PT88294B

PT88294B - Processo para a preparacao de derivados de fenantridina

Info

Publication number: PT88294B
Application number: PT88294A
Authority: PT
Inventors: Gabriele Fendrich; Willy Zimmermann; Johannes Gruner; John Anthony Lorimer Auden
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1987-08-20
Filing date: 1988-08-18
Publication date: 1995-03-31
Also published as: DK467488D0; ES2061722T3; CA1306213C; DK467488A; IE882541L; US4939158A; DE3887713D1; EP0304400B1; IE62423B1; EP0304400A2; ATE101393T1; JPS6483069A; US5093247A; EP0304400A3; PT88294A

Description

PATENTE DE INVENÇÃO

N.°

294

REQUERENTE: CIBA-GEIGY AG.,suiça,industrial,com sede em Klybeckstrasse 141, 4002 Basel, Suiça.

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DE

FENANTRIDINA

INVENTORES: Gabriele Fendrich, Willy Zimmermann,Johannes Gruner e John Anthony Lorimer Auden.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Suiça em 20 de Agosto de 1987,sob o n^e ..

3196/87-2.

INPI. MOD 113 RF 10732

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O invento refere-se ao processo para a preparação de 1 ,8-dihidroxi-3-meti1benzo/~b7fenantridina-7 ,12-diona e aos seus derivados de fórmula (I)

CIBA-GEIGY AG. ,

PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE DERIVADOS DE FENANTRIDINA

-2em que 1

R é hidrogénio ou o radical de formula II

C^₃

HO.....( )..... UD • —— ·

KHCHj i e a sais do composto, em que R é o radical de formula II. Estes compostos podem ser obtidos por meio de um novo proce£ so microbiológico.

E essencialmente caracterizado por compreender a cultura da estirpe Streptomyces viridochromogenes (Krainsky) Waksman e Henrici (sem formação de melanina)

DSM 3972 ou uma cultura derivável, num meio nutriente e 1 isolamento do composto de formula I, em que R é o radical de formula II do meio de cultura.

Estes compostos são utilizados no tratamento terapêutico de tumores.

presente invento refere-se a

-3derivados de benzo/~b7fenantridina específicos, nomeadamente 1 ,8-dihidroxi-3-meti1benzo/b7fenantridina-7,12-diona e aos seus derivados específicos, a um processo para a preparação destes compostos, a microorganismos para efectuar o processo de preparação, a composições farmacêuticas contendo um tal derivado de fenantridina e ao uso destes compostos como a gen. tes antineoplásticos .

Especificamente, o presente invento refere-se a 1,8-dihidroxi-3-meti1-benzo/~b7fenantridina-7 ,12 -diona e aos seus derivados de formula I

II (I) em que

R¹ é hidrogénio ou o radical de formula II

nhch₃ (II)

-4ι aos sais deste composto, em que R é um radical de formula II, a um processo para a preparação destes compostos, a micro organismos para efectuar o processo de preparação, a composj_ ções farmacêuticas contendo um tal derivado de fenantridina , e ao uso dos referidos compostos como agentes antineoplásticos.

De acordo com a espectroscopia de RMN, o radical de formula II tem a configuração relativa atras indicada e também expressa pela seguinte formula equivalente Ila:

/Α /1

HÓ\NHCH j (Ila) radical de formula II está na forma opticamente activa. A sua configuração absoluta e ainda desconhecida, mas pode ser definida equivocamente pelo processo de preparação.

presente invento refere-se em particular ao composto de formula I, em que R¹ é o radical opticamente activo de formula II na configuração absoluta que se pode obter por cultura de especie Streptomyces viridochromogenes DSM 3972. Estes composto é aqui designado posteriormente como fenantroviridina .

-5De acordo com a nomenclatura de IUPAC, a fenantrovlridina é denominada como 1-(2,3-6-tridesoxi-3-metilamino- °ú-ribo-hexopiranosiloxi)-8-hidroxi-3metilbenzo/~b7fenantridina-7,12-diona.

Nesta designação, o prefixo ribo como o prefixo eritro ou treo , indica apenas a configuração relativa nos centros da assimetria nas posições 3, 4 e 5 do radical 2,3,6-tridesoxi-3-metiamino-hexopiranosi1 o.

prefixo configuraciona 1 7-, não se refere a ribo, mas define a configuração na posição-1 do radical hexapiranosilo. A configuração absoluta, i.e., a atribuição para as serias-D ou -L-, fica e permanece em aberto.

Alternativamente, a fenantroviridina também pode ser designada por 1 -(2,3 ,6-tridesoxi-3met i1ami no - L-a1op iranos iloxi)-8-hidroxi-3-metilbenzo/“b7 fenantridina-7,12-diona.

Os sais de composto de formula I são sais não-toxicos farmaceuticamente aceitáveis de preferencia, i.e., sais de adição acida com ácidos inorgânicos tal como acido clorídrico, ácido sulfurico, ou acido fosfórico, ou com ácidos carboxilicos orgânicos, ou com ácidos sulfónicos adequados, por exemplo acido trifluoroacetico e com aminoácidos tal como argenina e lisina.

Para separação ou purificação também é possível usar sais não aceitáveis farmaceuticamente Para uso terapêutico, contudo, são apenas eligiveis os sais não-toxicosíàrmaceuticamente aceitáveis e por esta razão preferidos.

-6Os compostos de formula I e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis têm propriedades far. macológicas valiosas, em particular propriedades tumoricidas quando administradas a animais de sangue-quente incluindo o ser humano, como pode ser demonstrado por exemplo por tratamento experimental de tumores, por exemplo, carcinoma do pulmão humano MBA 9812. Tais compostos de formula I, quando administrados numa dose diária variando de 5 a 20 mg/kg, i.p., reduz o peso (25 mg) do carcinoma do pulmão MBA 8912, que foi implantado em ratinhos C-57 fêmeas nús pretas com um peso do corpo de 18 a 22 g até ca., 10% comparado com animais não tratados depois de 14 a 15 doses diárias.

A administração de uma dose diaria ι dupla de 5 mg/kg i.p. do composto de formula I, em que R é hidrogénio (aglicon), durante 15 dias efectua uma redução no peso do tumor de cerca de 96% até apenas 4%.

processo para a preparação de compostos de formula I ou de um sal do composto, em que R é o radical de formula II, compreende a cultura da especie

Streptomyces viridochromogenes (krainsky) Waksman et

Henrici (sem formaçao de melanina) DSM 3972, ou de uma sua cultura derivável, num meio nutriente adequado, separando o composto de formula I, em que R é o radical de formula II do meio de cultura, e, se desejado, convertendo o composto resultante num sal e, se se desejar, no composto de fórmu•1 la I, em que R é hidrogénio, por tratamento com um meio acídico.

processo atrás descrito será explicado agora com mais detalhe. Os compostos de formula I são obtidos por meio de um novo processo microbiologico, nomeadamente por fermentação com a nova espécie Streptomyces viridochromogenes (Krainky) Waksman et Henrici. (sem a forma ção de melanina) que foi depositada de acordo com as provisõe de Budapest Treaty ou The International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure, de 2 de Fevereiro, 1987, com o Deutsche Sammlung fϋr Mikroorganismen (Colecção Alemã para Microorganismos), Grise Bachstrasse 8, D-3400 Gõttingen, Republica Federal Alemã, sob o no. de acessão DSM 3972.

A especie foi isolada em 1983 a partir de uma amostra de solo tomada de uma floresta virgem tropical na região de Ribeirão Preto, Província de São Paulo Brazil. A determinação da especie foi feita de acordo com R. Hiitter Systematik der Streptomyceten, Verlag Kargel, Basel 1967, pag.96 e seguintes e o ácido (L , L-)-diaminopimé lico pode ser detectado em células hidrolizadas. Quer em meio peptona/agar quer em meio tirosina/agar aespecie DSM 3972 forma uma côr melanoide. Este facto está em contras^ te com os Streptomyces vi ridochromogenes representativos até aqui conhecidos. Os agars usados para testar a formação da melanina têm a seguinte composição:

-8Agar Peptona-ferro (pH=7,4) g/litro

Extracto de levedura 1 bactopeptona 15 citrato de ferro-amonio 0,5 k₂hr₄ 1

Na₂S₂0₂ 0,08 bacto agar 15

Meio sintético (pH - 7,4) g/litro tirosina 1 glicerol 15

L-arginina-HC1 5 metionina 0,3

K₂HP0₄ 0,5

MgS0₄ χ 7 H₂0 0,02

CuS0₄ χ 5 H₂0 0,01

CaCl₂ χ 2 H₂0 0,01

FeS0₄ χ 7 H₂0 0,01

ZnS0₄ χ 7 H₂0 0,01

-9(cont)

MnS0₄ χ 7 H₂0 0,04 bacto agar 15

A especie DSM 3972 utiliza os seguintes açucares e álcoois: arabinose, xilose, ramose, rafino se, manitol, inisotol, frutose, sacarose, glucose, lactose, celobiose, e adonite.

Não foi observado crescimento em insulina. 0 teste para a utilização de carbohidrato é efectuado no seguinte meio:

Meio Básico (ATCC 623; pH = 7,0) ácido L-glutâmico (nh₄)₂so₄

MgS0₄ χ 7H₂0 k₂hpo₄ kh₂po₄

Solução de sal* carbohidrato para ser testado g/litro

0,2

1,88

0,57 ml/1itro g / litro * A anterior solução de sal tem a seguinte composição:

-10Solução de sal g/litro

FeCl₃ χ 6 H₂0 0,6

MnCl₂ χ 4 H₂0 0,6

CuSO^ χ 5 H₂0 0,6

CaC1₂ χ 2 H₂0 0,6

ZnCl₂ 0,6

NaCl 0,6

A especie DSM 3972 está em comformidade em alguns factos com Streptomyces albocyaneus, mas em contradições com isso não forma um endopigmento.

A observação da seguinte lista de valores adicionais caracteriza a especie DSM 3972:

Morfolog i a

Micélio substracto:

micélio aereo:

cor do esporo:

castanho amarelado castanho-beige, mais tar de azul esverdeado azul esverdeado

-11(cont) cadeias de esporo:

forma do esporo:

superfície do esporo:

curtas , espirais proxi mas esférica-elipsóide com espinhos

Meio de Cultura

Agar de levedura (pH=7,0) g/litro

extracto	de	levedura	4
extracto	de	malte	5
g1ucose			4
agar			20

- Compreender-se-à uma cultura derivavel no sentido anterior como significado de qualquer cultu ra que em adição tem os caracteres distintivos da cultura depositada essencial para se efectuar o processo do invento, i.e., principalmente uma cultura derivada, em especial uma cultura cujos microorganismos contêm os mesmos genes estrutu rais que os da especie DSM 3972 essencial para a formação do composto de formula I.

-12Por uma cultura derivavel entender-se-à também qualquer cultura cujos mlcroorganismos contêm um equivalente dos genes estruturais da especie DSM 3972 essencial para a formação do composto de formula I, cujo equ£ valente é devido possivelmente â degeneração do codigo genetico.

Em particular, entender-se-â por cultura derivavel qualquer cultura que contem microorganismos do gene Streptomyces, de preferencia da especie Streptomyces viridochromogenes , que são capazes de produzir o composto de formula I. 0 termo cultura derivavel da especie DSM 3972 inclui também todos os mutantes da referida especie que são capazes de produzir o composto de formula I.

meio nutriente usado é de preferencia uma solução aquosa ou suspensão que contem pelo menos uma fonte de carbono e pelo menos uma fonte de azoto e de preferencia também substancias minerais. Exemplos de fontes de carbono são: glicerol, carbohidratos assimiláveis, tais como ciclitóis, por exmeplo manitol, polisacarídeos , por exemplo, amido, disacarídeos , por exemplo, lactose e sacarose, e monosacarídeos em especial, glucose e frutose, assim como materiais em bruto industriais correspondentes que contem carbohidratos, por exemplo melaços, obtidos a partir de beterraba ou da cana do açúcar. As fontes de azoto tipicas são: os aminoácidos, em particular, os ôó-aminoácidos ocorrentes na natureza, peptídeos assim como proteinas e os seus produtos de degradação tais como peptonas e triptonas , e também sais de amonio e nitratos, assim como materiais puros contendo -azoto apropriados tal como extractos de carne caseina hidrolisada e levedura autosilada e extracto de leve dura. As fontes mistas de azoto e carbono também sao adequa.

-13das, tal como diferentes sementes de plantas que são usadas na forma de extractos aquosos, farinha de/ou de misturas, por exemplo de feijões, tal como feijão de soja, grãos de cereal por exemplo trigo, e, em particular, milho (licor de infusão-milho); e também sementes de algodão e extracto de malte. Em adição aos sais de amonio, em particular cloreto de amonio, sulfato de amonio ou nitrato de amonio e outros nitratos, o meio nutriente também pode conter sais inorgânicos tais como cloretos, carbonatos, sulfatos e, de preferencia, fosfatos de metais alcalinos e de metais alcalino-terrosos, em particular de sodio, de potássio, magnésio e cálcio assim como de elementos traço tais como ferro, zi£ co e manganês.

meio nutriente é esterilizado e inoculado com uma cultura de produção da especie enquanto se mantêm as condições usuais.

A cultura é efectuada sob as condições aerobicas, por exemplo em cultura de superfície inacti va ou, de preferencia, de baixo da superfície enquanto se sacode ou agita com ar ou com oxigénio em garrafas misturadoras ou fermentadores. A temperatura é adequadamente da gama de ca. de 15° a 40°C, de preferencia de ca. de 22°C até 32°C. A temperatura mais preferida é ca. de 28°C. 0 tempo de fermentação é de preferencia de 2 a 12 dias, por exemplo de 7 a 8 dias.

A cultura é efectuada de preferen cia em vários passos, e, i.e., são preparadas primeiro uma ou mais pré-culturas em meio nutriente liquido e são depois usadas para inocular o meio de produção actual , por exemplo na razão de 1:20.

-14A separação é efectuada por métodos psico-quimicos por métodos de separação conhecidos per se, em especial, por centrifugação, por filtração, por extracção de solvente, precipitação, cristalização e por cromatografia de preferencia cromatografia de adsorção e de distribuição.

De preferencua, o meio de cultura é acidificado por exemplo com 50% de acido sulfurico até pH igual a 2 ca. e extraido com um solvente adequado, por exemplo, acetato de etilo, para remover as impurezas. 0 ex tracto é desprezado. 0 raflnato e o micelio são ajustados com um metal alcalino adequado por exemplo NaOH 5N até pH igual a 10 ca., e extraidos com um solvente adequado, por exemplo acetato de etilo. 0 extracto concentrado é purificado por repartição por exemplo entre um álcool adequado tal como metanol e um solvente orgânico não-polar adequado por exemplo, um hidrocarboneto tal como heptano. A fase alcoolica é concentrada por evaporação e o residuo é cromatografado em silica gel. A fracção principal é depois purificada em meio ligeiramente acidico por cromatografia em fase reversa. As fracções contendo o produto desejado são 1iofi1izadas.

liofilizado é cromatografado p

num gel dextrano modificado, por exemplo, Sephadex , e subsequentemente cristalizado.

A conversão do composto de formula

I, em que R é um radical de formula II, no aglicon é efectua da com um meio acidico tal como um acido mineral ou um pernw tador de iões ácidos, de preferencia por aquecimento do tri f1uoroacetato de/em acido clorídrico diluido, por exemplo,

HCl 0,1N a 50-120°C, por exemplo 90°C.

-15Os precipitados de aglicon e o precipitado é isolado por filtração, tomado num solvente orgânico adequado, por exemplo cloroformio, e purificado por extracção com água e recristalização da fase organica seca.

invento refere-se em particular a um processo para a preparação de fenantroviridina, quer compreende a cultura, sob condições aeróbicas da especie Streptomyces viridochromogenes DSM 3972 ou de um microorganismo que contem os mesmos genes estruturais que os da referida especie essencial para a formação de fenantrovir id_i na, num meio nutriente aquoso contendo uma fonte de carbono e uma fonte de azoto assim como sais inorgânicos e separação de fenantroviridina assim obtida.

invento refere-se primeiro a uma ilustração do processo anterior, que compreende a cultura de um microorganismo da especie Streptomyces viridochromoge nes que forma a fenantroviridina.

Uma ilustração preferida do processo anterior compreende a cultuar da especie Streptomyces viridochoromogene DSM 3972 ou de um seu mutante que forma a fenantroviridina.

Uma ilustração particularmente preferida do processo anterior compreende a cultura da especie Streptomyces viridochromogenes DSM 3972.

E preferido efectuar a fermentação sob condições descritas nos Exemplos.

-16Os microorganismos que contêm os mesmos genes estruturais essenciais para a formação de fenantroviridina como a especie DSM 3972 podem ser produzidos artificialmente, por exemplo pro manipulação de genes, por separação dos genes estruturais correspondentes da especie DSM 3972 e inserção deles num ponto apropriado no material genetico de outro microorganismo adequado. Os microorganismos adequados são aqueles em que os genes estruturais em questão não podem ser inseridos só, mas em que es tes genes estruturais também podem ser expressos e em que a fermentação da fenantroviridina não é degradada outra vez e também de preferencia, precipitada no meio de fermen tação. Estes microorganismos adequados são em particular outras especies do gene Streptomyces, mais particularmente os da especie Streptomyces viridochromogenes, desde que não possuam já os anteriormente genes estruturais.

Depcásde estabelecer a sequencia de nucleotídeos dos anteriores genes estruturais mencionados, estes podem ser também preparados sinteticamente.

Por causa da degeneração do codigo genetico, existe a possibilidade de troca das sequências de nucleotídeos específicos de tres nucleotídeos sucessivos conhecidos por codões, por outros codões que codificam para o mesmo aminoácido.

Podem ser produzidos mutantes de formação de fenantroviridina, por exemplo, por tratamento com raios-X ou ultravioletas ou com mutagenes químicos por exmeplo, N-meti1-N¹-nitro-N-nitrosoguanidina , e isolado de uma forma conhecida per se, por selecção de acordo com as suas propriedades especificas.

-170 invento refere-se também a um processo para a preparação de um produto de fermentação que contém uma quantidade detectável de fenantroviridina, cujo processo compreende a cultura da especie Streptomyces viridochromogenes DSM 3972, ou de uma cultura derivavel da referida especie, num meio nutriente e tornando o processo descontínuo para a separação e purificação da fenantroviridina na fase apropriada.

invento refere-se também ao uso de um composto de formula I para o tratamento medicinal de doenças em animais de sangue quente incluindo o ser humano, em particular para o tratamento de tumores, por exemplo tumores do pulmão, por administraçao de uma quantidade tera peuticamente efectiva, por exemplo, de uma quantidade tumor/ cida, de um composto de formula I. A dosagem para a admini£ tração a animais de sangue quente contendo um peso do corpo de 70 kg ca., por exemplo o de um ser humano, é de 100 a 1000 mg por dia. A administração é feita de preferencia parenteralmente na forma de composições farmacêuticas , por exemplo intravenosamente ou intraperitonealmente.

invento refere-se também a compo sições farmacêuticas que contêm um composto de formula I, em especial uma dose efectiva, por exemplo uma dose tumoricida, de um composto de formula I, juntamente com um veiculo farmacêutico, de preferencia uma quantidade significativa de um veiculo.

Os compostos farmacologicamente uteis deste invento podem ser usados na forma de composições para administração parenteral oud e soluções de infusão.

Tais soluções são de preferencai soluções aquosas isotónicas ou suspensões que, por exemplo como as composições liofiliza

-18das que contêm a substancia activa só ou juntamente com um veiculo, por exemplo manitol, podem ser preparados antes do uso. As composições farmacêuticas podem ser esterilizadas e/ou contêm adjuvantes, por exemplo preservativos, estabilizadores, agentes molhantes e/ou emulsificadores , solubiliz^ dores, sais para regularizar a pressão osmótica e/ou tampão. As composições farmacêuticas deste invento, que, se se desejar, podem conter também substancias farmacologicamente activas tais como antibióticos, são preparadas por um proces_ so conhecido per se, por exemplo por métodos convencionais de solubi1ização ou de 1iofi1ização , e contem de 0,1 ca. até 90%, de preferencia de 0,5 até 30% ca., por exemplo de 1 a 5%, de substancia activa ou de substancias activas.

Os Exemplos seguintes ilustram o invento sem implicar qualquer restrição ao que aqui é descrito. Os valores de Rf são determinados por pratos de silica gel em camada-fina (ex., Merck, Darmstadt, West Germany). A razão de eluentes para cada um dos outros nas misturas de eluentes utilizadas é dada em partes por volume (v/v). A concentração c da substancia no solvente ou mistura de solventes é expressa em % no caso de rotação optica (peso/volume).

São usadas as seguintes abreviaturas quando se indica o espectro de ressonância nuclear:

b = larga d = dupleto

Hz= Hertz

J = constante de acoplamento

-19m = multipleto q = quarteto s = singeleto t = tripleto

Exemplo 1 litros de solução cultura de pH igual a 8,8 (do passo 1.4) são ajustados para pH igual a 2, com 50% de acido sulfurico e agitou-se durante 15 minutos em 50 litros de acetato de etilo. 0 extracto de acetato de etilo é desprezado. 0 rafinato e micélio são ajustados para pH igual a 10 com solução de hidroxido de sodio 5N e agi tou-se durante 30 minutos em 110 litros de acetato de etilo.

extracto de acetato de etilo básico é concentrado por evaporação e o óleo residual é repartido entre metanol e hej) tano. A fase de heptano é desprezada e a fase de metanol é evaporada até â secura. 0 residuo é cromatografado em 500 g de silica gel (eluição com uma mistura de cloreto de metileno/metanol /sol ução de amónia aquosa a 25% na razão de 94:6:1) residuo seco da fracção principal· (AH g) é dissolvido em acetonitrilo/agua/acido trifluoroacetico (50:50:1) e purificando por cromatografia de fase

D reversa em Lichroprep (silica gel modificada por alquilo Cp C₄, por ex., Merck Darmstadt, West Germany). As fracções

-20contendo o produto desejado (fenantroviridina) são liofiliza

D das. 0 residuo é cromatografado em Sephadex -LH20 (gel dextrano modificado, ex Pharmacia, Sweden) com metanol como e1uente.

produto impuro é cristalizado a partir de metanol/isopropanol , para dar 1 -(2,3,6-tridesoxi-3-metilamino - ok - ribo-hexopiranosiloxi)-8-hidroxi-3-metilbenzo/b7fenantridina-7,12-diona-trifluoroacetato (trifluoro acetato de fenantroviridina) de p.f. de 196 a 197°C;

ΓΨ-J = +62 + 1,9° (c = 0,518 em metanol) h₃c (III) i 7 II í₆ V^a 'Ν·

MHz-¹³C-NMR (CD3OD): δ = 18,3 (qdd, J = 12? Hz; C-6’), 22,0 (qt,

J = 128 Hz; C-13), 29,2 (tm, J = 133 Hz; C-2'), 32,5 (qd, J = 142 Hz; Ç-NH), 57,6 (dm, J = 148 Hz; C-3’), 69,2 (dm, J = 144 Hz; C-4’ou C-5’), 69,3 (dm, J = 144 Hz; C-4’ ou C-5'), 99,2 (dm, J = 174 Hz; C-l'), 116,1 (tb; C-7a), 119,7 (dd; C-ll), 123,4 (C-12b), 124,0 (dddq; C-4), 124,5 (ddq; C-2), 124,9 (dd; C-9), 131,6 (s; C-12a), 133,8 (m; C-lla), 136,6 (d, J = 8 Hz; C-4a), 13S,4 (d; C-10), 144,9 (q; C-3), 145,4 (d,

J = 13 Hz; C-6a), 155,0 (sb; C-l), 158,4 (dm, J = 184 Hz e j = 4 Hz; C-5), 163,1 (dd, J = 9 Hz e J = 1 h₂; C-8), 186,0 (db, J = 4 Hz; C-12), 187,7 (sb; C-7).

-21A solução cultura inicial é obtida como se segue:

Passo 1.1

Para preparar o inócuo para a produção actual de fermentação, são inoculados um numero de culturas de levedura/agar em plano inclinado com a especie Streptomyces viridochromogenes (sem a formação de melanina) DSM 3972, que é mantida em ampôlas a -80°C e incubadas durante 7 a 10 dias a 28°C. Estas culturas em agar têm a seguinte composição:

g/i extracto de levedura 4 (Fould Springer) extracto de malte 5 (Difco) glucose 4 bacto agar 20

Os conteúdos de uma destas culturas de agar em plano inclinado são transferidos subsequentemente para um balão de Erlenmeyer de 500 ml de uma divisória e contendo 100 ml do meio SCR/9. 0 meio SCR/9 tem a seguinte compos i ção:

-22cerelose (glucose de grau comercial) 22 oxo Lab-Lemco 5 peptona (Difco) 5 extracto de levedura (Difco) 5 ant i-espuma (s i1i cone A/AF ) 0,01 caseina hidrolisada (Difco) 3

NaCl 1,5 balão de Erlenmeyer é incubado num misturador rotativo durante 48 horas a 28°C e a 250 rpm com um fluxo de 50 mm, tempo depois do qual o volume do mice lio embalado do meio de cultura (i.e., o volume da célula determinado por centrifugação durante 10 minutos a 1590 g) é de 5 a 8%.

-23Passo 1.2 ml do meio de cultura assim obtidos são depois inoculados sob condições assépticas, em cada um de dois balões de Erlenmeyer de 2 litros com 4 divisórias e contendo 500 ml de meio scr/9.

Estes balões são inoculados/inciu bados durante 48 horas a 28°C e 120 rpm num misturador rota tivo com um fluxo de 50 mm, tempo depois do qual o volume do micelio embalado é de 10 a 30%.

Passo 1.3

750 ml (2,5 % em volume) do meio de cultura obtido no passo 1.2, são depois transferidos sob condições assépticas para um fermentador de pré-cultura de 50 litros contendo 30 litros do meio esterilizado SCR/9.

fermentador é equipado com um agitador de turbina de 6-lâminas contendo um diâmetro de 115 mm e que roda a 600 r.p.m.

As condições de incubação sao: temperatura 28°C; arejamento :1 litro de ar por litro de meio de cultura por minuto; pressão superior: 50.000 Pa (0,5 bar) ; tempo de incubação: 48 horas. 0 volume do micé lio empacotado é de 8 a 10%.

-24Passo 1.4

5% em volume do meio de cultura obtido no passo 1.3 é transferido sob condições assépticas para um fermentador do mesmo tipo que o usado no passo 1.3 contendo 30 litros de meio de produção da seguinte composição :

9/1 cerelose (glucose de grau comercial) 20 protami na 1 (proteina registada) extracto de levedura (Fou1 d Spr i nger ) kh₂po₄

CaCo^ ant i-espuma

0,5

3,0 como necessário

A fermentação é efectuada durante 7 a 8 dias sob as mesmas condições que no passo 1.3, .

pH, o volume do micelio empacotado, a esterilidade, temperatura, arejamento, pressão superior e velocidade de agitação sao determinadas em intervalos regulares. No fim da fermentação, o pH do meio de cultura é > 8,0 e o volume do micelio empacotado é de 20 a 25%.

-25Exemplo 2

278 mg de trif1uoroacetato de fenantroviridina são acidificadas com 50 ml de acido clorídrico 0,1N (q.v. Exemplo 1) e aquecidos durante 30 minutos a 90°C. Depois do arrefecimento da mistura reaccional num banho de gelo, o precipitado castanho escuro é isolado por filtração e o residuo de filtração é dissolvido em 40 ml de cloroformio e a solução é extraída com 10 ml de água.

A fase de cloroformio é seca sobre sulfato de sodio e concentrada ao vacuo até à cristalização Os cristais são filtrados por sucção e secos sob vacuo com pentóxido de fosforo para dar 1,8-dihidroxi-3-metilbenzo/~b7fenantridina-7,12-diona (numeração como no Exemplo 1, formula III): p.f. de 234 a 235°C.

Espectro de RMN de protão -360 MHz (CDC1₃: CD₃0D = 9:1):$ = ₂,_{6 (s; 3H> CH3)j 7},_{33 (s; 1H>}

9-H), 7,44 (d, J = 9 Hz; 1 H, 4-H), 7,51 (s; IH, 11-H), 7,78 (t, J = 9 Hz; IH, 5-H), 7,95 (d, J = 9 Hz; IH, 6-H), 9,45 (s; IH, 12-H).

-26Espectro de RMN - -90MHZ

MHz-¹³C-NMR (CDC1₃:CD₃OD = 9:1): δ = 20,3 (C-13), 113,6 (C-7a), 119,5 (C-12b), 120,5 (C-ll), 120,7 (C-2), 122,8 (C-4), 124,7 (C-9), 127,5 (C-12a), 131,7 (C-lla), 132,7 (C-4a), 136,3 (C-10), 143,4 (C-3), 144,4 (C-6a), 153,8 (C-l), 159,1 (C-5), 161,0 (C-8), 185,1 (C-12), 188,6 (C-7).

Exemplo 3

Composição farmacêutica para administração parenteral

São cheias sob condições assépticas em ampôlas ou recipientes com 5 ml de uma solução aquosa esterilizada a 1% de hidrocloreto de fenantroviridina e liofilizadas. As ampôlas ou recipientes são selados sob azoto e testados .

-27Exemplo 4

Composição farmacêutica para administração parenteral

São cheias sob condições assépticas em ampôlas ou recipientes com 10 ml de uma solução aquosa esterilizada de 0,5% de hidrocloreto de fenantroviridina e 2,5% de lactose e 1iofi1izadas.

As ampõlas ou recipientes são selados e testados.

Claims

REIVINDICAÇOES

1⁹.- Processo para a preparação de 1 ,8-dihidroxi-3-meti1benzo/~b7fenantridina-7,12-diona ou de seus derivados de formula I ,ch₃ (I) z\ z’\

II I I II • · « · em que

R é hidrogénio ou o radical de formula II

HO·

CH j .-O \ z •(II)

KHCH 3 ou de um seu sal deste composto, em que R é o radical de formula II, caracterizado por compreender a cultura da estirpe

-29Streptomyces viridochromogenes (Krainsky) Waksman e Henrici (sem formação de melanina) DSM 3972, ou uma cultura derivavel desta estirpe, num meio nutriente adequado, isolamento do composto de formula I, em que R é o radical de formula

II, do meio de cultura e, se desejado, conversão do composto resultante num sal e, se desejado, no composto de formula I, 1 em que R é hidrogénio, por tratamento com um meio acfdico.

23.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a cultura da estirpe DSM 3972 ou de uma cultura que possui caracter distintivo da estirpe DSM 3972 essencial para efectuar tal processo, sob condições aerõbicas num meio nutriente aquoso que contém uma fonte de carbono e uma fonte de azoto tal como sais inorgânicos, e isolamento do composto de formula 1

I, em que R é o radical de formula II e, se desejado, conversão do composto resultante num sal farmaceuticamente acej_ tável .

33.- Processo de acordo com a rej_ vindicação 1 ou 2, caracterizado por compreender a cultura da estirpe DSM 3972 ou seus mutantes e formação do composto da formula I, em que R é 0 radical da formula II.

43.- Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se fazer a cultura da estirpe DSM 3972.

δ⁹.- Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela cultura ser efectuada de 2 a 12 dias a uma temperatura de 22°C até 32°C.

-306⁵.- Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a cultura ser efectuada de 7 a 8 dias a 28°C.

7^?.- Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser usa^ do um acido mineral ou um permutador de iões acídico como um meio acídico para rompimento do radical da formula II.

8³.- Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o radical da formula II ser dividido em HC1 0,1N entre 50 e 120°C.

9^?.- Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser preparada a 1 -(2,3 ,6-tridesoxi-3-meti1-amino- ribo-hexopiranosiloxi)-8-hidroxi-3-metilbenzo/b7fenantridina-7,12-diona de formula III

QH (III)

-31na configuração absoluta que se pode obter por cultura da estirpe Streptomyces viridochromogenes DSM 3972, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

10^â.- Processo de acordo com qual quer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser preparado a 1,8-dihidroxi-3-metilbenzo/b7fenantridina-7,12

-diona de formula I de acordo com a reivindicação 1, em