FI103868B - Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi fibriinin saostumisen tai kiinnikasvettumien estämiseksi - Google Patents

Description

103868

MENETELMÄ FARMASEUTTISEN KOOSTUMUKSEN VALMISTAMISEKSI FIB-RIININ SAOSTUMISEN TAI KIINNIKASVETTUMIEN ESTÄMISEKSI

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää paikallisesti käytettävän, fibriinin saostumisen tai kiinnikkeen muodostumisen estävän farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi.

Leikkauksenjälkeiset vatsaontelonsisäiset kiinnikasvettumat eli elinten ja kudosten pintojen patologinen kiinnittyminen toisiinsa on vatsaleikkauksia seuraavien sisäelintukkeumien pääasiallinen syy (H. Ellis, Surg. Gynec. Obstec., 133 (1971)). Kiinnikasvettuma koostuu tyypillisesti järjestyneestä fibriinisestä tulehdusnesteestä, joka on kohdistunut herakalvon pintaan, joka liittää tai kiinnittää kudosten « \ tai elinten vastakkaiset pinnat toisiinsa. Se on myös tär keä hedelmättömyyttä aiheuttava tekijä sen jälkeen, kun on tehty ennalleen palauttava munajohdinleikkaus (Buttram, V.C., Fert. and Ster. £0:5 (1983)). Julkaistujen tietojen mukaan 50 - 90 %:lle kaikista vatsaleikkauksen läpikäyneistä henkilöistä kehittyy kiinnikasvettumia (Colleti, L. ja Bassart, B., Arch Surg. Fert. £8:774 (1964)). Kiinnikasvet-tumien muodostumista on havaittu myös vatsaontelonsisäisen tulehduksen seurauksena (Hau, T. et. ai., Surg. Gyn. & Ob. 148:415-418 (1979)). Kiinnikasvettumien muodostumista on havaittu myös jänneleikkauksen jälkeen (Weiss, C. et ai., Bull. Hosp. Joint Diseases £7(1), 31 (1987//.

Jo vatsaleikkausten varhaisaikoina tulivat kirurgit tie- 2 103868 toisiksi fibriinisistä kiinnikasvettumista, jotka kiinnittivät ohutsuolen mutkia ja muita vatsan sisälmyk siä toisiinsa muutaman tunnin kuluttua leikkauksesta, tulehduksesta tai tapaturmasta. Fibriininen tulehdus-neste voi joko imeytyä takaisin välittömästi ja näin jättää jälkeensä puhtaan vatsaontelon tai järjestyä niin, että sen sisään kasvaa kapillaareja ja fibroblasteja ja muodostuu fibriininen kiinnikasvettuma. Tärkeä kysymys, joka vielä tänä päivänä on vailla vastausta, on, mikä tekijä määrää, absorboituuko fibriininen tulehdus-neste vai järjestyykö se. On kehitetty teoria, jonka mukaan kiinnikasvettumienmuodostus on seurausta vatsaontelon endoteelin tuhoutumisesta. Tämä teoria on kumottu useissa tutkimuksissa (Ks. esim. Ellis, H., Brit. J.

Surg., 50:10 (1962)).

On osoitettu, että vatsakalvon vammojen tai vikojen normaali paraneminen alkaa fibriinimatriisin muodostuksella, jota seuraa tuon matriisin fagosytoosi makrofagien, monosyyttien, lymfosyyttien ja polymorfien toimesta. Fibrobalsteja ja kollageenikimppuja on havaittavissa ennenkuin vatsakalvo saa normaalin ulkonäkönsä. Normaali paranemisprosessi kestää noin kolme (3) vuorokautta. (Buckman, R.F. et ai., J. Surg. Res. 2_1, 67 (1976)). Se/ absorboituuko fibriinimatriisi takaisin, näyttää liittyvän siihen, onko kudos iskeeminen (Rubin, I.C., Surg. Obstet., 12:117 (1911)). Ellis, H. et ai., Brit. J.

Surg. 52^:471 (1965), kehittivät iskeemisen peritoneaalisen mallin ja osoittivat, että 83 % iskeemisistä vammoista johti kiinnikasvettumien muodostumiseen, kun taas vain i noin 9 % ei-iskeemisistä malleista tuotti kiinnikasvettumia.

Elektronimikroskopiaa käyttämällä on fibroblastisen hyökkäyksen osoitettu johtuvan makrofageista, jotka soluttautuvat alueelle ja kehittyvät fibroblasteiksi, jättisoluiksi ja epiteelisoluja muistuttaviksi soluiksi (Eskeland, G., Acta Path. Microbiol. Scand., 62:459 3 103868 (1964)). Eilisin mukainen kiinnikasvettumienmuodostus toimii verisuonisiirteenä. Käyttämällä samanlaista mallia kuin Ellis osoittivat Buckman et ai., supra, että vatsakalvon vioilla on korkea plasminogeeniaktii-visuus, joka menetetään, kun vatsakalvo tulee iskeemi-seksi.

Fibriinin saostuminen, joka seuraa bakteerien pääsyä vatsaonteloon, on suojamekanismi, joka estää verenmyrkytystä (Ahrenholz, D.H. ja Simmons, R.L., Surgery £8:41-47(1980), Zinser, H.H. ja Pryde, A.W. , Ann. Surg.

136:818 (1982)). Bakteerit ovat kurissa, mutta fibriinin saostuminen johtaa usein märkäpesäkkeiden muodostumiseen (Ahrenholz ja Simmons, supra). Fibriinin saostumista esiintyy vatsakalvontulehduksen varhaisissa vaiheissa, kun vatsaontelon fibrinogeenipitoinen tulehdusneste muuttuu fibriiniksi (Hau, supra). Leikkauksenjälkeiset vatsaontelonsisäiset märkäpesäkkeet ovat potentiaalinen infektioiden ja lopuksi jopa kuoleman aiheuttaja. Vatsakalvontulehdus ja siihen liittyvät komplikaatiot johtavat usein kuolemaan. Vanhuksilla kuolleisuus on 60 - 80 % (Hau, T., et ai., Curr. Prob. Surg. 16: 1-65 (1979)).

: Plasminogeenin aktivaattorit, joita on läsnä mesoteelis- sa ja submesoteelin verisoluissa vatsakalvossa, saavat aikaan vatsaontelonsisäisten fibriinisaostumien lyysin ja poistumisen (Porter, J.M. et ai., L. Surg. Forum 2^:80(1969); Buckman, R.F. et ai., J. Surg. Res. 20:1 (1976)). Herakalvon tai vatsakalvon vaurioituminen ' esim. tulehduksessa tai tapaturmassa johtaa solukomponent- teja ja fibriiniä sisältävän tulehdusnesteen tihkumiseen vaurioituneen alueen pienten suonten läpi (Aurora, A.L. et ai., Indian J. Med. Res. £2:(1972)) sekä paikallista fibrinolyyttisen aktiivisuuden alenemista (Buckman, R.F. supra). On osoitettu, että paikallisen fibrinolyyt- « 103868 tisen aktiivisuuden aletessa 50 % tai enemmän ei fibriini poistu ja muodostuu pysyviä kiinnikasvettumia (Gervin, A. S. et ai., Am. J. Surg. 125 (1973)).

Lukuisia julkaisuja on ilmestynyt yrityksistä estää kiinnikasvettumien muodostumista. Useita ennaltaehkäiseviä menetelmiä on kokeiltu fibriinin saostumisen ja kiinnikasvettumien estämiseen. Fibriinin saostuminen vatsakalvon tulehdusnesteessä on koetettu estää käyttämällä natriumsitraattia, hepariinia tai muita antikogulant-teja. Jo muodostumaan ehtineen fibriinin poistoon on käytetty erilaisia entsyymejä, joista mainittakoon esimerkiksi trypsiini, pepsiini, papaiini, hyaluronidaasi, streptokinaasi ja streptodornaasi. Muita lähestymistapoja fibriinin poistamiseen ovat olleet suolojen, kuten natriumrisinoleaatin, käyttö tai fibriinin poistaminen mekaanisesti.

Hepariini ja dikumaroli olivat ensimmäisiä aineita, joita käytettiin fibriinin saostumisen estämiseen (Lehman, E.P. ja Boys, F., Ann. Sur., 112:969 (1949)); White.

B. H., Ann. Surg., 130:942 (1949)). Hepariinia saaneilla potilailla ilmoitettiin kuolemantapauksia ja leikkauksen-jälkeistä verenvuotoa. Myöhemmin on dekstraanin veritulp-pia estävä vaikutus johtanut sen käyttöön kiinnikasvettumien estämisessä (Choate, W.H. et ai., Arch. Surg., 88:249 (1964)). Vatsaontelonsisäisen dekstraanin havaittiin vähentävän kiinnikasvettumien voimakkuutta, mutta ei estävän niiden muodostumista (Kapur, B.M.L.

et ai., Indian J. Med. Res., 56^1406 (1968)). Oksifenbut- I. atsonin, joka on anti-inflammatorinen aine, oraalista antoa on myös käytetty kiinnikasvettumien muodostumisen estämiseen (Kapur, B.M.L., et ai., Arch. Surg., 98:310 (1969)).

On ehdotettu huuhtelua suolaliuoksella, dekstroosiliuok- • · 5 103868 sella tai erityisesti hypertonisella dekstroosiliuoksella, mutta tällaisten liuosten nopea absorptio en tehnyt niistä tehottomia (Buchbinder, J.R., Surg. Gynec. Obstet., 45:769 (1927); Totten, H.P., Surgery, 8:456 (1940)). Ruuansulatusentsyymeillä, kuten pepsiinillä ja trypsiinil-lä, ajateltiin olevan käyttöä fibriinin tuhoamisessa. Kuitenkin on niin, että vatsakalvon tulehdusnesteet neutraloivat nopeasti nämä molemmat aineet ja näin ollen ne ovat tehottomia (Kubota, T., Japan M. World, 1Λ:226 (1922)). On kokeiltu myös papaiinia, joka on proteolyyttinen entsyymi, mutta vatsakalvon tulehdusneste neutraloi sen. Papaiinia on myös annettu suun kautta ja sen on havaittu pienentävän kiinnikasvettumien voimakkuutta, mutta ei niiden esiintymistä (Kapur, B.M.L. et ai., Arch. Surg., 9J3:3Q1 (1969)). Papaiinin vatsaonte-lonsisäisellä antamisella rotille ei ole mitään vaikutusta kiinnikasvettumien muodostumiseen (Stevens, L.E., Amer.

J. Surg., 115:535 (1968)).

Kiinnikasvettumien estämiseen on kokeiltu lukuisia fibrinolyyttisiä aineita. Fibrinolyyttisellä järjestelmällä tarkoitetaan tyypillisesti sitä systeemiä veressä, joka liittyy plasminogeenin muuttamiseen plasmiiniksi. Luontainen plasminogeenin aktivaattori vaikuttaa plasmi-; nogeeniin muuttaen tämän prekursorin plasmiiniksi, joka sitten liuottaa verkkoutuneen fibriinin. Ulkoiset aktivaattorit, kuten streptokinaasi ja urokinaasi, aktivoivat myös plasminogeenin muuttumisen plasmiiniksi. Tukoksia liuottavia aineita ovat mm. plasmiini ja plasminogeenin aktivaattorit, kuten streptokinaasi, streptodornaasi ja urokinaasi. Näitä tukoksia liuottavia ja fibrinolyyt-tisiä aineita sekä muita aineita on käytetty fibriinin saostumisen estämiseen ja kiinnikasvettumien poistamiseen. Ensimmäiset työtulokset osoittivat, että streptokinaasi esti tapaturmaisesti aiheutuneita kiinnikasvettumia kaneilla, mutta ei koirilla (Wright, L.T., et ai., 6 103868

Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 75:602 (1950)). Eräässä tutkimuksessa havaittiin, että vatsaontelonsisäinen hoito kolmena peräkkäisenä vuorokautena oli tehokkaampi kuin yksi injektio (Knightly, J.J., et ai.. Surgery 52^250(1962)). Muut tutkimukset antoivat huonompia tuloksia. Koesarjassa, jossa annettiin erilaisia fibrino-lyyttisiä entsyymejä laskimonsisäisesti ja vatsaontelon-sisäisesti koirille, kaneille ja rotille ja käytettiin erilaisia menetelmiä kiinnikasvettumien aikaansaamiseen, ei voitu havaita mitään merkitsevää ennaltaehkäisevää eikä terapeuttista vaikutusta (Jewett, T.C. et ai.,

Surgery 52:280 (1965)). Kun rotille annettiin erittäin puhtaita streptokinaasivalmisteita kerta-annoksena tai useina kertainjektioina kolmena peräkkäisenä päivänä, ei tämä estänyt kiinnikasvettumien muodostumista (James, D.C.O., et ai., J. Path. Bact. 90:279 (1965)). Jatkotutkimukset, joissa annettiin rotille puhdistettua streptokinaasia, viittasivat siihen, että kiinnikasvet-tumat seinävaurioihin voitiin estää antamalla streptoki-naasiliuosta useana injektiona vatsaontelonsisäisesti kahtena tai kolmena peräkkäisenä päivänä (Id.). Tukosten-liuotusterapiaa on käytetty fibriinin saostumisen estämiseen sydämen sisäkalvontulehduksessa kanimallissa ((Duraug, D.T., J. Path. 129:537 (1975)). Fibrinolyytti-siä aineita on käytetty vähentämään haavojen infektioita, joita syntyy infektoituneista plasmahyytymistä marsun ihon viiloissa (Rodeheauer, G. et ai., Am. J. Surg. 129:537-544 (1975)).

Myös muita yhdisteitä, joilla on havaittu olevan fibrino-lyyttinen vaikutus, on käytetty kiinnikasvettumien estämiseen. Protoporfyriinin, jolla on fibrinolyyttistä vaikutusta, havaittiin vähentävän kiinnikasvettumapro-senttia, kun kiinnikasvettumat kehittyvät rotille vatsanavauksen yhteydessä (Iijima, N. et ai., Postgrad. Med. J. 46:278 (1979)). Hyaluronidaasi, joka on entsyymi, * t 1 103868 joka hydrolysoi hyaluronihappoa, joka on yksi solujen välisen perusaineen polysakkarideista, on estänyt kiinnikasvet-tumien muodostumista koirissa, kun anto on tapahtunut vat-saontelonsisäisesti samaan aikaan, kun talkkia käytettiin indusoimaan kiinnikasvettumien muodostusta (Conolly, J.E. ja Rochards, V. , Surg. Forum, 2:85 (1951)). Muut rotilla suoritetut tutkimukset, jotka seurasivat umpisuolen puhkeamista, eivät osoittaneet mitään kiinnikasvettumien vähenemistä, kun ensin annettiin hyaluronidaasia vatsaontelon-sisäisesti (Thomas, J. et ai., Roc. Soc. Exp. Biol. Med. 7j4 : 497 (1959) ) .

Deksametasonia, metyyliprednisolonia, natriumsukkinaattia, prometatsiinihydrokloridia ja ihmisen fibrinolysiiniä annettiin yksin tai yhdistelminä intramuskulaarisesti tai in-traperitoneaalisesti rotille kiinnikkeen muodostuksen estämiseksi (Gazziniga, A.G. et ai., Arch. Surg. 110:429 (1975)). Mikään näistä aineista ei yksin poistanut kiinni-. kasvettumien muodostumista. Metyyliprednisoloni, prometat- * siini ja ihmisen fibrinolysiini annettuina yhdessä vatsaon- telonsisäisesti yhtenä annoksena näyttivät poistavan kiinnikasvettumien muodostumisen. Id.

Edellä mainittujen lisäksi on muita aineita sijoitettu vat-. saonteloon estämään kiinnikasvettumien muodostumista, jois ta aineista mainittakoon mm. jauhettu härän vatsakalvo, oliiviöljy, epinefriiniliuos, aminoneste ja natriumri-sinoleaatti. Minkään näistä aineista ei ole havaittu estävän kiinnikasvettumien muodostumista tai uudelleenmuodostu-mista.

Tämän keksinnön tarkoituksena on poistaa edellä esitetyt epäkohdat. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaiset piirteet esitetty patenttivaatimuksissa. Olennaista keksinnölle on, että siihen lisätään terapeuttisesti tehokas määrä kudosplasminogeeniaktivaattoria ("t-PA") joka saatetaan niukkaliukoiseen muotoon jonka jälkeen koostumus 8 103868 saostetaan kiinteäksi ja johon lisätään inerttiä kiinni-tarttumista edesauttavaa apuainetta koostumuksen liu-kenemisominaisuuksien säätämiseksi halutulla nopeudella biologisessa nesteessä siten, että t-PA:n pitoisuus on noin 0,02 - 25 mg/g inerttiä kiinnitarttumista edesauttavaa apuainetta ja että kiinnitarttumista edesauttava apuaine on edullisesti geeli, vaseliini, polymeeri ja/tai hyaluroni-happo.

Esillä olevalla menetelmällä aikaansaadaan koostumus, jonka avulla estetään fibriinin saostuminen tai kiinni kasvettumi-en muodostuminen, käytettäväksi erilaisissa kirurgisissa ja kliinisissä yhteyksissä, joista mainittakoon, keksintöä mitenkään rajoittamatta, vatsa- ja munuaisallasleikkaus, jän-neleikkaus, nikamakaaren poisto, vatsainfektio, tulehdus tai tapaturma. Koostumusta on helppo ja kätevä käyttää kohtaan, johon saattaa saostua fibriiniä tai muodostua kiinni-kasvettuma siten, että koostumusta levitetään paikallisesti ;· elimiin ja/tai niitä ympäröiviin kudoksiin, joihin fib riiniä saattaa saostua tai kiinnikasvettuma muodostua. Esillä olevassa menetelmässä käytetään entsyymejä fibriinin saostumisen tai kiinnikasvettumien estämiseen niin, että entsyymit ovat sellaisessa muodossa, etteivät biologisten nesteiden sisältämät aineet inaktivoi niitä. Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään entsyymejä formulaationa, joka mahdollistaa jatkuvan vapautumisen ilman, että tarvitaan ulkoisia runkoaineita tai laitteita.

Edellä esitetty toteutetaan antamalla paikallisesti entsyymiä, joka on niukkaliukoista, jolloin entsyymiä levittyy : jatkuvasti kohtaan, jossa fibriiniä saattaa saostua tai kiinnikasvettumia muodostua. Niukkaliukoinen entsyymi, joka kykenee aikaansaamaan fibrinolyysin tai tukoksen liukenemisen, on käyttökelpoinen kiinnikasvettumisen hoidossa erityisesti leikkauksen, infektion, tapaturman tai tulehduksen jälkeen, kun anto tapahtuu paikallisesti kohtaan, jossa fibriinin saostuminen tai kiinnikasvettuman muodostuminen 9 103868 on mahdollista, jos huolehditaan siitä, että entsyymiä on jatkuvasti saatavissa kyseisessä kohdassa ainakin noin kolmen vuorokauden ajan. Niukkaliukoinen entsyymi on edullista antaa suspendoituina kiinteinä hiukkasina inertissä kiinnittymistä edesauttavassa apuaineessa, joka mahdollistaa entsyymin annon pitkän ajan kuluessa. Ennen tätä keksintöä ei ollut tiedossa, että yhdellä niukkaliukoisen kiinteän entsyymin paikallisella antamisella kyseiseen kohtaan saataisiin aikaan tuon entsyymin jatkuva saanti estämään fib-riinin saostumista tai kiinnikasvettuman muodostumista. Tässä käytetty entsyymi on mielellään saostettu plasmino-geenin kudosaktivaattori. Näin ollen keksinnöllä aikaansaadaan farmaseuttista seosta, joka sisältää niukkaliukoista entsyymiä, kuten plasminogeenin kudosaktivaattoria, estämään kiinnikasvettumien muodostumista eri yhteyksissä, kuten leikkauksen tai infektion jälkeen.

Kuva 1: Geeniteknologisesti tuotetun plasminogeenin ku- .. dosaktivaattorin annosten vaikutus kiinnikasvettumien muo dostuksen estämisessä kaneilla. Eri määrät geeniteknologisesti valmistettua plasminogeenin kudosaktivaattoria 2,5 grammassa puolikiinteätä kantaja-ainetta levitettiin vatsa-kalvokudoksen vaurioituneisiin alueisiin. Viikon kuluttua eläimet surmattiin ja kiinnikasvettumat arvioitiin. Kiinni-kasvettumia kehittäneiden kanien lukumäärä, kun oli annettu 0,125 tai 0,25 mg geeniteknologisesti valmistettua plamino-geenin kudosaktivaattoria grammassa geeliä, oli merkitsevästi (p<0,01) poikkeava verrokkiryhmästä ja ryhmästä, jolle oli annettu 0,062 mg geeniteknologisesti valmistettua plasminogeenin kudosaktivaattoria grammassa geeliä, kun : määritykset suoritettiin Mann-Whitney-ei-parametrisellä testillä.

Kuva 2: Geeniteknologisesti valmistetun plasminogeenin ku-dosaktivaattorin vaikutus kiinnikasvettumien uudelleenmuo-dostumiseen kirurgisen lyysin jälkeen. Muodostuneiden kiinnikasvettumien määrä kaneilla, joille ei oltu 10 103868 annettu hoitoa, on esitetty vuorokautena 7. Kun muodostuneet kiinnikasvettuamt oli lysoitu kirurgisesti, eläimet jaettiin kahteen ryhmään: verrokkieläimiin, jotka saivat ainoastaan kantaja-ainetta, ja käsiteltyihin eläimiin, jotka saivat 0,25 mg geeniteknologisesti valmistettua plasminogeenin kudosaktivaattoria grammassa geeliä. 14. vuorokautena niillä eläimillä, jotka olivat saaneet geeniteknologisesti valmistettua plasminogeenin kudosaktivaattoria, oli havaittavissa dramaattinen lasku uudelleenmuodostuneiden kiinnikasvettumien esiintymisessä.

Kuva 3: Geeniteknologisesti tuotetun plasminogeenin kudosaktivaattorin annosten vaikutus kiinnikasvettumien muodostukseen kaneilla. Eri määrät geeniteknologisesti valmistettua plasminogeenin kudosaktivaattoria 2,5 grammassa geeliä, joka sisälsi 2,8 % natriumhyaluronaat-tia, levitettiin vatsakalvon kudoksen vaurioituneisiin alueisiin. Viikon kuluttua eläimet surmattiin ja kiinni-kasvettuneisuus arvioitiin.

Tässä yhteydessä tarkoitetaan "niukkaliukoisella entsyymillä" molekyylimuodossa olevaa entsyymiä, joka liukenee ;; halutulla nopeudella biologiseen nesteeseen ja kykenee estämään fibriinin saostumisen tai kiinnikasvettumien muodostuksen, kun sitä levitetään kerran paikallisesti kohtaan, jossa fibriinin saostuminen tai kiinnikasvettumien muodostuminen on mahdollista. Entsyymi levitetään kohtaan, jossa fibriinin saostuminen tai kiinnikasvettumien · muodostuminen on mahdollista, kiinteänä aineena, esimer kiksi jauheena, lietteenä tai suspensiona. "Niukkaliukoi-nen" tarkoittaa entsyymin suhteellisen huonoa liukoisuutta biologisiin nesteisiin, esimerkiksi plasmaan, kudosnes-teisiin tai vatsaontelon nesteisiin. Liukenemisnopeus valitaan niin, että entsyymi liukenee biologiseen nestee- 11 103868 seen aikavälinä, joka riittää estämään fibriinin saostumi-sen tai kiinnikasvettuman muodostumisen tai uudelleenmuo-dostumisen kyseiseen kohtaan aikavälin ollessa tyypillisesti 3-14 vuorokautta. Niukkaliukoisen entsyymin liukeneminen mahdollisessa fibriinin saostumisen tai kiinnikasvettuman muodostumisen kohdassa tietyn ajan kuluessa johtuu suhteellisen pienestä liukoisuudesta.

Tämä pitkitetty liukeneminen aikavälin kuluessa tekee mahdolliseksi sen, että yksi paikallinen levitys tuottaa aktiivisen entsyymin jatkuvan vapautumisen halutun ajan kuluessa. Niukkaliukoinen entsyymi on mielellään kiinteätä levitysajankohtana. Tässä käytettäviksi sopivia entsyymejä ovat ovat mm. trombolyyttiset ja fibrinolyyt-tiset entsyymit, kuten plasmiini, streptokinaasi, uroki-naasi, plasminogeenin kudosaktivaattori ja streptodornaa-si. Fibrinolyyttisiä entsyymejä ovat mm. sellaiset, jotka muuttavat plasminogeenin plasmiiniksi, kuten streptokinaasi, urokinaasi ja plasminogeenin aktivaattori, tai sellaiset, jotka hajottavat fibriiniä suoraan. Trombolyyt-tisiä aineita ovat mm. fibrinolyyttiset entsyymit sekä eräät muut proteolyyttiset entsyymit. Tällainen proteo-lyyttinen entsyymi on brinaasi. Etusijalle asetettava niukkaliukoinen entsyymi on "plasminogeenin kudosaktivaattori", jolla tässä tarkoitetaan entsyymiä, joka voidaan uuttaa ja puhdistaa luonnonlähteistä (ks. USA:n patenttijulkaisu no. 4 752 603) tai valmistaa geeniteknologisesti (ks. eurooppalainen patenttihakemusjulkaisu no. 093 619). Esillä olevan keksinnön mukaiset etnsyymit voidaan saada nisäkäs-, bakteeri- tai hiivalähteistä. Etusijalle asetetaan se, että käytetään käsiteltävän lajin kanssa homologista entsyymiä. Esimerkiksi koiraeläimen entsyymiä tulisi käyttää kiinnikasvettumien muodostumisen estämiseen koirilla. Kiinteän entsyymin kattamaan alaan kuuluvat myös muunnokset, joissa on aminohappoja korvattu toisilla ja/tai deleetioita ja/tai additioita, plasminogeenin kudosaktivaattorin orgaaniset ja epäorgaaniset suolat • · 12 103868 ja kovalenttisesti muunnetut johdannaiset.

Termi "kiinteä" kuvaa entsyymin edullista tilaa silloin, kun se levitetään mahdolliseen kiinnikasvettuman muodostu-miskohtaan. Entsyymi on oleellisesti ottaen homogeenisessä muodossa, kun läsnä ei ole ainetta, joka kovalenttisesti tai ei-kovalenttisesti sitoutuu entsyymiin, jotta entsyymi vapautuu ajanjakson kuluessa. Kiinteä entsyymi on plasmino-geenin kudosaktivaattorin ollessa kyseessä valkoinen amorfinen jauhe. Entsyymi saadaan kiinteässä muodossa käyttämällä erilaisia alan tavallisen ammatti-ihmisen tuntemia menetelmiä, kuten dialyysiä, saostusta tai lyofilisaatiota. Entsyymi voidaan saada saostumaan esimerkiksi muuttamalla pH:ta, apuliuottimen koostumusta, lämpötilaa tai suolan avulla. Entsyymi voidaan lyofilisoida esimerkiksi vedettömällä lyofilisoinnilla käyttämällä tertiääristä butanolia, vesilyofilisoinnilla käyttämällä esimerkiksi vesisublimoin-tia tai haihtuvaa puskuria, kuten ammoniumasetaattia tai : ammoniumbikarbonaattia ja vettä, ja myös vesi/vedettömällä lyofilisoinnilla. Vesilyofilisointi asetetaan etusijalle käyttämällä ammoniumbikarbonaattia ja vettä.

Keksinnön mukaisesti valmistettu koostumus sisältää terapeuttisesti tehokkaan määrän niukkaliukoista entsyymiä esimerkiksi jauhemaisessa muodossa. Koostumus voi lisäksi sisältää inerttiä, tarttumista edesauttavaa apuainetta. Mainittu koostumus levitetään suoraan paikkaan, jossa fib-riiniä mahdollisesti saostuu tai kiinnikasvettuma muodostuu, jotta entsyymiä vapautuu kyseiseen kohtaan ajanjakson kuluessa. Kun entsyymi suspensoidaan inerttiin, myrkkyvai-: kutuksettomaan, tarttumista edesauttavaan apuaineeseen, vä henee endogeenisten proteaasien aiheuttaman hajoamisen mahdollisuus. Inertin kantaja-aineen takertumisvaikutus mahdollistaa kiinteän entsyymin retention levityskohdassa. Tämä 13 103868 mahdollistaa entsyymin paikallisen jatkuvan vapautumisen levityskohdassa ajanjakson aikana. "Jatkuva" tarkoittaa keskeytymätöntä, katkeamatonta entsyymin vapautumista levityskohdassa halutun ajanjakson ajan. Näin ollen uusi formulaatio säätelee kiinteän entsyymin liukenemista biologisiin nesteisiin ja suojaa sitä hajoamiselta.

Niukkaliukoinen entsyymi voidaan antaa annoksena, joka riittää estämään fibriinin saostumisen tai kiinnikasvet-tumien muodostumisen leikkauksen, infektion, tapaturman tai tulehduksen jälkeen. Terapeuttisesti tehokkaat määrät niukkaliukoista entsyymiä annetaan esillä olevan keksinnön mukaisesti. Esimerkiksi terapeuttisesti tehokas määrä streptokinaasia niukkaliukoisessa muodossa on välillä noin 300 yksikköä/ g geeliä - 12 500 000 yksikköä/ g geeliä. Edullinen terapeuttinen määrä streptokinaasia on välillä noin 10 000 yksikköä/g geeliä - noin 375 000 yksikköä/g geeliä. Kun kyseessä on plasminogeenin kudosak-tivaattori kiinteässä muodossa, ovat terapeuttisesti tehokkaat määrät noin 0,02 mg/g geeliä - 25 mg/g geeliä. Edullinen terapeuttinen määrä plasminogeenin kudosaktivaat-toria on välillä noin 0,125 mg/g geeliä - 2,5 mg/g geeliä. Edullisin terapeuttinen määrä plasminogeenin kudosaktivaat-toria on välillä noin 0,25 mg/g geeliä - noin 1,0 mg/g geeliä.

Tarttumista edesauttava apuaine on määritelmän mukaan puolikiinteä, limainen, farmaseuttisesti inertti kantaja-aine, joka on tarkoitettu niukkaliukoisen entsyymin sijoittamiseen siihen kohtaan, jossa kiinnikasvettuman muodostuminen on mahdollista. Apuaineet ovat inerttejä, myrkkyvaikutuksettornia, ei-ärsyttäviä ja fysiologisesti ja farmaseuttisesti hyväksyttäviä. Apuaineet ovat yleensä biologisesti poishankautuvia, koska ne kuluvat pois levityskohdasta verrattuina biologisesti hajoaviin apuaineisiin, jotka vaativat apuaineen kemiallista hajoa- 14 103868 mistä, jotta aktiivinen entsyymi vapautuu. Inertit tartuntaa edesauttavat apuaineet takaavat kiinteän entsyymin saannin levityspaikassa, mutta samalla ne vähentävät entsyymin ilmenemistä ei- toivotuissa paikoissa, esimerkiksi veressä. Niukkaliukoisella entsyymillä itsellään saattaa olla tarttumisominaisuuksia niin, että inertin tarttumi sta edesauttavan apuaineen käyttö on tarpeetonta. Tällaisina inertteinä tarttumista edesauttavina apuaineina voidaan käyttää pitkäketjuisia hiilivetyjä tai kasviöljyjä tai vahoja, jotka koostuvat tyydyttyneiden ja tyydyttymättömien rasvahappoglyseridien seoksista tai muunnettujen tyydyttyneiden ja tyydyttymättömien rasvahappoglyseridien seoksista. Tällaisia apuaineita tai kantaja-aineita ovat mm., näillä mitenkään rajoittamatta, puolikiinteät apuaineet kuten vaseliini-hyytelö tai puolisynteettiset glyseridit, polyhydroksiliuottimet, kuten glyseroli, pitkäketjuiset hiilivedyt, biologisesti pois kuluvat polymeerit tai liposomit. Biologisesti poiskuluvia polymeerejä ovat mm. pienimolekyyli-r painoiset polymeerit, jotka voidaan formuloida puolikiin- teään muotoon. Tällaisia formuloituja puolikiinteitä polymeerejä ovat mm. polyesterit, polyamidit, polyamino-hapot, polyasetaalit, polyanhydridit, polyortoesterit ja polysakkaridit, kuten luonnonhiilihydraatti, joka .· koostuu vuorottelevasti /3 -D-glukuronihaposta ja 2- asetamido-2-deoksi-^-D-glukoosista, joka hiilihydraatti tunnetaan hyaluronihappona. Polysakkaridit asetetaan etusijalle inertteinä tartuntaa edesauttavina apuaineina. Edullisin on hyaluronihappo. Esillä olevan keksinnön mukaisten myrkkyvaikutuksettomien apuainei- den ei pitäisi sisältää muita biologisesti hajoavia tai biologisesti pois kuluvia kiinteitä aineita kuin niukkaliu-koista entsyymiä, koska on havaittu, että jauheiden, kuten magnesiumsilikaatin, talkin ja tärkkelyksen, käyttö aiheuttaa kiinnikasvettumien muodostumista (Corson, S.L., J. Reprod. Med., 29 (3), 143 (1984)).

15 103868

Entsyymin niukkaliukoinen muoto voidaan dispergoida farmaseuttisesti inerttiin tarttumista edesauttavaan apuaineeseen, jotta saadaan aikaan haluttu liukenemisnopeus levi-tyskohdassa. Niukkaliukoinen muoto säätelee vapautumista biologiseen nesteeseen niin, että aktiivisuus esiintyy halutun ajanjakson ajan. Tämä on toisin kuin entsyymin liukoisen muodon ollessa kyseessä, jolloin entsyymi liukenee välittömästi. Entsyymin vapautuminen voidaan ennustaa sen liukoisuudesta ja hiukkaskoosta, kuten jäljempänä osoitetaan. Monoliittisessa apuaineessa, jossa enstyymi on dispergoituneena kiinteinä hiukkasina inerttiin runkoon, voidaan entsyymin vapautumisnopeus esittää yhtälöllä d£= 12A^_Ss)dx at z ja määrä, joka on vapautunut johonkin ajankohtaan mennessä antamisen jälkeen, voidaan approksimoida yhtälöstä: M = (2ADCet)1/2 s Näissä yhtälöissä on M vapautunut entsyymimäärä, A on lääkemäärä apuaineen massayksikköä kohti, C on entsyymin

S

liukoisuus apuaineessa, D on enstyymin diffuusiokerroin, t on aika ja dx on sen alueen paksuus rungossa, josta entsyymi on jo poistunut (T. Higuchi, J. Soc. Cosmetics Chemists _11, 85 (1960); T. Higuchi, J. Pharm. Sei 50, 874 (1961)). Näin ollen vapautumisnopeutta tämäntyyppisestä formulaatiosta voidaan muuttaa muuttamalla entsyymin liukoisuutta Cg (esim. käyttämällä erityyppisiä apuaineita) tai säätelemällä lääkkeen määrää apuaineessa.

Kun entsyymi on suspendoituneena kiinteinä hiukkasina vesiliukoisessa apuaineessa, proteiinin vapautumisnopeus voidaan esittää klassisella Noyesin yhtälöllä dM _ DA (C - C) 3t - TT s 16 103868 Tässä M on vapautunut tai liuennut määrä, t on aika, D on lääkemolekyylien diffuusiokerroin väliaineessa, A on alttinna oleva pinta, h on diffuusiokerroksen paksuus, C on entsyymin liukoisuus levityskohdassa ja C on entsyy-

O

min pitoisuus levityskohdassa. Jos entsyymi on kiinteinä hiukkasina sijoitettu nopeasti liukenevaan apuaineeseen, jättää apuaineen liukeneminen välitilasta entsyymidis-persion tuohon kohtaan. Koska entsyymi on suhteellisen liukenematon, se liukenee halutun ajan kuluessa riippuen entsyymin liukoisuudesta ja hiukkaskoosta.

Tämän yhtälön mukaisesti voidaan niukkaliukoisen entsyymin vapautumisnopeutta vesiliukoisesta apuaineesta säädellä muuttamalla A:ta, joka on alttiina oleva hiukkaspinta.

Tämä voidaan saavuttaa säätelemällä hiukkaskokoa. Suuremmista hiukkasista on seurauksena pienempi pinta-ala ja pienempi vapautumisnopeus, kun taas pienillä hiukkasilla on suuri alttiina oleva pinta ja niiden pitäisi tuottaa suurempi vapautumisnopeus.

Niukkaliukoinen entsyymi ei ole niin liukenematon, että se olisi läsnä biologisessa nesteessä erittäin pitkän ajan omaten samalla pienen aktiivisuuden. Niukkaliukoinen muoto takaa jatkuvan vapautumisen halutun ajanjakson kuluessa. Tätä jatkuvaa vapautumista voidaan myös edesauttaa inertillä apuaineella. Edullisia apuaineita ovat sellaiset, jotka saavat aikaan entsyymin vapautumisen halutun ajan kuluessa. Ajanjakso, jona entsyymiä vapautuu jatkuvasti, on vähintään noin 3 vuorokautta - noin kaksi viikkoa. Edullinen ajanjakso, jona entsyymiä vapautuu, ‘ on vähintään noin 4 vuorokautta - noin 10 vuorokautta.

Sopiva annostelusysteemi, jolla niukkaliukoinen entsyymi sijoitetaan mahdollisen kiinnikasvettuman muodostumis-kohtaan, koostuu sekoitussäiliöstä, jossa on välineet kahden säiliön sisällön sekoittamiseksi keskenään. Annos- 103868 telusysteemi kostuu ensimmäisestä taipuisasta säiliöstä, jossa voidaan erillään säilyttää steriiliä, tarttumista edesauttavaa apuainetta, ja toisesta taipuisasta säiliöstä, jossa voidaan säilyttää niukkaliukoista entsyymiä. Ensimmäisessä taipuisassa säiliössä on sisäänpääsykohta, jossa on puhkaistava diafragma. Toisessa taipuisassa säiliössä on vastakkainen aukko, joka voidaan sijoittaa ensimmäisen säiliön aukon yhteyteen niin, että steriili liuos ja niukka-liukoinen entsyymi saadaan sekoitetuiksi keskenään. Kunkin säiliön taipuisuus tai ainakin toisen säiliön taipuisuus mahdollistaa säiliöiden sisältöjen sekoittamisen keskenään. Taipuisa säiliö edesauttaa myös geelimäisen lääkkeen sijoittamista mahdollisen kiinnikasvettuman muodostumiskohtaan. Toisessa säiliössä on taipuisa sulkuväline, jolla toinen säiliö suljetaan tiiviisti. Taipuisassa sulkuväli-neessä on pääsyaukko, jonka läpi geelimäinen lääke, joka koostuu terapeuttisesti tehokkaasta määrästä niukkaliukoista entsyymiä ja laimennusaineesta tai inertistä tarttumista . edesauttavasta apuaineesta, pääsee ulos mahdolliseen kiin nikasvettuman muodostumiskohtaan.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu entsyymikoos-tumus voidaan antaa ennen kirurgista ompelua. Kun kyseessä on vatsaleikkaus, levitetään mainittu koostumus eli niukka-. liukoinen entsyymi yksin tai inertissä, tarttumista edesauttavassa apuaineessa käsin tai hieromalla tai jollakin muulla sopivalla menetelmällä, esimerkiksi laparoskoo-pilla, ohueksi kalvoksi vatsaelimille ennen kuin omentum vedetään elinten päälle ennen ompelua. Normaalit tiedot omaavalle kirurgille on selvää, mille elimille koostumusta : pitää levittää. Esimerkiksi vatsaleikkauksen ollessa ky seessä on ohutsuoli, johon saattaa syntyä tukos kiinnikasvettuman muodostuksen seurauksena, eräs mahdollinen levi-tyskohta. Levitetty seosmäärä on edellä kuvattu ja riippuu vaurion asteesta, leikkauksen tyypistä, potilaan tilasta, 18 103868 entsyymin trombolyyttisestä aktiivisuudesta ja muista sellaisista tekijöistä, jotka normaali, amamttitaitoinen lääkäri osaa arvioida.

Esimerkki 1

Materiaalit ja menetelmät 1) Kanimalli

Voimakkaimman stimulanssin kiinnikasvettumien muodostukselle on havaittu olevan iskeemisen kudoksen läsnäololla, joka johtuu vatsakalvon vikojen ompelusta tai paikkaamisesta, paremminkin kuin kaavitulla vatsakalvon pinnalla. Uuden-

Seelannin valkoiset kanit (n. 3,0 kg) nukutettiin Fluani- zonella ja Fentanyylillä ja suoritettiin keskiviivan vatsanavaukset käyttämällä steriilejä leikkausmenetelmiä.

2 9 cm :n alue vatsan seinästä poistettiin, ommeltiin takaisin paikoilleen silkkiompeleilla, jolloin syntyi vatsa- kalvon kudoksesta iskeeminen alue. Umpisuolen läheistä 2 aluetta (n. 75 cm ) hangattiin kuivalla sideharsolla, kunnes ilmeni pisteittäistä verenvuotoa. Liukenematon tai suhteellisen liukenematon entsyymi, jolla oli trombo-lyyttistä tai fibrinolyyttistä aktiivisuutta, levitettiin iskeemiseen kudokseen joko kalvona keksinnönmukaisella menetelmällä valituille elimille suoraan tai huuhtelunesteenä (0,5 mg plasminogeenin kudosaktivaattoria/150 ml isotonista suolaliuosta) tai suonen tuloaukon kautta, joka antaa lääkeliuoksen suoraan uudelleenommeItuun vatsa-kalvokudokseen tai levittämällä formulaatio ulkoisesti alueelle (2,5 g geeliä, joka sisälsi 0,25 mg plasminogeenin kudosaktivaattoria/g formulaatiota). Kun umpisuoli ·· oli sijoitettu takaisin vatsaonteloon, vatsan lihakskerros ommeltiin kiinni 1.0 langalla (proline) ja ihokerros suljettiin 2.0 langalla (proline). Seitsemän vuorokauden kuluttua kanit surmattiin ja suoritettiin vatsanavaukset uudestaan, jotta saatiin määritetyksi muodostuneiden kiinnikasvettumien määrä. Kriteeri, jonka mukaan kiinni-.. kasvettuman katsottiin muocös tuneen, oli umpisuolen tart- 19 103868 tuminen vatsakalvon seinässä olevaan iskeemiseen palaseen. Kiinnikasvettumien vakavuuden arvioinnissa käytettiin seuraavaa asteikkoa:

Arvosana 0 - kiinnikasvettumaa ei havaittu

Arvosana 1 - alle 10 % iskeemisestä palasta oli peittynyt kiinnikasvettumalla Arvosana 2 - 25 % iskeemisestä plasta on peittynyt kiinnikasvettumalla

Arvosana 3 - 50 % iskeemisestä palasta on peittynyt kiinnikasvettumalla

Arvosana 4 - 100 % iskeemisestä palasta on peittynyt kiinnikasvettumalla

Arvosana 5 - Iskeemistä palaa suurempi alue on peittynyt kiinnikasvettumalla.

2) Plaminogeenin kudosaktivaattorijauhe suurena määränä

Plasminogeenin kudoasaktivaattoria valmistettiin jauheena dialysoimalla liuotuspuskurista varastoliuoksesta. Tätä varten 1000 ml liuosta, joka sisälsi 2,5 mg/ ml plasminogeenin kudosaktivaattoria, 87,1 mg/ml L-arginiinia, 26,8 mg/ml fosforihappoa (85 massa-%) ja 0,1 mg/ml polysorbaat-ti 80, jaettiin 100 ml:n eriin ja siirrettiin dialyysikal-voputkiin (Spectrapor membrane tubing 6000-8000 MW cutoff). Jokainen erä dialysoitiin 1000 ml:aa vasten puhdistettua ja steriiliä vettä 5°C:ssa. Kun dialysaattia oli vaihdettu neljä kertaa, kerättiin putken sisällä oelva proteiini-sakka talteen. Sentrifugoitiin (4000 min ^ 15 minuuttia, 5°C, Beckman Accu-spin, jäähdytetty sentrifugi) ja dekan-toitiin, jonka jälkeen emäliuos dekantoitiin ja putkeen lisättiin puhdistettua steriiliä vettä. Proteiini huuhdeltiin sekoittajassa (Vortex-sekoittaja) ja erotettiin uudestaan sentrifugoimalla. Tämä toimenpide toistettiin vielä kolmesti. Näin saatiin aikaan valkoinen, amorfinen jauhe. Lopullisen huuhtelun jälkeen otettiin plasminogeenin kudosaktivaattori talteen ja siitä valmistettiin steriili jauhe yksikköannoksia varten.

20 103868 steriili jauhe yksikköannoksia varten.

3) Jauhemuodossa olevan yksikköannoksen valmistus a) Saostus vedellä

Bulkki-t-PA väkevöitiin kaksikymmenkertaiseksi ultrasuo-dattamalla vesi ja arginiinifosfaatti. Väkevöity bulkki steriilisuodatettiin. t-PA saostettiin lisäämällä vettä väkevöityyn huikkiin. Arginiinifosfaatti ja jäljellä oleva liukoinen t-PA poistettiin soastetusta suspensiosta peräkkäisillä vesipesuilla. Pestyllä suspensiolla täytettiin lääkepullot. Lääkepullojen sisällöt lyofilisoi-tiin niin, että saatiin t-PA-jauhetta.

b) pH-saostus

Bulkki-t-PA:n pH säädettiin arvoon 4 fosforihapolla. Bulkki-t-PA:n arginiinifosfaatti vaihdettiin suolahappo-liuoksella (pH 4) diasuodattamalla. Tämän jälkeen t-PA/ suolahappobulkki steriilisuodatettiin. t-PA saostettiin säätämällä suodatetun bulkin pH arvoon 6 laimealla nat-riumhydroksidiliuoksella. Natriumkloridi ja jäännös-t-PA poistettiin sakkasuspensiosta peräkkäisillä vesipesuilla. Pestyllä suspensiolla täytettiin lääkepullot. Lääkepul-;; lojen sisältö lyofilisoitiin niin, että saatiin t-PA-jau- hetta.

c) Ammoniumbikarbonaattilyofilisointi t-PA-bulkkiliuoksen, joka sisälsi 0,5 M arginiinifosfaat-tia (pH 7,2) ja Tween 80 (0,19 mg/ml), vaihto haihtuvalla-puskurilla, kuten ammoniumbikarbonaatilla, jonka pitoisuus oli alueella 0,2 - 0,8 M, mielelllään alueella 0,25 -0,5 M pH:n ollessa välillä 7,0 - 10,5, G-25-pylvään läpi suoritettiin lämpötila-alueella 2 - 28°C. t-PA:n eluentti ammoniumbikarbonaatissa ja Tween 80:ssä kerättiin ja 21 103868 väkevöitiin ultrasuodattamalla sellaiseen ammoniumbikar-bonaattipitoisuuteen, joka perustui t-PA:n liukoisuuteen valittuun ammoniumbikarbonaattipuskuriin ja prosessiläm-pötilaan. Tämän jälkeen t-PA-ammoniumbikarbonaattibulkki steriilisuodatettiin. Suodatetulla huikilla täytettiin lääkepullot. Lääkepullojen sisältö lyofilisoitiin niin, että saatiin t-PA-jauhe.

4) Annosmuodon valmistus

Eri vesiliuoksia, joita alalla käytetään, valmistettiin ja testattiin myös, kuten käyttämällä kolloidisia polysakkarideja, kuten dekstraania tai muunnettuja selluloosaku-meja (kohdan 4 formulaatiot 1 ja 2), muunnettua kollageenia tai poloksameerejä (kohdan 4 formulaatiot 3 ja 4) ja glyserolia sakeutettuna polyetyleeniglykolipolymeerili-säyksellä ( kohdan 4 formulaatio 5). Formulaatiot 1 - 4 kuuluvat kahteen kategoriaan: plasminogeenin kudosak- tivaattori liuotettuna vesipitoiseen geeliin (formulaatiot 1 ja 3) ja plasminogeenin kudosaktivaattori suspen-doituna niukkaliukoisina hiukkasina vesipitoiseen geeliin (formulaatiot 2 ja 4).

Formulaatio 1: ” A-puskuriliuos L-arginiini 3,48 g H3P04 (85 paino-%) 1,54 g

Puhdistettu vesi (riittävä määrä) 100 g L-arginiini liuotettiin 90 ml:aan puhdistettua vettä. Lisättiin hitaasti fosforihappo (1,54 g), jolloin saatiin liuos, jonka pH oli 6,0. Saadun liuoksen tilavuus säädettiin 100 ml:ksi puhdistetulla vedellä. Tämä liuos suodatettiin steriilisuodattimen läpi, jonka huokoskoko oli 0,22 um (Millex-GV tai vastaava), ja varastoitiin 5°C:ssa.

22 103868 B-lopullinen formulaatio: dekstraani (MW 2 000 000) 0,1 - 0,5 g plasminogeenin kudosaktivaattori 0,00025 g puskuriliuos A (riittävästi) 1,0 g

Plasminogeenin kudosaktivaattori lisättiin ja liuotettiin puskuriliuokseen A. Sitten lisättiin dekstraani hitaasti ja samalla voimakkaasti sekoittaen, jotta polymeeri liukeni ja saatiin homogeeninen liuos.

Formulaatio 2: dekstraani (MW 2 000 000) 0,1 - 0,3 g plasminogeeni kudosaktivaattori- niukka-liukoisina hiukkasina 0,00025 g puhdistettu vesi (riittävä määrä) 1,00 g

Dekstraani liuotettiin veteen ja samalla sekoitettiin voimakkaasti, jotta saatiin homogeeninen liuos. Liuokseen lisättiin plasminogeenin kudosaktivaattori, sekoitettiin ja proteiini dispergoitiin homogeeniseksi.

Formulaatio 3: A-puskuriliuos L-arginiini 3,48 g H3P04 (85 paino-%) 1,54 g puhdistettu vesi (riittävä määrä) 100 g L-arginiini liuotettiin 90 ml:aan puhdistettu vettä. Lisättiin fosforihappoa, jotta saatiin liuos, jonka pH oli 6,0. Lisätty määrä oli noin 1,54 g. Liuoksen tilavuus säädettiin 100 ml:ksi puhdistetulla vedellä. Tämä liuos laskettiin steriilisuodattimen läpi, jonka huokoskoko oli 0,22 um (Millex-GV tai vastaava). Saatua liuosta säilytettiin 5°C:ssa ja se käytettiin lopullisen formu-laation valmistukseen.

• « 23 103868 B-lopullinen liuos:

Poloxamer 407 0,05 - 0,3 g

Liukoinen plasminogeenin kudosak-tivaattori 0,00025 g puskuriliuos A (riittävä määrä) 1,0 g

Puskuriliuos A jäähdytettiin 5°C:seen, lisättiin plasminogeenin kudosaktivaattori ja liuotettiin. Sitten lisättiin poloxamer ja liuotettiin voimakkaasti sekoittaen, kunnes saatiin homogeenin liuos. Saatu liuos ajettiin steriilisuodattimen läpi, jonka huokoskoko oli 0,22 um (Millex-GV tai vastaava).

Formulaatio 4:

Poloxamer 407 0,05 - 0,3 g plasminogeenin kudosaktivaattori -niukkaliukoisina hiukkasina 0,00006 g puhdistettu vesi (riittävä määrä) 1,00 g

Vesi jäähdytettiin 5°C:seen, lisättiin poloxamer 407 ja liuotettiin voimakkaasti sekoittaen, kunnes saatiin homogeeninen liuos. Lisättiin plasminogeenin kudosaktivaattori ja se dispergoitiin homogeenisesti.

Formulaatiot 5-9 ovat lisäesimerkkejä keksinnönmukai-sista uusista koostumuksista: plasminogeenin kudosak tivaattori suspendoituneena niukkaliukoisina hiukkasina vedettömään, vesiliukoiseen geeliin (formulaatio 5); plasminogeenin kudosaktivaattori suspendoituneena niukka-·. liukoisina hiukkasina pitkäketjuiseen hiilivetypohjaan (formulaatio 6); ja plasminogeenin kudosaktivaattori suspendoituneena niukkaliukoisina hiukkasina biologisesti poishankautuvaan, puolisynteeettiseen öljyyn tai vahaan, joka koostuu tyydyttymättömien ja tyydyttyneiden rasvahappoglyseridien seoksesta (formulaatiot 7, 8 ja 9).

» 24 103868

Formulaatio 5: polyetyleeniglykoli (MW 800-1500) 0,0 - 0,3 g plasminogeenin kudosaktivaattori 0,00025 g glyseroli (riittävä määrä) 1,0 g

Glyseroli lämmitettiin noin 35 - 45°C:seen. Lisättiin polyetyleeniglykoli ja sekoitettiin, kunnes saatiin homogeeninen liuos. Formulaatio jäähdytettiin ja sen annettiin sakeutua huoneenlämpötilassa jatkuvasti sekoittaen.

Formulaatio 6: plasminogeenin kudosaktivaattori 0,00025 g valkovaseliini (riittävä määrä) 1/0 g

Vaseliini sulatettiin noin 35 - 45°C:seen. Plasminogeenin kudosaktivaattori lisättiin ja dispergoitiin homogeeniseksi. Formulaatio jäähdytettiin ja sen annettiin sakeutua huoneenlämpötilassa jatkuvasti sekoittaen.

Formulaatio 7: plasminoigeenin kudosaktivaattori 0,00025 g glykolysoituja polyoksietylenoituja ·. öljyglyseridejä (Labradil M1944CS) 0,05 - 0,5 g glykosyloituj a polyoksietylenisoituj a steariinilauropalmitoglyseridejä 1,00 g (Labrifil M2130CS) riittävä määrä

Formulaatio 8: plasminogeenin kudosaktivaattori 0,00025 g glykosyloituja polyoksietylenisoituja öljyglyseridejä (Labrafil M1944CS) 0,05 - 0,5 g transesteröityjä, tyydyttyneitä rasvahappoja (Suppocire AIM) riittävä määrä 1,00 g * 25 103868

Formulaatio 9: plasminogeenin kudosaktivaattori 0,00025 g neutraali kasviöljy (kapryyli/kapriinitriglyseridejä

Miglyol 812) 0,05 - 0,5 g transesteröityjä, tyydyttyneitä rasvahappoglyseridejä (Witepsol W32) riittävä määrä 1,00 g

Formulaatiot 7, 8 ja 9 valmistettiin seuraavalla tavalla: öljyt lämmitettiin noin 35 - 45°C:seen, kiinteät rasvahappoglyseridit lisättiin ja sulatettiin ja plasminogeenin kudosaktivaattori lisättiin ja dispergoitiin homogeenisesti seokseen. Formulaatio jäähdytettiin ja sen annettiin sakeutua huoneenlämpötilassa samalla jatkuvasti sekoittaen.

Formulaatiot 10 ja 11 ovat lisäesimerkkejä keksinnönmu-kaisista uusista koostumuksista.

Formulaatio 10: t-PA-jauhe 0,0001 - 0,05 g natriumtärkkelysglykolaatti (i.e. Explotab) riittävä määrä 1 g

Sekoita t-PA-jauhe ja tärkkelysglykolaatti kuivina keskenään. Tämä kuivaseos voidaan suoraan sirotella kostealle biologiselle pinnalle niin, että muodostuu geeli in situ.

Formulaatio 11: A - Geeliesiseos: natriumhyaluronaatti 0,01 - 0,05 g glyseroli (vedetön) 0,006 - 0,25 g 26 1 0 3 8 6 8 natriumfosfaattipuskuri 0,01 M pH 6,0 injektiovesi (riittävä määrä) 1 g B - Aktiivinen aineosa t-PA-jauhe 0,0001 - 0,05 g

Glyseroli ja natriumfosfaatti liuotettiin veteen ja pH säädettiin arvoon 6,0. Natriumhyaluronaattia liuotettiin puskuriliuokseen, kunnes saatiin homogeeninen geeli (gee-liesiseos).

Geeli ladattiin ensimmäiseen taipuisaan säiliöön, kuten steriiliin ruiskuun. t-PA-jauhe ladattiin toiseen taipuisaan säiliöön, kuten edellä on selostettu. Välittömästi ennen käyttöä t-PA-jauhe valmistettiin ensimmäisen taipuisan astian geeliesiseokseen sekoittamista varten lisäämällä tietty tilavuus sekoitusliuosta, kuten injektio-vettä, normaalia suolaliuosta tai 5 %:sta dekstroosia. Sekoitusliuosta lisättiin t-PA-jauheeseen toisessa taipuisassa säiliössä l g per 4 g geeliä ja sekoitettiin perusteellisesti. Määrättyä sekoitusliuostilavuutta voidaan muuttaa sen perusteella, mikä geeli-t-PA-määrä aiotaan antaa. Toinen taipuisa säiliö yhdistettiin ensimmäiseen taipuisaan säiliöön, joka sisälsi geeliesiseoksen, sterii-: Iin aukon välityksellä (esim. Burron'in nesteenannostus- liitin). t-PA ja geeliesiseos sekoitettiin keskenään työntämällä geeliä edestakaisin näiden kahden säiliön välillä niin kauan, kunnes saavutettiin homogeenisuus.

Esimerkki 2

Niukkaliukoisen koostumuksen vaikutus vatsakalvon kiinni-kasvettumiin

Kiinnikasvettumien muodostus

Eläimet käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla plasminogee- 27 103868 nin kudosaktivaattorilla, joka oli joko kiinteänä entsyyminä tai liukenevassa muodossa. Liukoisen entsyymin ollessa kyseessä, vatsaontelo huuhdeltiin kerran ennen haavan sulkemista. Muodostuneiden kiinnikasvettumien määrä arvioitiin 14 vuorokauden kuluttua. Vaihtoehtoisesti annettiin liuosta ulkokautta iskeemiseen kohtaan suonen pääsyaukon kautta. Kiinnikasvettumien muodostumisen laajuus pääsyaukkoannossa tutkittiin 5 vuorokauden kuluttua Kaikissa tapauksissa käytettiin suolaliuosta kontrollina. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1

Kanin tunniste 1234 Käsittelymenetelmä Arvosana

Huuhtelu 150 ml :11a 3 3 0 3 suolaliuosta

Huuhtelu 150 ml:11a aiola- liuosta, jossa oli 0,5 mg 2 0 2 4 plasminogeenin aktivaattoria

Suonen sisäänpääsyaukko 3 4 5 ml suolaliuosta/2 vrk:ssa/ .. 5 vrk:n ajan

Suonen sisäänpääsyaukko 000 0,5 mg plasminogeenin kudos-akti vaattoria/2x vrk:ssa/5 vnc:n ajan___ 28 103868

Kaikille hoitamattomille eläimille kehittyi korkean asteen kiinnikasvettumia, mikä osoitti, että leikkauksenjälkeisiä kiinnikasvettumia voidaan saada aikaan toistetta-vasti tällä mallilla. Kaneilla, jotka oli käsitelty yhdellä ainoalla huuhtelulla, esiintyi keskimäärin alempi kiinnikasvettuma-aste kuin vertailueläimillä. Tulos oli kuitenkin paljon selvemmin ilmenevä, kun plasminogee-nin kudosaktivaattoria levitettiin suoraan iskeemiselle alueelle kahdesti vuorokaudessa 5 vuorokauden ajan. Kolmesta eläimestä yhdelläkään ei esiintynyt mitään merkkiä kiinnikasvettumasta. Vertailuryhmän kummallekin eläimelle kehittyi asteen 4 ja 5 kiinnikasvettuma vastaavasti.

Plasminogeenin kudosaktivaattoria sijoitettiin keksinnön-mukaisiin uusiin puolikiinteisiin formulaatioihin ja levitettiin paikallisesti leiaktulle ja uudelleenommellul-le vatsakalvoseinäalueelle ja hangatulle umpisuolialueel-le. Levitetty plasminogeenin kudosaktivaattorimäärä pidettiin vakiona eli se oli 0,25 mg kudosplasminogeenin aktivaattoria per g geeliä. Noin 2,5 g keksinnönmukaista uutta koostumusta levitettiin käsin ja hierottiin ohueksi kalvoksi pintaan siihen kohtaan, jossa kiinnikasvettuman muodostuminen oli mahdollista.

*: Useimmissa tutkituissa tapauksissa vertailueläimille, jotka oli käsitelty placebolla, joka ei sisältänyt lainkaan plasminogeenin kudosaktivaattoria, kehittyi laaja kiinnikasvettuma koko vammautuneelle alueelle. Liuenneessa muodossa tai vesipitoisena geelinä levitetty plasminogeenin kudosaktivaattori (formulaatiot 1 ja 3) osoitti vain vähän parempaa tulosta kiinnikasvettumien muodostumisen estämisessä vertailuryhmään verrattuna. Kuten huuhtelukäsittelyssä, saattaa liunnneessa muodossa oleva plasminogeenin kudosaktivaattori inaktivoitua nopeasti in vivo eikä sen aktiivisuus pysy yllä riittävän pitkään, jotta kiinnikasvettumien muodostuminen estyisi täysin.

103868 29

Kiinnikasvettumien muodostumisen estyminen havaittiin kaikissa käsitellyissä ryhmissä, joille käytettiin esillä olevan keksinnön mukaista koostumusta. Vain kolme testatuista 29 eläimestä, joille käytettiin formulaatioissa 5, 6, 7,8 tai 9 selostettua uutta koostumusta, kehitti kiinnikasvettuman. Suhteellisen liukenematon entsyymi kiinteässä muodossa, kuten- plasminogeenin kudosaktivaat-tori vesiliukoisessa apuaineessa (formulaatio 5), esti myös tehokkaasti kiinnikasvettumien muodostumisen, mikä viittaa siihen, että plasminogeenin kudosaktivaattorin rajoitettu sisäinen liukoisuus on myös tekijä, joka edesauttaa aineen stabiilisuutta in vivo sekä pitkitettyä fibrinolyyttistä aktiivisuutta, jotka ovat edellytyksinä terapeuttisille vaikutuksille.

Suoritettiin lisäkokeita .käyttämällä vaihtelevia määriä plasminogeenin kudosaktivaattoria. 24 kania (3 kg) jaet tiin neljäksi yhtäsuureksi ryhmäksi. Kirurgisen vammauttamisen jälkeen levitettiin kunkin kanin vaurioituneelle alueelle 2,5 g apuainetta, joka sisälsi kokonaisannoksena 0, 0,16, 0,31 tai 0,63 mg geeniteknologisesti valmistettua plasminogeenin kudosaktivaattoria. Muodostuneiden kiinnikasvettumien laajuustulokset on esitetty yhteenvetona kuvassa 1. Vaikka mitään vaikutusta ei havaittu kiinni-.. kasvettuman muodostumisen laajuudessa, kun käytettiin esillä olevan keksinnön mukaisena uutena koostumuksena geeniteknologisesti valmistettua plasminogeenin kudosaktivaattoria pienimpänä annoksena, havaittiin dramaattinen kiinnikasvettumien muodostumisen lasku sekä 0,31 mg:11a että 0,63 mg:lla.

Muodostuneiden kiinnikasvettumien vakavuus arvosteltiin lisäksi määrittämällä se mekaanisen voiman määrä, joka tarvittiin erottamaan kiinnitarttunut kudos irti. Käytettyjä mekaanisia voimia olivat irrottaminen esimerkiksi suljetuilla saksilla, jotta kiinnikasvettunut kudos saa- 30 1 0 3 8 6 8 tiin erilleen, tai vakavan kiinnikasvettuman ollessa kyseessä varsinainen leikkaaminen. Näistä tuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa 3. Kiinnikasvettumat, jotka muodostuivat eläimille, jotka oli käsitelty 0,31 tai 0,63 grammalla plasminogeenin kudosaktivaattoria, vaativat yksinkertaisen erottamisen tylpällä esineellä. Kiinnikasvettumat, jotka muodostuivat pienellä annoksella tai ilman geeniteknologisesti tuotettua plasminogeenin kudosaktivaattoria, vaativat usein enemmän aikaavie-vän leikkauksen terävällä esineellä.

Suoritettiin kokeet, joissa käytettiin vaihtelevia määriä geeniteknologisesti tuotettua plasminogeenin kudosaktivaattoria hyaluroniahpossa formulaation 11 mukaisesti. 24 kania (3 kg) jaettiin neljään yhtä suureen ryhmään. Kirurgisen vammauttamisen jälkeen levitettiin kunkin kanin vaurioituneelle alueelle 2,8 g apuainetta, joka sisälsi geeniteknologisesti tuotettua plasminogeenin kudosaktivaattoria 0, 0,168, 0,225 tai 0,70 mg. Muodostuneiden kiinnikasvettumien laajuudesta saadut tulokset on esitetty yhteenvetona kuvassa 3, Kiinnikasvettumien muodostumista ei esiintynyt oleellisesti ottaen lainkaan milläään koekanilla, jolle oli annettu geeniteknologisesti tuotettua plasminogeenin kudosaktivaattoria keksinnön-• mukaisena uutena koostumuksena.

Kiinnikasvettumien uudelleenmuodostus

Vaikka esillä olevan keksinön mukaista formulaatiota, jcka sisältää trombolyyttistä tai fibrinolyyttistä ainetta, kuten geeniteknologisesti valmsitettua plasminogeenin kudosaktivaattoria, ja apuainetta, voidaan käyttää kiinnikasvettumien estämiseen, sitä voidaan myös käyttää estämään kiinnikasvettumien uudelelenmuodostumista kiinnikasvettumien erotuksen jälkeen. Seuraava koe suun- 3i 103868 niteltiin sen määrittämiseksi, vaikuttaako geenitekno-logisesti tuotettua plasminogeenin aktivaattoria sisältävä koostumus kiinnikasvettumien uudelleenmuodostumiseen kiinnikasvettumien lyysin jälkeen. 10 kania nukutettiin ja niille suoritettiin vatsanavaus keskiviivaa pitkin. Tehtiin iskeeminen vatsakalvon siirrännäinen ja sen jälkeen hangattiin umpisuolta edellä kuvatulla tavalla. Vaurioitettuun kudokseen ei levitetty mitään ainetta ennen vatsan sulkemista. 7 vuorokauden kuluttua suoritettiin vatsanavaukset uudestaan. Havaitut kiinnikasvettuneet rakenteet erotettiin ja kaikki verenvuoto tyrehdytettiin sähköpoltolia. Yhdeksällä kymmenestä kanista oli kiinnikasvettumia, jotka olivat astetta 3 tai enemmän. Yhdellä kanilla ei ollut lainkaan kiinnikasvettumaa ja se poistettiin tutkimuksesta. Neljällä kanilla erotetut fibriinillä peittyneet pinnat päällystettiin 2,5 grammalla apuainetta, joka sisälsi 0,63 g geeniteknologisesti valmistettua plasminogeenin kudosaktivaattoria. Viisi vertai-lukania saivat saman määrän apuainetta, joka ei sisältänyt lainkaan geeniteknologisesti valmistettua plasminogeenin kudosaktivaattoria. Kanit ommeltiin kiinni kahdeksi kerrokseksi ja avattiin uudestaan 7 vuorokauden kuluttua. Tulokset, jotka saatiin olemassaolevien kiinnikasvettumien ja leikkauksenjälkeisten kiinnikasvettumien uudel-leenmuodostumisen eliminoitumisen asteesta (kuva 2) osoittavat, että trombolyyttinen tai fibrinolyyttinen aine, kuten geeniteknologisesti valmistettu plasminogeenin kudosaktivaattori, keksinnönmukaisessa uudessa koostumuksessa ja levitettynä aiemman kiinnikasvettumanmuodostu-misen kohtaan siten, että ainetta vapautuu jatkuvasti, : on yhtä tehokas kiinnikasvettumien uudelleenmuodostumi- sen estämisessä kirurgisen irroituksen jälkeen kuin se on alkuperäisen kiinnikasvettumanmuodostuksen estämise-sä.

Suurien annosten geeniteknologisesti valmistettua plasmino- 32 103868 geenin kudosaktivaattoria trombolyyttisenä tai fibrinolyyt-tisenä aineena annettuiraon osoitettu saavan aikaan kohtalaisia alenemisia systeemisessä fibrinogeenissä (Rao, A.K. et ai., Clin. Res. 34, 337A (1986)). Se, oliko geeni teknologisesti valmistetun plasminogeenin kudosaktivaat-torin käytöllä geelissä vaikutusta systeemiseen fibrino-geenin hajoamiseen, arvioitiin mittaamalla verinäytteet neljältä kanilta käyttämällä geeniteknologisesti valmistetun plasminogeenin kudosaktivaattorin inhibiittoria, D-Phe-Pro-Arg-kloorimetyyliketonia (Mohler, M.A. et ai., Thromb. Hearn. 5jS:2 (1986)): mittasuajankohdat 0, 2, 3,4 ja 24 tuntia siitä, kun oli levitetty 2,5 g apuainetta, joka sisälsi 0,63 mg geeniteknologisesti valmistettua plasminogeenin kudosaktivaattoria, vatsaonteloon. Plasma-näytteistä määritettiin geeniteknologisesti valmistettu plasminogeenin kudosaktivaattori spesifisellä ELISA-testillä, jonka herkkyys riitti 15 ng:aan geeniteknologisesti valmistettua plasminogeenin kudosaktivaattoria per ml plasmaa. Minään aikana ei ollut mitään viitteitä kiertävästä, geeniteknologisesti valmistetusta plasminogeenin kudosaktivaattorista. Koska maksa poistaa geeniteknologisesti valmistetun plasminogeenin kudosaktivaattorin nopeasti, mitattiin plasmanäytteistä fibrinogeenin-muutokset trombiinista riippuvaisella menetelmällä; kiertä-.· vässä fibrinogeenissä ei ilmennyt mitään alenemista, mikä viittaa siihen, ettei geeniteknologisesti valmistettu plasminogeenin kudosaktivaattori helposti absorboidu vatsaonteloon verenkierrosta nopeudella, joka saisi aikaan muutoksia koagulaatiosysteemissä kaneilla.

: Buckman, R.F. et ai., J. Surg. Res. 20:1 (1976) ovat ehdottaneet, että jatkuva plasminogeenin kudosaktivaat-toriaktiivisuuden alhaisuus, joka johtuu vammasta ja sitä seuraavasta iskeemisestä vauriosta vatsakalvon pinnalla, on päästimulantti kiinnikasvettumien muodostukselle. Sitävastoin sisäisen fibrinolyyttisen systeemin ylläpi- 33 1 0 3 8 6 8 to saattaa johtaa fibriinin liukenemiseen eikä pysyvää kiinnikasvettumaa ehkä synny. Vaikka plasminogeenin kudosaktivaattorin aktiivisuuden alenemisen ajallista kulkua ei tunneta sidekudoksisen kiinnikasvettuman muodostumisen patogeneesissa, ei yksi vatsaontelonsisäisesti annettu, leikkauksenjälkeinen annos liukoista fibrinolyyt-tistä ainetta, kuten edellä on selostettu, riitä. Esillä oleva keksintö osoittaa ensi kertaa, että trombolyyttisen aineen, kuten geeniteknologisesti valmistetun plasminogeenin kudosaktivaattorin, niukkaliukoinen muoto formuloituna ja levitettynä suoraan mahdollisen kiinnikasvet-tuman muodostumiskohtaan, täydentää alentunutta fibrino-lyyttistä systeemiä kiinnikasvettuman muodostuksen estämisessä luultavimmin johtuen entsyymin hitaasta jatkuvasta vapautumisesta.

Geeniteknologisesti valmistetun plasminogeenin kudosaktivaattorin vatsaontelonsisäisestä käytöstä ei havaittu aiheutuvan mahdollisia komplikaatioita, kuten systeemistä fibrinogenolyysiä tai haavan paranemisen häiriintymistä. Näissä eläinkokeissa ei ilmennyt vatasontelonsisäistä verenvuotoa.

34 103868

Taulukko 2

Kanin tunniste 123456

Hoitomenetelmä Arvosana FORMULAATIO 1:

Verrokki 43 0 4 4 3

Hoidettu 033050 FORMULAATIO 2:

Verrokki 544100

Hoidettu 000004 FORMULAATIO 3:

Verrokki 444444

Hoidettu 33555 FORMULAATIO 4:

Verrokki 444444

Hoidettu 01 0 3 0 0 FORMULAATIO 5:

Verrokki 444455

Hoidettu 00 0 0 0 3 FORMULAATIO 6:

Verrokki 223555

Hoidettu 000001 FORMULAATIO 7:

Verrokki 144455

Hoidettu 000003 FORMULAATIO 8: ·' Verrokki

Hoidettu 044455 0 0 0 0 0 0 FORMULAATIO 9:

Verrokki 455543

Hoidettu 000000 35 103868

Taulukko 3

El kiinni- Tylppä- Terävä Terävä leikkaus kasvettunsa erotus leikkaus (vaikeuksia)

Vain apuainetta 032 1

Apuaine + 0,16 «g geeniteknologisesti valmistettua plas-minogeenin kudos- aktivaattoria 0 3 1 2

Apuaine + 0,31 mg geen i teknologi ses ti valmistettua plas-minogeenin kudos- akti vaattor ia 4 2 0 0

Apuaine -f 0,63 mg geeniteknologisesti valmistettua plas-minogeenin kudos- aktivaattoria 510 0 1

Niiden kiinnikasvettumien vakavuus, joita muodostui annos-vastetutkimuksessa (kuva 1), arvosteltiin sen mukaan, millainen kirurginen toimenpide vaadittiin kiinnikasva-neiden kudosten erottamiseen toisistaan. Taulukossa i on esitetty niiden eläinten lukumäärä, joiden kiinnikas- vettumat vaativat kirurgista irrotusta.

Esimerkki 3

Niukkaliukoisen koostumuksen vaikutus munuaisaltaan ... kiinnikasvet tumiin 36 103868

Naaraspuoliset Uuden-Seelannin valkoiset kanit (noin 3,0 kg) nukutettiin ketamiinilla, Rompunilla ja Acceprom-azinella ja suoritettiin vatsanavaukset· Kohdunsarvien koko pinta otettiin esiin ja sitä hangattiin, kunnes ilmeni pisteittäistä verenvuotoa, ja tämän jälkeen kudosta vaurioitettiin sarvista vakavasti sähköpoltolla. Plasmino-geenin kudosaktivaattoria levitettiin vaurioituneille kohdun sarville geeliformulaationa (Amogel - ks. edellä selostettu formulaatio 5), joka edusti esillä olevan keksinnön mukaista uutta koostumusta. Kun kohdunsarvet oli sijoitettu takaisin munuaisaltaaseen, vatsan lihaskerros ommeltiin umpeen ja ihokerros suljettiin kirurgisilla haoilla. 14 vuorokauden kuluttua kanit nukutettiin edellä kuvatulla tavalla ja suoritettiin vatsanavaukset uudestaan, jotta saatiin määritetyksi muodostuneiden kiinnikas-vettumien laajuus. Kiinnikasvettumien laajuus määritettiin mittaamalla sen alueen suuruus kohdunsarvissa, joka oli kiinnittynyt niihin itseensä.

2,5 g uutta koostumusta * ei geeliä vain geeliä 0,125 mg/g % kiinnittynyttä 53 %- 32 35,6%-20 31,67%-22,1 kudosta * 1 1 0,25 mg/g 0,5 mg/g % kiinnittynyttä 25%-16,3 18,9-11,3 kudosta * mg/g - mg plasminogeenin kudosaktivaattoria/g geeliä ** p < 0,05 määritettynä studentin t-testillä verrattuna ei geeliä-ryhmään

Eläimet, joilla oli sellaisia kiinnikasvettumia, jotka olivat erotettavissa kirurgisesti, ryhmiteltiin tämän jälkeen niin, että kiinnikasvettuneen kudoksen prosentti keskiarvo oli noin 25 %. Kun nämä kiinnikasvettumat oli erotettu, levitettiin edellä kuvatulla tavalla uusia koostumuksia, jotka sisälsivät plasminogeenin kudosakti- 37 103868 vaattoria. 14 vuorokauden kuluttua kanit surmattiin ja kiinnikasvettuneen kudoksen prosentuaalinen osuus arvioitiin kohdunsarvien makroskooppisella tutkimisella.

2,5 g uutta koostumusta vain geeliä 1 mg/g* 5 mg/g* % uudelleen kiinni- 61,86 37,36 20 kasvettunutta kudosta Δ muutos alkuperäisen 40,63-12,9 11,11%- 22,5 kiinnikasvettuman laajuudesta kiinnikasvet-tumisen uudelleenmuodostukseen 10 mg/g* % uudelleen kiinni- kasvettunutta kudosta 7,5 Δ muutos alkuperäisen -12,5%+-0 kiinnikasvettuman laajuudesta kiinnikasvet-tumisen uudelleenmuodostukseen *mg/g - mg plasminogeenin kudosaktivaattoria/g geeliä

Esimerkki 4

Niukkaliukoisen koostumuksen vaikutus silmän kiinnikas-vettumiin

Kaihileikkaukseen liittyvä komplikaatio on kiinnikasvettuman muodostus, joka johtaa karsastusleikkaukseen. Silmaleikkauksista johtuvien kiinnikasvettumien muodostumista on yritetty estää käyttämällä hyaluronihappoa. Hyaluronihappo on luonnonhiilihydraatti, joka koostuu vuorottelevasti /*rD-glukuronihaposta ja 2-asetamido-2-deoksi-/J-D-glukoosista. On ilmestynyt julkaisuja hyal-uronihapon tai sen kemiallisesti muunnetun muodon käytöstä leikkauksenjälkeisten kiinnikasvettumien vähentämisessä ja jänteenkorjausleikkauksissa {Searl, S.S., Meta, H.S. ja Lindahl, K.J., Ann. Ophthalmol. 19^ (7):259 (1978);

Weiss, C., Levy, H., Denlinger, J., Suros, J. ja Weiss, 38 103868 H., Bull. Hosp. Jt. Dis. Orhtop. Inst. 46:9-15 (1986); Weiss, C., Sucros, J., Michalow, A., Denliger, J., Moore, M., Tejeiro, W., Bull. Hosp. Jt. Dis. Orthop. Inst. 47: 31-39 (1987)). Näiden aineiden tehoa kiinnikasvettumien estämisessä ei näissä tutkimuksissa ole sitovasti todistettu .

Biologisen yhteensopivuutensa vuoksi voitaisiin hyaluroni-happoliuoksia käyttää niukkaliukoisen entsyymin, kuten t-PA:n, antamiseen. Seuraava formulaatio on esimerkki esillä olevan keksinnön mukaisesta uudesta koostumuksesta, joka sisältää niukkaliukoista entsyymiä, kuten plas-minogeenin kudosaktivaattoria, suspensoituna biologisesti pois hankautuvaan, limamaiseen kantaja-aineeseen, kuten hyaluronihappoon.

Formulaatio t-PA 0,1 - 1 mg hyaluronihappoa 3 - 50 mg

NaOH:a pH:n säätämiseen välille 4,5 - 8,0 WFI riittävästi ml

Hyaluronihappo liuotetaan steriiliin veteen ja samalla liuos tiirataan haluttuun pH-arvoon (mielellään välille 5,0 - 6,0) natriumhydroksidilla ja lisätään homogeenisesti dispergoitu t-PA-jauhe. Koostumusta sekoitetaan, kunnes muodostuu limamainen geeli. Esillä olevan keksinnön mukaista limamaista t-PA-formulaatiota levitetään välittömästi kaihileikkauksen tai karsastusleikkauksen jälkeen kohtaan, johon saattaa kertyä fibriiniä tai muodostua kiinnikasvettuma.

Esimerkki 5

Niukkaliukoisen koostumuksen vaikutus fibriinikertymään Fibriinin kertymistä esiintyy tyypillisesti vatsansisäi- 39 1 0 3 8 6 8 sen infektion kohdassa ja se antaa saarimaisen lokeron v bakteerien lisääntymiselle. Tämä lokeroituminen eristää infektion, mutta samalla se eristää infektion isännän puolustusjärjestelmästä. Samanlainen bakteeriperäinen vatsakalvontulehdus on havaittu potilailla, joille annetaan jatkuvaa kiertävää peritoneaalista dialyysiä (CAPD). (Norris, K.D., et ai., Am. J. of Kidney Disease, 10(1):62-65 (1987)). Bakteerien sekvestroitumisen fib-riinihyytymiin CAPD:ssä ajatellaan toimivan pesinä bakteereille niin, että ne ovat suojassa antibioottien ja leukosyyttien tappavalta vaikutukselta. Näille CAPD-potilaille on annettu hepariinia ja streptokinaasia liuoksina.

Fibriinihyytymävatsakalvontulehdusmalli on kehitetty siihen, että rottiin siirrostetaan infektoituja hyytymiä vatsaontelonsisäisesti (Wells, C.L., et ai.. , J. Antimicrob. Chemoth. 1_5 (Suppl: 0:199-206 (1985)). Esillä olevan keksinnön mukaista uutta seosta levitetään leikkauksen jälkeen mahdolliseen fibriininkertymiskohtaan ja märkä-pesäkkeenmuodostuskohtaan tai niiden lähelle. Suoritetaan vatsanavaus ja vatsaontelosta tutkitaan märkäpesäk-keidenmuodostus.

Esimerkki 6

Niukkaliukoisen koostumuksen vaikutus jänteen kiinnikas-vettumiin

Kiinnikasvettumanmuodostuksen koukistajalihaksen jänteen korjausleikkauksen jälkeen on havaittu estävän vahingoittuneen jänteen paranemista (Matthews, P. et ai., J. of Bone and Joint Surgery 58Bi230-236 (1976)). On havaittu, ettei jänteen alkuvamma itsessään stimuloi kiinnikasvet-tumien muodostusta. Kun koukistajalihaksen jänne katkeaa sormesta, sen päät lyhenevät ja tulevat sileän pyöreiksi leväten vapaasti tupen sisällä. Ei muodostu 40 1 0 3 8 6 8 kiinnikasvettumia eikä ole mitään reaktiota ympäröivissä kudoksissa. Ainoastaan silloin, kun jänteen päät avataan kirurgisesti, esiintyy vasteena kiinnikasvettumia.

Tutkimusta varten valittiin täysikasvuisia Uuden-Seelan-nin kaneja. Alkuvalmistelut olivat samat kaikissa kokeissa. Kanit nukutettiin intravenoosisesti Nembutalilla, sen jälkeen toinen etukäpälistä ajeltiin ja laitettiin suonenpuristuskoje, jolla saatiin verenvirtaus pysäytetyksi. Sitten iho puhdistettiin Hibitanen 1 %:sella spriiliuoksella ja laitettiin steriilit sidetaitokset.

Leikattiin nahka auki, ei itsestään sormesta vaan "käm-menalueelta" ja sen jälkeen koukistajalihaksen jänteet tunnistettiin tuppeentyöntymiskhdistaan ja nivelvoide-heijastus avattiin. Kun keskisormi taivutettiin ja vedettiin proksimaalisesti profungukseen, voitiin nivelvoi-dekalvon sisäinen jänteen osa vetää haavaan. Sitten jänne vaurioitettiin niin etäältä kuin mahdollista leikkaamalla leikkausveitsellä sen yli poikittain. Leikkaaminen lopetettiin juuri ennen täydellistä katkeamista niin, että vain sen verran jänteen säikeitä jäi ehjiksi, että jatkuvuus säilyi. Sitten veto vapautettiin ja jänteen vaurioitettu alue liuutettiin takaisin, jotta se jäi normaaliin tuppeen Proksimaalisen phalanxin distaaliseen kolmannekseen. Esillä olevan keksinnön mukaista geeliä levitettiin vaurioituneeseen alueeseen vapaasti. Nahka ommeltiin umpeen hienoilla katguttiompeleilla ja haavalle suihkutettiin aerosoli-kolloidonpeitettä.

• ·

Kun haava oli suljettu, laitettiin tiukasti paikoilleen sopiva kipsilasta ympäröimään koko kyseistä jäsentä ja tekemään sormet liikkumattomiksi. Kipsiä pidettiin paikoillaan kaikkiaan 24 vuorokautta, minkä jälkeen jäsen jätettiin vapaaksi.

4i 103868

Kaikissa leikkauksissa käytettiin aseptista tekniikkaa. Jänteitä käsiteltiin niin varovaisesti kuin mahdollista ja leikkauksissa käytettiin ainoastaan terävää leikkaus-veistä.

Kanit surmattiin korkeintaan 12 viikon välein. Leikattu sormi tutkittiin ensin huolellisesti leikkelymikroskoopin avulla ja havaittiin jänteen paranemisvaihe, kudosten reaktio vamman läheisyydessä ja kiinnikasvettumien läsnäolo tai vastaava. Sitten jänne poistettiin ympäröivien pehmeiden kudosten kanssa ja fiksattiin formolin 10 %:sessa suolaliuoksessa. Prosessoinnin ja upotuksen jälkeen leikattiin sarjassa pitkittäissektiot mikroskooppista tutkimusta varten. Sektiot värjättiin hematoxyliinillä ja eosiinilla, Jamesin hopeävärjäyksellä ja Halen kolloidisella rauta/PAS-värjäyksellä.

Claims (7)

103868

1. Menetelmä paikallisesti käytettävän, fibriinin saostumi- sen tai kiinnikkeen muodostumisen estävän farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että siihen lisätään terapeuttisesti tehokas määrä kudosplasminogeeniak-tivaattoria ("t-PA") joka saatetaan niukkaliukoiseen muotoon jonka jälkeen koostumus saostetaan kiinteäksi ja johon lisätään inerttiä kiinnitarttumista edesauttavaa apuainetta koostumuksen liukenemisominaisuuksien säätämiseksi halutulla nopeudella biologisessa nesteessä siten, että t-PA:n pitoisuus on noin 0,02 - 25 mg/g inerttiä kiinnitarttumista edesauttavaa apuainetta ja että kiinnitarttumista edesauttava apuaine on edullisesti geeli, vaseliini, polymeeri ja/tai hyaluronihappo.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se kykenee vapauttamaan kudosplasminogeeniaktivaattoria ajanjaksona, joka on kolmesta päivästä noin kymmeneen päivään .

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että inertti kiinnitarttumista edesauttava apuaine on vesiliukoinen.

4. Patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että inertti kiinnitarttumista edesauttava apuaine on puolikiinteä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että inertti kiinnitarttumista edesauttava apuaine on biologisesti kuluva polymeeri. 103868

6. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA:n pitoisuus on noin 0,125 - 2,5 mg/g inerttiä kiinnitarttumista edesauttavaa apuainetta.

7. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA:n pitoisuus on noin 0,25 - 1,0 mg/g inerttiä kiinnitarttumista edesauttavaa apuainetta. 103868