CA2157868A1

CA2157868A1 - Trousse de diagnostic d'un cancer secretant l'hcg ou des fragments d'hcg et moyens destines a l'immunotherapie d'un tel cancer

Info

Publication number: CA2157868A1
Application number: CA002157868A
Authority: CA
Inventors: Dominique Bellet; Frederic Troalen; Nathalie Rouas-Freiss; Jean-Michel Bidart
Original assignee: Individual
Current assignee: Cephalon France SAS
Priority date: 1993-03-11
Filing date: 1994-03-10
Publication date: 1994-09-15
Also published as: JPH08507604A; AU6211294A; NZ262435A; EP0688432A1; WO1994020859A1

Abstract

L'invention a pour objet une trousse de diagnostic d'un cancer secrétant l'hCG ou des fragments d'hCG comprenant un ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG. L'invention a également pour oyet l'utilisation d'un polyleltide correspondant à au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG pour la fabrication d'une composition destinée à l'immunothérapie de cancers secrétant l'hCG ou des fragments d'hCG.

Description

W O 94/208~9 2 ~ 8 PCT/FR94/00265 Trousse de diagn~stic d'un cancer secrétant l'hCG
ou des frA~Pnt~ d'hOG et mDyens destines ~ l'immunothérapie d'un tel cancer. i La présente invention concerne une méthode de traitement d'un cAnC~r secrétant l'hCG ou des fragments d'hCG et des moyens pour la mise en oeuvre de cette méthode.
L'hormone chorionique gonadotrope hl~m-~ne (hCG) est une glycoprotéine oligomérique constituée de l'association non covalente de deux sous-unités a(hCG-) et ~(hCG-~). Elle appartient à la famille des hormones gonadothyréotropes comprenant également l'hormone folliculotrope (FSH), l'hormone lutéotrope (LH) et l'hormone thyréotrope (TSH). L'hCG est secrétée physiolo-giquement par le trophoblaste dès le début de la gros-sesse et stimule le corps jaune pour maintenir la synthèse d'hormones stéroidiennes essentielle à l'implan-tation de l'embryon. Par ailleurs, l'hCG et/ou ses sous-unités sont également secrétées par une ma~orit~ de tumeurs trophoblastiques et certaines tumeurs non trophoblastiques, constituant ainsi des marqueurs biologiques pouvant aider au diagnostic ou au pronostic et à la surveillance de ces tumeurs (Bellet et al. Rev.
Prat. 40:1677-1990).
La séquence des acides ~ml n~C de l'hCG a été
décrite par Morgan F. J. et al. The amino acid sequence of Human chorionic gonadotropin, J. Biol. Chem. 250, 5247, 1975.
Au sein de la population normale, des taux sériques très faibles d'hCG dimérique sont retrouvés chez l'homme (<0,05 ng/ml correspondant à la limite de détection de la méthode utilisée) et chez la femme non ménopausée (<0,1 ng/ml). L'hCG est principalement détectable chez 30~ des femmes de plus de 45 ans (de 0,1 à 1 ng/ml). Plusieurs études suggèrent que l'hCG présente dans le sérum des sujets sains serait produite par des 2157~68 cellules hypophysaires. L'hCG-a est détectable chez l'homme sain (<1 ng/ml) et la femme de plus de 45 ans non ménopausée (<3 ng/ml). En revanche, l'hCG-~ n'est pas détectable dans la population normale.
Dans le cas de tumeurs trophoblastiques on a montré que les tumeurs placentaires bénignes (males hydatiformes) et malignes (choriocarcinomes) sont caractérisées par un rapport hCG/hCG-~ sérique important:
le pourcentage d'hCG-libre qui est de 0,05 à 1~ lors de grossesses normales s'éleve à 1-5% en cas de môle et dépasse 5~ dans les choriocarcinomes. Ce rapport hCG/hCG-~ sérique est utilisé comme un t~moin d'évolution des tumeurs testiculaires : un pourcentage d'hCG-~ devenant inférieur à 5~ est souvent caractéristique d'une évolu-tion favorable de la tumeur au cours du traitement. Ce rapport s'élèvera rapidement en cas d'évolution défavora-ble ou de rechute.
Dans le cas de tumeurs non trophoblastiques, Marcillac et al. Cancer Res. 52:3901, 1992 ont montré que l'hCG-~, non détectable chez les individus sains, est retrouvée chez de nombreux patients atteints de certaines tumeurs non trophoblastiques (tumeurs de la vessie, du pancréas, du col de l'utérus, les tumeurs sans primitif retrouvé, les tumeurs de 1'endomètre et du poumon).
Par ailleurs W0-A 90/02759 décrit un produit dit UGP qui est un mélange ou une combinaison de trois frag-ments peptidiques dont l'un est la ~-hCG et les deux autres sont dits différents des peptides présents dans la ~-hCG.
Sous une définition tres générale, ce document définit des agents de diagnostic pouvant etre constitués par l'UGP, alors qu'en pratique ce sont les anticorps qui sont utilisés.
EP-A-0~ 323 769 décrit des peptides comprenant FEUIL~E MODlFlEE

~1 ~78~8 2bis essentiellement une séquence de la ~-hCG couplée à une séquence de l'a-hCG pour constituer un vaccin antifertili-té. Ces peptides sont destinés à induire la formation d'anticorps.
US-A-4 201 770 décrit essentiellement également un vaccin antifertilité. Ce vaccin comprend une hormone (telle que CG) ses sous unités ou des fragments de ces sous unités qui ont été modifiés par couplage avec un matériau non endogène.
W0-A-92/07272 décrit simplement une méthode pour détecter entre autres un cancer et qui consiste à recher-cher la présence de "sérum gonadotropin peptide complex"
après dissociation.
La présente invention a pour objet une méthode de traitement d'un cancer secrétant l'hCG ou des fragments d'hCG qui consiste à
- identifier dans le sérum d'un patient à
l'aide d'un ensem~le de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG, un état d'immunisation vis-~-vis d'un de ces polypeptides.
- administrer au patient au moins un polypep-tide correspondant à l'antigène responsable de l'état d'immunisation.

FEI~ILLE MODIFIE~

~ wO 94/2085g 2 1 a 7 8 6 8 PCT~4/00265 Dans le cadre de la présente invention les polypeptides sont formés par un enchalnement de 9 a 40 aminoacides correspondant à une partie de la sequence primaire de l'hCG. Il peut s'agir en particulier de polypeptides comportant de 15 a 40 aminoacides ou, dans le cas de polypeptides susceptibles d'être re~on~ll~ par des lymphocytes T cytotoxiques, de polypeptides plus courts ayant notamment de 9 à 11 aminoacides.
On designe par ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG un ensemble de polypeptides tels que définis ci-dessus gui correspondent à des séqllenc~c sllrcecsives de l'hCG ou de ses fragments ou mieux qui correspondent à
des séquences qui se chevauchent.
On peut par exemple utiliser un e~ce~hle de polypeptides correspondant aux séquences suivantes :
hCG-a 1-20 hCG-~ 1-20 De préférence on utilisera au moins un ensemble de polypeptides qui recouvre la séquence primaire de la sous-unité ~ de l'hCG ou au moins une partie de cette séquence.

W094/20859 - PCT~94/00265 ~

2~S~ ~G~ 4 Il est à noter que la synthèse de la sous-unité ~ est sous la dépPn~nce d'un groupe multigénique comportant 7 gènes (T~l~s~ge et al., Nucl. Acids Res. 12, 8415, 1984).
L'analyse des séqll~nc~c nucléotiques montre que trois de ces gènes (1, 3, 5) ont une structure identique, quatre autres de ces genes (2, 6, 7 et 8) codent un variant au niveau du codon 117 avec substitu-tion de 1' A 1 An ~ ne a la place d'un acide aspartique. Une étude de l'expression des genes (Bo et al., J. Biol.
Chem., 267, 3179, 1992) montre que les gènes 1, 3 et 5 sont exprimés par le placenta normal.
On pense que dans les processus de tumorogé-nèse intéressant les cellules non trophoblastiques l'expression de plusieurs gènes conduit à la fois à la sécrétion de la protéine normale et d'une protéine mutée en 117.
Dans la présente invention on désigne donc par sous-unité ~ à la fois la protéine normale et la protéine mutée en 117.
Par "polypeptide correspondant à l'antig~ne responsable de l'état d'immunisation on désigne un polypeptide qui a la même séquence que l'un des polypep-tides responsable de l'état d'immunisation ou une séquence résultant de la combinaison de séqll~n~ec au moins partielles des polypeptides responsables de l'état d'immunisation.
L'état d'immunisation vis-à-vis d'un des polypeptides peut ~tre identifié par un test de stimula-tion de la prolifération des lymphocytes T par les polypeptides, ou encore par un test de cytotoxicité des lymphocytes T vis-~-vis des polypeptides.
Dans le cas de lymphocytes T cytotoxiques, les polypeptides r~onn-lc sont formés par un enchafnement d'au moins 9 aminoacides correspond~nt à une partie de W094/208~9 215 7 ~ ~ 8 PCT/~ 4/0026S

la séquence primaire de l'hCG. Pour être reconnus par les lymphocytes T cytotoxiques, les polypeptides interagis-sent avec les molécules de classe I du complexe ma;eur d'histocompatibilité du patient.
Chaque molécule de classe I interagit avec des peptides comportant des motifs précis. On peut par exemple utiliser les polypeptides correspondant aux séquences suivantes de l'hCG-~ :

3 - 12

4 - 12 W094/20859 PCT~94/00265 134 - 143.
On peut également mettre en évidence la pr~c~n~e éventuelle d'anticorps sériques spécifiques de l'hCG ou de ses fragments. Ces anticorps peuvent être mis en évidence notamment par une méthode immuno-enzymatique telle qu'une méthode ELISA.
La présente invention a également pour ob~et une trousse de diagnostic d'un cAncer secrétant l'hCG ou des fragments d'hCG comprenant un ensemble de polypepti-des recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG.
La présente invention a également pour objet une composition destinée à l'immunothérapie de cancers secrétant l'hCG ou des fragments d'hCG comprenant une dose efficace d'un polypeptide correspondant ~ au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG et notamment un polypeptide correspondant a au moins une partie de la s~quence primaire de la sous-unité ~ de l'hCG et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide correspondant ~ au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG et notamment d'un polypeptide correspondant à au moins une partie de la séquence primaire de la sous-unité ~ de l'hCG pour la fabrication d'une composition destinée à l'immunothérapie de c~n~-~rs secrétant l'hCG ou des fragments d'hCG.
Pour la thérapie on peut utiliser les poly-peptides sous forme libre ou sous une forme plus immuno-gène, notamment une forme dans laquelle le peptide estcoupl~ ~ une matrice de polylysine selon la tec~ni que du MAP (Posnett et al. J. Biol. Chem. 263, 17, 1988).
En outre, pour la thérapie on ~i ni stre le polypeptide avantageusement avec un agent ad;uvant de l'; In~ té. Comme exemples d'adjuvants de l'i ~ni té on wo 94,2085g ~ 8 6 8 PCT/FR94/0026~
-peut citer le muramyldipeptide et le SAF-l (Allison et al., J. Immunol. Methods 45, 157, 1986).
On peut également administrer le polypeptide couplé à des nanosphères ou à des nanoparticules telles t 5 que celles décrites dans EP 02 40 424.
Enfin, le polypeptide peut être protégé à ses extrémités NH2 et COOH terminales afin de réduire les risques de dégradation.
Dans le cas du traitement de certains ~nc~rs et notamment dans le cas du c~ncer de la vessie, on peut également administrer en plus de façon concomitante ou en mélange du vaccin BCG (Bacille de Calmette Guérin) constitué par des souches vivantes atténuées de bacille tuberculeux (voir notamment D. Lamm et al, New England Journal of Medicine 325, 17, 1205, 1991).
La présente invention a donc en outre pour ob~et une composition destinée à l'immunothérapie de c~ncers secrétant l'hCG ou des fragments d'hCG comprenant une dose efficace d'un polypeptide corresponA~nt à au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG et une dose efficace de BCG dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
En pratique l'immunothérapie peut être réalisée avec des doses de polypeptides de 1 à 100 mg administrés notamment au niveau de la tumeur. Par exemple, les polypeptides peuvent etre administrés dans le cas d'un c~nc~r de la vessie, comme cela est pratiqué
dé~à dans le cas d'une immunothérapie par le BCG, c'est-à-dire par instillation intravésicale une scm~ne après la résection de la tumeur, puis cette administration est répétée chaque semaine pen~nt 6 semaines et des admi-nistrations intravésicales supplémentaires sont effec-tuées 3, 6, 12, 18 et 24 mois après. Des ~ n~strations perCut~n~c ou par voie gén~rale sont ~galement possi-bles.

W094/20859 PCT~4/00265 2 ~ 8 DescriPtion des figures.
La Fig. 1 représente la prolifération deslymphocytes provenant d'un patient ayant un cAn~-~r de la vessie en présence d'hCG, des sous-unités a et ~ libres et de différents polypeptides.
La Fig. 2 représente la prolifération des lymphocytes provenant d'un autre patient ayant un c~ncer de la vessie en présence des sous-unités a et ~ libres et de differents polypeptides.
La Fig. 3A représente la prolifération des lymphocytes provenant d'un patient ayant un c~nc~r de la vessie en pr~sence de différents polypeptides.
La Fig. 3B représente la prolifération des lymphocytes provenant d'un patient ayant un cancer du testicule en pr~s~nce de différents polypeptides.
On donnera ci-après le compte-rendu d'essais de diagnostic.
l) Isolement des cellules mononuclées (PBMC) par qradient de ficoll :
Le sang total hépariné prélevé sur des patients présentant un c~nc~r est déposé sur une solution de ficoll-hypaque (1,077 g/l) dans un tube conique. Le tube est centrifugé 30 mn à 9OO g, 18-20C. La couche correspondant aux cellules mononuclées est récupérée ~
l'aide d'une pipette. Les cellules sont lavées dans du tampon de HANKs.
2) Test de ~rolifération lymPhocytaire Les PBMC sont cultivés (2x105 cellules par puits) dans du RPMI 1640 additionné de 10% de sérum humain AB, 2mM de L-glutamine, lOO UI/ml de p~n~ C~ 1 1 ine et lOO ~g/ml de streptomycine, en présence de polypeptide à différentes concentrations. Les cellules sont alors mises à incuber à 37C avec 5% de CO2 pendant 5 jours. Un ~Ci de thymidine tritiée est ensuite ajouté dans chaque puits. Les cellules sont collectées 18 heures après et W094/20859 PCT~94/00265 21~7~6~
~ t l'incorporation de la radioactivité est analysée par spectrométrie dans un liquide de scintillation utilisant un compteur ~.
On a donné sur la Fig. 1 les résultats de prolifération des lymphocytes provenant d'un patient ayant un c~cer de la vessie en présence - du milieu de culture (M) - de l'hCG et de ses sous-unités a et ~
- de différents polypeptides appartenant aux sous-unités a et ~.
Les résultats mettent en évidence une prolifération significative avec le polypeptide corres-pondant à la séquence 95-115 de la sous unité ~ de l'hCG
ainsi qu'avec le polypeptide correspondant à la séquence 25-59 de la sous unité a de l'hCG.
Les polypeptides 95-115 hCG-~ et 25-59 hCG-a peuvent être utilisés pour une immunothérapie chez le patient testé.
On a donné sur la Fig. 2 des résultats du meme type sur des lymphocytes d'un autre patient ayant un c~n~e~ de la vessie. Les résultats mettent en évidence une prolifération significative avec le polypeptide correspondant à la séquence 31 - 50 de la sous-unité ~
de l'hCG ainsi qu'avec le polypeptide correspon~nt à la séquence 41 - 61 de la sous-unité de l'hCG. Chez ce patient les polypeptides 31 - 50 de l'hCG-~ et 41-61 de l'hCG-a peuvent être utilisés pour une immunoth~rapie.
On a donné sur la Fig. 3A les résultats de tests de prolifération de PBMC d'un autre patient ayant un cancer de la vessie secrétant la sous-unité ~ de l'hCG
en présence de diff~rents polypeptides recouvrant la totalité de la sous-unité ~ de l'hCG (50 ~m).
Les résultats montrent que pour ce patient le polypeptide correspondant à la région ~ (20-47) de l'hCG
est le plus efficace pour induire une prolifération des W094/20859 PCT~94/00265 ~31 ~ 10 cellules T.
Par ailleurs, d'autres tumeurs (pancréati~ues et testic-llA~es) ont été étudiées. Les cellules T d'un patient, présentant un cancer du testicule, secrétant de l'hCG-~, ont proliféré en pr~s~nc~ du peptide hCG-~ (20-47) (Fig. 3B).
Ces résultats montrent que des peptides correspo~nt a une partie de la s~quence de l'hCG-~ sont immunogéniques chez des malades ayant une tumeur produc-trice d'hCG-~ et peuvent ainsi ~tre utilisés pour développer une immunothérapie antitumorale.
A l'inverse, aucune réponse contre l'hCG, ses sous-unités ou des peptides de structure analogue n'a été
observée chez 21 femmes enc~ntes.
On donnera ci-après les résultats ainsi obtenus.
Réponse immune cellulaire contre l'hCG ou ses sous-unités.
Populations test~es ~otal ~pon~~
20Tumeurs vésicales 21 5 Tumeurs hCG~+ 14 5 Tumeurs hCG~- 7 O
Femmes ~nc~i nteS 21 0 Su~ets sains 13 0 3) Test de CYtotoxicit~
Les PBMC isolés par gradient de Ficoll sont testés pour leur action cytotoxique vis-a-vis de cibles autologues (lymphocytes B du patient immortalisés par l'Epstein-Barr virus) marqu~es du chrome 51 et servant de cellules présentatrices des polypeptides de l'hCG. La cytotoxicité est évaluée par le comptage de la radioacti-vité due au relargage du 51Cr de la cible lysée.

Claims

REVENDICATIONS

1. Trousse de diagnostic d'un cancer secré-tant l'hCG ou des fragments d'hCG comprenant un ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG.

2. Trousse de diagnostic selon la revendica-tion 1, comprenant un ensemble de polypeptides qui recouvre la séquence primaire de la sous-unité .beta. de l'hCG (hCG-.beta. ou hCG-.beta.-Ala 117).

3. Trousse de diagnostic selon la revendica-tion 1, comprenant un ensemble de polypeptides qui recouvre au moins une partie de la séquence primaire de la sous-unité .beta. de l'hCG(hCG-.beta. ou hCG-.beta.-Ala 117).

4. Trousse de diagnostic selon l'une quelcon-que des revendications 1 à 3, comprenant des polypeptides ayant de 9 à 40 aminoacides.

5. Trousse de diagnostic selon l'une quelcon-que des revendications 1 à 4, comprenant des polypeptides dont les séquences se chevauchent.

6. Utilisation d'un polypeptide correspondant à au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG
pour la fabrication d'une composition destinée à l'immu-nothérapie de cancers secrétant l'hCG ou des fragments d'hCG.

7. Utilisation selon la revendication 6, dans laquelle le polypeptide correspond à au moins une partie de la séquence primaire de la sous unité .beta. de l'hCG (hCG-.beta.
ou hCG-.beta.-Ala 117).

8. Utilisation selon la revendication 6 ou la revendication 7, dans laquelle le ou les polypeptides ont de 9 à 40 aminoacides.

9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, dans laquelle le polypeptide est couplé à une matrice de polylysine.

10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, comprenant en outre un agent adjuvant de 1'immunité.

11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, dans laquelle le polypeptide est protégé aux extrémités NH2 et COOH terminales.

12. Composition destinée à l'immunothérapie de cancers secrétant l'hCG ou des fragments d'hCG
comprenant une dose efficace d'un polypeptide correspon-dant à au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG et une dose efficace de BCG dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

13. Méthode de diagnostic in vitro en vue du traitement d'un cancer secrétant l'hCG ou des fragments d'hCG qui consiste à identifier dans le sang circulant d'un patient à l'aide d'un ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG, une réponse immune vis-à-vis d'un de ces polypeptides.

14. Méthode selon la revendication 13, dans laquelle la réponse immune vis-à-vis d'un des polypeptides est identifié par un test de stimulation des lymphocytes T par les polypeptides.

15. Méthode selon la revendication 13, dans laquelle on met en évidence la présence éventuelle d'anticorps sériques spécifiques de l'hCG ou de ses fragments.

16. Méthode selon la revendication 13, dans laquelle la réponse immune vis-à-vis d'un des polypeptides est identifié par un test de cytotoxicité
des lymphocytes T vis-à-vis des polypeptides.

17. Méthode de traitement d'un cancer secré-tant l'hCG ou des fragments d'hCG qui consiste à
- identifier dans le sérum d'un patient à
l'aide d'un ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG, une réponse immune vis-à-vis d'un de ces polypeptides.

- administrer au patient au moins un polypep tide correspondant à l'antigène induisant la réponse immune.

18. Méthode selon la revendication 17, dans laquelle l'ensemble des polypeptides recouvre au moins une paratie de la séquence primaire de la sous unité .beta. de l'hCG(hCG-.beta. ou hCG-.beta.-Ala 117).

19. Méthode selon la revendication 17 ou la revendication 18, dans laquelle les polypeptides ont de 9 à 40 aminoacides.

20. Méthode selon la revendication 19, dans laquelle les séquences des différents polypeptides se chevauchent.

21. Méthode selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, dans laquelle la réponse immune vis-à-vis d'un des polypeptides est identifié par un test de stimulation des lymphocytes T par les polypep-tides.

22. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, dans laquelle on met en évidence la présence éventuelle d'anticorps sériques spécifiques de l'hCG ou de ses fragments.

23. Méthode selon la revendication 13, dans laquelle la réponse immune vis-à-vis d'un des polypeptides est identifié par un test de cytotoxicité
des lymphocytes T vis-à-vis des polypeptides.

24. Méthode selon l'une quelconque des revendications 17 à 23, dans laquelle on administre avec le polypeptide un agent adjuvant de l'immunité.

25. Méthode selon l'une quelconque des revendications 17 à 24, dans laquelle on administre de façon concomitante à l'administration du polypeptide ou en mélange avec le polypeptide, du BCG.