PT88439B

PT88439B - Processo para a preparacao de novos polissacaridos soluveis em agua

Info

Publication number: PT88439B
Application number: PT88439A
Authority: PT
Inventors: Serge Carel; Yves-Marie Page; Christine Vanderhoven; Norman Murray; Michel Monsigny; Francis Delmotte; Anne-Claude Roche; Claire Petit
Original assignee: Lipha
Priority date: 1987-09-08
Filing date: 1988-09-07
Publication date: 1992-11-30
Also published as: AU2107788A; HUT47643A; JPH01104182A; NO883967L; OA08948A; IL87681A0; DK497088A; TNSN88092A1; AU609173B2; MA21370A1; FR2620130B1; DD273450A5; PT88439A; EP0308279A1; FR2620130A1; DK497088D0; ZA886623B; NO883967D0; NZ226041A

Description

A presente invenção refere-se a um pro cesso para a preparação de novos polissacáridos imunomoduladores, extraidos de pelo menos uma estirpe bacteriana do tipo Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae.

Certos extractos de enterobactérias, nomeadamente glicoproteínas de Klebsiella pneumoniae sao conhecidos dos pedidos EP 0049.181 e 182 e 0115.988; e no pedi_ do de patente EP. 0139.551, descrevem-se processos para a preparaçao dos princípios activos immunoestimulantes obtidos por acçao de bacteriofagos sobre diversos bactérias.

Foi referido um aperfeiçoamento dos pro^ cessos anteriormente citados, permitindo obter novos polissa^ cáridos solúveis em água, contendo 65 a 75% de oses neutras,

FM

a 27% de ácidos urónicos e 5 a 9% de ácido pirúvico na fornia de piruvilideno, menos de 1% de proteínas, menos de 0,5% de osaminas e possuindo uma massa molecular superior a 50 000.

Designam-se por oses neutras, sobretudo hexoses como por exemplo a glicose, galactose e manose; e por ácidos urónicos sobretudo o ácido galacturónico; e por osaminas, sobretudo a glicosamina.

A massa molecular dos polissacaridos foi determinada por medida do coeficiente de sedimentação em ultracentrifugação analítica e por peneiração molecular.

Os polissacaridos obtidos de acordo com o processo da invenção podem ser extraídos a partir de diferentes estirpes de bactérias ou microorganismos de modo nao limitataivo; retêm-se contudo muito particularmente aqueles que provêm das estirpes de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae depositados no Instituto PASTEUR de PARIS, respectivamente com os números 62.23 e 58.5.

estudo da estrutura destes polissacãridos com a ajuda de diferentes técnicas como cromatografia em fase gasosa, espectrometria de massa, electroforese, autoanálise de aminoácidos, cromatografia liquida de alto rendimento, ressonância magnética nuclear e ultracentrifugaçao analítica permitiu precisar/a composição tal como acima mencionada. É de notar que a sub-fracção peptídica nao é responsável pelas actividades farmacológicas destes polissacaridos.

A composição molar dos novos polissacáridos contem uma molécula de galactose, 0,2 a 0,4 moléculas de glicose, 2 a 2,5 moléculas de manose,, 1 molécula de ácido galacturónico e 1 molécula de acido pirúvico.

Os polissacáridos solúveis em água sao isolados a partir de lisados bacteriofágicos de cultura de pelo menos uma estirpe bacteriana do tipo Escherichia coli e Klebsiella pneuminiae. Estes diferentes lisados podem ser preparados de acordo com uma técnica descrita nomeadamente no pedido EP. 0139.551. Ε o processo de preparação destes lisados do tipo lise bacteriana baseia-se numa sequência de pelo menos dois estádios indispensáveis, nomeadamente uma lise bacteriofágica, e em seguida eliminação das bactérias nao lisadas e de resíduos bacterianos por filtraçao, centrifugação, etc. Este processo pode ser conduzido a partir de uma bactéria, ou com utilização sucessiva de bactérias de estirpes diferentes ou ainda com utuilizaçao simultânea de bactérias de estirpes diferentes.

De acordo com a invenção, concentra-se um filtrado de lise bacteriofágica e procede-se simultaneamente a uma selacçao de moléculas por passagem em membranas de permeabilidade selectiva, em seguida trata-se a solução de polissacáridos extraídos por cromatografia, recolha-se a primeira fracçao, dialisa-se, concentra-se a solução e refraç ciona-se por cromatografia, recolhe-se a primeira fracçao e leva-se ã secura.

Descobriu-se que era possível aperfeiçoar o processo substituindo o meio de cultura quimicamente nao definido por um meio sintético definido inteiramente dialisavel, como as formulas do meio de acordo com Adams (M.

H. Adams, Bactériophages Intersiences Nova Iorque p. 446, 1959) enriquecido ou o meio de acordo com Rogers (H. J. Rogers Infect. Immuno. p. 445, 1973).

Este meio pode ser então vantajosamente eliminado por utilização de dispositivos de permeabilidade selectiva de moléculas. A utilização destes mesmos dispositivos permita uma concentração dos filtrados de lise e facilita o trabalho com menos volumes. 0 ultrafiltrado pode ser levado a secura por exemplo por liofilizaçao.

A técnica de selecção de moléculas permite eliminar o meio de cultura, em particular por utilização de nembranas com permeabilidade selectiva, nomeadamente ultrafiltros, de igual modo que a concentração dos filtrados de lise e realizada igualmente pelo mesmo processo. As membranas com permeabilidade selectiva podem ser de naturezas diferentes, por exemplo em acetato de celulose, à base de po. lissulfonas, polímeros aromáticos, copolímeros de cloreto de vinilo e de acrilonitrilo, à base de polissulfonas com supor, te de polietileno. Estas membranas podem apresentar-se na forma plana, tubular ou ainda sob a forma de fibras ocas ou espirais. As membranas permitem uma concentração de moléculas de massa molecular superior ou igual a 10 000 e assim uma eliminação por diálise do meio de cultura das moléculas de baixo peso molecular. Ê desejável obter-se uma concentração de cerca de trinta vezes.

De acordo com uma variante, pode-se proceder a uma fase de purificação preliminar por tratamento da solução obtida com um alcanol de abixo peso molecular como por exemplo o etanol, metanol ou isopropanol.

Em seguida, purifica-se o concentrado por cromatografia em coluna. São convenientes vários tipos de cromatografia para efectuar o processo com excelentes;? resultados.

Estas cromatografias podem ser do tipo peneiraçao molecular utilizando passagens sucessivas em geis permitindo a ecclusao numa primeira fase das moléculas de bai. xo massa molecular e, numa segunda fase, a separaçao das moléculas de elevada massa molecular.

Estas cromatografias podem ser de tipo cromatografia de afinidade utilizando lecitinas insolubiliza das em gel ou anticorpos do tipo IgG ou IgM insolubilizados em gel. Os anticorpos podem provir de soro de animais verte4 brados imunizados contra os polissacáridos pretendidos, nome adamente soro de coelho, rato, cobaia e ratinho. Estes anticorpos, podem ser de origem policlonal ou monoclonal e produtos de acordo com os processos bem conhecidos dos especialistas. As lecitinas e os anticorpos sao insolubilizados em géis inertes do tipo agarose ou do tipo poliacrilamida anteriormente activados por técnicas conhecidas, como por exemplo, a do paranitrofenilo-cloroformato.

Estas cromatrografias podem ser de tipo cromatografia de permuta iónica. Os suportes utilizados podem ser como exemplo géis de poliacrilamida ou de celulose substituídos por grupos diétilaminoétilo ou resinas de poliestireno-divilbenzeno substituidas.

A primeira separaçao por cromatografia pode ser com vantagem do tipo afinidade com anticorpos imobilizados em gel inerte ou de tipo permutadora iónica.

A segunda separação por cromatografia é de preferência de tipo permuta iónica.

Estas diversas operações de cromatogra_ fia sáo seguidas com a ajuda de processos clássicos nomeadamente utilização da refractometria diferencial, espectrofotometria, espectofluorometria ou análise de hexoses neutras pelo processo do resorcinol sulfurico.

A fracçao correspondente aos polissacáridos pretendidos na invenção pode ser assim dialisada ou ultrafiltrada e levada â secura por processos tais como atomizaçao ou liofilizaçao.

Os polissacáridos da invenção sao dotados de propriedades farmacológicas e terapêuticas muito interessantes; eles sao nomeadamente dotados de propriedades imunomoduladoras. Eles apresentam no homeme uma execelente tolerância, Estes novos polissacáridos, enquanto medicamentos, encontram, por exemplo, a sua utilização no tratamento ou pre vençao no homem e no animal de doenças que provêm de uma resgulaçao do sistema imunitário, na prevenção ou tratamento das agressões infecciosas bacterianas, virais, de fungos ou parasitarias, bem como em reumatologia, na cicatrizaçao de feridas e em oncologia.

Os medicamentos, de acordo com a invenção, podem ser associados a uma substância antibiótica, como por exemplo tetraciclinas; antiviral, como por exemplo nucleótidos sintéticos interferindo com a síntese do ácido núcleico virai; antifungica, como o buclosamido; ou antiparasitária como por exemplo a doroquina.

Numa outra forma de realizaçao, os medicamentos, de acordo com a invenção, podem ser associados a outros produtos e composiçoes farmacêuticas, como por exemplo um agente anti-tumoral (citostáticos), um agente imuno-supressor (ciclosporina, imunoglobulinas antilinfocitarias) um agente antimitotico, como por exemplo os derivados do acido fólico, ou anti-inflamatório, como por exemplo a indometacina.

Os medicamentos de acordo com a invenção podem assim ser ligados a vectores macromoleculares que melhoram a sua biodisponibilidade, a sua eficiência ou diminuem a sua toxicidade. Como exemplo nao limitativo, estes vectores podem ser lipossomas, anticorpos, proteinas e outras macromoleculas.

A posologia util é susceptivel de grandes variações em função da composição do medicamento, da indicação prescrita, da forma de administraçao e da idade do paciente tratado. A determinação das doses uteis e deixada ao critério do médico ou do veterinário, como ê prática habitual, nos tratamentos de modulações da resposta imune.

Como exemplo, a posologia pode ter doses indo de 50 yig/dia a 50 mg/dia por via oral do homem na pr vençao ou profilaxia das infecções ou complicações infecciosas pós operatórias, nos tratamentos das infecções crónicas ou reincidentes das vias respiratórias ou urinárias. A dose habitual por via parentérica pode ser, de acordo com o paciente tratado e com a infecção em causa, de 50 /ig a 50 mg/dia no homem.

Como medicamento, os polissacáridos da invenção podem ser administrados por via oral, perlingual, parentérica, aérea, trans-cutânea, per-cutânea ou/tópica.

As composiçoes farmacêuticas correspondentes podem ser solidos ou líquidos e apresentarem-se nas formas farmacêuticas correntemente utilizadas em medicina humana ou veterinária como por exemplo: comprimidos simples ou drageifiçados, comprimidos de acçap prolongada, geleias, granulados, pós, soluçoes, xaropes, supositórios, preparações in jectáveis liofilizadas ou nao, ovulos, cremes, géis, pomadas loções, gotas, colírios, aerossóis. Os princípios activos podem ser incorporados como excipientes habitualmente utilizado nas composiçoes farmacêuticas, como por exemplo talco, o estearato de magnésio, sílica coloídal, sacarose, sorbitol, manitol, veículos aquosos ou nao, aquosos, gorduras de origem animal ou vegetal^ derivados parafínicos, glicóis, diversos agentes molhantes ou emulsificantes e conservantes.

Vao em seguida apresentar-se, a título não limitativo, exemplos de realizaçao da invenção.

EXEMPLO 1

Preparaçao com utilização sucessiva de bactérias da estirpe IClebsiella e Escherichia.

A bactéria da estirpe Klebsiella, es pécie pneumoniae, é do serotipo K68 referida no Instituto Pasteur de Paris com a referência 58,5.

espécie

Pasteur

A bactéria da estirpe Escherichia, coli, ê do serotipo 0119: B14, referida no Instituto de Paris com a referência 62.23.

fago, homologo de Klebsiella, pertence ao grupo morfológico (nomenclatura do Sub-Comité de Taxonomia das Bacteriofágos do International Committee for Taxonomy of Virus da I.A.M.S.), tem uma cabeça icosaédrica, uma cauda curta, difícil de pôr em evidência, e o manto e a placa terminal nao sao detectáveis. Em meio de gel, os patamares de lise têm 0,5 a 3 mm e sao de forma muito irregular, com contornos esbatidos e um centro claro.

n i r+ —

Os clones sao raros.

colifago pertence ao grupo morfologico (nomenclatura do Sub-Comité de Taxonomia dos Bacteriofagos do International Committee for Taxonomy of Virus da

I.A.M.S.), tem uma cabeça isomêtrica, uma cauda muito curta, difícil de pôr em evidência, um amnto e uma placa terminal nao detectáveis. Em meio de gel, os patamares de lise têm um diâmetro de 1 a 1,5 mm, uma forma redonda, contornos regulare um centro difuso e clones r+ confluentes.

As duas estirpes bacterianas sao cultivadas por meio de um fermentador num meio sintético inteiramente dialisavel de composição:

NH.Cl 4	l.OOg	L-Arginina	180,00 mg
KH P0₄	3, OOg	L-Glutamina	417,00 mg
Na„P0.12H_0 2 4 2	6,OOg	L-Lisina HC1	104,00 mg
MgS0₄7H₂0	4,55g	L-Metionina	22,00 mg
D-Glicose	140,OOg	L-Fenilalanina	47,00 mg
		L-Treonina	68,00 mg
L-Leucina	78,00mg	Ácido fólico	0,50 mg
L-Histidina		Inositol	1,00 mg
HC1	60,OOmg	Nicotinamida	0,45mg
L-Isoleucina	78,OOmg	Piridoxal HC1	0,50mg
L-Valina	67,00mg	Pantotenato de Ca	0,50mg
L-Triptonano	15,OOmg	Cloreto de Colina	0,50mg
		Tiamina HC1	0,50mg

meio é inseminado com um inoculado de Klebsiella pneumoniae que se encontra na fase de crescimento estacionária. A densidade inicial é de 1 x 10 bactérias por ml. A cultura é colocada a 37°C, com agitaçao moderada .

No fim da fase latente ou seja, cerca de 60 minutos após inseminação, as bactérias sao infectadas pelos seus fagos homólogos e a multiplicidade de infecçao óptima é de 0,03.

A evolução da lise é seguida com a ajuda de um contador celular. Quando restam menos de 10 bactérias por ml, o meio é de novo inseminado com um inoculado de Escherichia que se encontra em fase de crescimento estacija nário. A densidade inicial desta nova cultura é de 5 x 10? Escherichia por ml.

No fim da fase latente, ou seja nas condiçoes experimentais, 20 minutos após a segunda inseminação, as bactérias sao infectadas pelos colifagos. A multiplicidade de infecção óptima é de 0,1.

A evolução da lise e seguida com o auxilio de um condutor celular. Quando restam menos de 10 Escherichia por ml, a cultura e parada por passagem através de um filtro de membrana esterilizante de 0,22 /um.

filtrado é em seguida dialisado e concentrado por ultrafiltraçao tangencial. A solução resultante pode ser levada a secura por liofilizaçao ou passando directamente numa coluna de 5 cm de diâmetro, contendo 1 liR ·* tro de DEAE Trisacryl.: Segue-se a evolução por um gradiente de uma solução de fosfáto de sódio em que a concentração varia de 50 a 650 mM. 0 pH dessa solução é de 7,5. As fracções correspondentes ao primeiro pico de eluição (detecção das hexoses neutras pelo processo do resorcinol sulfurico) sao reunidas e dialisadas contra uma solução de fosfato de sódio 10 mM e pH 7,5. A fracçao obtida é em seguida feita passar numa coluna de 2,5 cm de diâmetro contendo 500 ml de resina DOWEX 50-X2® de 100 a 200 malhas (eluente: âgua destilada) .

As fracções correspondendo ao primeiro pico de eluição (detecção por refractometria ou de hexoses neutras pelo processo de resorcinol) sao neutralizadas pela sonda IN ou com amoníaco a 5%, reunidas e liofilizada. Obtêm-se os polissacáridos pretendidos purificados, em que a composição molar é a seguinte: para uma molécula de galactose, 0,2 moléculas de glicose, 2,2 moléculas de manose, molécula de ácido galacturónico, 1 molécula de ácido pirúvico na forma de piruvilideno.

EXEMPLO 2

Os polissacáridos sao obtidos de acor do com o procedimento operatório do exemplo 1 utilizando apenas a bactéria da estirpe Klebsiella pneumoniae. A composição dos polissacáridos obtidos é a seguinte: 69% de hexoses neutros, 0,25% de glicosamina, 7% de ácido pirúvico, 22,7% de ácido galacturónico e 0,86% de proteínas.

EXEMPLO 3 cm no filtrado de lise das estirpes bacterianas de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae, obtido de acordo com o procedimento do exemplo 1, ê dialisado contra um tampao de fosfato de sódio a 150 mM e pH 7,4. 0 filtra_ do ê em seguida feito passar através de uma coluna de 5 de diâmetro contendo 500 ml de gel GF 2 000 Trisaeryl® qual sao fixados de modo covalente 1,5 mg de anticorpos específicos por ml de gel. Após uma hora de incubação, lava-se a coluna com 4 vezes o seu volume com um tampao de fosfato 150 mM a pH 7,4. Faz-se a eluição com uma solução do mesmo tampao contendo 2 M de cloreto de magnésio. Retem-se uma fra£ çao igual a 2 vezes o volume da coluna e dialisa-se contra água destilada. Esta fracção ê liofilizada e contem os polissacáridos com a composição molar seguinte: para 1 MOLÉCULA de galactose, 2,5 moléculas de manose, 0,3 moléculas de glicose, 1 molécula de ácido galacturónico, 1 molécula de ácido pirúvico na forma de piruvilideno.

ESTUDOS FARMACOLÓGICOS dos polissacáridos da tos obtidos de acordo

As actividades invenção foram com os exemplos no animale no homem determinadas com produ1 e 2.

Activação dos macrofagos alveolares murinos

Este ensaio poê em evidência o fenómeno da activaçao dos macrofagos através da medida da sua actividade citostatica ou citotoxica sobre as células da li11

nhagem tumoral.

Os leucócitos fagocitarios da classe dos monócitos-macrofagos podem sofrer um processo de activaçao que se manifesta por propriedades como por exemplo o aumento de fagocitose, aumento da secreção de enzimas proteolí. ticas, metabólitos do oxigénio como o aniao superóxido ou o peróxido de hidrogénio e factores citotóxicos.

Estes processos contribuem para aumentar o poder bactericida e tumoricida dessas células.

Alem disso, este processo de activaçao permite às células aumentarem a sua capacidade de apresentação de diversos antigenos aos linfócitos T cooperantes. Finalmente, o fenómeno de activaçao dos macrofagos per. mite a secreção de monocinas tal como os interferoes ou interleucina 1 que intervêm no processo de resposta imunitária ensaio de medida de activaçao dos macrofagos consiste em tratar uma cultura de macrofagos alve lares ou peritonais do rato ou do ratinho ou de monócitos humanos com doses de polissacaridos da invenção variando entre 0,001 e 50 /ig/ml. Realiza-se do modo seguinte:

Colocam-se 10^ macrofagos de ratinho da espécie Balb c, Swiss, C57/B16 ou DBA/2 ou de. rato da espécie Kyoto ou Wiatar numa placa de microtitulaçao num meio de cultura completa ou não com soro artificial e 1 a 10 ^g/m de polimixina.

Adicionam-se os pdLissacar idos da invenção ou o tampao correspondente sem polissacaridos como controlo negativo. As células sao incubadas 24 horas a 37°C Elimina-se em seguida o sobrenadante e lavam-se as células, com meio de cultura.

Adicionam-se em seguida as células alvo tumorais L 1210 ou P 815 num meio completo. A relaçao de macrofagos/células alvo é de 10. Incuba-se em seguida a cultura durante 24 horas a 37°C. Adicionam-se em seguida „ _

- 2 x 10 Bq de timidina tritiada por furo. As células sao recuperadas após 24 horas de incohação a 37°C num filtro de fibra de vidro. Após secagem dos filtros, mede-se a radioacti vidade em presença de uma mistura cintilante.

Os resultados correspondem a uma média de 3 medidas. A percentagem de activaçao ê expressa por:

x 100

R: radioactividade incorporada pelas células tumorais cultivadas na presença de macrofagos de referência.

S: radioactividade incorporada pelas células tumorais cultivadas na presença de macrofagos estimulados.

Os resultados apresentados na tabela I mostram a actividade dos produtos de acordo cornos exemplos 1 e 3.

Produto ensaiadio	dose	percentagem de activaçãi dos macrófagos de alveo· lares de ratos Kyoto
Polisacaridos
de	0,01	Xig/ml	58%
ex 1	0,1	Atg/ml	62%
ex 3	1	Mg/ml	60%
	10	jug/ml	86%
Dipéptido de
muramilo (MDP)
referência positiva	0,01	Aig/ml	28%
	1	gg/ml	90%
	10	/Ug/ml	92%
Placebo			0%

Actividade indutora de interferão in vivo no homem

Os interferões sao um grupo de moléculas de origem proteica apresentando propriedades antivirais e imunomoduladoras. Nas condiçpes normais, o desaparecimento' rápido do interferão sérico nao permite uma dosagem directa no soro humano. Ê possível, para ultrapassar esta dificuldade medir a actividade duma enzima induzida pelo interferão: a 2’-5’ oligo-isoadenilato sintetase.Foi possivel demonstrar que esta enzima é um bom marcador do interferão (ref. L.J.Z. Penn e B.R.G. Williams, J. Virol., 49, 1984, p. 748-753) nos pacientes saos, a sua actividade nos linfocitos do sangue periférico é constante. Pelo contrário, esta aumenta forteme_n te em acso de infecção virai ou durante a administraçao exógena de interferão.

efeito de uma administraçao oral única em dose elevada dos polissacáridos da invenção foi ensaiada em 10 voluntários.

Um grupo de 5 individuos recebeú um placebo enquanto outro grupo de 5 individuos recebeu uma dose única de 2 mg dos polissacáridos da invenção preparados de acordo com o exemplo 1.

Foram feitas tomadas de sangue antes da administração do produto/bem como 24 e 48 horas depois. Os leucócitos periféricos foram isolados e lisados. A actividade da 2’-5 * oligo-isoadenilato sintetase foi medida nestes lisados.

Os resultados apresentados na Tabela II demonstram que uma dose única de 2 mg dos produtos induz um aumento significativo da actividade da 2’-5’-oligo-isoadenilato sintetase particularmente 48 horas após a tomada oral.

TABELA II

Variaçao da activiadade da 2’-5' oligo-isoadenilato síntetase. Os valores iniciais foram referidos a 100%..

Oh 24h 48h

Placebo

2mg de produto do Exemplo 1

100 82 109

100 145 . 208

Indução de factores inibidores da migraçao de leucócitos (MIF-LIF)

Foi realizado um estudo contra placebo em 2 grupos de voluntários que receberam um placebo ou uma dose única do produto de acordo com o exemplo 1 por via oral com a dose única de 2 mg. A administraçao foi realizada

- 15 de uma maneira

duplamente aleatória.

Foram feitas tomadas de sangue, as 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, e 96 h após a tomada do produto.

• Os resultados descritos na Tabela III demonstram claramente que produto induz uma inibição significativa da migraçao de leucócitos em relaçao ao placebo,

TABELA III

Oh 24h 48h 96h

Placebo 0 033

Produto do exemplo 1

2mg 0 8 22 28

Os resultados sao expressos em % de inibição da migração.

A indução de tais factores solúveis demonstra o efeito dos polissacaridos da invenção nos mecanismos que efectuam a resposta imune.

interesse da indução desses factores é ilustrado pelos ensaios clínicos referidos acima.

Prevenção e tratamento das infecçôes crónicas ou reicidente das vias respiratórias

Três experimentadores? estudaram no plano clinico os polissacaridos da invenção de acordo com o exemplo 1 numa populaçao de pacientes atingidos por bronquite crónica. Estes pacientes apresentaram pelo menos 2 episódios infecciosos nos 12 meses que precederam os ensaios. Foram excluídos os pacientes que apresentavam problemas graves das funções hepática, renal ou cardíaca. E também os que

recebiam uma antibioterápia sistemática, um tratamento imunomodular ou uma corticoterapia.

Foram assim tratados 46 pacientes, que cumpriram os critérios, com uma tomada oral de 0,06 mg de polissacáridos ou de um^! placebo em jejum pela manhã, 20 dias consecutivos por mês durante 3 meses.

estudo foi efectuado de uma maneira duplamente aleatória. Observaram-se os pacientes durante os 9 meses que se seguiram ao início do tratamento.

Os resultados apresentados na Tabela IV mostram o efeito do produto durante os 3 meses seguintes ao tratamento.

TABELA IV

	produto da invenção Exl	Pla- cebo	% diminuição	significa-
çao tica	estatis
Número de episódios infecciosos	0,57	0,91	37,4%	P <	0,05
Duração dos episódios infecciosos (dias)	5,91	11,96	50,6%	P <	0,05
Duraçao da antibioterapia (dias)	6,04	10,17	40,6%	P <	0,05

Estes resultados indicam claramente uma diminuição significativa dos episódios infecciosos, da duraçao desses episódios e da antibioterápia nos pacientes tratados com os polissacáridos da invenção, de acordo com o exemplo 1.

Prevenção das complicações infecciosas pós-operatórias

A depressão da imunidade â mediaça celular (DTH) a seguir a um choque operatório ê um fenómeno bem conhecido. Três estudos tiveram por objecto o efeito de um tratamento oral com os polissacáridos do exemplo 1 sobre a incidência das complicações infecciosas pós-operatórias.

Foram tratados 58 pacientes durante o período de 7 dias antes e depois da intervenção cirúrgica. Os tratamentos foram administrados por via oral à razao de 0,06 mg por dia de acordo com uma metodologia duplamente aleatória.

A imunidade à mediação celular foi avaliada 7 dias antes da intervenção, no dia da intervenção e 7 dias após a medida da reacçao cutânea obtida em resposta a 7 antigenes que tinham uma resposta imunitária celular (sistema IMC-ensaio de Biomérieux).

Os resultados obtidos sao apresentados na Tabela V

TABELA ¥

	Polisacáridos do Exemplo 1	Placebo
Diferença do resultado IMC-TEST entre j-7 e J0	- 6,3 mm	- 11,9 mm
Significação estatística	p < 0,01	p < 0,001

A depressão da imunidade â mediação celular provocada pela intervenção cirúrgica ó nitidameii te menor nos pacientes tratados com o produto do que nos tra tados com placebo. Por outro lado, durante os 7 dias a seguir ao acto cirúrgico, o produto da invenção leva a uma recuperação mais rápida dos valores normais da imunidade celular em relaçao ao placebo.

risco infeccioso sendo directamente proporcional ao valor da imunidade celular (ref.: J.I. GALLIN e A.S. FAUCI; Advances in Host Defense Mechanisms.

Ed. Ravem Press. Nova Iorque, 1986, vol. 6), o produto da iii vençao pode ser considerado como eficaz na prevenção e no tratamento das complicações infecciosas pós-operatórias.

ESTUDOS TOXICOLÕGICOS

Toxicidade aguda

Não foi observada qualquer toxicidade dos polissacáridos da invenção (mortalidade, aspecto macroscópico dos orgaos) no rato após uma administraçao oral de 20000 vezes a dose terapêutica.

Toxicidade crónica

Nenhuma toxicidade crónica durante 4 meses de tratamento no rato e no cao para uma dose diária oral de polissacáridos da invenção indo até 1 800 vezes a dose terapêutica.

Mutagenicidade

Os ensaios bacterianos de Ames demonstratram uma uasência de poder mutagênico dos polissacúridos da invenção.

TOLERÂNCIA

0s polissacáridos da invenção

administrados durante 3 meses consecutivos na dose terapêutica de O,G5mg/dia sao perfeitamente bem tolerados. Os exames da tolerância biológica realizados durante os diversos ensaios clínicos não demonstraram qualquer variação anormal dos parâmetros seguintes: fórmula sanguínea, hemoglobina, electr^o litos , ureia, glicémia, proteínas do soro, creatinina, ácido úrico, colesterol total, ALAT, ASAT, CK, fosfatases alcali nas e bilirubina. A tolerância e avaliada pelos médicos e pelos pacientes como excelente.

Claims

- I^a Processo para a preparação de novos polissacaridos a partir de um filtrado de lise bacteriofágica de cultura de pelo menos uma estirpe bactiriana do tipo Escherichia coli ou IClebsiella pneumoniae, caracterizado por se concentrar o referido filtrado e se proceder simultaneamente a uma escolha de moléculas por passagem em membranas com permeabilidade selectiva, em seguida tratar-se a solução de polissacáridos extraídos por cromatografia recolher-se a primeira fracçao, dialisar-se, concentrar-se a solução e refraccionar-se por cromatografia, recolher-se a primeira fracçao e levar-se ã secura.

- 2^ã Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a primeira cromatografia ser do tipo de afinidade com os anticorpos imobilizados ou do tipo de permuta iónica, a segunda cromatografia ser do tipo de permuta iónica, e a fracção contendo os polissacaridos ser levada a secura por liofilização.

- 3^â Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o filtrado & lise bacteriana ser obtido com utilização simultânea de bactérias das estirpes Escherichia coli e IClebsiella pneumoniae.

- 4 ^a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por os referidos polissa_ cáridos conterem 65 a 75% de doses neutras, 18 a 27% de ácidos uronicos, 5 a 9% de acido piruvico sob a forma de piruvi lideno, menos de 0,5% de osaminas, menos de 11% de proteínas, e com uma massa molecular superior a 50 000.

- 5^â Processo de acordo com a reivindicação 4? caracterizado por os referidos- polissacáridos conterem 65 a 75% de hexoses tais como a glicose, galactose ou manose,

18 a 27% de ácido úronico tal como o ácido galacturónico, 5 a 9% de ácido pirúvico, menos de 1% de proteínas, e menos de 0,5% de glicosamina.

- 6- Processo de acordo com a reivindicapor os referidos polissacáridos conterem galactose, 0,2 a 0,4 moléculas de glicose, manose, uma molécula de ácido galacturóde ácido pirúvico.

çao 5, caracterizado para uma molécula de 2 a 2,5 moléculas de nico e uma molécula

- 7^â çao 1, caracterizado extraídos pelo mebos

Processo de acordo com a reivindicapor os referidos polissacáridos serem de uma estirpe esooLhida entre as estirpes

Klebsiella pneumoniae K68, Escherichia coli 0119 depositada no Instituto Pasteir com as referencias respectivas de 58.5 e 62.23.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi a presentado na França em 8 de Setembro de 1987, sob o n^a 87 12.407.

22 Lisboa,7 de Setembro de 1988 0 AGEWTE ©FieiAL DA PROPRIEDADE iíWUSTíW