NO890138L - Porfyrin-insekticider. - Google Patents

Description

Den oppfinnelsen som er beskrevet heri ble gjort i løpet

av arbeid understøttet av gaver fra U.S. Department of Agriculture, the National Science Foundation, the University of Illinois, the Illinois Agricultural Experiment Station, og John P. Trebellas Photobiotechnology Research Endowment.

Denne oppfinnelsen vedrører insekticidpreprater og fremgangsmåter, og mere spesielt insekticidpreparater og fremgangsmåter for å heve det endogene tetrapyrrolnivået hos insekter.

Kopending USSN søknad 895.529 beskriver herbicidpreparater som omfatter en eller flere forbindelser utvalgt fra gruppen bestående av delta-aminolevulinsyre, induksjonsmidler for delta-aminolevulinsyre hos planter, midler for å øke omdanningen av delta-aminolevulinsyre til fotodynamiske tetrapyrroler hos planter, og inhibitorer for omdanning av divinyltetrapyrroler til monovinyltetrapyrroler hos planter; fremgangsmåter for å indusere akkumuleringen av fotodynamiske tetrapyrroler hos levende planter ved bruk av nevnte preparater, og fremgangsmåter for å drepe planter ved bruk av nevnte preparater. Nevnte preparater er imidlertid ikke tidligere blitt kjent eller beskrevet som insekticider.

De følgende begrepene som anvendes ovenfor og nedenfor, har følgende betydning dersom det motsatte ikke er uttalt spesielt: ALA = delta-aminolevulinsyre; Chl = klorofyll; Chlid = klorofyllid; Koprogen = koproporfyrinogen; DP = dipyridyl; DV = divinyl; Mg-Proto = Mg-protoporfyrin IX; MV = monovinyl; PA = fenantrolin; PBG = porfobilinogen; PChl = protoklorofyll;

PChlid = protoklorofyllid; Feo = feofytin; Feobid = feoforbid; Proto = protoporfyrin IX; Protogen = protoporfyrinogen; Uro=uroporfyrin oktametylester; og Urogen = uroporfyrinogen. Begrepene Proto, Mg-Proto, PChlid, Chlid, Chl, Feo, og Feobid viser til ansamlinger som er laget av MV og/eller DV komponenter dersom det ikke uttrykkelig er merket med en MV eller DV betegnelse.

Delta-aminolevulinsyre, en aminosyre med fem karbonatomer, finnes i de fleste levende dyr og planteceller og er den primære forløperen for tetrapyrrol. Den er tilgjengelig fra flere kjemiske spesialfirma, f.eks. Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. I planter er ALA forløper for klorofyll via en 6-grenet vei som omfatter protoporfyrinogen, protoporfyrin, Mg-protoporfyrin, metallporfyriner med lengere bølgelengde, protoklorofyll, og klorofyllid [se Fig. 1 i kopending USSN 895.529]. Hos insekter omdannes ALA til protoheme (jern (II) protoporfyrin IX) via en vei som omfatter porfobilinogen, uroporfyrinogen, koproporfyrinogen, protoporfyrinogen, protoporfyrin IX, og jern (II) protoporfyrin IX (dvs. protoheme):

[Se også Granick, S. og D. Mauzerall, i Metabolic Pathwavs. Vol. 2 (D.M. Greenberg, ed.) (Academic Press, NY, 1961), pp. 525-616]. Protoheme og hemene a og c er prostetiske grupper av alle cytokromene i plante- og dyreceller.

Det er nå blitt oppdaget at insekter kan drepes ved administrering av et preparat som omfatter en eller flere forbindelser utvalgt fra gruppen bestående av ALA, induksjonsmidler for ALA hos insekter, og midler til å øke ALA omdanningen til tetrapyrroler hos insekt.

Spesielt er det nå blitt oppdaget at levende insekter kan induseres ved eksponering for eksogen ALA til å akkumulere kunstig høye mengder av tetrapyrrol-mellomprodukter som ligger høyere enn det nivået som normalt finnes hos slike insekter, og at slike induserte kunstig høye nivåer er toksiske for insektene. Dette er overraskende da insekter normalt syntetiserer cytokromer bare ved en hastighet som er tilstrekkelig til å opprettholde vekst og vedlikehold, og man antok ikke tidligere at denne hastigheten ville være tilstrekkelig til å tillate akkumulering av letale mengder av slike tetrapyrrol-mellomprodukter.

Mens den eksakte mekanismen for toksisiteten ikke er

kjent, synes det at de akkumulerte tetrapyrrolene kan virke på en av to måter. I lyset antas det at de akkumulerte tetrapyrrolene vil fotosensitere dannelsen av singlettoksygen, som er et svært sterkt oksydasjonsmiddel. Singlettoksygenet oksyderer raskt lipoprotein-komponentene i insektenes cellemembraner, og setter således i gang en høyst destruktiv kjedereaksjon med frie radikaler, som kan sammenfattes som følger (hv = et lysfoton;<1>Tet = tetrapyrrol i singlettens grunntilstand;<3>Tet<*>;= tetrapyrrol i triplettens eksiterte tilstand; 3C-2 = oksygen i triplettens grunntilstand;<1>C>2* = oksygen i singlettens eksiterte tilstand; UMLP = umettede membranlipoproteiner):

6) repetisjon av trinnene (4) og (5) inntil mesteparten av UMLP er oksydert.

Fotosensitering ved injeserte tetrapyrroler er beskrevet i dyrisk og humant vev (se, f.eks., Ellefson, R.D., Mayo Clinic Proe. 57:454-458 (1982); Christensen, T., T. Sandquist, K. Feren, H. Waksvik og J. Moan, Br. J. Cancer 48:35-43 (1983); Hopf, F.R., og D.G. Whitten, i The Porphyrins. Vol. 1. Dolphin, D., ed. (Academic Press, New York, 1978), pp. 161-195; Sandeberg, S., I. Romslo, G. Hovding og R. Bjørndal, Acta Dermatovener (Stockholm) Suppl. 100:75-80 (1982) ; Latham, P.S. , og J.R. Bloomer, Photochem. Photobiol. 37:553-557 (1983); Bickers, D.R., R. Dixit og H. Mukhtar, Biochem. Biophys. Res. Comm. 108:1032-1039 (1982)], men dette fenomenet med ALA-avhengig tetrapyrrolakkumulering er ikke tidligere blitt demonstrert hos insekter, og heller ikke er det tidligere blitt anvendt til å avlive uønskede insektarter.

I mørke synes det at akkumulerte tetrapyrroler virker gjennom en annen mekanisme, og resulterer i økt nivå av Zn-protoporfyrin. Zn-Proto er ikke et naturlig metabolisk mellomprodukt i porfyrinheme-reaksjonsmekanismen. Dets forekomst i levende eller og vev betyr vanligvis en forgiftet porfyrinheme-metabolisme [se, f.eks. Lamolla, A.A., og T. Yamane, Science 186:936-938 (1974)]. De fleste ferrochelataser (de enzymene som innfører toverdig jern i Proto for å danne heme) kan innføre Zn istedenfor jern i Proto for å gi Zn-Proto, spesielt under ugunstige reaksjonsbetingelser [Marks, G.S., i Heme and Chlorophyll (Van Nostrand, 1969), pp. 146-147]. Mens den eksakte mekanismen ikke er kjent og søkerne ikke ønsker å være bundet av en spesiell teroi, antas det for tiden at akkumuleringen av Zn-Proto som et resultat av insekticidmetoden ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan forårsakes ved ødeleggelse av ferrochelatasesystemet, hvilket fører til at enzymet innfører zink istendenfor toverdig jern i noe av Proto. Til slutt betyr dette at zink istendenfor toverdig jern finnes

i noen av de prostetiske gruppene i det absolutt nødvendige respiratoriske enzymet cytokrom c oksydase. Som en konsekvens kan de cytokrom c oksydasemolekylene som inneholder Zn-Proto istedenfor heme, ikke holde tett mot giftige frie radikaler såsom oksygen superoksyder og hydroksyd frie radikaler som vanligvis dannes under Krebs sitronsyre-syklusen. [Halliwell,

B. , Whafs New in Plant Physiology 15:21-24 (1984)]. Under disse betingelsene kan de destruktive frie radikalene frigjøres i det biologiske membranmiljøet og bidra til den frie radikal-avhengige ødeleggelsen som resulterer i insektdød.

Det er dessuten blitt oppdaget at i tillegg til eksponering for eksogen ALA, vil også eksponering av levende insekter for induksjonsmidler for ALA resultere i akkumulering av massive mengder av toksiske tetrapyrroler i insektvevet. Ved "induksjonsmiddel for ALA" eller "induksjonsmiddel" menes en forbindelse som, når den anvendes på insekter, stimulerer insektet til å produsere en høyere enn normal mengde av endogen ALA, som da har den samme virkningen som eksogen ALA beskrevet ovenfor. Insekticidpreparatene ifølge denne oppfinnelsen kan således omfatte et eller flere induksjonsmidler for ALA i tillegg til, eller istedenfor, ALA selv. Ikke-begrensende eksempler på induksjonsmidler er 2,2'-dipyridyl; 1,10-fenantrolin; 4,7-dimetyl-1,10-fenantrolin; 4-metyl-l,10-fenantrolin; 5-nitro-1,10-fenantrolin; 5-metyl-l,10-fenantrolin; 5,6-dimetyl-l,10-fenantrolin; 4,7-difenyl-l,10-fenantrolin; 5-klor-l,10-fenantrolin; 3,4,7,8-tetrametyl-l,10-fenantrolin; 2,2'-ditiobis-(pyridin N-oksyd); 4,4'-dimetyl-2,2'-dipyridyl; fenyl 2-pyridylketoksim; og 2 ,2':6' ,2''-terpyridin.

Det er dessuten blitt oppdaget at visse forbindelser virker som enhancere for ALA omdanningen til tetrapyrroler hos insekter. Ved "enhancer for ALA" eller "enhancer" menes en forbindelse som, når den anvendes på insekter, øker evnen for det behandlede insektet til å omdanne eksogen eller endogen ALA til insekticide tetrapyrroler. Insekticidpreparatene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan således også omfatte en eller flere enhancere for ALA i tillegg til, eller istedenfor, eksogen ALA eller induksjonsmidler for ALA. Ikke-begrensende eksempler på egnede enhancere er 2,2'-dipyridyl; 1,10-fenantrolin; 4,7-dimetyl-l,10-fenantrolin; 4-metyl-l,10-fenantrolin; 5-nitro-1,10-fenantrolin; 5-metyl-l,10-fenantrolin; 5,6-dimetyl-1,10-fenantrolin; 4,7-difenyl-1,10-fenantrolin; 5-klor-l,10-fenantrolin; 3,4,7,8-tetrametyl-l,10-fenantrolin; 2,2'-ditiobis-(pyridin N-oksyd); 4,4'-dimetyl-2,2'-dipyridyl; fenyl 2-pyridylketoksim; og 2,2':6',2''-terpyridin. Visse forbindelser som virker som induksjonsmidler i et preparat kan virke som enhancere i et annet preparat eller i andre konsentrasjoner. Alternativt kan visse forbindelser (f.eks. 2,2'-dipyridyl; 1,10-fenantrolin; 4,7-dimetyl-l,10-fenantrolin; 4-metyl-l,10-fenantrolin ; 5-nitro-l,10-fenantrolin; 5-metyl-l,10-fenantrolin; 5,6-dimetyl-l,10-fenantrolin;4,7-difenyl-l,10-fenantrolin; 5-klor-1,10-fenantrolin; 3,4,7,8-tetrametyl-l,10-fenantrolin; 2,2'-ditiobis(pyridin N-oksyd); 4,4'-dimetyl-2,2'-dipyridyl; fenyl 2-pyridylketoksim; og 2,2':6,2''-terpyridin) samtidig fungere som induksjonsmidler og enhancere.

Insekticidpreparatene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan også omfatte kombinasjoner av to eller flere forbindelser, valgt fra gruppen bestående av ALA, induksjonsmidler og enhancere, f.eks. ALA + et eller flere induksjonsmidler, ALA + en eller flere enhancere, ALA + et eller flere induksjonsmidler + en eller flere enhancee, ett eller flere induksjonsmidler +

en eller flere enhancere: etc.

Preparatet kan også inneholde en eller flere av de følgende: passende bærere [f.eks. kolloidalt magnesiumaluminiumsilikat, pimpsten, talkum eller kombinasjoner derav]; løsningsmidler [f.eks. vann, 0,45 aceton:0,45 etanol:0,l Tween 80:9 vann (v/v/v/v), 0,45 aceton:0,45 metanol:0,l Tween 80:9 vann (v/v/v/v), 0,1-1% Tween 80 i vann (v/v), 0,9 polyetylenglykol (PEG):0,1 Tween 80:9 vann (v/v/v), 0,1-0,7 PEG:0,2-0,8 metanol:0,1 Tween 80:9 vann (v/v/v/v), 0,9 metanol:0,1 Tween 80:9 vann (v/v/v), 0,45 aceton:0,45 etanol:0,2 Tween 80:9 etylenglykol:18 vann (v/v/v/v), eller en eller flere av de følgende: benzen, toluen, xylen, parafin, 2-metoksyetanol, propylenglykol, dietylenglykol, dietylenglykoldietyleter, formamid, metylformamid, cykloheksanon, isoforon]; buffere [f.eks. sitronsyre]; fuktemidler [f.eks. natrium N-metyl-N-oleoyltaurat, en alkylfenoksypolyoksyetylenetanol, natriumalfa-olefinsulfonat, natriumisopropylnaftalensulfonat, polyoksyetylert vegetabilsk olje]; dispergeringsmidler [f.eks. natriumlignin-sulfonat, natriumsaltet av et naftalensulfonsyre-formaldehyd-kondensat, hydroksyetylcellulose]; antiskummidler [f.eks. silikon]; brekkmidler [f.eks. natriumtripolyfosfat, tetrakalium-pyrofosfat, arekotin, apomorfin, kobbersulfat]; illeluktende midler [f.eks. pyridin]; penetrerende midler; overflateaktive midler; emulgeringsmidler; hjelpestoffer; herbicider; og et eller flere andre kjente insekticider.

Preparatet kan formuleres på hvilken som helst måte som vanligvis anvendes for insekticidpreparater, f.eks. som en bestanddel i insektforet for indre systemisk anvendelse, eller som en løsning, suspensjon, emulsjon, flytbart konsentrat, emulgerbart konsentrat, gel, pasta, skum, krem, aerosol, fuktbart pulver, støv, dispergerbare granuler og lignende for utvendig lokal anvendelse, ifølge fremgangsmåter som er kjent for spesialister på området. Formuleringen har til hensikt å levere en passende mengde åv en eller flere aktive bestanddeler til målinsektene. For lokal anvendelse er preparatet fortrinnsvis en løsning, suspensjon, emulsjon, aerosol, flytbart eller emulgerbart konsentrat, eller fuktbart pulver. Naturligvis må formuleringen for lokal anvendelse være slik at de aktive bestanddelene trenger igjennom insektvevet og translbkerer til de stedene der tetrapyrrolsyntesen foregår.

Hvor den aktive bestanddelen kombineres med en eller flere aktive eller inerte fobindelser eller preparater nevnt ovenfor, kan kombinasjonen utføres ved omgivende temperatur, eller ved temperaturer over og under omgivende temperatur, forutsatt at stabiliteten for det endelige preparatet ikke påvirkes. Hvor peparatet omatter ALA, holdes temperaturen fortrinnsvis mellom omlag 4°C og omlag 75"C. Når insekticidpreparatet ifølge den foreliggende oppfinnelsen er i vandig løsning, kan pH være ved det isoélektriske punktet for de aktive bestanddelene, eller over eller under det isoélektriske punktet, forutsatt at stabiliteten og løseligheten for den aktive bestanddelen ikke blir så alvorlig påvirket at det kan influere på effektiviteten. Når insektpreparatet omfatter ALA, justeres imidlertid pH fortrinnsvis slik at den er mellom omlag pH 3 og omlag pH 8.

Hvor to eller flere komponenter blir kombinert for å danne insektpreparatene, kombineres de fortrinnsvis under betingelser som sikrer jevn konsentrasjon gjennom hele blandingen. Dette gjøres passende ved teknikker såsom omrøring, rysting, miksing, blanding etc.

I de tilfellene hvor den aktive bestanddelen er den eneste komponenten i insekticidpreparatet ifølge den foreliggende oppfinnelsen, må den aktive bestanddelen fremstilles forsiktig for å oppnå jevn anvendelse. I tilfeller med en fast aktiv bestanddel, gjøres dette passende ved oppdeling til et fint pulver. Når en slik eneste komponent er i form av en væske, kan den passende atomiseres til en fin tåke eller yr ved egnede temperaturer ved teknikker som er vel kjent for spesialister på området. Når de diettetiske eller topiske preparatene lages i oppløsning, kan de passende omfatte konsentrasjoner på fra omlag 2 til omlag 50 mM ALA, og fra omlag 0,1 til omlag 50 mM induksjonsmiddel eller enhancer.

Ifølge fremgangsmåtene i den foreliggende oppfinnelsen, kontaktes insektene som skal avlives med et insekticidpreparat som omfatter ALA og/eller induksjonsmidler for ALA og/eller enhancere for omdanning av ALA til tetrapyrroler. Insekticidpreparatene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes lokalt, f.eks. som støv, bløtgjøringsmiddel, dyppemiddel, spray, yr eller tåke, i en mengde som er tilstrekkelig til å oppnå dødlig innvendig nivå for tetrapyrroler. Mengden av insekticidpreparat som skal anvendes lokalt vil variere, avhengig av de spesielle aktive bestanddlene som velges, men vanligvis vil de være en mengde som er tilstrekkelig til å levere fra omlag 0,28-2,2 kg ALA pr. hektar /og eller fra omlag 0,1 til 1,5 kg induksjonsmiddel eller enhancer pr. hektar. Midler til å bestemme optimale anvendelsesmengder er innenfor rekkevidde for spesialister på området.

Alternativt kan insekticidpreparatene ifølge foreliggende oppfinnelse administreres via dietten, tilsatt til åte eller annet for eller drikke som skal svelges av insektene som skal avlives. Atter vil mengden av insekticidpreparat som skal administreres variere, avhengig av de spesielle aktive bestanddelene som velges, men vanligvis vil de være en mengde som er tilstrekkelig til å levere fra omlag 10 ng til omlag 5 mikrogram ALA pr. mg legemsvekt, og/eller fra omlag 1 ng til omlag 5 mikrogram av et induksjonsmiddel eller enhancer pr. mg legemsvekt.

Dersom det er ønskelig å avlive insektet via den mørke mekanismen, kan insektet behandles, og deretter skjermes fra eksponering for lys, for å tillate maksimal akkumulering av tetrapyrrol. Insektet kan skjermes på en hvilken som helst passende måte, som ved å dekke grunnen eller området hvor insektet finnes med tøy, mørkt papir eller folie. Under feltbetingelser er den ideelle fremgangsmåten til å sørge for en periode med mørk inkubasjon å påføre insekticidpreparatet i kveldingen eller om natten, på et tidpunkt som velges for å tillate insektene å hvile i mørke i minst en time. Det skal forstås at for å lette akkumuleringen av tetrapyrrol, behøver ikke mørke å være totalt fravær av lys, men heller i det vesentlige fravær av lys med bølgelengde på fra 380 til 700 nm. Fortrinnsvis holdes insektene i mørke i fra omlag 1 til omlag 20 timer. 1 til 8 timer foretrekkes spesielt. Naturligvis vil mange insekter naturlig foretrekke mørke omgivelser, og man behøver ikke å foreta ekstra foranstaltninger for å skjerme dem fra lys etter kontakt med insektpreparatet.

Dersom insektene skal avlives via lysmekanismen, blir insektpreparatet påført eller administrert, og insektene blir samtidig eller deretter eksponert for omlag 5 ft. candles (54 cd/m<2>) eller mer med lys ved bølgelengder på omlag 380 til omlag 700 nm. Lyset kan leveres fra en hvilken som helst passende kilde, f.eks. en glødelampe, metallhalogenidlampe, sollampe eller en kjølig hvit eller overlysfluorescerende pære.

I marken er den foretrukne lyskilden naturligvis sollys.

Insektene eksponeres for lyset i et tidsrom som er tilstrekkelig til å oksydere mesteparten av de umettede membran-lipoproteinene; en periode på fra omlag 2 min. til omlag 3 døgn blir foretrukket.

Insektene som skal behandles ved hjelp av den foreliggende oppfinnelsen kan passende være i egg-, larve- eller voksent stadium. Hos larvene kan instarstadiet påvirke mottageligheten for behandling; larver i senere instarstadier er relativt mere mottagelige for behandling enn larver i de tidligere eller midlere instarstadiene. Det kan derfor være nødvendig å variere dosenivåene i samsvar med utviklingsstadiet for majoriteten av den larvepopulasjonen som er målgruppen.

Insekticid-aktiviteten indikeres ved forandringer i hudfargen, etterfulgt av uttørring og død.

En ytterligere forståelse av denne oppfinnelsen kan oppnås fra de følgende ikke-begrensende eksemplene. Som anvendt heri ovenfor og nedenfor uten at det er uttrykkelig oppgitt til motsatte, skal alle temperaturer og temperaturområder referere til centigradsystemet, og uttrykkene omgivende og romtemperatur refererer til omalg 2 0-2 5'C. Uttrykket prosent eller (%) betyr vekt-%, og uttrykket mol betyr grammol. "Signifikansnivå" refererer til sannsynligheten for at for en populasjon for hvilken korrelasjonkoeffisienten r er lik 0, kan man ta en prøve med størrelse n, for hvilken korrelasjonskoeffisienten er lik eller overskrider den beregnede verdien for r som rapporteres for den gitte prøven. Forkortelsen "n.s." står for "ikke signifikant".

Eksempel I

Pigmenter i dietten som T. ni larver ble oppdrettet på.

Egg fra Trichoplusia ni (Hubner) (kålmark, den mest utbredte insektplagen i grønnsakavlinger i USA) ble skaffet fra Ms. Paula Peters i USDA Insect Biological Control Laboratory, Department of Entomology ved universitetet i Missouri i Columbia. Larvene, puppene og voksne møll ble oppdrettet i Percival Model 1-60 inkubatorer (Percival Mfg. Co., Boone, Iowa 50036) ved 25°C og 75% relativ fuktighet under et daglig regime på 14 timer lys og 10 timer mørke. Larvene ble holdt på

kunstig diett ifølge metodene beskrevet av Waldbauer, G.P.,

R.W. Cohoen og S. Friedman, Great Lakes Entomol. (1984) 17:114. Tyve-tretti larver ble oppdrettet i individuelle 1/4 liters pappbeholdere med klart plastlokk, kjøpt fra Lily-Tulip, Inc.

(Augusta, GA). For å unngå genetiske forandringer i kolonien, ble ville kolleksjoner tilsatt til kulturen hver sommer. For å minimalisere mikrobesykdommer ble eggene og puppene fra hver generasjon overflatesterilisert.

Siden T. ni larvene oppdrettet på en diett som inneholdt gulaktig-grønt alfalfa-mel, fikk en gulaktig-grønn farge, mens T. ni larver oppdrettet på en diett uten alfalfa-mel, visuelt manglet pigmentering, ble det endogene pigmentinnholdet i dietten undersøkt som en foreløpig forholdsregel for å studere induksjonen av tetrapyrroler ved kjemisk behandling.

Den gulaktig-grønne fargen på dietten som inneholdt alfalfa-mel, var typisk for den gulaktig-grønne fargen på Feo-er (Chl-er som har mistet sitt Mg atom) og på feobider (Chlider som har mistet sitt Mg atom). Dette ble bekreftet ved 77°K spektrofluorimetrisk analyse. Grammengder av dietten ble homogenisert i 6 ml aceton:0,1 N NH4OH (9:1 v/v), og det resulterende vandige acetonekstraktet som inneholdt forskjellige pigmenter, ble befridd for lipoproteiner og celleavfall ved sentrifugering ved 39000 g i 10 min. ved 0°C. Apolare pigmenter såsom Chl-er og Feo-er ble fjernet fra den vandige aceton-løsningen ved ekstraksjon med heksan. De mere polare di- og monokarboksylpigmentene såsom Proto, Mg-Proto, PChlider,

Chlider og Feo-er ble tilbake i den heksanekstraherte vandige acetonfraksjonen. En liten alikvot av heksanekstraktet som inneholdt klorofyllpigmentene ble tørket under nitrogengass, og residuet ble løst igjen i 80% aceton for den spektrofluorimetriske bestemmelsen av mengdene av Chl-er og Feo-er ifølge metoden til Bazzaz, M.B. og CA. Rebeiz, Photochem, Photobiol.

(1979) 30:709.

Fluorescensspektra ble opptatt på et fullstendig korrigert fotontellende spektrofluorimeter Model SLM 8000DS som beskrevet i Rebeiz, CA., A. Montazer-Zouhoor, H.J. Hopen og S.M. Wu, Enzyme Microb. Technol. (1984) 6:390. Eksitasjonen var ved 400, 420 og 440 nm. Absorpsjonsspektra ble opptatt ved en spalte-bredde på 2 nm på et dobbelbølgelengde-spektrofotometer av Aminco modell DW-2 (Travenol Laboratories Inc., Silver Springs, MD 20910). Kontrollene var MV Feo a og b fremstilt fra henholdsvis MV Chl a og b, som beskrevet i Bazzaz, M.B. og CA. Rebeiz, Photochem. Photobiol. (1979) 30:709. Resultatene er vist i Tabell I:

Suksessive eksitasjoner av eterglasset med det

apolare ekstraktet mellom 400 og 450 nm bragte for dagen to Chl-lignende emisjonsbånd med maksima ved henholdsvis 655 og 666-667 nm (Tabell I: Cl, 2). Soret-eksitasjonsspekteret av det 655 nm emisjonsbåndet hadde splittede Soret-eksitajonsmaksima ved 440 nm (stort maksimum) og ved 450 nm (mindre maksimm)

(Tabell I: C 1). Disse emisjons- og eksitajonsmaksima var identiske med de for autentisk MV Feo b (E44OE450F656) (Tabell 1: A). I denne sammenhengen refererer "E44O450" til de splittede Soret-eksitasjonsmaksima for MV Feo b ved 77"K i eter, mens "F656" refererer til fluorescens-emisjonsmaksimum for MV Feo b ved 656 nm. Fluorescensbåndet (E44OE450F656) ble derfor identifisert som MV Feo b. Små mengder MV CHL b var også tilstede.

Soret-eksitasjonsspekteret for 666 nm emisjonsbåndet viste et enkelt eksitajonsmaksimum ved 414 nm, og var identisk med autentisk MV Feo a (Tabell I: B, C 2). Denne (E414F666) fluorescerende forbindelsen ble derfor identifisert som MV Feo a.

De spektrofluorimetriske egenskapene for den polare fraksjonen var svært like med egenskapene for den apolare fraksjonen (Tabell I:C 1-4). Forbindelsene (E44OE450F655) og (E414F666-667) var altfor polare til å gå med heksan, og ble i det vandige acetonresiduet. De ble identifisert med henholdsvis MV Feobid b og MV Feobid a. Feobider har de samme elektroniske spektroskopiske egenskapene som Feo-er, men er mere polare fordi de har mistet den langkjedede alkoholen i stilling 7 i makrocyklen. Det er blitt dokumentert at graden av esterifise-ring i stillingene 6 og 7 i makrocyklen har ingen virkning på de elektroniske absorpsjons- og fluorescensegenskapene for tetrapyrroler (se f.eks. Belanger, F.C. og CA. Rebeiz, J.

Biol. Chem. (1982) 257:1360).

Mengdene av Proto, Mg-Protoer, PChlider, Chlider og Feobider ble bestemt ved spektrofluorimetri på alikvoter av den polare heksanekstraherte acetonfraksjonen ifølge metodene til Rebeiz, CA., J.R. Mattheis, B.B. Smith, CC Rebeiz og D.F. Dayton, Arch. Biochem. Biophys. (1975) 171:549 og Bazzaz, M.B.

og CA. Rebeiz, Photochem. Photobiol. (1979) 30:709. Resultatene er vist i Tabell II:

hvori "Diett + A.M." = diett som inneholder alfalfa-mel, og "Diett - A.M." = diett som mangler alfalfa-mel.

Mengdene av MV Feobid a og b i den alfalfa-mel-holdige dietten er rapportert i Tabell II: A. Små mengder av Chlid a og b var også tilstede (Tabell II: A). Dietten som manglet alfalfa-mel inneholdt bare spormengder av klorofyllpigmenter (Tabell II: B).

Eksempel II

Pigmenter i T. ni.

T. ni larver i sitt femte instar oppdrettet på dietter som innehold eller som manglet alfalfa-mel, ble inngående homogenisert enten med morter og pistill eller med en Brinkman modell PT 10/35 homogenisator (Brinkman Instrument Co., Westury, NY 11590) i aceton: 0,1 N NH4OH (9:1 v/v) med en mengde på 6 ml løsningsmiddel pr. gram vev. Polare og upolare pigmenter ble ekstrahert som i Eksempel I. Resultatene er vist i Tabell III: hvori "T. ni + A.M. = larver oppdrettet på diett som inneholdt alfalfa-mel, og "T. ni - A.M." = larver oppdrettet på diett uten alfalfa-mel.

I motsetning til dietten med alfalfa-mel som inneholdt betydelige mengder av MV Feo a og b i tillegg til MV Feobid a og b, inneholdt T. ni små mengder Feo-er, hvis nivå syntes å variere fra kohort til kohort (Tabell III: A; se også Tabell IV nedenfor). Pigmentene som larvene akkumulerte var mere polare, og besto hovedsakelig av MV feoforbid a og MV feoforbid b (Tabell I: E; Tabell III: A). På den annen side inneholdt larver som var oppdrettet på den dietten som ikke hadde alfalfa-mel, bare spormengder av klorofyllpigmenter (Tabell

III: B).

For å bestemme stedet for pigmentakkumuleringen, ble huden, hemolymfen og innvollene fra femte instar T. ni larver oppdrettet på den alfalfa-melholdige dietten, separert og analysert på pigmentinnhold. Hemolymfe ble oppsamlet fra 9 til 10 larver foret på en diett uten alfalfa, og fra 9 til 10 larver foret på en diett med alfalfa, ved forsiktig å stikke gjennom huden over hjertet i et bakre sigment av larvens buk. Den ekstruderte hemolymfen ble oppsamlet i en sprøyte nr. 2 2 og ble øyeblikkelig sprøytet over i kald aceton: 0,1 N NH40H (9:1 v/v). Etter oppsamling av hemolymfen, ble larvene nedfryst i flytende nitrogen, og deretter delvis opptint før oppsplitting av huden på langs med en skarp skalpell. Den opptinte huden (dvs. insektets integument) ble deretter forsiktig skrellet vekk fra de fremdeles frosne innvollene. Huden ble plassert i iskaldt destillert vann for ytterligere vasking, mens innvollene ble plassert i iskald aceton: 0,1 N NH40H (9:1 v/v). Huden ble skyllet tre ganger med destillert vann, deretter ble den plassert i kald aceton: 0,1 N NH40H (9:1 v/v) for homogeniser-ing. Hemolymfen, innvollene og integumentfraksjonene ble homogenisert i kald aceton: 0,1 N NH40H (9:1 v/v) med morter og pistill og ekstrahert ifølge fremgangsmåten i Eksempel I. Resultatene er vist i Tabell IV:

Som rapportert i Tabell IV ble mesteparten av pigmentet funnet i innvollene. Små mengder pigment ble også oppdaget i integumentet og i hemolymfen.

Eksempel III

Akkumulering av protoporfyrin IX i T. ni behandlet med delta-aminolevulinsyre og 2 , 2 '- dipyridyl.

En blokk av for (2,5 x 1,5 x 1 cm) og 20 til 30 T. ni larver i sitt tredje instar ble plassert i en 1/4 liters papirbeholder (9 cm i diameter), og beholderen ble påsprøytet med 0,35 ml av 40 mM ALA + 30 mM 2,2'-DP i aceton: etylalkohol: Tween 80: vann (0,45:0,45:0,1:9 v/v/v/v/), justert til pH 3,5. Løsningen ble påført som en fin dusj med en gjennomsnittlig dråpediameter på omlag 50 pm. Dette var likeverdig med en sprøytehastighet på 40 gallons pr. acre (373 liter pr. hektar). Behandlingene ble gjentatt fire ganger. De påsprøytede beholderne ble dekket med et gjennomskinnelig plastlokk, og de behandlede larvene ble deretter inkubert over natten (17 timer, vanligvis fra klokken 16 på en spesiell dag til klokken 09 den neste dag) i mørke ved 28"C før ekstraksjon som i Eksempel II. Resultatene er vist i Tabell V:

Selv om pigmentprofilen fra kontrollarvene, som ble sprøytet med utelukkende løsningsmiddel, var lik den som ble beskrevet i Tabellene I: E og III: A, var pigmentprofilen for de ALA + 2,2'-DP-behandlede larvene drastisk forskjellig. Fluoroescensen for MV feobid a og b i den heksan-ekstraherte vandige acetonfraksjonen ble fullstendig formørket av fluorescens med et emisjonsmaksimum ved romtemperatur på 631 nm, og et Soret eksitasjonsmaksimum ved 405 nm. Denne fluorescensprofilen var identisk med fluorescensprofilen for autentisk DV Proto oppløst i heksanekstrahert vandig aceton [Fig. 1: (a) heksanekstrahert acetonekstrakt fra kontrollarver; emisjonstoppen ved 674 nm er emisjonstoppen for MV Feo a; (b) ekstrakt av behandlede larver; (c) autentisk DV Proto i heksanekstrahert aceton]. Bekreftelse av karakteren av det akkumulerte pigmentet ble oppnådd ved å sammenligne dets absorpsjonsspektrum i 80% aceton med absorpsjonsspektrene for uroporfyrinoktametylester, koproporfyrin, DV Proto og DV Mg-Proto (Phorphyrin Products, Logan, UT). Som vist i Tabell V viste det 80% acetonekstraktet av T. ni. et absorpsjonsspektrum ved romteperatur som var identisk med autentisk DV Proto. Etter overføring til eter viste pigmentet den samme fluorescensemisjonen og Soret eksitasjonsmaksima ved 77'K (henholdsvis 629 og 409 nm) som autentisk Proto. Etter innføring av Mg i pigmentet (som beskrevet i Belanger, F.C. og CA. Reibeiz, J. Biol. Chem.

(1982) 257:1360), viste det den samme fluorescensemisjonen og eksitasjonsmaksima i eter ved 77°K som autentisk DV Mg-Proto (Tabell V). Tilsammen viste disse resultatene at behandling av T. ni larver med ALA og 2,2'-DP resulterte i biosyntese og akkumulering av DV Proto hos larvene.

Eksempel IV

Insekticide virkninger av ALA + 2^'- DP- behandlingen.

For å bestemme forholdene mellom ALA + 2,2'-DP-behandlingen, pigmentakkumuleringen og insekticidvirkningene, ble T. ni larver i tredje instar påsprøytet med 40 mM ALA + 30 mM 2,2'-DP ved en pH på 3,5, og ble inkubert over natten (17 timer) i mørke ved 28°C som i Eksempel III. Neste morgen ble et sett med tre replikater plassert i drivhuset ved 25'C under en fotoperiode med 14 timer lys, 10timer mørke, for å observere larvedøden. Det fjerde replikatet utgjorde kontrollen (påsprøytet med bare løsningsmiddel); kontrollen og behandlede replikater ble ekstrahert for kvantitative pigmentbestemmelser som i Eksempel II. Larvedøden ble bestemt ved daglig sammen-ligning av overlevede larver av de behandlede og kontroll-insektene. Protein ble bestemt ved å suspendere det aceton-uløselige residuet som var utfelt ved sentrifugering av vevs-homogenatet i destillert vann med en vevsutgnider fullstendig av glass. Totale proteiner ble bestemt med biurett på en liten aliquot av suspensjonen etter det lipidering ifølge metoden til Rebeiz, CA. og P.A. Castelf ranco, Plant Physiol. (1965) 40:281. Resultatene av flere eksperimenter er gjengitt i Tabell VI: hvori "larvedød" betyr prosent død ved begynnelsen av den fjerde fotoperioden, dvs. etter 3 dager i drivhuset, og "A forandring" betyr forskjellen i pigmentinnhold mellom de ALA + 2,2'-DP-behandlede larvene og kontrollarvene etter den mørke inkubasjonsperioden på 17 timer etter påsprøyting.

ALA + 2,2'-DP-behandlingen resulterte i massiv Proto-akkumulering og signifikant larvedød. Prosent larvedød viste høy grad av korrelasjon med Proto-akkumulering (Tabell VI). Mesteparten av døden fant sted under den første fotoperioden.

I løpet av minutter til et par timer etter eksponering til lys, ble larvene trege og slappe p.g.a. tapet av kroppsvæsker; døden ble etterfulgt av utstrakt uttørring.

For å bestemme stedet for Proto-akkumulering ble integumentet, hemolymfen og innvollene fra ALA + 2,2'-DP-behandlede larver, i sitt tidlige femte instar, separert og analysert for pigmentinnhold som i Eksempel II. På en pr. enhet proteinbasis ble omlag 59% av den akkumulerte Proto obsevert i hemolymfen,

35% i innvollene og 6% i integumentet.

Eksempel V

Virkningene av protoporfyrin- akkumulerinq på larvedød og forandringer i legemsvekt i mørke og i lys.

Under eksperimentene ble det observert at ALA + 2,2'-DP-behandlingen konsekvent forårsaket larvedød i mørke så vel som i lys. For å bestemme om den ALA + 2,2'-DP-avhengige larvedøden var et fotodynamisk fenomen eller ikke, ble T. ni larver i det tredje instar påsprøytet enten med bare løsningsmiddel (kontroller) eller med 40 mM ALA + 30 mM 2,2'-DP justert til pH 3,5 som i Eksempel III. De påsprøytede larvene fikk akkumulere Proto over natten ved inkubering i mørke i 17 timer ved 28"C. Den neste morgen ble noen av larvene eksponert for 0, 3 eller 6 timers lys i drivhuset, før pigmentekstraksjonen som i Eksempel II. Duplikatprøver underkastet den samme lysbehandlingen ble returnert til mørke i henholdsvis 48, 45 og 42 timer, før kontroll av gjennomsnittlig larvedød som i Eksempel V. Ytterligere evaluering av behandlingsavhengig ødeleggelse

blandt overlevende larver, foregikk ved bestemmelse av legemsvekt

etter 3 døgns fotoperiodisk eksponering i drivhuset. Resultatene av to eksperimenter er rapportert i Tabell VII:

Behandling av larvene med ALA + 2,2'-pP resulterte i akkumulering av Proto. En signifikant grad av larvedød ble også observert i de behandlede larvene ved slutten av postspray-inkubasjonsperioden i 17 timer mørke, før eventuell eksponering for lys (Tabell VII: A 2, B 2). Ytterligere mørkeinkubasjon resulterte i ytterligere larvedød. Denne formen for larvedød refereres heri som mørkeavhengig larvedød. De larvene som overlevet mørke-larvedødperioden, undergikk ikke et observerbart tap av legemsvekt (Tabellene VII: Al, 2; Bl, 2). Disse resultatene viste at den ALA + 2,2'-DP-avhengige Proto-akkumuleringen ble etterfulgt av larvedød i mørke. 3 eller 6 timers belysning av de larvene som hadde akkumulert Proto under postspray-mørkeinkubasjonen på 17 timer, resulterte i ødeleggelse og forsvinning av den akkumulerte Proto (Tabell VII: A 2-4, B 2-4). Dødeligheten av behandlede larver som ble eksponert for 3 eller 6 timers belysning før de ble plassert tilbake i mørke i henholdsvis 45 og 42 timer, var større enn nivået for dødeligheten av mørke-larver (Tabell VII: A 2-4, B 2-4). Denne formen for larvedød refereres heri som lysavhengig larvedød. Denne formen for dødelighet viste signifikant korrelasjon med lengden av belysningen (Tabell VII: kolonne 6). Dessuten viste de behandlede larvene som overlevet lysbehandlingen, en signifikant hemming av økningen i legemsvekt, sammenlignet med de ubehandlede kontrollene som ble påsprøytet med bare løsningsmiddel (Tabell VII, kolonne 7). Korrelasjonen mellom lengden av eksponeringen til lys etter behandlingen, og hemmingen av økningen i legemsvekt var høyst signifikant (Tabell VII: kolonne 7).

Tilsammen viste disse resultatene at i tillegg til mørke-larvedød, resulterte Proto-akkumulering i en lysavhengig eller fotodynamisk larvemortalitet. Dessuten forsvant den akkumulerte Proto under belysning, trolig som en konsekvens av foto-destruksjon.

Eksempel VI

Synergistiske virkninger av ALA og 2. 2 '- PP på Proto- akkumulering og larvedød i T. ni.

De relative virkningene av ALA og 2,2'-DP på Proto-akkumulering og larvedød i tredje instar T. ni behandlet som i Eksempel III og undersøkt som i Eksempel II er beskrevet i Tabell VIII: A:

Delta-aminolevulinsyre alene resulterte i et moderat nivå av Proto-akkumulering og larvedød (Tabell VIII: A 2). 2,2'-dipyridyl i fravær av tilsatt ALA var mere effektiv enn ALA i å forårsake Proto-akkumulering og larvedød (Tabell VIII: A 2, 3); dvs., i fravær av tilsatt ALA virket 2,2'-DP som et induksjonsmiddel for Proto-akkumulering. Endelig fastslo man de synergistiske virkningene av ALA + 2,2'-DP når de to kjemikaliene ble anvendt sammen ved behandling av T. ni larvene. Under disse betingelsene overskred Proto-akkumuleringen (80,4 nmol) og larvedøden (90%) betydelig summen av Proto-akkumulering (2,5 + 15,5 = 18 nmol) og larvedød (26 + 41 = 67%) forårsaket av separate ALA og 2,2'-DP-behandlinger (Tabell VIII: A 2-4).

Eksempel VII

Enhansering av ALA omdanning til protoporfyrin ved 2. 2'-dipvridvl.

For å bestemme hvorvidt 2,2'-DP i tillegg til sine induserende egenskaper (Tabell VIII: A 3) viste enhanserende egenskaper som antydet i Tabell VIII: A, ble dets virkninger på Proto-akkumulering og på ledsagende larvedød undersøkt i nærvær av forskjellige mengder tilsatt ALA. Larver i sitt tredje instar ble sprøytet som i Eksempel III og undersøkt som i Eksempel II. Ved høy (30 mM) og middels (15 mM) konsentrasjon viste 2,2'-DP enhanserende egenskaper i tillegg til sine Proto-induserende egenskaper. De Proto-induserende egenskapene av 2,2'-DP ble demonstrert ved økningen i Proto-akkumulering og den ledsagende larvedøden i fravær av tilsatt ALA (Tabell VIII: B 2, C 2). De enhanserende egenskapene hos 2,2'-DP fremkom tydelig ved den dramatiske økningen i Proto-akkumulering og larvedød i de ALA + 2,2'-DP-behandlede larvene, langt over de som ble behandlet med 2,2'-DP alene, som et resultat av den svært forbedrede omdanningen av eksogen ALA til Proto (Tabell VIII: B 3-5, C 3-5). Tilslutt er avhengigheten av de 2,2'-DP enhanserende egenskapene av 2,2'-DP-konsentrasjonen beskrevet i Tabell VIII: D.

Tilsammen viser de foregående resultatene at selvom 2,2'-DP i fravær av tilsatt ALA virket som induksjonsmiddel for Proto-akkumuleringen, virket det også i nærvær av eksogen ALA som enhanser for ALA omdanningen til Proto. 2,2</->DP er således et eksempel på"en induser-enhancer for biosyntesen av tetrapyrrol .

Eksempel VIII

Virkningen av pH på ALA + 2. 2'- DP- avhengig Proto- akkumulering og på larvedød i T. ni.

Delta-aminolevulinsyre er et zwitterion, dvs. at dens netto ladning er en funksjon av pH. Da dens isoioniske punkt er ved pH 6,47, får den en positiv ladning under pH 6,47, og en negativ ladning over denne pH. Siden translokasjonen av zwitterioner i biologisk vev påvirkes av størrelsen av den netto elektriske ladningen på ionet, undersøkte man innvirkningen av denne parameteren på translokasjonen av ALA og 2,2'-DP inn i de behandlede larvene. Størrelsen av translokasjonen av ALA og 2,2'-DP inn i T. ni larvene sluttet man seg til fra størrelsen av Proto-akkumuleringen og larvedøden.

T. ni larvene i det tredje instar ble sprøytet med 3 0 mM 2,2'-DP + 40 mM ALA løsninger ved pH 3,5 og 5,5 (ALA positivt ladet) og ved pH 7,5 (ALA negativt ladet) ifølge fremgangsmåten i Eksempel III. Som vanlig ble kontrollene sprøytet med bare løsningsmiddel. Etter den 17 timers postspray-mørkeinkubasjons-perioden, ble noen av larvene ekstrahert for Proto-bestemmelse ifølge fremgangsmåten i Eksempel II, mens duplikatprøver ble eksponert for lys i drivhuset. Larvedøden ble bestemt etter 3 døgn i drivhuset. Resultatene er vist i Tabell IX:

Som vist i Tabell IX ble betydelige mengder Proto dannet av de behandlede larvene ved alle pH verdier. Larvedøden var også betydelig ved alle pH verdier. Mellom pH 3,5 og 7,5 syntes hverken Proto-akkumulering eller larvedød å være korrelert med pH. Tilsammen indikerte disse resultatene at translokasjonen av ALA + 2,2'-DP inn i T. ni larvene og påfølgende omdanning av ALA til Proto i larvene, ikke var strengt avhengig av pH i området 3,5 til 7,5.

Eksempel IX

Avhengigheten av larvedød i T. ni behandlet med ALA + 2, 2'- PP av alderen på larvene.

Avhengigheten av larvedøden i ALA + 2,2'-PP-behandlede T. ni av alderen på de behandlede larvene ble undersøkt. T. ni larver i første, andre, tredje og fjerde instar ble behandlet med 40 mM ALA + 30 mM 2,2'-PP ved pH 3,5 som i Eksempel III. Etter en 17 timer mørkeinkubasjonsperiode ble de behandlede og kontrollarvene eksponert for lys i drivhuset. Larvedøden ble evaluert etter 3 døgn i drivhuset. Resultatene er vist i Tabell X:

Tabell X viser at følsomheten hos T. ni for ALA + 2,2'-DP-behandlingen var omvendt proporsjonal med instar-orden, med unge første instar-larver som de mest følsomme, og eldre fjerde instar-larver som de minst følsomme.

For å bestemme hvorvidt følsomheten for ALA + 2,2'-DP-behandlingen var avhengig av utviklingstrinnet innenfor en bestemt instar, ble T. ni larver i de tidlige-, mellom- og sene stadiene i tredje og fjerde instar behandlet med ALA + 2,2'-DP som ovenfor. Resultatene er vist i Tabell XI:

Resultatene antyder at, for en bestemt instar, var det

sene trinnet det mest følsomme, etterfulgt av henholdsvis det tidlige og det midtre trinnet. Dette antydet i sin tur at jo nærmere larvene var til apolyse (separasjon av underhud fra overhud), jo mere følsomme var de for ALA + 2,2'-DP-behandlingen. De midtre-, tidlige- og sene stadiene i hver bestemt instar ble gitt en rangering på 1, 2 eller 3, med "1" som det minst følsomme stadiet og "3" som det mest følsomme stadiet. For å elimimere statistiske forskjeller i følsomhet mellom tredje og fjerde instar (se Tabell X), ble alle prosentdødverdier innenfor hvert eksperiment normalisert til samme verdi. Sistnevnte ble valgt lik 100, og representerte prosent døde for det sene stadiet innenfor hver instar (Tabell XI, siste

kolonne). På denne måten ble det mulig å teste forholdet mellom larvedød og de tidlige, midtre og sene stadiene i instar, uten hensyn til rangeringen av instar. Som vist i Tabell XI var dette forholdet høyst signifikant, med de tidlige og midtre stadiene av instar mindre følsomme forALA +2,2'-DP-behandlingen enn det sene stadiet i instar. Denne perioden med maksimum følsomhet tilsvarer den perioden når larvene er rolige og den nye underhuden for den neste instar blir aktivt synteti-sert under den gamle underhuden.

Eksempel X

Forholdet mellom larvearter, ALA + 2, 2'- DP- avhengjg Proto-akkumulering og larvedød.

For å bestemme hvorvidt ALA + 2,2'-DP-avhengig Proto-akkumulering og larvedød var generelle fenomener felles for alle insektlarver, eller spesifikke for visse spesielle insektarter, ble foretatt en studie av responsen hos forskjellige larvearter på ALA + 2,2'-DP-behandlingen.

Kolonier av maisboreren Heliothis zea (Boddie) (Lepidoptera: Noctuidae) ble dyrket fra egg levert av Dr. Gilbert Waldbauer,

i Department of Entomology ved the University of Illinois i Urbana-Champaign. Larvene ble foret med samme dietten som T. ni ovenfor.

Larvene av H. zea ble sprøytet som i Eksempel III; imidlertid er, i motsetning til T. ni, larvene hos H. zea kannibalistiske, og måtte behandles forskjellig. 25 larver 1 cm lange (blanding av tredje og fjerde instar) ble plassert enkeltvis med en kube av for i enkeltrom (3 x 5 x 1,5 cm) i et plasttraug med 25 rom (Bioserve, Inc,. Frenchtown, NJ 08825). For å begrense larvene til sine enkeltrom ble plasttrauget dekket med en glassplate. Glassplaten ble fjernet før sprøyting, og ble plassert tilbake straks deretter. Sprøytingen var som beskrevet for T. ni. De sprøytede beholderne ble dekket med en glassplate før de ble plassert i mørke ved 25'C i 17 timer.

Resultatene er vist i Tabell XII:

De 40 mM ALA + 30 mM 2,2'-DP-behandlingene som resulterte i massive mengder Proto-akkumulering og i signifikant larvedød i Ti ni (Tabellene VI-IX) resulterte i et lavt nivå for Proto-akkumulering i IL zea. Larvedøden var også mye lavere enn i T. ni (Tabell XII). Man vet for tiden ikke hvorvidt den lavere grad av Proto-akkumulering og ledsagende lavere grad av larvedød i ALA + 2,2'-DP-behandlede H. zea sammenlignet med T. ni skyldes (a) forskjeller i translokasjonen av de anvendte kjemikaliene til det indre vevet hos insektet eller (b) noen mere grunnleggende biokjemiske forskjeller i reguleringen av porfyrin-heme reaksjonsmekanismen mellom de to artene. Hos ALA + 2,2'-DP-behandlet T. ni akkumulerte mesteparten av Proto i hemolymfen. Dette indikerte i sin tur en tilfredsstillende translokasjon av ALA og 2,2'-DP til målstedene. Hvorvidt disse kjemikaliene translokerer like bra til det indre vevet hos H. zea er ikke kjent.

Disse resultatene viser at noen larvearter er mere følsomme enn andre for ALA + 2,2'-DP-behandlingen. Siden det er svært ønskelig å avlive skadelige insekter og samtidig spare de som gjør godt, kan den forskjellige følsomheten hos forskjellige insektarter for porfyriske insekticider utnyttes til å utvikle arts-spesifikke porfyriske insekticider.

Eksemmpel XI

Effektiviteten av ALA + 2. 2'- DP- behandlingen i fravær av en postspray mørke- inkubasi onsperiode

Andre instar T. ni larver ble sprøytet med ALA + 2,2</->DP og ble underkastet en 17 timers mørke-inkubasjonsperiode før eksponering til lys i drivhuset (mørkespray). Lignende larver ble sprøytet med ALA + 2,2</->DP i drivhuset ved begynnelsen av lysfasen av den 14 timers lys - 10 timers mørke fotoperioden (lysspray). Resultatene av fire eksperimenter er gitt i Tabell

XIII:

hvori "DSP" = mørkesprøyting og "LSP" = lyssprøyting. Lyssprøyt-ingene var like effektive til å forårsake larvedød som mørke-sprøytingene. Disse resultatene var i sin tur svært like med dem fra fotodynamiske mørke- og lysbehandlinger med herbicider, som er vist i USSN 895,529.

Eksempel XII

1. 10- fenantrolin som induksionsmiddel/ enhancer.

For å bestemme hvorvidt kjemikalier som viste induserende eller enhanserende tetrapyrrolegenskaper hos planter ville vise lignende egenskaper hos insekter, ble undersøkt virkningen av tetrapyrrolakkumulering hos T. ni av flere kjente enhancere og induksjonsmidler for tetrapyrrolakkumulering hos planter. Tredje instar T. ni larver ble sprøytet med en løsning av 4 0 mM ALA + 30 mM 1,10-PA som beskrevet i Eksempel III for ALA + 2,2'-DP. Kontrollen og behandlede larver ble bearbeidet og analysert som beskrevet i Eksempel II. Resultatene av disse eksperimentene er vist i Tabell XIV:

Som observert med 2,2'-DP (Tabell VIII) viste 1,10-PA svært sterke tetrapyrrolinduserende-enhanserende egenskaper, som vist ved den svært sterke synergismen i Proto-akkumuleringen som ble observert når ALA og 1,10-PA ble brukt sammen.

I tillegg til den massive akkumuleringen av Proto, resulterte behandling med 1,10-PA i nærvær eller fravær av ALA, i dannelsen av mindre mengder Zn-Proto. Korrelasjonen mellom Zn-Proto-akkumulering og larvedød var høyst signifikant. Dette i sin tur antydet at dannelsen av Zn-Proto på en eller annen måte var sterkt relatert til larvedøden.

Andre eksperimenter ble utviklet for å bestemme hvorvidt Zn-Proto i virkeligheten ble dannet ensymatisk eller ikke. F.eks. førte tilsetting av 1,10-PA til Proto løst i 80% aceton ikke til Zn-Proto-dannelse etter 17 timers inkubasjon. I andre eksperimenter ble levende og døde T. ni larver behandlet med 40 mM ALA + 30 mM 1,10-PA nøyaktig som beskrevet i Tabell XIV. De døde larvene ble avlivet ved koking i vann ved 100°C i 5 minutter før sprøytingen. Resultatene er vist i Tabell XV:

Som vist var bare levende insekter med aktiv metabolisme i stand til å akkumulere Proto og Zn-Proto. Tilsammen indikerte disse resultatene sterkt at dannelsen av Proto og Zn-Proto hos de behandlede insektene var en konsekvens av enzymatisk aktivitet.

Eksempel XIII

Administrasjon av ALA + 1. 10- PA- behandlingen i dietten.

Under visse feltbetingelser er det av og til fordelaktig å administrere et insekticid som en åte istedenfor ved sprøyting. De følgende eksperimentene ble derfor utviklet for å demonstrere effektiviteten av porfyriske insekticider når de administreres som åte.

I et eksperiment ble forkuber av Waldbauer's medium sprøytet med en samlet mengde på 1,5 ml pr. 10 ml fast for. En tredel av volumet ble sprøytet pr. gang. Forkubene fikk tørke, deretter ble fremgangsmåten repetert to ganger til. Ubehandlede larver ble deretter plassert med det behandlede foret i mørke i 17 timer. Alternativt ble larvene, sammen med deres for, sprøytet nøyaktig som i Eksempel III. Resultatene er vist i Tabell XVI:

Som vist var anvendelsen av kjemikaliene utelukkende via foret like effektiv til å forårsake larvedød, som sprøyting både av insektet og dets for. Dessuten ble det observert at mesteparten av larvedøden hos insektene som svelget det behandlede foret, fant sted under de første 8 minuttene av eksponering for lys, med betydelig død under de første 2 minuttene i lyset.

I et annet eksperiment ble ALA og 1,10-PA tilsatt til foret i en mengde på henholdsvis 16 og 12 mM. Foret ble blandet med ALA og 1,10-PA i en blandemaskin ved 37'C i 5 minutter. Larvene ble plassert på foret tilsatt åte i 17 timer i mørke, før eksponering for lys. Resultatene er vist i Tabell

XVII:

I et annet eksperiment ble foret oppvarmet i en konveksjonsovn og ALA og 1,10-PA ble tilsatt til det oppvarmede foret ved 57°C. Blandingen ble deretter omrørt i 45 sekunder i en Sorval Omnimixer (Omni Co. International, CT 06706). Resultatene er vist i Tabell XVIII:

Som vist i Tabell XVII (2) og XVIII (4) resulterte tilsetningen av kjemikaliene i foret i en utmerket grad av larvedød. Den samme synergismen mellom ALA og 1,10-PA ble observert som når de to kjemikaliene ble tilsatt ved sprøyting (Tabell XV vs. Tabell VIII).

Tilsammen indikerer disse resultatene at porfyriske insekticider kan være effektive enten ved sprøyting eller i form av åte.

Eksempel XIV

Administrering av alternative induksjonsmidler og/ eller enhancere

Waldbauer's medium ble oppvarmet i en konveksjonsovn til 57-65"C og kombinert med 4 mM ALA og 3 mM av en av forskjellige testforbindelser. Blandingen ble deretter omrørt i 2 minutter i en Sorval Omnimixer.

T. ni larver ble plassert med det behandlede foret i mørke

i 17 timer som ovenfor. Larvedøden ble bestemt ved enden av den mørke perioden (før eksponering for lys) og etter 3 døgn i drivhuset.

En kontroll bestående av blindprøve (ubehandlet) for ble utført for hver testet forbindelse.

Resultatene er vist i Tabell XIX:

Gjentatte forsøk med 4 mM ALA alene ga en larvedød etter 3 døgn i drivhuset som konsistent lå på mellom 0 og 5%. Resultatene ovenfor viser således klart at 1,10-fenantrolin; 4,7-dimetyl-1,10-fenantrolin; 4-metyl-l,10-fenantrolin; 5-nitro-l,10-fenantrolin; 5-metyl-l,10-fenantrolin; 5,6-dimetyl-l,10-fenantrolin ; 4,7-difenyl-1,10-fenantrolin; 5-klor-l,10-fenantrolin ; 3,4,7,8-tetrametyl-l,10-fenantrolin; 2,2'-ditiobis(pyridin N-oksyd); 4,4'-dimetyl-2,2'-dipyridyl; fenyl 2-pyridylketoksim; og 2,2':6',2''-terpyridin fungerer som induksjonsmidler og/eller enhancere for ALA og er effektive lysaktive insekticider.

Eksempel XV

Virkningen av ALA og 1. 10- fenantrolin på larver av Mamestra brassica.

Virkningen av svelget insekticid omfattende ALA og 1,10-fehantrolin ble testet på larvene av Mamestra brassicae. en viktig insektplage hos korsblomstrede grønnsaker.

Foret ble fremstilt i en rustfri stålbolle med en Kenwood kjøkkenmaskin som følger: 1. 1530 ml avmineralisert vann, 504 g malt mais (maksimum partikkelstørrelse 1 mm), 135 g ølgjær og 135 g hvetekim ble sammenblandet ved romtemperatur. 2. 5,4 g parahydroksymetylbenzoat ble fortynnet i 12 ml etanol ved 90°C og hele mengden på 12 ml ble tilsatt til blandingen fra trinn (1) ovenfor. 3. 1530 ml vann ble blandet med 72 g agar og 6 g benzosyre, og blandingen ble bragt til koking. Blandingen fikk avkjøle seg til 70'C og ble deretter tilsatt til blandingen fra trinn (2) ovenfor. 4. Blandingen fra trinn (3) ovenfor fikk avkjøle seg til40°C, og 18 g askorbinsyre ble tilsatt som oksydasjons-retarder. 5. Den resulterende blandingen ble homogenisert og lagret

for anvendelse som standardfdr.

Behandlet for ble fremstilt ved å løse passende mengder aktive bestanddeler i etanol, og tilsette 1 ml av denne løsningen til 9 ml avmineralisert vann. Hele mengden på 10 ml av den resulterende etanol:vann (1:9 v/v) løsningen, som inneholdt de passende mengdene av aktive bestanddeler ble deretter tilsatt til blandingen fra trinn (3) ovenfor, før tilsettingen av askorbinsyre.

Kolonier av M. brassicae ble masseoppdrettet på standard (ubehandlet) for. Ettersom larvene nærmet seg den tredje instar, ble porsjoner på 20 larver hver forandret fra standard for til forskjellige testfor som inneholdt aktive bestanddeler. Skålene ble pakket i aluminiumfolie, og larvene fikk ete testforet ad libitum under en 16 timers mørkeperiode. Deretter ble folien fjernet, og larvene ble eksponert for kunstig lys (400 watt kvikksølvdamplampe ved 50 cm). Kontrollene ble foret med ubehandlet for. Resultatene er vist i Tabell XX:

Virkningen av eksponering for lys er dramatisk: umiddelbart ved eksponeringen begynte de behandlede insektene å tørke inn å dø. 100% av de behandlede insektene var døde i løpet av 2 minutter. Dette eksperimentet ble gjentatt tre ganger med identiske resultater.

Eksempel XVI

Virkningen av ALA og 6- aminonikotinamid på voksne Blatella germanica.

Virkningen av svelget insekticid omfattende ALA og 6-aminonikotinamid ble testet på husholdnings-insektplagen Blatella germanica (tysk kakerlakk).

Standardforet omfattet en blanding av malt korn (mais, hvete, ris og hvetekim), sukkerrør, soyaprotein, egg, fennikel-ekstrakt, fullstendig for for laboratoriemus og avmineralisert vann

Behandlet for ble fremstilt ved å løse en passende mengde av de aktive bestanddelene i etanol, slå sammen en del av denne etanolløsningen med 19 deler vann, og tilsette 1 ml av den resulterende løsningen til 5 g for. Foret fikk tørke før bruk.

Kolonier av B.<g>ermanica ble masseoppdrette på standard (ubehandlet) for til det voksne stadium. På en tidlig ettermiddag i norvember i Marseilles, Frankrike ble 10 voksne hanner plassert i hver av 3 Petrie-skåler sammen med 5 g av en av testforblandingene. Skålene fikk ligge på benkeplaten, fikk vanlig romlys (fluorescerende pluss dagslys), for resten av dagen (omlag 3,5 timer). Skålene fikk dessuten ligge under vanlige rombetingelser (omgivende lys og temperaur) i 4 døgn for å simulere vanlige husholdningsbetingelser. De ble eksponert for naturlig mørke hver natt i omlag 13 timer, og for omgivende lys i omlag 11 timer i løpet av hver dag. En fjerde skål med kontroller ble foret med standard (ubehandlet) for. Dødelig-hetstellinger ble utført hver ettermiddag. Resultatene er gitt i Tabell XXI:

Disse resultatene viser klart at 6-aminonikotinat er et effektivt induksjonsmiddel og/eller enhancer for ALA, og at insekticidpreparater ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være effektive mot insekter under vanlige innendørs betingelser med omgivende lys og mørke.

Den kjemiske induksjonen av insektlarver til å akkumulere Proto og Zn-Proto som forårsaker larvedød i mørke og i dagslys, tilveiebringer nye insekticidpreparater og fremgangsmåter. Vi foreslår at begrepet "porfyriske insekticider" skal vise tilbake til dette fenomenet. I lyset forsvinner det akkumulerte Proto og Zn-Proto fra insektvevet i løpet av timer. Denne tilnærmingen er lignende med den utformingen av fotodynamiske herbicider som er vist i USSN 895.529. Ødeleggelsen av plantene som var behandlet med nevnte herbicider foregikk imidlertid bare i dagslys, og var utelukkende fotodynamisk av karakter. De mest ødeleggende tetrapyrrolene var dessuten Mg-tetrapyrroler som hørte til den Chl biosyntetiske reaksjonskjeden. Det antas at MG-grenen av tetrapyrrolens biosyntetiske reaksjonskjede som fører til Chl biosyntesen ikke er funksjonell hos insekter. Som en konsekvens kan ikke biosyntesen av Mg-holdige mellomprodukter i den Chl biosyntetiske reaksjonskjeden bli oppdaget i T. ni behandlet med ALA eller med ALA + 2,2</->DP. Derfor blir de klorofyllpigmentene som ga larvene sine gulaktig grønne farger mest sannsynlig avledet fra klorofyllpigmentene i foret (Tabellene II, III, IV). Imidlertid inneholder alle insekter cytokromer som virker som elektronbærere ved oksydativ fosforylering. Det antas for tiden at heme-gruppen i cytokromene blir dannet fra Proto som i sin tur syntetiseres fra ALA via den biosyntetiske porfyrinreaksjonsveien [flyteskjema A ovenfor]. Den ALA-avhengige akkumuleringen av Proto og ZN-Proto hos T. ni er fullstendig kompatibel med denne hypotesen.

I motsetning til det som obseveres hos planter, følges mørkeakkumuleringen av Proto hos T. ni av larvedød i mørke (Tabell VII). I lyset synes imidlertid ikke en massiv oppbygging av Proto å være påkrevet for at det skal finne sted en fotodynamisk ødeleggelse (Tabellene VII, XIII). Denne konklusjonen er basert på to observasjoner: (a) i lyset observeres ikke en massiv akkumulering av Proto, sannsynligvis som en konsekvens av den stasjonære fotodestruksjonen av det biosyntetiserte Proto (Tabell VII) og (b) lyssprøytinger (som ikke innvolverer en postsprøyting-mørkeinkubasjonsperiode under hvilken Proto kunne akkumuleres) var like effektive til å forårsake larvedød som mørkesprøyting som innbefattet en slik postsprøyting-mørke-inkubasjonsperiode før eksponering for dagslys (Tabell XIII). Tilsammen antyder disse resultatene at det som trenges for at den fotodynamiske ødeleggelsen skal foregå hos behandlede insekter, er en stasjonær dannelse av små mengder Proto i mengder som er akkurat store nok til å sette i gang ødeleggende kjedereaksjoner med frie radikaler.

Et av de større problemene som ligger foran insekticid-industrien er den alarmerende hastighet hvormed insektene utvikler resistens mot insekticider. Dette er vanligvis en konsekvens av mutasjoner som kan øke avtoksifiseringsmekanismene hos insektene, eller forandre de lipofile egenskapene hos toksinet, og således redusere dets membranpermeabilitet. I sin tur avkorter dette betydelig den nyttige levetiden for nye introduserte insekticider, og reduserer deres økonomiske verdi. Det antas at siden den kjemiske moduleringen av reaksjonskjeden for porfyrin-heme ifølge den foreliggende oppfinnelsen, synes å innebære mere enn et metabolisk trinn, kan det være vanskeligere for insektene å utvikle resistens mot porfyriske insekticider. Selvom noen insekter lykkes i å utvikle resistens mot tetrapyrrolakkumulering ved å utvikle midler til raskt å ødelegge de akkumulerte tetrapyrrolene, er det ikke sannsynlig at dette vil beskytte de muterte insektene mot fotodynamisk ødeleggelse i lyset. Som det antydes i Tabellene VII og XIII blir Proto mest sannsynlig ødelagt i lyset nesten så raskt som det blir dannet; allikevel er en slik minimal akkumulering nok til å forårsake utstrakt fotodynamisk ødeleggelse av larvene. Dessuten ville en mutasjon som blokkerer Proto og cytokrombiosyntesen fullstendig, mest sannsynlig være dødelig.

Ytterligere eksempler på preparater og anvendelser innenfor ånden og rammen av denne oppfinnelsen vil være åpenbare for spesialister på dette området ved betraktning av det foregående, og derfor bør bare slike begrensninger som fremgår i de vedlagte kravene legges derpå.

Claims (23)

1. Insekticidpreparat, karakterisert ved at det omfatter en insekticidisk effektiv mengde av en eller flere forbindelser bestående av delta-aminolevulinsyre, induksjonsmidler for delta-aminolevulinsyre eller akseleratorer for omdanning av delta-aminolevulinsyre til tetrapyrroler.

2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter delta-aminolevulinsyre.

3. Preparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det omfatter et eller flere induksjonsmidler for delta-aminolevulinsyre.

4. Preparat ifølge kravene 1, 2 eller 3, karakterisert ved at det omfatter en eller flere akseleratorer for omdanning av delta-aminolevulinsyre til tetrapyrroler.

5. Preparat ifølge hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert ved at mengden av nevnte forbindelser er tilstrekkelig til å levere fra omlag 0,28 til 2,2 kg av delta-aminolevulinsyre pr. hektar og/eller fra omlag 0,11 til 1,7 kg induksjonsmiddel eller akselerator pr. hektar.

6. Preparat ifølge hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert ved at det omfatter en eller flere av de følgende: bærere, løsnings-midler, buffere, fuktemidler, dispergeringsmidler, antiskummidler, brekkmidler, illeluktende midler, penetreringsmidler, overflateaktive midler, emulgeringsmidler, hjelpemidler, herbicider og et eller flere andre insekticider.

7. Preparat ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte forbindelser foreligger i en løsning som har en konsentrasjon på fra omlag 2 til omlag 50 mM av delta-aminolevulinsyre og/eller fra omlag 0,1 til omlag 50 mM av induksjonsmiddel eller enhancer.

8. Preparat ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte forbindelser foreligger i et preparat som skal svelges av insektene, og at mengden av nevnte forbindelser er tilstrekkelig til å levere fra omlag 10 ng til omlag 5 pg av delta-aminolevulinsyre pr. mg av insektets legemsvekt og/eller fra omlag 1 ng til omlag 5 jjg av induksjonsmiddel eller enhancer pr. mg av insektets kroppsvekt.

9. Preparat ifølge hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert ved at nevnte preparat omfatter en eller flere forbindelser bestående av delta-aminolevulinsyre; 2,2'-dipyridyl; 1,10-fenantrolin; 4,7-dimetyl-l,10-fenantrolin; 4-metyl-l,10-fenantrolin; 5-nitro-1,10-fenantrolin; 5-metyl-l,10-fenantrolin; 5,6-dimetyl-1,10-fenantrolin; 4,7-difenyl-1,10-fenantrolin; 5-klor-l,10-fenantrolin; 3,4,7,8-tetrametyl-l,10-fenantrolin; 2,2'-ditiobis-(pyridin N-oksyd); 4,4'-dimetyl-2,2'-dipyridyl; fenyl 2-pyridylketoksim; og 2 ,2':6' ,2''-terpyridin.

10. Fremgangsmåte for produksjon av insekticidpreparat, karakterisert ved at man formulerer nevnte preparat omfattende en insekticidmessig effektiv mengde av en eller flere forbindelser bestående av delta-aminolevulinysyre, induskjonsmidler for delta-aminolevulinsyre, eller akseleratorer for omdanning av delta-aminolevulinsyre til tetrapyrroler.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at man anvender delta-aminolevulinsyre.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10 eller 11, karakterisert ved at man anvender et eller flere induksjonsmidler for delta-aminolevulinsyre.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 10, 11 eller 12, karakterisert ved at man anvender en eller flere akseleratorer for omdanning av delta-aminolevulinsyre til tetrapyrroler.

14. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående kravene 10 til 13 , karakterisert ved at det amvendes en mengde av nevnte forbindelser som er tilstrekkelig til å levere fra omlag 0,28 til 2,2 kg delta-aminolevulinsyre pr. hektar og/eller fra omlag 0,11 til 1,7 kg induksjonsmiddel eller enhancer pr. hektar.

15. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de foregående kravene 10 til 14, karakterisert ved at man innfører en eller flere av de følgende: bærere, løsningsmidler, buffere, fuktemidler, dispergeringsmidler, antiskummidler, brekkmidler, illeluktende midler, penetrerende midler, overflateaktive midler, emulgeringsmidler, hjelpemidler, herbicider og et eller flere andre insekticider.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at nevnte forbindelser innføres i en løsning som har en konsentrasjon på fra omlag 2 til omlag 50 mM delta-aminolevulinsyre og/eller fra omlag 0,1 til omlag 50 mM induksjonsmiddel eller akselerator.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at nevnte forbindelser innføres i et preparat som skal svelges av insekter og at mengden av nevnte forbindelser er tilstrekkelig til å levere fra omlag 10 ng til omlag 5 jjg delta-aminolevulinsyre pr. mg av insektets legemsvekt og eller fra omlag 1 ng til omlag 5 jjg induksjonsmiddel eller enhancer pr. mg av insektets legemsvekt.

18. Fremgangsmåte for å indusere akkumulering av tetrapyrroler hos levende insekter, karakterisert ved at nevnte fremgangsmåte omfatter å kontakte nevnte insekter med et preparat ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 9.

19. Fremgangsmåte for avliving av insekter, karakterisert ved at nevnte fremgangsmåte omfatter å kontakte nevnte insekter med et preparat ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 9.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at nevnte behandlede insekter utsettes for mørke i omlag 1 til 8 timer og deretter utsettes for lys.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 20, karakterisert ved at nevnte lys omfatter naturlig dagslys.

22. Fremgangsmåte ifølge kravene 19 eller 20, karakterisert ved at nevnte eksponering for lys er for en periode på omlag 1 til 14 døgn.

23. Fremgangsmåte ifølge kravene 10, 18 eller 19, karakterisert ved at den omfatter anvendelse av en eller flere forbindelser bestående av delta-aminolevulinsyre; 2 ,2'-dipyridyl; 1,10-fenantrolin; 4,7-dimetyl-l,10-fenantrolin; 4-metyl-l,10-fenantrolin; 5-nitro-1,10-fenantrolin; 5-metyl-l,10-fenantrolin; 5,6-dimetyl-1,10-fenantrolin; 4,7-difenyl-1,10-fenantrolin; 5-klor-l,10-fenantrolin ; 3,4,7,8-tetrametyl-l,10-fenantrolin; 2,2'-ditiobis-(pyridin N-oksyd); 4,4'-dimetyl-2,2'-dipyridyl; fenyl 2-pyridylketoksim; og 2,2':6',2''-terpyridin.