PT89362B - Processo para a preparacao por manipulacao genetica de anticorpos - Google Patents

Processo para a preparacao por manipulacao genetica de anticorpos Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
A expressão de anticorpos em leveduras foi descrita (C.R. Wood, M.A. Boss, J.H. Kenten, J.E.Calvert, N. A. Roberts e J.S. Emtage, Nature 314, 446 (1985)), mas só uma fracção muito pequena da proteína expressa provou ser funcional. Até agora só foi possível obter em E.coli as pro teínas de anticorpos de forma desnaturada ((M.A.Boss, J.H. Kenten, C.R. Wood e J.S. Emtage, Nucleic Acids Res. 12,3791 (1984); S. Cabilly, A.D. Riggs, H. Pande, J.E. Shively, W.E. Holmes, M.Rey, L.J. Perry, R. Wetzel e H.L. Heyneker, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81, 3273 (1984)). A purificação de anticorpos activos ou de fragmentos de anticorpos a partir de leveduras ou de outros microorganismos ainda não é conhecida. Até agora experiências de enrolamento de proteínas têm conduzido só até uma pequena percentagem a proteínas de anticorpos recombinantes enroladas de forma conveniente.
CR. ú
Além disso, é difícil separar as proteínas funcionais desejadas das proteínas não funcionais indesejadas, o que dificulta a medição exacta das constantes de ligação, dos rendimentos no enrolamento, das características espectrais e de caracteristícas semelhantes bem como a utilização emprego na terapia e na técnica. A optimização das condições de enrolamento é, por isso, extraordinariamente difícil, tanto mais que não existem quaisquer processo de medição do grau de enrolamento experimentados.
A expressão de anticorpos funcionais completos ou de domínios de ligação funcionais de anticorpos em sistemas de expressão bacterianos não é até agora conhecida e as perspectivas para a sua realização foram encaradas com pejs simismo (S.L. Morrison, Science 229, 1202 (1985), M.A. Bos e C.R. Wood, Immunol. Today 6, 12 (1985)).
Um tal sistema seria muito desejável, uma vez que os processos de manipulação genética especialmente para E. coli foram bem trabalhados e são facilitados em virtu de do rápido crescimento da produção em massa, o que do ponto de vista económico tem um importante significado.
A presente invenção refere-se por conseguinte à preparação de anticorpos funcionalmente aptos, dos seus fragmentos funcionais ou de proteínas de fusão a partir de domínios de anticorpos e de outras proteínas em bactérias, de preferência em bactérias Gram-negativas, em especial em E. coli. 0 processo de acordo com a presente invenção caractje riza-se precisamente por se acoplar o gene para a cadeia simples da molécula do anticorpo ou fragmentos a uma sequência de sinal, que acciona o transporte das cadeias de polipeptídeos através da membrana citoplasnática e que pode ser cindida, provocar a expressão da estrutura genética e isolar a proteína funcional a partir do espaço periplasmático ou do meio.
As formas de concretização preferidas da presente invenção são em seguida esclarecidos mais em pormenor ou são definidas nas reivindicações.
A acoplagem do gene para as cadeias simples providas com sequências de sinal é levada a efeito com vantagem de acordo com a técnica de um sistema de operação
regulável que efectua a expressão simultânea através de uma região de controle conjunta. Deste modo as cadeias de protejí nas foram expressas conjuntamente em proporções estequiométri^ cas aproximadas e transportadas para os espaços periplasmáticos onde se efectua a ligação à molécula funcional. 0 transporte de proteínas a partir do citoplasma realiza-se por meto dos conhecidos em si, tal como são descritos, por exemplo, na EP-B 0 006 694.
Como região de comando interessa cada região de regulação de gene regulável apropriada, por exemplo lac, tac,trp, ou sequências sintécticas. São especialmente preferidas as regiões de regulação que seguramente se podem interromper.
isolamento da proteína a partir do espa ço periplasmático é realizado com vantagem por produção nas células separadas de um choque osmótico suave e por concentra ção da fase líquida assim obtida por meio de ultrafiltração ou de precipitação, por exemplo com sais como por exemplo o sulfato de amónio.
Um choque osmótico suave provoca a saída do periplasma mantendo-se no entanto intacta a membrana ci toplasmática.
concentrado de proteínas é, após uma diálise, de modo conveniente feito passar através de um absor vente, vantajosamente sob a forma de uma coluna de afinidade carregada com o antigene ou hapteno correspondente. Através de diluição apropriada, de modo vantajoso com o antigéne ou hapteno, obtêm-se então o anticorpo ou o fragmento de anticor po funcional.
Nas células eucarióticas foram construídos anticorpos no espaço do retículo endoplasmático - provavelmen te sob a acção de isomerase de dissulfureto, de isomeráse de prolina-cis-trans e possivelmente de outras enzimas ou protei. nas. Foi surpreendenteque as células bacterianas também possuam a capacidade de produzir as duas cadeias nas quantidades estequiométricas aproximadamente iguais, de transportar ambas as proteínas precursoras no espaço periplasmático ou no seu
meio envolvente, de cindir correctamente a sequência de sinal, de fazer enrolar correctamente os domínios globulares e solúveis, de construir as ligações de dissulfureto intramoleculares e de associar ambas as cadeias a um heterodímero porque é considerado como inverosímil que a célula da bactéria disponha destas enzimas ou de outras de actuação idêntica. Verificou-se também surpreendentemente que no caso de bactérias Gram-negativas o periplasma bacteriano é a este respeito um equivaJente funcional do espaço do retículo endoplasmático eucari£ tico.
processo de acordo com a presente inven ção possui uma série de vantagens abstraindo da fermentação bacteriana em massa já referida foram construídas proteínas imediatamante funcionais, evitando-se deste modo a cisão de pro teínas de fusão com isolamento posterior da proteína desejada ou de fragmentos de proteína, a respectiva oxidação ou a dobra gem in-vitro.
Segundo o processo da presente invenção também não se verificaram quaisquer problemas com proteases celulares. Como se sabe, por causa destas proteases celulares, as proteínas são expressas em bactérias normalmente sob a forma de proteínas de fusão, especialmente como corpos de inclusão insolúveis, o que no entanto implica a realização dos referidos passos de pos-processamento. Em oposição a isto a separação e a purificação até à homogeneidade segundo os processos de acordo com a presente invenção são rápidas e simples .
A presente invenção permite assim um ace£ so fácil aos anticorpos, aos seus fragmentos funcionais e a anticorpos modificados que se diferenciam dos anticorpos nativos através de inserção, de eliminação e/ou de intercâmbio de ácidos aminados. Assim pode-se, por exemplo, eliminar uma cisteína ou substitui-la por outros ácidos aminados, para se suprimir um enrolamento indesejada. Da mesma forma pode-se introduzir um anticorpo murino num anticorpo humano ou realizar outras mutações. Junto das possibilidades de uso farmacológico e técnico existe assim uma utilização na facilitação
da investigação da estrutura dos anticorpos e da sua função e dos princípios de catálise enzimática (V. Raso e B.D. Stollar, Biochemistry 14, 591 (1975); A. Tramontano, K.D. Janda e R.A. Lerner, Scienci 234, 1566 (1986); S.J.Pollack, J.W. Jacobs e P.G. Schultz, Science 234, 1570 (1986); J. Jacobs, P.G. Schultz, R. Sugasawara e M. Powell, J. Am. Chem. Soc. 109, 2174 (1987).
A presente invenção permite ainda o empre_ go de sistemas de ensaio (análises) imediatos pera a célula'beoeteriana em que foi construído o anticorpo funcional e deste modo uma investigação rápida do anticorpo eventualmente mutado.
Além das referidas variações das moléculas dos anticorpos através da variação de um único ou de poucos á. eidos aminados podem ser inseridas no gene do anticorpo ainda outras regiões genéticas ou podem ser trocadas por regiões ge néticas não criticas. Podem-se assim acopolar enzimas de mar cação (M.S. Neuberger, G.T.Williams e R.O. Fox, Nature 312, 604 (1984)), Toxinas (G. Moller (ed.)Antibody cariers of drugs and toxins in tumor therapy, Immunol. Rev. 62, Munksgaard, Copenhaga (1982)) ou regiões de imunoglobulina de uma classe diferente (M.S. Neuberger, G.T. Williams, E.B. Mitchell, S.S. Jouhal, J.G. Flanagan, e T.H. Rabbitts, Nature 314, 268 (1985)) ou uma espécie diferente (P.T. Jones, P.H. Dear, J. Foote, M.S. Neuberger, e G. Winter, Nature 321, 522 (1986) na molécula de anticorpo.
O processo da presente invenção é esclare^ eido em seguida por meio de exemplos dos diversos domínios das proteínas de mieloma de anticorpos McPC603 ligadas por fosforileolina. A estrutura tridimensional desta imunoglobulina A de rato é conhecida (D.M. Segai, E.A. Padlan, G.H. Coh en, S. Rudikoff, M. Potter e D.R. Davies , Proc. Natl. Acad. Sei. 71, 4298 (1974). Foram inseridos genes sintéticos para a cadeia leve e para a cadeia pesada variáveis. Estes genes sintéticos são apresentados nas publicações de pedidos das Patentes Alemãs 37 15 033 ou EP-A 0 290 005 e AU-A 15631/88 (nos Quadros 1 e 2). Os Quadros mostram uma forma de realização especialmente oportuna destes genes sintéticos,
na qual se apresenta a sequência de ADN dos plasmideos de expressão conjuntos, encontrando-se os genes para as duas cadei. as sublinhados pela indicação dos ácidos aminados. Na constru ção destas sequências de ADN foram evitados os codões,. que ra ramente são empregues, por E. colí. Para além disso foram construídos locais de corte de enzimas de restrição e teve-se em atenção a estrutura secundária do .ADN.
No fragmento de anticorpo funcional que serve como modelo cada domínio tem uma ponte de dissulfureto intramolecular (de Cys 23 a Cys 94 em de Cys 22 a Cys 98 em VjP · Não existe qualquer ponte de dissulfureto entre as cadeias e também não existe qualquer cisteína livre.
vector de expressão pASK 22 inserido é reproduzido em esquema na seguinte fórmula.
Nesta fórmula encontram-se acoplados os genes sintéticos para os domínios e em fragmentos de genes para a sequência de sinal bacteriana da membrana proteica
A (ompA) por um lado e a fosfatase alcalina (phoA) por outro.
Os genes para ambas as proteínas precursoras estão ordenados numa estrutura do tipo de operação artificial por detrás do promotor: lac, garantindo-se deste modo a indução, a co-expres_ são e a co-secreção simultâneas de ambos os genes.
Após a indução dos genes de expressão as células foram separadas e expostas a um choque osmótico suave. A fase líquida assim obtida que contém as proteínas periplasmá ticas foi concentrada através de ultrafiltração, foi dialisada e aplicada directamente numa coluna de afinidade que contém um derivado de fosforilcolina (B. Chesebro e H. Metzger, Biochemi. stry 11, 766 (1972)) como ligante de afinidade. Através de eluição com fosforilcolina obtém-se um fragmento Fy homogéneo que é uniforme por electroforese de gel. A partir do gel de poliacrilamida SDS verifica-se que as duas cadeias do fragmen to Fy purificado estão presentes numa proporção molar de 1:1 e que os pesos molares esperados da proteína madura são (V^: 13600 D, : 12400 D). Para verificação da cisão correcta das duas sequências de sinal foram sequenciados os seis ácidos aminados N-terminais das duas cadeias. Verificou-se que as duas cadeias apresentavam as terminações N correctas para as proteínas maduras. Assim ambas as pré-proteínas heterólogas foram correctamente cindidas através da peptidase de sinal bacteriana sem que seja possível reconhecer qualquer ponto de referência de que se seguiu um processamento impreciso ou uma reacção de desintegração N-terminal.
A constante de afinidade dos fragmentos Fy recombinantes de McPC603 foi medida com diálise equilibrada. Para este fim foram empregues as mesmas condições que fo ram utilizadas na determinação da constante de afinidade dos anticorpos nativos McPC603 isolados a partir de ascite de rato. O valor encontrado para o tratamento Fy de 1,21 + 0,06 x x 10 5 M é, dentro da precisão de experiência, idêntico ao valor relatado para o anticorpo nativo de 1,6 + 0,4 x 10^ M~l. A curva de ligação segundo Scatchard (Ann. N. Y. Acad. Sei. 51, 660 (1949)) é linear e a extrapolação indica que se encontram ligados aproximadamente 1 mol de hapteno por mol de frag mento Fy.
Deste modo, foi confirmado que só existe uma forma de locais de ligação por fragnento Fy e que na proteina isolada não estão presentes quaisquer componentes inactivos.
Mostrou-se assim surpreendentemente que se pode preparar o fragmento Fy no anticorpo McPC603 sob a forma de uma proteína completamente funcional e estável em E. coli . Deste modo foi provada a equivalência funcional do transporte no espaço do retículo endoplasmático da célula eucariótica. Esta equivalência é desconhecida e também insuspe_i tada uma vez que a proteína bacteriana até agora melhor caracterizada, a qual poderia ser definida como uma proteína heterodímera solúvel em periplasma, a penicilina-acilase de E. cq, li, é produzida através de processamento proteolítico em perí^ plasma a partir de um precursor de cadeia simples (G. Schumacher, D. Sizmann, H. Hang, P. Buckel e A. Bock, Nucleic Acids Res. 14, 5713 (1986)). Além disso foi já chamada a atenção de que segundo os conhecimentos actuais as bactérias não possuem enzimas ou proteínas que em eucariontes poderiam partici par no enrolamento.
Foi também surpreendente o facto de que o fragmento Fy de McPC603 possui sensivelmente a mesma constante de afinidade para fosforilcolina que o próprio anticorpo McPC603 intacto. Este resultado é inesperado visto que a funcionalidade dos fragmentos Fy é muito discutida na literatura (J. Sen e S. Beychok, Proteíns 1, 256 (1986)). Por aqui se mostra que uma modificação ou mesmo uma suspressão completa dos domínios constantes permitem conservar a funcionalidade .
Em oposição aos métodos até agora únicos para a preparação de fragmentos F^, nomeadamente através de proteólise de um anticorpo, os processos da presente invenção não apresentam qualquer problema com a proteínas não funcionais, incorrectamente enroladas, incorrectamente reassociadas ou modificadas quimicamente. Em geral o processo de isolamento preferido também é próprio para, com a ajuda de um adsorven te carregado de antigene ou de hapteno, purificar os fragmentos FV obtidos de acordo com os processos conhecidos, uma vez que tais impurezas não foram ligadas ou não foram eluídas.
Exemplo 1:
Preparação do plasmideo pASK 22 plasmideo de expressão pASK22 foi cons truido a partir do fragmento maior EcoRl-HindIII de pUC12 (C. Yanisch-Perron, J. Vieira e J. Messing, Gene 33, 103 (1985)), a partir de fragmentos dos vectores pIN III-OmpAl (Y.Masui, J.Coleman e M. Imouye em Experimental manipulation of gene expression, M. Inouye ed. Academic Press (1983)) e pH161 (H. Inouye, W. Barnes e J. Beckwith, J. Bacteriol. 149, 434 (1982)) bem como de diversos fragmentos de ADN sintjé ticos em várias fases com o auxilio de métodos conhecidos em si (T. Maniatis, E.F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982). A sequência de ADN completa do vector pASK.22 obtido desta forma é apresentada no quadro.
Com a mistura de ligação foram transfor madas células de E.coli competentes, que em seguida foram seleccionadas por resistência à amplicilina. Os plasmideos com a estrutura genética desejada foram caracterizados através de análises de restricção bem como de sequenciação das passagens criticas.
Exemplo 2 ·, Preparação dos fragmentos f^.
Uma cultura de estirpe de E.coli W3110 transformada com pASK22 foi cultivada em meio LB com 100 mg/ /1 de amplicilina até uma DO555 de 0,5. A expressão foi induzida através de adição de IPTG até uma concentração final de 1 mM. Após 45 minutos as células foram recolhidas por meio de centrifugação a 4 OOOg (10 minutos a 42C). Por meio da ressuspensão dos agregados celulares em tampão de TES (Tris-HCl 0,2 M, pH 8,0 ; EDTA 0,5 mM; sacarose 0,5 M ) em 10 ml/1 da cultura original foi efectuada uma fraccionação das células. As células foram expostas a um choque osmótico suave através de adição de 15 ml/1 da cultura original de tam pão TES, o qual foi diluído com 1:4 de água e continha fosforilcolina 2 mM. Após 30 minutos de incubação sobre o gelo, a suspensão foi centrifugada durante 10
minutos a 5000 g e o sobrenadante foi centrifugado novamente durante 15 minutos a 48 000 g. O sobrenadante assim obtido, que contém todas as proteínas periplasmáticas solúveis, foi * (R) concentrado por meio de ultrafiltraçao (membrana AMICON YM5) até um volume de cerca de 2,5 ml/1 da cultura original e foi dialisado contra tampão de BBS (borato 0,2 Μ/NaOH, pH 8,0; NaCl 0,16 M). Esta solução concentrada foi feita passar atra vés de uma coluna de afinidade (1 a 4 ml de solução por ml de volume de leito) carregada com um derivado de fosforilcolina (B. Chesebro e H. Mezger, supra), foi lavada com tampão de BBS e o fragmento Fy foi eluído com uma solução de de fosforil colina 1 mM em tampão BBS.
Exemplo 3:
Diálise equilibrada
Numa camâra de diálise com 100 ^ul de volume de cada lado da membrana carregaram-se de um lado 500 yul de fragmento Fv purificado em tampão BBS e do outro lado uma solução de 50 ^ul de fosforil(metil)- 4C)colina (50 mCi/mMol) em tampão de BBS. Para uma Οθ205 6,85 foi determinada para o fragmento Fy uma concentração de 0,22 mg/ml (R.K. Scopes, Protein purification principies and practice, Springer-Verlag, New York, 1982, p. 241). Após um equilíbrio de 22 horas à temperatura ambiente foram analisadas amostras de 20 jul de cada solução num contador de cintilação (Beckman LS 1801) e os dados foram aplicados segundo Scatchard (supra). A partir do aumento da linha obtida resultou uma constante de afinidade Ka = 1,21 + 0,06 χ 105 M_1.

Claims (2)

  1. REIVINDICAÇÕES
    - lê Processo para a preparação de anticorpos funcionais, de fragmentos de anticorpos funcionais ou de proteínas de fusão no domínio dos anticorpos e de outras proteínas caracterizado por se acoplarem os genes para cada uma das cadeias de cada sequência de sinal que realizam o transporte das cadeias de polipeptídeos através da membrana citoplasmática de uma célula bacteriana e que em seguida se cindem, se provocar a expressão das estruturas génicas numa bactéria e se isolarem as proteínas funcionais a partir do espaço periplasmático ou a partir do meio.
    - 2ê Processo caracterizado por a bactéria de acordo com a reivindicação 1, ser uma bactéria Gram-negativa.
    - 3ê Processo caracterizado por a bactéria de acordo com a reivindicação 2, ser E. coli.
    - 4ê processo de acordo com qualquer das reivin dicações 1, 2 ou 3, caracterizado por se acoplarem os genes para ambos os pré-peptídeos sob a forma de um sistema de operões regulável.
    - 5ê Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações anteriores, caracterizado por se submeterem as bactérias separadas a um choque osmótico a fim de se isolar a proteína funcional a partir do espaço periplasmático de tal modo que o periplasma seja feito sair da célula mas que o citoplasma fique intacto, se enriquecer a fase líquida obtida deste modo por centrifugação e se obter a proteína pretendida a partir deste concentrado.
    -16- 6ê Processo de acordo com uma ou várias das reivindicações anteriores, caracterizado por se adicionar a solução contendo a proteína funcional sobre um absorvente carregado com um antigene ou um hapteno correspondente e se eluir a proteína pretendida por isolamento com uma solução contendo um dos antigenes ou dos haptenos referidos.
    Os requerentes declaram que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 31 de Dezembro de 1987, sob ο ηθ.Ρ 37 44 595.2.
    Lisboa, 29 de Dezembro de 1988.
  2. 2 AC-íNT: CFiÇU; -ΊΟ.'-· FCUD-
    R E S U Μ Ο
    PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO POR MANIPULAÇÃO GENÉTICA DE ANTICORPOS
    A invenção refere-se a um processo para a preparação de anticorpos funcionais, de fragmentos de anticor pos funcionais ou de proteínas de fusão no domínio dos anti corpos e de outras proteínas que compreende acoplarem-se os genes para cada uma das cadeias de cada sequência de sinal que realizam o transporte das cadeias de polipeptídeos através da membrana citoplasmática de uma célula bacteriana e que em seguida se cindem, se provocar a expressão das estruturas genéticas numa bactéria e se isolarem as proteínas funcionais a partir do espaço peripíasmático ou a partir do meio.
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