PT89053B - Processo de preparacao de estruturas peptidicas, e imunogenios contendo-as destinados ao controlo da fertilidade - Google Patents
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Description
MEMÓRIA DESCRITIVA
Resumo presente invento tem por objecto um processo de preparação duma estrutura peptidica compreendendo pelo menos:
- a sequência 106-ll6 de uma B-CG ou de uma J3-LH
- uma sequência de pelo menos 5 amino-ácidos compreendendo pelo menos um residuo lisina.
LAVOR PHARMA S.A.
«PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE ESTRUTURAS PEPTIDICAS, E IMUNOGÉNIOS CONTENDO-AS DESTINADOS AO CONTROLO DA FERTILIDADE» ii
-2Estas estruturas são preparadas por síntese peptidica.
Estas estruturas podem ser utilizadas para a preparação de vacinas destinadas ao controlo da fertilidade.
I
Ο presente invento dis respeito à preparação de estruturas peptidicas © de imunogéneos sintéticos, compreendendo estas estruturas peptidicas e as suas aplicações particularmente à preparação de vacinas destinadas ao controlo da fertilidade nos humanos e nos animais.
presente invento dis respeito em particular à preparação de vacinas anti-hCG e de vacinas anti-Lll.
A hormona corionica gonadotropa humana (hCG) faz parte das hormonas glicoproteicas. Quatro destas hormonas apresentam um estreito parentesco de estrutura e são, além da hCG, a hormona luteiniznnte ou lutropina (hLIl), a folitropina (hFSH) e a tirotropina (hTSH) c compreendem cada uma das sub-unidades C*ie associadas por ligações não covalentes. A sub-unidade X é idêntica nas quatro hormonas e as sub-uniades apresentam uma importante homologia de estrutura. Em particular a ^»-hCG e a ^•hLH têm 82$ de residuos semelhantes e a f^-hCG difere essencialmente da (^-hLH pelos 30 residuos da extremidade terminal-C.
Esta homologia entre as sequências existe igualmente noutras espécies e regiões altamente conservadas no decurso da evolução são discerniveis não somente para a mesma hormona entre as diversas espécies (lh) mas também entre as hormonas (CG/LH).
Recordar-se-à além disso que as hormonas CG não existem senão nos mamíferos mais evoluidos e que nos outros animais a função das hormonas CG é substituída pelas hormonas LH.
Sabe-se que a hCG tem um papel importante no estabelecimento e no desenvolvimento da gravidez.
Se bem que o papel biológico da hCG não seja ainda totalmente conhecido parece que o seu papel principal é ser o sinal enviado pelo óvulo fecundado ao corpo amarelo para que este mantenha uma sintese de hormonas esteroidianas. Para ter uma acção biológica, a hCG deve primeiro que tudo fixar-se sobre os receptores presentes no ovário, essencialmente ao nivel do corpo amarelo.
Procurou-se já inibir a função da hCG para se dispor de um método imunológico de controlo de nascimentos.
Para este efeito, propuseram-se vacinas susceptiveis de induzir a formação de anticorpos anti-hCG.
Pode-se citar a este respeito a patente FR-74 15780 que descreve uma vacina compreendendo como antigénio, um polipêptido modificado quimicamente e de modo especial a hCG ou a ^-hCG modificadas quimicamente.
Pode-se tomar nota igualmente da patenfce FR-75 23 Ó73 que descreve uma vacina, compreendendo como antigénio um fragmento terminal-C do ^-hCG (contendo de 3θ u 38 residuos de ácidos aminados). Este fragmento foi escolhido para evitar as reacções cruzadas com as hormonas vizinhas e de um modo especial com a hLH.
Pode-se encontrar um balanço dos ensaios das vacinas anti-hCG no artigo de Vernon Stevens que apareceu em Immunology Today (Vol. 7» 369, 1986). Esta artigo analisa em particular os primeiros ensaios efectua-5-
dos em que foi utilizado como imunogênio a sequência 109-l45 da (5-hCG acopulado à anatoxina diftérica. Mas o autor concluiu na necessidade de desenvolver novas vacinas anti-hCG.
Ele reconheceu de facto que a imunogenicidade desta vacina é fraca e não permite obter uma taxa de anticorpos suficiente.
: A Organização Mundial de Saúde num relatório de 1985 (special progranun of research deve lopment and research training in human reproduction) ;í concluiu igualmente pela necessidade de encontrar novos lí ;i imunogónios, ;> Por outro lado, é notar que > Aushu Vashishtha e col., deram conta, por ocasião do 3rd
Interirfcional Congress of Reproduction Immunology, Toronto 1-5 Julho 198ú, da utilização como imunogénio dum péptido conjugado ã anatoxina tetânica compreendendo este péptido | a sequência 21-31 da p -hCG e a sequência 104-115 |^-hCGj -Tyr, estando estas duas sequências ligadas por uma ponte 1 dissulfureto.
Além disso, um artigo de Jean Michel Bidrat e Gol. em Molecular Immunology 24, 339,1987 dá conta de duas regiões imuno-dominantes na p-hCG, a saber, a região 110-116 e a região 134-139.
Descobriu-se agora que se obtinha uma actividade imunogénea importante associando por um lado uma região fortemente imunogénea da jf^-hGG, a saber a re gião a volta do residuo 112 da p?-hCG e de modo especial a região IO6-II6 da jj^hCG e, por outro lado, uma sequência de ácidos aminados compreendendo um residuo lisina, tal
corno os que se encontram nas sequências altamente conservadas no decurso da evolução das sub-unidades (X , e que era possível assim obter uma vacina anti-hCG.
Verificou-se igualmente que esta descoberta podia ser estendida a outras hormonas glicoproteicas e em especial às hormonas luteinizantes que têm um papel importante na reprodução de várias especies animais (gato, cão, etc.).
presente invento tem, em consequência, por objecto um processo de preparação duma estrutura peptidica compreendendo pelo menos:
- a sequência 106-ll6 duma^-CG ou de uma 'p-LH,
- uma sequência de pelo menos 5 ácidos aminados compreendendo pelo menos um residuo lisina.
í·
f.
presente invento tem, mais particularmente, por objecto uma estrutura peptidica compreendendo pelo menos:
- a sequência IO6-II6 da ^-hCG
- uma sequência de pelo menos cinco ácidos aminados compreendendo pelo menos um residuo lisina.
presente invento tem, além disso por objecto uma estrutura peptidica compreendendo pelo menos :
- a sequência IO6-II6 de uma p.LI-I
- uma sequência de pelo menos 5 ácidos aminados compreen1 dendo pelo menos um residuo lisina.
A sequência 106-116 da (^-hCG é a sequência ÍIPLTCDDPRFQ *
A sequência 106-ll6 da $-dLH (hormona luteinizante canina) é a sequência QSLACDRPLLP (ver NO 86/07383)»
A sequência de pelo menos 5 ácidos aminados compreendendo pelo menos um residuo lisina pode ser em particular uma sequência de umaôC-CG contendo pelo menos um residuo lisina, em particular a sequência 46-55 da ^-hCG, a sequência 45-4^ daoO-hCG, a sequência 43-55 da '%-hCG ou a sequência 4l-58 ou 59 da οζ-hCG.
Todavia outras sequências são possiveis na medida em que elas compreendam pelo menos um residuo lisina. Pode tratar-se em particular de uma sequência inversa duma sequencia da (X.-hCG contendo pelo menos um residuo lisina ou mesmo de uma sequência compreendendo, além de um residuo lisina, uma série qualquer de ácidos aminados .
Na estrutura peptidica segundo o invento, as duas sequências podem sex* combinadas sob a forma de um encadeamento linear, caso em que o residuo lisina
Para o significado dos símbolos dos ácidos aminados ver o anexo
Ό '·.
é vantajosamente separado por pelo menos 4 ácidos aminados da sequência 106-ll6 da -CG ou daJ^-LH. Neste encadeamento linear as sequências podem ser combinadas numa ordem qualquer, quer dizer que se pode ter por exemplo o encadeamento (sequência compreendendo a lisina) - (sequência 10 6-II6 -hCG·) ou o encadeamento (sequência IO6-H6 -hCG)h -(sequência compreendendo a lisina).
*1 Além disso, no encadeamento linear j( as duas sequências podem ser separadas por uma sequência intercalar ou spacer” compreendendo de 1 a 10 ácidos aminados.
il il í; As duas sequências podem ser ii ~
Ι igualmente combinadas sendo ligadas por uma ligação interí: molecular ou mesmo int ramo le cu lar. Assim as duas sequências
S podem ser ligadas por uma ligaçao entre o grupo -COOH de um dos dois restos ácido aspártico e o grupo NH^ livre do residuo lisina. No caso de uma ligação intramolecular a estrutura peptidica tem nesse caso a forma de uma fivela» j Para reforçar a imunogluicidade, j emparelha-se vantajosamente, de maneira conhecida, a estrutura peptidica a um portador» invento tem portanto igualmente por objecto um processo de preparação de um imunogéneo sintético compreendendo a estrutura peptidica segundo o invent acoplado a um portador.
«τ'
Os portadores podem ser particularmente portadores proteicos e de modo especial:
l) as anatoxinas:
. tetânica e a sua fracção II preparada segundo o processo de Covey e Col., Amer, J. Reprod, Immunol. Microbiol, 8, 43 (1985) . diftérica, coquelúchica.
2) as vacinas antidiarreicas (contida rotavírus, cólera, Shigelles, B. coli e Salmonella).
3) os virus da poliomielite e da febre ama.rela inactivados pelo calor e pela radiação.
4) as proteínas de membrana do esporozóito de P. Falciparum
5) a ELI-I (Keyhole Limpect Hemocyanin).
acoplamento pode ser realizado com a ajuda de um agente de acoplamento tal como o glutaraldeido, uma carboddimida ou a benzidina bis-diazotada.
glutaraldeido permite um acoplamento entre a proteina e o residuo lisina da sequência contendo pelo menos ura residuo lisina.
As carboddimidas permitem um acoplamento entre a proteina e um residuo ácido aspártico da sequência lOó-lló de uma P’ -CG ou de uma j^-LH (por exemplo na sequência lOó-lló da ^-hCG existem resíduos ácido aspártico em posições 111 e 112).
A benzidina bis-diazotada necessita para o acoplamento da presença de um residuo tirosina
-10sobre ο péptido. Com este fim um residuo tirosina é vantajosamente acrescentado ã extremidade da cadeia.
imunogénio sintético pode também ser constituido segundo a técnica do HAP (líultiple Antigenic Peptide) descrito por D. Posnett et al (J. Biol. Chem. 263, 17-19, 1988). Neste caso a sintese do péptido ó efectuada sobre uma matriz de polilisina previamente construída. Este processo permite obter um polimero do péptido possuindo uma massa molecular suficiente para ser imunogéneo.
presente invento tem, além disso por objecto um processo de preparação de uma •vacina anti-fertilidade que consiste em pôr uma estrutura peptidica segundo o invento ou de preferência um imunogéneo sintético segundo o invento sob uma forma farmaceuticamente aceitável.
presente invento tem em particular por objecto um processo de preparação duma vacina anti-hCG que compreende uma estrutura peptidica compreendendo pelo menosí
- a sequência lOó-llé da p-hCG
- uma sequência de pelo menos 5 ácidos aminados compreendendo pelo menos um residuo lisina ou um imunogéneo sintético compreendendo uma tal estrutura peptidica acoplada a um portador e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
“XI-
Μ
Ί
Η h
π
Ί
Ο presente invento tem alem disso em particular por objecto um processo de preparação de uma vacina anti-LIí que compreende uma estrutura peptidica compreendendo pelo menos:
- a sequência lOÓ-lló da^-LH
- uma sequência de pelo menos 5 ácidos aminados compreendendo pelo menos um residuo lisina ou um imunogénio sintético compreendendo uma tal estrutura peptidica acoplada a um portador e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
imunogéneo sintético acoplado ao seu portador é de preferência administrado após mistura < com adjuvantes de imunização. Poder-se-à, por exemplo, misíj turar o antigénio com o éster N-butilico (murabutido) do muramil dipéptido (MDP; N-acetilglucosamina-3il-acetil-Lj -alanil-D-isoglutamina) diluido numa solução salina. A misj tura pode ser em seguida emulsionada por meio de um volume igual de esqualeno em presença de arlacei (excipientes). ií É também possivel utilizar outros adjuvantes como os análogos do MDP, fracções bacterianas tais como as preparações estreptocécicas (OK 4-32), ou o Biostim (01k2) ou as prepara ções de lipolissacrideos modificados (LPs) de peptidoglicano j (N-Opaca) ou de proteoglicanos (lí-Pneumoniae). Para os excipientes, as emulsões água-em-óleo são preferíveis às emulsões óleo-em-água.
Pode-se igualmente administrar o imunogéneo sintético sob a fornia de partículas biodegradáveis, tais como as microcápsulas ou as microsferas, as preparações de lipossoma e as nanoparticulas. Neste caso, o imunogéneo é incluído na partícula. Estes processos têm por fim aumentar a duração da acção da vacina.
À administração da vacina faz-se por via parentérica (para as vacinas em suspensão) e eventualmente por via oral (para as vacinas administradas sob forma particular). Por exemplo, a emulsão pode ser injectada por via intramuscular no músculo tricipite. A quantidade de imunogéneo utilizada em cada injecção é variável porque ela depende da resposta imunitária de cada individuo Na prática, utilizam-se doses de 5θθ-1ΟΟΟ yg por injecção ou seja 1-20 yg/lcg de peso corporal. São dadas várias injecções até à obtenção de um titulo em anticorpos suficiente. Cada rappel é separado do seguinte por um período de 4 a 6 semanas. Controla-se a presença de anticorpos dirigidos contra a liCG e contra a proteina portadora eventual cindo dias apos o segundo rappel1’ e depois seis meses após a vacinação.
As vacinas segundo o invento podem além disso conter outros péptidos ou outro imunogéneos, presente invento tem igualmente por objecto um processo de controlo da fertilidade que consiste em administrar a uma fêmea uma vacina segundo o invento.
presente invento tem mais particularmente por objecto um processo de controlo de nascimentos que consiste em administrar a uraa fêmea uma vacina compreendendo uma estrutura peptidica compreendendo pelo meno s:
- a sequência lOé-llé da -LlCG
- uma sequência de pelo menos 5 ácidos aminados compreendendo pelo menos um residuo lisina ou um imunogéneo sintético compreendendo uma tal «gtrutur peptidica acoplada a um portador e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
Além disso as estruturas peptidicas compreender?, pelo menos
- a sequência 106-ll6 da ^-liCG·
- uma sequência de pelo menos 5 ácidos aminados compreendendo pelo menos um residuo lisina podem ser utilizadas para bloquear os receptores da hCG e impedir o desenvolvimento da gravidez.
presente invento tem, em consequência, igualmente por objecto uma composição para a interrupção da gravidez compreendendo a titulo de ingrediente activo uma estrutura peptidica compreendendo pelo menos:
- a sequência IO6-II6 da í^-hCG
- uma sequência de pelo menos 5 ácidos aminados compreendendo pelo menos um residuo lisina.
As estruturas peptidicas segundo o invento podem ser preparadas de maneira clássica por sintese peptidica em fase liquida ou sólida por acoplamentos sucessivos dos diferentes residuos de ácidos aminados a incorporar (da extremidade terminal-N para a extremidade terminal-C em fase liquida, ou da extremidade terminal-C para a extremidade terrainal-ÍT em fase sólida) e portanto as extremidades terminais-N e as cadeias laterais reactivas são previamente bloqueadas por agrupamentos apropriados, largamon te conheeidos.
Podem-se utilizar diferentes métodos de acoplamento:
1. Acoplamento dos residuos por uma carbodiimida (por ex., N-ciclo-hexil-N’-morfolinoetilcarbodiimida (CMECDl), diciclo-liexilcarbodiimida (DCC), N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDO)) com ou sem catálise (ex. 1-hidroxibenzotriazole (ϊ-ΣΟΒΤ/) ou outro agente de acoplamento (ex. N-etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-di-h.idroquinoleína (SEDQ))
2. Utilização dos ácidos aminados sob a forma de anidridos simétricos pré-áormados.
3. Utilização dos ácidos aminados sob a forma de ésteres activados (ex. p-nitrofeniléster, HOBT ester) e acoplamento pelo intermediário de DDC,
Prefere-se todavia utilizar a técnica de síntese em fase solida, dita técnica de Merrifield.
Segundo esta técnica, utiliza-se uma resina polímera porosa. Sobre esta massa de resina são enxertados agrupamentos funcionais, por diferentes métodos. 0 primeiro ácido aminado é então enxertado pela sua função carboxilica terminal; a sua função aminada terminal é então protegida por um agrupamento protector lábil sob certas condições. As cadeias laterais são também protegidas e permanecerão até ao fim da síntese»
Depois da desprotecção da função aminada terminal do ácido aminado fixado sobre a resina por um lado, e da activação da função carboxilica do ácido aminado a acoplar, por outro lado, a formação da ligação
-15peptidica 4 realizada. Depois da lavagem e da eliminação dos produtos da reacção, uma nova desprotecção pode ser empreendida para fixar um novo ácido aminado activado.
Numa última etapa tem lugar a separação do péptido, depois de ter, ou ao mesmo tempo, libertado as cadeias laterais dos seus diferentes agrupamenj tos protectores.
I
No caso em que o grupo protector da função aminada é o grupo t-butiloxicarbonilo (t.Boc), ele pode ser eliminado por tratamento da resina com ácido t rifluoro acético.
i; As cadeias laterais são então pro;J tegidas por agrupamentos resistentes à acção do ácido trifluoroacético isto é, tosilo para a arginina e para a histidina, benzilo para o ácido aspãrtico, benzil oxicarbonilo (z) para a lisina.
Logo que a sintese da totalidade da cadeia esteja efectuada, eliminam-se os grupos protecto; res dos diferentes ácidos aminados, particularmente com uma solução de ácido fluoridrico fracamente concentrado numa mistura paracresol/sulfureto de dimetilo e desprende-se o péptido da resina por exemplo com a ajuda duma forte í! concentração em ácido fluoridrico.
Si it i
Os exemplos seguintes ilustram o presente invento
I - Preparação das estruturas peptidioas
1) Preparação do péptido (sequência 46-55 da 0£-hCG)-( sequência 106-116 da -hCG) (TMLVQKNVTSHPLTCDDPRFQ ).
Realizou-se a sintese sobre um sintetizador automático Applied Biosystem Model 4lOÀ.
A função amina dos ácidos aminados foi protegida por ura grupo t-Boc e a desprotecção foi efectuada pelo ácido trifluoroacético.
A desprotecção final foi realisads com uma mistura contendo 6,5 ml de sulfureto de dimetilo, g de paracresol e 1 ml de HF para 1 g de resina péptida durante 1 h a OSC. A separação do peptido foi realizada a 09C com 10 ml de HF e 1 g de paracresol para 1 g de resina-péptida desprotegida.
péptido assim obtido é em seguida purificado por cromatografia de exclusão. É analisado após hidrólise ácida por cromatografia de permutas de uma IIPLC e detecção à ninidrina. A sequencia é igualmente verificada»
Coligiu-se no quadro I seguinte a estrutura do péptido assim preparado assim como as de outros péptidos preparado de maneira análoga.
Quadro I
Péptido do tipo Sequência de residuo Lys-Sequência 10é-llé
| 1 1 1 1 106-116 β-hCG 1 | |
| MIMOTOPO 1 com sequência 46-55 a-hCG | I 1 1 TMLVQKNVTSiHPLTCDDPRFQ 1 1 |
| MIMOTOPO 2 | 1 1 |
| com sequência °( inversa | STVNKQVLMTHPLTCDDPRFQ 1 1 |
| MIMOTOPO 3 com sequência 45-49 a-hCG | 1 1 KTLMLVHPLTCDDPRFQ 1 1 |
| MIMOTOPO 4 com sequência 43-49 tx-hCG | ---------------r l 1 SKKTMLVjHPLTCDDPRFQ 1 1 |
| MIMOTOPO 5 com sequência 43-55 a-hCG | 1 1 SKKTMLVQKNVTSÍHPLTCDDPRFQ 1 1 1 |
-182) Preparação de um péptido de residuo tirosina.
Preparou-se o péptido seguinte tendo em vista o seu acoplamento à KLH pela benzidina sobre o residuo tirosina. Este péptido está proetgido na extremidade terminal-G sob a forma -CONH^.
TtILVQiaTVTSHPLTCDDPRPQYG - CONH^
3) Preparação de um péptido do tipo MAP.
Preparou-se segundo a técnica descrita por Posnett et al (referência já citada) o péptido de tipo MAP tendo a férmuia seguinte P1 A
Pd-A-K-K-K-OH
P1 A na qual Ρχ = TMLVQKNVTSHPLTCDDPRVQ (mimotropo l).
-19II - Preparação de imunogéneos sintéticos
l) Acoplamento com a anatoxina tetânica
Acoplaram-se as estruturas peptidd cas mimotropos com a anatoxina tetânica utilizando como agente de acoplamento por um lado o glutaraldeido e por outro lado um derivado carbodiimida.
A. Acoplamento ao glutaraldeido
Este agente de acoplamento foi escolhido para permitir uraa ligaçao entre o agrupamento do residuo Lys e os agrupamentos g?-NH2 da proteina portadora.
esquema reaccional é o seguinr^-nh2 + och-(ch2)3-cho-s-nh2-r2 —>
R-j-NsCH- (CH2)3-CH=N-R2
PÔs-se em contacto o péptido e a proteina numa proporção 50/l no tampão bicarbonato O,1M, NaCl 0,15M, pll = 8,5.
Juntou-se gota a gota o glutaraldeido (diluido para 1/10 no mesmo tampão) de maneira a ter uma relação glutaraldeido/péptido de 50·
Deixou-se em contacto durante 2 horas (amarelecimento da solução sem precipitação) à temperatura ambiente.
Depois efectuou-se uma cromatografia de exclusão sobre coluna Sephadex G25.
Obteve-se com a estrutura peptidica mimotropo 1 uma relação péptido/proteina portadora = 24.
b) Acoplamento com um derivado carbodiimida hidrossoluvel.
Este agente foi escolhido para permitir uma ligação majoritária entre o ^-COOH de um residuo de grupo ácido livre (ácido aspártico : 111 ou 112) e os radicais NH^ da proteina portadora.
Utilizou-se como carbodiimida o
CMECDI.
Seis miligramas do péptido atrás definido são dissolvidos em 0,5 ml de tampão fosfato/NaCl.
À esta solução, adicionou-se 0,2 ml da solução de CMECDI, p-metiltolueno sulfonato (10 mg/ml). Após agitação, sãa adicionadas 5 mg de proteina portadora (anatoxina tetânica em solução a 6 mg/ml) à mistura péptido-agente de acoplamento e incubadas durante 2 h ã temperatura ambiente e sob agitação. 0 conjugado péptido-proteina portadora é em seguida purificado por uma cromatografia de exclusão e a detecção do conjugado faz-se graças a uma dosagem das proteínas pelo teste de Lowry, A relação moles de péptido/ moles de proteina portadora é determinado por meio de uma análise de ácidos aminados depois de hidrólise ácida. Com o mimotropo 1, esta solução é de 44 moles de péptido para uma mole de proteina portadora.
2) Acoplamento com KLH
Dissolve-se benzidina (18,8 mg) em
1,8 ml de ácido clorídrico 0,2M aquecendo ligeiramente entre 25SC a 3OSC para obter uma dissolução rápida e completa e depois arrefece-se e mantem-se a 02C.
Juntam-se gota a gota 200 /il de uma solução de nitrito de sodio a 14 mg/200 £l1 mantida a 02C.
Deixa-se a reacção prosseguir durante cerca de três minutos a Q-C e depois utiliza-se imediatamente esta preparação de benzidina bis-diazotada.
Misturam-seaO2C as duas soluções seguintes:
- 10 mg de ICLH (Keyhola Limpet Hemocyanin; M.M: 6,5 x 10 ) ou seja 1,5 mole em 750 μΐ de tampão borato O,1ÓM pH 9,1 contendo cloreto de sódio 0,15M (a fracção insolúvel de KLH é eliminada antes da utilização da solução).
- 3 moles de péptido (isto é, 8 mg para o péptido definido sob I 2) em 750 μΐ do mesmo tampão borato pH 9,1 atrás usado.
Adicionam-se gota a gota sob agitação 100 ;ul da solução de benzidina bis-diazotado#
Depois de somente um minuto de reacção efectua-se uma filtração sobre gel Sephadex G.25 M (Coluna Pharraaeia PD 10: 50 mm de altura por 15 mm de diâmetro) equilibrado antes de tudo por cloreto de sódio 0,l5M utilizado igualmente como fase eluente.
-22Recolhem-se fracções de 1 ml; as fracções 3 ® 4 (0,6 ml) são conservadas depois de se ter efectuado um teste à ninidrina sobre 10 pl d© cada fracção. 2stas duas fracções reunidas contêm o péptido acoplado à KLH. 100 pl são daí previamente tirados para uma hidroli se ácida (líCl ÓN + 0,1 $ fenol) a IIQSC durante 18 h. Depois da dosagem dos aminoácidos e proporção real é calculad sendo aqui R = 1520, o que corresponde a 3,75 mg/ml (6 mg/ / 1,6 ml).
III - Imunização
Foi efectuada uma imunização de pe lo menos 2 coelhos (Faure de Bourgogne) com cada imunogeneo.
Protocolo de imunização
1.1 Preparação do imunogéneo para uma imunização.
Diluiram-se em 500 pl de tampão fosfato 0,1 M pl-l = 7,4 NaCl 0,15M, 200 pg de equivalente péptido (isto é para a estrutura mimotropo 1 133 pl de solução proteica péptido/pr©teina portadora para o acoplamento ao glutaraldeido e 167 pg para o acoplamento ao CMB-CDI).
Adicionam-se extemporaneamente a estas duas soluções proteicas 500 pl de adjuvante de Freunc. completo ou incompleto, consoante o modo de injecção.
Emulsionou-se a mistura e procedeu-se à injecção.
1.2 Calendário da injecçâo
JO Reco3heu-se previamente uma amostra sanguinea (teste múnha). Injecçâo intradérmica da solução proteica + adjuvante de Freund completo (volume total ml). 10 a 20 pontos de injecçâo (região dorsal).
J+10 Injecçâo subcutânea da solução proteica + adjuvante de Freund incompleto (volume total 1 ml). I única injecçâo.
J + 20 Injecçâo subcutânea da solução proteica + adjuvante de Freund incompleto (volume total 1 ml).
J+22 Recolha de uma amostra sanguinea e controlo da presença e do titulo em anticoxpos.
J+30 Rappel” idêntico a J + 20
J+33 Recolha idêntica a J * 22 ...
1,3 Resultados da imunização método utilizado para detectar a presença de anticorpos dirigidos contra as hormonas e suas subunidades e a sua especificidade é baseado na dosagem radio-imunológica (RIA). As hormonas (hCG, hLH) e as suas subunidades ( ^*-hCG, ôC-hOGr) são marcadas por um elemento radioactivo (Ral 125) utilizando o processo de Fracker P.J. e Speck, J. C. Biochem. Biophys. Res. Commun. 80,84-9 (1978
Incuba-se o antí-soro a testar com as diferentes moléculas marcadas (traçadores): o anti-soro é diluido num tampão apropriado e uma quantidade constante de traçador o adicionado a cada diluição. Sm presença de anticorpos no soro, forma-se um complexo antigénio (molécula marcada) - anticorpo que pode ser precipitado pelo polietileno-glicol. Λ quantidade de radioactividade precipitado é proporcional à quantidade de anticorpos. A especificidade dos anticorpos é examinado da seguinte maneira: a uma diluição constante do anti-soro adiciona-se uma quantidade constante de liCG-I 125 a quantidades crescentes de moléculas a testar (liCG, P?-h.GG, £^-liCG, bLH . ..).
A especificidade do anticorpo é dada pela molécula que, à mais fraca concentração, dá um deslocamento significativo da ligação antigénio anticorpo (2 resultados das imunizações no coelho).
-25No quadro seguinte, dão-se os resul tados obtidos oom os imuno-soros recolhidos em J22 © provenientes da imunização com imunogénios constituídos por uma estrutura peptidica segundo o invento acoplado à anatoxina tetânica:
Quadro II
| Acoplamento Número | Número de respostas | ||||
| de | animais hCG- | positivas | hLH | ||
| -a hCG-β | hCG | ||||
| MIMOTOPO 1 com sequência | a* | 12 0 | 11 | 12 | 0 |
| 46-55 a-hCG | 8* | 18 0 | 13 | 14 | 0 |
| MIMOTOPO 2 | |||||
| com sequência 0( inversa | 8 | 2 0 | 0 | 1 | 0 |
| MIMOTOPO 4 | |||||
| com sequência 43-49 a-hCG | β | 2 2 | 0 | 2 | 1 |
| MIMOTOPO 5 | |||||
| com sequência 43-55 a-hCG | β | 2 1 | 2 | 2 | 1 |
$ Acoplamento «X> = pelo glutaraldeído, acoplamento^ por carbodiimida.
Este Quadro II põe em evidência os bons resultados obtidos com o minotopo 1 com uma imunização efectiva em quase todos os casos, em face da hGG e uma ausência de reactividade cruzada com a bLH.
Dar-se-ão a seguir os resultados das actividades de ligação média dos anti-soros obtidos contra o mimotopo 1 à hGG e às suas subunidades (média θ desvio padrão) (percentagem depois de diluição a 1/10 ).
QUADRO III
| Posição de Numero de acoplamento animais | hGG- ÍX | Ligação à: | |
| hCG- p | hCG | ||
| 10 | 0 | 21(12) | 32(17) * |
| fb 10 | 0 | 21(17) | 19(15) * ‘ |
t = 1,51 * * t =0,18
Significativo a ρ·< 0,05 para t } 1,81
-28“
Às actividades dè ligação medidas hCG e sua subunidade 'p’ mostram que o acoplamento do peptidc à sequência IX. dá uma ligação dos anti-soros obtidos com o mimofcopo 1 superior para a hCG.
IV - Actividade biológica dos anti-soros
Determinou-se a neutralização do efeito biológico da hCG por um anti-soro de coelho em ratazanas medindo a inibição da ovulação.
Para este efeito, duas ratazanas por grupo foram injectadas com: l) o soro pré-imune,
2) o soro imune dirigido contra o mimotopo l^C. obtido num coelho, 3) soro fisiológico. Oito horas depois, 500 mUI de hCG foram administradas. Os animais são sacrificados ao fim de 4 horas e nota-se o aparecimento ou a ausência (-) de folículos hemorrágicos em cada ovário.
Soro
Anti-soro pré-imune
Soro fisiolégic
Ovários Ovários Ovários
12 12
Ratazana 1
Ratazana 2 h
Estes ensaios põem em evidência uma actividade antagonista dos anti-soros antimiraotopo 1 sobre a produção de folículos ovarianos.
| Símbolos dos | ácidos aminados | |
| A | Ala | alanina |
| C | Cys | cisteina |
| D | Asp | ácido aspártico |
| E | Glu | ácido glutâmico |
| F | Phe | fenilalanina |
| G | Gly | glicina |
| II | His | histidina |
| I | lie | isoleucina |
| E | Lys | lisina |
| L | Leu | leucina |
| M | Met | metionina |
| N | Asn | asparagina |
| P | Pro | prolina |
| Q | Gin | glutamina |
| R | Arg | arginina |
| S | Ser | serina |
| T | Thr | treonina |
| V | Vai | valina |
| W | Trp | triptofano |
| Y | Tyr | tirosina |
(BjeSSESEKE,
Claims (14)
- REIVINDICAÇÕES;1&. - Processo para a preparação de uma estrutura peptidica compreendendo pelo menos- a sequência 106-116 de uma p-OG ou de uma B-LH- uma sequência de pelo menos 5 amino-ácidos compreendendo pelo menos um residuo lisina, caracterizado por se preparar a estrutura, por uma síntese peptidica compreendêndc o acoplamento sucessivo dos diferentes residuos de amino-ácidos.
- 2&. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se preparar uma estrutura peptidica, compreendendo pelo menos- a sequência IO6-II6 da p-hCG- uma sequência de pelo menos 5 amino-ácidos compreendendo pelo menos um residuo lisina.
- 3‘-. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se preparar uma estrutura peptidica, compreendendo pelo menos- a sequência loó-lló de uma B-LH- uma sequência de pelo menos 5 amino-ácidos compreendendo pelo menos um residuo lisina.-324ã. - Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por se preparar uma estrutura peptidica, compreendendo- a sequência 106-116 da p-iiCG- uma sequência de pelo menos 5 amino-ácidos de uma -CG compreendendo pelo menos um residuo lisina.
- 5-. - Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por se preparar uma estrutura peptidica compreendendo- a sequência 106-116 da p-hGG- a sequência 46-55 daíX-hCG.
- 6&. - Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por se preparar uma estrutura peptidica, compreendendo- a sequencia 106-116 da p-íiCG- a sequencia 45-49 da gZ -h.CC.
- 7£ - Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por se preparar uma estrutura peptidica, compreendendo- a sequência lOÓ-lló da E-liCG- a sequência 43-55 da ^Z-hCG.Processo de acordo com a rei vindicação 1 caracterizado por se preparar uma estrutura peptidica na qual as duas sequências são combinadas sob a forma de um encadeamento linear.
- 9-. - Processo de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por se preparar uma estrutura peptidica, n a qual o residuo lisina está separado pelo menos por 4 amino-ácidos da sequência IO6-II6 da p-CG ou da p-LI-I.
- 10a. - Processo de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por se preparar uma estrutura peptxdica, compreendendo o encadeamento linear (sequência compreendendo pelo menos um residuo lisina)-(sequência 106-II6 da p-hCG.
- 11&. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por se preparar uma estrutura peptidica compreendendo o encadeamento linear .(sequência 46-55 da -hCGH)-(sequência I06-H6 da p-hOG).
- 12 - Processo para a preparação de um imunogénio sintético compreendendo uma estrutura peptxdica obtida por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por se acoplar a estrutura peptidica a ura portador.
- 13- Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o portador ser a anatoxina tetânica.- Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o portador ser acoplado a um residuo lisina da sequência que compreende pelo menos um residuo lisina.
- 15-. - Processo de acordo com a reivindicação l4, caracterizado por o acoplamento ser realizado pelo glutaraldeido.l6^. - Processo de acordo com a reivindicação 12 ou com a reivindicação 13, caracterizado por o portador ser acoplado a um dos amino-ácidos da sequência 106-116 da B-hGG.Γ72. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o portador ser acoplado a um dos residuos ácido aspártico da sequência I06-II6 da p-h.CG.
- 18- Processo para a preparação de uma vacina antifertilidade, caracterizado por se por uma estrutura peptidica obtida por um processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11 ou um imunogénio sin tático obtido por um processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 a 17, sob uma forma farmaceuticamente aceitável.
- 19-. - Processo para a preparação de uma vacina anti-hCG caracterizado por se por uma estrutura peptidica obtida por um processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 e 4 a 11 ou um imunogénio sin tático compreendendo uma tal estrutura peptidica acoplada a um portador, sob uma forma farmaceuticamente aceitável.2QS. - Processo para a preparaçao de uma vacina anti-LH, caracterizado por se pôr uma estrutura peptidica obtida por um processo de acordo com a reivindicação 3 ou um imunogénio compreendendo uma talestrutu ra peptidica acoplada a um portador, sob uma forma farmaceuticamente aceitável.
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