PT89991B - Processo para a preparacao de compostos macrolidos - Google Patents
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Description
A presente invenção refere-se a uia processo para a preparação de compostos macrolidos.
O Pedido de Patente Inglesa N2.2166436 e o Pedido de Patente Europeia N2.170006 descrevem uma classe de substâncias que foi designada por antibióticos S541, os quais podem ser preparados por fermentação de estirpes propor cionadorae de antibióticos S541 pertencentes às espécies Streptomyces thermoarchaensis e Streptomyces cyaaeogriseua noncyanogenus. Os antibióticos S541 possuem actividade antibiótica e, em particular, possuem actividade anti-endoparasítica, anti-ectoparasítica, anti-fúngica, insecticida, nematocida e ac&ricida e possuem interesse especial para utilização em agricultura, horticultura e para a saúde animal e humana.
- 1 Dascobriu-aa agora ua aovo processo para a preparaçao da compostos de antibióticos 5541 a reapeccivos derivados químicos.
Juste modo, de acordo com um aspecto da presoata iuvaução, proporcioua-ae um processo para a preparação du compostos da xóraula (1) *2 CJ /íliV ii' 15 17 · w:. 11
3*1
IS
13/43 li' ·' J. -X Λ lu (I) cu íe» K.1 representa um grupo metilo, etilo ou isopropilo»
R represente ub átomo de hidrogénio ou um grupo OS.
(em que OR^ representa um grupo hidroxilo ou un grupo hidroxilo substituido possuindo eté 25 átomos de carbono) e * *23
R representa um átomo de hidrogénio, ou TC e E7 em conjunto con o átomo de carbono so qual estão ligados representem /OC, /OCd^ oi£ ONC*/> (et* que T** representa um átomo de hidrogénio, vu £,rupc alquiloíC^-Cg) ou ua grupo alquenilofC^-C^) c o 6rupo ΟΝΟ£^ enccntra-sc ca configuração E)} e
1 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo) ,
o çual consiste er- incubar ur, connos c· de tômil.® (Ϊ1) ot.
n.1' (Ιϊ) ca
3 (em que R , R e R possuem as significações anteriores) num meio adequado na presença de ura micro-organismo ou de uma ensina dele derivada, ou da uma prapa ração derivada de um micro-organismo contendo a enzima com interesse susceptível de efectuar a con versão.
Os micro-organismoβ adequados e respectlvoa extractos para utilixação no processo de acordo cora a presente invenção podem ser identificados por testes preliminares em pequena escala concebidos para demonstrar a capecida de de um micro-organismo ou de um seu extracto para converter compostos de fórmula (XI) em compostos de fórmula (I).
Λ formação dos compoatos de fórmula (I) pode ser confirmada por análise cromatográfica adequada (por exemplo cromatografia líquida de elevado rendimento) da mistura de reacção.
Descobriu-se que os micro-organismos do género Streptoayces s os seus extractos são particularmente adequados para utilixeção no processo de acordo com a presente invenção.
- 3 ''λ
J
Os nlcro-orgasisc.oa Stréptonvcas particulares para utilização do processo do acordo e<xr o proscrito in vaupco eu^loba^ aa aatirpes da StreptiXgycas cbõrgoarchaenaia, G trup t-y.ayc<- s eyjnriosriagua noncyaaoqenus, Streutrerrces averr^j, tilis e Streptoayco hy drosoo?? icus subsp. aureolacrirsoaus.
Oa exewploa particulares de estirpes adequadas englobam Strej> tuuyces tbereoarchaenais UCI3 12212 c 12212 (registados a t> de Liarço de 1936 na colocção ea cultura peraancnte de National Collectioua of Industrial and ííaríne Bactoría, Torry ”.cagarch Station, Aberdae-u, Rei«c< Unido] c os mitantea destas estirpes, Streptotrrces averaitilia ATCC 31272 e 317S0 e Straa toayces hydroscopicua subsp. áureo1acrisoaoo 7SRH ? 143S.
Os mutantes das estirpes anteriores podem aparecer espontaneamente ou podem ser produzidos de acorde com diversoa nétodos incluindo os que ostão descritos no Pedi do de Patente In&leea Í7CC06.
2166436 e no Peciido de Patente Europeia
Ay ensiaas adequadas para utilização no processo da acordo coca a presente invenção podees ncr deriva<Ias da fontes entrornamente amplas. Contudo, oc micro-organij» mos Strcntorryces anteriormente referidos repre-tentam una fonte partieularmente adequada de euzines susceptiveis do ccrvcr ter compostos de fórmula (II) em compostos de fórmula (I).
Num doe aspectos no processo de acordo com a presente invenção, pode efectuar-ec e conversão de ur^ cospos to de fórmula (II) num composto 5-OP.^ correspondente de fór:ia la (I) fornecendo o conpoeto de fórmula (TT) nusr solvente ade quado, a un meio dc- fermentação constituído pelo micro-orga nistaos ÉinteriorRcnte referido na presença de fontes de carbono. asoto e dc esis ninerats essinileveis.
As fontes aesiuíleveis de carbono, dc aro to c de. sais minerais podem ser proporcionadas por nutrientes simples ou complexos. As fontes ce carbono englobarão qcrclmente a glicose, ualtose, amido, gliccrol, «-«laços, dextrina, lactose, sacarose, fruatose, ácidos carboxílicos, aminoseicos, çlíeéridos, álcoois, a1canos e óleos vegetais. As fontes de carbono constituirão geralmente entre 0,5 e 102 cs p«eo do caio de feraeutação.
is fontes co anoto t-n^iobarao ^eralacctê í-í-rii-Lh. da soja, iiccxce in tciuçonu fu Cíitíi., coitxlaúos solúveis, extinctus co Icvecurc, i«_iiu_u cn ηχ_η;.ιη& -c ei^oòãc, fârindu ce amtncoLc, tctinceu ce n^itc, —éiuços, c^seicn, cisLerei Ct nuinoscicos, unóuic (&SÍ. cu âoluçuo), fiis ct ccõcfo ou nitratos. xaabém ca poct utclicar uxaxa « o u £ η i is inntus ue moto cecsLicuix<—o ^nra^.ncntc *n tre C,i c ΙνΣ tcc peso do xaio ce úrse&uçsc.
Os sois xinerais nutrientes que se podam incorporar no ceio de cultora englobarão gcraluiante co cait susceptíveis ce proporcionarei! iões de sódio, potássio, «nónio, ferre, carnesío, cinco, níquel, cobalto, aanganês, vanudio ,erário,cálciocobre, an)'ibd*nio, boro, ioscato, suliato, cloreto e c«r Icuux to · roce osttr presente uu aponte cxiti-cspu nante p«rc controlar a captuoc excessiva puceucc ser scicicnucè ictcrvelscenêote ccniorac necessário.
C cottpoato de iõrnclu (II) r.o solvente do Li*, o sol vente orgânico uiscível ec. c&uc (por ecesipiu un álcool tal coxo o uttanol ou prcpau-l-cl, u- diol tal coax prupen-i, l-ol cu i.'Utan-i,3-ol, ucu extern. tsl cono acetona, cítxilo tal coco acetonitrilo, inc éter tal ccnc tetru-Lícrcru renc ou cioxcno, une eride «ubstituíds tcl coco cimtil-fui na t-ídn on uc. diclquil-sulfotido tal coxo díretí1-rullúricc) por scr scicícnuco no início da cultura, ou nais noranlcécte, quande o desecvolvincnto do nicro-craánicno já st está a rt-alírsr, por tncnplo 1 c 4 dias epea o início de cultura.
ή cultura do or^anisno ciectcar -sc-c j,erxinectc a unu temperatura conpretncid« nutre 10 a 5011, c<_ preferencie entre 15 a 45út, e r&alircr-cc-e cesejavtixantt cen riejc— ente í agitação» por cxtnpio ncnenco ou e^ltunco. é ueic peut scr icicialxs-ats inoculado cen una paq^-ena cusi.ridccí: ct une suspensão co xicrc-or^cnisco tspcrciacu une, x.u senticc te tu evitar una falta dc crescimento, poct preparar-tt cc inocule vt^ctative co or^âniccn inoculando u..a pequena quauoícitê co auic ce cultura ccm a forni ca espero co or^õnlawo, podando tranafarir-·· para o «aio da fermentação o inoculo ve^eCativo obtido ou, ítala preferencialaente, n«rs i«n ou verios estádios tíe ^.enaiuaçao «a que ocorra desci^olvi/.eâto adicional, aatss de se transferir para o r«io dc ier.-.ar.Cação principal. Geralmente efectuur-ae-á a fermentação pera valores de pH coirpreendidos entre 5,5 e 3,5 de preferencia entre 5,5 e 7,5.
Depois de se cer adicionada o composto Ge fórmula (II) ã cultura, laexendo suavenenLc-. csuiora é habitual, msntec-se a cultura de eoôo a que o produto desejado soja acurailado. A presença do produto no caldo de fermentação po ce ser detersiinada fazendo o controlo dos extractos «Io caldo por cronatografia líquida de elevado rendimento e por espectroscopia de w a abioa*.
0(e) produto(s) p«jde ser isolado a partir cc tcdo o caldo de fermentação por técnicas de isolamento e separação convencionais, conforate descrito nos Pedidos de Patentes Ingleses fi^a. 2166436 e 2176132.
é*uõi aspecto adicional do processo de scor ao com a presente invenção, pode efectucr-cs e coavereão da uu composto de iórxuia (II) suai composto a-Ui/’ correspondente oa iáratula (I) coasbinando e incubando uaa composto de fórmula (II) aum solvente adequado (por exearplo, um solvente orgânico iiscível est água couioraie aaterioraente definido) eoa uxa pre paraçao da enzima da presente invenção, desejavelmente uuu:a solução tarapac, por exemplo β uraa tempera cure entre OH. s bOSC, an preierêncía entre 2t)à « 462C, por exemplo cerca de 231C.
Gt r a ir. íence efactuar-se-á a reacção para valoras de pi« cvapxeuuaicos entre 3,5 e 3,5, por exemplo entre 5,5 e 7,5. Se cesejaco, pode efectuar-se & reacção na presença de ws co-fac tor tal couc ΚΑΏΕ ou ΓΛΙ5ΡΗ. Quando a reacção estiver complete, is te c, quando o cosposto de fórmula (II) já não sh con verter no coxnosto da preueute invenção (conforaie determinado peie controlo dos extractos da niGtura de reacção por cror.iío ^rafía líquida de elevado rendimento e per espectroscopía dc uv a 23Snr), recupera-se o produto por técnicas de isolaeiento e de separaçao convencionais descritas nos Pedidos de Paten tee Ingleses M2s. 2166436 e 2176182.
A eusícu* psira utilix-sção nc· processo da prcaents invenção pode ser preparada, par snomplo, rszs.rds a cal cura <le ur. siicro-organismo cue proporcione a cnzi:na ird •t± ·? r» t·
Jzâ bA*«t .ceio nutriente. Os xeíos nutrientes adequados α as condições de fenssutação para a preparação da «'vaicc·. en^lobau os xnte ríomcute descritos para a preparação da u.r cojsposto de cor.ou la (1) a partir de uti ccseposto de fórraula (11) cc presença de ué :ai cr o-organismo. ú tmpo decorrido até qu« s. actividaôt znzinãcicn necrssãria atinja o irÁrcin-.o, variará, coito ã avidan te, cor. oa isicro-orqanisnios utilizador e, c onsequent ornar, te, o cer.po de cultura óptimo para cada astirpe utilircda é desejavelrwntc detarctinado dc forca independente.
Para os aicro-orqar.isoios -rz que a ensina seja extra-celular, pode utilizar-sa coro fcncc do anzir-x o rvaio de cultura liquido ou o filtrado apõe r«noção da todan ao célula3 . Quando a enzizia S3tivar libada às células, pode 3cr libertada utilizando métodos convencionais tais coao c tratamento por ultrassons, a trituração con esferas da vidro, houoqencizução, tratamento com enzimas lltico- cu con dar«crqen c«-;s, opôs -suspensão das células rrtrc tampão adequado.
?ode utilizar-se curso fonte ensiisãcics ί lares. Todavia .r.m rezu j.tar* e, con ou sets remoção a ^utentes c*.au ΰ preferível purificar a cazis-i por neios eurtesciunaís. Toou utilizar-se convônientenéute a crouatoipra lia era porções ou ers coluna con celuloses da pur.rota iõãica ou con adsorventes com afinidade on coa outros adsorvantss, por cu amplo hiáronil-apatite. Adiciona Inunte, a enzima pode uinàa ser concentrada e purificada por técnicas de criva ção sioiecuiur, per azeoplu ultra-filtração ou p ΟΣ7 ÕuilãiCá’ydO. â ta oerelJ
-.1117 ãif* Olé pHUCCGã/vé^ià CO7? OQ ρυΓΪ..^ iCãi j liuncâr o nu:.: coãspreandido centra 3 g Π.
?;jds t- & Liixicrã lieiiâic* zoiâ.dt. é»_À-^bi rrmdr, por enumpio ρ or insolubiliraçao ou pàrallxaçao ou numa cx<xd7a«c« citlCx^Uãàéic* * IhOcIo * un estracto de r*te ^>ode i,er uaiúu ou lijçauo a iu polímero inorgânico cu orjâuieo in«rtv , per ..Ι rz ízgo soora uu.a tiox*u ou souto tí.jcf .^-iior exu-cu polímero tal co&o gel de poli-acrilamioa, «itorvldo numa resina de permuta iónica ligedo r^eticulareente cc~. w> reaaen te tal coao glutaraldeido, ou adsorvido num involucro na forma de pequena esfera. As enzimas imobilizada» υν»1«. rrr utilizadas vantajosaaente nos processos por lotes, podendo poste rioraente utilizar-se de novo a enzima, e noe processos de fluxo continuo e« qu<; os substratos paasac através de uma coluna contendo a enzima imobilizada.
Quando o grupo ?.^ estiver presente noa campos de fórmula (I) podem representar uc çrupc ocílc, por exemplo um grupo de fórmula P/CC” ou P/OCO“ ou R-CCS” (cr» que b/ representa ua grupo alifático, eralifático ou rrcnático, por exemplo ua, grupo alquilo, alqusnilo, slçuinilo, cielo
-alquilo, aralquilo ou crilo), um grupo forailo, um grupe 2a com a stesma significação anteriormente deflr.ida para 7. , tu,
9 grupo 2. -SC^- (as que S. represente tm grupo alquiloou um srupo arilo(C^-CjQ>), um grupo eilile, ua grupo accta) cíclico cu sclclico, us grupo -00(032).^02^^ (em que ã^* representa uú ãcomo de hidrogénio ou um grupo coxa a nanna aijai ficação anteriortiente definida para S? e n representa 0, 1 ou
7 7 0 »1 7;
2) ou um grupo R^^R *«C0- (*a que R e R podem representar iudepeuaentemente ua étomo de hidrogénio cu um grupo alquilo <4“S>
**
Quando u ou R° representarem grupos alquilo, pode tratar-se por exemplo de grupos alquile(C^-Cg), per eueapls siatilo, etilo· n-propilo, i-propiio, n-oaciio, i-butilo, p-butílo ou n-heptiio, podendo os referidos grupos alquilo ser também substituídos, Quando 5.7 representar ua grupo alcailosubstituido, pode ser substituído por exemplo, por um ou vários, evencualamnte dois ou três, ήtomos de halogéneo (por exemplo átomos de cloro ou de broco), ou por uc grupo carboxi, alcoxi(Cj-C^>(por exemplo cetcri, ctor.i), fenoxi ou sililoxi. Quando R-θ representar uc r-nrpo alquilo subjs tituído, pode ser substituído por uc- grupo ciclo-clquilo, por exemplo um grupe ciclu-propilo.
S
Quando R e R repreeer.tcrcr. grupes tlquenllo ou alquinilo, possuem preferencialmente 2-6 atemos do car bono e quando R e Rw representarem grupos ciclo-alquilo, podem ser por exemplo grupos ciclo-alquilo (C^-C^) tais como
- 3 ciclo-aiquilo{Cj-C?) , por exm&plo grupes ciclc-pencilo.
8
Quando â. « R represontaxeui grupos arai** quilo, poenuirêo dc preferência 1-6 «termos ie carbono no radi cri xlqcilo c c ,~rv~o(r.), arilo pode ser ccrbcclclicc ou heterocícli. cc e ccnterí prsfersncialreste 4-15 ícemcs de cs.roono, por exemplo fenilo. Zz cretpie» «2-e tais- eru;?t svi^lubam fen-aiqui io(Cj-C^), por «xemplo os grupos benzilo.
Quando k7 e Rw representarem grupos arilo, podem ser carbccíc.Licoe e possuirão preferencia lmente 4-15 atomos de carbono, uor extaplo fenilo. Quando R representar ua grupo K/SC^-, pode tratar-se por exemplo de um grupo mutil-aulfonllo ou u-toluano-sulfonilo.
Quando ϊΖ reprecantar us v.rupo acatai cíclico, pod* possuir por exsasplo 5-7 sambros no anal tal como tíítra-hidcopiraailo.
Quando t? representar ux grupo siiilo ou R' contiver cm substituinte aililoxi, o grupo siiilo pede suportar 3 «rupos poder esr igucir. cn dífcrcr.tcr, selecciotsdc.s entre grcooE slquilo, slqnsnilc, cIcot.í, ciclo-alquilo, .-rralcuilr., arilo o crilcxi. Taic grupes ptdcr ccr conforme antarlorsente definidos e englobam psrticularmence os grupos estilo, t-butilo e fenilo. Os exemplos particulares da tais grupos siiilo são o trimetil-siiilo e c-butll-dlmecil-sllilo.
Quando & representar um grupo -C0(CHo)„pode trstar-»e cor ex«Miplo de tx grupo -C0C0oR^® ou x 1C 10 - ~
-'JC-CH-CÀi-,09., KV em que K representa um sco.io du hidrogénio ou ua *?mpo alquilo (C-.-C.) (por exemplo metilo ou etilo).
-* * 5 11 12
Ocando fí recrescr.tcr nr. cru^c R R MCO-,
12
R c E. podíx- ro^resestar itidcpendentcite^le uia écomo de hidro&onlo ou um grupe mctilc cn etile, por trerrplc.
Quando R^ representar um grupo alquilo(C^-Co) pode ser por exemplo um grupo metilo, etilo, n-propilo, i-propllo, n-butilo, i-butilo ou t-butiio, e preferenclalmente representa um grupo metilo.
Quando 22 reprussnear ui grupo alquenilo (C3-C.), pode ser por exeaq>lo us» grupo sliio.
Os compostos preferidos de fórmula (1) que
- 9 ά pOlí.iXV jl ρχ-ijrp çZo criqLchan Oii ~ar de acordo c» o proezaso 1 csapoa toe ítj qu* R~ ro?rô35nta preeente Inven j.aopropilo.
Oa coupoatoa inqtortantrÍa de fórmula (I) que ê poaalvel crecarar dc acordo coci o procerao da oraaente - 2 bivençao engloban aqualeo cn que R representa ue, grupo hidro
- -23 ri ny τ-.tori o R rapreaenta trr ator.o de hidrogénio» ou R e R representam ináividualetónte ira átomo de hidrogénio; ou R^ e R^ ;in conjunto con o átooo de carbono ao qual estão ligadoa repre sentan /00, ^OCH ; OU/C-NOCH^.
Os compostos particularmente importantes da fõríiula (I) que -á possível preparar do acordo con o processo de pre3e:ito invenção aão aquoles en que:
ra
Λ repreta isvpropilc, 2. a 2. eca conjuaco ccva v ato mo de oarbouo ao qual esciv lig.ad-?? r*pr< a entufe O —HOCIi- «d i'’ vepreseutd u/? ííxmv d* hidrogénio»
3 4 xepresente. iaopropílc c , 3. a .?. re.pt as&r.txt a coiros d* hidrogénio» e
3 represente isoprop!lo, R represoute hidróxi e R e R* representem átomos de hidrooénio.
Os coBspeetos de ícrrcla (TT) em que R* re 2 presente m grupo oetilo, etilo ou ieopropilo. R representa u» grupo hidroxilo e RJ repreçents oe» ãtoíso de hidrogénio estão descritos no Fedido d« Patente Inglesa NS. 2187742A.
Os outros compostos de fórmula (II) d^scritts no Γο-ίί-ΐο de Patente Europeia NS. C234258-Al.
Às seguintes Prepareçõea e Rxrsplos ilustram a invenção, »ix.cc tod&£ ac txixpcrcuurxx cu e **1N signi ilea litro. ή&ηφίοχ aeguxntcs, cíuctoOw-ae x nplc (croma túgxaiia llquion d» olevadc xandia:mcu) nuiia ccíua* ópherisorb S50DS-·?. (150mm x 2.1mm)w utiliseo.de o*v»o eluante acetonitrilo/s-gue a uns velocidade da 0.5 ^1 Minuto, salvo quando eje pacificado d..j outro modo. Com wj cinto móvel de Finnigan esta baleceu-se o interface entre o eflusnte ds coluna e ua eapectroeietro de massa Finuigatt ΗΜ%*0».’Μ sob coc.diçóee E.x. para n carac ter issçeo do espectro dc riíisan. Os co-ipostci» las preparações seguintes foram designados tomando como referência o
'Factor' original conhecido, o Factor A. 0 Factor A (descrito no Fedido de Patence Inglesa Si. 2166436) é ua composto de fórmula (I) ea que r! representa tca grupo isopropilo,
IV representa ua grupo hidroxilo e
R e R representam â tosto» de hidrogénio.
Intermediário 1
5-ceto Factor A, preparado conforme descrito no Sxeaplo 2 do Pedido de Patente Ingleea 39. 2187742Λ.
In teme diário 2
5.23-diceeo Factor At preparado conforme descrito no Exemplo 2 de KP-A1 238236.
Intemediãrio 3
2tur 23-atllico de 5-cefco Factor A, preparado couronse deacri to no fhtcuplo 7 de AF-Al 233233.
Intermediário 4
23-henios^ilat:o de 5-ccto Factor A,
Agitou-ae conjuntanento 5-ceto Factor A. (330 ag), carbonato de cálcio finanente dividido (200 ug) e cloreto de oxalilo (0,07 ml) «s diclero-eereno seco (5 nl) durante 10 minutos. Depois adicionou-se ácido clorídrico 2V.
(4 âl> seguindo-oc 5 ctinatos depois a sdlç&o de «cúcatc d».· etilo. Recolheu-se a rase orgânica, secou-se «:W.porím-ue e diefjõlvcu-Mtí o resíduo cn éter úi-isopropliíco. Zt diluição desta solução com éter do petróleo (p.e. 40-602C) precipitou o composto em epígrafe na forma de ua sólido floculento branco (262 mg), [<<jp +1202 (£0.6, CHC13), 24ϋπω (Γ.* 425), πλχ (CHBrJ 3440 (OH), 1800 (CO.,H dimero) 1720 («eter), — 1 z * r
1676c« <1 z'd-cctocu insatnrsda), tf (CDCI^) euglobu 6.52 (a, estreito 1H), 5.07 (q,3Hx,lH), 3.78 <a,lH), 1.83 (s.3fl) e
- 0.71 (d,7Hx,3H).
- 11 I
lateraédio 5
5-ceto 23[E]-oetoxi-lmlno Factor A, preparado conforme descrito ao Exemplo 16 EP-A1 238258.
Exemplo 1 (a) Utilizou-se uma eu*pensão de esporos (0,1 al) de Streptoaycea thanaoarcaaenais KCXB 12213 (preparada conforme descrito para Streptomyces thermoarchaenais NCI3 12015 no Exemplo 2 do Pedido de Patente Inglesa H1.2187742A) para inocular um balão contendo o Meio A (2,5 al) :
Meio A gl-1
D-Glicoee 2,5
Dextrina de suilte MD 30£ (Koquette (UK)Ltd) 25,0 Aricasoy 50 (Sritish Arkady Co.Ltd) 12,5 Melaços 1,5
S2H?04 0,125
Carbonato de cálcio 1,25
MOPS ácido (3-(ti-aorfolino)propano-sulfõnico 21,0 (água destilada atá 1 litro, pH ajustado para
6,5 com íáaOH 5N antes de se colocar ea autoclave J .
Incubou-se esta cultura a 31SC durante 4 dias nua agitador rotativo funcionando a 250 rotações/minuto, e decorrido esse tempo adicionou-ae o Intermediário 1 (1 mg) em dimetil-sulfóxido de (0,05 al). Incubou-se a cultura durante mais 24 horas a 31SC, depois centrifugou-se (aproximadamente 10 000 rpm/10 minutos), removeu-ee o aobrenadante e adicionou-se 1,8 ml de metanol ao resíduo. Deixou-ae a suspensão resultante em repouso durante 1 hora á teape ratura ambiente e depois centrifugou-se. Analisou-se o sobrenadante por hplc, tendo ficado demonstrado por comparação com waa amostra autêntica descrita no Pedido de Patente Ingle sa MS.2166436,a presença na amostra ensaiada do composto de fórmula (1)
que
R representa ura grupo isopropilo,
R representa ura grupo hídroxilo, ·* —
R representa um átoao de hidrogénio e
R* representa ua átoao de hidrogénio (3,32 -expresso era percentagem do aaterial de partida adicionado que foi convertido no produto].
(b) Repetiu-se uaa parte da experiência (a) cora Streptorayces averraitilis ATCC 31780 e cora Intermediário I, proporcionando ura extracto cuja analise por hplc demonstrou a presença do coaposto de fórmula (1) era que
R^ representa ura grupo isopropilo,
R representa ua grupo hidroxilo,
R^ representa ura átoao de hidrogénio e
R^ representa na átoao de hidrogénio (8,62 - percentagem expressa tal como na parte (a)].
(c) Por ua processo idêntico ao da parte (a) incubou-se c Intermediário 1 cora Streptoayces therraoarchaen»is SC1R 12212, cora a excepçào de ae ter preparado a cultura a partir de uaa suspensão de esporos adicionada ao Melo A, raas que ae utilizou ao fia de 3 dias de incubação conforme descrito (transferidos 0,1 al) para inocular uaa porção recente do esmo melo (2,5 ml).
A esta uitiaa cultura adicionou-se o intermediário 1 (1 rag era 0,05 ral de diraetii-suifóxido) ao fia de 2 dias e depois incubou-so a cultura durante sai» dois dias antes de se proceder á colheita, e extraiu-ae o anaLicou-ee conforaa descrito na parte (a). A análise por hplc de uaa amostra de ensaio demonstrou a presença do coaposto de fórmula (I) era que
Rx representa ua grupo isopropilo,
Rz representa ua grupo hidroxílo,
R representa ua átomo de hidrogénio e
repreo-snta urx áíoisc de hídrcgênio <Io [5,.11 centagea expressa como na parte (a)].
Exemplo 2 (a) Utllizou-se uma suspensão de esporos (0,4 ml) d« Streptomyces thermoarchacnaia MC1B 12213 [prepaiaiu conforme descrita para o Exemplo 1] para inocular ua balão agitado em ζόϋ al contendo o Heio A (25 ml). Incubou-»c esta cultura a 2S2C durante 2 dis» nxiai agitador rotativo funcionando a 250 rotações/minuto. Decorridos 2 dias adicionou-se uma porção (5 ml) desta cultura a um balão agitado de 50 al e adicionou-se uma solução a 20 mg/ml de intermediário 2 em metanol (50 yú.). I.*cubou-ae a cultura durante :anis 2-3 dias nas mesmas condições, depois tratou-se coa volume igual de metanol. Agitou-se a suspensão resultante durante 1 hora e centrífugou-se. Analisou-se o sobrenadante por espectrometria de massa/hplc. Um pico com um tempo de retenção de 3 minutos apresentou uma caracteristica de espectro de maeea do composto de fórmula (I) em que representa isopropilo,
3 H e R en conjunto coa o ãtoao do carbono ao qual estão ligados representam OO e
j (b) Repetiu-se a parte (a) de experiência coa Streptomyces ι theraoarchaensis KCI3 12213 e com Intermediário 3, proporcxonando um extracto cuja análise por espectrometria de massa/hpxc (utilizando como eluente acetouitrllo/água 9:1) demonstrou a presença de um composto da fórmula (1) em que
| representa | uu á to;?o | d íi : i X C Γ O j; Ο Λ X O | |
| representa | u’t tccr.c | de hidrcícr.io, | per c c m.p « r s ç : z |
| ec·'/. uma cr.o | stra autêntica dcscrxta | to Pedido de |
Patente Inglese KL’ 2176182.
(c) U”cc repetição de parte (a) du experiência ccm Scrcptcrryc»b chertrourchaensls hCIô 12213 ε coe o Interuediárlc 4 prcpor cícncu um eztracto cujc análise por hplc dexcr.strcu a presença du um ccr.pcato de fórmula (I) eib que
Λ
,4 representa mi grupo isopropilo, representa un grupo -OCUCóqi,
4.
representa ur. átomo de hidrogénio e representa um atojao de hidrogénio, por comparaçao ccji um* amostra autêntica descrita no Pedido de P«Lente Inglesa Nfí. 2175182.
(d) U*:e repetição da parte (e) da experiência com Scrcptot-ruea cherutarchaensis NCIL 12213 e con o Inccrvsedinric 5 pro pvrcionou uc· extractc cuja analise por hplc der.cnstrou a pr»·.cença ne uai cooposto de fórmula (I)
e.a que
-.1 xx .2 representa ura grupo isopropilo, a _
Tc cm conjunto coe o ãtowo de carbono ao qusl eacao li.ados representam
C-NOCIi- e representa uu atoso de hidrogénio, per corpcrnçr.o cot. ut«i szc-stra autêntica descrita r.o Pedido ?ntente ren
2192630Λ.
Λ espectros copia de masca ... 1. de una --«os t-xu-oolaua a ρηχ tir de imiu hplc ax.exxtc.ee propoxexeneu nn i*.u tcoiccuier a o39 e proporcionou trag»ventos caxactvxístico· > cii, 1x7, 311, 49G, 44í»,434,368, 2t>4, 2,4o e xli.
- 1<J Processo para a preparação de coapostos
an qn»·.
j.·'
L
M. ' é uo grupo «aetilo, etilo ou ioopropilo;
- - - 5 <
t: atesto de hidrogénio ou u* grupo Od (er: rur·. OR.
ê us grupo hidroxilo ou ur $rupo hidroxilo riohetiiul^ do cor* ate 25 átonos de caròoac) e ê úa. itcxe de i»£drcfténic, ou iz a CJ tn. ecujuutc coico c iLwit ca carauuo ao ^gual ae^a— liga—os rcpve— fafeucaa >Ο·Ό, >CKCn9 eu >OA;lLa (cu que nv rap-rasen ta ua Xtcjuc da hidrogénio, un grupe alquile (C-,-Ca) ou us. grupo alquiiv Í^--Cg) c c grupe >ΟΗΟϋυ aetã aa ceníiguxação X)ι a •í jk ãcoíio áa hidrogénio ou co grupo raatilo, enrscfcrizado per sa incubar no cosrnoote do fâmulo II
em que
3
R , R e R sao como definido anteriormente num meio adequado na presença de um microorganismo ou enzima seu derivado ou uma preparação derivada de um microorganismo contendo o enzima susceptível de efectuar a conversão.
Claims (3)
1, caracterizado por o microorganismo ser uma estirpe Streptomyces thermoarchaensis, Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus, Streptomyces avermitilis ou Streptomyces hygroscopicus subesp. aureolacrimosus.
-3êProcesso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o microorganismo ser Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12212 e 12213 e mutantes destas estirpes, Streptomyces avermitilis ATCC 31272 ou 31780 ou Streptomyces hygroscopicus subesp. aureolacrimosus FERM P 1438.
- Processo de acordo coai u reivindicação í, caractsrirfico por ee edicionar o composto de iórmula li uca solvente ad^uado a uc, maio de fermentação que consiste ao aicroorganisao na presença de fontes assiailáveis de carbono, fezoto e sais minerais.
- 5ê Processo de acordo coe a reivindicação 1, caracterizado por se desenvolver a ua pE compreendido entre
5,5 e 7,5 e a tasa tezsperature compreendida entre 25 e 4ULG.
- 6í Processo de acordo coa a reivindicação 1, caracterizado por í&A na fórnula (1) e na fónsula (11) ser uu grupo isopropilo.
- 7é Processo de acordo cora a reivindicação 1, caracterizado por r.e fórmula (I) e fórmula (II),
S\
ΡΛ ser uu grupo hidroxi ou etoni ·
6/ ser ura etoreo de hidrogénio) ou cada e R representar um ãtoao de hidrogénioj ou RZ e fi? en conjun to com o átomo de carbono eo qual estão ligados representa» >00, XXSí^ ou /OfcOCH^.
-ga Processo da acordo con a reivindicação 1, ί caracterizado por na fóraula (I)t
1 2 3 K ser isopropiloι h e R era conjunto coa o «tomo de j carbono ao qual estão ligados representam C«Ku€li^ e sor uti átomo da hidrogénio;
i 2 3 4.
R~ aer iaopropiio, R , 3 c 3 serea átomo de hidrogénio; ou etsr Jí^protjJp» <j »’t S J*i «í.jÍêOóiniO·
A requerente neclara que o prVaeiro pedi ao deòta paceace rox apresentado na Gra-nretanna ea 14 de Março de idoc, sou o àt. Oôu59/U.
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| MM3A | Annulment or lapse |
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