【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は、成人型Ｔ細胞性白血病（ADULT
Ｔ―CELL LEUKEMIA、以下「ATL」と呼ぶ）
に関連する抗体の測定方法、詳しくはATL患者
の血清と特異的に反応する新規な抗原性蛋白
（ATL関連抗原、ATL―associated antigen、以
下「ATLA」と呼ぶ）を不溶性支持体に固定化
した不溶化抗原を用いて螢光もしくは酵素免疫測
定法によつて、上記ATLAの抗体を容易迅連に
測定する新しい方法に関する。
ATLは、成人が罹病する悪性の疾患であるが、
現在その病因は尚解明されていない
〔Takatsuki，K.Uchiyama，T.，Saqawa，K.
and Yodoi，J.，（1977）in Topics in
Hematoloay，、eds.Seno，S.，Takaku，F.，
and Irino，S.（Excepta Medica，
Amsterdam），pp73−77及びUchiyama，T.，
Yodoi，J.，Saqawa，K.，Takatsuki，K.and
Uchino，H.，Blood50，481−492（1977）等参
照〕。
近年上記ATLの診断等を可能とするATLA抗
体の螢光免疫測定法による測定技術が提案された
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，Vol.78，No.10，
p6476−6480（1981）〕。この方法は培養ATL細胞
そものものを抗原として、これをガラススライド
上に載置し、該スライド上で被検血清及び螢光標
識抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体と反応させて検鏡
下に螢光標識物質の局在を観察・測定するもので
あつた。しかしながら上記方法は、抗原として生
きた細胞自体を用いること及び一検体（被検血
清）ごとに検鏡下観察を行なうことを必須とする
ため、その操作が頻雑であることは勿論のこと、
大量の検体を容易迅連に測定及び診断できないと
いう欠点があつた。また測定法を一般に普及する
場合は、一定条件下で測定を行ない得ることが必
要な要件となるが、上記提案された方法では生の
細胞自体を利用することに基づき、その抗原陽性
率の変動を回避し得く、一定の抗原が常に安定し
て入手困難で、惹いては測定及び診断の誤りを招
く危険があつた。
本発明は、上記ATLA抗体の測定方法に見ら
れる諸問題を悉く解消した新しいATLA抗体の
測定法を提供するものである。
即ち本発明はATL細胞の可溶性細胞質蛋白及
びATLウイルスの可溶化処理蛋白から選ばれた
少なくとも１種を、不溶性支持体に固定化してな
る不溶化抗原を用いることを特徴とする螢光もし
くは酵素免疫測定法によるATLA抗体の測定法
に係る。
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、培養
ATL細胞の可溶性細胞質蛋白（以下「SCP」と
する）及びATLウイルスの可溶化処理蛋白（以
下「VAP」とする）がATLA抗体と特異的に反
応する抗原となり得ることを見い出し、更にこれ
を不溶性支持体に固定化した不溶性抗原を用いる
時には、大量の検体を容易迅速に且つ常に一定の
条件下に精度良く測定できることを見い出した。
本発明はこの新知見に基づいて完成されたもので
ある。
本発明方法によれば、大量の検体を簡便な操作
で迅速に例えば検鏡下での上記従来法に比し約10
倍以上もの量及び速度で測定することができる。
本発明においてSCPの原料として利用する培養
ATL細胞としては、既に細胞ラインとして確立
されたATL細胞〔Miyoshi，I.，Kubonishi，I.，
Sumida，M.，Hiraki，S.，Tsubota，T.，
Kimura，I.，Miyamoto，K.and Sato，J.，
Gann71，155−156（1980）〕の他、ATL患者の末
梢血或はリンパ節より常法に従い分離したATL
細胞の培養細胞や上記ATL細胞を別個にヒトＴ
細胞と混合培養して得られる培養細胞〔例えば
Nature，294，770−771（1981）〕等を挙げること
ができる。上記混合培養に使用されるヒトＴ細胞
としては特に制限はなく、例えば末梢血、骨髄、
リンパ節、脾臓、扁桃腺、胸腺等に由来する各種
Ｔ細胞をいずれも例示できる。また上記ATL細
胞の培養及び該ATL細胞とヒト細胞との混合培
養は通常の方法により行なうことができる。培地
としては通常の細胞培養に用いられる各種の栄養
培地をいずれも使用できる。好ましい培地として
は例えばRPMI 1640培地（Flow Laboratories
社）、イーグル最低必須培地（MEM培地）等を
ウシ胎児血清（FCS）、仔ウシ血清等の血清補液
を用いて改質した培地等を例示できる。培養条件
は通常の細胞培養に利用される条件と特に異なる
ものではなく、一般には約36〜38℃の温度及び
6.4〜7.6のPHを採用できる。また上記培地にはＴ
細胞増殖因子（TCGF）等の増殖促進剤或は哺乳
類レトロウイルスの誘導剤として知られる各種薬
剤、例えば５―ヨード―2′―デオキシウリジン
（IdUrd）、シクロヘキシイミド（CH）、プロマイ
シン（Puromycin）、フオルボール 12―ミリス
テート 13―アセテート（TPA）、ｎ―ブチレー
ト（ｎ―酢酸ナトリウム）等を適宜添加使用する
ことができる。培養は通常３〜５日毎に液交換を
行なうことにより有利に実施され、これにより所
望細胞を良好に増殖させ得る。
また上記SCPは例えば上記培養ATL細胞を生
理食塩水又はリン酸塩緩衝食塩水等の適当な緩衝
液中でホモジネートした後、遠心分離等の適当な
手段により上清として採取することができる。
本発明においてVAPの原料として利用する
ATLウイルスとしては、例えば上記ATL細胞の
培養液より、常法により分離されたものを挙げる
ことができる。上記ATLウイルスの分離は、通
常の遠心分離法等により行なわれ、本発明では特
に、密度勾配法等に従い更に精製されたATLウ
イルスを用いるのが好ましい。VAPは上記ATL
ウイルスを可溶化することにより収得できる。該
可溶化は通常の可溶化剤を用いて容易に行ない得
る。可溶化剤としては各種の界面活性剤例えば
「トリトンＸ−100」（和光純薬社製）、「NP−40」
（シエル社製）、ジキトニン、尿素等の非イオン性
界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）等
の陰イオン性界面活性剤等を例示できる。可溶化
方法としては特に制限はないが、より好ましくは
可溶化剤を0.01％〜臨界ミセル成形点程度使用し
て、約０〜100℃程度の温度下に数分〜６時間程
度を要して行なわれる。かくして得られるVAP
は、好ましくは例えば遠心分離法、透折法等の通
常の方法に従い更に精製され、更に例えばDEAE
−セルロース、DEAE−セフアデツクス等の陰イ
オン交換カラムに付し、残存するか又はそのおそ
れのあるウイルス核酸を吸着除去するのがよい。
本発明に用いる不溶化抗原は、上記SCP及び
（又は）VAPを、不溶性支持体上に固定化させる
ことにより製造される。用いられる不溶性支持体
としては特に制限はなく、物理的吸着法に常用さ
れる通常のもの、具体的には例えばポリスチレ
ン、ガラス、ポリカーボネート、ポリプロピレン
等の多孔性担体を挙げることができる。之等不溶
性支持体上へのSCP及び（又は）VAPの固定は、
通常の方法に従い行なうことができる。例えば生
理食塩水、リン酸塩緩衝液等の各種液中に不溶性
支持体とSCP及び（又は）VAPを入れ、０〜37
℃程度で約２〜24時間を要して反応させればよ
い。上記反応は、好ましくは減圧条件下に実施さ
れる。反応終了後は、使用した不溶性支持体に残
存する吸着部位を常法に従い、例えば0.2％ゼラ
チン、0.2％ウジ血清アルブミン（BSA）等を用
いて飽和させる。
かくして得られる不溶性抗原は、水洗後乾燥状
態で、又は上記緩衝液中で保存される。
本発明方法は、上記の如くして得られる不溶性
抗原を用いて通常の螢光もしくは酵素免疫測定法
に従い標識された抗原−抗体複合体の標識活性を
測定することにより実施される。より詳細には、
上記不溶性抗原に、必要に応じて希釈された被検
血清を加えて免疫反応させ、これを洗浄後得られ
る抗原−抗体反応物に標識作因剤を反応させて標
識し、この標識された複合体の標識活性を常法に
従い測定する。殊に本発明によれば、上記不溶性
抗原を用いることによつて、一度に大量の被検血
清を一定条件下に容易且つ迅速に精度良く測定で
きる。上記において被検血清としては、例えば
ATLA抗体の測定を所望する被検者より常法に
従い採血した血液から分離された血清、又はこれ
を適当な緩衝液で希釈したものを使用できる。こ
こで用いられる緩衝液は特に制限はないが、通常
リン酸塩緩液（PH7.4）を用いるのが適当である。
また上記被検血清と不溶性抗原との免疫反応は、
単に両者を混合接触させるのみで行ない得る。該
反応は通常約４〜37℃下に約0.5〜16時間で終了
し、反応終了後は適当な緩衝液好ましくは生理食
塩水又は被検血清の希釈に用いた緩衝液で充分に
洗浄するのが望ましい。
上記反応に引き続く、得られる抗原−抗体反応
物の標識作因剤による標識化は、上記と同様の緩
衝液で予め希釈した標識作因剤を上記抗原−抗体
反応物と混合して約４〜37℃下に約0.5〜16時間
反応させることにより行なわれ、反応終了後は上
記と同様にして得られる複合体を充分に洗浄する
のが望ましい。上記において標識作因剤として
は、抗体と特異的に結合する能力を有する物質と
各種の酵素標識物質又は螢光標識物質との結合体
をいずれも使用できる。代表的酵素標識物質とし
ては、例えばパーオキシダーゼ（POX）、キモト
リプシノーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、
グリセロアルデヒド―３―リン酸脱水素酵素、ア
ミラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ―Nase、Ｐ―
Nase等の各種酵素試薬を例示できる。螢光標識
物質としては、例えばフルオレツセイン・イソチ
オシアナート（FITC）、テトラメチルローダミ
ン・イソチオシアナート（TRITC）、置換ローダ
ミン・イソチオシアナート（XRITC）、ローダミ
ンＢ・イソチオシアナート、ジクロロトリアジン
フルオレツセイン（DTAF）等を例示できる。
また之等との結合により標識作因剤となる、抗体
と特異的に結合する能力を有する物質としては、
例えば、「プロテインＡ」（ProA、フアルマシア
社）やヒツジ抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体、ウサ
ギ抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体、ヤギ抗ヒト免液
グロブリンＧ抗体、マウス抗ヒト免疫グロブリン
Ｇ抗体、ラツト抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体等の
抗ヒト免液グロブリンＧ抗体等を挙げることがで
きる。
上記抗体と特異的に結合する能力を持つ物質と
標識物質との結合体は、既に種々作成され市販さ
れており、本発明では標識作因剤として市販の各
種結合体を用いてもよく、また通常知られている
方法〔B.F.ERLANGERら、Acta.Endocrinol.
Suppl.，168，206（1972）、及びM.H.KAROLら、
Proc.Nat.Acad.Sci.，USA，57，713（1967）〕に
従い、新たに結合体を作成して用いてもよい。上
記作成方法として例えば酵素標識物質を用いる場
合は、これと、上記ProA又は抗ヒト免疫グロブ
リンＧ抗体とを適当な酸化剤例えばNaIO4等の存
在下にPH４〜６の緩衝液中で室温付近で２〜５時
間カツプリング反応させ、次いで適当な還元剤例
えばNaBH4等で還元することにより実施される。
各試薬の使用割合としては、ProA又は抗ヒト免
疫グロブリンＧ抗体１モルに対して、酵素標識物
質を約１〜３モル程度、酸化剤を約100〜300モル
程度とし、還元剤は酸化剤の約１〜２倍モル程度
とするのが適当である。
また螢光標識物質を用いて螢光標識作因剤を作
成する場合、螢光標識物質をPH６〜８の水又は生
理食塩水中に入れ、０℃乃至室温付近で、これを
ProA又は抗ヒト免疫グロブリンＧ抗体と約0.5〜
３時間反応させればよい〔螢光抗体法、医化学実
験法講座、No.４，263〜270頁、1972年第１刷発
行、中山書店〕。ProA又は抗ヒト免疫グロブリン
Ｇ抗体に対する螢光標識物質の使用量は、一般に
約1/50重量倍前後とするのが適当である。
本発明における不溶性抗原−被検血清
（ATLA抗体）−標識作因剤から成る複合体の測
定は、用いられた標識作因剤における標識物質に
応じて常法に従い、該複合体の標識活性（酵素活
性又は螢光活性）を求めることにより行なわれ
る。かくして本発明によれば多量の被検血清の
ATLA抗体を容易迅速に測定できる。
以下本発明を更に詳細に説明するため実施例を
挙げるが本発明はこれに限定されるものではな
い。
実施例１ （不溶化抗原の製造）
ATL患者（50才、男性、長崎市在住）よりヘ
パリン採血して得た血液20mlを「フイコールパツ
ク」（フアルマシア・ジヤパン株式会社製）で遠
心分離して、末梢血リンパ球細胞５×107個を得
る。
これを10％仔ウシ血清加RPMI1640培地（フロ
ー ラボラトリーズ社）で、３×105個／mlの細
胞濃度で、37℃下に３日間培養する。この６×
108個を30mlの0.05Mリン酸緩衝液（0.14M NaCl
含有、PH7.4、以下「PBS」という）中で、ホモ
ジナイズし、次いで１時間遠心分離（105000×
ｇ）する。上清を採取し、PBSで蛋白量を120μ
ｇ／ml（この蛋白量は、大塚アツセイ研究所製の
総蛋白定量試薬であるトネイン−TP」を用い
た発色法により測定したものである）に調整し
て、SCP液を得る。
次いで上記SCP液の140mlに、予め0.1N―HCl
水溶液、0.1N−NaOH水溶液及びエタノールに
て順次洗浄したポリスチレンビーズ（直径6.4mm、
Precision Plastic Co.，Ltd.，USA）700個を加
え、アスピレーターによる減圧下に室温で６時間
放置後、過して不溶化抗原を得る。これは0.2
％ゼラチンを含む0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.4）
中に４℃で保存される。
実施例２ （不溶化抗原の製造）
(1) ATL細胞（Kyo−Ya cell、京都大学ウイル
ス研究所より入手）を、10％仔ウシ血清
（FCS）及び50μｇ／ml５−ヨード―2′―デオキ
シウリジン（IdUrd）加RPMI1640培地で、３
×155個／mlの細胞濃度で37℃下に４日間培養
する。培養液を遠心分離（1500rpm、10分）
し、細胞と培養液とを分離収得する。
(2) 上記(1)で得た培養ATL細胞５×109個に、生
理食塩水30mlを加えてホモジナイズし、次いで
１時間遠心分離（105000×ｇ）して上清を採取
し、以下実施例１と同様にして蛋白量120μ
ｇ／mlのSCP液を調整し、これから同様にして
不溶化抗原（抗原吸着ポリスチレンビーズ）を
得る。これは0.2％ゼラチンを含む0.05Mリン
酸塩緩衝液（PH7.4）中に一夜放置後、水洗、
乾燥して保存される。
(3) 上記(1)で得た培養液500mlを遠心分離（40000
×ｇ、１時間）して、沈殿成分を採取する。こ
れを25〜60％シヨ糖密度勾配超遠心に付し、密
度1.15〜1.16の画分を採取する。これを0.5％ト
リトンＸ―100を含む0.8M NaCl水溶液1.5mlに
て可溶化処理（４℃、60分）後、遠心分離
（35000rpm、１時間）して、上清を採取する。
上記で得た上清を0.3M NaClを含む0.02Mトリ
ス塩酸緩衝液（PH7.5）で５時間透析（セロフア
ン膜）して、可溶化剤の除去及び塩濃度の調整を
行なう。かくして得られるVAP液を上記緩衝液
で平衡化したDEAE―セルロースカラムに付し、
素通り画分を得る。該画分に蒸留水を加え蛋白量
を2.8μｇ／mlに調製し、この40mlに予め前記と同
様にして洗浄したポリスチレンビーズ（実施例１
と同じもの）80個を加え、室温で６時間放置し
て、不溶化抗原を得る。これは0.2％ゼラチンを
含む0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.4）中に一夜放
置後水洗、乾燥して保存される。
実施例３ （被検血清の調製）
ATL患者及び健康人より採血し、室温下に３
時間静置し、その上清をとり、これを2000rpmで
10分間遠心分離後、その上清をとり、被検血清と
する。
実施例４ （ATLA抗体の測定）
実施例３で調製した各被検血清を0.2％ゼラチ
ン加0.05Mリン酸塩緩衝液（PH7.4）で80，160，
320，640，1280倍と倍々希釈して希釈血清を作成
する。この希釈血清0.5mlに実施例１で得た不溶
化抗原（抗原吸着ポリスチレンビーズ）１個を加
え、37℃で２時間放置する。アスピレーターで反
応液を吸引除去し、生理食塩水２mlを加えてビー
ズを洗浄し、洗浄液を吸引除去する。この操作を
３回繰返す。
また上記と同一の緩衝液で44000倍に希釈した
パーオキシダーゼ標識プロテインＡ（E.Y.ラボラ
トリーズ社製）の0.55mlに、上記で処理したビー
ズ１個を加え、37℃で２時間放置した後、同様に
して充分に洗浄する。
一方ｏ―フエニレンジアミン60mgの0.2M―マ
クレビン緩衝液（PH5.8）20ml溶液にH2O2を最終
濃度0.02V／Ｖ％となるように撹拌混合して発色
試薬を調製する。
試験管に生理食塩水２ml及び上記発色試薬0.5
mlを入れ、次いでこれに上記で作成処理したビー
ズ１個を加え、室温で30分間放置した後、3N塩
酸１mlを加えて酵素反応を停止させ、反応液の
492nmでの吸光度を測定する。結果を下記第１表
に示す。
The present invention relates to adult T-cell leukemia (ADULT).
T-CELL LEUKEMIA, hereinafter referred to as "ATL")
A novel antigenic protein (ATL-associated antigen, hereinafter referred to as "ATLA") that specifically reacts with the serum of ATL patients is immobilized on an insoluble support. The present invention relates to a new method for easily and rapidly measuring the above-mentioned ATLA antibody by fluorescence or enzyme immunoassay using insolubilized antigen. ATL is a malignant disease that affects adults.
At present, the etiology is still unknown [Takatsuki, K. Uchiyama, T., Saqawa, K.
and Yodoi, J., (1977) in Topics in
Hematoloay,, eds.Seno, S., Takaku, F.,
and Irino, S. (Excepta Medica,
Amsterdam), pp73-77 and Uchiyama, T.,
Yodoi, J., Saqawa, K., Takatsuki, K. and
See Uchino, H., Blood 50, 481-492 (1977), etc.]. In recent years, a measurement technology using fluorescence immunoassay for ATLA antibodies has been proposed, which enables the diagnosis of ATL mentioned above [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78, No. 10,
p6476−6480 (1981)]. In this method, cultured ATL cells themselves are used as an antigen, placed on a glass slide, and reacted with the test serum and fluorescently labeled anti-human immunoglobulin G antibody on the slide. The purpose was to observe and measure the localization of labeled substances. However, the above method requires the use of living cells themselves as antigens and the observation under a microscope for each sample (test serum), which of course requires frequent operations.
The drawback was that a large number of specimens could not be easily and quickly measured and diagnosed. In addition, if the measurement method is to be widely disseminated, it will be necessary to be able to carry out the measurement under certain conditions, but the method proposed above is based on the use of living cells themselves, and the antigen positivity rate will fluctuate. However, it was difficult to consistently obtain a certain antigen in a stable manner, which could lead to errors in measurement and diagnosis. The present invention provides a new method for measuring ATLA antibodies that eliminates all the problems found in the above-mentioned methods for measuring ATLA antibodies. That is, the present invention provides a fluorescence or enzyme immunoassay characterized in that it uses an insolubilized antigen obtained by immobilizing at least one selected from soluble cytoplasmic proteins of ATL cells and solubilized proteins of ATL viruses on an insoluble support. This relates to a method for measuring ATLA antibodies using the method. As a result of intensive research, the present inventors found that culture
We discovered that the soluble cytoplasmic protein of ATL cells (hereinafter referred to as "SCP") and the solubilized protein of ATL virus (hereinafter referred to as "VAP") can serve as antigens that specifically react with ATLA antibodies. It has been found that when an insoluble antigen immobilized on a support is used, a large amount of specimen can be measured easily, quickly, and always under constant conditions with high accuracy.
The present invention was completed based on this new knowledge. According to the method of the present invention, a large amount of specimen can be processed quickly with a simple operation, for example, compared to the above-mentioned conventional method under a microscope.
The amount and speed can be measured more than twice as much. Culture used as raw material for SCP in the present invention
ATL cells have already been established as cell lines [Miyoshi, I., Kubonishi, I.,
Sumida, M., Hiraki, S., Tsubuta, T.,
Kimura, I., Miyamoto, K. and Sato, J.,
Gann 71, 155-156 (1980)], as well as ATL isolated from peripheral blood or lymph nodes of ATL patients using conventional methods.
Cell culture cells and the above ATL cells were separately cultured with human T cells.
Cultured cells obtained by mixed culture with cells [e.g.
Nature, 294 , 770-771 (1981)]. There are no particular restrictions on the human T cells used in the above mixed culture, such as peripheral blood, bone marrow,
Examples include various T cells derived from lymph nodes, spleen, tonsils, thymus, etc. Further, the above-mentioned culture of ATL cells and mixed culture of the ATL cells and human cells can be carried out by conventional methods. As the medium, any of the various nutrient media commonly used for cell culture can be used. Preferred media include, for example, RPMI 1640 medium (Flow Laboratories
Examples include a medium obtained by modifying Eagle's minimum essential medium (MEM medium) using a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) or calf serum. The culture conditions are not particularly different from those used for normal cell culture, and generally include a temperature of approximately 36-38°C.
A pH of 6.4 to 7.6 can be adopted. In addition, the above medium contains T.
Various drugs known as growth promoters such as cell growth factor (TCGF) or inducers of mammalian retroviruses, such as 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdUrd), cycloheximide (CH), and puromycin. ), phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA), n-butyrate (n-sodium acetate), etc. can be added and used as appropriate. Cultivation is usually advantageously carried out by exchanging the liquid every 3 to 5 days, thereby allowing the desired cells to proliferate well. Further, the SCP can be obtained by homogenizing the cultured ATL cells in an appropriate buffer such as physiological saline or phosphate buffered saline, and then collecting the supernatant by an appropriate means such as centrifugation. Used as a raw material for VAP in the present invention
Examples of the ATL virus include those isolated from the above-mentioned ATL cell culture solution by conventional methods. The above-mentioned separation of the ATL virus is carried out by a conventional centrifugation method, etc., and in the present invention, it is particularly preferable to use an ATL virus that has been further purified by a density gradient method or the like. VAP is ATL above
It can be obtained by solubilizing the virus. The solubilization can be easily carried out using conventional solubilizing agents. Various surfactants can be used as solubilizers, such as "Triton X-100" (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and "NP-40".
(manufactured by Ciel Corporation), nonionic surfactants such as dichitonin and urea, and anionic surfactants such as sodium dodecyl sulfate (SDS). There are no particular restrictions on the solubilization method, but it is more preferable to use a solubilizing agent of 0.01% to the critical micelle forming point and to take several minutes to 6 hours at a temperature of about 0 to 100°C. It is done. The VAP thus obtained
is preferably further purified according to conventional methods such as centrifugation, diafiltration, etc., and further purified by e.g. DEAE
- It is preferable to apply it to an anion exchange column such as cellulose, DEAE-Sephadex, etc., to adsorb and remove remaining viral nucleic acids. The insolubilized antigen used in the present invention is produced by immobilizing the above-mentioned SCP and/or VAP on an insoluble support. There are no particular restrictions on the insoluble support used, and examples include common supports commonly used in physical adsorption methods, specifically porous supports such as polystyrene, glass, polycarbonate, and polypropylene. Immobilization of SCP and/or VAP on such an insoluble support can be
This can be done according to conventional methods. For example, place the insoluble support and SCP and/or VAP in various solutions such as physiological saline and phosphate buffer, and
The reaction may take about 2 to 24 hours at a temperature of about .degree. The above reaction is preferably carried out under reduced pressure conditions. After completion of the reaction, adsorption sites remaining on the insoluble support used are saturated using, for example, 0.2% gelatin, 0.2% maggot serum albumin (BSA), etc., according to a conventional method. The insoluble antigen thus obtained is washed with water and then stored in a dry state or in the above buffer. The method of the present invention is carried out by measuring the labeling activity of a labeled antigen-antibody complex using the insoluble antigen obtained as described above according to a conventional fluorescence or enzyme immunoassay method. More specifically,
A test serum diluted as necessary is added to the insoluble antigen to cause an immunoreaction, and after washing, the resulting antigen-antibody reaction product is labeled by reacting with a labeling agent, and the labeled complex is The labeling activity of the body is measured according to a conventional method. In particular, according to the present invention, by using the above-mentioned insoluble antigen, a large amount of test serum can be measured easily, quickly, and accurately at one time under certain conditions. In the above, the test serum is, for example,
Serum separated from blood collected in a conventional manner from a subject whose ATLA antibody is desired to be measured, or serum diluted with an appropriate buffer can be used. The buffer used here is not particularly limited, but it is usually appropriate to use a weak phosphate solution (PH7.4).
In addition, the immune reaction between the test serum and the insoluble antigen is as follows:
This can be done simply by mixing and contacting the two. The reaction is usually completed in about 0.5 to 16 hours at a temperature of about 4 to 37°C, and after the reaction is completed, the reaction is thoroughly washed with an appropriate buffer, preferably physiological saline or the buffer used to dilute the test serum. is desirable. Following the above reaction, labeling of the resulting antigen-antibody reaction product with a labeling agent is carried out by mixing a labeling agent pre-diluted with the same buffer as above with the antigen-antibody reaction product for approximately 4 to 4 hours. The reaction is carried out at 37° C. for about 0.5 to 16 hours, and after the reaction is completed, it is desirable to thoroughly wash the composite obtained in the same manner as above. As the labeling agent in the above, any conjugate of a substance capable of specifically binding to an antibody and various enzyme labeling substances or fluorescent labeling substances can be used. Typical enzyme labeling substances include, for example, peroxidase (POX), chymotrypsinogen, procarboxypeptidase,
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, amylase, phosphorylase, D-Nase, P-
Examples include various enzyme reagents such as Nase. Examples of fluorescent labeling substances include fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), substituted rhodamine isothiocyanate (XRITC), rhodamine B isothiocyanate, and dichlorotriazine fluorescein. (DTAF) etc. can be exemplified.
In addition, substances that have the ability to specifically bind to antibodies and become labeling agents by binding with such substances include:
For example, "Protein A" (ProA, Pharmacia), sheep anti-human immunoglobulin G antibody, rabbit anti-human immunoglobulin G antibody, goat anti-human immunoglobulin G antibody, mouse anti-human immunoglobulin G antibody, rat anti-human immunoglobulin G antibody, Examples include anti-human immunoglobulin G antibodies such as globulin G antibodies. A variety of conjugates of a substance capable of specifically binding to the above-mentioned antibody and a labeling substance have already been prepared and commercially available, and in the present invention, various commercially available conjugates may be used as the labeling agent. Commonly known methods [BFERLANGER et al., Acta. Endocrinol.
Suppl., 168 , 206 (1972), and MHKAROL et al.
Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 57 , 713 (1967)], a new conjugate may be created and used. For example, when using an enzyme-labeled substance in the above preparation method, this and the above-mentioned ProA or anti-human immunoglobulin G antibody are mixed in a buffer solution of pH 4 to 6 at around room temperature in the presence of an appropriate oxidizing agent such as NaIO 4 . This is carried out by coupling reaction for 2 to 5 hours and then reducing with a suitable reducing agent such as NaBH4 .
The ratio of each reagent to be used is approximately 1 to 3 moles of the enzyme labeling substance and approximately 100 to 300 moles of the oxidizing agent per 1 mole of ProA or anti-human immunoglobulin G antibody, and the reducing agent is the oxidizing agent. Appropriately, the amount is about 1 to 2 times the mole. In addition, when creating a fluorescent labeling agent using a fluorescent labeling substance, place the fluorescent labeling substance in water or physiological saline with a pH of 6 to 8, and store it at around 0°C to room temperature.
About 0.5~ with ProA or anti-human immunoglobulin G antibody
It is enough to react for 3 hours [Fluorescent Antibody Method, Medical Chemistry Experimental Method Course, No. 4, pp. 263-270, 1st edition published in 1972, Nakayama Shoten]. The appropriate amount of fluorescent labeling substance to be used is generally about 1/50 times the weight of ProA or anti-human immunoglobulin G antibody. In the present invention, the complex consisting of an insoluble antigen, a test serum (ATLA antibody), and a labeling agent is measured according to a conventional method depending on the labeling substance in the labeling agent used. This is done by determining enzyme activity or fluorescent activity). Thus, according to the present invention, a large amount of test serum can be
ATLA antibodies can be measured easily and quickly. Examples will be given below to explain the present invention in more detail, but the present invention is not limited thereto. Example 1 (Production of insolubilized antigen) 20 ml of heparinized blood was collected from an ATL patient (50 years old, male, resident in Nagasaki City) and centrifuged using "Ficoll Pack" (manufactured by Pharmacia Japan Co., Ltd.). Obtain 5 x 10 7 peripheral blood lymphocytes. This is cultured at 37° C. for 3 days at a cell concentration of 3×10 5 cells/ml in RPMI1640 medium (Flow Laboratories) supplemented with 10% calf serum. This 6×
10 8 pieces in 30ml of 0.05M phosphate buffer (0.14M NaCl)
homogenized in PBS (containing PBS, pH 7.4, hereinafter referred to as "PBS"), and then centrifuged for 1 hour (105,000
g) Do. Collect the supernatant and reduce the protein amount to 120μ with PBS.
g/ml (the amount of protein was measured by a color method using Tonein-TP, a total protein quantitative reagent manufactured by Otsuka Atsusei Research Institute) to obtain an SCP solution. Next, add 0.1N-HCl to 140ml of the above SCP solution in advance.
Polystyrene beads (diameter 6.4 mm,
Precision Plastic Co., Ltd., USA) was added, and the mixture was allowed to stand for 6 hours at room temperature under reduced pressure using an aspirator, and then filtered to obtain an insolubilized antigen. This is 0.2
0.05M phosphate buffer (PH7.4) containing % gelatin
stored at 4°C. Example 2 (Production of insolubilized antigen) (1) ATL cells (Kyo-Ya cells, obtained from the Institute of Virus Research, Kyoto University) were treated with 10% calf serum (FCS) and 50 μg/ml 5-iodo-2'-deoxyuridine. (IdUrd) with RPMI1640 medium, 3
Culture at 37°C for 4 days at a cell concentration of 5× 15 cells/ml. Centrifuge the culture solution (1500 rpm, 10 minutes)
Then, the cells and the culture medium are separated and collected. (2) Add 30 ml of physiological saline to 5 x 10 9 cultured ATL cells obtained in (1) above, homogenize, centrifuge for 1 hour (105,000 x g), collect the supernatant, and carry out the following procedures. Protein amount 120μ as in Example 1
Prepare an SCP solution of g/ml and obtain insolubilized antigen (antigen-adsorbed polystyrene beads) from it in the same manner. This was left overnight in 0.05M phosphate buffer (PH7.4) containing 0.2% gelatin, washed with water,
stored dry. (3) Centrifuge 500ml of the culture solution obtained in (1) above (40,000
xg for 1 hour) and collect the precipitated components. This is subjected to 25-60% sucrose density gradient ultracentrifugation, and a fraction with a density of 1.15-1.16 is collected. This was solubilized in 1.5 ml of a 0.8 M NaCl aqueous solution containing 0.5% Triton X-100 (4°C, 60 minutes), centrifuged (35000 rpm, 1 hour), and the supernatant was collected. The supernatant obtained above is dialyzed (cellophane membrane) for 5 hours against 0.02M Tris-HCl buffer (PH7.5) containing 0.3M NaCl to remove the solubilizing agent and adjust the salt concentration. The VAP solution thus obtained was applied to a DEAE-cellulose column equilibrated with the above buffer solution,
Obtain the flow-through fraction. Distilled water was added to the fraction to adjust the protein amount to 2.8 μg/ml, and 40 ml of this was added with polystyrene beads (Example 1) that had been washed in the same manner as above.
Add 80 pieces of the same product as above and leave to stand at room temperature for 6 hours to obtain insolubilized antigen. This is left overnight in 0.05M phosphate buffer (PH7.4) containing 0.2% gelatin, washed with water, dried, and stored. Example 3 (Preparation of test serum) Blood was collected from ATL patients and healthy people and kept at room temperature for 3 days.
Let it stand for a while, take the supernatant, and run it at 2000 rpm.
After centrifuging for 10 minutes, take the supernatant and use it as the test serum. Example 4 (Measurement of ATLA antibody) Each test serum prepared in Example 3 was diluted with 0.05M phosphate buffer (PH7.4) containing 0.2% gelatin at 80, 160,
Create diluted serum by diluting 320, 640, and 1280 times. One insolubilized antigen (antigen-adsorbed polystyrene bead) obtained in Example 1 is added to 0.5 ml of this diluted serum, and the mixture is left at 37°C for 2 hours. Suction and remove the reaction solution using an aspirator, add 2 ml of physiological saline to wash the beads, and remove the washing solution by suction. Repeat this operation three times. Additionally, one bead treated above was added to 0.55 ml of peroxidase-labeled protein A (manufactured by EY Laboratories) diluted 44,000 times with the same buffer as above, and after being left at 37°C for 2 hours, the same procedure was carried out. Wash thoroughly. On the other hand, a coloring reagent is prepared by stirring and mixing H 2 O 2 to a solution of 60 mg of o-phenylenediamine in 20 ml of 0.2 M Maclevine buffer (PH 5.8) to a final concentration of 0.02 V/V%. 2 ml of physiological saline and 0.5 of the above coloring reagent in a test tube
ml, then add one bead prepared above, leave it for 30 minutes at room temperature, add 1 ml of 3N hydrochloric acid to stop the enzyme reaction, and dilute the reaction solution.
Measure the absorbance at 492nm. The results are shown in Table 1 below.
【表】
また上記において実施例１で得た不溶化抗原に
代え、実施例２―(2)及び実施例２―(3)で得た各不
溶化抗原（抗原吸着ポリスチレンビーズ）の夫々
を用い、80倍又は100倍希釈血清について同様の
試験を繰り返した結果を、下記第２表（実施例２
―(2)の不溶化抗原使用）及び第３表（実施例２―
(3)の不溶化抗原使用）に夫々示す。[Table] In addition, in place of the insolubilized antigen obtained in Example 1, each of the insolubilized antigens (antigen-adsorbed polystyrene beads) obtained in Example 2-(2) and Example 2-(3) was used. The results of repeating the same test on serum diluted 1-fold or 100-fold are shown in Table 2 below (Example 2).
- (2) Use of insolubilized antigen) and Table 3 (Example 2 -
(3) Use of insolubilized antigen).
【表】【table】
【表】
実施例 ５
不溶化抗原として、前記実施例２―(2)で得た抗
原吸着ポリスチレンビーズを、また標識作因剤と
して600倍に希釈したパーオキシダーゼ標識ヤギ
抗ヒト免疫グロブリンＧ（E.Y.ラボラトリーズ社
製）を使用する以上は、上記実施例４と同様にし
てATLA抗体を測定した。各血清希釈倍率での
吸光度（492nm）を求めた結果を第１図に示す。
図中１はATL患者を、また２は健康人を夫々示
す。
上記第１表乃至第３表及び第１図より明らかな
通り、本発明方法によれば吸光度測定により
ATLA抗体を簡便に測定でき、ATL患者の診断
及びスクリーニング法として極めて有効であるこ
とが判る。[Table] Example 5 The antigen-adsorbed polystyrene beads obtained in Example 2-(2) were used as an insolubilized antigen, and peroxidase-labeled goat anti-human immunoglobulin G (EY Laboratories) diluted 600 times was used as a labeling agent. ATLA antibody was measured in the same manner as in Example 4 above except that the ATLA antibody was used. The results of determining the absorbance (492 nm) at each serum dilution rate are shown in Figure 1.
In the figure, 1 indicates an ATL patient, and 2 indicates a healthy person. As is clear from the above Tables 1 to 3 and FIG. 1, according to the method of the present invention, by absorbance measurement,
It can be seen that ATLA antibodies can be easily measured and is extremely effective as a diagnostic and screening method for ATL patients.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
第１図は本発明方法（実施例５）に従い、
ATLA抗体を測定した結果を示すグラフである。
FIG. 1 shows the method according to the present invention (Example 5).
It is a graph showing the results of measuring ATLA antibodies.