidade, do . _ meio e da técnica de imobilização. A concentração dos sítios de ligação ê proporcional ã ãrea de superfície de afinidade; mediu-se o número dos referidos sítios e concluiu-se variarem até ~21’ /The equilibrium constant of the bond varies between 10 ^ θ and 10 ^ 8 M ' 1 depending on the cell type, the affinity ligand, the. _ means and the immobilization technique. The concentration of the binding sites is proportional to the affinity surface area; the number of said sites was measured and found to vary up to ~ 21 '/
2 ~ -r χ 10° sítios cm. Embora a concentração actual dos sítios de ligação escolhidos varie bastante consoante a aplicação específica, a célula alvo, o ligante de afinidade e a base, os valores óptimos são geralmente 10 vezes inferiores ã concentração de células alvo no meio e de preferência 2 vezes inferiores a referida concentração em que a concentração dos sítios de ligação ê de finida como a área de afinidade por unidade de volume multiolic^ do pelo número de sítios de ligação por unidade de ãrea, A concentração dos sítios de ligação óptima calcula-se utilizando as equações de equilíbrio da ligação para as células alvo e para as células ligadas de modo não-específico, Igualando a zero a derivada da taxa da ligação específica para a não-esnecífica em rela ção a concentração dos sítios de ligação, oode resolver-se para a concentração óptima dos sítios de ligação:2 ~ -r χ 10 ° sites cm. Although the actual concentration of the chosen binding sites varies greatly depending on the specific application, the target cell, the affinity ligand and the base, the optimum values are generally 10 times less than the concentration of target cells in the medium and preferably 2 times less than said concentration in which the concentration of the binding sites is defined as the area of affinity per unit volume multiplied by the number of binding sites per unit area. The concentration of the optimal binding sites is calculated using the equations of binding balance for target cells and nonspecifically bound cells, equal to zero the derivative of the specific nonspecific binding rate in relation to the concentration of the binding sites, can be resolved to the concentration connection sites:
K _ _ [_B.J___ ~ [T-B] [S-B] em que 3 = concentração de células alvo ligadas K _ _ [_B.J ___ ~ [TB] [SB] where 3 = concentration of bound target cells
T = concentração de células alvoT = concentration of target cells
K = constante de equilíbrio de ligação para células alvoK = binding equilibrium constant for target cells
S = concentração dos sítios de ligação,S = concentration of binding sites,
Resolvendo para B que utiliza a fórmula quadrática:Solving for B using the quadratic formula:
B2-(S+T+1/K)B+TS = 0 (7)B 2 - (S + T + 1 / K) B + TS = 0 (7)
B = 1 /2[ ( S + T+1 jK) - V (S+T+ 1 /K) 2-4TS _7 (8)B = 1/2 [(S + T + 1 jK) - V (S + T + 1 / K) 2 -4TS _7 (8)
-22A taxa da ligação de células específicas oara nao-especí fica pode ser representada de modo similar:-22 The rate of binding of specific or non-specific cells can be represented in a similar way:
B . 1/B/S+T-O/Kl-__________VstTtRÚ-^TS 7B . 1 / B / S + T-O / Kl -__________ VstTtRÚ- ^ TS 7
N 1~/2Ζ·(5 + Τη+'4η- V(s+Tn+ /κη! ’5TS -7 em que N = concentração de células ligadas de modo não-e^ □ecíficoN 1 ~ / 2Ζ · (5 + Τ η + '4 η - V (s + T n + / κ η ! ' 5TS - 7 where N = concentration of non-e ^ □ bound cells
T = concentrarão de todas as células n '( = constante de equilíbrio da ligação para as cé lulas que se ligam independentemente do ligan teT = will concentrate of all n 'cells (= equilibrium equilibrium constant for cells that bind regardless of the ligand
A concentração óptima dos sítios calcula-se igualando a zero a derivada da equação (9) em relação ao S e resolvendo naThe optimal concentration of the sites is calculated by equalizing the derivative of equation (9) with respect to S and solving in the
Com densidades de sítios de afinidade e concentracões de células alvo vulgarmente utilizadas, isto corresponde a menos deWith densities of affinity sites and concentrations of commonly used target cells, this corresponds to less than
- - 10 c.rii de area de afinidade/ml de meio. Isto e menos do que e normalmente utilizado na técnica anterior.- - 10 c.rii of affinity area / ml of medium. This is less than and is normally used in the prior art.
A natureza do equilíbrio da ligação da célula requer a u tilização de ãreas de superfície de afinidade relativamente grandes quando essencialmente todas as células alvo da mistura são para ser retidas num tratamento. Quando se desejam amostras muito puras de uma sub-população de células alvo e o rendimento ζThe nature of the cell binding balance requires the use of relatively large affinity surface areas when essentially all the target cells in the mixture are to be retained in a treatment. When very pure samples of a sub-population of target cells are desired and yield ζ
-23do tipo de célula é uma oreocupação secundaria, é necessária ou desejável muito menos área uma vez que a quantidade de ligação de células não-específica é geralmente proporcional à área da superfície. Geralmente, a área seleccionada que utiliza a con£ tante de equilíbrio e consideravelmente inferior a normalmente prati cada.-23 of the cell type is a secondary concern, much less area is required or desirable since the amount of non-specific cell binding is generally proportional to the surface area. Generally, the selected area using the equilibrium constant is considerably less than normally practiced.
Utilizando os processos anteriormente descritos nara aumentar a proporção de contacto entre as células e a sunerfície de afinidade, limitar a força de corte sobre as células ligadas, e seleccionar uma área de suDerfície de afinidade aprooriada , resulta em excelentes separações de células nor afinidade que proporcionam elevados rendimentos e/ou nurezas elevadas das céli£ las alvo. Podem utilizar-se os vários nrocessos isoladamente ou em combinação uns com os outros, se se desejar.Using the processes previously described to increase the proportion of contact between cells and the affinity surface, limit the shear force on the bound cells, and select an area of affinity surface that results in excellent cell separation and affinity that provide high yields and / or high hardness of the target cells. The various procedures can be used alone or in combination with each other, if desired.
EXEMPLO 1EXAMPLE 1
Ligação de Anticorpos a uma sunerfície de prato de culturaBinding of Antibodies to a culture dish surface
Utilizam-se os nrocessos a seguir descritos para ligar an ticorpos a superfície de um prato de cultura de poliestireno ou a superfície de uma pérola magnética. Imobilizou-se um anticorpo do antí-IgM de rato desenvolvido em cabra (G x R IgM) (Canoel) sobre pratos para cultura de tecidos em poliestireno, de 35 mm, numa concentração de 0,1 ^g/cm utilizando o nrocesso seguinte . Adicionou-se a cada cavidade do prato de cultura um volume de 0,3 ml de uma solução de carbodi-imida (0,05 o de cloridrato de carbodi-imida por ml de acetato de sódio 0,1M ; pH 4,8) e 0,3 mlThe procedures described below are used to attach antibodies to the surface of a polystyrene culture dish or the surface of a magnetic bead. A goat anti-IgM antibody developed in goat (G x R IgM) (Canoel) was immobilized on 35 mm polystyrene tissue culture dishes at a concentration of 0.1 µg / cm using the following procedure . A volume of 0.3 ml of a carbodiimide solution (0.05 o carbodiimide hydrochloride per ml 0.1M sodium acetate; pH 4.8) was added to each well of the culture dish. and 0.3 ml
-24- / contendo 0,96 jig de anti-IgM de rato desenvolvido em cabra por ml de acetato de sódio 0,1 M; pH 4,8. Incubou-se o prato com oscilação durante 60 minutos a 25°C. Lavaram-se as cavidades três vezes com 3 ml de PBS. Adicionou-se a cada prato um segun do anticorpo ou anticorpo de retenção em 3 ml de PBS ã concentra^ ção de 3 jig/ml . Incubaram-se de novo os pratos a. temperatura am biente durante uma hora sem misturar. Lavou-se duas vezes o excesso de anticorpo com 3 ml de aliquotas de PBS e uma alíquota de PBS contendo 1% de soro de vitelo fetal inactivado aquecido (FCS) (Gibco). Bloquearam-se ou suprimiram-se os restantes sí tios de ligação da proteína sobre a placa adicionando 0,1% de albumina de soro de bovino (BSA), em 3 ml de PBS, ao prato. Incubou-se o prato durante 30 minutos ã temperatura ambiente sem misturar. Finalmente, lavou-se o prato três vezes com aliquotas de 3 ml de PBS. Num caso o segundo anticorpo foi designado por 187,1, que é específico para imunoglobulina de murganho e foi obtido por Jonh McKarn (E. I. du Pont de Nemours and Company, Glenolden, PA). Num outro caso, o segundo anticorpo foi designado por 7D4, que ê um anticorpo monoclonal de IgM desenvolvido em rato, específico para uma subunidade receptora de murganho IL-2. 0 7D4 foi obtido por Tom Waldman, NCI, Bethesda, MD./ Containing 0.96 µg of goat anti-IgM developed in goat per ml of 0.1 M sodium acetate; pH 4.8. The plate was incubated with oscillation for 60 minutes at 25 ° C. The wells were washed three times with 3 ml of PBS. One second of the antibody or retention antibody in 3 ml of PBS was added to each dish at a concentration of 3 µg / ml. The dishes were incubated again. room temperature for one hour without mixing. The excess antibody was washed twice with 3 ml of PBS aliquots and an PBS aliquot containing 1% heated inactivated fetal calf serum (FCS) (Gibco). The remaining protein binding sites on the plate were blocked or deleted by adding 0.1% bovine serum albumin (BSA), in 3 ml of PBS, to the dish. The dish was incubated for 30 minutes at room temperature without mixing. Finally, the dish was washed three times with 3 ml aliquots of PBS. In one case the second antibody was designated 187.1, which is specific for mouse immunoglobulin and was obtained by Jon McKarn (E. I. du Pont de Nemours and Company, Glenolden, PA). In another case, the second antibody was designated 7D4, which is an IgM monoclonal antibody developed in a mouse, specific for an IL-2 mouse receptor subunit. 7D4 was obtained by Tom Waldman, NCI, Bethesda, MD.
Ligaram-se também moléculas de anticorpos a pratos de cultura por simples adsorção. Para o processo de acoplamento por adsorção física, adicionou-se 3 ml de uma solução salina tampo nada de fosfato ao prato antes da adição do primeiro anticorpo.Antibody molecules were also attached to culture dishes by simple adsorption. For the coupling process by physical adsorption, 3 ml of a phosphate-buffered saline solution was added to the dish before adding the first antibody.
Deixou-se que o primeiro anticorpo se adsorvesse ã placa durante uma hora ã temperatura ambiente antes de se lavar três vezes com 3 ml de PBS. Utilizou-se o primeiro anticorpo para ligar ã base umThe first antibody was allowed to adsorb to the plate for one hour at room temperature before washing three times with 3 ml of PBS. The first antibody was used to bind a base to the base
segundo anticorpo com afinidade esoecífica oara a célula alvo (i. é, o ligante de afinidade). Pode utilizar-se o segundo ant$ corpo como uma sobrenadante da cultura de células de mieloma. Adicionou-se o segundo anticorpo a 3 ml de PBS nos oratos e incu baram-se de modo estático durante uma hora ã temperatura ambiente. Lavaram-se os pratos duas vezes com PBS, uma vez com PBS+1 % de FCS, e parou-se com 0,1 ml de albumina de soro bovino (BSA) em PBS durante 30 minutos. Lavaram-se os pratos 3 vezes com 3 ml de PBS imediatamente antes da adição das células.second antibody with specific affinity for the target cell (i.e., the affinity ligand). The second antibody can be used as a supernatant for myeloma cell culture. The second antibody was added to 3 ml of PBS in the orates and they were statically incubated for one hour at room temperature. The dishes were washed twice with PBS, once with PBS + 1% FCS, and stopped with 0.1 ml of bovine serum albumin (BSA) in PBS for 30 minutes. The dishes were washed 3 times with 3 ml of PBS just before adding the cells.
EXEMPLO 2EXAMPLE 2
Medições da constante de equilíbrio da ligaçãoConnection equilibrium constant measurements
Efectua ram-se medições da constante de eouilíbrio de 1 i g a^ ção em pratos de corning para cultura de tecidos em poliestireno com 35 mm. Imobilizaram-se os anticorpos que se utilizaram como ligantes de afinidade, sobre a superfície dos pratos oara cultura, utilizando os processos descritos no exemplo 1. Antes da adição de células ã superfície de afinidade, colheram-se as células por centrifugação durante 10 minutos a 1000 x g, decanta^ ram-se e suspenderam-se de novo em PBS + 1% de FCS. Incubou-se um numero seleccionado de células (normalmente 10 ou mais por prato) no prato, durante duas horas a 37°C. Eliminaram-se as ce lulas não-aderentes por decantação do meio a partir do orato e lavou-se o prato duas vezes com 3 ml de alíquotas de PBS + 1% de FCS qi se adicionaram cuidadosamente e se moveram com uma pipeta. Removeram-se as células aderentes por rasnagem do orato com um raspador de PVC e lavando-o duas vezes com PBS+ 1% de FCS. ContaramgAH OCWÍW*·Measurements of the equilibrium constant of 1 µg ation in 35 mm polystyrene tissue culture corning dishes. The antibodies used as affinity binders were immobilized on the surface of the culture dishes using the procedures described in example 1. Before adding cells to the affinity surface, the cells were harvested by centrifugation for 10 minutes at 1000 xg, decanted and resuspended in PBS + 1% FCS. A selected number of cells (usually 10 or more per dish) were incubated in the dish for two hours at 37 ° C. Non-adherent cells were removed by decanting the medium from the orate and the dish was washed twice with 3 ml aliquots of PBS + 1% FCS which were added carefully and moved using a pipette. Adherent cells were removed by scraping the orate with a PVC scraper and washing it twice with PBS + 1% FCS. ContaramgAH OCWÍW * ·
-26-(-26- (
-se as células num contador Coulter com uma abertura de 50 micra .cells are placed in a Coulter counter with a 50 micron opening.
Para as experiências de equilíbrio, os controles para a especificidade da ligação das células consistiram em pratos que tinham sido submetidos ao mesmo tratamento, mas receberam o segundo anticoroo para a célula alvo a ser retida. Os outros coji troles para a especificidade de ligação de células que foram testados, incluíam pratos sem o orimeiro anticorpo e prato com um segundo anticorpo irrelevante, não específico para a célula alvo. Efectuaram-se os controles durante toda a experiência oara todas as variáveis. Algumas das fontes mais importantes de variação na eficiência da ligação de células incluem a idade, a saúde e a actividade das células; a eficiência da ligação do segundo anticorpo;'e o processo para limpar com jacto de água as células não-aderentes dos pratos.For equilibrium experiments, the controls for cell binding specificity consisted of dishes that had undergone the same treatment, but received the second antibody to the target cell to be retained. The other controls for cell binding specificity that were tested, included dishes without the first antibody and dish with a second irrelevant antibody, not specific for the target cell. Controls were carried out throughout the experiment for all variables. Some of the most important sources of variation in the efficiency of cell binding include the age, health and activity of the cells; the efficiency of binding the second antibody; 'and the process of cleaning the non-adherent cells of the dishes with a water jet.
Determinou-se o número total de células retidas nor unida de de área pela superfície de afinidade, em função da quantidade (densidade) de anticorpo inicialmente anlicado aos oratos nara células CTLL (American Type Culture Collection P1B-162) reti das pelo anticorpo 7D4 que tinha sido fisicamente absorvido nelo anti-IgM de rato desenvolvido em cabra. 0 anticorpo de anti-IgM de rato desenvolvido em cabra foi ligado de modo covalente ao prato pelo processo de ligação da carbodi-imida (exemplo 1). Cori cluíu-se que o número total de células retidas atingiu um máximo e diminuiu a níveis muito elevados de 7D4.The total number of cells retained in common by the affinity surface was determined as a function of the amount (density) of antibody initially annealed to the orates in the CTLL cells (American Type Culture Collection P1B-162) retained by the 7D4 antibody that I had been physically absorbed n anti-IgM link mouse developed in goat. The goat anti-mouse IgM antibody developed was covalently bound to the dish by the carbodiimide binding process (example 1). Cori concluded that the total number of cells retained reached a maximum and decreased to very high levels of 7D4.
Determinou-se a ligação de células em função da concentra^Cell binding was determined as a function of concentration.
çao das células. Fizeram-se estas experiências utilizando um ní _ 2 vel optimo de anticorpo de 7D4 (1,0 jjg/cm ). A constante de eaui líbrio da ligação (Keq) define-se [ B 7 como Keq = [ T-B ] C S- 3] em que B = células ligadas de modo específicocells. These experiments were performed using an optimal level of 7D4 antibody (1.0 µg / cm). The binding free eaui constant (Keq) is defined [B 7 as Keq = [T-B] C S-3] where B = cells specifically linked
T = total de célulasT = total cells
S = total de sítios e os parêntesis indicam concentraçãoS = total sites and parentheses indicate concentration
Determinou-se a constante de equilíbrio e a densidade de sítios a partir de dados da ligação utilizando métodos de regre£ são não-linear. As densidades dos sítios e as constantes de equilíbrio de ligação para os vários sistemas de sunerfície de afing dade e de células representativas estão resumidas no quadro I. Existem vários pontos imoortantes a notar nos dados apresentados no quadro I. A imobilização covalente do primeiro anticorno pro poreiona valores muito diferentes dos que a adsorção física proporciona. A adsorção física proporciona densidades de sítios equivalentes oara 5 mono- camadas de células com 7?4. Λ liqação covalente directa de 7D4 e a ligação covalente do nrimeiro anticorpo (anti-IgM de rato desenvolvido em cabra) senuida da adsorção física de 7D4, proporcionam resultados comparáveis. Nota-se o efeito dramático do FCS no meio. í notória a semelhança de va lores obtidos com diferentes superfícies (pratos para cultura em poliestireno VS. partículas magnéticas). As grandezas das consThe equilibrium constant and site density were determined from binding data using non-linear regression methods. The site densities and the link equilibrium constants for the various affinity and surface cells systems are summarized in Table I. There are several important points to note in the data presented in Table I. The covalent immobilization of the first pro values very different from those that physical adsorption provides. Physical adsorption provides density of sites equivalent to 5 monolayers of cells with 7? 4. The direct covalent bonding of 7D4 and the covalent bonding of the first antibody (anti-mouse IgM developed in goat), which is not affected by the physical adsorption of 7D4, provide comparable results. Note the dramatic effect of the FCS in the middle. The similarity of values obtained with different surfaces is notorious (culture dishes made of polystyrene VS. magnetic particles). The magnitudes of cons
-28tes de equilíbrio da ligação referidas no quadro Γ são muito ele vadas. Os valores da literatura nara as constantes de equilíbrio da ligação de anticoroos monoclonais oara os seus antiaénios em solução livre variam entre cerca de 10®e ΙΟ^θ Μ \ A densidade dos sítios define-se aqui como o numero máximo de células que se podem ligar a superfície. As constantes de equilíbrio de ligaçao muito elevadas determinadas oara a ligação das células nara uma superfície revestida de anticorpos tem origem no facto de muitos sítios de ligação do anticoroo estarem ocupados Dor uma uníca cé lula e muitas ligações serem formadas deste modo entre a suoerfí cie de afinidade e uma célula individual.-28 connection balance towers referred to in table Γ are very high. The values in the literature for the equilibrium constants of monoclonal anti-choroid binding to their antiagens in free solution vary between about 10® and ΙΟ ^ θ Μ \ The density of the sites is defined here as the maximum number of cells that can be connect the surface. The very high binding equilibrium constants determined for the binding of cells to an antibody-coated surface originates from the fact that many antibody binding sites are occupied by a single cell and many bonds are formed in this way between their surface area. affinity and an individual cell.
A razão fundamental para a elevada afinidade ou avidez da célula para a superfície de afinidade é a formação de múltiplas ligações entre as células e a superfície que reduz drasticamente a velocidade de desabsorção das células.The fundamental reason for the high affinity or avidity of the cell for the affinity surface is the formation of multiple bonds between the cells and the surface which drastically reduces the rate of cell desorption.
-29QUADRO I-29 TABLE I
CONSTANTES DE EQUILÍBRIO E DENSIDADES DE SÍTIOSBALANCE CONSTANTS AND SITE DENSITIES
EXPERIMENTALMENTE MEDIDAS PARA VÁRIAS CÉLULASEXPERIMENTALLY MEASURES FOR VARIOUS CELLS
E COMBINAÇÕES DE SUPERFÍCIES DE AFINIDADEAND AFFINITY SURFACE COMBINATIONS
Constante deConstant of
Dens i dadeDensity
Equilíbrio de SítiosBalance of Sites
G R IgG zana oro dutor de hi bri do-G R IgG zana oro ductor de hi bri
-30Devido ã ligação das células, conforme se demonstrou ajn tes, ser reversível, não e possível ligar todas as células alvo. Assim, as tentativas para aumentar a área de superfície de afinj dade a fim de ligar todas as células alvo alcançarão o ponto de resposta de diminuição quando a ligação específica aumentar mais rapidamente do que a ligação específica das células alvo ã super fície de afinidade.-30 Due to the binding of the cells, as has been shown, to be reversible, it is not possible to ligate all target cells. Thus, attempts to increase the affinity surface area to bind all target cells will reach the point of diminishing response when the specific binding increases more rapidly than the specific binding of the target cells to the affinity surface.
EXEMPLO 3EXAMPLE 3
AREA DA SUPERFÍCIE DE AFINIDADEAFFINITY SURFACE AREA
Imobilizou-se um anticorpo de anti-IgG de murganho deseri volvido em cabra (Jackson Immunoresearch) sobre um prato para cuj turas de tecido em poliestireno, conforme se descreveu no exemplo 1. 0 ligante de afinidade do segundo anticorpo, um anticorpo mo noclonal designado por GL439, específico para uma subunidade de receptor de IL2 humano (Tac) foi ligado à superfície revestida com anti-IgG de murganho desenvolvido em cabra numa concentraçãoA goat anti-mouse IgG antibody immobilized (Jackson Immunoresearch) was immobilized on a polystyrene tissue dish, as described in example 1. The second antibody affinity binder, a mo noclonal antibody designated by GL439, specific for a human IL2 receptor (Tac) subunit, was attached to the surface coated with goat anti-mouse IgG developed at a concentration
7 de 1,0 jjg/cm . Adicionaram-se 10 células de ser humano HUT 102 (ATCC P1B-162) a diferentes áreas de superfícies de afinidade. A ligação _e cel la_ específica e não específica foi a seguinte;7 of 1.0 µg / cm. 10 human cells HUT 102 (ATCC P1B-162) were added to different areas of affinity surfaces. The _and cel la_ specific and non-specific link was as follows;
% de li nação% li li on
** Ligaçao ã superfície preparada usando o** Connection to the prepared surface using the
A recolha de células a partir de sangue completo é uma ta refa particularmente difícil devido ã elevada densidade de cêluQ las (3 a 5xl0/ml) e a elevada viscosidade do sangue que reduz drasticamente a eficiência de contacto das células a um dado nível de corte. Adicionaram-se 2xl08 células CTLL de murganho a ml de sangue humano completo (heparinizado) a 4oC. Suspendenram-se pérolas magnéticas (Dynal ME-450) revestidas com 7D4, um anticorpo monoclonal de IgM contra uma sub-unidade de receptor >32IL-2 de murganho (TAC), em sangue ã concentração de 4 x lO^/ml.The collection of cells from whole blood is a particularly difficult task due to the high density of cells (3 to 5x10 / ml) and the high blood viscosity which drastically reduces the contact efficiency of cells at a given cutoff level . Were added 2xl0 8 mouse CTLL cells ml of whole human blood (heparinized) at 4 ° C up Suspendenram magnetic beads (Dynal ME-450) coated with 7D4, a monoclonal antibody against IgM receptor subunit > 32IL-2 mouse (TAC), in blood at a concentration of 4 x 10 6 / ml.
Calcula-se esta concentração de pérolas para proporcionar uma ta xa de contacto de 7,5 x 10^ colisões/seg/ml que é suficiente para assegurar que 99% das células CTLL estejam em contacto, pelo menos uma vez durante a incubação de duas horas, Outros protoco los publicados (embora nenhum relatório anterior tenha citado a aplicação a sangue completo) utilizam taxas de contacto da ordem de grandeza inferior a esta (Kemshead, et al,, Adv, in Neuroblasy toma Res., p. 413-423. Alan R. Liss, 1985). Apõs duas horas, recolheram-se as pérolas e as células aderentes utilizando um magneto, decantaram-se as células não-aderentes e lavaram-se as pérolas por ressuspensão em 1 ml de PBS, recolhendo-as com um magneto, e decantando o PBS três vezes. Detectaram-se as células CTLL nas misturas por coloração com anti-THY 1,2 marcado com f1uoresceína, um anticorpo monoclonal de IgG de rato, especifico para o marcador de células T THY 1,2 (Becton Dickinson), e anali sando-as num citõmetro de fluxo. A concentração inicial de cêlu las CTLL foi de 0,03%; a concentração final variou entre 6 e 63% com um rendimento entre 13 e 48%. A força de corte sobre uma cê lula na superfície de uma pérola foi de cerca de 1,6 x 10 dines/cm e o tempo de contacto foi de cerca de 0,4 minutos. Nestas condições, a força de corte, F, dividida pelo quadrado doThis bead concentration is calculated to provide a contact rate of 7.5 x 10 ^ collisions / sec / ml which is sufficient to ensure that 99% of CTLL cells are in contact at least once during the incubation of two hours, Other published protocols (although no previous report cited the application in whole blood) use contact rates of the order of magnitude lower than this (Kemshead, et al ,, Adv, in Neuroblasy takes Res., p. 413-423 Alan R. Liss, 1985). After two hours, the beads and adherent cells were collected using a magnet, the non-adherent cells were decanted and the beads were resuspended in 1 ml of PBS, collected with a magnet, and decanted the PBS 3 times. CTLL cells were detected in the mixtures by staining with fluorescein-labeled anti-THY 1,2, a mouse IgG monoclonal antibody, specific for the THY 1,2 T cell marker (Becton Dickinson), and analyzing them in a flow cytometer. The initial concentration of CTLL cells was 0.03%; the final concentration varied between 6 and 63% with a yield between 13 and 48%. The shear force on a cell on the surface of a pearl was about 1.6 x 10 dynes / cm and the contact time was about 0.4 minutes. Under these conditions, the cutting force, F, divided by the square of the
- -10 2 2 tempo de contacto, tc, e de cerca de 10 dines/cm /min .- -10 2 2 contact time, t c , and about 10 dynes / cm / min.
EXEMPLO 5EXAMPLE 5
UTILIZAÇÃO DA RENOVAÇÃO DA SUPERFÍCIE PARAUSE OF SURFACE RENEWAL FOR
AUMENTAR A EFICIÊNCIA DE CONTACTO DEINCREASE THE CONTACT EFFICIENCY OF
SUPERFÍCIE DE AFINIDADE E DAS CÉLULASAFFINITY AND CELL SURFACE
-33Imobi1izou-se umanticorpo de anti-IgG de murganho deseji volvido em cabra (Jackson Immunoresearch) num sector de 70 cm de um frasco de Corning de rotação para cultura de tecidos, de-33Imobi1ized a desired goat anti-mouse IgG antibody (Jackson Immunoresearch) in a 70 cm section of a rotating Corning flask for tissue culture,
OO
490 cm . Ligou-se um anticorpo monoclonal, designado por 7G7, específico para uma subunidade do receptor de IL2 humano (TAC), ã superfície revestida com anti-IgG de murganho desenvolvido em490 cm. A monoclonal antibody, designated 7G7, specific for a human IL2 receptor (TAC) subunit, was attached to the surface coated with mouse anti-IgG developed in
7 cabra na concentração de 0,08 pg/cm . Adicionou-se 10 células de ser humano HUT 102 (ATCC P1B-162) a 7m1 de sangue humano completo. Submeteram-se os frascos a rotação a 1 rpm durante 1 hora a 26°C.7 goat at a concentration of 0.08 pg / cm. 10 human cells HUT 102 (ATCC P1B-162) were added to 7m1 of whole human blood. The vials were rotated at 1 rpm for 1 hour at 26 ° C.
A taxa de contacto da superfície e da célula foi de cerca de x 10®col i sões/( seg . ml), a força de corte sobre as células na superfície foi de 0,4 dines/cm , o tempo medio de contacto por colisão foi de 10,8 segundos. Baseadas na constante de enijilíbrio de 10^®M~^ (litros/mole de células), a densidade máxima de sítios das células de 7,9 x 10 /cm , e a área disnonível de pThe contact rate of the surface and the cell was about x 10® collisions / (sec. Ml), the shear force on the cells on the surface was 0.4 dynes / cm, the average contact time per collision was 10.8 seconds. Based on the 10 ^ ®M ~ ^ (liters / mole of cells) enijilibrium constant, the maximum cell site density of 7.9 x 10 / cm, and the non-available area of p
cm , a recolha de células em equilíbrio prevista seria decm, the expected equilibrium cell collection would be
92%.92%.
Analisaram-se as células aderentes e não-aderentes num citõmetro de fluxo por coloração das células HUT com 7G7 e depois com anticorpo de murganho desenvolvido em cabra marcado com FITC (Tago). Recolheram-se 34% das células HUT juntamente com anenas 0,6% de células sanguíneas. Nestas condições, a força de corte, F, dividida pelo quadrado do tempo de contacto, tc, é de 12,3 di^ nes/cm /min . Em condiçoes estáticas (apenas sedimentação) a ta xa de colisão é 1/12 da taxa antes referida e a lioação de células HUT a partir de sangue completo não Õ distinguível sobre o fundo (1 %).Adherent and non-adherent cells were analyzed on a flow cytometer by staining the HUT cells with 7G7 and then with mouse antibody developed in FITC-labeled goat (Tago). 34% of HUT cells were collected together with only 0.6% of blood cells. Under these conditions, the shear force, F, divided by the square of the contact time, t c , is 12.3 dimes / cm / min. Under static conditions (sedimentation only) the collision rate is 1/12 of the aforementioned rate and the lyonation of HUT cells from whole blood is not distinguishable on the bottom (1%).
EXEMPLO 6EXAMPLE 6
UTILIZACAO DE UM FLUXO NAO ESTACIONÁRIO PARA — ,. —— rf , , ..................... , ....USE OF A NON STATIONARY FLOW FOR -,. —— rf,, ....................., ....
APERFEIÇOAMENTO DOS PROCESSOS DE SEPARAÇAO DE CÉLULAS POR AFINIDADEIMPROVING CELL SEPARATION PROCESSES BY AFFINITY
A utilização de fluxo instável apresenta várias vantagens para os processos de recolha de células por afinidade. 0 fluxo instável aumenta a eficiência da colisão ao romper as camadas Π mites de fluxo. Com uma selecção adequada de débitos, os proces_ sos de fluxo instável proporcionam, em tempos diferentes, forças de corte reduzidas que aumentam a eficiência da ligação durante o contacto das células e forças de corte aumentadas para reduzir o nível da ligação de células não-específica.The use of unstable flow has several advantages for affinity cell collection processes. The unstable flow increases the collision efficiency by breaking the flow boundaries. With an adequate selection of flow rates, unstable flow processes provide reduced shear forces at different times that increase the efficiency of binding during cell contact and increased shear forces to reduce the level of non-specific cell binding .
Revestiu-se um frasco de rotação de Corning para cultura pA spinning bottle of Corning for p culture was coated
de tecidos (490 cm ) com o primeiro anticorpo de anti-IgM de rato desenvolvido em cabra e (lepois com 7D4, um anticorpo de IgM com receptores de IL2 de roedores. Adicionaram-se 8 x 10θ células CTLL em 20 ml de meio de Iscove com 15% de soro de vitelo ao frasco e incubaram-se de modo estático durante 4 minutos, a 22°C. Submeteu-se o frasco a rotação a 5 rpm durante um minuto e depois deixou-se em repouso durante mais quatro minutos. Apôs seis des^ tes ciclos (30 minutos), a ligação das células foi de 57% enquan to a ligação não específica foi apenas de 4%. As células e os frascos preparados de modo idêntico, mas submetidos a rotação de modo estático a 1 rpm ligaram apenas 30% das células com 12% de ligação não específica. Nas condições da exneriéncia, a densidjj _ 5 ?of tissues (490 cm) with the first goat anti-IgM antibody developed in goats and (after with 7D4, an IgM antibody with rodent IL2 receptors. 8 x 10θ CTLL cells were added in 20 ml of Iscove with 15% calf serum to the flask and were incubated in a static manner for 4 minutes at 22 ° C. The flask was rotated at 5 rpm for one minute and then left to stand for another four minutes. After six cycles (30 minutes), cell binding was 57% while nonspecific binding was only 4% Cells and flasks prepared in the same way, but rotated statically at 1 rpm linked only 30% of the cells with 12% non-specific binding In the conditions of experience, the density?
de dos sítios de ligaçao das células foi de 7,9 x 10 /cm“, a consof the cell binding sites was 7.9 x 10 / cm “, the consensus
35-/ tante de equilíbrio de ligaçao ê de .99 x 10^® litros/mole de cê lulas, a velocidade média de colisão em cada experiência foi de cerca de 200 colisoes/(seg.cm ) , a força de corte, quando em ro2 tação, a 1 rpm, foi de cerca de 0,02 dines/cm e cerca de 0,12 dines/cm a 5 rpm. Nestas condições, a ligação de equilíbrio foi de 77% do total de células adicionadas. 0 tempo médio de contacto a 1 rpm foi de 10,8 seg, o tempo de contacto a 5 rpm foi de 2,2 seg, o tempo médio de contacto durante os intervalos estã ticos foi de 2 minutos. A força de corte dividida relo quadrado35- / amount of bonding balance is .99 x 10 ^ ® liters / mole of cells, the average collision speed in each experiment was about 200 collisions / (sec.cm), the cutting force, when in rotation, at 1 rpm, it was about 0.02 dynes / cm and about 0.12 dynes / cm at 5 rpm. Under these conditions, the equilibrium bond was 77% of the total cells added. The average contact time at 1 rpm was 10.8 sec, the contact time at 5 rpm was 2.2 sec, the average contact time during static intervals was 2 minutes. The cutting force divided by square watch
2 do tempo de contacto a 1 rpm foi de 0,617 (dines/cm /min ), a 52 of the contact time at 1 rpm was 0.617 (dynes / cm / min), at 5
2 rpm foi de 89 (dines/cm /min ) e de modo estático foi de 0.2 rpm was 89 (dynes / cm / min) and static was 0.
Claims (40)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US20203488A | 1988-06-03 | 1988-06-03 |
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