PT88385B - Processo para a preparacao de conjugados de citoquinas com imunoglobulinas - Google Patents
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Description
processo de preparação dos referidos conjuga^ dos consiste, essencialmente em se fazer reagir uma citoquina com imunoglobulina humana, e, se desejado, com um formador de pontes.
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Conjugados de citoquinas com imunoglobulinas presente invento relaciona-se com novos conjugados consistindo numa citoquina e uma imunoglobulina humana, se desejado, ligadas por meio de um formador-de-ponte, com processos para a preparação desses conjugados, com preparações farmacêuticas, e com a utilização daqueles conjugados para o tratamento de infecções a virus e de tumores.
Fundamentos do Invento
As citoquinas são proteínas e glicoproteinas solúveis que são segregadas pelas células somáticas, especialmente células imunocompetentes, como resposta a estimulação. As citoquinas possuem um grande número de actividades biológicas. São moléculas mensageiras que actij am (tomam parte) na regulação do estudo metabólico das células adjacentes, são produzidas localemnente nas células e são também normalmente eficazes apenas localmente. As citoquinas aumentam ou suprimem a actividade de uma célula adjacente no que se refere a uma propriedade especifica.
Exemplos de citoquinas são madiado res que influenciam monocitos e macrúfagos, tais como o fa£ tor inibidor da migração dos macrófagos (MIF), factor activa dor dos macrófagos (MAF) ou factor quimiotáctico para marófagos, mediadores que influenciam os leucócitos polimorfonuêleares, tais como factor inibidor dos leucócitos, factor inibidor da migração dos leucócitos (LIF) ou factor promotor da migração dos leucócitos, mediadores que influenciam os linfocitos, factores qua euxiliam as células especificas ou não especificas, em relação aos antigénios, mediadores que actuam sobre outras células, tais como 1inpotoxinas, factor de necrose de tumor (TNF), factor estimulador de colonia (CSF), factores inibidores do crescimento o promotores de crescimento, especialmente factor de crescimento da célula -B (BCGF), factor de crescimento afim da insulina (IGF), factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF) factor de crescimento do fibroblasto (FGF) e outros e também o grupo dos interferons (IFN) e o grupo das interleuquinas (IL):
Tal como a maior parte das citoqui nas, os interferons têm um peso molecular que varia entre cerca de 10.000 e 40.000 Daltons. Os interferons protegem as células em relação a um grande numero de virus, inibem o crescimento celular em culturas, influenciam as respostas imunitárias e aumentam a quantidade ou actividade de cerca e certos enzimas intra-celulares específicos. 0s interferons são subdivididos em três classes, nomeadamente interferons Y-, p e /. 0 interferon natural humano (huIFN ) é produzido por leucócitos e por células 1infobastoides e compreende pelo menos uma duzia de poliptidos diferentes que diferem uns dos outros na sua composição em amino ácidos e no seu grau de gl icosilação. 0 interferon natural yB humano (huIFNp) é formado por praticamente todas as células do organismo (corporais), por exemplo pelos fibroblastos e num grau pouco elevado também pelas células 1infoblastoides.
interferon natural ή humano (huIFN ), também chamado inter feron imunitário, é produzido por linfocitos-T ou células NK. Em contraste com o IFNoóe com o IFNB, o IFN/ ê labil em relação a (num) meio acido (pH2) e é distintivamente (cia ramente) diferente quanto às suas prorpiedades serologicas.
Objectivo do Invento objectivo do invento consiste em tomar as citoquinas disponiveis de modo a tornar possivel aumentar o seu tempo de residência e a sua concentração no plasma sanguíneo e nos tecidos. Uma solução especialmente apropriada para este problema é proporcionada por conjugados que consistem numa citoquina e numa imunoglobulina, se desejado ligadas por meio de um formador-de-ponte orgânico, conjugada esses que possuem surpreendentemente meias-vidas biológicas claramente mais longas do que as citoquinas livres São também descritos um processo para a preparação das conju gados preparações farmacêuticas, e a sua utilização no tratamento de infecções a virus e tumores.
Descrição do Invento invento relaciona-se com conjuga, dos de citoquinas como imunoglobulina humana.
Uma citoquina é uma proteina ou glicoproteina solúvel, que é sintetizada e se necessário, segregado, como resposta a uma estimulação por células somáti
-6cas, por exemplo células imunocompetentes, afim de realizar uma alteração metabólica nas células adjacentes, por exemplo a fim de influenciar as suas propriedades de crescimento, e é também um composto afim que difere de uma citoquina natural como resultado da substituição, omissão ou adição de um ou mais amino ácidos e/ou residuos de hidratos de carbono, ou é um fragmento de um composto tal que retenha a actividade biologica.
Por exemplo, um, dois, tres ou quatro amino ácidos de um péptido natural podem ser substitui, dos por outros amino ácidos ou podem ser omitidos completamente, um, dois, tres, ou quatro amino ácidos adicionais podem estar presentes, por exemplo na extremidade amino do péptido, um ou dois residuos de hidratos de carbono da glico proteina natural podem ser substituídos por outros residuos de hidratos de carbono ou um, dois, ou tres ou todos os rasiduos de hidratos de carbono podem estar ausentes.
Além disso, podem ser formados compostos afins, por exemplo, também de partes de duas citoquinas, diferentes.
Exemplosde citoquinas desta defini ção, são os factores que ocorrem naturalmente, tais como fac tor inibidor de migração dos macrofagos (MIF), factor activ£ dor dos macrofagos (MAF), interleuquina 1,2,3,4,5, ou 6 factor estimulador das colónias (CSF), linfotoxina, factor de crescimento da celula-B (BCGF), interferon alfa (IFN-à6) interferon beta (IFNJ3) ou interferon gama (IFNy), especia/ mente as citoquinas humanas correspondentes, também compostos que são afins ou idênticos aos factores naturais e que são
produzidos por tecnologia de gene recombinante nos procarion tes, nos eucariontes ou células dos mamíferos, tais como recombinante MAF, MIF, interleuquina, CSF, BCGF, linfotoxina, IFNaô, por exemplo IFNoòp IFN^, IFN<Xg, etc., até IFN e híbridos IFN oóA, IFNa//B, IFNaó/D, IFN oá/F ou IFN <=*VB-D, IFN^ ou IFN y , e também fragmentos dos compostos naturais ou recombinantes que retêm a actividade biologica. As hormo nas e os anticorpos (também chamados imunoglobulinas) que são segregados pelos linfocitos-B após estimulação por antigé nios e/ou mitogenios não se situam no âmbito da definição de citoquinas.
Uma imunoglobulina ê uma imunoglobulina humana (anticorpo) que peretence a classe A, D, E, G ou M de imunoglobulinas, de preferencia imunoglobulina G ou M. A região variavel da imunoglobulina possui uma especificidade arbitrária.
De preferencia, a imunoglobulina no conjugado do invento é uma mistura de anticorpos da mesma classe da imunoglobulina mas com tantas especificidades diferentes quanto possível, que possam ser obtidos a partir do sangue de seres humanos saudaveis.
Uma imunoglobulina no conjugado do invento pode, contudo, ser também um anticorpo humano policlonal ou monoclonal especifico em relação a um antigénio que seja estranho ao organismo (corpo).
Um conjugado é uma molécula híbrida em que estão combinadas uma ou mais citoquinas e uma ou mais imunoglobulinas. E um complexo quimico em que a ligação
-8<? _/ é realizada por meio de uma ligação química, por exemplo uma ligação ionica ou covalente, ou facultativamente, um formador -de-ponte por exemplo um formador-de-ponte orgânico, ou uma associação de moléculas envolvidas. Os complexos ou associa^ ções químicos mencionados são de preferencia estáveis em condições fisiológicas.
invento relaciona-se de preferen cia com conjugados com a formula:
Ck-Z-Ig (I) em que
CK é um residuo de citoquina humana ou de uma citoquina recombinante, Ig é um residuo de uma imunoglobulina humana e Z é uma ligação covalente ou um formador-de-ponte orgânico ligado covalentemente e em que CK, Ig e7ou Z podem também ocorrer varias vezes.
resíduos CK é mono- ou poli-valen te, por exemplo di- ou tri-valente, dependendo do numero de átomos de hidrogénio e/ou de grupos hidroxi que são substituidos por ligações a formadoras-de-ponte Z ou a resíduos de imunoglobulina Ig.
residuo Ig é mono- ou poli-valeii te, por exemplo di-, tri-, tetra- penta- ou hexa-valente, dependendo do numero de átomos de hidrogénio e/ou de grupos hidroxi que são substituidos por ligações a formadores-de-ponte Z ou a resíduos da citoquina CK.
Em conjugados com a formula I em que Z é uma ligação covalente, as citoquinas e as imunoglobulinas podem ligadas por uma ligação amida entre uma função amino ter minai ou uma função amino cadeia mlateral de um péptido e uma função acido carboxílico terminal ou uma função acido ca boxilico cadeia lateral de outro péptido, ou por uma ligação carbono-azoto entre uma função amino terminal ou uma função amino cadeia lateral de um péptido e um residuo hidratado de carbono de outra glicoproteina.
Nesses conjugados em que Z é uma ligação covalente, os resíduos da citoquina e da imunoglobulina são ligados de preferencia por uma 1igação'amida entre a função carboxi terminal da citoquina e uma função amino da imunoglobulina ou por uma ligação carbono-azoto entre uma função amino da citoquina e o residuo hidrato de carbono da imunoglobulina.
Um formador de ponta orgânico Z é um radical de hidrocarboneto polivalente por exemplo di-, tri-, ou tetra-valente, que é, desejado, substituido e/ou em que um ou mais átomos de carbono são se desejado substitui, dos por heteroátomos, e que é ligado covalentemente â citoquj, na e ao residuo da imunoglobulina por uma ligação simples amido, éster, amina, yioéter, tioéster ou dissulfureto, ou por uma dupla ligação carbono-azoto. Estes radicais hidrocar bonetos têm até 30, especialmente de 4 a 20 átomos de carbono e são, por exemplo, de natureza alifatica, cicloalifatica, aromatica, aralifatica ou araiifatica-cicloalifatica Os substituintes desses radicais hidrocarbonetos Z são, por exemplo, um ou mais, por exemplo dois, se desejado, grupos hidroxi protegidos, alcoxi inferior, alquilamino inferior
grupos oxo, se desejado grupos protegidos, grupos imino, nitro, alcoxi inferior, alquilamino inferior, di-alquilo inferj_ or-amino ou alquilo inferior, se desejado grupos hidroxi-alquilo inferior protegidos, se desejado grupos amino-alquilo inferior desejado protegidos, se desejado grupos mercapto-alquilo inferior protegidos, grupos metiltio-alquilo inferior, se desejado grupos carboxi-alquilo inferior protegidos, carbamoilo-alquilo inferior, amidino-alquilo inferior arilo-alquilo inferior, por exemplo fenilo-alquilo inferior ou se desejado grupos hidroxifenilo-alquilo inferior protegidos, e grupos heteroarilo-alquilo inferior, por exemplo, se desejado grupos indolilo-alquilo inferior ou imidazolilo-alquilo inferior protegidos. Nesses heteroátomos dos radicais hidrocarboneto que substituem os átomos de carbono, encontram-se por exemplo, oxigénio, enxofre e/ou azoto, sendo os átomos de azoto se desejado substituídos por alquilo inferior ou fazendo parte do anel cicloalifatico.
Os radicais hidrocarbonetos divalen tes sao, por exemplo, alquileno inferior, cicloalquileno, fenileno ou combinações desses radicais, tais como alquileno inferior-cicloalquileno, alquileno inferior-fenileno , alquileno inferior-cicloalquileno-alquileno inferior, alquileno inferior-fenileno-alquileno inferior, etc.,
Os radicais hidrocarbonetos em que os átomos substituem os átomos de carbono são, por exemplo, amino-alquileno inferior, alquileno inferior-amino-alquileno inferior-hidrazino-fenileno-amino, oxi-alquileno inferior, alquileno inferior oxi-alquileno inferior, tio-alquileno inferior, alquileno inferior-tio-alquileno inferior, alquile no inferior-ditio-alquileno inferior e azacicloalquileno em que o átomo de azoto substitui um atomo de carbono do anel, e combinações dos radicais mencionados, tais como, por exemplo, de 2 a 10 unidades repetidas de radicais aminoalqui
leno inferior iguais ou diferentes os quais se desejado são ligados a hidrazino-fenileno, amino-alquileno inferior-ditio-alquileno inferior-amino, alquileno inferior-azacicloalquileno, alquileno inferior-azabiciclo-alquileno-tio-alquileno inferior, alquileno inferior-fenileno-azacicloalquileno, alquileno inferior-cicloalquileno-azacicloalquileno, alquile no inferior-oxi ou amino-alquileno inferior-azacicloalquileno, azacicloalquileno-fenileno-azacicloalquileno, alquileno inferior-amino-fenileno-amino-alquileno inferior, alquileno inferior-oxi-alquileno inferior-oxi-alquileno inferior, etc.
Os radicais hidrocarbonetos trivalentes são, por exemplo, alquileno inferior-meti 1 ideno, feni_ leno-alqui1ideno inferior e radicais semelhantes e os sadicais correspondentes em que os átomos de azoto substituem átomos de carbono, por exemplo, amino-fenileno-hidrazini1 ide no. Os radicais hidrocarbonetos tetravalentes sao, por exemplo, alcano inferior diliideno, cicloalcanodii1ideno ouA radicais semelhantes.
Os radicais hidrocarbonetos trivalentes são, por exemplo, alquileno inferior-meti1ideno, fenileno-alqui1ideno inferior e radicais semelhantes e os radicais correspondentes em que os átomos de azoto substituem átomos de carbono, por exemplo, amino-fenileno-hidrazini1id£ no. Os radicais hidrocarbonetos tetravalentes são, por exem pio, alcano inferior diliideno, cicloalcanodii1ideno ou radicais semelhantes.
A expressão inferior utilizada em alquilo inferior, alcoxi inferior, alquileno inferior, etc., indica que esses grupos têm 1 a 7, de preferencia 1 a 4,
-12átomos de carbono. 0 alquilo inferior de preferencia tem até 4 átomos de carbono e é, por exemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo ou terc.-butilo. 0 alcoxi inferior tem de preferencia até 4 átomos de carbono e é, por exemplo, metoxi, etoxi, propoxi ou butoxi. 0 alquileno inferior tem de preferencia até 7 átomos de carbono e é, por exemplo, metileno, etileno, 1,3-propileno, 1,4-butileno ou 1,6-hexileno.
cicloalquoleno tem de preferencia de 3 a 8 átomos de carbono, e é, por exemplo, 1,2-ciclopentileno, 1,3-ciclopentileno, 1,4-ciclohexileno ou
1,5-ciclooctileno. 0 fenileno é 1,2- 1,3- ou 1,4-fenileno azaciclo alquileno, é, por exemplo, 1-aza-1,2-ciclopentile no, 1-aza-1,3-ciclopentileno ou 1-aza-1,3-ciclohexileno.
Os grupos protectores são os grupos habitualmente usados na quimica dos péptidos ou dos hidratos de carbono.
Um grupo amino protegido, apresen ta-se, por exemplo, sob a forma de um grupo acilamino, arilmetilamino, 2-acil-alquenilo inferior-1-amino ou silil-amino rapidamente separavel (clivavel) ou sob a forma de um grupo azido. Os grupos protectores de amino preferidos são radicais acilo de semiésteres de acido carbonico, especialmente terc.-butoxi-carbonilo, se desejado benziloxicarbonilo, substituido, difenilmetoxicarbonilo, 2-halo-alcoxi inferior carbonilo, tritilo ou formilo.
Um grupo hidroxi é protegido, por exemplo, sob a forma de um grupo aciloxi rapidamente separavel (clivavel), especialmente um grupo oxicarboniloxi, tal como terc.-butoxicarboniloxi, benziloxicarboniloxi ou 2-halo-alco xi inferior-carboniloxi, ou um grupo éter rapidamente separavel (clivavel), especialmente arilmetoxi, tal como tritiloxi, 1-oxialcoxi, tal como 1 -etoxietoxi, ou 2-tetrahidropi_ raniloxi, e sililoxi, tal como terc.-butildimetilsililoxi.
Um grupo carboxi é protegido, por exemplo, sob a forma de um grupo éster rapidamente separavel (clivavel). Os grupos protectores de carboxi são terc.butoxi, se desejado benziloxi substituído, difenilmetoxi, aliloxi e 2-(trimeti1si1i1)etoxi.
Um grupo mercapto é protegido, por exemplo, sob a forma de um grupo tioéster, monotioacetal tioêter ou dissulfureto rapidamente separavel (clivavel).
Um formador de ponte Z é ligado com o residuo dz citoquina e com o residuo da imunoglobulina, por exemplo por meio de uma ligação amida entre a função terminal ou uma função amino cadeia lateral da citoquina ou imunoglobulina e uma função carboxi de Z, por uma ligação amido entre a função carboxi terminal ou uma função carboxi cadeia lateral da citoquina ou da imunoglobulina e uma função amino de Z, por ligação simples ou dupla azoto-carbono entre uma função amino terminal ou cadeia lateral de citoqui_ na ou imunoglobulina e um átomo de carbono de Z, por uma ligação simples ou.dupla carbono-azoto entre um residuo hidrato de carbono da imunoglobulina e uma função amina ou
-14hidrazina de Z, por uma ligação éster entre uma função hidro xi de um amino ácido ou de um residuo hidrato de carbono da citoquina ou imunoglobulina e um átomo de carbono de Z, por uma ligação tioéter ou tioéster entre uma função mercapto de um residuo cisteina da citoquina ou da imunoglobulina e um átomo de carbono de Z ou por uma ponte dissulfureto entrz uma função mercapto de um residuo cisteina da citoquina ou imunoglobulina e uma função mercapto de Z.
Um formador-de-ponte Z é, por exem pio, 1-oxo-alquileno inferior ou 1-oxo-alquileno inferior-amino, tal como carbonilo-propileno, carbonilo-propileno-amino, carbonilo-etileno, carbonilo-etileno-amino, ou de preferencia carboni1-metileno. De preferencia, esse grupo Z estáligado a citoquina ou a imunoglobulina no grupo carbon^ lo e no radical amina por uma ligação amida, e, se desejado, é ligado na extremidade alquileno inferior por uma ligação simples carbono-azoto.
Um outro formador-de-ponte Z é, por exemplo, um radical divalente ou trivalente consistindo em de 1 a aproximadamente 10, de preferencia de 1 a 3, grupos carbonilo-metileno-amino, e se desejado, um grupo car bonilo-metileno, fenileno-hidrazino ou fenileno-hidrazini1 ide no. Nesse grupo carboniloímetileno-amino, se desejado, o metileno é substituido por alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, amino-alquilo inferior, mercapto-alquilo inferior metiltio-alquilo inferior, carboxi-alquilo inferior, carbamoilo-alquilo inferior, amidino-alquilo inferior, fenilo-alquilo inferior, hidroxifenilo-alquilo inferior, indolilo, -alquilo inferior ou imidazolilo-alquilo inferior, por exemplo tal como nos resíduos dos amino ácidos que surgem naturalmente glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina,
-15serina, treonina, lisina, cisteina, metionina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, fenij_ alanina, tirosina, triptofano e histidina. 0 metileno e o amino num grupo carbonilo-metileno-amino podem também ser ligados por alquileno inferior, por exemplo tal como no residuo do amino acido prolina que ocorre naturalmente.
Os grupos carbonilo-metileno-amino são ligados uns aos outros e ao grupo carbonilo-metileno por ligações amida. De preferencia, um tal formador de ponte est-a ligado à citoquina ou imunoglobulina na extremidade carbonilo e na extremidade amino por uma ligação amida, e se aplicaevl na extremidade metileno e/ou na extremidade hidrazina por uma ligação simples carbono-azoto e na extrenn dade hidrazini1ideno por uma dupla ligação carbono-azoto.
Exemplos desses formadores-de-ponte são os resíduos tripeptidicos glicina-alanina-arginina, iso leucina-alanina-tirosina, os resíduos pentapeptidicos leucina-glicina-alanina-arginina, glicina-glicina-leucinaalanina-tirosina, alanina-isoleucina-alanina-isoleucina-lisina e formadores de ponte em que esses resíduos peptidicos são ligados na extremidade azoto a carbonilo-metileno, 4-fenileno-hidrazino ou 4-fenileno-hidrazini1ideno.
Um outro formador-de-.ponte. Z ê um radical divalente amino-alquileno inferior-tio, de prefe rência, amino-etiléno-tio, oxo-alquileno inferior-tio, de preferencia carbonilo-metileno-tio ou carbonilo-etileno-tio, metileno-carboni1-metileno-tio ou 1-imino-alquileno inferior-tio, de preferência carboni1imidoilo-propileno-tio. Nesse formador-de-ponte a função tio está ligada a um residuo cisteina da citoquina ou da imunoglobulina por meio de uma
-16* 1 ponte dissulfureto.
Um outro formador-de-ponte Z é um radical divalente amino-alquileno inferior-tio, de prefé rência amino-etileno-tio, oxo-alquileno inferior-tio, de preferencia carboni1-metileno-tio ou carboni1-etileno-tio , metileno-carbonil-metileno-tio ou 1-imino-alquileno inferior tio, de preferencia carboni1imidoi1-propileno-tio.
Neste formador de ponte a função tio está ligada a um residuo cisteina da citoquina ou da imunoglobulina por uma ponte dissulfureto.
Um outro formador-de-ponte Z é o radical amino-alquileno inferior-di-tio-alquileno inferioramino, de preferência amino-etileno-ditio-etileno-amino, ou oxo-alquileno inferior-ditio-oxo-alquileno inferior, de preferencia carbonil-meti 1eno-ditio-metileno-carbonilo, carboni1-etileno-ditio-etileno-carbonilo ou carboni1-propile no-ditio-propileno-carbonilo, oxo-alquileno inferior-ditio-imino-alquileno inferior, por exemplo carboni1-metileno-, etileno, ou propileno-ditio-propileno-carbonimidoilo, ou imino-alquileno inferior-ditio-imino-alquileno inferior, por exemplo carbonimidoil-propileno-ditio-propileno-carbonj_ midoil ou carbonimidoi1-butileno-ditio-butileno-carbonimidoilo.
Nesses formadores-de-ponte a função carbonilo está ligada â citoquina ou imunoglobulina de preferencia por uma ligação amida e a função carbonumidoj. lo de preferencia por uma ligação tio-iminoester.
Um outro fórmador-de-ponte Z ê, por exemplo, um radical divalente que é formado por um lado a partir de oxo-alquileno inferior, tal como carboni1-etileno, a partir de cvarboni1-cicloalqui1ideno, tal como carboni 1-1,4-ciclohexi leno, a partir de metileno-carboni1-metileno metileno-carboxi-alquileno inferior, tal como metileno-carbo xi-metileno, a partir de metileno-carboxamido-alquileno inf/ rior, tal como metielno-carboxamido-metileno, ou a partir de carboni1-fenileno, de preferencia carboni1-1,3-fenileno, e por outro lado a partir de 1-succinimidileno-3,1-succinimidileno-3-tio-alquileno inferior-aminq, tal como 1-succini_ midileno-3-tio-etileno-amino, a partir de 1-succinimidileno-3-tio-oxoalquileno inferior em que o alquileno inferior é, por exemplo, etileno ou, de preferencia, propileno, a partir de 1-succinimidileno-3-tio-metileno-carboni1-metileno ou a partir de 1-succinimidileno-3-tio-imino-alquileno inferior em que o alquileno inferior é de preferencia butile no. Os dois grupos do formador-de-ponte são ligados um com o outro por meio de um átomo de azoto de succinimidileno.
Um radical 1-succinimidileno-3 de um fromador-de-ponte é ligado, por exemplo, ao carbono 3 de um grupo mercapto de um residuo cisteina da citoquina ou da imunoglobulina. Especialmente preferidos são os forma dores-de-ponte carbonil-1,3-fenileno-1-succinimodileno-3tio-etileno-carbonilo e carboni1-1,3-fenileno-1-succinimidileno-3-tio-propileno-carbonimidoilo, que são ligados â citoquina e â imunoglobulina por ligações amida e uma ligação tioiminoéster.
Um outro formador-de-ponte Z é, por exemplo, um radical alquileno inferior divalente, um radical alquileno inferior-meti1ideno trivalente ou um radical alcano inferior diilideno tetravalente, sendo possivel,
que estes radicais sejam substituídos por alquilo inferior, por exemplo 1,5-pentileno, 3-metil-1,5-pentileno, 3,3-dime ti 1-1,5-pentileno, 1,6-hexileno, 1,4-butileno-meti1ideno,
1,5-pentidi1ideno, 3-meti1-1,5-penti1ideno, ou 3,3-dimetil-1,5-penti1ideno, de preferencia 1,5-pentileno e 1,5- pentj_ i1ideno.
Este formador de ponta está de preferencia ligado a citoquina e â imunoglobulina por uma ligação simples carbono-azoto ou dupla ligação.
Um outro formador-de-ponte Z é, por exemplo, um radical alquileno inferior divalente tendo 2 grupos hidroxi, por exemplo 2,3-dihidroxi 1-4,butileno ou, de preferencia, 2,4-dihidroxi-1,5-pentileno, ou alquileno inferior-oxi-alquileno inferior e alquileno inferior-oxi-alquileno inferior-oxi-alquileno inferior tendo 2 grupos hidroxi, por exemplo (2-hidroxi-1,3-propileno)-oxi-(2-hidroxí-1,3-propileno) ou (2-hidroxi-1,3-propileno)-oxi-(1,4butileno)-oxi-(2-hidroxi-1,3-propileno). Este formador-de-ponte está de preferencia ligado â citoquina e a imunoglobulina por uma ligação simples carbono-azoto.
Um outro formador-de-ponte Z é, j5or exemplo, um radical carbonil-amino-fenileno-aminc-carboni divalente, o qual se desejado, ê substituido por grupos alquilo, por exemplo carbonil-amino-1,4-fenileno-amino-carbo nilo ou carbonil-amino-1-metil-2,4- ou 2,6-fenileno-amino-carbonil, ou os correspondentes radicais tiocarbonilo.
Este formador-de-ponte está ligado a um grupo amino da citoquina e da imunoglobulina por uma ligação amida sendo assim um derivado da ureia opu da tioureia.
-19Em comparação com as citoquinas isoladamente, os conjugados do invento possuem surpreendentemente um tempo de residência de meia vida no plasma sangui neo e nos tecidos substancialmente mais elevado. Esta obser vação podem ser feita, por exemplo, injectando animais de laboratorio, por exemplo ratinhos, ratos ou coelhos, intravenosamente, subcutâneamente ou intramuscularmente apenas com citoquinas, com conjugados de de acordo com o invento, e com misturas de citoquinas e imunoglobulinas não-conjugadas, colhendo amostras de sangue e tecidos e/ou com vários intervalos de tempo e verificando o seu conteúdo em citoquj_ na ou conjugados de citoquina.
Este teste demonstra que, em compa. ração com as citoquinas isoladamente ou com misturas citoquj. na-imunoglobulina, o tempo de residência da meia vida dos conjugados do invento é mais elevado por um factor de 5 ou mais.
Os conjugados do invento podem assim ser utilizados mesmo modo que as citoquinas correspondentes por si mesmas para o tratamento de infecções a virus e/ou tumores.
Em comparação com as próprias cito quinas, contudo, os conjugados do invento podem possuem a vantagem de poderem ser usados em quantidades claramente mais pequenas devido ao seu tempo de residência mais longo no organismo e especialmente na corrente sanguínea e nos tecidos. Além disso, espera-se que os conjugados do invento, quando aplicados directamente ao local no qual devem actuar, irão ali permanecer mais tempo levando assim a um menor numero de efeitos secundários, por exemplo, no siste-20ma nervoso central.
invento relaciona-se especialmente com conjugados com a formula I, em que
CK é um residuo de um interferão humano natural ou recombinante, de interleuquina, de um composto afim ou de um fragmento que retenha a actividade biologica, por exemplo interferon alfa, beta ou gama, interleuquina 2 ou uma proteína ou glicoproteina recombinantes em que um, dois, tres, ou quatro amino ácidos de um interferon ou interleuquina foram substituidos ou omitidos, além disso um, dois, três, ou todos os resíduos hidratos de carbono de um interferon ou interleuquina faltam, partes de dois interferons ou interleuquinas diferentes são combinados um com o outro, ou apenas a parte biológicamente activa do interferon ou da interleuquina está presente, Ig é um residuo de uma imunoglobulina humana natural, por exemplo, uma imunoglobulina G ou M a partir do sangue de um.. ser humano saúdavel,
Z ê uma ligação covalente de/ou um radical hidrocarboneto di-, tri- ou tetra-valente ligado covalentemente o qual, se desejado, é substituido e/ou em que, se desejado, um ou mais por exemplo dois, tres ou quatro, átomos de carbono foram substituidos por átomos de oxigénio, enxofre e/ou azoto não substituido ou substituído, por exemplo alquileno inferior cicloalquileno, fenileno e combinações dos tres radicais mencionados uns com os outros e/ou com oxi, tio e amino nao substituido ou substituido em alquilo inferior, também como azacicloalquileno, sendo possível para os referidos radicais serem substituidos por hidroxi, oxo, amino, imino, alcoxi inferior, alquilamino inferior, di-alquilo inferior, amino, alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, amino-alquj. lo inferior, mercapto-alquilo inferior, metiltio-alquilo,
-21inferior, carboxi-alquilo inferior, carbamoílo-alquilo infe rior, amidino-alquilo inferior, fenilo-alquilo inferior, hidroxifenilo-alquilo inferior, indolilo-alquilo inferior ou por imidazol i lo-alqui lo inferior, também alquileno infer_i_ or-meti1ideno, fenileno-alqui1ideno inferior, amino-fenileno-hidrazini1ideno, alcano inferior diilideno ou cicloalcanodiilideno, e em que CK, Ig e/ou Z também podem ocorrer varias vezes por exemplo duas vezes ou tres vezes.
invento relaciona-se mais especi almente com conjugados com a formula I, em que
CK é um ersiduo de um interferon humano natural ou recombinante ou de um composto afim, de por exemplo, interferon natu ral alfa, interferon natural gama, interferon recombinante alfa, por exemplo, IFNo/p IFNo/2, IFNo<3, a IFNotjg, e IFNoí/A, IFN o^/B, IFN°Ó/D, IFN <xí/F ou IFN ^/B-D hibrido sob a forma de glicosilada ou não glicosilada e com, se desejado, um a quatro amino ácidos substituidos não existentes ou adicionais, ou interferon recombinante gama,
Ig é um residuo de uma imunoglobulina humana natural por exemplo uma imunoglobulina G ou M a partir de sangue de um ser humano saudavel, eZé uma ligação covalente ou um radica hidrocarboneto divalente ligado covalentemente o qual, se desejado, é substituido por oxo ou imino e/ou em que um ou mias, por exemplo dois, tres ou quatro, átomos de carbono foram substituidos por átomos de oxigénio, enxofre e/ou azoto, por exemplo alquileno inferior não substituido ou substituído em oxo e/ou imino e combinações desse radical com oxi, tio, amino, fenileno e/ou azacicloalquileno, por exemplo 1-oxo-alquileno inferior, por exemplo carbonil-propi
-22leno, carboni1-etileno ou carbonil-metileno, 1-oxoalquileno inferior-amino, por exmeplo carboni1-propileno-amino ou carbonil-etileno-amino, amino-alquileno inferior-tio, por exemplo amino-etileno-tio, oxo-alquileno inferior-tio, por exem pio carbonilmetileno-tio, carboni1-etileno-tio ou metileno-carbonil-metileno-tio, 1-imino-alquileno inferior-tio, por exemplo carbonimidoi1-propileno-tio, amino-alquileno inferior-ditio-alquileno inferior-amino, por exemplo amino-etileno -ditio-etileno-amino, oxo-alquielno inferior-ditio-oxo-alquileno inferior, por exemplo carboni1-metileno-ditio-metileno-carboni1, carbonil-etileno-ditio-etileno-carbonil ou carbonilpropileno-ditio-propileno-carboni 1 , oxo-alquileno inferior-ditio-imino-alquileno inferior, por exemplo carboni 1 -eti leno-di ti opropi leno -carbonimidoi lo, imino-aluileno inferior-ditio-imino-alquileno inferior, por exemplo, carbonimidoi1-propileno-ditio-propilenocarbonimidoilo, carbonil-fenileno-succinimidileno, por exemplo carboni1-1,3fenileno-1-succinimidileno , por exemplo carboni1-1,3-fenileno- 1-succinimidileno-3 , carbonil-fenileno-succinimidileno-tio-alquileno inferior-amino, por exemplo carboni1-1,3-fenj^ 1eno-1-succinimidileno-3-tio-etileno-amino, carboni1-fenileno-succinimidi leno-tio-oxo-alqui leno inferior, por exemplo, carboni1-1,3-fenileno-1-succinimidileno-3-tio-etileno-carbonilo, ou carbonil-fenileno-succinimidileno-tio-imino-alquileno inferior, por exemplo carboni1-1,3-fenileno-1-succinimidi leno -3-t io-propi leno -carbonimidoi lo .
invento relaciona-se mais especialmente com conjugados com a formula I em que CK é um res£ duo de um interferon humano alfa natural ou recombinante, por exemplo IFNoZ 2b ou IFN ^/B-D híbrido, Ig é um residuo de uma imunoglobulina humana G natural, por exemplo tal como pode ser obtido a partir do sangue de um ser humano saudavel e
Z é um radical alquileno inferior-ditio-alquileno inferior ligado covalentemente substituido em oxo ou imino, por exemplo carboni1-etileno-ditio-etileno-carboni1, carboni1-eti le no-ditio-propileno-carbonimidoilo ou carbonimidoi1-propileno-ditio-propileno-carbonimidoilo. Mais especialmente o invento relaciona-se com os conjugados mencionados nos Exemplos.
invento relaciona-se também com um processo para a preparação de citoquinas com imunoglobulinas humana que compreende a reacção de uma citoquina com imunoglobulina e, se desejado, um formador-de-ponte. A conjugação é realizada de acordo com métodos que são conhecidos per se.
invento relaciona-se de preferência com um processo para a preparação de conjugados com a formula
CK - Z - Ig (I), que compreende a reacção de 2 ou 3 sub-unidades reactivas do conjugado com a formula I umas com as outras de modo a formar-se um conjugado tendo ligações covalentes, e isolamento do conjugado.
presente invento relaciona-se especialmente com o referido processo que compreende:
a) para a preparação de um conjugado com a formula I em que as sub-unidades são ligadas por uma ligação amida, conden sado uma sub-unidade contendo um grupo amino com a sub-unidade complementar contendo um grupo acido carboxílico ou com um seu derivado reactivo, ou
b) para a preparação de um conjugado com a formula I em que as sub-unidades são ligadas por uma ligação dissulfureto tratando duas sub-unidades complementares contendo ambas um grupo mercapto com um reagente da oxidação suave, ou
c) para a preparação de um conjugado com a formula I em que as sub-unidades estão ligadas por uma ligação dissulfureto, substituindo um derivado funcional substituível reacti vo do grupo mercapto de uma sub-unidade com a sub-unidade con tendo um grupo mercapto, ou
d) para a preparação de um conjugado com a formula I em que as sub-unidades estão ligadas por uma ligação carbono-eii xofre, adicionando uma sub-unidade contendo um grupo mercapto â sub-unidade contendo uma dupla ligação carbono-carbo no ou contendo uma função epóxido, ou substituindo uma liga ção carbono-halogenio pelo grupo mercapto, ou
e) para a preparação de um conjugado com a formula I em que as sub-unidades estão ligadas por uma ligação simples ou dupla carbono-azoto, condensado com um grupo aldeido de uma sub-unidade com a sub-unidade complementar contendo um grupo amino ou hidrazino , e, se desejado, reduzindo a resultante dupla ligação carbono-azoto a uma ligação simples carbono-azoto com um agente de redução, ou
-25f) para a preparação de um conjugado.com a formula I em que as sub-unidades são ligadas por uma ligação simples car bono-azoto, adicionando uma sub-unidade contendo um grupo amino ou hidrazino â sub-unidade complementar contendo uma função epóxido, ou substituindo uma logação carbono-halogenio pelo grupo amino ou hidrazino.
Pares de sub-unidades que podem ser ligadas entre si de acordo com a processo a) por uma ligação amida são, por exemplo, uma citoquina e uma imunoglobulina que contem cada uma um grupo carboxi livreou um grupo amino livre, uma citoquina e uma imunoglobulina substituídas por um ou mais formadores-de-ponte contendo um grupo livre carboxi e/ou amino, uma citoquina substituída por um ou mais formadores-de-ponte contendo um grupo livre carboxi e/ou amino e uma imunoglobulina,ou uma citoquina e uma imunoglobulina transportando cada uma delas uma metade formadora-de-ponte contendo um grupo carboxi livre e um amino livre, respectivamente, e estas duas metades em conjunto formam um formador-de-ponte Z. Esses pares de sub-unidades ou misturas de tres sub-unidades consistindo em citoquina, imunoglobulina e um formador-de-ponte contendo uma função carboxi livre e uma função amino livre são tratados com um agente de condensação. Agentes de condensação apropriados são aqueles que são usados convenientemente em quimica pepti. dica, por exemplo, carbodiimidas, por exemplo, Ν,Ν'-diciclo hexi1-carbodiimida, de preferencia carbodiimidas solúveis na agua tais como N-eti1-N1-(3-dimetilaminopropi1)-carbodiimida ou N-eti1-N1 -(3-N-morfolinopropi1)-carbodiimida, ou isocianetos, por exemplo isocianeto de 2-(N-morfolino-etiló), se desejado na presença de uma amina terciaria, por exemplo trietilamina, N-metilmorfolino, ou 4-dimetilaminopiridina, e de um composto hidroxi activado, formador de éster, por exemplo N-hidroxi-succinimida, imida de acido N-hidroxi-5norborneno-2,3-dicarboxilico, ou 1-hidroxibenzotriazole,
-26Outros agentes de condensação apropriados, são por exemplo,
2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina ou fosfatos activados, tais como difeniIfosforoazidato ou dietilfosforo cianidato, se desejado na presença de uma amina terciária.
A condensação ê realizada num solvente aquoso que pode conter um tampão orgânico ou inorg_â nico e/ou um diluente orgânico miscivel, por exemplo um alca nol inferior, por exemplo terc .-butanol, um alcano inferior diol, por exemplo glicol, dimetilformamida, acetonitrilo, etc., a temperaturas variando entre aproximadamente -20°C e aproximadamente +50°C, de preferencia entre 5°C e a tempe raturam ambiente.
Os derivados funcionais reactivos das sub-unidades no processo a) podem ser formados in situ e são, por exemplo, derivados reactivos do acido carboxiH co, por exemplo ésteres activados do acido carboxilico, anidridos misturados reactivos, amidas cíclicas reactivas, isocianatos ou isotiocianatos.
Os esteres activados dos ácidos carboxilicos são, por exemplo, do tipo ester vinilico, por exemplo esteres vinilicos, esteres vinilicos carbamoilos ou ésteres 1-alquilo inferior vinilicos, ésteres de tipo amidj. na, por exemplo esteres amidinodi-substituídos em N,N' que podem ser obtidos tratando o acido correspondente com uma carbodiimida di-substituida em N,N'apropriada, por exemplo com N,N1-diciclohexilcarbodiimida, ou também ésteres amidj_ no di-substituidos, em N,N, ésteres arilo apropriados, especialmente ésteres fenilicos substituídos por substituiji tes que atrem electrão, por exemplo 4-nitrofeni1, 2,4,5-tri
-27ς\ clorofenil, éster pentaclorofeni1ico, ou 4-feniIdiazofeniΠ co, ésteres cianometi1icos, toésteres, especialmente tioéster nitrofeni1ico, ou de preferencia esteres amino ou amido que foram obtidos, por exemplo, tratando o correspondente acdio com um composto N-hidroxiamino ou N-hidroxiamido, por exemplo com N-hidroxisuccinimida, N-hidroxipiperidina, N-hidroxiftalamida, imida de acido ou N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxi1ico ou 1-hidroxibenzotriazole.
Os anidridos misturados reactivos de ácidos são, por exemplo, anidridos com ácidos inorgânicos por exemplo haletos ácidos, especialmente cloretos ácidos, anidridos com semiésteres alquilicos inferiores de acido carbonico, anidridos com ácidos fosforicos ou derivados do acido fosforico, dihalogenados, especialmente diclorinados, anidridos com ácidos carboxílicos fortes, por exemplo acido, trifluoroacético, ou anidridos com ácidos ulfonicos orgânicos, por exemplo ácidos alcano inferior sulfonicos ou ácidos arilsulfonicos, tais como acido metano- ou p-tolueno-sulfonj_ co.
Amidas cíclicas apropriadas são especialmente aquelas com diazaheterociclos aromáticos com cinco membros por exemplo amidas com imidazole ou pirazole, por exemplo com 3,5-dimetilpirazole.
Os derivados reactivos de acido carboxílico são reagidos com um reagente contendo um grupo amino livre em condições de reacção idênticas às que foram atras descritas para sub-unidades não-activadas exceptuando o facto do agente de condensação poder ser omitido. De preferencia, é adicionado um composto de ligação com ácido, por exemplo, um carbonato de metal alcalino ou carbonato de
metal alcalino ou carbonato de hidrogénio, por exemplo carbonato de sodio ou de potássio ou carbonato de hidrogénio, habitualmente juntamente com o sulfato correspondente, ou uma base organica por exemplo uma tri-alquilo amina impedida estericamente, por exemplo diisopropilamina de etilo.
De preferencia, os ácidos carboxilicos reactivos são derivados do fromador-de-pontas, por exem pio dicloretos de acido dicarboxi1ico, diésteres activados de acido dicarboxi1ico, diisocianatos, por exemplo, fenileno -1 ,4-diisocianato ou 1-meti 1-fenileno-2,4-diisocianato, ou di isotiocianatos.
Os materiais de partida para o processo a) são conhecidos ou podem ser preparados de acor do com o processos conhecidos, por exemplo, por meio de um processo tal como é descrito aqui atras ou aqui a seguir
Pares de sub-unidades que podem produzir uma ligação dissulfureto de acordo com o processo
b) ou c), são, por exemplo, uma citoquina e uma imunoglobulina que cont?em ambas uma metade formadora-de-ponte contendo uma função mercapto e em que as metades formadoras -de-ponte em conjunto formam o radical Z. No processo c) o grupo mercapto de uma das duas sub-unidades apresenta-se sob a forma de um derivado funcional reactivo substituível.
Agentes de oxidação apropriados para o processo b) do presente invento são especialmente agentes de oxidação suaves, por exemplo iodo, 1 ,2-di iodoetj. leno, ácidp o-iodobenzoico, 1-10-fenantrolina e sulfato
de cobre, hexacianoferrato de potássio (III), ou, de preferencia, oxigénio ou ar. A reacção é realizada em ãgua ou solução aquosa de tampão com um pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 9, de preferencia proximo do ponto neutral, e a temperaturas variando entre aproximadamente -50°C e aproximadamente a temperatura ambiente. 0 meio de reacção aquoso contem, se desejado, um solvente orgânico miscível, por exemplo um álcool inferior, por exemplo terc .-butanol dimetilformamida, acetonitrilo, etc., e/ou iodeto de metal alcalino, por exemplo iodeto de sodio ou potássio.
Um derivado funcional recativo substituível do grupo mercapto de uma sub-unidade no proce£ so c) pode ser fromado insitu e é, por exemplo, um haleto de sulfenilo, sulfenamida, sulfenilsulfona, tiossulfato ou, de preferencia, um dissulfeto misturado.
Um haleto de sulfenilo ê, por exem pio, um cloreto de sulfenilo ou um brometo de sulfenilo Uma sulfenemida ê derivada, por exemplo, de uma amina cicli_ ca, de uma imida de acido dicarboxi1ico ou de um heterociclo e é, por exemplo, N-sulfeni1-piperidina, N-sulfenilsuc cinimida, N-sulfenilftalimida, imida de acido, N-sulfenil-5-norborneno, 2 ,3-dicarboxi1ico, 1-sulfenilbenzotriazole ou 1-sulfeni1imidazole.
Um dissulfureto misturado é, por exemplo, um dissulfureto de/com um tiol aromatico, por exem pio com tiofenol substituido por halogénio, nitro, ciano ou carboxi, por exemplo com o-clorotiofenol, 2,4-diclorotiofenol ou p-nitrotiofenol, ou um dissulfureto com um tiol heteroaromatico, por exemplo com piridinotiol, de preferen-30cia com 2-piridinotiol, com acido mercaptopiridinocarboxilj_ co, quinolinotiol, 2-mercaptobenzimidazole, 2-mercaptobenzo tiazole ou com 2-mercaptobenzoxazole.
Uma sulfenilsulfona é, por exemplo, um alquilo inferior tiossulfonato, por exemplo, um metanotios sulfonato, ou um benzenotiossulfonato, o qual, se desejado, é substituido por metilo, nitro ou halogénio, por exemplo tiossulfonato de p-tolueno.
Num tiossulfato o radical orgânico contendo a função mercapto derivatizada é ligada ao enxofre. De preferencia, o tiossulfato apresenta-se sob a forma aniónica, por exemplo um tiossulfato de metal alcalino, por exemplo tiossulfato de sodio ou de potássio.
E especialmente preferido como o derivado funcional reactivo substituido do grupo mercapto no processo c) um dissulfureto de misturado, especialmente um dissulfureto com 2-piridinotiol.
Os derivados funcionais reactivos do grupo mercapto são preparados de acordo com métodos habituais conhecidos a partir de compostos tendo uma função mercapto livre ou uma função mercapto derivatizada de qualquer outro modo.
No processo c) o reagente contendo um grupo mercapto livre e o reagentes contendo um derivado funcional reactivo susbtituivel do grupo mercapto são feitos
-31reagir em água ou, de preferencia, num tampão aquoso, com um pH variando entre aproximadamente 3 e aproximadamente 9, de preferencia proximo do ponto neutral, ou seja com um pH entre 6 e8, a temperaturas variando entre aproximadamente -20°C, e aproximadamente +50°C, de preferencia entre -5°C e a tempe ratura ambiente. Se desejado, o meio de reacção aquoso contem um solvente aquoso miscivel, por exemplo um alcanol inferior, por exemplo, terc.-butanol, dimetilformamida, acetonitrilo, etc.,.
Os materiais de partida para os processos b) e c) são conhecidos ou podem ser preparados por processos que são conhecidos per se, por exemplo por um processo tal como é descrito aqui anteriormente ou a seguir. São preparadas uma citoquina substituida e imunoglo bulina substituida em que os substituintes transportam um grupo mercapto, por exemplo, a partir da citoquina e da imuno globulina, respectivamente, por reacção com um composto con tendo um grupo mercapto protegido e uma função acido carboxilico activado, por exemplo um ester activado tal como foi aqui anteriormente descrito no processo a).
grupo protector da função mercap_ to é então removido por processos que são conhecidos per se. Por exemplo, um dissulfureto, tal como foi descrito aqui anteriormente como um derivado funcional reactivo substituível do grupo mercapto, pode ser utilizado como um grupo protector durante um processo analogo ao processo a), e em seguida clivado (separado) em condições de redução suaves, por exemplo com um tiol, por exemplo 2-mercaptoetanol
3-mercapto-1,2-propanodiol, acido tioglicolico, éster metilico de acido tioglicólico, ou acido 3-mercaptopropiónico, de preferencia com um ditiol, por exemplo ditiotreitol ou
ditioeritritol, numa solução aquosa de tampão com um pH variando entre aproximadamente 3 e aproximadamente 6, de preferencia entre 4 e 5, a temperaturas variando entre aproximadamente -5°C e aproximadamente a temperatura ambiente.
Podem ser preparadas uma citoquina substituída e uma imunoglobulina substituída em que os substituintes transportam uma função mercapto, por exemplo, também a partir de uma citoquina e de uma imunoglobulina, respectivamente, por reacção com uma iminotiolactona, por exemplo 2-iminotiolano, numa solução aquosa de tampão com um pH variando entre aproximadamente 5 e aproximadamente 9, de preferencia proximo do ponto neutral, ou seja um pH de cerca de 8, a temperaturas variando entre aproximadamente -5°C e aproximadamente a temperatura ambiente.
E especialmente preferido um processo em que uma citoquina ou uma imunoglobulina é condensa, da com propionato de N-succinimidil-3-(2-piridiltio) de acordo com o processo a), e ao mesmo tempo a imunoglobulina ou citoquina complementar apropriada é feita reagir com
2-iminotiolano do modo anteriormente descrito, e as duas sub-unidades são ligadas para formar uma ligação ditio de acordo com o processo c). De preferencia os passos da reacção são realizadas sem se isolarem produtos intermediários.
Pares de sub-unidades que podem formar em conjunto uma ligação carbono-enxofre de acordo com o processo d) são, por exemplo, citoquinas e imunoglobulinas substituídas substituídas por metades formadores-de-ponte, em que uma metade formadora de(5onte transporta (possui )uma dupla ligação carbono-carbono, uma ligação carbono-halogenio
-33ou uma função epoxido e a outra metade formadora-de-ponte transporta (possui um grupo mercapto, e as duas metades formadoras-de-ponte em conjunto formam o radical Z.
A dupla ligação carbono-carbono no processo d) é substituída de preferencia numa ou nas duas extremidades por um grupo que atraia electrões, por exemplo por um grupo carbonilo de uma cetona, de um éster ou de uma amida, por exemplo tal como nas cetonas vinilicas, esteres acrílicos acrilamidas, 2-buteno-1 ,4-dionas substitui^ das, por exemplo, quinonas, ésteres fumáricos, amidas fumárj_ cas, esteres maleicos ou, de preferencia maleimidas.
átomo de halogénio de uma ligação carbono-halogenio no processo d) é, por exemplo, cloro, bromo ou iodo. A ligação carbono-halogenio é activada de preferencia por uma dupla ligação carbono-carbono ou carbono -oxigénio, por exemplo tal como em haletos de alilo, cetonas halometi1icas., por exemplo cetonas clorometi1icas , ácidos haloaceticos e derivados de acido haloacêtico, por exemplo, acetatos e acetamidas de iodo, bromo ou cloro, carboxilatos de Ac 1 oro-a 1 cano inferior, etc.,
A função epoxido no processo d) ê de preferencia uma função epoxido primaria, ou seja um oxira_ no mono-substituido e pode ser obtida, por exemplo, in situ a partir de halohidrina por tratamento com uma base.
No processo d) os reagentes são reagidos num solvente aquoso o qual, se desejado, contem um tampão orgânico ou inorgânico e/ou um solvente orgânico miscivel, por exemplo um alcanol inferior, um alcano-inferi-34or diol, dimetilformamida, acetonitrilo, etc., de preferencia na presença de um agente de ligação de acido, por exemplo um carbonato de metal alcalino, por exemplo carbona to de sodio ou de potássio ou carbonato de hidrogénio, ou um carbonato de metal alcalino terroso, por exemplo carbona^ to de magnésio ou carbonato de cálcio, ou uma base organica por exemplo uma tri-alquilo amina impedida (entravada) esté ricamente, por exemplo diisopropilamina etilica, a temperaturas variando entre aproximadamente -20°C e aproximadamente +50°C de preferencia entre -5°C e a temperatura ambien te.
Os materiais de partida para o pro cesso d) são conhecidos ou podem ser preparados de acordo com processos que são conhecidos per se, por exemplo de acordo com um dos processos aqui descritos anteriormente ou a seguir. Em particular, são preparados citoquinas subs tituidas ou imunoglobulinas substituídas contendo grupos mercapto de um modo descrito para os materiais de partida para os processos b) e c).
Pares de sub-unidades que podem for mar em conjunto uma ligação simples ou dupla carbono-azoto de acordo com o processo e), são por exemolo a citoquina v
contendo um grupo amino livre, ou substituindo por um ou mais formadores-se-ponte contendo uma função amina ou hidra_ zina livre, e um derivado recativo de uma imunoglobulina contendo uma função aldeído, um derivado reactivo de uma citoquina contendo uma função aldeido e uma imunoglobulina contendo um grupo amino livre ou contendo um formador-de-por[ te tendo uma função amino ou hidrazina livre, ou uma citoquj_ na substituida e uma imunoglobulina substituída em que um substituinte contem uma função aldeido e o outro, substitui^ te complementar, contem uma função amino ou hidrazino, e os
-35dois substituintes são em conjunto um formador-de-ponte Z.
Um conjugado com a formula I é também formado no processo e) a partir de uma mistura contendo uma citoquina, uma imunoglobulina e um derivado reactivo do formador-de-ponte contendo duas funções aldeido, por exemplo um dialdeido alcano, por exemplo glutaraldeido.
A condensação de acordo com o proces^ so e) é realizada num solvente aquoso o qual, se desejado, contem um tampão orgânico ou inorgânico e/ou um solvente or gânico miscivel, por exemplo, um alcanol inferior, por exemplo terc.-butanol, um alcano inferior diol, por exemplo glicol, dietileno glicol, polietileno glicol, dimetilforma' mida, acetonitrilo, tec., a temperaturas variando entre apro ximadamente -20°C e aproximadamente +50°C, de preferencia entre -5°C e a tempartaura ambiente.
Os conjugados que se podem deste modo obter que contem duplas ligações carbono-azoto, ou seja iminas ou hidrazónas, são, se desejado, tratados com um agente redutor selectivo que reduz a dupla ligação carbo no-azoto numa ligação simples carbono-azoto mais estável sem afectar as ligações amida das proteínas. Esses agentes redutores são, por exemplo, borohidretos, por exemplo, borohidretos de metal alcalino, por exemplo borohidreto de sodio ou potássio, ou borohidreto de zinco, em que, se dese jado, um ou dois hidretos foram substituidos por grupos alcoxi inferiores, por exemplo tal como em dimetoxiborohidre to de sodio ou terc.-butoxiborohidreto, ou de preferencia em que um hidreto foi substituido por um grupo ciano, tal como no cianoborohidreto de sodio.
A redução é realizada numa solução tampão aquosa com um pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 9, de preferencia de 3 a 6 para reduções com cianoborohidreto de sodio, e proximo de ponto neutral, ou seja com um pH entre 6 e 8, para reduções com borohidretos de metal que são não substituídos ou substituídos por grupos alcoxi inferiores, a temperaturas variando entre aproxima damente -20°C, e aproximadamente +50°C de preferencia entre -5°C e a temperatura ambiente. Se desejado, o solvente aquoso contem um diluente orgânico miscível, por exemplo um alcanol inferior, por exemplo metanol, etanol, isopropa. nol ou terc.-butanol, ou dietileno glicol, trietileno glicol, acetonitrilo, etc.,
Os materiais de partida para o processo e) são conhecidos ou podem ser preparados de acordo com processos que são conhecidos per se , por exemplo por um processo aqui descrito anteriormente ou a seguir. Derivados reactivos de uma citoquina ou de uma imunoglobulina contendo uma função aldeído podem ser preparados de acordo com um processo tal como foi descrito no Requerimento da Patente Europeia No.88.695.
Neste processo os resíduos hidratos de carbono dos referidos compostos são convertidos em derivados aldeídos por oxidação parcial. Este Requerimento de Patente também descreve a formação de compostos tendo uma função hidrazina, por exemplo pela reacção de uma amina com p-fluorofenilhidrazina.
Pares de reagentes que podem formar uma liagação simples carbono-azoto de acordo com o processo
-37f) são, por exemplo, uma citoquina contendo um grupo amino livre e uma imunoglobulina substituída por um ou mais formadores-de-ponte contendo uma ligação carbono-halogenio de uma função epoxido, uma citoquina substituída por um ou mais formadores-de-ponte contendo uma ligação carbono-ha logénio ou uma função epoxido de/e uma imunoglobul ina conteii do um grupo amino livre, ou citoquinas substituídas e imunoglobulinas substituídas em que um substituinte contem um grupo amino ou hidrazino e o outro substituinte contem uma ligação carbono-halogenio ou uma função epoxido e em pares os substituintes em conjunto formam um formador-de-poii te Z.
Um conjugado com a formula Ié tmebme formado no processo f) a partir de uma mistura conter^ do uma citoquina, uma imunoglobulina e um derivado recativo de um fromador-de-ponte contendo duas ligações carbono-halogenio ou duas funções epoxido.
A natureza da ligação carbono-halo genio e da função epoxido é de preferencia tla como foi atras descrita no processo d). Os derivados reactivos de um formador-de-ponte contendo duas ligações carbono-hidrogenio são por exemplo, cetonas bis-halometi1icas, por exemplo, 1,3dicloro- ou 1,3-dibromo-acetona, derivados de acido bis-haloacetico, por exemplo acetato de 1,4-butanodii 1-bis-iodo ou bromo e compostos semelhantes.
Os derivados reactivos de um forma dor-de-ponte contendo duas funções epoxido são, por exemplo butadieno-bis-epoxido 1,4-pentadieno-bis-epoxido ou éter bis-glicidilo.
As condições dê reacção para o processo f) são as mesmas que para as condições de reacção descritas aqui anteriormente no processo d).
Os materiais de partida para o processo f) são conhecidos ou podem ser preparados de acordo com processos que são conhecidos per se, por exemplo por um processo tal como foi aqui anteriormente descrito.
Os produtos intermediários e os produtos finais do processos do invento são, se desejado, purificados, por exemplo por diálise com agua ou com soluções de tampão, por métodos cromatograficos, de preferência cromatografia por gel, cromatografia liquida de pres_ são elevada, cromatografia de afinidade ou cromatografia de permuta iónica, por ultrafiltração ou por ultracentrifugação.
invento relaciona-se também com as formas do processo em que um composto que se pode obter como intermediário em qualquer estádio é usado, como material de partida e sendo os restantes passos realizados, ou o processo ê interrompido em qualquer estádio, ou um composto que se pode obter de acordo com o processo do invento é produzido nas condições do processo e posteriormente processado in situ.
invento relaciona-se também com novos intermediários e processos para a sua preparação. Os materiais de partida e as condições de reacção são de preferencia seleccionados de modo a obter-se os compostos preferidos referidos na descrição.
-39_
Os conjugados do. invento podem ser usados para o tratamento de infecções a virus e tumores soba forma de preparações farmacêuticas que contêm uma quan tidade eficaz do conjugado juntamente com uma quantidade significativa de um veiculo inorgânico ou orgânico, solido ou liquido, farmaceuticamente aceitavel.
São preferidas as preparações farmacêuticas para administraçao intramuscular, subcutânea ou intravenosa, a seres humanos. Essas preparações são ou suspensões aquosas isotónicas contendo os conjugados activos em conjunto com um veiculo e, se desejado, produtos complementares, por exemplo estabilizadores, emulsificadores, solubi1izadores, sais para a regulação do pH e a da pressão osmotica, agentes preservativos e/ou de humidificação.
As preparações; farmacêuticas podem ser preparadas de acordo com métodos que são conhecidos per se, por exemplo num proces so em que os conjugados activos e os veículos e os produtos complementares farmaceuticamente aceitáveis são misturados se desejado 1iofi1izados, e dissolvidos antes da utilização
A dosegam das preparações farmaceu ticas contendo os conjugados activos depende da perturbação a ser tratada, do peso corporal, da idade e das condições individuais do doente a ser avaliado pelo médico assistente e do método de administração. Em comparação com a dosagem da citoquina livre correspondente, são utilizadas quantidades que são duas a aproximadamente cem vezes mais pequenas que produzem a mesma actividade biológica.
,
Por exemplo, um conjugado contendo interferon alfa é administrado em de uma a tres unidades de
Λ C dosagem diarias ou de 10 a 10 IU(UI) (Unidades Internacionais da Actividade do Interferon), de preferencia de 104 a 105 IU (UI).
conjugado também pode ser admini^ trado em doses mais elevadas, por exemplo numa quantidade e tal que se alcança a mesma actividade biologica que se obtem habitualemnte com a citoquina livre. Consequentemente, o desejado efeito terapêutico da citoquina é conseguido numa percentagem mais elevada de doentes tratados.
Os para ilustrar o invento mas o seu âmbito
Exemplos que se seguem servem não limitam de qualquer modo
As abreviaturas usadas nos Exemplos têm os significados que se seguem:
| IFN | interferon |
| ig | imunoglobulina |
| igG | imunoglobulina G |
| IU | Unidades Internacionais de actividade di IFN |
| solução salina fisiológica tamponada com fo£ | |
| PBS | fato. |
| rIFN | interferon recombinante. |
-41[rIFNa ][(C=NH)CH2CH2CH2SSCH2CH2('Ci=o)][lgG] Exemplo 1 -_ 5 mg de anticorpo humano policional IgG) liofilisado, intraglobin F , Biotest) é dissolvido num tubo Eppendorf em 500 ul de PBS, pH 7.2 12ul de éster N-hidroxisuccinimida de acido 3-(2-piridilditio)-propio nico 1,6 mM e 12 ul de etanol são adicionados gota a gota a uma solução de IgG agitada num Whirlmix e a mistura ê incubada â temperatura ambiente duranet 30 minutos.
Subsequentemente a mistura é dialj. sada durante a noite com PBS (tampão mudado tres vezes) a 4°C.
10ug de interferon humano recombinante 2b sã0 dissolvidos num tubo Eppendorf em 500 ul de PBS, pH 7,2. Dissolve-se 2-iminotiolano a 0°C em clorohidreto de trietanolamina 1M, pH,8,0. Adicionam-se 5 ul deste solução de iminotiolano â solução de IFN e a mistura é incubada â temperatura ambiente durante 90 minutos. A mistura da reacção é dialisada com PBS a 4°C quatro vezes durante 1 hora em cada caso.
A solução de IFN é misturada com so luço IgG atrás referida, agitada â temperatura ambiente durante 2 horas e mantida a 4°C durante a noite.
conjugado é separado do IFN livre por ultrafiltração a 4°C, usando um filtro (limite de exclusão medio 50.000 Dallons). As duas fracções são ensaia
-42das quanto à actividade do IFN no ensaio de inibição CPE (Cytopathic Effect, (Efeito Citopático), ver Ho and Enders, Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 45., 385-389 (1959 ). 0 conjugado activo é encontrado no produto flutuante.
Para um controlo, a sequencia total da reacção é repetida com IFN marcado radioactivamente com 125
I. 0 conjungado radioactivo é encontrado em fracções 1 a 10, o IFN radioactivo em fracções 12 a 25.
A mesma reacção é também realizada com interferon humano recombinante «6/B-D hibrido (Ciba-Geigy AG, EP 205 404) e com interferon humano natural (DRK Blutspendedienst /“German Red Cross Blood Donor Service7 /“Serviço de Dadores de Sangue da Cruz Vermelha Alemã7Springe) em vez de IFNo<2b.
Exemplo 2 (IFNa][(C=O)CH2CH2SSCH2CH2(C=O)][IgGj mg de anticorpo humano policlonal IgG( 1 iofi 1 isado, Intraglobina FR, Biotest) e 100 pg (10? IU) de interferon humano ^(DRK Blutspendedienst Springe) são cada um deles dissolvidos em 1 ml de PBS, pH 7,2 18jul de éster N-hidroxisuccinimida de acido 3-(2-piridilditio)-propio nico 20mM e são adicionados 82 ^1 de PBS a cada solução, sendo as misturas incubadas durante 30 minutos â temperatura ambiente com agitação suave, e dialisadas durante a noi-te a 4°C em cada caso com 500 ml de PBS.
A solução de IFN é estabilizada com albumina a 0,1% e armazenada a 4°C. A solução IgG é ajustada até aproximadamente um pH de 6 com 156 jul de acetato de sodio 0,1M (pH 4,5) sendo adicionados 3,8 mg de ditiotreitol e o todo é incubado durante 20 minutos â temperatura ambiente sendo então dialisado de novo durante a noi. te a 4°C com PBS. A solução de IFN e a solução de IgG tiolada são misturadas uma com a outra, agitadas durente 2 horas, à temperatura ambiente e mantidas a 4°C durante a noite. 0 conjugado é então separado tal como foi descrito no Exemplo 1.
Exemplo 3
Tempo de Residência do conjugado IFN-IgG no soro murino
Tres ratinhos são cada um deles injectado intramuscularmente com 0,4 ml de uma solução do conjugado do Exemplo 1 contendo 3 χ 104 IU. As amostras do soro são examinadas quanto â sua actividade de interferon* no ensaio de inibição-CPE apõs alguns minutos 4, 8, 24, 48 56 e 80 horas. Neste ensaio as actividades medidas são como se segue (log 10 IU (UI) por ml:
| 0 h | 4 h | 8 h | 24 h | 48 h | 56 h | 80 h | |
| ratinho 1 | 0,5 | 2,3 | 2,0 | 2,1 | 2,0 | 2,2 | 2,0 |
| ratinho 2 | (2,0) | 2,2 | 2,2 | 2,2 | 2,0 | 2,2 | 2,2 |
| ratinho 3 | 1,5 | 2,1 | 2,2 | 2,0 | 2,0 | 0 9 1 “ | 2,2 |
| valor médio | 1,2 | 2,2 | 2,1 | 2,1 | 2,0. | 9 9 | 2,1 |
Por comparação, a actividade do IFN do IFNc^2b injectado intramuscularmente isoladamente (3 χ 104 IU(UI) cai de um modo consideravelmente mais acentuado:
| 0 h | 4 h | 24 h | 32 h | 56 h | 72 h | 80 h | |
| ratinho 1 | 0,7 | 2,3 | 0,7 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| ratinho 2 | O,S | 2,2 | 1,6 | bi | 0,6 | 0,5 | - |
| ratinho 3 | 0,5 | 0,8 | 2,1 | 0,9 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| ratinho 4 | - | 1,7 | 2,1 | 1,2 | - | 0,7 | 0,5 |
| valor médio | 0,6 | 2,0 | 1,9 | 1,0 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
Praticamente verificam-se os mesmos valores que os obtidos com IFN<V32b isoladamente se se injecta rem misturas de IFN 2b e Intraglobina F (IgG humana)
Exemplo 4
Descrição Detalhada Geral para a preparação de citoquina ί(C=O)CH:CH2SSCH2CH2(C=O)3 íIg1
Em cada caso 2,5 mg de citoquina e de imunoglobulina são dissolvidos em 0,5 ml de PBS pH 7,2 e cada solução é incubada durante 30 minutos a 25°C com 100 ul de uma solução recentemente preparada de ester N-hidro xisuccinimida de acido 3-(2-piridiltio)-propionico (4 mM).
Uma coluna de filtração de gel PD-10 é equilibrada com 20 ml de solução de ditiotreitol. A solução Ig é então aplicada â coluna e eluida com 6 ml de tampão acetato de/com pH 4,5. São recolhidas fraccões de 500 jul de e a extinção é medida a 280 nm.
As fracções contendo proteina são combinadas, aplicadas a uma nova coluna de filtração de gel PD-10 equilibrada com PBS e eluida com tampão fosfato.
A solução de citoquina é também submetida a filtração por gel com tampão fosfato sobre uma coluna PD-10, sendo então misturada com a solução de Ig tiolada e incubada durante 2 horas â temperatura ambiente e durante 20 horas e 4°C.
produto da reacção é analisado usando electroforese com gel poliacrilamida.
Exemplo 5
Composição Farmacêutica
A albumina humana é adicionada a £
soluções contendo 10 IU (UI) do conjugado IFN do Exemplo 1 até se alcançar uma concentração final de 1% ,as misturas são dialisadas com PBS a 4°C, filtradas com esterilização atarves de um filtro bacteriológico, e o filtrado é introduzido em condições assépticas em 10 ampolas de 1 ml.
As ampolas são armazenadas de prefe rência a baixa temperatura, por exemplo a -18°C.
Claims (10)
- REIVINDICAÇOES1-.- Processo para a preparação de conjugados de citoquinas com imunoglobulina humana, caracaterizado por compreender a reacção de uma citoquina com i_ imunoglobulina humana, e se desejado, com um formador de pontes
- 2â.- Processo de acordo com a reivin dicação 1, para a preparação de conjugados com a formulaCK-Z-Ig (I) em que CK é um residuo de uma citoquina humana natural ou de uma citoquina recombinante, Ig é um residuo de uma imunoglobulina humana e Zé uma ligação covalente ou um formador de pontes organicas ligado covalentemente, e em que CK, Ig e/ou Z podem ocorrer varias vezes, caracterizado por compreender, deste modo, a reacção de 2 ou 3 sub-unidades reac tivas do conjugado com a formula I umas com as outras de modo a formar-se um conjugado tendo ligações covalentes, e o isolamento do conjugado.
- 3â.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender:a) para a preparaçãi de um conjugado com a formula I, em que as sub-unidades são unidas por uma ligação amida, e a condensação de uma sub-unidade contendo um grupo amino com a sub-unidade complementar contendo um grupo de acido carboxilico ou com um seu derivado reactivo, oub) para a preparação de um conjugado com a formula I em que as sub-unidades são unidas por uma ligação dissulfureto, o tratamento de duas sub-unidades complementares contendo am bas um grupo mercapto com um reagente de oxidação moderada, ouc) para a preparação de um conjugado com a formula I, em que as sub-unidades são unidas por uma ligação dissulfureto a substituição de um derivado funcional substituível reactivo do grupo mercapto de uma sub-unidade com a sub-unidade complementar contendo um grupo mercapto, oud) para a preparação de um conjugado com a formula I em que as sub-unidades são unidas por uma ligação carbono-eii xofre, a adição da sub-unidade contendo um grupo mercapto â sub-unidade complementar contendo uma dupla ligação carbono-carbono ou contendo uma função epoxido, ou a substituição de uma ligação carbono-halogenio pelo grupo mercapto, oue) para a preparação de um conjugado com a formula I em que as sub-unidades são unidas por uma ligação simples ou dupla carbono-azoto, a condensação dum grupo aldeido de uma sub-unidade com a sub-unidade complementar contendo um grupo amino ou hidrazino, ou e se desejado, a redução da resultante migação dupla carbono-azoto até uma ligação simpleí carbono-azoto com um agente de redução, comf) Para a preparação de um conjugado :com a formula I em que as sub-unidades são unidas por uma ligação simples carbono-azoto, a adição de uma sub-unidade contendo um grupo amino ou hidrazino â sub-unidade complementar contendo uma função epoxido, ou a substituição, de uma ligação carbono-halogenio pelo grupo amino ou hidrazino.
- 4â.- Processo de acordo com a reivifi dicação 2 ou 3, caracterizado por se preparar conjugados com a formula :I, em que CK é um residuo de um interferão humano natural ou recombinante, de interleuquina de um compos to afim de um fragmento que retenha a actividade biologica,Ig é um residuo de uma imunoglobulina humana antuarl, Z é uma ligação covalente ou um radical hidrocarboneto di-, triou tetra-valente ligado covalentemente, o qual, se desejado é substituido e/ou em que, se desejado, um ou mais ãtomos de carbono foram substituídos por átomos de oxigénio, enxofre e/ou por átomos de azoto não substituídos ou substituídos, e em que CK, Ig e/ou Z também ocorrem varias vezes.
- 5â.- Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por se preparar conjugados com a formula I em que CK é um residuo de um inerferão humano natural :ou recombinante .ou de composto afim, Ig é um residuo de uma imunoglobulina humana natural, eZé uma liga ção covalente ou um radical hidrocarboneto divalente ligado covalentemente o qual, se desejado, é substituido por oxo ou por imino, e/ou em que um ou mais átomos de carbono foram substituídos por átomos de oxigénio, enxofre e/ou azoto.
- 6â.- Processo de acordo com a reivindicação 3 ou 2, caracterizado por se preparar conjuga-51- dos com a formula I em que CK é um residuo de um interferão alfa ou gama humano natural ou recombinante, Ig ê um residuo de uma imunoglobulina humana natural G ou M, e Z ê uma ligação covalente, alquileno inferior não substituído ou substituido com oxo ou imino, ou combinações desse radical com oxi tio, amino, fenileno, e/ou azacicloalquileno.
- 7â.- Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por se preparar conjugados com a formula I em que CK é um residuo de um interferão alfa humano natural ou recombinante, Ig é um residuo de uma imunoglobulina humana G natural, e Z ê um radical, liga do covalentemente, alquileno inferior-ditio-alquileno inefrior substituido com oxo e/ou imino.
- 8â.- Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por se preparar conjugados com a formula I em que CK'é um residuo de IFN ^b’ Ig ê um residuo de uma imunoglobulina humana G natural, e Z ê carbonimidoi1propileno-ditio-etileno-carbonilo.
- 9â.- Processo para a preparação de preparações farmacêuticas contendo conjugados de citoquinas com imunoglobulinas humana, caracterizado por compre ender a mistura dos referidos conjugados com um veiculo far maceutico.-5210â.- Método para o tratamento de infecções virais e tumores, caracterizado por se administrar a um paciente um conjugado de citoquina com imunoglobulina humana, preparado de acordo com qualquer uma das reiviii dicações 1 a 8, ou uma composição farmacêutica, preparada de acordo com a reivindicação 9, sendo a gama de dosagem de ZL fi
- 10 a 10 IU (Unidades Internacionais de Actividade de InterΛ C
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Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3818055A1 (de) * | 1988-05-27 | 1989-11-30 | Biotest Pharma Gmbh | Kombination aus humanen immunglobulinen und interleukin-2 zur bekaempfung von infektionskrankheiten |
| GB8820377D0 (en) * | 1988-08-26 | 1988-09-28 | Offord R E | Chemical compounds |
| GB8820378D0 (en) * | 1988-08-26 | 1988-09-28 | Offord R E | Chemical compounds |
| KR900005995A (ko) * | 1988-10-31 | 1990-05-07 | 우메모또 요시마사 | 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법 |
| DE3839332A1 (de) * | 1988-11-22 | 1990-05-23 | Bayer Ag | Verfahren zur herstellung von substituierten 2-chlorpyridinen |
| IE63847B1 (en) * | 1989-05-05 | 1995-06-14 | Res Dev Foundation | A novel antibody delivery system for biological response modifiers |
| US5527527A (en) * | 1989-09-07 | 1996-06-18 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates |
| US5154924A (en) * | 1989-09-07 | 1992-10-13 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates |
| US5977307A (en) * | 1989-09-07 | 1999-11-02 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins |
| US5182107A (en) * | 1989-09-07 | 1993-01-26 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates |
| US5314995A (en) * | 1990-01-22 | 1994-05-24 | Oncogen | Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins |
| US5349053A (en) * | 1990-06-01 | 1994-09-20 | Protein Design Labs, Inc. | Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses |
| US5478804A (en) * | 1990-09-19 | 1995-12-26 | The Salk Institute For Biological Studies | Treatment of tumorigenic pathophysiological conditions with FGF-cytoxic conjugates |
| DE69204990T2 (de) * | 1991-01-03 | 1996-05-15 | Salk Inst For Biological Studi | Mitotoxin zur behandlung von gefässbeschädigung. |
| CA2101735A1 (en) * | 1991-02-04 | 1992-08-05 | Mark J. Redmond | Vp6 encapsulated drug delivery |
| IE920366A1 (en) * | 1991-02-04 | 1992-08-12 | Univ Saskatchewan | Vp6 encapsulated drug delivery |
| JP3105629B2 (ja) * | 1991-04-23 | 2000-11-06 | サングスタット メディカル コーポレイション | 特異的結合ペアのメンバーの細胞活性調節接合体 |
| EP0533006A1 (en) * | 1991-09-18 | 1993-03-24 | F.Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft | Chimaeric interleukin 5-receptor/immunoglobulin polypeptides |
| US7754211B2 (en) | 1992-04-10 | 2010-07-13 | Research Development Foundation | Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER-2/neu) related surface antigens |
| US6030613A (en) * | 1995-01-17 | 2000-02-29 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
| US6485726B1 (en) | 1995-01-17 | 2002-11-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
| US6086875A (en) * | 1995-01-17 | 2000-07-11 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of immunogens |
| US6015555A (en) * | 1995-05-19 | 2000-01-18 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates |
| EP0833666B1 (en) * | 1996-04-10 | 2003-12-10 | Sangstat Medical Corporation | Cytomodulating conjugates of members of specific binding pairs |
| IT1289608B1 (it) * | 1997-02-05 | 1998-10-15 | Angelini Ricerche Spa | Composizione per uso terapeutico o diagnostico somministrabile per via intranasale,sublinguale o vaginale |
| ES2221717T3 (es) | 1997-12-08 | 2005-01-01 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Proteinas de fusion heterodimeras utiles para inmunoterapia dirigida e inmunoestimulacion general. |
| SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| HUP0202442A3 (en) | 1999-08-09 | 2005-01-28 | Lexigen Pharmaceuticals Corp L | Multiple cytokine-antibody complexes |
| ES2269366T3 (es) | 2000-02-11 | 2007-04-01 | Merck Patent Gmbh | Mejoramiento de la vida media en circulacion de proteinas de fusion basadas en anticuerpos. |
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| ZA200305980B (en) | 2001-02-12 | 2007-01-31 | Res Dev Foundation | Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof |
| DK1366067T3 (da) | 2001-03-07 | 2012-10-22 | Merck Patent Gmbh | Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed |
| WO2002079415A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| RU2306320C9 (ru) | 2001-05-03 | 2008-01-27 | Мерк Патент Гмбх | Рекомбинантное опухолеспецифичное антитело (варианты) и его применение |
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| RU2312677C9 (ru) | 2001-12-04 | 2008-03-27 | Мерк Патент Гмбх | Иммуноцитокины с модулированной селективностью |
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