PT87886B

PT87886B - Metodo para a prevencao de deposicao de fibrina ou de formacao de adesoes e processo para a preparacao de composicoes terapeuticas para esse fim

Info

Publication number: PT87886B
Application number: PT87886A
Authority: PT
Inventors: Tue H Nguyen; Marjorie A Mohler
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1987-07-01
Filing date: 1988-06-30
Publication date: 1993-09-30
Also published as: JPH04502753A; AU621305B2; IL102625A0; PT87886A; PH26527A; FI103868B; DK675389A; NZ225260A; IL86933A; IE65658B1; FI896359A0; EP0297860B1; NO895338D0; DK675389D0; NO301748B1; DE3883645D1; AU1998588A; DE3883645T2; FI103868B1; KR890701124A

Description

..MÉTODO PARA A PREVENÇÃO DE DEPOSIÇÃO DE FIBRINA OU DE FORMA ÇAO DE ADESÕES E PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE COMPOSIÇOES TERAPÊUTICAS PARA ESSE FIM

dendo a referida composição incluir um veiculo inerte que aumente a aderência.

E também referido o processo para a preparação da referida composição bem como o dispositivo distribuidor utilizado na administração da referida composição.

Campo do Invento

Este invento relaciona-se com métodos e composições para evitar a formação ou reformação de aderências, particularmente nas cavidades peritoneal ou pélvica resultantes de cirurgia, infecção, inflamação ou traumatismo. 0 invento aplica-se a administrações humanas e veterinárias .

Fundamentos

A formação de aderências intraperitoneais pós-operatórias, ou seja a aderência patológica de orgãos e de superfícies dos tecidos, constitui a causa principal da obstrução intestinal a seguir à cirurgia abdominal. (H. Eli is, Surg. Gynec . Obstec . , I 33 Z?1971/). Uma aderência compreende tipicamente um exsudado fibrinoso organizado projectado sobre a superfície de uma membrana serosa que liga ou adere as superfícies opostas de tecidos e de orgãos. As aderências constituem também o factor principal contribuindo para a infertilidade (esterilidade) após cirurgia reconstructiva das trompas. (Buttram, V.C., Fert. and Ster.40:5/1983/). Foi referido que 50-90% da totalidade das pessoas submetidas a cirurgia abdominal desenvolvem aderências (Cllecti , L. and Bassart, B. Arch. Surg. Fert. 88:774/1964/). Também se observou a formação de aderências a seguir a uma infecção íntraabdomina 1 (Hau, T. et a 1., Surg. Gyn. & 0b. 148:415-418 /”1979/). A formação de aderências foi também observada a seguir à cirurgia dos tendões (Weiss, C. et al., Bull.Hosp. Joint Diseases 4 7( 1) , 31/Ί987/).

A partir dos primeiros dias da cirurgia abdominal, os cirurgiões ficam cientes da aparição · de aderências fibrinosas que provocam a adesão de ansas -intestinais e de outras vísceras abdominais entre si umas horas após a cirurgia, inflamação ou traumatismo.0 exsudado

fibrinoso pode ou ser reabsorvido cornp 1 etamente, deixando uma cavidade peritoneal transparente, ou pode organizar-se com um crescimento no seu seio de capilares e de fibroblastos para formar aderências fibrosas estabelecidas. A questão importante, que até hoje penranece sem resposta, consiste em saber qual o factor que determina se o exsudado fibrinoso vai ser absorvido ou se vai organizar. Desenvolveu-se uma teoria segundo a qual a formação da aderência é uma consequên_ cia da destruição do endotelio peritonea1.Numeroso estudos refutaram esta teoria (Ver, por exemplo, EI lis, H. Brit. J. Surg. , 50: 10 Λ 96 27) .

Verificou-se que a cicatrização normal das lesões ou defeitos peritoneais começa com a formação de uma matriz de fibrina, seguida por fagocítose dessa matriz por macrófagos, monocitos, linfocitos e polimorfos. Os fibroblastos e os feixes de fibras do colagénio são observados antes do peritoneu voltar a ter um aspecto normal. 0 processo normal de cicatrização dura aproximadamente três (3) dias. (Buckman, R.F. et a I. , J. Surg. Res. 21 , 67 719767. 0 facto da matriz de fibrina ser reabsorvida parece estar relacionado com o facto do tecido ser isquémico (Rubin, I.C., Surg. Obstet., 12:177 719117). EI lis, H.

et a 1 . , Brit. J. Surg. 52.:471 ( 1965) desenvolveu um modelo peritoneal isquémico e revelou que 83% das lesões isquémicas resultavam em formação de aderências eoquanto que apenas 9% dos modelos não isquémicos produziram aderências. Usando microscopia eléctrónica, verificou-se que a invasão fibroblástica resultava de macrofagos que infiltraram a área, e que se desenvolveram em fibroblastos, células gigantes, e células do tipo epite 1 ia 1.(Eske1and, G. Acta Path. Microbiol. Scand., 62:459 719 6 47). A formação de aderências de acordo com Ellis actuava como um enxerto vascular. Usando um modelo semelgante ao de EI 1is.Buckman et aI., supra., verificou-se que os defeitos peritoneais possuem uma elevada actividade do pIasminogéneo que é perdido no peritoneu tornado isquémico.

A deposição de fibrina a seguir à infiltração bacteriana da cavidade peritoneal constitui um mecanismo de defesa para evitar septicémia (Ahrenholz, D.H. and Simmons, R.L., Surgery 88: 41 -47/1 980/,Zinser,Η.H. and Pryde, A.W., Ann. Surg. 136: 818/1982/). As bactérias são controladas, mas a deposição de fibrina conduz frequentemente à formação de um abcesso. (Ahrenholz and Simmons, supra).A deposição de fibrina ocorre durante estádios precoces da peritonite, quando o exsudado rico em fibrinogénio na cavidade peritoneal é convertido em fibrina.(Hau, supra).Os abcessos intrabdominais pós-operatórios constituem uma fonte potencial de infecção e, por último, de morte. A peritonite e as suas complicações estão associadas a uma elevada taxa de mortalidade. Entre os mais idosos a taxa de mortalidade varia entre 60-80%.(Hau.T. et a 1., Curr.Prob. Surg. 16:1-65 /19797).

Os activadores do p1 asminogénio presentes tanto no mesotélio como no submesoté1io dos vasos sanguíneos do peritoneu são responsáveis pela lise e pela remoção dos depósitos intraperitoneais de fibrina.(Porter. J.M.et al., L. Surg.Forum 20:80/196 9/; Buckman, R.F. et a 1., J. Surg. Res. 20:1 /1976/). As lesões da serosa ou peritoneaís tais como inflamação ou traumatismo resultam na formação de um exsudado de componentes celulares e de fibrina através de lesões (rupturas) nas veias pequenas da área traumatizada (Aurora, A.L. et a 1. Indian J.Med. Res. 62: /1972/)assim como uma diminuição local da actividade fibrinolíti ca.(Buckman, R.F. supra). Verificou-se que quando a actividade fibrino 1ítica local é reduzida em 50% ou mais, a fibrina não pode ser removida formando-se aderências permane/ tes. (Gervin, A.S. et al., Am. J. Surg. 125/1973/).

Foram publicados numerosos artigos descrevendo os esforços para evitar a formação de aderências. Foram tentados vários métodos profiláticos para evitar a deposição de fibrina e as aderências. A prevenção da deposição de fibrina no exsudado peritoneal envolveu a utilização de sódio, citrato, heparina, e de outros anticoagu1 antes. Para a remoção da fibrina que já se tenha formado foram utilizados vários enzimas; por exemplo, tripsina, pepsina, papaina, hia 1uronidase , estreptoquina se e estreptodornase. Outras tentativas para a remoção de fibrina utilizam sais tal como ricinoleato de sódio ou lavagem para a remoção mecânica da fibrina.

A heparina e o dicumarol foram os primeiros agentes usados para evitar a deposição de fibrina. (Lehman, E.P. and Boys, F. Ann. Sur., 1 1 2:969/1940/;White,

B.H. Ann. Surg., 130:942 /1949/). Foram referidas mortes e hemorragia pós-operatória nos doentes que receberam heparina. Mais recentemente, a propriedade antitrombogénica do dextrano levou à sua utilização para evitar as aderências. (Choate, W.H. et al., Arch. Surg., 88 : 249/1 964/ ). Verificou-se que o dextrano faz diminuir a gravidade das aderências mas não evita a sua formação (Kapur, B.M.L. et al., Indian J. Med. Res., 56 : 140 6/1 968/ ). Foi também utilizada a administração oral do agente anti-inf1amatório oxifenbutazona para reduzir a formação de aderências. (Kapur, B.M.L., et al., Arch. Surg. , 98 : 301 /1 969/).

Foi também sugerida a lavagem com solução salina, dextrose, ou particu 1armente uma solução de dextrose hipertónica, mas a absorção rápida dessas soluções tornou-as ineficazes. (Buchbinder, J.R., Surg. Gynec Obstet., 45:769 /1927/); Totten, H.P., Surgery, 8:456/1 940/). Pensou-, -se que os enzimas digestivos tais como a pepsina e a tripsina pudessem ter utilidade para a destruição da fibrina. Contudo, estas substâncias são ambas rápidamente neutralizadas por

exsudados peritoneais e revelaram-se i nef i c® s. ( Kubota , T., Japan M. World, 11:226 /19227). A papaina, um enzima proteolitico, foi também ensaiado mas verificou-se que era neutralizada pelo exsudado peritoneal. A papaina foi também administrada oralmente e verificou-se que reduzia a gravidade das aderências, mas não a incidência.(Kapur, B.M.L. et al., Arch. Surg., 98: 301 /1969/). A administração i ntraper i tonea 1 da papaina em ratos não apresenta qualquer efeito sobre a formação de aderências . (Stevens, L.E., Amer. J. Surg., 1 15:535/1968/) .

Foi ensaiado um certo número de agentes fibrinoliticos para evitar as aderências. Considera-se tipicamente que o sistema fibrino 1itico significa o sistema no sangue que envolve a conversão do plasminogénio em plasmina. Um activador natural do p 1 asminogénio interactua com o plasminogénio para converter o precursor na plasmina a qual realiza a lise da fibrina com ligação cruzada. Os activadores exógenos tais como a estreptoquina se e a uroquinase também activam a conversão do plasminogénio em plasmina.Os agentes trombolíticos incluem os activadores da plasmina e do plasminogénio tais como a estreptoquinase, a estreptodornase, e a uroquinase. Foram utilizados estes agentes trombo 1iticos e fibrino 1iticos assim como outros agentes para evitar a deposição de fibrina e para remover as aderências. 0 trabalho inicial revelou que a estreptoquinase e a estreptodornase evitavam as aderências induzidas traumâticamente em coelhos, mas não em cães. (Wright, L.T., et al., Proc. Soc. Exp.Biol. Med., 75:602 /19507). Num estudo, observou-se que a terapêutica intraperitonea 1 em três dias sucessivos era mais eficaz do que uma única injecção.(Knight1y, J.J., et al.Surgery, 52:250/196 27) Outros estudos foram menos favorávei s . Numa série de experiências usando administração intravenosa e intraperitonea1 de uma série de enzimas fibrinoliticos em cães, coelhos e ratos assim como diferentes técnicas para produzir aderências, não se observou qualquer efeito profilático ou terapêutico.(Jewett. T.C., et al., Surgery 57:280

/1 965/). Preparações altamente purificadas de estreptoquinase administrada a ratos, numa injecção de dose simples ou em injecções múltiplas de doses simples em três dias sucessj vos não inibiram a formação de aderências.(James, D.C.O., et al., J. Path. Bact. 90:279/1965/) . Estudos adicionais usando estreptoquinase purificada em coelhos indicou que as aderências a áreas de lesão parietal podiam ser inibidas administrando injecções múltiplas de estreptoquinase em solução, intraperitonealmente, em dois ou três dias consecut/ vos.(Id.). Tem sido usada a terapêutica trombolítica para evitar a deposição de fibrína na endocardite num modelo de coelho.(Duraug, D.T., J. Path. 129:537 /1975/). Os agentes fibrinoliticos foram usados para reduzir as infecções de feridas induzidas por coágulos de plasma infectados em incisões da pele da cobaia.(Rodeheauer, G. et a 1., Am. J. Surg. 1 29 : 537-544/1 975/) .

Outros compostos que se verificou terem um efeito fibrino 1itico foram também usados para evitar as aderências. Verificou-se que a protoporfirina , que possui uma acção fibrino 1itica , reduz a percentagem de aderências resultantes da laparotomia no rato. (Iijima, N, et al., Postgrad.Med. J. 46 : 278/1970/ ) . A hia 1uronid ase, um enzima que hidrolisa o ácido hialurónico, um dos polissacáridos que constitui a substância de base interce1u1 ar , evitou a formação de aderências em cães quando administrada intraperitonealmente ao mesmo tempo que se aplicava talco para induzir a formação das aderências. (Connoly, J.E. and Richards, V. Surg. Forum, 2:85/1951/). Outros estudos em ratos a seguir a esmagamento cecal não revelaram qualquer redução na incidência de aderências a seguir à administração intraperitonea1 de hia 1uronidase.(Thomas. J.et al.,Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 74:497/1950/).

Dexametasona , met i 1 predn i so 1 ona , succina_ to de sódio, clorohidreto de prometazina e fibrinolisina humana isoladamente e em combinação foram administrados intramuscu 1 armente ou intraperitoneaImente a ratos para evitar a formação de aderências. (Gazziniga, A.G. et a 1., Arch. Surg. 1 1 0 : 429/’l 9757 ) . Nenhum dos agentes isoladamente eliminou a formação de aderêncías.Meti1predniso1ona, prometazina e fibrino 1isina humana em combinação intraperitonea1 mente numa única dose pareceram eliminar a formação de aderências. Id.

Para além destas substâncias atrás mencionadas, outras têm sido colocadas na cavichde peritoneal para evitar a formação de aderências, incluindo peritoneu picado de boi, azeite, solução de epinefrina, liquido amniótico e ricinoleato de sódio. Nenhuma das substâncias revelou possuir a capacidade de evitar a formação ou reformação de aderências.

Um objectivo do presente invento con s i_s te em proporcionar uma composição que evite o depósito de fibrina ou a formação de aderências para utilização em vários contextos cirúrgicos é clínicos incluindo, mas não se limitando a, cirurgia abdominal e pélvica, cirurgia dos tendões, 1 amínectomia , infecção, inflamação ou traumatismo abdominal. Um outro objectivo do invento consiste em proporcionar uma composição que seja de aplicação fácil e convenier^ te ao sitio (local) de potencial deposição de fibrina ou formação de aderências. Ainda um outro objectivo do invento consiste em proporcionar um método para evitar o depósito de fibrina ou a formação de adesão por meio de aplicação tópica da composição deste invento a orgãos e/ou tecidos circundantes nos quais se possa depositar fibrina ou formar-se aderências. E ainda outro objectivo deste invento consiste em eliminar a introdução de sólidos não degradáveis como meios para a libertação de agentes que evitem a deposição de fibrina ou a formação de aderências.Um outro objecti-10-

vo consiste em proporcionar enzimas para evitar a deposição de fibrina ou a formação de aderências de um modo tal que não sejam inactivados por substancias nos fluidos biológicos. Ainda um outro objectivo consiste em proporcionar esses enzj_ mas numa formulação que permita uma libertação continua sem qualquer necessidade de matrizes ou de dispositivos exógenos.

Resumo do Invento

Os objectivos deste invento são realizados pela administração tópica de um enzima moderadamen te solúvel que permita a aplicação contínua do enzima ao sítio (local) de potencial depósito de fibrina ou formação de aderências. Um enzima moderadamente solúvel eficaz na fibrinolise ou na trombolise é útil para o tratamento das aderências particularmente a seguir a cirurgia, infecção, traumatismo ou inflamação quando administrado tópicamente ao sitio (local) do potencial depósito de fibrina ou formação de aderências de modo a que o enzima se encontra contínuamente disponível no sitio (local) durante pelo menos cerca de três dias. 0 enzima moderadamente solúvel é administrado de preferencia sob a forma de partículas sólidas suspensas numa aderência inerte facilitando o fornecimento do enzima durante um período de tempo pro1ongado.Não foi apreciado(considerado) até ao presente invento que uma aplicação tópica simples de um enzima sólido moderadamente solúvel a um sitio (local) pudesse proporcionar um fornecimento contínuo desse enzima para evitar o depósito de fibrina ou a formação de aderências. De preferencia o enzima aqui utilizado é activador de p1asmínogénio dos tecidos precipitado. Consequentemente, num aspecto o invento é dirigido a uma composição farmacêutica compreendendo um enzima moderadamente solúvel, tal como activador do p1 asminogénio dos tecidos, para evitar a formação de aderências em várias si‘tuações, tal como a seguir a cirurgia ou infecção.Num outro aspecto o invento é dirigido para um método de tratamento da

-11deposição de fibrina ou formação de aderências no campo clinico e para a utilização dessas composições.

Descrição Breve dos Desenhos

Figura 1. Efeito de doses de activador do plasminogénio dos tecidos recombinante na prevenção da formação de aderências em coelhos. Quantidades variáveis de activador do plasminogénio dos tecidos recombinante em 2,5 gramas de um veiculo semi-sólido foram aplicadas às superfícies traumatizadas de tecido no peritoneu. Após uma semana os animais foram sacrificados e fez-se a avaliação da extensão das aderências. 0 número de coelhos com aderências com uma dose de 0,125 e 0,25 mg de activador do plasminogénio dos tecidos recombinante/gm de gel foi significativamente (p< 0,01 ) diferente do do controlo (da testemunha) e do dos grupos com 0,062 mg de activador do plasminogénio dos tecidos recombinante/gm de gel tal como foi determinado pelo teste não paramétrico de Mann Whitney.

Figura 2.

Efeito do activador do plasminogénio dos tecidos recombinantes sobre a prevenção da reformação de aderências após lise cirúrgica. A extensão das aderências formadas nos coelhos sem qualquer tratamento é indicada no dia 7. Após lise cirúrgica das aderências que se formaram, os animais foram divididos em dois grupos;animais de controlo (testemunhas) receberam apenas o veiculo e os animais tratados receberam 0,25 mg do activador do plasminogénio dos tecidos recombinante/ /gm de gel. No dia 14 o número de animais que tinha recebido o activador do plasminogénio dos tecidos recombinante apresentava uma diminuição

dramática na extensão das aderências que se tinham reformado.

Figura 3. Efeito de doses de activador do plasminogénio dos tecidos recombinante na prevenção da formação de aderências em coelhos. Quantidades variáveis de activador do plasminogénio dos tecidos recombinante em 2,5 gramas de um gel a 2,8% de hialuronato de sódio foram aplicadas às superfícies traumatizadas do tecido no peri toneu. Após uma semana, os animais foram sacrificados e a extensão das adesões foi registada.

Descrição Detalhada

Tal como é aqui utilizado um enzima moderadamente solúvel é um enzima sob uma forma molecular que se dissolve a um ritmo desejado num fluido biológico capaz de evitar a deposição de fibrina ou a formação de aderências por meio de uma aplicação tópica simples a um sitio(local) de potencial deposição de fibrina ou formação de aderências. 0 enzima é aplicado ao sitio (local) da potencial deposição de fibrina ou formação de aderências sob a forma de um sólido, por exemplo como um pó, pasta ou suspensão. Moderadamente solúvel refere-se à solubilidade relativamente baixa do enzima nos fluidos biológicos, por exemplo no plasma, intersticial ou peritoneal. A taxa de dissolução é seleccionada de modo a que o enzima se dissolva no fluido biológico durante um periodo de tempo suficiente para evitar a deposição de fibrina ou a formação ou re-formação de uma aderência no sitio(local) alvo tipicamente durante cerca de três a catorze dias. A dissolução do enzima· moderadamente solúvel no sitio(local) da potencial deposição de fibrina ou formação de aderências durante um determinado periodo de tempo deve-se à sua solubilidade relativa-13-

mente baixa. Esta dissolução mantida durante um determinado período de tempo permite uma única aplicação tópica para proporcionar uma libertação contínua do enzima durante o desejado periodo de tempo. E preferível que o enzima moderadamente solúvel seja um sólido na altura da aplicação. Incluídos nos enzimas aqui utilizados contam-se os enzimas tromboliticos ou fibrino 1iticos, tais como a plasmina, estreptoquinase, uroquinase, activador do p1asminogénio dos tecidos e estreptodornase. Os enzimas fibrinoliticos incluem enzimas que convertem o plasminogénio em plasmina, incluindo estreptoquinase, uroquinase, e activador do plasminogénio ou que digerem a fibrina directamente. Os agentes trombo 1iticos incluem enzimas fibrino 1iticos assim como outros enzimas proteo1iticos . Um enzima proteolitico é a brinase. Um enzima sólido moderadamente solúvel preferido é oactivador do plasminogénio dos tecidos o qual tal como é aqui usado refere-se a um enzima que pode ser extraído e purificado a partir de fontes naturais e (Ver Patente dos E.U.A. No. 4.752.603) ou pode ser obtido usando meios recombinantes (Ver a Publ. do Requerimento da Patente EPO No. 093.619). Os enzimas deste invento podem assim ser obtidos a partir de mamíferos, bactérias ou leveduras. E preferível utilizar o enzima homólogo para a espécie a ser tratada. Por exemplo, de acordo com este invento deve-se utilizar enzima canino, para evitar a formação de aderências no cão. São também incluídas no âmbito do enzima sólido variantes tendo substituições e/ou eliminações e/ou adições de amino ácidos, sais orgânicos e inorgânicos e derivados modificados cova 1entemente do activador do plasminogénio dos tecidos.

A expressão sólido descreve o estado preferido do enzima na altura da aplicação ao sitio (local) da potencial formação de aderências. 0 enzima apresenta-se numa forma substancialmente homogénea sem a presença de um agente que se ligue cova 1entemente ou não-cova 1entemente ao enzima para libertar o enzima durante um determinado

periodo de terpo. 0 enzima sólido apresenta-se no caso do activador do p1asminogénío dos tecidos sob a forma de um pó branco, amorfo. 0 estado sólido do enzima é obtido usando vários métodos conhecidos pelos técnicos especialistas por exemplo diálise, precipitação ou 1 iofi1ização. A precipitação do enzima pode ser realizada, por exemplo, por variação do pH, composição de co-solvente, temperatura e sal. A Iiofilização do enzima pode ser realizada, por exemplo, por liofilização não-aquosa usando butanol terciário, 1iofilização aquosa usando, por exemplo, sublimação com água ou um tampão volátil, tal como acetato de amónio ou bicarbonato de amónio e água, e fibalmente, liofilização aquosa/não aquosa. E preferida a liofilização aquosa. Mais preferida é a liofilização usando bicarbonato de amónio e água.

A composição deste invento compreende uma quantidade terapeut i camente eficaz de um enzima moderada, mente solúvel em, por exemplo, forma de pó. A composição pode adicionalmente incluir um veiculo inerte que realce (aumente) a fixação. A composição deste invento é aplicada directamente ao sitio (local) da potencial deposição de fibrina ou formação de aderências para libertação continua do enzima nesse sitio (local) durante um determinado período de tempo. A suspensão do enzima num veiculo inerte não tóxico que aumente a aderência reduz a possibilidade de degradação por proteases endógenas. A qualidade de fixação do veiculo inerte aumenta a retenção do enzima sólido no sitio (local) de aplicação. Isto permite uma libertação continua localizada no sitio (local) de aplicação durante um determinado período de tempo. Continua refere-se a uma libertação sem solução de continuidade, não interrompida, do enzima no sitio (local) de aplicação durante um período de tempo desejado. Assim a nova formulação controla a dissolução do enzima solido nos fluidos biológicos e protege-o de degradação.

enzima moderadarente solúvel pode ser administrado numa dose suficiente para evitar a deposição de fibrina ou a formação de aderências a seguir a cirurgia, infecção, traumatismo ou inflamação. Quantidades terapeuticamente eficazes do enzima moderadamente solúvel serão administradas de acordo com os ensinamentos deste invento. Por exemplo, quantidades terapeuticamente eficazes de estreptoquinase numa forma moderadamente solúvel variam entre cerca de 300 unidades/grama de gel e 12.500 unidades/grama de gel. Uma quantidade terapêutica preferida de estreptoquj, nase varia entre cerca de 10.000 unidades/grama de gel e cerca de 375.000 unidades/grama de gel. N0 caso do activador do p1asminogénio dos tecidos sob uma forma sólida, as quantidades terapeuticamente eficazes variam entre cerca de 0,02 mg/grama de gel e 25 mg/grama de gel. Uma quantidade terapêutica preferida do activador do plasminogénio dos tecidos varia entre cerca de 0,125 mg/grama de gel e 2,5 mg/grama de gel. Uma quantidade terapêutica mais preferida do activador do plasminogénio dos tecidos varia entre cerca de 0,25 mg/grama de gel e cerca de 1,0 mg/grama de gel.

Um veiculo que aumenta a fixação é definido como um veiculo farmaceuticamente inerte mucilaginoso, semi-sólido para colocação do enzima moderadamente solúvel no stio (local) da potencial formação de aderências. Os veículos são inertes, não-tóxicos, não-irritativos e são fisiologicamente e farmaceuticamente aceitáveis. Os veículos geralmente são susceptíveis de erosão biologica visto sofrerem desgaste a partir do sitio(local) de aplicação em comparação com os veículos biodegradáveis que requerem cisão química do veículo a fim de libertar o enzima activo. Os veículos inertes que aumentam a fixação asseguram um fornecimento continuo do enzima no sitio (local) de aplicação reduzindo entretanto a aparição do enzima em localizações indesejáveis, por exemplo no sangue. A forma moderadamente solúvel do enzima pode possuir qualidades de fixação e nesse

caso torna-se desnecessária a utilização de um veiculo inerte que aumente a fixação. Hidrocarbonetos de cadeia longa ou óleos vegetais e ceras compostas de misturas de glicéridos de ácidos gordos saturados e não saturados ou misturas de glicéridos modificados de ácidos gordos saturados e não saturados podem ser utilizados como os tais veículos ou excípientes inertes que aumentam a fixação. Esses veículos ou excipientes incluem, mas não se limitam a, veículos semi-sólidos tais como geleia de petrolatum ou glicéridos semi-sintéticos , solventes polihidroxi, tais como glicerol, hidrocarbonetos de cadeia longa, polímeros susceptiveis de erosão biologica ou liposomas. Incluídos nos polímeros susceptiveis de erosão biológica encontram-se os polímeros de baixo peso molecular que podem ser formulados numa forma semi-sólida. Esses polímeros semi-sólidos formulados incluem poli(ésteres), poliamidas, poli(amino ácidos), poliacetais, po1ianidridos, poli(orto ésteres) e polissacaridos tais como o carbohidrato natural consistindo em ácido β-D-gIucoronico e 2-acetamído-2-desoxi-p-D-glucose alternos conhecido como ácido hialurónico. São preferidos os polissacáridos para utilização como veiculo inerte para aumento da fixação. Ornais preferido é o ácido hia 1urónico.Os veículos inertes não-tóxicos deste invento não devem incluir sólidos susceptiveis de biodegradação ou não degradáveis para além do enima moderadamente solúvel visto se ter observado que a aplicação de pós tais como silicato de magnésio, talco e amido causam formação de aderências (Corson,

S.L., J. Reprod. Med., 29 ( 3) , 143fl984j).

A forma moderadamente solúvel do enzima pode ser dispersa no veiculo farmaceuticamente inerte que aumenta a fixação para se conseguir uma determinada taxa de dissolução no sitio(local) de aplicação. A forma moderada, mente solúvel controla a libertação para os fluidos biológicos permitindo uma actividade durante um determinado período de tempo desejado. Isto em contraste com uma forma solúvel

do enzima que se encontraria imed i ataiente disponível. A libertação do enzima pode ser prevista a partir da sua solubilidade e do tamanho des suas partículas tal como é indicado a seguir. Para um veiculo monolítico, em que o enzima é disperso sob a forma de partículas sólidas no interior de uma matriz inerte, a taxa de libertação do enzima é dada pela equação:

dM = (2A-C ) dx dt 2 e a quantidade libertada em qualquer altura após a administração pode ser calculada aproximadamente pela equação:

M = (2ADC_st)^1/2

Nestas equações, M é a quantidade de enzima libertado, A é o carregamento (carga) de droga por unidade de massa do veiculo, C$ é a solubilidade do enzima no veiculo, D é o coeficiente de difusão do enzima, t é tempo e dx é a espessura da zona esvaziada de enzima no interior da matriz (T. Higuchi, J. Soc. Cosmetic Chemists 1 1 , 85 ΖΊ9607; T. Higuchi, J. Pharm. Sei. 50, 874 /1961/). Consequentemente, a taxa de libertação a partir deste tipo de formulação pode ser modificada por variação de C_$, da solubilidade do enzima (por exemplo usando diferentes tipos de veículos) ou controlando a carga de droga no veiculo.

Quando o enzima é suspenso sob a forma de partículas sólidas num veiculo solúvel na água, a .taxa de libertação da proteína pode ser descrita por meio da equação-Noyes clássica:

dM = DA (C -C) dt h

Aqui, M é a quantidade libertada ou dissolvida, t é tempo, D o coeficiente de difusão das moléculas da droga no meio, A a área da superfície exposta, h a espessura da camada de difusão C$ e C são a solubilidade e a concentração do enzima no sitio (local) da aplicação. No caso das partículas sólidas do enzima colocadas num veiculo susceptivel de dissolução rápida, a dissolução do veiculo no espaço intersticial dará origem a uma dispersão do enzima nesse espaço. Sendo o enzima relativamente insolúvel ele dissolver-se-á durante um período de tempo desejado dependendo da sua solubilidade e do tamanho das suas partículas.

De acordo com esta equação, a taxa de libertação do enzima moderadamente solúvel a partir de um veiculo solúvel na água pode ser controlada variando A, a área da superfície da partícula exposta. Isto pode ser conseguido controlando o tamanho da partícula. Partículas maiores resultam numa área de superfície mais pequena e numa taxa de libertação mais lenta, enquanto que partículas pequenas possuem uma superfície exposta total aumentada e devem proporcionar uma taxa de libertação mais elevada.

enzima moderadamente solúvel não é tão insolúvel que se mantenha presente nos fluidos biológicos durante um período de tempo extremamente longo com uma actividade muito baixa. A forma de baixa solubilidade assegura uma libertação continua durante o desejado período de tempo. Esta libertação continua pode também ser promovida pela utilização de um veículo inerte. Os veículos pre. feridos são os que proporcionam uma libertação do enzima durante o período de tempo desejado. 0 período de tempo

durante o qual o enzima é libertado continuamente dura pelo menos de cerca de três dias a cerca de duas semanas. 0 período de tempo preferido durante o qual o enzima é libertado é de pelo menos cerca de quatro dias a cerca de dez dias.

sistema de administração apropria^ do para fornecimento do enzima moderadamente solúvel ao sitio (local) da potencial formação de aderências compreende um sistema com um recipiente para mistura possuindo os meios para misturar os conteúdos de dois recipientes. 0 sistema de administração compreende um primeiro recipiente flexível apropriado para armazenamento separado de um veiculo estéril para aumentar a fixação e um segundo recipiente flexível apropriado para o armazenamento do enzima moderadamente solúvel. 0 primeiro recipiente flexível tem um membro de abertura com um diafragma penetrável. 0 segundo recipiente flexível tem uma abertura reciproca a ser colocada em posição com a abertura do primeiro recipiente para a mistura da solução estéril com o enzima moderadamente solúvel. A flexibilidade de cada recipiente, ou pelo menos de um recipiente, permite a mistura dos conteúdos dos recipientes. 0 recipiente flexível servirá também para auxiliar a administrar o medicamento em forma de gel ao potencial sitio (local) de formação de aderências. 0 segundo recipiente tem um meio de vedação flexível que serve para encerrar e selar o segundo recipiente. 0 meio de vedação flexível tem uma abertura de acesso através da qual o medicamento em gel compreendendo uma quantidade terapeut i camente eficaz do enzima moderadamen. te solúvel e o diluente ou um veiculo inerte que aumente a fixação vai passar para o sitio (local) da potencial forma_ ção de aderências.

A administração da composição do enzima do presente invento pode ser feita antes da sutura cirúrgica. No caso de cirurgia abdominal a composição deste

invento que é constituída apenas pelo enzima moderadamente solúvel ou ainda por um veiculo inerte que aumenta a fixação será aplicada manualmente ou com massagem ou por meio de qualquer outro método apropriado, por exemplo, por meio de um 1aparoscopio, numa camada delgada sobre os orgãos abdominais antes de puxar o omento (epiplon) sobre os orgãos antes da sutura. E evidente para um cirurgião competente quais os orgãos sobre os quais se deverá aplicar a composição. Por exemplo no caso da cirurgia abdominal o intestina delgado, que pode ser o local de obstrução consequente à aderência formada, seria um sitio (local) possível (provável) para aplicação.

A quantidade da composição a ser aplicada será a atrás descrita, sujeita a critérios clínicos tais como a extensão da lesão, tipo de cirurgia, situação do doente, actividade trombolitica do enzima e ainda outros factores como será apreciado por um médico competente.

Exemplo 1

Materiais e Métodos

1) Modelo com Coelho

Verificou-se que o estímulo mais forte para a formação de aderências é constituído mais pela presença de tecido isquémico que resulta da sutura ou remerdos dos defeitos peritoneais do que pelos cortes em tiras (faixas) da superfície peritonea1.Coe 1hos brancos da Nova Zelândia (aprox. 3,0 kg) foram anestesiados com Fluanizona e Fentanyl, e foram realizadas laparotomias medianas (na linha média) usando técnicas operatórias assépticas.Foi removida uma área de novo cm da parede peritoneal que foi re-su_ turada no seu lugar nos cantos com suturas de seda, criando um entalhe isquémico de tecido peritoneal. Uma área proximal do cego (aprox. 75 cm ) foi raspada com gaze seca até ocorrer uma hemorrogia punctiforme. Um enzima insolúvel ou relativa-21-

mente insolúvel possuindo actividade trombolitica ou fibrinolitica foi administrada ao tecido isquémico quer sob a forma de uma película pelo método do invento directamente a orgãos seleccionados ou sob a forma de lavagem (0,5 mg de activador do p1 asminogénio dos tecidos/150 ml de solução salina isotónica), ou através de uma abertura de acesso vascular que fornece a solução da droga directamente ao tecido perítoneal re-suturado por meio de uma aplicação externa de uma formula, ção sobre a superfície (2,5 gramas de gel contendo 0,25 mg do activador do plasminogénio dos tecidos/grama da formulação). Depois de reposição do cego na cavidade abdominal, a camada muscular do abdómen foi suturada e fechada com proline 1,0 e a camada da pele com proline 2,0. Após sete dias, os coelhos foram sacrificados e foram realizadas laporotomias repetidas para determinar a extensão das aderências formadas. Os critérios estabelecidos para uma aderência positiva foi a adesão do cego ao entalhe isquémico de tecido na parede perítoneal. 0 sistema de registo que se segue foi usado para avaliar a gravidade das aderências:

Grau 0 = não se observou qualquer aderência

Grau 1 = mercs de 10% do entalhe isqisfiico coberto com aderência.

Grau 2 = 25% do entalhe isquémico coberto com aderência.

GRau 3 = 50% do entalhe isquémico coberto com aderência.

Grau 4 = 100% do entalhe isquémico coberto com aderência.

Grau 5 = superfície maior do que a do entalhe isquémico coberta com aderência.

-222) Carga em Pó de Activador do Plasminogénio dos Tecidos

Foi preparada uma carga em pó de activador do plasminogénio dos tecidos por separação por diálise do tampão a partir de uma solução de reserva. Assim, l.OOOml de uma solução contendo 2,5 mg/ml de activador do plasminogé nio dos tecidos, 87,1 mg/ml de L-arginina, 26,8 mg/ml de ácido fosfórico (85% p/v), e 0,1 mg/ml de polisorbato 80 foram divididos em porções de 100 ml e transferidos para tubagens com membranas para diálise tubagem de membrana Spectrapor 6.000-8.000 MW cutoff). Cada porção foi dialisada contra 1.000 ml de água purificada e estéril a 5oC.Após quatro mudanças do dialisado, o precipitado de proteína no interior da tubagem foi recolhido. A seguir a centrifugação (4.000 rpm durante 15 minutos a 5°C numa centrífuga refrigerada Beckman Accu-spin) e decantação do liquido flutuante, adicionou-se ao tubo água purificada e estéril.A proteína foi lavada por meio de um misturador (misturador Vértice), e separada de novo por centrifugação. Esta operação foi repetida mais três vezes. A carga de produto obtida era constituída por um pó amorfo, branco. Após a lavagem final, foi recolhido activador do plasminogénio dos tecidos que foi preparado sob a forma de um pó estéril com a configuração de uma unidade de dosagem.

3) Preparação do Pó da Unidade de Dosagem

a) Precipitação pela Agua

A carga de t-PA foi concentrada vinte vezes através de ultrafiItração de água e de fosfato de arginina. A carga concentrada foi filtrada em condições estéreis. 0 t-PA foi precipitado adicionando ãgua à carga concentrada. 0 fosfato de arginina e o restante t-PA solúvel foram removj_ dos da susparão precipitada por meio de lavagens sequenciais com água. A suspensão lavada foi introduzida sob a forma de

pasta em frascos. Os conteúdos dos frascos foram liofilizados para formar um pô de t-PA.

b) Precipitação pelo pH pH da carga de t-PA foi ajustado para pH 4 com ácido fosfórico. 0 fosfato de arginina na carga de t-PA foi permutado por solução de ácido clorídrico (pH 4) através de diafi1 tração. A carga de t-PA/ácído clorídrico foi então filtrada em condições estéreis. 0 t-PA foi precipitado ajustando a carga filtrada para pH 6 com solução diluida de hidróxido de sódio. 0 cloreto de sódio e o t-PA solúvel residual foram removidos da suspensão do precipitado por meio de lavagens sequenciais com água. A suspensão lavada foi introduzida sob a forma de pasta nos frascos. Os conteúdos dos frascos foram liofilizados para formar o pó de t-PA.

c) Liofilização pelo Bicarbonato de Amónio

A permuta da solução da carga de t-PA contendo fosfato de arginina 0,5 M com um pH de 7,2 e Tween 80 (0,19 mg/ml) com um tampão volátil tal como bicarbona to de amónio a uma concentração variando entre 0,2 e 0,8M, com uma concentração preferida variando entre 0,25 e 0,5 M com um pH variando entre 7,0 e 10,5, através de uma coluna G-25 foi realizada a uma temperatura variando entre 2°C e 28°C. 0 eluente do t-PA em bicarbonato de amónio e Tween 80 foi recolhido e concentrado por u1trafi1 tração a uma concentração de bicarbonato de amónio tendo como base a solubilidade do t-PA no tampão bicarbonato de amónio seleccionado e a temperatura do processo. A carga de t-PA/bicarbonato de amónio foi então filtrada em condições estéreis. A carga -filtrada foi introduzida em frascos. Os conteúdos dos frascos foram liofilizados para formar um pó de t-PA.

4) Preparação da Forma de Dosagem

Várias soluções aquosas seielhantes às utilizadas nesta técnica foram também preparadas e testadas, por exemplo, usando polissacáridos coloidais tais como dextrano ou gomas de celulose modificadas (Formulações 1 e 2 da Secção 4), colagénio modificado ou poloxameros (Formulações 3 e 4 da secção 4) e glicerol espessado pela adição de polímeros de polietileno glicol (Formulação 5 da secção 4). As formulações 1-4 situam-se em duas categorias: activador do plasminogénio dos tecidos solubilizado num gel aquoso (Formulações 1 e 3); e activador do plasminogénio dos tecidos suspenso sob a forma de partículas moderadamente solúveis num gel aquoso (Formulações 2 e 4).

Formulação 1:

Solução do Tampão-A

L-arginina	3,48 gm
H₃P0₄(85% p/p)	1,54 gm
Agua Purificada q.b.	100 gm

L-arginina foi dissolvida em 90 ml de água purificada.Adicionou-se lentamente ácido fosfórico (1,54 gm) para se obter uma solução com pH 6,0. 0 volume da solução foi levado até 100 ml com água purificada. Esta solução foi feita passar através de um filtro estéril com poros do filtro com um tamanho de 0,22 um (Millex-GV ou equivalente) e armazenada a 5°C.

Formulação Final-B

Dextran (MW 2 000 000)	0,1 - 0,5	gm
Activador do p1asminogénio
dos tecidos	0,00025	gm
Solução tampão A q.b.	1 ,00	gm

activador do p1asminogénio dos tecidos foi adicionado e dissolvido em tampão solução A. Adicionou-se então lentamente dextran com mistura vigorosa para dissolver o polírero até se obter uma solução homogénea.

Formulação 2:

Dextran (MW: 2,000,000)

0,1-0,3 gm

Partículas moderadamente solúveis do activador do plasminogénio dos tecidos

0,00025 gm

Agua purificada q.b.

1,00 gm dextran foi dissolvido em água com mistura vigorosa até se obter uma solução homogénea. 0 activador do p1asminogénio dos tecidos foi adicionado à solução; misturado e a proteína foi dispersa até à homogeneidade.

Formulação 3:

Solução do Tampão-A

L-arginina	3,48 gm
H₃P0₄(85% p/p)	1,54 gm
Agua purificada q.b.	100 gm

L-arginina foi dissolvida em 90 ml de água puríficada.Adi-26-

cionou-se ácido fosfórico lentamente para se obter uma solução de pH 6,0. A quantidade foi de aproximadamente 1,54 gm. 0 volume da solução foi levado até 100 ml com água purificada. Esta solução foi feita passar através de um filtro estéril com poros do filtro com um tamanho de 0,22 um (Millex-GV ou equivalente). Foi então armazenada a 5°C e usada na preparação da formulação final.

B- Formu1 ação Final:

Poloxamer 407	0,05-0,3	gm
Activador do plasminogénio
dos tecidos solúvel	0,00025	gm
So 1 ução tampão A q.b.	1 ,o	gm

A solução tampão A foi arrefecida até 5°C, e o activador do p1 asminogénio dos tecidos foi adicionado dissolvido. 0 poloxamer foi então adicionado e dissolvido com mistura vigorosa até se obter uma solução homogénia. A solução foi então feita passar através de um filtro estéril com poros do filtro com um tamanho de 0,22 um (Millex-GV ou equivalente).

Formulação 4:

Poloxamer 407

Partículas moderadamente solúveis do activador do plasminogénio dos tecidos

0,05-0,3 gm

0,00006 gm

Agua purificada q.b.

1,00 gm

A água foi arrefecida até 5°C, adicionou-se poloxamer 407 que foi dissolvido com mistura vigorosa até se obter uma solução homogénea. Adicionou-se o activador do plasminogénio .dos tecidos que foi disperso homogéneamente.

As formulações 5-9 são exemplos adicionais das novas composições deste invento, e podem ser classificadas em três categorias principais: activador do p1asminogénio dos tecidos suspenso sob a forma de partículas moderadamente solúveis num gel solúvel na água, anidro (Formulação 5); activador do p1asminogénio dos tecidos suspenso sob a forma de partículas moderadamente solúveis numa base h i drocarboneto de cadeia longa (Formulação 6); e activa. dor do p1 asminogénio dos tecidos suspenso sob a forma de partículas moderadamente solúveis num óleo semi-sintético susceptivel de erosão biológica ecera composta por misturas de glicéridos deácidos gordos não saturados e saturados ( Formu 1 ações 7, 8 e 9).

Formu1 ação 5:

Polietileno glicol MW 800-1.500 0,0-0,3 gm

Activador do plasminogénio dos tec idos 0,00025 gm g 1 i cero1 q.b. 1,00 gm glicerol foi aquecido até aproximadamente 35°C a 45°C.O polietileno glicol foi adicionado e misturado até se obter ume solução homogénea. 0 activador do plasminogénio dos tecidos foi adicionado e disperso homogéneamente. A formulação foi arrefecida e coagulada à temperatura ambiente com agitação cont i nua .

Formulação 6:

Activador do plasminogénio dos tecidos

0,00025 gm

Petrolatim branco q.b.

1,00 gm petrolatum foi fundido a aproximadamente 35°C a 45°C. 0 activador do plasminogénio dos tecidos foi adicionado e dis-28-

perso até à homogeneidade. A formulação foi arrefecida e coa^ guiada à temperatura ambiente com mistura continua.

Formulação 7:

Activador do p1asminogénio dos tecidos

0,00025 gm

Glicéridos oleicos polioxiet/ lenizados glicosilados (Labrafil M1944CS)

0,05-0,5 gm

Glicéridos lauropalmito esteáricos pol ioxietilenizados glicosilados (Labrifil M2130CS) q.b.

1,00 gm

Formulação 8:

Activador do p1asminogénio dos tec idos

0,00025 gm

Glicéridos oleicos polioxietile nizados glicosilados (Labrafil M1944CS)

0,05-0,5 gm

Glicéridos de ácidos gordos saturados, transesterifiçados

1,00 gm (Suppocire AIM) q.b.

Fo rmu 1 ação 9 :

Activador do p1asminogénio dos tecidos

0,00025 gm

Oleo vegetal neutro (tr i g 1 i cér i dos capr Π i co/cápr ico

Mi g 1 yo1 812)

Glicéridos de ácidos gordos saturados, transesterifiçados (Witepsol W32) q.b.

0,05-0,5 gm ,00 gm

As formulações 7, 8 e 9 foram preparadas como se segue; óleos foram aquecidos até aproximadamente 35°C a 45°C, os glicéridos de ácidos gordos sólidos foram adicionacts e fundidos, e o activador do plasminogénio dos tecidos foi adicionado e disperso homogéneamente na mistura. A formulação foi arrefecida e congelada à temperatura ambiente com mistura contínua.

As formulações 10 e 11 constituem exemplos adicionais das ncxas composições deste invento.

Formulação 10:

pó t-PA 0,0001 a 0,05 gm glicolato de amido de sódio (isto é Explotab) q.b. 1 gm

Mistura-se a seco pó de t-PA com o glicolato de amido. A mistura seca pode ser salpicada directamente sobre uma superfície biológica húmida para formar um gel i n s i tu.

Formu1 ação 11:

A-Pré-mistura de Gel

Hialuronato de sódio	0,01 a 0,05 gm
Glicerol anidro	0,006 a 0,25 gm
Tampão fosfato de sódio	0,01 M pH 6,0
Agua para injecção q.b.	1 gm

B-Ingrediente Activo:

pó t-PA	0,0001 a 0,05 gm
Glicerol e fosfato de sódio foram	dissolvidos em água e o pH

foi ajustado para 6,0. 0 hialuronato de sódio foi dissolvido.para a solução tampão até se obter um gel homogéneo

(pré-mistur a de gel).

gel foi carregado para um primeiro recipiente flexível tal como uma seringa estéril. 0 pó de t-PA foi carregado num segundo recipiente flexivel tal como foi atrás descrito. Imediatamente antes da utilização, o pó de t-PA foi preparado para mistura com pré-mistura em gel no primeiro recipiente flexivel adicionando um volume fixo de solução de mistura tal como a água para injecção, solução salina normal, ou dextrose a 5%. A solução de mistura foi adicionada ao pó de t-PA no segundo recpiente flexivel numa quantidade de 1 gm para 4 gm de gel sendo misturada cuidadosamente. 0 volume fixo da solução de mistura pode ser alterado tendo como base a quantidade de gel de t-PA a ser administrada. 0 segundo recipiente flexivel foi ligado ao primeiro recipiente flexivel contendo a pré-mistura em gel por meio de uma abertura estéril por exemp1 o(dispositivo de ligação fornecedor de fluico de Burron). 0 t-PA e a pré-mistura em gel foram misturados empurrando o gel para trés e para diante entre os dois recipientes até se obter a homogeneidade.

Efeito da	Exemplo 2 Composição Moderadamente Solúvel
sobre	asAcÊrências Peritoneais

Formação de Aderências

Os animais foram tratados tal como foi atrás descrito com activador do ρ1 asminogénio dos tecidos quer sob a forma de um enzima sólido quer sob uma forma soljj. vel. No caso do enzima solúvel, a cavidade peritoneal foi lavada uma vez antes do encerramento da incisão. A extensão das adesões formadas foi avaliada após catorze dias. Alterna-

tivamente, foram feitas repetidas administrações externas da solução ao sitio ( 1 oca 1)isquémico por meio de uma abertura de acesso vascular. A extensão da formação da adesão para a aplicação de abertura de acesso foi examinada após cinco dias. A solução salina foi utilizada como controlo em todos os casos. Os resultados são indicados no Quadro 1.

Quadro 1

Identificação do Coelho 1

Método de Tratamento

Lavagem com 150 ml de soluçãosalina 3

Lavagem com 150 ml de solução salina contendo

0,5 mg de act i vador do p1 asminogénio dos tecidos 2

Abertura de acesso vascular ml solução salina/ /2 x por d i a/5 d i as 5

3 4

Grau

0 3

2 4

Abertura de acesso vascular

0,5 mg de activador do p1asminogénio dos tecidos/ /2 x por dia/ 5 dias 0

Todos os animais não tratados desenvolveram aderências com valores de registo elevados demonstrando que a aderência pós-cirurgica pode ser produzida com reprodutibi1idade com este modelo. Os coelhos tratados com uma única lavagem revelaram uma média dos valores de registo das aderências inferior em relação aos animais de controlo. A melhoria foi contudo mais pronunciada quando o activador do p1 asminogénio dos tecidos foi aplicado directamente sobre a superfície isquémica duas vezes por dia durante um período

-32de 5 dias. De três animais, todos eles não apresentaram quaisquer sinais de aderências. Ambos os animais no grupo de controlo desenvolveram aderências do grau 4 e 5 respectiva_ mente.

activador do p 1 a sm i nogén i o dos tec_i dos foi incorporado nas novas formulações semi-sõlidas de acordo com este invento e foi aplicado tópicamente sobre a superfície da parede perítoneal excisada e re-suturada e sobre o segmento de cego raspado (lesado).A quantidade de activador do plasminogénio dos tecidos aplicada foi mantida constante a 0,25 mg de activador do p1asminogénio dos tecidos por gm de gel. Aproximadamente 2,5 gm da nova composição deste invento foram aplicados e massagados até se obter uma camada delgada sobre a superfície do sitio(local) de potencial formação de aderências.

Na maior parte dos casos estudados, os animais de controlo tratados com formulações placebos não contendo activador do p1 asminogénio dos tecidos, desenvolveram extensas aderências sobre a totalidade da superfície traumatizada. 0 activador do plasminogénio dos tecidos solubilizado e aplicado sob a forma de um gel aquoso (Formulações I e 3), revelaram pouco progresso na prevenção da formação de aderências em comparação com o grupo de controlo. Tal como no tratamento com lavagem, o activador do plasminogénio dos tecidos pode ser rápidamente inactivado in vivo, e a sua actividade não é suficientemente mantida de modo a evitar completamente a formação de aderências. A inibição da formação das aderências foi observada em todos os outros grupos tratados utilizando a composição deste invento. Apenas três dos 29 animais testados usando as novas composições descritas nas Formulações 5, 6, 7, 8 e 9 desenvolveram aderências.Um enzima re1ativamente insolúvel sob a forma sólida tal como _activador do plasminogénio dos tecidos suspenso num veiculo solúvel na água (Formulação 5) foi também eficaz na prevenção

da formação de aderências sugerindo que a solubilidade intrin_ seca limitada do activador do plasminogénio dos tecidos é também um factor que contribui para a estabilidade do agente in vívo e para a prolongada actividade fibrino 1itica requerida para efeitos terapêuticos.

Foram realizadas experiências adicio nais usando várias quantidàdes de activador do plasm inogénio dos tecidos. Vinte e quatro coelhos (3 kg) foram divididos em quatro grupos iguais. Após lesão cirúrgica 2,5 gramas de veiculo contendo uma dose total de 0, 0,16, 0,31 ou 0,63 mg de activador do p1asminogénio dos tecidos recombinantes foram aplicados aos tecidos traumatizados de cada rato. Os resultados da extenção das aderências formadas são resumidos na Figura 1. Embora não se tenha verificado qualquer efeito sobre a extensão da formação de aderências pelo activador do p1 asminogénio dos tecidos recombinante na nova composição deste invento com a dose mais baixa, verificou-se uma diminuição dramática na formação de aderências com ambas as doses de 0,31 e 0,63 mg.

A gravidade das aderências que se formaram foi ainda caracterizada pela determinação da intensidade da força mecânica requerida para separar os tecidos aderentes. Uma dissecção rude (grosseira) usando, por exemplo, tesouras fechadas para separar o tecido aderido ou no caso de aderência grave, mesmo corte, constituíram as forças mecânicas utilizadas.

Estes resultados são resumidos no Quadro 3. As aderências que se formaram nos animais tratados com 0,31 e 0,63 mg do activador do p1asminogénio dos tecidos requereram simples dissecção grosseira para a separação. As aderências que se formaram com a dose baixa ou sem qualquer activador do p1asminogénio dos tecidos recombinante requereram frequentemente uma dissecção grosseira mais prolongada para conseguir a separação.

Foram realizadas experiências utilizando várias quantichdes de activador do p 1 asminogénio dos tecidos recombinante em ácido hialurónico tal como foi descrito na Formulação 11. Vinte e quatro coelhos (3 kg) foram divididos em quatro grupos iguais. Após lesão cirúrgica aplicaram-se aos tecidos traumatizados de cada coelho 2,8 gramas de veiculo contendo uma dose total de 0, 0,168, 0,225 ou 0,70mg do activador do plasminogénio dos tecidos recombinante.Os resultados da extenção das aderências formadas são resumidos na Figura 3. A formação de aderência foi virtualmente eliminada em todos os coelhos do teste pelo activador do plasminogénio dos tecidos recombinante na nova composição deste invento.

Reformação da Aderência

Embora a formulação deste invento compreendendo um agente trombolitico ou fibrino 1itico tal como o activador do plasminogénio dos tecidos recombinante e um veiculo possa ser utilizada para evitar aderências, ela pode também ser usada para evitar a reformação de aderências a seguir à separação das aderências. A experiência que se segue teve como finalidade determinar se a composição de activador do plasminogénio dos tecidos recombinante influencia a reformação de aderências após a lise das aderências. Dez coelhos foram anestesiados sendo realizadas laparotomias medianas. Foi criado(a) um(a) peritoneal isquémico(a) no flanco direito seguindo-se lesão do cego tal como foi atrás descrito. Não se aplicou qualquer veiculo aos tecidos traumatizados antes do encerramento abdominal. Após sete dias rea1izaram-se novas laparotomias repetidas. Por meio de exploração, as estruturas aderidas foram separadas e todas as hemorrogias foram controladas por meio de electrocauterização.Nove dos dez coelhos apresentavam aderências com o Grau 3 ou acima desse valor. Tm coelho não apresentou aderências e foi removido do estudo. Em quatro coelhos as superfícies revestidas por fibrina se-35-

paradas foram cobertas com 2,5 gramas de veiculo contendo 0,63 mg de activador do p 1 a sm i nogén i o dos tecidos recomb i na nte. Os cinco coelhos de controlo receberam a mesma quantidade de veiculo não contendo activador do plasminogénio dos tecidos recombinante. Os coelhos foram fechados com suturas em duas ca, madas e foram abertos de novo após 7 dias. Os resultados do grau de eliminação das aderências existentes e a reformação de aderências pós-operatórias (Figura 2) indicam que um agente trombolitico ou fibrino 1itico, tal como o activador do plasminogénio dos tecidos recombinante, na nova composição deste invento e aplicado ao sitio(local) da formação da aderência anterior de modo a haver uma libertação continua do agente é tão eficaz na eliminação e na prevenção da reformação das aderências após lise cirúrgica como o é na prevenção da formação da aderência inicial.

Doses elevadas de activador do plasminogénio dos tecidos recombinante administrado como um agente trombolitico ou fibrinolitico revelaram causar diminuj, ções moderadas no fibrinogénio sistémico(Rao, A.K. et a 1., Clin. Res. 34, 337A/1986/) . Estabeleceu-se se a utilização do activador do plasminogénio dos tecidos recombinante em gel na prevenção da formação de aderências contribuía para a degradação do fibrinogénio sistémico ensaiando amostras de sangue de quatro coelhos usando o inibidor do activador do plasminogénio dos tecidos recombinante, D-Fe-Pro-Arg-c1orometilcetona (Mohler, M.A. et a 1., Thromb.Heam. 56:2Π986/ ) a 0,2, 3, 4 e 24 horas após a aplicação de 2,5 gramas de veiculo contendo 0,63 mg de activador do plasminogénio dos tecidos recombinante na cavidade peritonea 1.As amostras de plasma foram ensaiadas quanto ao activador do plasminogénio dos tecidos recombinante por meio de um ELISA especifico com uma sensibilidade de 15 ng de activador do plasminogénio dos tecidos recombinante por ml de plasma. Não se verificou qualquer evidência de activador do plasminogénio dos tecidos recombinante em qualquer altura(momento). Como o activador do plasminogénio dos tecidos recombinante é rápidamente elimina-36-

do pelo fígado, as mesmas amostras de plaBraa foramnedidas quanto a alterações no fibrinogénio por meio de um método dependente da trombina; não eram evidentes quaisquer diminuições no fibrinogénio em circulação indicando que o activador do p1asminogénio dos tecidos recombinante não era rápidamente adsorvido para a circulação a partir da cavidade peritoneal numa taxa que pudesse desencadear alterações no sistema de coagulação nos coelhos.

Buckman, R.F. et a 1 . , J . Surg.Res. 20:1(1976) sugeriram que uma depressão persistente da actividade do activador do plasminogénio resultante de um traumatismo com consequente lesão isquémica da superfície peritoneal, constitui um estimulo importante para a formação de aderências. Reciprocamente , uma manutenção do sistema fibrinolitico intrínseco pode conduzir à conversão da fibrina podendo não se desenvolver uma aderência permanente. Embora o decurso do tempo da actividade deprimida do activador do plasminogénio não seja conhecido na patogenese da formação da aderência fibrosa, uma única dose intraperitonea1 pés-operatória de um agente fibrinolitico solúvel tal como foi atrás discutido não é suficiente. Este invento estabeleceu pela primeira vez que uma forma moderadamente solúvel de um agente trombolitico tal como o activador do plasminogénio dos tecidos recombinante formulado aplicado directamente ao sitio(local) de potencial formação de aderências suplementa o sistema fibrinolitico endógeno deprimido para evitar a formação de aderências, muito provávelmente por meio de uma libertação contínua, lenta, prolongada, do enzima.

Não se observaram possíveis complicações derivadas da utilização intraperitoneal de activador do plasminogénio dos tecidos recombinante tais como fibrinogenólise sistémica e cicatrização da ferida. Nestes estudos anirais não se verificou hemorragia intraperitoneal.

Quadro 2

Identificação do Coelho

Método de Tratamento Grau

FORMULAÇÃO 1:

Controlo		4	3	0	4	4	3
TRatado		0	3	3	0	5	0
FORMULAÇÃO	2 :
Controlo		5	4	4	1	0	0
Tratado		0	0	0	0	0	4
FORMULAÇÃO	3 :
Controlo		4	4	4	4	4	4
Tratado		3	3	5	5	5
FORMULAÇÃO	4 :
Controlo		4	4	4	4	4	4
Tratado		0	1	0	3	0	0
FORMULAÇÃO	5:
Controlo		4	4	4	4	5	5
Tratado		0	0	0	0	0	3
FORMULAÇÃO	6:
Contro1 o		2	2	3	5	5	5
T ratado		0	0	0	0	0	1
FORMULAÇÃO	7:
Contro1 o		1	4	4	4	5	5
Tratado		0	0	0	0	0	3
FORMULAÇÃO	8 :
Controlo		0	4	4	4	5	5
Tratado		0	0	0	0	0	0
FORMULAÇÃO	9 :
Contro1 o		4	5	5	5	4	3
Tratado		0	0	0	0	0	0

Quadro 3

Nenhuma	Dissecção	Dissecção com	Dissecção com
aderência	grosseira	instrumento	instrumento
		afiado	afiado (com
			dificuldade

Apenas veiculo 0

Veículo +

0,16 mg de activador do plasminogénio dos tecidos recombinante 0

Veiculo +

0,31 mg de activador do plasminogénio dos tecidos recombinante 4

Veiculo +

0,63 mg de activador do plasminogénio dos tecidos recombinante 5

0 0

A gravidade das aderências que se formaram no estudo de resposta à dose (Fig. 1) foi registada no que se refere ao esfojr ço cirúrgico requerido para separar os tecidos aderentes.E indicado o número de animais com aderências que necessitaram _de 1 i se c i rurg i ca .

Exemplo 3

Efeito da Composição Moderadamente Solúvel sobre as Aderências Pélvicas

Coelhos brancos da Nova Zelândia fêmeas (aprox. 3,0 kg) foram anestesiadas com ketamine, Rompun e Accepromazine sendo realizadas laparotomias. A totalidade da superfície das trompas uterinas foi exposta e submetida a abrasivo até ocorrer hemorragia punctiforme seguindo-se lesão tissular grave das trompas com electrocauterização.0 activador do p1asminogénio dos tecidos na nova composição deste invento foi administrado às trompas uterinas traumatizadas sob a forma de uma formulação em gel (Amogel - ver Formulação 5 atrás descrita). Após reposição das trompas uterinas na cavidade pélvica, a camada muscular do abdómen foi fechada por meio de sutura e a camada da pele foi fechada com grampos cirurgicos.Após catorze dias, os coelhos foram anestesiados tal como foi atras descrito e repetiram-se laparotomias para determinar a extensão das aderências formadas. A extensão das aderências foi determinada pela quantificação da área da superfície das trompas uterinas que se apresentava aderente a si própria.

2,5 gr da nova composição sem gel apenas gel 0,125 mg/gr* 0,25 mg/gr* 0,5 mg/g** %de tecido aderente 53% + 32 35,6% + 20 31,67% + 22,1 25%+16,3 18,9%+ll,í * mg/gr-mg de activador do p 1 asminogénio dos tecidos/grama de gel ** p/0,05 tal como foi determinado pelo t-teste de Student em comparação com o grupo sem gel

Animais tendo aderências que foram submetidos a lise cirúrgica das aderências foram então agrupados de modo a que a % do tecido aderente fosse de aproximadamente 25%. Depois das suas aderências serem separadas, foram aplicadas novas composições

contendo activador do plasminogénio dos tecidos de um modo serelhante ao atrás descrito. Após catorze dias, os coelhos foram sacrificados e avaliou-se a percentagem do tecido aderente por meio de exame macroscópico das trompas uterinas.

2,5 gr da nova composição apenas gel 1 mg/gr* 5 mg/gr* 10 mg/gr* % de tecido re-aderente 61,86 37,36 20 7,5

Δ alteração a partir da extenção da aderência inicial até â reformação das aderências

40,63%+12,9 ll,ll%+22,5 0%+13,2 -12,5%+0 * mg/gr-mg de activador do plasminogénio dos tecidos/grama de ge 1

Exemplo 4

Efeito da Composição Moderadamente Solúvel sobre as Aderências Oftálmicas

Uma complicação da cirurgia das cataratas é a formação de aderências conduzindo a estrabismo cirúrgico. A prevenção da formação de aderências consequente à cirurgia oftálmica foi tentada usando ácido hialurónico.0 ácido hialurónico é um hidrato de carbono natural consistindo em ácido β-D-g1ucoronico e 2-acetamido-2-desoxi-p~D-glucose alternada. A utilização de ácido hialurónico ou de uma forma modificada quimicamente deste composto para a redução das aderências pós-cirurgicas na cirurgia do olho e nas operações de reconstrução dos tendões, foi referida.(Searl , S.S., Meta, H.S. anõ Lindahl, K.J., Ann. Ophthalmol. 19 ( 7 ) : 259 ,/1 9877 ; Wei ss , C . ,

Levy, H. Denlinger, J., Suros, J. and Weiss, H., Bull.Hosp. Jt. Dis. Orthop.Inst. 46:9-15/19867;Weiss ,C. Suros, J.,

-41Michalow, A., Den1inger,J.,Moore,M., Tejeiro,W. Buli, Hosp.

Jt.Dis.Orthop.Inst. 47:31-39/í987/). A eficácia destas substâncias na prevenção das aderências não foi demonstrada conclusivamente nestes estudos.

Contudo, devido à sua biocompatibilidade, as soluções de ácido hialurónico podem ser utilizadas para fornecer um enzima moderadamente solúvel, tal como t-PA. A formulação que se segue é um exemplo da nova composição deste invento compreendendo um enzima moderadamente solúvel, tal como o activador do plasminogénio dos tecidos suspenso num veiculo muci1aginoso, susceptivel de erosão biológica, tal como o ácido hialurónico.

Formulação

t-PA	0,1 a 1 ng
Acido hialurónico	3 a 50 mg
NaOH para ajustar o pH entre	4,5 a 8,0
WFI q.b.	1 m 1

ácido hialurónico é dissolvido em água estéril fazendo-se entretanto a titulação da solução até ao pH desejado(de preferencia 5,0 a 6,0) com NaOH, e adicionando pó de t-PA disperso homogéneamente.A composição é agitada até se formar um gel muci 1 aginoso.A formulação de t-PA mucilaginosa deste invento é aplicada imediatamente a seguir à cirurgia das cataratas ou à cirurgia do estrabismo ao sitio(local) de potencial deposição de fibrina ou formação de aderências.

Exemplo 5

Efeito da Composição Moderadamente Solúvel sobre a Deposição de Fibrina

A deposição de fibrina ocorre tipicamente no sitio(local) da infecção intraabdominal , proporcionando um compartimento insular para a proliferação bacteriana. Esta compartimenta1ização , embora isole a infecção, também isola a infecção dos mecanismos de defesa do hospedeiro . Observou-se um problema semelhante de peritonite bacteri^ na em doentes submetidos a diálise peritoneal ambulatória continua (CAPD).(Norris,K.D. et a 1.,Am.J.of Kidney Disease, /0(1):62-65 /1987/). Pensa-se que o sequestro das bactérias no interior dos coágulos de fibrina em CDPD serve de ninho para as bactérias, protegendo-as de serem mortas pelos antibióticos ou pelos leucócitos. Foi administrada heparina e estreptoquina se em solução a estes doentes submetidos a CAPD.

Foi desenvolvido um modelo de coágulo de fibrina na peritonite para inocular ratos intraperitonea/ mente com coágulos infectados. (Wells.C.L., et a 1., J.

Antimicrob.Chemoth.15(supp1:C ):199-206/1 985J).A nova compos/ ção deste invento é aplicada a seguir à cirurgia no ou próx_i_ mo do sitio(local) de potencial deposição de fibrina e formação de abcesso. E realizada uma laparotomia e a cavidade peritoneal é inspeccionada em relação à formação de abcesso.

Exemplo 6

Efeito da Composição Moderadamente Solúvel sobre as Aderências dos Tendões

Verificou-se que a formação de aderências após cirurgia de reparação do tendão flexor suprimia a reparação do tendão lesado. (Matthews, P. et a 1., J. of Bone and Joint Surgery 58B:230-236/19767). Observou-se que a lesão inicial de um tendão não constitui por si própria um estimulo para o desenvolvimento de aderências. Quando um tendão é cortado num dedo, as suas extremidades retraem-se e tornam-se suavemente arredondadas.para permanecerem livres no interior da bainha. Não se formam aderências e não se verifica reacção nos tecidos circundantes. E só quando as extremidades do tendão são apostas cirurgicamente que ocorre uma resposta adesiva.

São se 1 eccionados para o estudo coelhos brancos da Nova Zelândia completamente desenvo1vidos.A preparação inicial é a mesma em todas as experiências. Os coelhos são anestesiados com Nembutal intravenoso, e em seguida uma das patas dianteiras é rapada sendo-lhe aplicado um torniquete para sangrar. A pele é então preparada com 1 por cento de solução Hibitane em álcool sendo aplicado pensos estéreis.

A incisão na pele é feita, não no proprio dedo, mas na área palmar, sendo então os tendões flexores identificados no seu ponto de entrada na bainha e sendo a prega sinovial aberta. Flectindo completamente o dedo médio e puxando proximamente no profundus, uma extensão da parte intrasinovia 1 desse tendão pode ser puxado para a ferida.0 tendão é então traumatizado tão distalmente quanto possível cortando-o transversalmente com um bisturi. A incisão para justamente antes da secção completa, deixando intacto apenas

um número suficiente de fibras do tendão para manter a continuidade.A tracção é então aliviada e a zona traumatizada do tendão desliza para trãs para se situar no interior da bainha normal sobre o terço distai da falange proximal.O gel t-PA deste invento é aplicado 1ibera 1 mente(em quantidade) à zona traumatizada. A pele é fechada com suturas de catgut fino sendo pulverizado sobre a ferida um revestimento de colód io em aerosol.

Depois de se fechar a ferida, aplica-se uma tala de gesso-de-Paris fortemente apertada para envolver a totalidade do membro afectado e para imobilizar os dedos.0 gesso é retido durante um periodo de vinte e quatro dias e, em seguida, o membro é deixado livre.

Em todos os processos operatórios,foi utilizada uma técnica completamente asséptica. Os tendões são manipulados tão suavemente quanto possível e usa-se exclusivamente a dissecção com um instrumento afiado.

Os coelhos são sacrificados com intervalos de até doze semanas. 0 dedo operado é primeiro examinado cuidadosamente com o auxilio de um microscópio de dissecção e toma-se nota do estado de cicatrização do tendão, da reacção dos tecidos na vizinhança da lesão e da presença ou não de aderências.0 tendão é então removido com os tecidos moles circundantes e é fixado em solução salina de formol a 10 por cento.Após processamento e inclusão, são feitos cortes longitudinais em seria para exame microscómico. As secções (os cortes) são corados com hematoxi 1 ina-eosina , corante de prata de James e corante de ferro coloidal/PAS de Hale.

Claims

REIVINDICAÇOES l^â. - Método de tratamento de um animal para evitar a deposição de fibrina ou a formação ou reformação de adesões caracterizado por compreender a administração tópica de uma composição a um sítio de potencial deposição de fibrina ou formação de adesões em que a composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um enzima moderadamente solúvel que é libertado continuamente nesse sitio durante um período de tempo que varia entre cerca de três dias e duas semanas.
2³. -Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o enzima ser activador de plasminogénio de tecido.
3*. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a composição incluir um veic£ lo inerte que aumenta a aderência.
4³. - Método de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por a quantidade terapeuticamente eficaz de um enzima moderadamente solúvel variar entre cerca de 0,125 mg/g de veiculo inerte que aumenta a aderência e cerca de 2,5 mg/g de veiculo inerte que aumenta a aderência.
5³. - Método de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por a quantidade terapeuticamente eficaz de um enzima moderadamente solúvel variar entre cerca de 0,25 mg/g de veiculo inerte que aumenta a aderência e cerca de 1,0 mg/g de veiculo inerte que aumenta a aderência.

-466^?. - Método de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por o veiculo inerte que aumenta a aderência ser um gel solúvel na água.
7-. - Método de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por o veiculo inerte que aumenta a aderência ser um veiculo semi-sólido.
8-. - Método de acordo com a reivin dicação 7 caracterizado por o veiculo semi-sólido ser geleia de petrólato.
9³. - Método de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por o veiculo ser um polímero biocor ros í ve 1 .
10^?. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o veiculo ser ácido hialurónico.

dicação 1 cerca de 11 * caracterizado por três dias e cerca . - Método de acordo com a reivin- entre o período de de dez dias. tempo variar 12³ . - Método de acordo com a re i v i n- dicação 3 caracterizado por o período de tempo variar entre pelo menos cerca de três dias e cerca de dez dias. 13 - . - Método de acordo com a re i v i n- dicação 1 ca racter i zado por a deposição de f i br i na ser conse-

quente ao animal ter peritonite.
14³. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a formação de adesão ser consequente ao animal ter sido submetido a uma intervenção cirúrgica.

I5^â. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica para evitar a deposição de fibrina ou a formação de adesão que é aplicável tópicamente e capaz de fornecer um enzima num período variando entre cerca de três dias e duas semanas caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade terapeuticamente eficaz de um enzima moderadamente solúvel.
16^. - Processo de acordo com a reivindicação 15 caracterizado por se incluir na referida composição um veículo inerte que aumeta a aderência.
17^â. - Processo de acordo com a reivindicação 15 caracterizado por o enzima moderadamente solúvel ser activador de plasminogénio de tecido.
18-. - Processo de acordo com a reivindicação 16 caracterizado por o enzima moderadamente solúvel ser activador de plasminogénio de tecido.
19^?. - Processo de acordo com a reivindicação 16 caracterizado por o veiculo inerte que aumenta a aderência ser um veiculo semi-sólido.
20-. - Processo de acordo com a reivindicação 19 caracterizado por o veiculo semi-sólido ser geleia de petrolato.
21^â. - Processo de acordo com a reivindicação 16 caracterizado por o veiculo inerte que aumenta a aderência ser um polímero biocorrosíve1.
22^â. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o veiculo inerte que aumenta a aderência ser ácido hialurónico.
23-. - Dispositivo distribuidor para a administração de uma composição farmacêutica para evitar a deposição de fibrina ou a formação de adesão caracterizado por compreender:

a) um primeiro recipiente flexível contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um enzima moderadamente solúvel;e

b) um segundo recipiente flexível contendo um veículo que aumente a aderência.
24*. - Dispositivo distribuidor de acordo com a reivindicação 23 caracterizado por o enzima moderadamente solúvel no primeiro recipiente flexível conter activador de p1asminogénio de tecido.
25*. - Dispositivo distribuidor de acordo com a reivindicação 23 caracterizado por o veiculo que aumenta a aderência no segundo recipiente flexível ser ácido hialurónico.
26-. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o enzima moderadamente solúvel ser um sói ido.
27*. - Método de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por o activador de plasminogénio de tecido ser um sólido.
28*. - Processo de acordo com a reivindicação 15 caracterizado por o enzima moderadamente solúvel ser um sólido.
29*. - Processo de acordo com a

-49reivindicação 17 caracterizado por o activador de plasminogénio de tecido ser um sólido.