PT88889B - Processo para modificar as condicoes da interaccao entre celulas sensiveis de um hospedeiro e um agente patogenico pela utilizacao de dinitro-trinitrofenilo e dos seus derivados ou de anticorpos anti-nitrofenilos - Google Patents
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Description
A presente invenção diz respeito a um processo para a modificação das condiçães de interacção entre células sensíveis de um hospedeiro e um agente patogénico. De um outro ponto de vista, tem por objecto a aplicação de nitro-fenilos e dos seus derivados ou de anticorpos anti-nitrofenilos policlonais ou manoclonais, para modificar a interacção entre células sensíveis de um hospedeiro e um agente patogénico.
Por célula sensível entende-se qualquer célula de hospedeiro capaz de ser afectada de modo patológico por um agente patogénico, resultando o efeito patológico especialmente da introdução do agente patogénico nas células ou da sua fixação sobre estas últimas por exemplo sobre um receptor apropriado destas.
Células sensíveis constituindo alvos para alguns agentes patogénicos são especialmente os linfócitos T ou B, ou os timócitos, os fibroblastos, as células rehaisjÇtc
agente patogénico em causa é frequentemente um microrganismo, por exemplo um vírus, ou uma molécula ou um agregado de moléculas capaz de interferir com o metabolismo celular, logo que penetra nas células sensíveis definidas antes ou reage com aquelas de qualquer outra maneira, por exemplo quando o agente patogénico é um auto-anticorpo.
Observou-se já na ocasião da interacção in vivo entre um agente patogénico, por exemplo um vírus infeccioso e as células sensíveis, uma modificação da taxa de anticorpos naturais (AcN) no hospedeiro atingido pela doença infecciosa ou autoimune correspondente. Estes AcN são anticor pos presentes nos soros e líquidos biológicos de seres humanos e de animais, capazes de reconhecer antigénios (Ag) do ”eu e do não eu. Estes AcN existem nos líquidos biológicos mesmo quando os homens e os animais não foram previamente intensionalmente imunizados contra um agente patogénico determi nado.
A poliespecificidade dos AcN e o facto de frequentemente possuírem uma alta afinidade para um antigénio dado (t. Ternynck, S. Avrameas,Immunol. Rev. 1986) permite-lhes reconhecer vários antigénios presentes nos agentes pato, génicos. É de notar, por outro lado, que entre estes AcN, alguns possuem uma actividade do tipo anti-dinitrofenilo (DNP) ou anti-trinitrofenilo (TNP) e que em várias situações patológicas (doenças autoimunes e infecções virais) e título destes anticorpos (anti-NP) séricos está significativamente modificado (P. Matsiota e colab. Clin. exp, Immunol., 1987 e
Ann. Pasteur 1987).
Por uma questão de comodidade de linguagem, reagrupar-se-á sob o termo NP, as moléculas contendo grupos de nitrofenilos possuindo um, dois ou três grupos nitro (N02), de preferência 2 ou 3 grupos nitro. As moléculas NP preferidas são os nitrofenois. Outras moléculas interessantes são mais particularmente o 2,4-dinitrofenilo (DNP), ou o 2,4, 6-trinitrofenilo (TNP)'.
Mais particularmente, verificou-se que a taxa de anticorpos com actividade anti-NP (Ac anti-NP) é significativamente mais elevada do que a taxa dos outros anticorpos naturais quando destas doenças autoimunes ou de infecçSes virais. Estes resultados foram particularmente objecto de publi^ cações na continuação de estudos feitos no quadro de infecçães causadas pelo vírus da SIDA (HIV) (Detection of natural auto-antibodies in the serum of anti-HIV-positive individuais”, dito de outra maneira ('‘Detecção de auto-anticorpos naturais no soro de indivíduos tendo uma reacção positiva anti-HIV.
P. Matsiota e colab. Ann. Inst. Pasteur/lmmunol 1987, 138, 223-233) e no quadro de um estudo respeitante ao lupus eritematoso Natural antibodies in systemic lupus erythematosus dito de outra maneira ^Anticorpos naturais do lupus eritematjo so do organismo. P. Matsiota e colab. Clin. exp. Immunol.
69, 79-89 (1987) J.
A presente invenção resulta da descoberta feita pela requerente de que a realização de um contacto - in vitro ou in vivo- das células sensíveis atingidas pelo agente pato^ génico ou susceptíveis de ser atingidas, inclusivamente o pró prio agente patogénico, com anticorpos anti-NP objecto de um fornecimento exterior, por um lado, ou pelo contrário com derivados de NP reconhecidos por anticorpos anti-NP. por outro lado, se manifesta por uma modulação controlável das interacç8es entre as referidas células e o referido agente patogénico quando este último e aquelas entram em contacto. É de salientar que os efeitos induzidos pelos anticorpos anti-NP ou pelos NP são eles próprios frequentemente da mesma natureza, e isto pode ser visto que, no plano imunolôgico, os NP podem ser considerados como imagens internas dos anticorpos anti-NP.
A presente invenção visa então um processo para modificar as condições da interacção entre as células sensíveis de um hospedeiro vivo e um agente patogénico para este hospedei±o, caracterizado pelo facto de se fazer contactar estas células sensíveis com o agente patogénico (”in vitro11 ou in vivo'*) com anticorpos anti-NP ou com NP sem efeitos tóxicos (charmar-se-lhes-á ainda NP não tóxico ou derivados NP) e isto nas condições particularmente de doseamento dos anticorpos anti-NP ou dos NP não tóxicos, função do grau de modulação pretendida da referida interacção.
processo de acordo com a presente invenção é mais particularmente aplicável à realização de uma modulação da interacção entre as células sensíveis de um hospedeiro vivo e um agente patogénico que consiste em um vírus.
Por NP não tóxicos (ou derivados NP) entende-se qualquer molécula NP modificada quimicamente em Cl do ciclo fenílico ao nível da sua posição fenol, por um grupo químico que assegura a neutralização das propriedades tóxicas 11 in vivow da molécula NP não modificada. Esta modificação química faz em particular intervir uma ligação covalente entre a posição fenol do NP e um grupo funcional apropriado, por exemplo amino, do grupo de modificação. 0 grupo de neutralização descrito antes é escolhido de tal modo que não afecta a capacidade do NP de ser reconhecido pelos anticorpos anti-NP.
À natureza do efeito ou a influência dos anticorpos anti-NP ou, pelo contrário, das NP não tóxicos, sohre a interacção entre células sensíveis do hospedeiro e o agente patogénico em relação a estas células sensíveis, pode ser ava liada in vitro”, utilizando um teste compreendendo:
- o contacto do agente patogénico com células sensíveis atingidas ou susceptíveis de ser atingidas por este agente patogénico, na presença de doses variáveis, por exemplo crescentes de anticorpos anti-NP ou de NP não tóxicos,
- a observação para cada uma destas doses do efeito exercido pelo anticorpo anti-NP ou NP não tóxico sobre a interacção in vitro do agente patogénico e as células sensíveis e
- a apreciação da variação do efeito exercido sobre esta interacção em função das referidas doses.
Verificou-se, com efeito, que a interacção entre o agente patogénico e as células sensíveis é geralmente modificado na presença dos anticorpos anti-NP ou dos NP não tóxicos, acompanhando-se esta modificação na maior parte dos casos pela incorporação de uma parte pelo menos dos NP não tóxicos, nas células sensíveis.
A evolução da interacção entre o agente patogénico e as células sensíveis, quando da realização do teste anterior manifesta-se, segundo os casos e por exemplo por:
- uma inibição da fixação do agente patogénico sobre as células sensíveis ou da sua internalização nestas células, eventualmente em virtude de um possível bloqueio dos recepto res celulares pelos anticorpos ou pelos NP não tóxicos,
- um efeito de neutralização e a replicação (se se tratar de um vírus) ou da actividade lítica do agente patogénico em relação às células sensíveis, etc..
Estes efeitos podem sofrer variaçSes ou ser invertidos, em função das doses administradas.
A determinação in vi tro11 dos efeitos dos anti corpos anti-NP ou , pelo contrário, dos NP não tóxicos sobre a interacção, entre as células sensíveis do hospedeiro e o agente patogénico pode assim permitir a orientação de um tratamento terapêutico do indivíduo atingido por um agente patogénico ou a prevenção da doença correspondente neste indivíduo, compreendendo este tratamento terapêutico então a administração a este indivíduo de doses apropriadas de anticorpos anti-NP ou de NP não tóxicos.
A determinação das doses apropriadas pode resultar da determinação feita in vitro”. AdaptaçSes destas y
/
{.' (j
doses apropriadas deverão naturalmente ser realizadas pelo clínico,cam vista às diferentes sensibilidades dos pacientes aos anticorpos anti-NP ou aos NP não tóxicos administrados.
Em um modo de realização particular do processo anterior, a modificação da interacção entre o vírus e uma célula sensível a este vírus será obtida mediante con tacto destas células com um anticorpo monoclonal anti-NP.
Estes anticorpos podem obter-se em particular mediante cultura de hibridomas realizados por fusão de células de murganhos previamente imunizados com NP e células mi£ lomatosas,sendo estes hibridomas seleccionados de entre os híbridos celulares resultantes destas fusões e produzindo tais anticorpos monoclonais,
A selecção dos anticorpos anti-NP pode ser utilizada para tratar um paciente, de acordo com o processo de modificação da interacção entre as células sensíveis de um hospedeiro e um agente patogénico para este hospedeiro, mas pode igualmente fazer-se mediante realização do teste de determinação da modulação da interacção descrito antes na presença destes anticorpos monoclonais, em particular quando uma primeira determinação desta modulação tenha sido previamente feita com anticorpos policlonais. A modulação observada pode ser utilizada como referência para orientar a selecçâo dos Ac-anti-NP activos. Podem ser retidos os anticorpos monoclonais que, em ensaios realizados em condições semelhan tes às dos testes com os anticorpos policlonais realizados
antes, induzem efeitos semelhantes ou mais intensos que os ob servadores com os anticorpos policlonais.
Em um outro modo de realização preferido os anticorpos utilizados são anticorpos monoclonais anti-NP.
Em um outro modo de realização preferido de acordo com a presente invenção, substitui-se os Ac-anti-NP pelos NP não tóxicos. De um modo preferido, o NP utilizado no quadro do processo de acordo com a presente invenção é quimicamente modificado no carbono 1 do núcleo fenílico ou ao nível da sua posição fenólica mediante substituição por um aminoácido, por um péptido, por uma proteína ou por qualquer grupo químico não tóxico, que não interfira e nem modifique desfavoravelmente a influência exercida win vitro” pelos NP sobre a referida interacção.
Entre os aminoácidos particularmente adapta dos para serem substituídos na posição fenólica da molécula NP, citar-se-á particularmente a glicina e a lisina.
Em um modo de realização particularmente pre^ ferido actualmente do processo de acordo com a presente invenção, o NP será modificado pela glicina.
Entre as proteínas adaptadas para a realiza ção do processo de acordo com a presente invenção, pode-se men cionar a sero-albumina-bovina (BSA) (abreviatura inglesa de Bovine Serum-Albumin , a ovalbumina (OVA) assim como a miosina.
È evidente que estas moléculas são citadas a título de exemplo e não limitam em nada a escolha dos grupos de substituição que realizam a modificação da molécula NP. A presente invenção diz com efeito respeito a todas as moléculas adaptadas para a modificação da molécula de NP n quadro da realização do processo de modificação de acordo com a presente invenção, na medida em que o derivado NP obtido é desprovido de carácter tóxico e não perdeu a sua capacidade de ser reconhecido pelos anticorpos anti-NP.
A compatibilidade do grupo de modificação com a capacidade da molécula NP para ser reconhecido pelos anticorpos anti-NP pode ser verificada por um ensaio 11 in vitro que compreende o contacto da molécula NP modificada em estudo, com anticorpos anti-NP previamente imobilizados sobre um suporte sólido insolúvel em condições que permitam a formação eventual de um complexo imunológico entre anticorpos anti-NP e a molécula NP modificada em estudo, e a d_e tecção deste complexo imunológico.
A presente invenção diz igualmente respeito às composições farmacêuticas para o tratamento de doenças virais ou de doenças autoimunus, induzidas por um agente pat£ génico cuja interacção com as células do hospedeiro pode ser efectuada no sentido da redução em relação a estas células na presença de anticorpos anti-NP ou de NP não tóxicos, caracterizadas pelo facto de conterem uma quantidade efectiva de anticorpos anti-NP ou de NP não tóxicos em associação com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e sob uma dose eficaz para modificar as condições de interacção entre as células sensíveis do hospedeiro ao qual a coiftposição farmacêutica se destina e o agente patogénico para este hospedeiro.
De acordo com um modo de realização preferido para a preparação da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, o grupo químico para modificação ao nível do carbono 1 do núcleo fenílico ou da posição fenol do NP é um aminoácido, particularmente a glicina ou a lisina, um péja tido ou uma proteína, particularmente a BSA, a OVA ou a miosina.
De um modo geral, a modificação de uma molécula NP pelo grupo escolhido pode realizar-se mediante qualquer reacção química apropriada utilizando a posição Cl do núcleo fenílico ou a posição fenol do NP, por um lado, e uma função reactiva transportada pela molécula destinada à forma ção do grupo para modificação com o objectivo de realizar a sua ligação covalente. Por exemplo, a molécula de modificação transporta uma função amina, caso em que se pode recorrer a qualquer técnica apropriada para ligar entre elas esta função amina com a função hidroxi do NP. De acordo com um outro exemplo em que a molécula de modificação comporta uma função carboxilo, pode-se proceder a uma reacção de esterificação.
Por exemplo, os agentes de condensação podem ser constituídos por carbodiimidas quando as funçSes compl£ mentares são respectivamente constituídas por grupos carboxilo e amina, ou vice-versa, por exemplo o p-tolueno-sulfo7
nato de N-ciclohexil-N-/á’-(N-metil-morfolino-etil)-carbodiimida e o cloridrato de (3-metil)-aminopropil-carbodiimida ou a diciclohexil-carbodiimida. A reacção é então conduzida nas condições usuais na química das proteínas.
Os agentes de condensação podem então ser constituídos por um 6-maleimido-capróico-acil-N-hidroxi-succinimida-éster ou o N-succinimido-3-il-(2-piridil-ditio)-propionato (SPDP), quando as funções complementares são respectivamente, no início, um grupo sulfidrilo e um grupo amina, ou vice-versa.
As condições reaccionais apropriadas são ainda as descritas nos artigos seguintes: J. CARLSSON e colab. Biochem. J.» (1978) 173, 727-737 ou P.E. THORPE e colab. em Euro, J. Biochem. Il6, 447-454, (1981).
A presente invenção diz por outro lado respeito à aplicação de uma composição farmacêutica descrita antes, ã preparação de um medicamento para o tratamento de uma infecção virai ou de uma doença autoimune.
As doses de composições farmacêuticas de acor do com a presente invenção, administradas para tratar doenças virais ou doenças autoimunes deverão ser escolhidas de modo a que se observe a eficácia destas composições no tratamento da doença. Poderão ser moduladas durante o tratamento em função da natureza da evolução da interacção entre o agen te patogénico e as células sensíveis.
Outras características técnicas da presente invenção tornar-se-ão claras nos exemplos ilustrativos que se seguem. Estes exemplos não são de modo nenhum limitativos no que respeita à aplicação dos processos de acordo com a presente invenção às doenças virais ou autoimunes.
EXEMPLO I
Efeito dos anticorpos naturaus e do TNP sobre a proliferação dos linfócitos de murganho
a) Preparação dos anticorpos
Os anticorpos utilizados são anticorpos monoclonais (am) naturais (N5-12, N5-17, MO-1, 62-1, D-23) e provêm de hibridomas preparados mediante fusão de células de baço de murganhos que não receberam nenhuma imunização prévia nem nenhuma estimulação mitogénica com o mieloma de murganhos XÓ3-Ag8. Os hibridomas TNP11 e TNP9 resultam da fusão das células de baço de murganhos imunizados com Ficoll-TNP. Foram mantidos em cultura no meio RPMI completo contendo 10$ de soro de feto de vitela. Os hidridomas foram injectados a murganhos Balb/c previamente tratados com pristano com o objecti. vo de obter ascites. Os AM foram utilizados na qualidade de sobrenadantes de cultura ou como ascites ou após isolamento mediante cromatografia de afinidade sobre uma coluna de DNP-Sepharose. Estes anticorpos foram ensaiados por teste imunoenzimático sobre diferentes antigénios imobilizados sobre pia cas de poliestireno e revelados por um anticorpo anti-Ig de murganho ligado à ^-galactosidase.
b) Preparação dos derivados NP
TNP foi ligado à sero-albumina bovina (BSA) pelo método descrito por Little & Eisen: 1 ml de BSA a 20 mg/ml em tampão de carbonato-hidrogenocarbonato, O,1M, pH 9,5, © adicionado a uma solução de ácido trinitrobenzeno sulfénico a 2 mg/ml no mesmo tampão. Interrompe-se a reacção decorridos 30 a 120 minutos de acordo com a substituição pr_e tendida mediante eliminação do excesso de reagentes sobre um permutador de iões (Dowex 1x4) e depois diálise. Utilizaram-se preparações de BSA substituídas com quer 14 ou 30 moléculas de TNP por molécula de BSA (TNP^-BSA ou ΤΝΡ^θ-BSA).
A DNP-Glicina (DNP-Gli) e a DNP-Lisina (DNP-Lis) provêm dos Laboratórios Sigma e são solubilizados directamente no meio de cultura.
c) Preparação das populações celulares
Células provenientes de baço ou de timo de murganho. Os murganhos são mortos por deslocação cervical e colhe-se o seu baço ou o seu timo esterilmente e depositam-se no meio RPMI. As células são dissociadas, lavadas uma vez com o meio, depois os glóbulos vermelhos são lisados com clo^ reto de amónio (θ,9 durante 1 minuto a frio e depois as células são novamente lavadas no meio completo.
As sub-populações de células B ou T são em seguida separadas como se segue:
- Sub-população T : as células T são obtidas a partir da população de células do baço mediante eliminação das células compor tanto Ig na sua superfície (sub-população B) sobre anti. corpos anti-Ig de murganho imobilizados quer sobre esferas // «
magnéticas (Magnogel) quer sobre caixas de Petri.
- Sub-população B : as células B são obtidas após despren dimento mecânico dos suportes sobre os quais foram fixadas por intermédio dos anticorpos anti-Ig (após isolamento das células T), ou após eliminação da sub-população das células T da população total das células de baço mediante um tratamento com um anticorpo anti-células T seguido de complemen to de cobaia.
Timocitos : os timocitos são dissociados em RPMI e as cjé lulas isoladas são lavadas em meio completo antes de se cultivarem.
d) Cultura das células meio de cultura utilizado é o RPMI 1640 contendo soro de feto de vitela (5 $) , piruvato de sódio (lmM), L-glutamina (imM), 2-mercapto-etanol (0,05mM), peni cilina (100 >ug/ml) e estreptomicina (50/ug/ml).
c x lCr células de cada população celular ou e» x IO'* de células de baço não fraccionadas são distribuídas sob um volume final de 200 um em caixas de cultura de alvéolos de fundo plano na presença ou não dos diferentes estimuladores (ou mitogénios) (40 ;ug/ml de lipopolissacá ridos W.S. Typhosal 2 /ig/ml de concanavalina A, ou sobre nadantes de cultura contendo anticorpos monoclonais para di ferentes diluições ou uma solução de TNP-BSA para concentra çães finais compreendidas entre 200 mg e 200 xig/ml). As culturas são efectuadas durante 48 a 96 horas a 37°C atmosfera a 5 $ de CO^·
- 15 e) Determinação da proliferação das células
Seis a oito horas antes do fim da cultura, colheram-se 100 jnl de sobrenadante de cada alvéolo de cultura a fim de ser testado quanto ao seu conteúdo em anticorO pos. Adiciona-se 10 μΐ de uma solução de JH-timidina (actividade específica = 5j*Ci=l85GBq/mM) a 50 jiCl/ml à cultura que continua em seguida. As células de cada alvéolo são reco lhidas sobre papel de filtro com a ajuda de urra colector aut<> mático e, apos secagem, os filtros são contados em um líquido cintilante.
Os resultados obtidos estão reunidos no quadro I no que diz respeito à acção dos anticorpos monoclohais sobre células dadas e no quadro II no que diz respeito à acção dos derivados NP.
QUADRO I
Efeito dos anticorpos monoclonais sobre a proliferação dos linfócitos de murganho
Calcula-se a percentagem de aumento (+) ou de
inibição (-) em | relação aos números obtidos | com o | meio de ci | ||
tura sozinho. | |||||
Anticorpos | D23 | 62-1 | TNP11 | TNP? | |
Células de baço | |||||
1/10 | + | 20$ | - 90$ | - 90$ | 0 |
l/40 | + | 60$ | - 48$ | - 80$ | 0 |
1/160 | + | 20$ | - 26$ | - l!0$ | + 40$ |
1/640 | 0 | + 40$ | + 4o$ | + 40$ |
Quadro I (Continuação)
Anticorpos | D23 | 62-1 | TNP11 | TNP9 | |
Células í | B | ||||
1/10 | + 10$ | - 90$ | + 92$ | - 52$ | |
ΐ/4θ | + 300$ | - 80$ | + 42$ | - 10$ | |
l/l60 | + 300$ | - 46$ | + 28$ | + 42$ | |
1/640 | 0 | + 100$ | 0 | - | |
> | Células | T | |||
1/10 | + 1000$ | + 700$ | + 2000$. | - | |
i/4o | + 500$ | + 600$ | + 700$ | - | |
l/l60 | + 400$ | + 500$ | + 500$ | - | |
1/6 4o | 0 | - | - | - |
Timocitos
1/10 | + 100$ | 0 | + 4oo$ | + 200$ | |
> | 1/40 | 0 | 0 | + 200$ | 0 |
1/160 | 0 | 0 | + 100$ | 0 |
- 17 Ύ
QUADRO II
Efeitos dos derivados NP sobre a proliferação dos linfócitos de murganho
Calcula-se a percentagem de aumento (+) ou de inibição (-) em relação aos números obtidos com o meio sozinho (M) ou a que se adicionou lipopolissacáridos (LPS) ou concavalina (con A).
Após tratamento das células com os derivados NP durante 48 horas, os mitogénios concanavalina A (com A) e lipo> polissacáridos (LPS) são adicionados às células e a cultura prossegue durante 24 a 48 horas.
Derivados NP TNP-BSA DNP-Glicina TNP-Lisina
M conA* LPS* M ConA* LPS* M conA* LPS*
Células de baço
200 | Aig/ml | + 50 | + 46 | +30 | -64 | -50 | -60 | 0 | -6 | -3 |
50 | +30 | + 30 | +20 | -30 | 0 | -20 | 0 | 0 | 0 | |
12 | + 10 | +28 | 0 | -10 | -30 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
Célul | as B | |||||||||
200 | Xig/ml | + 100 | nt | + 18 | -90 | nt | -80 | -50 | nt | nt |
50 | + 50 | nt | 0 | -60 | nt | -64 | -30 | nt | nt | |
12 | 0 | nt | 0 | -50 | nt | -4o | -50 | nt | nt | |
3 | 0 | nt | 0 | -25 | nt | -7 | -4o | nt |
Quadro II (Continuação)
Células T
200 >ug/ml | +30 | -50 | nt | +4 | -45 | nt | +32 | -50 | nt |
50 | +18 | -25 | nt | +30 | -15 | nt | +20 | -20 | nt |
12 | + 20 | -20 | nt | 0 | -4 | nt | 0 | -20 | nt |
3 | 0 | -40 | nt | 0 | -5 | nt | 0 | -10 | nt |
0,7 | 0 | -50 | nt | + 50 | 0 | nt | 0 | 0 | nt |
CONCLUSÕES
Conforme os anticorpos monoclonais e segundo a sua concentração (aproximadamente compreendida entre 1 e 100 pg por ml) os efeitos observados são positivos ou negativos.Além disso, os efeitos de LPS sobre as células B são significativamente inibidos na presença de concentrações elevadas de anticorpo monoclonal.
Estes resultados demonstram a existência de uma actividade dos anticorpos anti-NP e dos derivados NP sobre a proliferação das células linfocitárias. As células linfocitárias encontram-se portanto entre as células sensíveis que podem ser visadas pelos processos de acordo com a presente invenção.
- 19 EXEMPLO II
Efeito víroneutralizante in vitro dos anticorpos anti-NP e dos derivados NP sobre infecciosidade do vírus da coriomeningite linfocitária (CML).
efeito dos anticorpos anti-NP em sobrenadante de cultura e dos derivados NP foi estudado sobre o CML in vitro. testando a redução das placas das células infectadas.
Preparação do meio de cultura.
Obtém-se a mistura de metil-celulose-Dulbecco como se segue:
- Preparação da solução metil-celulose: dissolve-se 1,8 g de metil-celulose em 100 ml de água destilada com agitação magnética contínua a +A°C durante 2 dias. Em seguida, esteriliza-se a 105°C durante 20 minutos e conserva-se à temperatura do laboratório.
- Preparação do meio de Dulbecco: dissolve-se o pó de um pequeno saco previsto para 5 litros de meio em 2 litros e meio de água destilada. Adiciona-se depois 2,2 g de hidrogenocarbonato de sódio por litro de meio e esteriliza-se mediante filtração sobre filtro 0,22 /1.
Preparação do violeta cristalizado.
- Adiciona-se 1 volume de formol e 8 volumes de água destilada adicionados a 1 volume de solução mãe.
- Solução mãe: violeta cristalizado 20 g, etanol 200 ml, formol 100 ml, água destilada 700 ml.
Ρ !!
tí
Técnica das regides (plages) para o vírus CML horas antes da infecção, cultiva-se apés tripsinação das células L929 Gibco, que estão no fira da lag phase, (l8-24 horas apés o início da cultura). Ajusta-se a suspensão celular a 0,5x 10^ células por ml em meio Dulbecco (cuja preparação é dada na continuação) mais 3,7 g de hidrogenocarbonato de sódio por litro e 5% de soro de feto de vitela. As células são repartidas à razão de 2 ml por alvéolo e incubam-se a 37°θ sob atmosfera de 10% de CO^ durante o máximo de 24 horas antes da infecção.
Uma hora antes da infecção colocam-se as células a 37°C na presença do anticorpo ou do antigénio diluído em meio celular, imediatamente antes da infecção elimina-se o meio de cultura contendo o anticorpo ou o antigéneio dos alvé olos e distribui-se o vírus (pfu ml) a razão de 0,5 ml pôr ál^ véolo. Guarda-se um alvéolo como testemunha das células e jun ta-se-lhe 0,5 ml de meio e um alvéolo que não recebeu o anticorpo ou o antigénio recebe o vírus e é considerado como testemunha vírus. Incuba-se as células a 37°θ durante 1 hora sob atmosfera de C02 a 10% na presença do vírus. Elimina-se o inoculo e adiciona-se a cada alvéolo 2 ml da mistura metil-celulose-Dulbecco ( 1 volume de metil celulose + 1 volume de meio Dulbecco contendo 10 % de soro de feto de vitela).
Incuba-se a placa durante 5 dias a 37°C em atmojs fera de 5 % de C02» Elimina-se o meio dos alvéolos mediante viragem da placa. Lava-se 3 vezes com PBS e cora-se durante 20 minutos com uma solução de violeta cristalizado.
- 21 Finalmente, lava-se com água da torneira e conta-se as regiões.
Os resultados destes ensaios estão reunidos a seguir (quadros III a XIII).
QUADRO III
Neutralização da actividade lítica do CML pelos AcN e os anticorpos anti-NP.
Seroneutralização : Nenhum efeito
Neutralização da actividade lítica do CML pelos AcN e os anticorpos anti-NP pré-incubados com as células L, de Inibição
Testemunha | vírus | 0 | |||
Anticorpos | TNP11 | em | sobrenadante | puro | 53 |
M | 1/2 | 47 | |||
11 | i/4 | 50 | |||
Anticorpos | TNP 9 | em | sobrenadante | puro | 6l |
11 | 1/2 | 44 | |||
II | 1/4 | 44 | |||
Anticorpos | 621 | em | sobrenadante | puro | 22 |
11 | 1/2 | 22 | |||
11 | 1/4 | 20 |
(Os anticorpos D23 e mol dão resultados comparáveis aos obtidos com 621).
QUADRO IV
Neutralização da actividade lítica do CML pelos derivados NP
Seroneutralização
Testemunho vírus TNP-BSA a 1 mg/ml ” 0,5” “ 0,25 ”
0,12 M
0,06
0,03
DNP-glicina a 0,48 mg/ml » 0,240 ·'
0,120
0,060
0,030 ”
0,015 % de Inibição
6l
8o
QUADRO V
Neutralização da actividade lítica do CML pelos derivados
NP pré-incubados com as células L.
If >
II
Testemunha vírus a 1 mg/ml 0,5 ”
0,25 ”
0,12
DNP-glicina a 0,48 mg/ml ” 0,24 ”
0,12 «
0,06
0,03 » 0,01 >
de Inibição
Λ
QUADRO VI
Neutralização da actividade lítica do CML pelos derivados NP adicionados à cultura celular depois da infecção virai.
Testemunha vírus
TNP-BSA a 1 mg/ml 0,5
DNP-glicina a 0,48 mg/ml ·' 0,24
0,12
0,06
0,03 ” 0,01 « % de Inibição o
CONCLUSÕES utilizados
Entre os anticorpos monoclonais de murganho (TNP11, TNP9, D23, 62-1, MOl) só os anticorpos
TNP11 e TNP9 específicos das determinanates TNP ou DNP podem neutralizar o efeito lítico do CML. A acção dos anticorpos anti-NP parece não se exercer directamente sobre os antigénios virais. Estes anticorpos parecem neutralizar o efeito virai agindo sobre a célula. Os derivados NP agem em seroneutralização e em incubação com as células. Isto mostra que o seu modo de acção se exerce simultaneamente sobre o vírus e
- 25 / sobre a célula. Os resultados demonstram que o derivado DNP-glicina pode inibir o vírus mesmo se este se adicionar à cultura celular depois da infecção virai provavelmente mediante penetração na célula e actuação directa sobre o vírus ou sobre a sua replicação.
EXEMPLO III :
Neutralização in vitro da actividade lítica do vírus da estomatite vesicular (VSV) pelo AcN N3-17»
1- Seroneutralização
N5-17 é utilizado aqui sob a forma de ascite. Procede-se a uma seroneutralização clássica do
VSV bruto Lg (passado 3 vezes sobre células L929) diluído de modo a obter-se 50 regiões (plages) por alvéolo pelo anticorpo N5-17 em diferentes diluições. Incuba-se o vírus na presença do anticorpo durante 1 hora a 37°θ em banho-maria. Ensaia-se em seguida a neutralização da actividade lítica pela técnica das plages sobre células L929 (técnica das plages descrita em detalhe pelo CML). As plages são reveladas 48 ou 72 horas depois mediante coloração com violeta cristalizado. Os valores representados nos resultados (quadro VII) são os obtidos depois da correcção para se ter em conta a inj. bição obtida com as ascites testemunhas.
QUADRO VII % de inibição
- Testemunha vírus 0
- Anticorpo | N5-17 em ascite, puro | 58 | |||
— II | II | diluído | a | l/2 | 48 |
— H | II | diluído | a | 1/4 | 32 |
II | II | diluído | a | 1/8 | 26 |
_ n | It | diluído | a | l/l6 | 20 |
tv | diluído | a | 1/32 | 10 | |
2- | Neutralização i | da | actividade | lítica do VSV |
pelo anticorpo N5-17 pré-incubado com as células L.
Incuba-se o anticorpo N5-17 para diferentes diluições e células L929 durante 1 hora a 37°C em uma atmosfera enriquecida em CO^ ou durante 1 hora a +4°C. Após lavagem para eliminar o excesso de anticorpo N5-17, infecta-se com o VSV diluído de modo a obter 50 plages” por alvéolo. A neutralização do efeito lítico do VSV é testado pela técnica das plages” (descrita em detalhe pelo CML). Os valores dados nos resultados (quadro VIIl) são os obtidos após correcção para ter em conta a inibição obtida com as ascites testemunhas
- 27 QUADRO VIII
Pré-incubação das células L com o anticorpo N5-17 durante hora a 37°C γ> de Inibição
-Testemunha vírus
-Anticorpo N5-17 em ascite al/2 _ « » « i / 4 it II II i/8
1/16
4o
Pré-incubação das células L com o anticorpo N5-17 durante hora a 4°C % de Inibição
- Testemunha vírus 0
- Anticorpo N5-17 em ascite a l/2 0 >
EXEMPLO IV
Neutralização in vitro” da actividade lítica do VSV pelo anticorpo N5-12.
Seroneutralização.
N5-12 é utilizado aqui sob a forma de sobrenadante de cultura. Procede-se a uma seroneutralização como a descrita para o anticorpo N5-17 θ a uma revelação da neutralização da actividade lítica do VSV pelo método das plages.
Os resultados estão reunidos no quadro IX.
QUADRO IX | ||||
% de Inibição | ||||
- Testemunho vírus | 0 | |||
- Anticorpo | N5-12 em | sobrenadante | puro | 60 |
— H | M | a | 1/2 | 44 |
_ II | 11 | a | 1/4 | 25 |
_ »» | II | a | 1/8 | 6 |
_ M | tl | '· a | l/l6 | 0 |
- Anticorpo | TNP11 em | sobrenadante | puro | 0 |
Neutralização da actividade lítica do VSV pelo anticorpo
N5-12 pré-incubado com as células L,
Procede-se de acordo com o processo descrito para o anticorpo N5-17, e obtém-se os resultados do quadro X.
QUADRO X
Pré-incubação das células L com o anticorpo N5-12 durante uma hora a 37°C % de Inibição
- Testemunha vírus 0
- Anticorpo N5-12 em sobrenadante puro 0
Pré-incubação das células L com o anticorpo N5-12 durante uma hora a 4°C.
% de Inibição 0
- Testemunha vírus
- Anticorpo N5-12 em sobrenadante puro
- 29 CONCLUSÕES PARA OS EXEMPLOS III e IV,
Os AcN poliespecíficos podem neutralizar o efeito lítico do vírus da estomatite vesicular mediante reacção com epitopos virais e mediante seroneutralização, por conseguinte, do vírus (anticorpo N5-17» anticorpo N5-12) ou mediante reacção completa com os epitopos celulares em relação com a fixação e a penetração do vírus nas células (anticorpo N5-17)·
EXEMPLO V:
Vironeutralização do vírus HIV1 win vitro11 pelos anticorpos anti-NP e os derivados NP.
A técnica de cultura e de titulação da transcrip tase inversa do HIV é recordada a seguir. Linfôcitos humanos, previamente activados pela PHA (fitohemaglutinina) são incubados em um meio nutritivo (RPMI 1640 + soro de feto de vitela + + antibióticos + B-mercaptoetanol 10-¾ + 2 xig/ml polibreno + + soro anti-interferão 1/2000 + IL2 10%). Após centrifugação, coloca-se o sedimento celular na presença do HIV1 (10.000 cpm/ /10 células) durante uma hora a 37 C. Após lavagem e centrifugação, suspende-se novamente as células em meio nutritivo.
Os sobrenadantes de cultura celular são seguidos durante vários dias pela sua actividade de transcriptase inversa. Centrifugam-se durante 7 minutos a 95 000 rotações e o sedimento é lisado com triton a 0,1% (produto Tougart e Matignon). Adiciona-se uma mistura reaceional (Tris, DTT (ditiotreitol), MgClg, KOI, PoliA, Oligo dT, 3HTTP, HgO) e» aP°s uma hora de incubação a 37°C interrompe-se a reacção com pirofosfato de sódio e adiciona-se ácido nucleico de levedura para ajudar a precipitação.
ê
Adiciona-se ácido tricloroacético (TCà) e deixa-se a solução durante 15 minutos a 4°C. Após filtração sob vazio com filtros milipore 0,4-5 j^m e várias lavagens com TCA (0,5 %) t pro cede-se a uma lavagem com etanol, a uma secagem em estufa a 37°C e, finalmente, à contagem.
Seroneutralização
Incuba-se o HIV1 durante uma hora a 37°C na prje sença de AcN (D23, 621, N5-12), de anticorpos anti-NP (TNPll) ou na presença de derivados NP (DNP-glicina e DNP-lisina) . Tej5 ta-se imediatamente a actividade de transcriptase inversa do HIV1 (caso dos derivados DNP-glicina e DNP-lisina). Como alter nativa, infecta-se linfócitos humanos com HIV1 pré-incubado com os produtos a ensaiar e observa-se a cultura celular durante 3 semanas mediante titulação de transcriptase inversa. Durante este período as culturas dos linfócitos humanos não contêm nem anticorpos nem antigénio.
Obtiveram-se os seguintes resultados:
QUADRO XI
Actividade de transcriptase inversa nos sobrenadantes de cultura dos linfócitos infectados com HIV1 pré-incubado com anticorpos.
Tempo em dias depois da infecção | 3 | 7 | 10 | 14 | 17 |
Testemunha | |||||
vírus | 792 | 16130 | 5826o | 14610 | 8820 |
Ns-12 | 4430 | 6498 | 17482 | 21958 | 2602 |
D23 | 1768 | 6386 | 18020 | 55392 | 3804 |
621 | 1918 | 8320 | 15070 | 13112 | 2605 |
TNPll | 1018 | 5138 | 11755 | 19638 | 9504 |
i
QUADRO XII
Testemunha vxrus
DNP-glicina 10 M zr
M _7 'M io9m
DNP-lisina 10~9M z
M
10“7M
10~9M
Actividade de transcriptase inversa do vírus HIVl incubado com derivados NP e testada imediatamente para a actividade enzimática.
Actividade de transcriptase inversa
11924 5444 3424 4090 3638 4652
3932 7240 9262
CONCLUSÕES
Quando o
HIVl é pré-incubado na presença de AcN e de anticorpos anti-NP nenhuma diferença significativa da acti vidade de transcriptase inversa, em relação a testemunha vírus, foi encontrada. Quando o HIVl é pré-incubado com derivados NP observa-se uma nítida seroneutralização.Na presença de DNP-glicina, observa-se uma seroneutralização do vírus que é vá-3 -9 lida para concentrações compreendidas entre 10 e 10 M e na presença de DNP-lisina a seroneutralização observa-se até a concentração do produto de 10*^M.
-32 - / fi
2- Neutralização da actividade enzimática do HIV1 pelos anticorpos anti-NP e os derivados NP, pré-incubados com os linfócitos
Os linfócitos humanos, previamente activados pela PHA, são incubados na presença de AcN, anticorpos anti—
-NP e derivados NP (DNP-glicina, DNP-lisina) durante uma noite a 37°C. No dia seguinte, coloca-se o sedimento na presença do HIV1 durante 1 hora a 37° C no dia seguinte, coloca-se o sedimento na presença do HIV1 durante uma hora a 37° θ θ«ι hanho-maria e suspende-se novamente as células em meio nutri tivo na presença dos produtos a ensaiar. Os sobrenadantes de cultura são ensaiados para a actividade de transcriptase inversa durante 3 semanas.
Η I I ο cn
Ρ I ι ο
CM
CM ιη ο σ\ cn
CM
CM j· cn cm o o o o w
H cn cm m CM H
O CM | O | 00 0 m | 0 | 0 b- H i—l | 00 •tf »n <3\ CM | P m | O -tf 00 P CM | 00 P CM r-l | ||
00 | 00 | |||||||||
00 | -tf | P | -tf | P | m | |||||
H | CM | H | 0 | -tf | O | 0 | cn | o\ | ||
0 | CM | O | -tf | cn | ||||||
H | MJ | 1—1 | b- | 00 | b- | |||||
H | O | |||||||||
H | O | |||||||||
X | Φ | |||||||||
<H | ||||||||||
O | R | P | 00 | 0 | -tf | -tf | P | |||
PS | •rl | cn | CM | O | 0 | 0\ | 1—1 | -tf | P | |
A | 03 | r-l | •tf | O | CM | O | CM | o\ | •tf | |
P | 00 | H | cn | H | ||||||
P | Ό | m | H | P | ||||||
01 | (0 | |||||||||
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0 | CM | m | cn | 0 | P | b- | O | |||
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σ\ | 00 | 0 | CM | 0 | 0\ | b- | m | |
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Φ P | CM | P | m | 1—1 | ||||
H | H | |||||||
0 | ||||||||
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E | ||||||||
φ cn | -tf | in | 0 | 0 | P | 00 | CM | P |
e* | O0 | H | σ\ | m | r-l | P | cn | |
cn | CM | H | P | »n | Pi | |||
H | cn | CM |
nJ | cti | cti | cd | |||||||||
P | P | P | fi | |||||||||
R | fl | H | Ή | fl | •rl | |||||||
□ | 3 | E | E | 3 | EO | |||||||
E | E | r-l | Ίω | H | ε | •rl | ||||||
Φ | m | 0\ | Φ | tc | H | 1—( | 'ω | (0 | r-l | |||
+> | 3 | cn | +> | 3 | 3 | 3 | +> | 3 | 1 | |||
tC | R | CM | a | <0 | fl | a | a | X. | tn | fl | a | |
Φ | *rl | & | Φ | *ri | iz; | 0 | £ | CM | Φ | *rl | & | |
61 | A | ► | m | H | i> | A |
Ph g
A
-glicina 1064 890 1234 1572 1276 1270
CONCLUSÕES
A incubação dos linfócitos com AcN antes ou durante a adição do vírus não modifica de um modo signifi. cativo, em relação à testemunha vírus, a actividade de trans critase inversa.
Os anticorpos anti-NP / do tipo IgM (TNP-11) e do tipo IgG ( TNP 9.17 retardam o aparecimento da activi dade de transcriptase inversa em relação à testemunha vírus ou inibem completamente o aparecimento da actividade enzimática virai. Este efeito é dose-dependente e varia de acordo com o tempo de adição do anticorpo na cultura. Os derivados NP (DNP-glicina e DNP-lisina) podem conduzir a uma inibição total da infecciosidade virai e esta inibição não exige a presença contínua destes derivados na cultura dos linfócitos infectados.
Exemplo VI
Efeito de NP quimicamente modificados sobre a proliferação do vírus.
efeito dos NP ligados (TNP-BSA, DNP-glicina) foi calculado pelo método das plages”, de acordo com o processo descrito para o vírus da coriomeningite linfocitá ria no exemplo II. 0 efeito neutralizante dos NP ligados foi calculado sobre os seguintes vírus com envelope ou sem envelo pe s
1) Vírus com envelope:
IHDT-6 (“International Health Division-Tu35 mor-6):
Este vírus é um Pox vírus com ADN de cordão duplo. Cultiva-se sobre células de murganho TCC31.
Os resultados foram obtidos 3 dias depois da cultura.
VSV (Vesicular Stomatitis Virus)
Trata-se de um Rhabdovírus de cordão simples de ARN. Cultiva-se sobre células L 929 de murganho.
Os resultados foram obtidos 3 dias depois da cultura.
HVE (Herpes virus Eidolon)
Trata-se de um vírus do herpes com cordão duplo de ADN que se cultiva sobre células TCC31 de murganho. Os resultados sao observados 2 dias depois da cultura.
2) Vírus sem envelope.
EMCV (Encephalomyocarditis Virus)
Este Picorna-vírus com ARN de cordão simples foi cultivado sobre células L 929 de murganho. Os resul tados são obtidos 1 dia depois da cultura.
Para todos os vírus testados, as diluições dos vírus dão 50 plages/alvéolo.
RESULTADOS IHDT TNP-BSA conc. em mg/ml | de inibição |
2,4 | 72 |
1,2 | 73 |
0,6 | 51 |
0,3 | 37 |
0,15 | 31 |
0,07 | 21 |
Conclusão: 0 TNP-BSA | pode seroneutralizar |
uma concentração de 0,6 mg/ml.
HVE
TNP-BSA conc. em | # de mg/ ml | inibição | DNP-Glic conc. em mg/ml | % de inibição |
- | - | 2,1 | 92 | |
1,0 | 79 | 1,2 | 57 | |
o,5 | 55 | 0,6 | 50 | |
0,25 | 35 | 0,3 | 48 | |
0,12 | 16 | 0,15 | 40 | |
0,06 | 5 | 0,07 | 28 | |
0,03 | 0 | 0,03 | - | |
Conclusão | ! 0 TNP-BSA pode seroneutralizar o vírus HVE at |
uma concentração de 0,5 mg/ml. 0 DNP-Glicina pode igualmente seroneutralizar o vírus HVE até uma concentração de 0,6 mg/ / ml.
- 37 7 vsv
TNP-BSA % de ini- DNP-Glic % de ini-
conc. em mg/ml | bição | conc. em mg/ml | bição |
2,0 | 24 | 2,4 | 41 |
1,0 | 15 | 1,2 | 68 |
0,5 | 12 | 0,6 | 47 |
0,25 | 0 | 0,3 | 38 |
0,12 | 0 | o,15 | 6 |
0,06 | 0 | 0,07 | 0 |
0,03 | 0 | 0,03 | 0 |
Conclusão: 0 TNP | -BSA não seroneutraliza o vírus VSV. 0 DNP | ||
-Glicina tem um | efeito até | uma concentração de | 1,2 mg/ml. |
EMCV | |||
TNP-BSA | de ini | - DNP-Glic | % de ini- |
conc. em mg/ml | bição | conc. em mg/ml | bição |
2,0 | 14 | — | — |
1,0 | 4 | 1,2 | 78 |
0,5 | 8 | 0,6 | 62 |
0,25 | 0 | 0,3 | 32 |
0,12 | 0 | 0,15 | 20 |
0,06 | 0 | 0,07 | 0 |
0,03 | 0 | 0,03 | 0 |
Conclusão: 0 TNP-BSA não | tem nenhum efeito neutralizante |
sobre EMCV. O DNP-Glicina seroneutraliza até uma concentração de 0,6 mg/ml.
Claims (8)
- Reivi.ndicaç 5 e s1.- Processo para modificar as condições da interacção entre células sensíveis de um hospedeiro vivo e um agente patogénico para este hospedeiro, caracterizado pelo facto de se fazer contactar estas células sensíveis a este agente patogénico in vivo, ou in vitro, com anticorpos anti-NP, ou com moléculas de NP quimicamente modificadas por meio de uma ligação covalente ao nível do Cl do núcleo fenílico ou ao nível da posição fenólica do NP, por um grupo químico de neutralização das eventuais propriedades tóxicas in vivo da molécula NP não modificada sem contudo afectar a sua capacidade de ser reconhecido pelos anticorpos anti-NP, e isto em condições partieularmente de doseamento dos anticorpos anti-NP ou dos referidos NP modificados, função do grau de modulação pretendido da referida interacção.
- 2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o agente patogénico ser um vírus.
- 3,- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se fazer contactar as células sensíveis com moléculas de NP quimicamente modificadas por qualquer grupo químico destoxificador que não interfira e nem modifique desfavoravelmente a influência exercida 11 in vitro pelos NP sobre a referida interacção.
- 4.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de se fazer contactar as células sensíveis com moléculas de NP quimicamente modificadas por um aminoácido, ou um péptido.
- 5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteriΛ r zado pelo facto de o NP ser quimicamente modificado por um aminoãcido e de o aminoácido ser a glicina ou a lisina.
- 6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de o NP ser quimicamente modificado por uma proteína.
- 7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de a proteína ser a BSA.
- 8,- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica destinada ao tratamento de doenças virais ou de doenças autoimunes, induzidas por um agente patogénico, em que a interacção com as células do hospedeiro pode ser afectada no sentido da redução da patogenicidade do agente patogénico em relação a estas células, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade efectiva de anticorpos anti-NP ou de moléculas NP quimicamente modificadas, tais como definidas respectivamente em uma qualquer das reivindicações 1 e 3 a 7, como ingrediente activo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, e em uma dose eficaz para modificar as condições de interacção entre células sensíveis do hospedeiro, ao qual a composição farmacêutica se destina, e o agente patogénico para este hospedeiro, >Lisboa, 28 de Outubro de 1988 O Agente Ci,e,c,i L .'-tc v:cd;;c!e Indusíriol
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8715126A FR2622444B1 (fr) | 1987-10-30 | 1987-10-30 | Application de dinitro-trinitrophenyle et de ses derives ou d'anticorps anti-nitrophenyles a la modification de l'interaction entre des cellules sensibles d'un hote et un agent pathogene |
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Family
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