PT89440B - Processo para a preparacao de insecticidas porfiricos - Google Patents

Description

THE BOARD OF TRUSTEES OF THE UNIVERSITY 0F ILLINOIS, Instituição Académica norte-americana (Estado de Illinois), com sede em 506 South Wright Street, Urbana, Esta do de Illinois 61801, Estados Unidos da América, pretende obter em Portugal, para : PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE INSECTICIDAS PORFÍRICOS

Mod. 71 - 10 000 οχ - 4-87 invento aqui descrito foi concebido no de curso de trabalhos suportados pelos subsídios provenientes do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, A Fundação Nacional de Ciência, a Universidade de Illinois, a Estação de Experiência Agricultural de Illinois, e da John P. Trebellas Photobiotechnology Research Endowment.

presente invento refere-se a composições e processos insecticidas, e mais particularmente a composições insecticidas e processos para elevar os níveis de tetrapirrole endógenos em insectos.

pedido de patente co-pendente norte-ameri_ cano N? de Série 895-529 descreve composições herbicidas que compreendem um ou mais compostos escolhidos do grupo que consiste em ácido delta—aminolevulínico, indutores de ácido delta-aminolevulínico em plantas, intensificadores da conversão de ácido delta-aminolevulínico até tetrapirroles fotodlnâmicos em plantas, e inibidores de conversão de te— s Ot ·/ / <e-, r’ I ^;

6o.568

Case UI-I9IO pirroles de divinilo em tetrapirroles de monovinilo em plan tas; processos para induzir a acumulação de tetrapirroles fotodinâmicos em plantas vivas utilizando as referidas composições, e processos para exterminar plantas utilizando as referidas composições. Todavia, as referidas composições não eram anteriormente conhecidas nem tinham sido descritas como insecticidas.

Os termos seguintes, como utilizados anteriormente e em seguida, têm o seguinte significado, a menos que seja expressamente indicado o contrário: ALA = ácido delta-aminolevulínico; Chi = clorofila; Chlide=Clorofilida Coprogen = coproporf irinogeno; DP = dipiridilo; DV = divj. nilo; Mg-Proto = Mg-protoporfirina IX; x'lV = monovinilo;

Mod. 71 - 10 000 ex - 4-87

PA = fenantrolina; PBG = porfobilinogeno; PChl = protoclor fila; PChlide = protoclorodilida; Pheo = feofitina; Pheobide = feoforbida; Proto = protoporfirina IX; Protogen = protoporfirinogeno; Uro = éster octametílico de uroporfirina; e Urogen = uroporfirinogeno. Os termos Proto,

Mg-Proto, PChlide,

Chlide, Chi, Pheo, e Pheobide referem-se a associações compostas por componentes MV e/ou DV a menos que precedidos por uma designação MV ou DV.

ácido delta—aminolevulínico, um aminoácido com cinco átomos de carbono, é encontrado na maior parte das células de animais e plantas vivos e é o precursor primário de tetrapirrole. 0 mesmo está disponível a partir de uma variedade de fontes da especialidade, por exemplo a Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Em plantas, ALA é um precursor de clorofila através de uma passagem hexagonal envolvendo protoporfirinogeno, protoporfirina, Mg-protopor firina, metaloporfirinas de mais comprimento de onda, protoclorofila, e clorofilida / ver Fig. 1 do Pedido de patente co—pendente norte-americano N? de Série 895.529/· Em in sectos, ALA é transformado em protohema (protoporfirina ferrosa IX) através de uma passagem que envolve porfobili30

6o.568

Case UI-I9IO nogeno, uroporfirinogeno, nogeno, protoporfirina IX, to é protoheme):

ciproporf irinogeno, protoporfiri e protoporfirina ferrosa IX (isGRÁFICO DE FLUXO A:

O

II

C00H-CH₂-CH₂-C-CH₂-NH₂

HOOC CH„—COOH

I I ²

H₂c ch₂

ALA

H₂N

Mod. 71 · 10 000 βχ - 4-87

PBG

CH₂ CH

COOH COOH

OROGEN III = 3 =

6θ.568

Case UI-I9IO

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87 ç^h ₂ ch₂

COOH COOH

COPROGEN III

COOH COOH

DV PROTOGEN IX

60.568

Case UI-1910

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87

DV PROTO IX

COOH COOH

Fe-Proto (Protoheme)

60.568

Case UI-1910

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87

COOH COOH <F^H3

Heme A R·^ = -CH-CH₂-CH₂~CH=C---CH₂-CH=C---CH₂~CH₂-CH=Ç

OH CH₃ CH3 CH₃ r₂ = -ch=ch₂

R₃ = -CHO

Heme C R^ = R^

-CH-CH-j

S ¹ t

Proteína

-CH

6o.568

Case UI-I9IO

Mod. 71 - 10 000 ex - 4-87 / Ver também Granick, S. e D. Mauzerall, em Metabolic Pathways, Vol. 2 (D.M. Greenberg, ed. ) (Academic Press, NY, 1961), págs. 525—6167. Protoheme e hemes a e c são grupos prósteticos de todos os citocromas em células de plantas e animais.

Verificou-se agora que os insectos podem ser exterminados pela administração de uma composição que compreende um ou mais compostos escolhidos do grupo que con siste em ALA, indutores de ALA em insectos, e intensificadores da conversão de ALA em tetrapirroles em insectos.

Em particular, verificou-se agora que os in sectos vivos podem ser induzidos por exposição a ALA exógeno para acumular artificialmente elevadas quantidades de intermediários tetrapirrole em excesso dos níveis normalmen te controlados em tais insectos, e que tais elevados níveis artificialmente induzidos são tóxicos para o insecto. Isto é surpreendente, visto que os insectos sintetizam normalmen te citocromas apenas a uma porção suficiente para manter com desenvolvimento e restabelecimento, e não se acreditava anteriormente que esta proporção seria suficiente para permitir a acumulação de quantidades letais de tais intermediários tetrapirrol.

Embora o mecanismo exacto de toxicidade não seja conhecido, parece que os tetrapirroles acumulados podem actuar de uma ou duas maneiras. À luz, crê-se que os tetrapirroles acumulados fotosensitivam a formação de oxigénio singleto, que é um oxidante muito forte. O oxigénio singleto oxida rapidamente os componentes de lipoproteína das membras celulares de insecto, ajustando assim em movimento uma reacção em cadeia de radical livre altamente destrutivo, que pode ser sumarizado como segue (hv = fotão de luz; ^Tet = tetrapirrole no estado triturado singleto;

* 3

Tet = tetrapirrol no estado excitado tripleto 0_? = oxi1 z génio no estado triturado tripleto; 0₂* - oxigénio no = 7 =

60.568

Case UI-I9IO

estado excitado singelto; UMLP = lipoproteínas de membrana insaturada):

1)	1Tet	+ hv
2)	3_ Tet
3)	1 M 02*	+ (UMLP)

4) hidroperóxidos

^TTet +

hidroperóxido s radicais livres

5) radicais livres + UMPL mais hidroperóxidos

6) repetição das fases (4) e (5) até a maior parte de UMPL estar oxidada

Mod. 71 - 10 OOO ex - 4-87

A fotosensibilização por meio de tetrapirroles injectados foi descrita em tecidos de animais e seres humanos/ ver, por exemplo, Ellefson, R.D., Mayo Clinic Proc. 57*454-458 (1982); Christensen, T., T. Sandquist, K. Feren, H. Waksvil· e J. Moan, Br. J. Câncer 48:35-43 (1983); Hopf, F.R., e D.G. Whitten, em The Porphyrins, Vol. _1, Dolphin, D., ed. (Academic Press, Nova Iorque, 1978), págs. 161-195; Sandeberg, S., I. Romslo, G. Hovding, e R. Bjorndal, Acta Dermatovener (Estocolmo) Suppl. 100:75-80 (1982); Latham, P.S., e J.R. Bloomer, Photochem. Photobiol. 37*553-557 (1983); Bickers, D.R., R. Dixit, e H. Mukhtar, Biochim. Biophys. Res. Comm. 108:1032-1039 (1982^7mas este fenómeno de acumulação de tetrapirrole ALFA-dependente não tinha sido previamente demonstrado em insectos, mas tinha sido previamente adaptado para exterminar espécies de insectos indesejáveis .

No escuro, parece que os tetrapirroles acu mulados actuam através de um mecanismo diferente e resultam em níveis aumentados de Zn-protoporfirina. 0 Zn-Proto não é um intermediário metabólico natural do caminho porfirina-heme. A sua ocorrência em células vivas e tecidos denota usualmente um metabolismo porfirina-herne envenenado / ver = 8 =

6θ . 568

Case UI-I9IO

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-07 por exemplo, Lamolla, A.A., e T. Yamane, Science 186:936-938 (1974)7· A maior parte dos ferroquelatases (os enzimas que introduzem ferro ferroso em Proto para formar heme) pode introduzir Zn em vez de ferro no Proto para dar Zn-Proto, particularmente sob condições de reacção desfavoráveis /Marks, G.S., em Heme abd Chlorophill (Van Nostrand, 1969), págs. 146-1477. ^Emb ora o mecanismo exacto não seja conhecido e a requerente não deseje ficar ligada a qualquer teoria particular, crê-se presentemente que a acumulação de Zn-Proto comc um resultado dos métodos insecticidas do presente invento pode ser provocada por dano do sistema ferroquelatase fazendc com que o enzima introduza zinco em vez de ferro ferroso em alguns dos Proto. Eventualmente isto significa que zinco em vez de ferro ferroso é encontrado em alguns grupos prostéticos do enzima respiratório crucial citocroma c oxidase. Come consequência aquelas moléculas de citocroma c oxidase contendo Zn-Proto em vez de heme não podem manter-se fixas aos radicais livres tóxicos tais como superóxidos de oxigénio e ra dicais livres de hidróxido que são normalmente formados durar te o ciclo de ácido cítrico de Krebs / Halliwell, B., What's New in Pant Physiology 15s21-24 (1984)/· Nestas ci rcunstâncias os radicais livres destrutivos podem ser libertados no ambiente da membrana biológica e contribuir para a perda do radical-dependente livre o que tem como resultado a morte do insecto.

Verificou-se ainda que além da exposição al ALA exógeno, a exposição de insectos vivos a indutores de ALA resultará também na acumulação de quantidades maciças de tetrapirroles nos tecidos dos insectos. Por indutor de AMA’ quer—se significar um compost que, quando aplicado a insectos, estimula o insecto a produzir uma quantidade superior à normal de ALA endógeno, o qual tem então o mesmo efeito que o ALA exógeno descrito acima. Assim, as composições insecticidas do presente invento compreendem um ou mais indutores de ALA além de, ou no lugar do próprio ALA. Exemplos = 9 =

60.568

Case UI-1910

Mod. 71 - 10 OOO βχ - 4-87 não limitativos de indutores são 2,2 '-dipiridilo; 1,10-fenantrolina; 4,7-dimetil-1,10-fenantrolina; 4-metil-l,10-fenantrolina; 5-nitro-l,10-fenantrolina; 5-metil-l,10-fenantrolina; 5,6-dimetil-l,10-fenantrolina; 4,7-difenil-fenantrolina; 5-cloro-l,10-fenantrolina; 3,4,7,8-tetrametil-1,10-fenantrolina; 2,2'-ditiobis(piridina N-óxido); 4,4¹-dimetil-2,2'-dipiridilo; fenil-2-piridil cetoxima, e 2,2¹;6¹,2-terpiridina.

Verificou-se ainda que determinados compos tos funcionam como intensificadores de conversão de conversão ALA até tetrapirroles em insectos. Por intensificador de ALA ou intensificador quer-se significar um composto que quando aplicado a insectos aumenta a capacidade de os insectos tratados transformarem os exógenos ou endógenos ALA em tetrapirroles insecticidas. Assim as composições insecticidas da presente invenção podem também compreender um ou mais intensificadores de ALA além de, ou em vez de ALA exógeno ou indutores de ALA. Exemplos não limitativos de intensificadores adequados são 2,2'—dipiridilo; 1,10-fenantrolina; 4,7-dimetil-1,10-fenantrolina; 4-meti1-1,10-fenantrolina; 5-nitro-l,10-fenantrolina; 5-metil-1,10-fenantrolina; 5,6-dimetil-1,10—fenantrolina; 4,7-difenil-1,10-fenantrolina; 5-cloro-l,10-fenantrolina; 3,4,7,8- tetrametil-1,10-f enantrolina; 2,2 ' di tiobis-(piridina N-óxi^ do); 4,4'-dimetil-2,2’—piridilo; fenil-2-piridil cetoxima, e 2,2’:6’,2-terpiridina. Certos compostos que funcionam como indutores numa composição podem funcionar como intensificadores noutra composição ou com diferentes concentra ções. Alternativamente, certos compostos (por exemplo 2,2' -piridilo; 1,10-fenantrolina; 4,7-dimetil-l,10-fenantrolina; 4-metil-l,10-fenantrolina; 5-nitro-1,10-fenantrolina;

5,6-dimetil-l,10-fenantrolina; 4,7-difenil-l,10-fenantrolina; 5-cloro-l,10-fenantrollna; 3,4,7,8-tetrametil-1,10-fenantrolina; 2,2¹-ditiobis(piridina N-óxido); 4,4'-dimetil -2,2'-dipiridilo; fenil-2-piridil-cetoxima, e 2,2':6',210

6θ.568

Case UI-I9IO

-terpiridina) podem funcionar como indutores e intensificadore s.

Os compostos insecticidas do presente invento podem também compreender combinações de dois ou mais compostos escolhidos do grupo que consiste em ALA, indutores e intensificadores, por exemplo ALA + um ou mais indutores

ALA + um ou mais intensificadores ALA + um ou mais indutores + um ou mais intensificadores, um ou mais indutores + um ou mais intensificadores; etc.

Mod. 71 - 10 000 ox - 4-87

A composição pode também conter um ou mais dos seguintes:

veículo(s) adequado(s) / por exemplo silicato de alumínio magnésio coloidal, pedra-pomes, talco, ou combinações dos mesmos/; dissolvente(s) / por exemplo água, 0,45 de acetona: 0,45 de etanol:0,l de Tween 80:9 de água (v/v/v/v),

0,45 de acetona; 0,45 de metanol:0,l de Tween 80,9 de água (v/v/v/v), 0,1-1% de Tween 80 em água (v/v), 0,9 de polietileno glicol (PEG): 0,1 de Tween 80:9 de água (v/v/v), 0,1-0,7 PEG:0,2-0,8 metanol:0,l de Tween 80:9 de água (v/v/ /v), 0,45 de acetona:0,45 de etanol:0,2 de Tween 80;9 de etileno glicol:18 de água (v/v/v/v), ou um ou mais dos seguintes: benzeno, tolueno, xileno, queroseno, 2—metoxi— etanol, propileno glicol, dietileno glicol, éter dietílico de dietileno glicol, formamida, metilformamida, ciclohexanona, isoferona; tampões / por exemplo ácido cítrico/; agente(s) molhante(s) / por exemplo N-metilN-oleciltaurato de sódio, um alquilfenoxi polioxietileno etanol, sulfonato alfa-olefina de sódio, sulfonato isopropilnaftaleno de sódio, óleo vegetal polioxietilado/; agente(s) de dispersão / por exemplo sulfonato de lignina de sódio, o sal de sódio de um condensado de ácido—formaldeído naftaleno sulfónico, hidroxietil celulose/; agente(s) de eliminação de espuma / por exemplo silicone/; emético(s) / por exemplo tripolifosfato de sódio, pirofosfato de tetrapotássio, are11

6o.568

Case UI-I9IO

v cotina, apomorfina, sulfato de cobre7; agente(s) contra cheiros / por exemplo piridina7j nenetrante(s); agente(s) tensioactivo(s); emulsionante(s); adjuvante(s); herbicida(s); e um ou mais outros insecticidas conhecidos.

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87

A composição pode ser formulada de uma ma neira convencional utilizada para preparações insecticidas, por exemplo como um ingrediente no alimento para aplicação sistémica interna, ou como uma solução, suspensão, emulsão, concentrado fluível, concentrado emulsionável, gel, pasta, espuma, creme, aerosol, pó molhável, pó, grânulos dispersíveis e análogos para aplicação tópica externa, de acordo com os processos conhecidos dos entendidos na técnica. A for mulação é concebida para libertar uma quantidade adequada de um ou mais ingredientes activos para o insecto ou insectos em alvo. Para aplicação tópica, a composição é de pre ferência uma solução, suspensão, emulsão, aerosol, concentra do fluível ou emulsionável, ou pó molhável. Evidentemente, a formulação tópica deve ser tal que o(s) ingrediente(s) activo(s) penetre(em) no tecido do insecto e se desloque para os locais da síntese de tetrapirrole.

Quando o ingrediente activo é combinado com um ou mais compostos ou composições activas ou inertes acima mencionada, a combinação pode ser feita à temperatura ambiente, ou a temperaturas acima ou abaixo da temperatura ambiente desde que a estabilidade da composição não seja afectada. Quando a composição compreende ALA, a temperatura é de preferência mantida entre cerca de 4°C e cerca de 75°C. Quando a composição insecticida da presente invenção está em solução aquosa, o pH pode estar no ponto isoeléctrico do ingrediente(s) activo(s), ou acima ou abaixo do ponto isoeléctrico, desde que a estabilidade e solubilidade do ingrediente activo não seja tão adversamente afectada que interfira com a eficácia. Todavia, quando a composição insec ticida contém ALA, o pH é de preferência ajustado de modo a

60.568

Case UI-191O cerca de pH e e pH 8 mais componentes são combinados ficar entre

Quando doois ou para formar preferência as composições combinados sob centração uniforme através te feito por técnicas tais turação, combinação, etc.

Naqueles casos insecticidas, os mesmos são de condições que asseguram uma conda mistura. Isto é convenientemencomo movimentação, agitação, misem que o ingrediente activo e para

Mod. 71 - 10 000 ex - 4-87 ser o único componente da composição insecticida do presente invento, o imgrediente activo deve ser cuidadosamente preparado para se conseguir a aplicação uniforme. No caso de um ingrediente activo sólido, isto é convenientemente subdividindo o mesmo até um pó fino. Quando um tal te único está na forma de um líquido, o mesmo entemente ser atomizado até nevoeiro ou névoa efectuado componenpode convenia temperaturas adequadas por meio de técnicas bem conhecidas didos nesta matéria. Quando as composições de cas são feitas em solução, as mesmas convenientemente compre emdem concentrações de cerca de 2 a cerca de 5θ nM ALA e de para os entenregime ou tópi^ cerca de 0,1 a

De cerca de 5θ nM indutor ou intensificador.

acordo com os métodos do presente invento, os insectos a ser ção insecticida que compreende ALA e/ou indutores de ALA e/oi intensificadores de conversão de ALA em intrapirroles. As composições insecticidas do presente invento podem ser apliexemplo como pó, embebimento, imersão ou névóa, numa quantidade suficiente níveis laterais internos de tetrapircomposição insecticida a ser aplicada topicamente variará conforme o(s) ingrediente(s) activo(s), mas em geral será uma quantidade suficiente para fornecer de cerca de 0,25-2 lb por acre e/ou de cerca de 0,1-1,5 lb de indutor ou intensificador por acre. Meios para a determinação da aplicação de proporções óptimas estão dentro da compe extreminados são contactados com uma composicadas topicamente, por pulverização, nevoeiro para se conseguirem roles. A quantidade de = 13 =

6θ.5θ8

Case UI-191O

Mod. 71 - 10 000 ex - 4-87 tência dos entendidos nesta técnica.

Alternativamente, as composições insecticidas do presente invento podem ser administradas através de dieta, incorporadas em engodo ou outro alimento ou bebida a ser ingerido pelos insectos a serem exterminados. Novamente, a quantidade da composição insecticida a ser administrada variará conforme o(s) ingrediente(s) activo(s) escolhidos, mas em geral estará numa quantidade suficiente para fornecer de cerca de ^.0 ng a cerca de 5 ug de ALA por mg de peso de corpo , e/ou de cerca de 1 ng a cerca de 5 A>g de um indutor ou intensificador por mg de peso de corpo.

Se for desejado que o insecto seja morto atra vés do mecanismo de escuro, o insecto pode ser tratado e depois protegido da exposição á luz para permitir a acumulação máxima de tetrapirrole. 0 insecto pode ser protegido de qual quer maneira conveniente, como por cobertura do chão ou área em que o insecto é para ser encontrada, mediante tecido, papel escuro ou chpa. Nas condições do campo, o método ideal para proporcionar um período de incubação no escuro consiste em aplicar a composição insecticida ao crepúsculo ou durante a noite, num momento escolhido para permitir que os insectos permaneçam no escuro durante pelo menos uma hora. Deve compreender-se que, a fim de facilitar a acumulação de tetrapirrole, a escuridão não necessita ter total ausência de luz, mas antes substancial ausência de luz a comprimentos de onda de 3θθ a 700 nm. De preferência, os insectos são mantidos no escuro durante cerca de 1 a cerca de 20 horas. De uma a 8 horas é um período de tempo particularmente preferido. Evidentemente, muitos insectos preferem naturalmente os ambientes escuros e não são necessárias fases extra para proteger os mesmos da luz depois do contacto com a composição insecticida .

Se os insectos forem para ser extreminados através do mecanismo de luz, a composição insecticida é apli= 14 =

6o.568

Case UI-I9IO

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87 cada ou administrada e os insectos são ao mesmo tempo ou subsequentemente expostos a velas de cerca de ft. ou mais de luz a comprimentos de onda de cerca de 380 a cerca de 700 nm. A luz pode ser fornecida por qualquer fonte conveniente, por exemplo uma lâmpada incandescente, lâmpada de ha logeneto metálico, lâmpada solar, ou um bolbo fluorescente branco ou clarabóia. No campo, evidentemente, a fonte de luz preferida é a luz do sol. Os insectos são expostos â luz durante um período de tempo suficiente para oxidar a maior par te das lipoproteínas de membrana insaturadas; prefere-se um período de cerca de 2 minutos a cerca de 3 dias.

Os insectos a serem tratados pelo presente in vento podem adequadamente estar na fase oval, larval ou adu_l ta. Em larvas, a fase do instar pode afectar a susceptibilidade do tratamento; as larvas em instares posteriores são relativamente mais susceptíveis ao tratamento que as larvas nos instares iniciais ou médios. De acordo com isto, pode ser necessário variar os níveis de dosagem de acordo com a fase de desenvolvimento da maioria da população larval protegida.

A actividade insecticida é indicada por altera,ão da cor da pele, seguida por dissecação e morte.

Uma outra interpretação do presente invento pode ser tomada a partir dos seguintes exemplos não limitativos, Como utilizada acima e em seguida, a não ser que de outro modo seja expressamente indicado, em contrário, todas as temperaturas e parâmetros de temperatura são referidos ao sistema centígrado e os termos ambiente e temperatura ambiente referem—se a cerca de 20—25°C. 0 termo percentagem ou (%) refere-se à percentagem em peso e os termos mole e moles referem-se a moles por grama. Nível de significância' refere-se à probabilidade de para uma população para a qual o coeficiente de correlação (r) é igual a zero, pode ser tomada uma amostra de tamanho n , para o qual o coeficiente = 15 =

6o.568

Case UI-I9IO de correlação iguala ou excede o valor calculado de r reportado para a amostra dada. A abreviatura n.s. quer dizer não significativo.

Mod. 71 - 10 000 ex - 4-87

EXEMPLO I

Pigmentos das Dietas em que Larvas T. nj foram criadas

Ovos de Trlchoplusia ni (Hubner) (larva da couve, a peste mais extensiva em culturas vegetais nos Estados Unidos) foram obtidos por cedência da Sra. Paula Peters do USDA Insect Biological Control Laboratory, Departamento de Entomologia na Universidade de Missouri na Columbia. As larvas, ninfas e mariposas adultas, foram criadas em incubadoras Percival Modelo 1-60 (Percival Mfg. Co., Boone, Iowa 5OO36) a 25°C e 75 % de humidade com um regime diário de 14 horas de luz e 10 horas de escuridão. As larvas foram mantidas em dietas artificais seguindo os métodos descritos por Waldbauer, G.P., R.W. Cohen e S. Friedman, Great Lakes Entomol, (1984) 17:114. Vinte-trinta larvas foram criadas em re cipientes de papel de 8—oz com tampas de plástico transparente vendidos pela Lily-Tulipe, Inc. (Augusta, GA). Para evitar alterações genéticas na colónia, foram adicionadas colecções selvagens às culturas em cada varão. Para minimizar as doenças microbianas, os ovos e ninfas de cada geração foram esterilizados superficialmente.

Visto que as larvas T. ni. criadas numa dieta contendo farinha de alfalfa verde-amarelada adquirem uma cor verde-amarelada, enquanto que as larvas R. ni criadas sem farinha de alfalfa estavam visualmente isentas de pigmentação, o teor de pigmento endógeno da dieta foi investigado como uma fase preliminar para estudar a indução de tetrapirroles por tratamento químico.

A cor verde-amarelada da dieta contendo farinha de alfalfa foi típica da cor verde-amarelada de Pheos =

$0.568

Case UI-1910

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87 (Chis que perderam o seu átomo Mg) e de Pheobides que perderam o seu átomo Mg) e de Pheobides (Chlides que perderam o seu átomo Mg). Isto foi confirmado por análise espectrofluo rométrica a 77°C. Quantidades Gram da dieta foram homogeneizadas em 6 ml de acetona:0,l N NH^OH (9:1 v/v) e o extra£ to de acetona aquosa resultante contendo vários pigmentos foi limpo de lipoproteínas e fragmentos da célula por centri fugação a 39000 g durante 10 minutos a 0°C. Pigmentos opolares tais como Chis e Pheos foram removidos da solução de ace tona aquosa por extracção com hexano. Os pigmentos mais polares di- e monocarboxílicos tais como Proto, Mg-Proto, PChlides e Pheos permanecem na fracção de acetona aquosa extraída com hexano. Uma pequena parte alíquota do extracto de hexano contendo os pigmentos clorofilosos foi secada sob gás de azoto e o resíduo foi dissolvido de novo em acetona a 80% para a determinação espectrofluorométrica das quantidades de Chis e Pheos de acordo com o método de Bazzaz, M.B. e C.A. Rebeiz, Photochem. Photobiol. (1979) 30:709.

Os espectros de fluorescência foram registados num medidor de espectro de fluorescência contador de fotões completamente corrigido, Modelo SLM 8OOODS como descrito em Rebeiz, C.A. Montazer-Zouhoor, H.J. Hpen e S.M. Wu, Enzyme Microb. Technol. (1984) 6:3°O. A excitação foi a 400, 420 e 44O nm. Os espectros de absorção foram registados a uma largura de fenda de 2 nm num espectrfotómetro de comprimento de onda duplo DW-2, modelo Aminco (Travenol Laboratóries Inc., Silver Springs, MD 20910). Os controles foram MV Pheo a e b preparados a partir de MV Chi a e b, respectivamente, como descritos em Bazzaz, M.B. e C.A. Rebeiz, Photochem. Photobio 1. (1979) 30:709. Os resultados estão apresentados na Tabela I:

=

60.568

Case UI-1910

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87 to o ff c Φ E MJ ff a

4)

Ί3

tn	Φ
	0
	Ό	rt
		<P
		ff
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		Ό	ff
	p		Φ
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6θ.568

Case UI-1910

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87

Excitações sensíveis do copo do éter do extracto polar entre 400 e 450 nm extrairam duas bandas de emissão Chl-análogas com os máximos a 655 θ 666-667 nm respectivamente (Tabela : Cl, 2). 0 espetro de excitação Soret da banda de emissão de

655 nm apresentou a fenda de excitação máxima Soret a 440 nm (máximo tamanho) e a 450 nm (o mais pequeno) Tabela I: Cl). Estes máximos de emissão e excitação foram idênticos aos do auautêntico MV Pheo b (e44O E45OF656) (Tabela I: A). Neste contexto E44O 450 refere-se á fenda máxima de excitação Soret de MV Pheo b a 77°K ^em éter, enquanto F656 se re fere ao máximo de emissão de fluorescência de MV Pheo b a

656 nm. A banda fluorescente (E44O E45OF656) foi identifi- cada como MV Pheo b. Pequenas quantidades de MV Chi b estavam também presentes.

espectro de excitação Soret da banda de emissão de 666 nm, apresentou um máximo de excitação simples a 414 nm, e era idêntico ao autêntico MV Pheo a (Tabela I: B, C 2). Este composto fluorescente (E414F666) foi portanto identificado como MV Pheo a.

As propriedades espectrofluorométricas da fracção polar foram muito semelhantes às da fracção apoiar (Tabela I:C 1-4). Todavia, os compostos (e440 E45OF655) e (E414F666-667) eram demasiado polares para a divisão com hexano e permaneceu no resíduo aquoso da acetona. Os mesmos foram identificados com MV Pheobide b e MV Pheobide íi, respectivamente. Os Pheobides têm as mesmas propriedades espectroscópicas electrónicas que os Pheos mas são mais polares porque eles perderam o álcool de cadeia comprida na posição 7 do macrocíclo. Foi documentado que a extensão de esterificação nas posições 6 e 7 do macrocíclo não tem efeito nas propriedades de absorção electrónica e fluorescência de tetrapirroles (ver, por exemplo, Belanger, F.C. e C.A. Rebeiz, J. Biol. Chem. (1982) 257:136o).

As quantidades de Proto, Mg-Protos, =

6θ,568

Case UI-1910

PChlides, Chlides e Pheobides foram determinados por espectrofluorometria sobre partes alíquotas da fracção polar hexano acetona extraída de acordo com os métodos de Rebeiz, C.A., J.R. Mattheis, B.B. Smith, C.C. Rebeiz, e D.F. Dayton, Arch. Biochem. Biophys. (1975) 171:5^9 θ Bazzaz, M.B. e C.A.

Rebeiz, Photochem. Photobiol. (1979) 3L:7O9. Os resultados estão apresentados na Tabela II:

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87

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60.568

Case UI-I9IO

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Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87

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60.658

Case UI-1910

em que Diet + A.M. = a dieta contendo farinha de alfalfa, e Diet - A.M. = dieta que não contém farinha de alfalfa.

As quantidades de MV Pheobide a e b na dieta contendo farinha de alfalfa estão indicadas na Tabela II: A. Pequenas quantidades de Chlide a e b estavam também presentes (Tabela II: A). A dieta que não continha farinha de alfalfa tinha apenas vestígios de pigmentos clorofílosos (Tabela II: B).

EXEMPLO II

Pigmentos de T. ni

Mod. 71 - 10 000 οχ - 4-87

Larvas T. ni no seu quinto instar criadas sobre dietas contendo ou não farinha de alfalfa foram cuidadosamente homogeneizadas quer com argamassa e almofariz quer com um homogeneizador Brinkman modelo PT 10/35 (Brinkman Instrument Co., Westbury, N.I. 11590) em acetona: :0,l N NH^OH (9:1 v/v) a uma proporção de 6 ml de dissolven te por grama de tecido. Pigmentos polares e apoiares foram extraídos como no Exemplo I. Os resultados estão indicados na Tabela III:

60.658

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Case UI-I9IO

Mod, 71 - 10 ooo ex - 4-87 em que T, ni + A.M. = a larvas criadas sobre dietas conter do farinha de alfalfa e T. ni - A.M. = a larvas criadas sobre dieta isenta de farinha de alfalfa.

Em contraste com a dieta de farinha de alfalfa que continha quantidades substanciais de MV Pheo a e b além de MV Pheobide a e b , o R. ni continha pequenas quantidades de Pheos, cujo nível parece variar de corte para corte (Tabela III: A; ver também Tabela IV abaixo). Os pigmentos acumulados pelas larvas eram mais polares e consistiarr principalmente em MV pheophorbide a e MV pheophorbide b (Tabela I: E; Tabela III: A). Por outro lado, as larvas cria das sobre a dieta que não tinha farinha de alfalfa continham apenas vestígios de pigmentos clorofilosos (Tabela III: B).

A fim de determinar o local da acumulação de pigmento, a pele, hemolinfa e entranhas do quinto instar das larvas T. ni criadas sobre a dieta contendo farinha de alfalta foram separadas e analizadas quanto ao teor de pigmento. A hemolinfa foi reunida a partir de 9 a 10 larvas alimentadas com uma dieta sem alfalfa e de 9 ^a 1θ larvas alimentadas com uma dieta com alfalfa perfurando suavemente a pele sobre o coração compartimentado em um segmento posterior do abdómen das larvas. A hemolinfa extrudida foi recolhida numa ceringa No. 22 e foi imediatamente esguichada em acetona fria: 0,1 N NH^OH (9:1 v/v). Depois da colheita de hemolinfa, as larvas foram parcialmente descongeladas antes da abertura da pele longitudinalmente com um escalpelo afiado. A pele dej congelada (isto é, o tegumento de insecto) foi então cuidadosamente retirada das entranhas ainda congeladas. A pele foi colocada com água destilada arrefecida com gelo para posterior lavagem enquanto as entranhas foram colocadas em acetona arrefecida por gelo: 0,1 N NH^OH (9:1 v/v). A pele foi enxaguada três vezes com água destilada, depois foi colocada em acetona fria: 0,1 N NH^OH (9:1 v/v) para homogenizaçâo. A hemolinfa, entranhas e fracções de tegumento foram homogeneizadas em acetona fria: 0,1 N NH^OH (9:1 v/v) com argamassa =

6O.658

Case UI-I9IO

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87

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60.658

Case UI-I9IO

Como indicado na Tabela IV, a maior parte do pigmento foi encontrada nas entranhas. Pequenas quantidades de pigmento foram também detectadas no tegumento e na hemolinfa.

EXEMPLO III

Acumulação de Protoporfirina IX em T. ni Tratada com Ácido

Delta-aminolevulínico e 2,2 *-Dipiridilo

Um bloco de alimento (2,5 ^x 1,5 ^χ 1 cm,) e a 30 larvas T♦ ni no seu terceiro instar foram colocados num recipiente de papel 8-oz (9 cm de diâmetro) e o recipiente foi pulverizado com 0,35 ml de 40 mM ALA -30 nM 2,2'-DP em acetona: álcool etílico: Tween 80: água (0,45:0,45:

:0,1:9 v/v/v/v), ajustado ao pH 3,5·

A solução foi aplicada

Mod. 71 - 10 000 ex - 4-87 como uma pulverização fina com um diâmetro médio das gotículas de cerca de 50 microns. Isto fojéquivalente a uma velo cidade de pulverização de 40 galões por acre. Os tratamentos foram repetidos quatro vezes. Os recipientes pulverizados foram cobertos com uma tampa de plástico transparente e as larvas tratadas foram então incubadas durante a noite (17 horas, geralinente das 4 da tarde de um determinado dia até às 9 da manhã do dia seguinte) no escuro a 28°C antes da ex tracção como no Exemplo II. Os resultados estão indicados na Tabela V.

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Case UI—191θ

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60.658

Case UI-I9IO

Mod. 71 - 10 000 θχ - 4-β7

Embora o perfil do pigmento das larvas de controle, que foram pulverizadas apenas com dissolvente, seja semelhante ao descrito nas Tabelas I: E e III: A, o perfil de pigmento das larvas tratadas com ALA - 2,2'-DP foi drasticamente diferente. A fluorescência de MV Pheobide a e b na fracção de acetona aquosa extraída com hexano tornou-se completamente obscura por fluorescência com uma emissão máxima à temperatura ambiente a 631 nm e uma excitação máxima Soret a 405 nm. Este perfil de fluorescência foi idêntico ao do au têntico DV Proto dissolvido em acetona aquosa extraída com hexano / Fig. 1: (a), extracto extraída com hexano de larvas de controle; o pico de emissão a 674 nm é o mestno de MV Pheo a ; (b) extracto das larvas tratadas; (c) autêntico DV Proto na acetona extraído com hexano/· A confirmação da natureza do pigmento acumulado foi conseguida comparando o seu es pectro de absorção em acetona a 80% para os de éster octametilo de uroporfirina, coproporfirina, DV Proto, e DV Mg-Proto (Porphyrin Products, Logan, UT). Como está indicado na Tabela V, o extracto de acetona a 80% de T. ni apresentou um espectro de absorção à temperatura ambiente que era idêntica ao autêntico DV Proto. Depois de transferido para éter, o pigmento apresentou a mesma emissão de fluorescência e excitação máxima Soret a 77°K (629 e 409 nm respectivamente) como Proto autêntico. Depois da inserção de Mg no pigmento (como descrito em Belanger, F.C. e C.A. Rebeiz, J. Biol. Chem. (1982) 257:136o), o mesmo apresentou a mesma emissão de fluorescência e máxima excitação em éter a 77°K como autêntico DV Mg-Proto (Tabela V). Conjuntamente estes resultados indicam que o tratamento de larvas T. in com ALA e 2,2¹-DP resultou na biosíntese e acumulação de DV Proto pelas larvas.

EXEMPLO IV

Efeitos Insecticidas do Tratamento

ALA + 2,2'-DP

Para determinar as relações entre o trata29 =

6θ.65θ

Case UI-191O

I ' i

mento ALA + 2,2’—DP, acumulação de pigmento e efeitos insec ticidas, larvas T. ni na terceira instar foram pulverizadas com 4θ mM ALA - mM 2,2¹-DP a um pH de 3,5 θ foram incubadas durante a noite (17 horas) no escuro a 28°C como no Exemplo III. Na manhã seguinte, uma série de três réplicas foram colocadas na estufa a 25°C sob um fotoperíodo de 14 horas de luz, 10 horas de escuro, a fim de se se obsrvar a morte das larvas. A quarta réplica constitui o controlo (pulverizado apenas com dissolvente); o controlo e as réplicas tratadas foram extraídas para determinações quantitativas de pigmen15

Mod. 71 - 10 000 οχ - 4-87 to como no Exemplo II. A morte das larvas foi avaliada por comparação diária das larvas sobreviventes entre os insectos tratados e os de controle. A proteína foi determinada suspendendo o resíduo de acetona insolúvel que foi precipitado por centrifugação do homogeneto tecido em água destilada com um triturador de tecido totalmente de vidro. As proteínas totais foram determinadas por biureto numa pequena parte alíquota depois da aplicação de acordo com o método de Rebeiz, C.A. e P.A. Castel franco, Plant Physiol. (1965) 40:2811 Os resultados de várias experiências estão indicados na Ta bela VI:

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Case UI-I9IO

Mod. 71 - 10 000 ex - 4-βΤ

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6o.658

Case UI-I9IO

Mod. 71 - 10 000 ex · 4-87 em que Morte Larval se refere à percentagem de morte no início do quarto fotoperíodo, isto é, depois de 3 dias na estufa, e alteração Δ ” refere-se à diferença em teor de pigmento entre as larvas tratadas com ALA + 2,2'-DP e as lar vas de controle depois do período de incubação no escuro de 17 horas após a pulverização.

tratamento ALA + 2,2'-DP resultou em acumulação maciça Proto e morte larval significativa. A percentagem de morte larval apresentou um elevado grau de correlação com a acumulação (Tabela Vi). A maior parte das mortes ocorreram durante o período fotoperíodo. Dentro de minutos até poucas horas depois da exposição à luz as larvas tor naram-se lentas e flácidas devido à perda de fluídos do corpo; a morte foi acompanhada por dissecação extensiva.

Para determinar o local de acumulação Proto, o tegumento, hemolinfa e entranhas tratadas com ALA + + 2,2'-DP, na sua anterior quinta instar, foram separados e analisados quanto ao teor de pigmento como no Exemplo II. Numa base de proteína por unidade, cerca de 59% do Proto acumulado foi observado na Hemolinfa, 35 % nas entranhas e 6% no tegumento.

EXEMPLO V

Efeitos de Acumulação de Protoporfirina sobre a

Morte Larval e Alteração de peso do Corpo no Escuro e à Luz

Durante o curso da experiência, foi observado que o tratamento com ALA + 2,2’-DP tinha causado de modo consistente a morte larval tanto no escuro como à luz. Para determinar se a morte larval depende de ALA + 2,2' foi ou não um fenómeno fotodinâmico, larvas T. ni na terceira instar foram pulverizadas quer apenas com dissolvente (controles) quer com 40 mM ALA + 30 mM 2,2'-DP com o pH ajusta33 =

60.658

Case UI-I9IO

do a 3,5 como no Exemplo III. As larvas pulverizadas foram deixadas acumular Proto durante a noite por incubação no escuro durante 17 horas a 28 C. Na manhã seguinte, algumas das larvas foram expostas a 0, 3 ou 6 horas à luz, na estufa, antes da extracção do pigmento como no Exemplo II. Amos tras em duplicado submetidas ao mesmo tratamento de luz fcj ram levadas de novo para o escuro durante 48, 45 θ 42 horas respectivamente, antes de controlar a média da morte larval como no Exemplo V. Avaliação posterior dos danos do tratamento dependente entre as larvas vivas foi feita por determinação do peso do corpo passados três dias de exposição fçs toperiódica na estufa. Os resultados das duas experiências estão indicados na Tabela VII:

Mod. 71 - 10 000 ex - 4-87 = 34 =

60.658

Case UI-I9IO

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= 37 =

60.568

Case UI-1910

O tratamento das larvas com ALA + 2,2’-DP resultou na acumulação de Proto. Um grau significativo da morte de larvas foi também observado nas larvas tratadas ao fim de 17 horas depois do período de incubação de pulverização no escuro, antes de qualquer exposição á luz (Tabela VII: A 2,

B 2). A incubação adicional no escuro resultou em posterior morte larval. Este modo de morte larval é aqui referido como morte larval dependente do escuro. As sobreviveram ao período de morte larval no escuro larvas que com compre emdem uma perda de peso do corpo detectável (Tabelas VII: A 1, 2; B 1, 2). Estes resultados indicam que a acumulação

Proto de ALA + 2,2'-DP-dependente foi acompanhada pela morte larval no escuro.

Mod. 71 10 000 ex - 4-87

Três ou seis horas de eluminação das larvas que tinham acumulado Proto durante as 17 horas de incubação no escuro depois da pulverização resultou na destruição e desaparecimento do Proto acumulado (Tabela VII: A 2-4, B 2-4). A mortalidade de larvas tratadas que foram expostas a 3 ou 6 horas de iluminação antes de serem colocadas de novo no escuro durante 45 © 42 horas, respectivamente, excedeu o nível de mortalidade larval no escuro (Tabela VII: A 2-4, B 2-4). Este modo de morte larval é aqui referido como morte larval dependente da luz. Esta forma de mortalidade apresentou uma correlação significativa com a extensão da iluminação (Tabela VII: coluna 6). Além disso, as larvas tratadas que sobreviveram ao tratamento de luz apresentaram uma inibição significativa em ganho de peso de corpo em comparação com os controles não tratados que foram pulverizados apenas com dissolvente (Tabela VII, coluna 7). A correlação entre a extensão da esposição do pós-tratamento à luz e a inibição no ganho do peso do corpo foi altamente significativa (Tabela VII, coluna 7)·

Em conjunto, estes resultados indicaram que além da morte larval no escuro, a acumulação de Proto resul tou numa mortalidade larval dependente da luz ou fotodinâ= 38 =

60.568

Case UI-1910 mica. Além disso o Proto acumulado desapareceu durante a iluminação, provavelmente como uma consequência de fotodestrição.

EXEMPLO VI

Efeitos Sinérgicos de ALA e 2,2'-DP sobre Acumulação de

Proto e Morte Larval em T. ni

Os efeitos relativos de ALA e 2,2'-DP sobre acumulação de Proto e morte larval na terceira instar T. ni tratada como no Exemplo III e ensaiada como no Exemplo II estão descritos na Tabela VIII: A:

TABELA VIII

Efeitos Sinérgisticos de ALA e 2,2¹-DP que Provocam a

Mod. 71 - 10 000 οχ - 4-8/

	Acumulação Proto e Morte	Larval em T.	ni
				Morte
			Teor de	larval
			Proto	passados
Ex-			(nmol/	3 dias na
peri-		Tratamento	100 mg	estufa
ência		proteina)	(%)
	1	Controle	0	6
A	2	40 mM ALA	2,5	26
	3	30 mM 2,2’-DP	15,5	41
	4	40 mM ALA + 30 mM 2,2’-DP	80,4	90
	1	Controle	0	2
	2	30 mM 2,2’-DP	11	61
B	3	30 mM 2,2'-DP + 10 mM ALA	75	86
	4	30 mM 2,2’-DP + 20 mM ALA	89	76
	5	30 mM 2,2’-DP + 4θ mM ALA	73	92
		= 39 =

60.568

Case UI-1910

TABELA VIII (Continuação)

Efeitos Sinergísticos de ALA e 2,2'-DP que Provocam a

Acumulação Proto e Morte Larval em T, ni

Experi- Tratamento ência

Teor de

Pro to (nmol/

100 mg pro teína)

Morte larval passados dias na estufa (%)

Mod. 71 - 10 000 ex - 4-87

1	Controle		0	7
2	15 mM 2,2'-DP		1	22
C 3	15 mM 2,2'-DP +	10 mM ALA	8	42
4	15 mM 2,2’-DP +	20 mM ALA	34	40
5	15 mM 2,2'-DP +	40 mM ALA	27	43
1	Controle		0,2	5
2	40 mM ALA		1,1	7
D 3	40 mM ALA + 5 mM 2,2'-DP	3,8	4
4	40 mM ALA + 10	mM 2,2'-DP	6,7	18
5	40 mM ALA + 20	mM 2,2'-DP	12,1	34
6	40 mM ALA + 30	mM 2,2'-DP	15,3	71
Correlaçã	io entre 0 teor	de Proto	0,857
e a morte larval
Nível de	signif icância		0,1 %

4o =

60.568

Case UI-1910

O ácido delta—aminolevulínico isolado resultou no modesto nível de acumulação Proto e morte larval (Tabela VIII: A 2) ., 2,2¹-Dipiridil na ausência de ALA adicionado foi mais eficaz que ALA para provocar a acumulação Proto e morte larval (Tabela VIII: A 2, 3); isto é, na ausência de ALA adiciona do, o 2.2'-DP actuou como um indutor de acumulação de Proto. Finalmente, os efeitos sinergísticos de ALA + 2,2'-DP foram manifestados quando os dois produtos químicos foram utilizados conjuntamente no tratamento das larvas T. ni. Sob estas condições a acumulação Proto (8o , 4 nmoles) Sob estas condições a acumulação Proto (tíO,4 nmoles) e morte larval (90%) excedendo largamente a soma de acumulação Proto (2,5 + 15,5 = 18 nmoles) e a morte larval (26 + 41 =67%) provocada pelos tratamentos separados com ALA e 2,2¹-DP (Tabela VIII: A 2-4) .

Mod. 71 - 10 000 οχ - 4-87

EXEMPLO VII

Aumento de Conversão ALA até Protoporfirina por meio de

2,2'-Dipiridilo

Para determinar se além das suas propriedades de indução (Tabela VIII: A 3) a propriedades de aumen to de 2,2'-DP apresentadas como sugeridas pela Tabela VIII; A, os seus efeitos sobre a acumulação de proto e sobre a concomitante morte larval foram examinados na presença de várias quantidades de ALA adicionada. As larvas na sua terceira instar foram pulverizadas como no Exemplo III e ensai adas como no Exemplo II. A concentração alta (30 mM) e a média (15 mM), de 2,2’-DP apresentaram propriedades aumenta das além das suas propriedades indutoras de Proto. As propriedades indutoras de Proto 2,2'—DP foram demonstradas pelo aumento na acumulação de Proto e a morte larval concomitante na ausência de ALA adicionado (Tabela VIII: B 2, C 2); As propriedades melhoradas de 2,2'-DP foram evidenciadas pelo aumento dramático em acumulação Proto e morte larval =

6θ.568

Case UI-1910 nas larvas tratadas com ALA + 2,2'-DP, sobre a para além das tratadas apenas 2,2', como resultado da conversão grandemente melhorada de ALA exógeno até ^rroto (Tabela VIII: B 3-5, C 3-5)· Finalmente a dependência das propriedades de intensificação do 2,2'—DP sobre a concentração de 2,2'-DP está descrito na Tabela VIII: D.

conjunto dos resultados anteriores indica que embora na ausência da adição de ALA, o 2,2'-DP actuou como no indutor de acumulação de Proto,na presença de ALA exógeno e também actuou como um intensificador da conversão de ALA até Proto. 2,2'—DP é assim um exemplo de um indutor-intensificador de biosíntese de tetrapirrole.

Mod. 71 - 10 000 θχ - 4-87

EXEMPLO VIII

Efeito de pH sobre a Acumulação de Proto Dependente de ALA

-2,2'-DP e sobre a Morte Larval em T. ni ácido delta-aminolevulínico é um Zwitterion, isto é, a sua carga líquida é uma função do pH.Visto que o seu ponto isoiónico é a um pH 6,4-7, o mesmo adquire uma carga positiva abaixo do pH 6,47 θ uma carga negativa acima desse pH. Visto que a translocação de Zwitterions nos tecidos biológicos é influenciada pela magnitude da car ga eléctrica líquida sobre o ião, a influência deste parâmetro sobre a translocação de ALA e 2,2'-DP nas larvas tratadas foi examinada. A extensão de translocação de ALA e 2,2'-DP nas larvas T. ni foi inferida a partir da extensão da acumulação de Proto e morte larval.

As larvas T. ni na terceira instar foram pulverizadas com soluções de 30 mM 2,2'—DP + 40 mM ALA ao pH 3,5 θ 5,5 (ALA carregado positivamente) e ao pH 7,5 (ALA carregado negativamente) de acordo com o processo do Exemplo III. Como é usual os controles foram pulverizados com apenas o dissolvente. Passadas as 17 horas do período

6θ.568

Case UI-I9IO

71- 10 000 ex - 4-87 pos-pulverização de incubação no escuro, algumas das larvas foram extraídas para determinação Proto de acordo com o processo do Exemplo II, enquanto as amostras em duplicado foram expostas à luz na estufa. A morte das larvas foi determinada

5 10	passados 3 Tabela IX: Ef ei to	dias na estufa, de pH sobre ALA	Os resultados estão TABELA IX + 2,2'-DP Acumulação m larvas T. ni	indicados na Dependente
de Prc	to e
				Teor de
				Proto Morte larval
15	Ex-			(nmol/ pas	sados 3 dias
	peri- ψ	Tratamento		100 mg na	e s tufa
	ência			proteína)	(%)
	A 1	Controle		0,1	3
	2	Tratado, pH	3,5	85,0	81
20	3	Tratado, pH	5,5	73,8	85
	4	Tratado, pH	7,5	108,5	80
	B 1	Controle		0,0	1
	2	Tratado, pH	3,5	96,7	75
25	3	Tratado, pH	5,5	110,4	82
	4	Tratado, pH	7,5	73,7	85
	Coeficiente de correlação	0,007a	0,540b
	Nível de	significância
30	Correlação entre 0 pl	e 0	teor Proto em larva	s tratadas

com ALA + 2,2'

Correlação entre o pH e a morte larval em larvas tratadas com ALA + 2,2'—DP.

= 93 =

6ο.568

Case UI-1910

Como está representado na Tabela IX, quantidades consideráveis de Proto foram formadas pelas larvas tratadas a todos os valores de pH. A morte larval foi também substancial a todos os valores de pH. Entre o pH 3,5 θ 7,5» nem a acumulação Proto nem a morte lerval mostraram estar correlacionadas com o pH. Em conjunto estes resultados indicam que a translocação de ALA + 2,2'-DP em larvas T. ni e subsequente conversão de ALA em Proto pelas larvas não es tava estrictamente dependente do pH na gama de 3,5 a 7,5·

000 θχ - 4-87

EXEMPLO IX

Dependência da Morte Larvar em T. ni Tratadas com

ALA - 2,2¹-DP sobre a Idade das Larvas

A dependência da morte larval T. ni tratadas com ALA + 2,2'-DP sobre a idade das larvas tratadas foi investigada. As larvas T. ni, na primeira, segunda, terceira e quarta instar foram tratadas com 40 m>l ALA + 30 mM 2,2 -DP ao pH 3,5 como no Exemplo III. Depois de um período de incubação no escuro de 17 horas, as larvas tratadas e de controle foram expostas à luz na estufa. A morte larval foi avaliada passados 3 dias na estufa. Os resultados estão indicados na Tabela X:

=

6θ.568

Case UI-I9IO

Mjd. 71- 10 000 ex - 4-87

TABELA X

Dependência da Susceptibilidade de T. ni para o Tratamento

ALA + 2,2'-DP sobre o Instar das Larvas Tratadas

Experi ência	Instar*	Morte larval sobre a para dos controles depois de 3 na estufa (%)	além dias
A	1	1	76
	2	2	42
	3	3	43
	1	1	64
B	2	2	63
	3	3	27
	1	2	75
C	2	3	28
	3	4	11
	1	2	70
D	2	3	23
	3	4	11
Coeficiente de	correlação	-0,897
entre 0	grau da	instar e
a morte	larval
Nível de	signif	icância	0,1%

^al, 2, 3 referem-se à primeira, segunda e terceira instar, respectivamente

A Tabela X mostra que a susceptibilidade de T. ni para o tratamento ALA - 2,2'-DP foi inversamente proporcional ao grau do instar, sendo as larvas do instar mais jovens as = 45 = /

è

6θ.568

Case UI-I9IO mais susceptíveis e sendo as da quarta instar as menos susceptíveis .

Para determinar se a susceptíbilidade ao tratamento ALA + 2,2'-DP depende da fase de desenvolvimento dentro de uma instar particular, larvas T. ni nas fases inicial, média e final da terceira e quarta instares foram tratadas com ALA + 2,2'-DP como acima. Os resultados são mostrados na Tabela XI:

TABELA XI

Dependência da Susceptibilidade de T. ni para ALA - 2,2'-DP sobre o Estágio de Desenvolvimento dentro de uma Instar Particular

- 10 000 ex - 4-87

Ex- periência	4	Estágio de instar	Grau de susceptibilidade	Morte larval sobre e para além dos contro les depois de 3 dias na estufa
Antes de normaliza ção (%)	Depois de normalização (%)
	1	Terceiro médio	1	47	52
A	2	Terceiro primitivo	2	60	66
	3	Terceiro tardio	3	91	100
	1	Terceiro médiò	1	47	92
B	2	Terceiro primitivo	2	39	76
	3	Terceiro tardio	3	51	100
	1	Terceiro médio	1	21	57
C	2	Terceiro primitivo	2	18	49
	3	Terceiro tardio	3	27	100
	1	Terceiro médio	1	26	5h
D	2	Terceiro primitivo	2	35	73
	3	Terceiro tardio	3	48	100
Correi	aça	0 entre 0 estágio de	desenvolvi	mento 0,739
dentro	de	uma instar e a morte	larval
Nível	de	significância		1%

= 46 =

6o.568

Case UI-1910 instar particular, seguido pelos estágios

Os resultados sugerem que, para uma sus ceptível, o último estagio foi o médio.

primitivo e próximas as larvas culo da epiderme), mento mai s sugere que quanto

Isto por sua vez estiverem da apólise (separação do mais susceptíveis as com ALA - 2,2'-DP. Os estágios mesmas são ao mai s cutítratamedio, primitivo e tardio de cada instar particular foram assinalados de 1 ou 3, o estágio estatísticas

II II com um grau estágio menos susceptível e mais susceptível. Para eliminar as diferenças indicando ”1 o instars (ver morte dentro me smo valor entre as terceira e quarta valores de percentagem de foram normalizados para o / Jd. 71 - 10 000 ex - 4-87 em susceptibilidade Tabela X), todos os de cada experiência 0 último foi escolhido como 100, e representou a percentagem de morte para o último estágio dentro de cada (Tabela XI, última coluna). Deste modo tornou-se possível testar a relação entre a morte larval e primitivos, médio e tardio da instar, instar os estágios indendentemente do grau da instar. Como está indicado na Tabela XI, esta relaÇãO méd i foi altamente o da significativa com os estágios primitivo e instar a ser menos susceptíveis ao tratamento com + 2,2'-DP que o estágio tardio da instar. Este período de máxima susceptibilidade corresponde ao período em que as cutícula para a

ALA larvas são susceptibilidade corresponde imóveis e a nova está sendo activamente sintetizada por instar seguinte baixo da cutícula velha

EXEMPLO

Relação entre as espécies Larvais,

ALA +

2,2' -DP

Proto-acumulação Dependente, e Morte Larval

Para determinar se ALA + 2,2'-DP-acumulação Proto dependente e morte larval foram fenómenos gerais comuns a todas as larvas de insectos ou específicos para determinadas espécies particulares de insectos, foi realizado um estudo da resposta de várias espécies larvais ao trata= 47 =

60.568

Case UI-1910

Mod. 71 - 10 000 ΘΧ - 4-87 mento com ALA + 2,2-DP.

Colónias do perfurador do milho Heliothis zea (Boddie) (Lepidoptera: Noctuidae) foram desenvolvidas a partir de ovos proporcionados pelo Dr. Gilbert Waldbauer,no Departamento de Entomologia da Universidade de Illinois em Urbana Champaign. As larvas foram alimentadas com a mesma dieta que as T. ni acima.

As larvas de H. Zea foram pulverizadas como no Exemplo III; todavia, ao contrários das T. ni, as larvas H. zea são canibalísticas e têm de ser tratadas de maneira diferente. Vinte e cinco larvas com 1 cm de comprimento (mis tura da terceira e quarta instar) foram colocadas individualmente com um cubo de dieta em compartimentos individuais (3 x 5 x 1,5 cm) de um tabuleiro de plástico com 25 células (Bioserve, Inc., Frenchtown, NJ 08825). Para confinar as larvas aos seus compartimentos individuais, o tabuleriro plástico foi coberto com uma placa de vidro. A placa de vidro foi removida antes da pulverização e foi colocada de novo imediatamente depois, Ã pulverização foi como se descreveu para T. ni. Os recipientes pulverizados foram cobertos com uma placa de vidro antes de ser colocadas no escuro a 25° durante 17 horas.

Os resultados são apresentados na Tabela XII:

TABELA XII

Dependência de ALA + 2,2'-DP - Acumulação Proto Dependente

e Morte Larval sobre as Espécies	Larvais
Experiência	Tratamento de H. zea	Teor de Proto (nmol/100 mg proteina)	Morte Larval dos 3	em H.zea passa dias na estufa í%)
	Controle	0		0
A	Tratado	2,5		7
	alteração	2,5		7
	Controle	0		0
B	Tratado			33
	alteração	i,2*		33
« 48 =

6ο. 568

Case UI-1910

Λ

- 10 000 βχ - 4-87

Os tratamentos com ALA 40 mM + 30 mM 2,2'-DP que resultaram em quantidades maciças de acumulação e em morte significativa larval em T. ni (Tabelas VI-OX), resultaram num baixo nível de acumulação Proto em H. Zea. A morte larval foi também muito mais baixa que em T. ni (Tabela XII). Não se sabe presentemente se a proporção mais baixa de acumulação Proto e a concomitante proporção mais baixa de morte de lar vas H. Zea tratadas com ALA - 2,2'-DP em comparação com T. ni é devida a(a) diferenças na transposição dos produtos químicos aplicados aos tecidos internos do insecto ou (b) a algumas outras diferenças fioquímicas básicas na regulação da passagem porfirina—heme entre as duas espécies. Nos T. ni tratados com ALA + 2,2'—DP, a maior parte de proto acumulou-se na hemolinfa. Isto por seu turno indicou uma transposição adequada de ALA e 2,2'-DP para os locais pretendidos. Se estes produtos químicos se transpõem do mesmo para os tecidos interiormente de H. zea não é conhecido.

cas.

EXEMPLO XI

Eficácia do Tratamento com ALA + 2,2¹-DP na Ausência de um Período de Incubação no Escuro Pos-Pulverização

Larvas de T. ni na segunda instar foram pulverizadas com ALA + 2,2'—DP e foram submetidas a um período de incubação no escuro de 17 horas antes da exposição á luz na estufa (pulverização no escuro). Larvas semelhan— = 49 =

60.568

Case UI-I9IO tes foram pulverizadas com ALA + 2,2'-DP na estufa, no início da fase de luz do fotoperíodo 14 horas de luz-10 horas de escuro (pulverização à luz). Os resultados de quatro experiências estão indicados na Tabela XIII:

TABELA XIII

Comparação da Eficácia de ALA + 2,2'-DP Pulverização com

Luz e Pulverização no Escuro em T. ni

- 10 000 ex - 4-87

Esperiência	Tratamento	Morte Larval passados 3 dias na
estufa
	DSP Controle	21
A	DSP 20 mM ALA + 15 mM 2,2'-DP	90
	DSP de alteração	69
	LSP Controle	25
B	LSP 20 mM ALA + 15 mM 2,2'-DP	94
	LSP de alteração	6q
	DSP controle	14
C	DSP 40 mM ALA + 30 mM 2,2'-DP	93
	DSP de alteração	79
	LSP controle	5
D	LSP 40 mM ALA + 30 mM 2,2’-DP	83
	LSP de alteração	78

em que DSP = pulverização no escuro e LSP = pulverização à luz. As pulverizações á luz foram tão eficazes a pro vocar a morte larval como as pulverizações no escuro. Estes resultados foram por sua vez muito semelhantes aos dos tratamentos herbicidas fotodinâmicos no escuro e à luz apresen tados na patente norte-americana Numero de Serie 895.529.

=

6ο.568

Case UI-1910 e»

< Vo

EXEMPLO XII

1,10-Fenantrolina como um Inibidor/lntensificador

Para determinar se os produtos químicos que apresentaram propriedades indutoras ou intensificadoras apresentariam propriedades semelhantes em insectos, foi examinado o efeito sobre acumulação em T. ni de vários intensificadores e indutores de acumulação de tetrapirrole em plnatas conhecidas. As larvas T. ni na terceira instar foram pulverizadas com uma solução de 40 mM ALA + 30 mM 1,10-PA como descrito no Exemplo III para ALA + 2,2¹-DP. As larvas de controle e as larvas tratadas foram trabalhadas e analisadas como descrito no Exemplo II. Os resultados destas experiências são apresentados na Tabela XIV:

- 10 000 οχ - 4-87

TABELA XIV

Efeitos Sinérgicos de ALA + 1,10-PA ao Provar Acumulação

Proto e Zn-Proto e a Morte Larval em T. ni

Experiência		Tratamento	nMoles/100 mg proteína	Morte Larval passa dos 3 dias na estufa (%)
Teor de Pro to	Teor de Zn-Pro to
	1	Controle	0,19	0	0
	2	40 mM ALA	3,18	0	16,8
A	3	30 mM 1,10-PA	35,26	4,45	69,6
	4	40 mM ALA + 30 mM 1,10-PA	151,92	3,75	93
	1	Controle	0	0	6,1
	2	40 mM ALA	2,08	0	5,3
B	3	30 mM 1,10-PA	18,55	1,08	74,7
	4	40 mM ALA + 30 mM 1,10-PA	227,77	6,15	93,3
Coef icien	te de correlação 0,78	0,862b
Níve 1	de	signif icância	5%	1%

a

Correlação entre morte larval e acumulação Proto

Correlação entre morte larval e acumulação Zn-Proto.

= 51 =

6o.568

Case UI-I9IO

Mod. 71 - 10 000 ex - 4-87

Como foi observado com 2,2'-DP (Tabela VIII), o 1,10-PA apresentou propriedades muito fortes de indução-intensificação de tetrapirrole, como é mortrado pelo muito forte sinergismo em acumulação Proto que foi observada quando ALA e 1,10—PA foram utilizados conjuntamente.

Além disso, para a acumulação maciça de Proto, o tratamento com 1,10—PA na presença ou na ausência de ALA, resultou na formação de quantidades mais pequenas de Zn-Proto. A correlação entre a acumulação Zn-Proto e a morte larval foi altamente significativa. Idto, por sua vez, sugeriu que a formação de Zn-Proto estava de algum modo fortemente relacionada com a morte larval.

Outras experiências foram designadas para determinar se o Zn-Proto foi de facto formado enzimaticamente ou não. Por exemplo, a adição de 1,10—PA a Proto dissolvidos em acetona a 80% não resultou na formação de Zn-Proto depois de 17 horas de incubação. Noutras experiências, larvas T. ni vivas e mortas foram tratadas com 40 mM ALA + + 30 mM 1,10-PA exactamente como descrito na Tabela XIV. As larvas vivas foram mortas por fervura em água a 100°C durante 5 minutos antes da pulverização. Os resultados estão apresentados na Tabela XV:

TABELA XV

Efeito do tratamento com ALA + 1,10-PA sobre Zn-Proto e Acumulação do Proto em Larvas T. ni vivas contra as mortas

Experi- Tratamento ência nMoles/100 mg proteína

Teor de Teor de Proto Zn-Proto

Morte Larval passados 3 dias na estufa (%)

Controle

Larvas mortas tratadas com

A 40 mM ALA + mM 1,10-PA O O = 52 =

6ο.568

Case UI-1910

TABELA XV (Continuação)

- 10 000 οχ · 4-87

Efeito do tratamento com ALA + 1,10-PA sobre Zn-Proto e
Acumulação do Proto em	Larvas T.	ni vivas	contra	as mortas I
		nMoles/100 mg	Morte	Larval pas-
Ex-		proteína	sado s	3 dias
peri- 4	Tratamento	Teor de	Teor de	na	estufa
ênc ia		Proto	Zn—Pro to		(%)
3	Larvas vivas tratadas com 90 mM ALA + 30 mM 1,10-PA	292,7	3,25		93,9
1	Controle	0,11	0		0
2	Larvas mortas tratadas com
B	90 mM ALA + 30 mM 1,10-PA	0	0		—
3	Larvas vivas tratadas com 40 mM ALA +
	30 mM 1,10-PA	251,23	9,93	100

Como está apresentado, apenas insectos vivos com metabolismos activos foram capazes de acumular Proto e Zn-Proto. 0 conjunto destes resultados indica fortemente que a formação de Proto e Zn-Proto pelos insectos tratados foi uma consequência da actividade enzimática.

EXEMPLO XIII

1,10-PA na Dieta

Sob certas condições de campo é por vezes preferível administrar um insecticida como um engodo em vez de como uma pulverização. As seguintes experiências foram portanto concebidas para demonstrar a eficácia de insecticidas porfíricos quando administrados como engodo.

60.568

Case UI-I9IO

Numa experiência, cubos de alimento de i.eio Waldbauer foram pulverizados a uma velocidade total de 1,5 ml por 10 ml de dieta sólida. Um terço do volume foi pul verizado ao mesmo tempo. Os cubos de dieta foram deixados secar, depois o processo foi repetido mais duas vezes. As larvas não tratadas foram então colocadas com as tratadas com dieta no escuro durante 17 horas. Alternativamente, as larvas, juntamente com a sua dieta, foram pulverizadas como no Exemplo III. Os resultados estão apresentados na Tabela XVI:

TABELA XVI

Efeito da Adição de ALA + 1,10-PA á Dieta na Morte

Larval de T. ni

000 οχ - 4-87

Morte Larval dentro + Tra tamento dos primeiros nutos à luz

miNorte Larval passados 3 dias na estufa (%)

1	Con trole	0	2,2
2	Dieta pulverizada apenas com 40 mM ALA + 30 mM 1,10-PA	62,5	95,9
3	Dieta e insecto pulverizados com 40 mM ALA + 30 mM 1,10-PA	91,2	96,7

Como apresentado, a aplicação dos produtos químicos apenas através do alimento foi tão eficaz em provocar a morte larval como na pulverização tanto nos insectos como na sua dieta. Além disso observou—se que a maior parte da morte larval em insectos que ingeriram a dieta tratada ocorreu durante os primeiros 8 minutos de exposição à luz, com substancial nú = 54 =

60.568

Case UI-I9IO mero de mortes ocorrendo durante os primeiros 2 minutos a luz.

Noutra experiência, o ALA e 1,10-PA foram incorporados na dieta a uma velocidade de 16 a 12 mM respectivamente. A dieta foi misturada com o ALA e 1,10-PA num misturador a 37°C durante 5 minutos. As larvas foram colocadas na dieta engodada durante 17 horas no escuro antes de se rem expostas à luz. Os resultados estão apresentados na Tabela VII:

TABELAXVII

Efeito da Adição de ALA + 1,1O-PA à Dieta na Morte

Larval de T. ni

Mod 71-10 000 cx - 4-87

+	Tratamento	Morte Larval den tro dos primeiros 8 minutos à luz W	Morte Larval passados 3 dias na estufa (%)
1	Control	0	4
2	Dieta contendo 16 mM ALA + 12 mM 1,1O-PA	91,9	100

Noutra experiência, a dieta foi aquecida num forno de convecção e o ALA e 1,10—PA foram adicionados à dieta aquecida a 57°θ· A mistura foi então amalgamada durante 45 segundos num Sorvai Omnimixer (Omni Co. International, CT 06706). Os resultados são apresentados na Tabela XVIII:

= 55 =

60.568

Case UI-I9IO

TABELA XVIII

Efeito da Adição de ALA + 1,10-PA à Dieta na Morte

Larval de T. ni

Morte Larval den

Tratamento tro dos primeiros minutos à luz (%)

Morte Larval passados 3 dias na estufa (<£)

1	Con trole	0	1^,5
2	Dieta contendo 16 mM
	ALA	0	5,2
3	Dieta contendo 12 mM
	1,ÍO-PA	0	4o, 4
4	Dieta contendo 16 mM
	ALA + 12 mM 1,10-PA	94,4	94,4

- 10 000 ex - 4-87

EXEMPLO XIV

Administração de

Indutores e/ou Intensificadores Alternativos meio de Waldbauer foi aquecido num forno de convecção a 57-65°C e combinado com 4 mM de ALA e 3 mM de um dos vários compostos de teste. A mistura foi então combinada durante 2 minutos num Omnimixer Sorvai.

Larvas T. ni foram colocadas com a dieta tratada no escuro durante 17 horas como acima. A morte das larvas foi determinada ao fim do período de escuridão (antes da exposição à luz) e depois de três dias na estufa.

Um controle que consiste em dieta em branco (não tratada) foi passado por cada composto testado.

Os resultados são apresentados na Tabela

XIX = 56 =

6o.568

Case UI-1910

M jd. 71 - 10 000 ex - 4-87

X H X <

m <

ce

Φ G X!

O <d ra a

Φ ♦H Q ra q m o > -H a ra c

G φ a a <n Φ G o Ό ra o tC <H Ή

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CD Φ G O -P □ Ό

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6θ.568

Case UI-I9IO

Mod. 71 - 10 000 βχ - 4-87

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6o.568

Case UI-1910

- 10 000 ex - 4-87

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60.568

Case UI-I9IO

Experiências repetidas com 4 mM ALA apenas deram a morte larval passados três dias na estufa que consistentemente variou entre 0 e 5%· Assim, os resultados acima mostram claramente que 1,10-fenantrolina; 4,7-dimetil-1,lOfenantrolina; 4-metil-l,10-fenantrolina; 5-nitro-1,10-fenantrolina; 5-metil-l,10-fenantrolina;

5,6-dimetil-1,10-fenantrolina; 4,7-difeni1-1,10-fenantrolina; 3,4,7,8-tetrametil-l,10-fenantrolina; 2,2'-ditio~ bis(piridina N-óxido); 4,4¹-dimetil-2,2¹-dipiridilo; fenil 2-piridil cetoxima; e 2,2':6¹,2-terpiridina funcionam como indutores e/ou intensificadores de ALA e são eficazes como insecticidas activos à luz.

- 10 000 cx - 4-87

EXEMPLO XV

Efeito de ALA e 1,10-Fenantrolina sobre Larvas de

Mamestra brassicae efeito de insecticida ingerido que compreende ALA e 1,10-fenantrolina foi testado sobre as larvas de Mame s tr a brassicae , uma peste importante ern vegetais crucíferos.

A dieta foi preparada num vaso de aço inoxidável utilizando um misturador de cozinha Kenwood como segue:

1. I53O ml de água desmineralizada, 504 g de milho triturado (também máximo de partícula 1 mm), 135 g de levedura de cerveja, e 135 g de germen de trigo foram combinados à temperatura ambiente.

2. 5,4 g de parahidroximetilbenzoato foram diluídos em 12 ml de etanol a 90°C e todos os 12 ml foram adicionados à mistura da fase (1) acima.

3. I53O ml de água foram combinados com 72 g de agar e 6 g de ácido benzóico e a mistura foi levada até á ebulição. A mistura foi deixada arrefecer até =

6θ.568

Case UI-1910

Mod. 71 - 10 000 οχ - 4-87

C, depois foi adicionado abd à mistura resultante a partir da fase (2) acima.

4. A mistura resultante da fase (3) acima foi deixada arrefecer até 4o°C e foram adicionados 18 g de ácido ascórbico como um retardador de oxidação.

5. A mistura resultante foi homogeneizada e armazenada para utilização como dieta padrão.

A dieta tratada foi preparada dissolvendo uma quantidade apropriada(s) de ingrediente(s) activo(s) em etanol e adicionando 1 ml desta solução a 9 ml de água desmineralizada. Todos os 10 ml da solução etanol:água (1:9 v/v) resultante contendo a quantidade(s) apropriada(s) de ingrediente(s) activo(s) foram então adicionados à mistura resultante da fase (3) acima, antes da adição de ácido ascórbico .

Colónias de M, brassicae foram criadas em massa sobre dieta padrão (não tratada), λ medica que as lar vas se aproximavam da terceira instar, porções de 20 larvas cada foram desviadas da dieta padrão para várias dietas de teste contendo ingrediente(s) activo(s). Os discos foram cobertos com folha de alumínio e as larvas foram deixadas alimentar-se sobre a dieta de teste ad libitum durante um período no escuro de 16 horas. Depois a folha foi removida e as larvas foram expostas a luz artificial (lâmpada de vapor de Mercúrio de 400 watts a 50 cm). Os controles foram alimentados com dieta não tratada. Os resultados estão indicados na Tabela XX:

= 61 =

60.568

Case UI-I9IO

TABELA XX

Efeito de ALA e 1,10-Fenantrolina sobre Larvas de

M. brassicae

Depois da exposição

Antes da exposi à luz durante ção a luz 2 minutos

16 mM ALA + 12 mM
1,10-fenantrolina	0	100
2 mM ALA + 1,5 niM
1,10-fenantrolina	0	100
Controle	0	0

Mjd. 71 - 10 000 ex - 4-87 efeito da exposição à luz é dramático: ime diatamente depois da exposição,o6 insectos tratados começaram a torcer—se e morreram. 1 00% d os insectos tratados estavam mortos num espaço de dois minutos. Esta experiência foi repetida três vezes com resultados idênticos.

EXEMPLO XVI

Efeito de ALA e 6—Aminonicotinamida sobre Blatella germanica adultos efeito de insecticida ingerido compreenden do ALA e 2-aminonicotinamida foi testado sobre a peste doméstica Blatella germanica (barata germânica).

A dieta padrão compreendeu uma mistura de grãos triturados (milho, trigo, arroz e farelo), açúcar de cana, proteína de soja, ovos, extracto de erva doce, alimento completo para ratos de laboratório, e água desmineralizada.

alimento tratado foi preparado dissolvendo = 62 =

60.568

Case UI-1910

- 10 000 θχ 4-87 quantidade apropriada de ingredientes activo(s) em etanol, combinando uma parte desta solução de etanol com 19 partes de água, e adicionando 1 ml de solução resultante a 5 g de alimento. O alimento foi deixado secar antes de ser utilizado .

Colónias de B. germanica foram desenvolvidas em massa sobre dieta padrão (não tratada) até à fase adulta. Num princípio de tarde em Novembro, em Marselha, França, dez machos adultos foram colocados em cada um dos discos de Petrie juntamente com 5 g de uma das dietas de teste. Os dis cos foram deixados assentar sobre o topo da bancada, receben do a luz do dia), durante o resto do dia (cerca de 3,5 horas). Os discos foram depois deixados assentar sob condições ambientes normais (luz e temperatura ambiente) durante quatro dias para simular as condições domésticas normais. Os mesmos foram expostos à escuridão natural durante, cada noite, 13 horas e à luz ambiente durante cerca de 11 horas cada dia. Um quarto disco de controles foi alimentado com dieta padrão (não tratada). As contagens de mortalidade foram conduzidas em cada tarde . Os resultados estão indicados na Tabela XXI:

TABELA XXI

Efeito de ALA e 6-Amiiiomicotinato sobre B, germanica Adultas

Ingrediente activo	Concentração (mg/g de alimento)	% de Mortalidade
Dias de 1 2	Espo si ção 3	4
Controle	0	0 0	0	0
ALA	1	0 0	0	0
6-Aminonicotinato	1	0 0	0	0
ALA + 6-Aminonicotinato	1+1	50 70	90	100

= 63 =

60.568

Case UI-1910

- 10 000 θχ - 4-87

Estes resultados mostram claramente que o

6-aminonicotinato é um indutor e/ou intensificador de ALA, e as composições insecticidas do presente invento podem ser eficazes contra insectos sob condições normais no interior de luz e escuridão ambientes.

A indução química das larvas de insecto para Proto e Zn-Proto acumulados que provocam a morte larval no escuro e à luz do dia proporciona novas composições e métodos insecticidas. Propõe-se a expressão insecticidas por fíricos para referir este fenómeno. λ luz o Proto e Zn-Proto acumulados desaparecem dos tecidos dos insectos dentro de horas. Esta aproximação é semelhante à concepção dos herbicidas fotodinâmicos apresentada na patente norte-americana No. de Série 895.529. Todavia, o dano nas plantas tratadas com os referidos herbicidas ocorreu apenas à luz do dia e foi apenas de natureza fotodinâmica. Além disso, os tetrapirroles que mais danificaram foram Mg-tetrapirroles que pertenciam ao caminho biosintético Chi.

Crê-se que o ramo Mg do caminho biosintético de tetrapirrole que conduz à biosíntese de Chi não é funcional em insectos. Como consequência a biosíntese de ir termediários contendo Mg do caminho biosintético Chi não pode ser detectada em T♦ ni tratadas com ALA ou com ALA + + 2,2¹-DP. Portanto, os pigmentos de clorofila que dão às larvas a sua cor verde amarelado são muito provavelmente derivados de pigmentos de clorofila da dieta (Tabelas II, III, IV). Todos os insectos, contudo, devem conter citrocromas que actuam como veículos de electrões em fosforilação oxidativa. Crê-se presentemente que a metade heme de citocromas é formada a partir de Proto que é sintetizada por sua vez a partir de ALA através do caminho biosintético de porfirina / Flowchart A acima/. A acumulação dependente de ALA de Proto por Ti. ni é completamente compatível com esta hipótese.

Ao contrário do que foi observado em plan30

6o.568

Case UI-I9IO tas ni é acompanhada Á luz, a acumulação no escuro de Proto em T. pela morte larval no escuro (Tabela Vil), ção maciça de Proto não parece ser obrigatória, todavia, para a ocorrência de dano fotodinâmico (Tabelas VII, XIII). Esta conclusão é baseada em duas observações: (a) à luz, a acumulação maciça de Proto não é observada, consequência do estado uniforme de foto-destruição do Proto biosintetizado (Tabela Vil), e (b) pulverizações à luz (que não envolvem um período de incubação pós-pulverização durante o qual o Proto se pode acumular) foram tão uma forniaprovavelmente como uma ef i- 10 000 ex - 4-87

T3

O cazes em provocar a morte larval como as pulverizações escuro que não incluíam um tal período de incubação no curo pós-pulverização antes da exposição à luz Em todos os casos estes no essário tado s dades para a ocorrência e uma formação de iniciar (Tabela resultados sugerem que o que é de dano fotodinâmico em insectos tra

XIII) ne ces estado uniforme de pequenas quantide Proto em proporções suficientemente em cadeia de danificação grandes para dús tira as reacções de radical liUm relação a indos maiores problemas dos insecticidas é a alarmante velocidade à qual os em insectos desenvolvem resistência contra os insecticidas.Isto é normalmente uma consequência de mutações que podem aumendesintoxicação dos insectos ou alteração das propriedades liofílicas da toxana, tar os mecanismos de a sua permeabilidade consideravelmente o reduzindo assim de membrana tempo de vida

Isto por útil de sua vez encurta insecticidas reseu valor comercial. Crêvisto que a modulação química do caminho porfirinaacordo com o presente invento parece envolver mais que uma fase metabólica, será mais difícil para os insectos desenvolver resistência contra insecticidas porfíricos. Mesmo se alguns insectos tiverm êxito em desenvolver contra a centemente introduzidos e reduz o

-se que acumulação de tetrapirrolepor desenvolvimento de meios para rapidamente destruirem os tetra-pirroles acumulados, isto =

6ο.568

Case UI-1910

- 10 000 θχ - 4-87 não é suficiente para proteger os insectos mutados contra o dano fotodinâmico à luz. Como é sugerido pelas Tabelas VII e XIII, á luz o Proto é mais provavelmente destruído quase tão rapidamente como é formado; ainda, tal acumulação mínima é suficiente para provocar o dano fotodinâmico extensivo às larvas. Ainda, uma mutação que bloqueia o Proto e a biosíntese de citocroma em conjunto seriam analogamente mais letais.

Outros exemplos de composições e aplicações dentro do espírito e âmbito do presente invento tornar-se-ão evidentes para os entendidos nesta técnica tendo em consideração o que antecede e consequentemente apenas tais limitações como aparecem nas reivindicações anexas deverão ser colocadas ao mesmo.

depósito do primeiro pedido para o invento acima descrito foi efectuado nos Estados Unidos da América em 13 de Janeiro de 19θθ sob o N? 144 883.

6ο.568

Case UI-I9IO

000 ΘΧ - 4-87

Claims (23)

1. -REIVINDICAÇÕES1- - Processo para a preparação de uma com posição insecticida, caracterizado por se incorporar uma quantidade eficaz como insecticida de um ou mais compostos que consistem em ácido delta-aminolevulínico, indutores de ácido delta-aminolevulínico, ou intensificadores da conversão de ácido delta-aminolevulínico em tetrapirroles.
2. 2^ — Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se incorporar ácido delta-aminolevulínico .
3. 3- - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por compreender um ou mais indutores de ácido delta-aminolevulínico.
4. 4- - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por se incorporar um ou mais in tensificadores de conversão de ácido delta-aminolevulínico em tetrapirroles.
5. 5- - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a quantidade dos referidos compostos ser suficiente para fornecer de 113,4 a 907,2 g (0,25 a 2 libras) de ácido delta-aminolevulí nico por 4.046,84 m“ (1 acre) e/ou de 45,6 a 680,85 g (0,1 a 1,5 libras) de indutor ou intensificador por 4,0,46,84 m (1 acre).
6. 6* — Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se incorporar um ou mais dos seguintes: veículo(s), dissolvente(s), tampão(ões), agente(s) de humedecimento, agente(s) de disper são, agente(s) de eliminação de espuma, emético(s) agente(s) contra cheiros, penetrante(s), agente(s) tensioactivo(s), emulsionante(s), adjuvante(s), herbicida(s) e um ou mais de outros insecticida(s).

   = 67 =

   6θ.568

   Case UI-I9IO
7. 7- - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por os referidos compostos estarem contidos numa solução que tem uma concentração de cerca de 2 a cerca de 50 mM de ácido delta-aminolevulínico e/ou de cerca de 0,1 a cerca de 50 mM de indutor ou intensificador.
8. 8- - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por os referidos compostos estarem contidos numa preparação a ser ingerida por insectos e a quanti dade dos referidos compostos ser suficiente para fornecer de cerca de 10 ng a cerca de 5 ⁿS de ácido delta-aminolevulínico por mg de peso do corpo do insecto e/ou de cerca de 1 ng a cerca de 5 microgramas de indutor ou intensificador por mg de peso do corpo do insecto.
9. 9- — Processo de acordo com qualquer uma

   71 - 10 000 ΟΧ - 4-87 das reivindicações anteriores, caracterizado por a referida composição compreender um oy mais compostos que consistem em ácido delta-aminolevulínico; 2,2'-dipiridilo; 1,10-fenantrolina; 4,7-dimetil-l, 10-f enantrolina; 4-metil-l, 10-f enantrolj.

   na; 5—nitro-1

   5,6-dimetil—1 na; 5—cloro-1 trolina; 2 -dipiridil dina.
10. 10—fenantrolina;

    10-fenantrolina;

    10-fenantrolina;

    -ditiobis(piridina N-óxido); 4,4 fenil 2-piridil cetoxima, e

    5-metil-l,10-fenan tro1ina;

    4,7-difenil-1,10-fenantroli3,4,7,8-tetra-metil-l,10fenan '-dimetil-2,2'2,2' :6' ,2-terpiri—

    10* - Processo para a insecticida de acordo com as preparação de uma reivindicações antereferida composição como insecticida de compo si ção riores, caracterizado por se formular a de modo a incluir uma quantidade eficaz um ou mais compostos que consistem em ácido delta-aminolevulínico, indutores de ácido delta-aminolevulínico, ou intensi ficadores da conversão de ácido delta-aminolevulínico em te trapirroles
11. 11- - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por se utilizar ácido delta-aminolevu68 =

    6θ.568

    Case UI-1910

    1ínico.
12. 12? - Processo de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por compreender a utilização de ou mais indutores de ácido delta-aminolevulínico.

    um ção 10, 11 ou 12 intensificadores em tetrapirroles
13. 13- - Processo de caracterizado por da conversão de
14. 14? - Proc e s so acordo com a reivindicase utilizar um ou mais ácido delta-aminolevulínico de acordo com qualquer uma

    10 000 οχ - 4-87 ó

    das reivindicações anteriores 10 quantidade dos referidos cer cerca de 113,4 a 907 ta-aminolevulínico por 4

    45,6 a 680,85 g (0,l a 1 dor por 4.046,84 m

    13, caracterizado por a da s compostos 2 g (0,25 046,84

    5 libras) (1 acre) ser suficiente para forne a 2 libras) de ácido del(1 acre) e/ou de cerca de de indutor ou intensifica

    Processo de incorporar um ou mais dos te(s), tampão(ões), de dispersão, agente(s) t ivo(s), mais de

    Ção 15, cluído s a cerca ca de 0, acordo com qualquer uma caracterizado por se veículo(s), dissolvenagente(s) emético(s),
15. 15^? reivindicações anteriores 10 a 14, seguintes:

    agente(s) de humedecimento, agente(s) de eliminação de espuma, penetrante(s), agente(s) tensioacadjuvante(s), herbicida(s) e um ou contra cheiros, emulsionante(s), outros insecticida(s)
16. 16? - Proce sso de acordo com a reivindicacaracterizado por os referidos compostos numa solução que tem uma concentração de de 50 mH de ácido delta-aniinolevulínico e/ou de cer1 a cerca de 50 mM de indutor ou intensificador.

    estarem incerca de 2
17. 17? - Processo de acordo com a reivindica— caracterizado por os referidos numa preparação a ser ingerida por tidade dos referidos compostos ser suficiente para fornecer cerca de 10 ng a cerca de 5 ng de ácido delta-aminolevulíniÇão 15, cluído s compostos estarem ininsectos e a quan = 69 =

    60.568

    Case UI-I9IO

    71 - 10 000 ex - 4-87 co por mg de peso de corpo de insecto e/ou de cerca de 1 ng a cerca de 5 microgramas de indutor ou intensificador por mg de peso do corpo do insecto.
18. 18? - Processo para induzir a acumulação de tetrapirroles em insectos vivos, caracterizado por se pôr em contacto os referidos insectos com uma composição obtida pelo processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
19. 19- - Processo para exterminar insectos, caracterizado por se pôr em contacto os referidos insectos com uma composição obtida pelo processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 9.
20. 20? - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por os referidos insectos tratados serem expostos à escuridão durante cerca de 1 a 8 horas e depois expostos à luz.
21. 21? - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por a referida luz compreender a luz natural do dia.
22. 22? - Processo de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado por a referida exposição à luz ser efectuada durante um período de cerca de 1 a 14 dias.
23. 23?

    -Processo de acordo com as reivindicações 10, 18 ou 19, ção de um ou mais compostos que nolevulínico; 2,2' til-1,10-fenantrolina;

    -1,10-fenantrolina;

    a utilizacaracterizado por compreender consistem em acido delta—ami

    -dipiridilo; 1,10-fenantrolina

    4-metil-l,10-fenantrolina

    5-metil-1,10-fenantrolina; 5

    4,7-dime5-nitro6-dimetil35

    6o . 568

    Case UI-1910

    -1,10-fenantrolina; 2,2'-ditiobis(piridina N-óxido); 9,4' -dimetil-2,2'-dipiridil; fenil 2-piridil cetoxima, e 2,2' :6',2-terpiridina.