PT85589B - Processo para a preparacao de um adn que codifica uma proteina semelhante ao inibidor de plasmina alfa2 e para a preparacao da referida proteina - Google Patents

Description

*

Memória descritiva referente à patente de invenção de HOECHST JAPAN LIMITED, japonesa, indus trial e comercial, com sede em 10-16, 8-chome, Akasaka» Mina-to -kuToky o, Japão, (inventores: Masahide Tone, residente no Japãot Akiko Iwaki, residen te nos E.U.A., Reiko Kikuno, Tamotsu Hashimoto e Hiroshi Okazaki, residentes no Japão), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM ADN QUE CODIFICA PARA UMA PROTEÍNA SEMELHANTE AO INIBIDOR DE PLASMINA E PARA A PREPARAÇÃO DA REFERIDA PRO-TEÍNA".

MEMÓRIA DESCRITIVA

Titulo da Invenção

Processo para a preparação de um ADN que codi fica para uma proteína semelhante ao inibidor de plasmina oCg e para a preparação da referida proteína.

Base da invenção 1* Campo da invenção A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de um novo ADN o qual contém a informação , genética derivada de mARN que codifica para a proteína seme-* lhante a inibidor de Ç(g-Plasmina. - 1 - t

0 ADN da presente invenção pode ser utilizado para produzir uma proteína semelhante a inibidor de fl^-plasrai na de acordo com um processo que consiste em integrar num vec tor plasmídeo contendo um promotor de expressão sob a forma de um cADN descrito no Quadro 2 apresentado em seguida para expressar num hospedeiro como por exemplo em células animais. 2. Descrição do estado da técnica São conhecidas no plasma humano substâncias antagonistas da plasmina tais como ^"“B^^&lokulina, <^-anti tripsina» inibidor de &,-plasmina e antitrombina III. Entre eles, o inibidor de p^-plasmina ê uma substância muito importante devido à sua afinidade alta para com a plasmina apesar de sá existir em pequenas quantidades no plasma humano. A fi-brina formada durante o processo da coagulação do sangue é de composta pela acção da plasmina e o inibidor de plasmina apre senta actividade antagonista à acção da plasmina ligando-se com ela. Se for possível dispor do inibidor de plasmina em grandes quantidades por um baixo preço, poderá ser útil como agente anti-hemorrágica ou como um componente de um adesivo para tecidos orgânicos. 0 inibidor de «^“pla-sraina é uma glicoproteína de cadeia simples com um peso molecular de 65 000 a 70 000 e existe no plasma humano numa concentração tão baixa como 0,7 a 1 /ãM. Até agora ainda não foi isolado e clinicamente isolado . A sequência de ácidos aminados do inibidor de flfg-pi-anml110. foi parcialmente elucidada por H.R, Lijnen et al. (Literatura e outras referências descritas seguidamente).

Além disso, Fair, D.S. et al. elucidaram que uma pequena quantidade do inibidor de (Xg-pias mina é produzida no sobrenadante de um meio de cultura das células chamadas Hep Gr2, as quais são uma das linhas de células do cancro das células hepáticas humanas (j. Lab. Clin. Med., 101, P. 372 2 (1983)) W. E. Holmes et al. no Journal Cell Biochem. Suppl. 10A» 27^ relatam que um clone de cADN do inibidor de OC-pla smina foi obtido utilizando fígado humano como fonte de mAEN e que a sequência de ácidos aminados do inibidor de plasmina deduzida a partir do cADN foi oomparada com a sequên cia de ácidos aminados do inibidor de ι^-plasmina e substâncias relacionadas. Não há, no entanto, qualquer descrição par ticular da sequência base do cADN e de toda a sequência de ácidos aminados do inibidor de ^,-plasmina deduzida daí.

Apesar de o inibidor de 0tg-plasmina poder ser utilizado como agente anti-hemorrágico ou como componente de um adesivo para tecidos orgânicos mencionado acima, não ê co-merciálmente viável por causa da pequena quantidade em que es tá presente no plasma.

Breve descrição do desenho 0 desenho em anexo mostra o mapa da restrição enzimática do APHL obtido de acordo com o processo da presente invenção.

Sumário da invenção

Como resultado de amplos estudos para a obten ção de inibidor de 0^-plasmina ou de uma substância fisiològi oamente idêntica, foi levada a cabo a presente invenção.

De acordo com a presente invenção estabeleceu -se um processo para a preparação do seguinte novo ADNi l) ADN que codifica para uma proteína semelhante a inibidor de (Xg-pia smina humana com a seguinte sequência de ácidos

Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-

Leu-Leu-Ly s-Leu-Gly-Asn-Gln-Glu-Pro-Giy- - 3 -

Gly-Gln-Thr-Ala-Leu-Lys-Ser-Pro-Pro-Gly-

Val-Cys-Ser-Arg-Asp-Pro-Thr-Pro-Glu-Gln-

Thr-His-Arg-Leu-Ala-Arg-Ala-Met-Met-Ala-

Phe-Thr-Ala-Asp-Leu-Phe-Ser-Leu-Val-Ala-

Gln-Thr-Ser-Thr-Cys-Pro-Asn-Leu-Ile-Leu-

Ser-Pro-Leu-Ser-Val-Ala-Leu-Ala-Leu-Ser-

His-Leu-Ala-Leu-Gly-Ala-Gln-Asn-His-Thr-

Leu-Gln-Arg-Leu-Gln-Gln-Val-Leu-His-Ala-

Gly-Ser-Gly-Pro-Cys-Leu-Pro-His-Leu-Leu-

Ser-Arg-Leu-Cys-Gln-Asp-Leu-Gly-Pro-Gly-

Ala-Phe-Arg-Leu-Ala-Ala-Arg-Met-Tyr-Leu-

Gln-Lys-Gly-Phe-Pro-Ile-Lys-Glu-Asp-Phe-

Leu-Glu-Gln-Ser-Glu-Gln-Leu-Phe-Gly-Ala-

Lys-Pro-Val-Ser-Leu-Thr-Gly-Lys-Gln-Glu-

Asp-Asp-Leu-Ala-Asn-Ile-Asn-Gln-Trp-Val-

Ly s-Glu-Ala-Thr-Glu-Gly-Ly s-Ile-Gln-Glu-

Phe-Leu-Ser-Gly-Leu-Pro-Glu-Asp-Thr-Val-

Leu-Leu-Leu-Leu-Asn-Ala-Ile-Hi s-Phe-Gln-

Gly-Phe-Trp-Arg-Asn-Lys-Phe-Asp-Pro-Ser-

Leu-Thr-Gln-Arg-Asp-Ser-Phe-His-Leu-Asp-

Glu-Gln-Phe-Thr-Val-Pro-Val-Glu-Met-Met-

Gln-Ala-Arg-Thr-Tyr-Pro-Leu-Arg-Trp-Phe-

Leu-Leu-Glu-Gln-Pro-Glu-Ile-Gln-Val-Ala-

His-Phe-Pro-Phe-Lys-Asn-Asn-Met-Ser-Phe-

Vai-Vai-Leu-Vai-Pro-Thr-Hi s-Ph e-Glu-Trp-

Asn-Val-Ser-Gln-Val-Leu-Ala-Asn-Leu-Ser-

Trp-Asp-Thr-Leu-His-Pro-Pro-Leu-Vai-Trp-

Glu-Arg-Pro-Thr-Lys-Val-Arg-Leu-Pro-Lya- - k -

Leu-Tyr-Leu-Lys-His-Gln-Met-Asp-Leu-Val-Ala-Thr-Leu-Ser-Gln-Leu-Gly-Leu-Gln-Glu-Leu-Phe-Gln-Ala-Pro-Asp-Leu-Arg-Gly -Ile-Ser-Glu-Gln-Ser-Leu-Val-Val-Ser-Gly-Val-Gln-Hi s-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu-Leu-S er-Glu-Val-Gly-Val-Glu-Ala-Ala-Ala-Ala-Thr-Ser-IIe-Ala- Me t-Ser-Arg-Met-Ser-Leu-Ser-Ser-Ph e-Se r- Vai-Asn-Arg-Pro-Phe-Leu-Ph e-Ph e-Ile-Phe-Glu-Asp-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Leu-Phe- Vai-Gly-Ser-Vai-Arg-Asn-Pro-Asn-Pro-Ser-Ala-Pro-Arg-Glu-Leu-Lys-Glu-Gln-Gln-Asp-Ser-Pro-Gly-Asn-Lys-Asp-Phe-Leu-Gln-Ser-Leu-Lys-Gly-Phe-Pro-Arg-Gly-Asp-Lys-Leu-Phe-Gly-Pro-Asp-Leu-Lys-Leu-Val-Pro-Pro-Met-Glu-Glu-Asp-Ty r-Pro-Gln-Phe-Gly-Ser-Pro-Lys. ADN de acordo com a alínea l) tendo a seguinte sequência base AAC.CAG.GAG.OAG.GTG.TCC.CCA.CTT.ACC. CTC.CTC.AAG.TTG.GGC.AAC.CAG.GAG.CCT.GGT. G GC.CAG.ACT.GCC.CTG.AAG.AGT.CCC.CCA.GGA. GTC.TGC.AGC.AGA.GAC.CCC.ACC.CCA.GAG.CAG. ACC .CAC .AGG.CTG, GCC .CGG.GCC .ATG.ATG. GGC . TTC. ACT. GCC. GAC . CTG. TTC .TCC . CTG. GTG. GCT. CAA.ACG.TCC.ACC.TGC.CCC.AAC.CTC.ATC.CTG. TCA .CCC. CTG. AGT. GTG. GCC. CTG. GCG. CTG. TCT. CAC.CTG.GCA.CTA.GGT.GCT.CAG.AAC.CAC.ACG. - 5 - TTG. CAG. AGG. CTG. CAA. CAG. GTG. CTG. CAC . GCA. GGC.TCA.GGG.CCC.TGC.CTC.CCC.CAT.CTG.CTG. AGC.CGC.CTC.TGC.CAG.GAC.CTG.GGC.CCC.GGC. GCG.TTC.CGA.CTG.GCT.GCC.AGG.ATG.TAC.CTG. CAG.AAA.GGA.TTT.CCC.ATC.AAA.GAA.GAT.TTC. CTG.GAA.CAA.TCC.GAA.CAG.CTA.TTT.GGG.GCA. AAG.CCC.GTG.AGC.CTG.ACG.GGA.AAG.CAG.GAA. GAT.GAC.CTG.GCA.AAC.ATC.AAC.CAA.TGG.GTG. AAG. GAG. GCC. ACG. GAG. GGG. AAG. ATT. CAG. GAA. TTC.CTC.TCT.GGG.CTG.CCG.GAA.GAC.ACC.GTG. TTG.CTT.CTC.CTC.AAC.GCC.ATC.CAC.TTC.CAG. GGT.TTC.TGG.AGG.AAC.AAG.TTT.GAC.CCG.AGC. CTT,ACC.CAG.AGA.GAC.TCC.TTC.CAC.CTG.GAC. GAG.CAG.TTC.ACG.GTG.CCC.GTG.GAA.ATG.ATG. CAG.GCC.CGC.ACG.TAC.CCG.CTG.CGC.TGG.TTC. TTG.CTG.GAG.CAG.CCT.GAG.ATC.CAG.GTG.GCT. CAT.TTC.CCC.TTT.AAG.AAC.AAC.ATG.AGC.TTT. GTG.GTC.CTT.GTA.CCC.ACC.CAC.TTT.GAA.TGG. AAC.GTG.TCC.CAG.GTA.CTG.GCC.AAC.CTG.AGT. TGG.GAC.ACC.CTG.CAC.CCA.CCT.CTG.GTG.TGG. GAG.AGG.CCC.ACC.AAG.GTC.CGG.CTG.CCT.AAG. CTG.TAT.CTG.AAA.CAC.CAA.ATG.GAC.CTG.GTG. GCC.ACC.CTC.AGC.CAG.CTG.GGC.CTG.CAG.GAG. TTG.TTC.CAG.GCC.CCA.GAC.CTG.CGT.GGG.ATC. TCC.GAG.CAG.AGC.CTG.GTG.GTG.TCC.GGC.GTG. CAG.CAT.CAG.TCC.ACC.CTG.GAG.CTC.AGC.GAG. GTC.GGC.GTG.GAG.GCG.GCG.GCG.GCC.ACC.AGC. ATT.GCC.ATG.TCC.CGC.ATG.TCC.CTG.TCC.TCC. 6 f

f TTC .AGC .GTG .AAC .CGC .CCC .TTC . CTC . TTC .TTC . ATC.TTC.6AG.GAC.ACC.ACA.GGC.CTT.CCC.CTC. TTC .GTG.GGC .AGC .GTG.AGG.AAC .CCC ,AAC .CCC . AGT.GCA.CCG.CGG.GAG.CTC.AAG.GAA.CAG.CAG. GAT.TCC.CCG.GGC.AAC.AAG.GAC.TTC.CTC.CAG. AGC.CTG.AAA.GGC.TTC.CCC.CGC.GGA.GAC.AAG. CTT.TTC.GGC.CCT.GAC.TTA.AAA.CTT.GTG.CCC. CCC.ATG.GAG.GAG.GAT.TAC.CCC.CAG.TTT.GGC. AGC.CCC.AAG. A proteína semelhante a inibidor de pias mi na codificada pelo ADN preparado de acordo com o proeesso da presente invenção ê composta pelos 452 aminoácidos representa dos pela sequência acima mencionada» a qual ê idêntica à do inibidor de fl^-plasmina na maior porção da sequência de ácidos aminados. A sequência de ácidos aminados da proteína seme lhante a inibidor de 0^-plasmina identificada na presente invenção e, no entanto, diferente em parte da sequência parcial do inibidor de ^-plasmina descrito na literatura nos seguintes aspectos. (l) Enquanto que a proteína codificada no ADN da presente invenção contém so 4 cistinas, refere-se na literatura (Referên cia l) que existem 6 cistinas. (2) Ha diferenças em pelo menos 7 resíduos de ácidos aminados. (3) Enquanto que o grupo carboxilo final do inibidor de &Ç-piasmina 4 descrito como sendo a sequência de ácidos aminados fenilalanina-leucina (h.R. Lijnen et al«, Thtomb Haemostas (Estugarda) 48 (3)» 311-314 (1982)), o grupo carboxilo final da proteína codificada no ADN da presente invenção ê prolina--lislna.

No entanto, como a sequência dos ácidos amina - 7 - f

t dos é na sua maior parte idêntica â descrita na literatura, crê-se que a proteína codificada no ADN da invenção tem pelo menos uma estrutura similar à estrutura do inibidor de (Xg-plas mina humano.

Além disso existem algumas sequências na sequência de ácidos aminados deduzida na presente invenção nas quais pode ocorrer uma glicosilação corno* por exemplo, Asn-X--Ser ou Asn-X-Thr sugerindo desse modo que os sacarídeos estão ligados nessas porções.

Em primeiro lugar isolaram-se m-ARNs de células Hep G2 (ATCC HB8O65) conhecidas como produtoras de inibidor de P^-plasmina. Preparou-se um banco de cADN utilizando os m-ARNs como padrão. 0 banco de cADN acima mencionado foi sujeito a uma selecção com uma sonda (Quadro l) que consiste num ADN que codifica para uma porção da sequência de ácidos aminados do inibidor de C^-plasmina, a qual foi parcialmente elucidada por H.R. Lijner et al., para dar um clone de cADN chamado λΑΡΗ3^ que forma um híbrido com a referida sonda.

Separadamente sujeitou-se a selecção empregan do a mesma sonda um banco de cADN de fígado humano obtenível comercialmente da Companhia Toyo Boseki K.K. para dar um clone de cADN chamado λΑΡΕΙ que contém um fragmento inserido de cADN que hibrida com a sonda.

Apos determinação das sequências de ADNna por çâo onde os dois clones tinham hibridado com a sonda e na vizinhança desta porção, coneluiu-se que os fragmentos de cADN derivados dos dois clones estavam numa relação de acordo com a indicação do desenho, produzindo desse modo um APHL de cADN de cadeia completa. A sequência base da cadeia cADN de APHL é epr e sentada no Quadro 2. 8

Quadro 1

Preparação da sonda de ADN

Gln-Glu-Asp-Asp-Leu-Ala-Asn-Ile-Asn-Gln-Trp-Val-Lys-Glu

5'-G GAG GAC GAC CTG GCC AAC ATC AAC CAG TGG GTG AAG GAG

31 -AGGTC CTC CTG CTG GAC CGG TTG TAG TTG GTC ACC CAC TTC CTC

PstX -Ala-Thr Glu-Gly-Lys-Ile-Gln-Glu-Phe GCC ACC GAG GGC AAG ATC CAG G-3' CGG TGG CTC CGG TTC TAG GTC CTT ΑΑ-5'J—> Porção da sonda

EcoRI - 9 - f

Zkx

GAA TTC CGG CTG GCA GGG GAG AÀC * 25 69 * ATG .GCG.CTG.CTC .TGG.GGG.CTC .CTG .GTG.CTC ,AGC .TGG.TCC .TGC .CTG Met-Ala-Leu-Leu-Trp-Gly-Leu-Leu-Val-Leu-Ser-Trp Ser-Cys-Leu x 70 13Ax CAA.GGC .CCC .TGC .TCC .GTG.TTC .TCC .CCT.GTG.AGC .GCC .ATG.CAG.CCC Gln-Gly-Pro-Cys-Ser-Val-Phe-Ser-Pro-Val-Ser-Ala-Met Glu-Pro x 115 159* TTG.GGC.TGG.CAG.CTA.ACT.AGC.GGG.CCG.AAC.CAG.GAG.CAG.GTG.TCC Leu-Gly-Trp~Gln-Leu-Thr-Ser-Gly-Pro-Asn-Gln-Glu-Gln-Vai-Ser x 160 zohx GCA.CTT.ACC.CTC.CTC.AAG.TTG.GGC.AAC.CAG.GAG.CCT.GGT.GGC.CAG Pro-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Leu-Gly-Asn-Gln-Glu-Pro-Gly-Gly-Gln s 205 249* ACT.GCC.CTG.AAG.AGT.CCC.CCA.GGA.CTC.TGC.AGC.AGA.GAC.CCC.ACC Thr-Ala-Leu-Ly s-Ser-Pro-Pro-Gly-Val-Cys-Ser-Arg-Asp-Pra-Thr x 250 294* CCA.GAG.CAG.ACC.CAC.AGG.CTG.GCC.CGG.GCC.ATG.ATG. GCC.TTC.ACT Pro-Glu-Gln Thr His-Arg-Leu-Ala-Arg-Ala-Met-Met-Ala-Phe-Thr x 295 339* GCC .GAC . CTG.TTC .TCC . CTG. GTG. GCT.CAA. ACG.TCC . ACC. TGC . CCC . AAC Ala-Asp-Leu-Phe-Ser-Leu-Val-Ala-Gln-Thr-Ser-Thr-Cys-Pro-Asn x 3^0 384x CTC . ATC . CTG. TC A. CCC . CTG. AGT. GTG. CCC . CTG. GCG. CTG. TCT. C AC . CTG Leu-Ile-Leu-Ser-Pro-Leu~Ser-Val-Ala-I*eu-Ala-Leu-Ser-His-Leu x 385 ^29* GCA.CTA.GGT.GGT.CAG.AAC.CAC.ACG.TTG.CAG.AGG.CTG.CAA.CAG.GTG Ala-Leu-Gly-Ala-Gln-Àán-Hls-Thr-Leu-Gln-Arg-Leu-Gln-Gln-Val x 430 k7hx CTG.CAC.GCA.GGC.TCA.GGG.CCC.TGC.CTC.CCC.CAT.CTG.CTG.AGC.CCC Leu-Hls-Ala-Gly-Ser-Gly-Pro-Çy s-Leu-Pro-Hi s-Leu-Leu-Ser-Arg ^75 519* CTC.TGC.CAG. GAC.CTG. GGC.CCC.GGC.GCG.TTC.CGA.CTG.GCT.GCC.AGG Leu-Cys-Gln-Asp-Leu-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Arg-Leu-Ala-Ala-Arg 520 564x ATG.TAC.CTG.CAG.AAA.GGA.TTT. CCC.ATC.AAA.GAA.GAT.TTC.CTG.GAA Met-Tyr-Leu-Gln-Lys-Gly-Phe-Pro-Ile-Lys-Glu-Asp-Plie-Leu-Glu 10

* 565 CΑΑ. TC C . GAA. CAG. CTA. TTT. GGG. GC A. AAG. CC C.GTG. AGC . CTG. ACG. GGA Gln-Ser-Glu-Gln-Leu-Phe-Gly-Ala-Lys-Pro-Val-^er-Leu-Thr-Gly x 610 654* AAG. C AG. GAA. GAT. GAC. CTG. GC A. AAC. ATC. AAC . C AA. TGG. GTG. AAG. GAG Lys-Gln-Glu-Asp-Asp-Leu-Ala-Asn-Ile-Asn-Gln-Trp-Val-Lys-Glu x 655 699* GCC .ACG.GAG.GGG.AAG.ATT.CAG.GAA.TTC .CTC .TCT.GGG.CTG.CCG.GAA Ala-Thr-Glu-Gly-Lys-Ile-Gln-Glu-Phe-Leu-Ser-GIy-Leu-Pro-Glu x 700 744* GAC . ACC .GTG.TTG*CTT·CTC .CTC .AAC .GCC .ATC .CAC .TTC .CAG.GGT.TTC Asp-Thr-Val-Leu-Leu-Leu-Leu-Asn-Ala-Ile-His-Phe-Gln-Gly-Phe x 7^5 789* TGG.AGG.AAC.AAG.TTT.GAC.CCG.ACC.CTT.ACC.CAG.AGA. GAC.TGC.TTC Trp-Arg-Asn-Ly s-Ph e-Asp-Pro-Ser-Leu-Thr-Gln-Arg-Asp-Ser-Phe * 790 834x CAC ; CTG. GAC . GAG. CAG. TTC . ACG. GTG. CCC .GTG. GAA. ATG. ATG. CAG. GCC His-Leu-Asp-Glu-Gln-Phe-Thr-Val-Pro-Val-Glu-Met-Met-Gln-Ala x 835 879* CGC . ACG.TAC .CCG. CTG. CGC . TGG. TTC . TTG. CTG. GAG. CAG. GCT. GAG. ATC Arg-Thr-Tyr-Pro-Leu-Arg-Trp-Phe-Leu-Leu-Glu-Gln-Pro-Glu-Ile »880 924* CAG.GTG.GCT.CAT.TTC.CCC.TTT.AAG.AAC.AAC.ATG.AGC.TTT. GTG.GTC Gln-Val-Ala-His-Phe-Pro-Phe-Lys-Asn-Asn-Met-Ser-Phe-Vai-Vai x 925 969* CTT.GTA.CCC.ACC.CAC.TTT.GAA.TGG.AAC.GTG.TCC.CAG.GTA.CTG.GCC Leu-Val-Pro-Thr-His-Phe-Glu-Trp-Asn-Val-Ser Gln-Val-Leu-Ala * 970 1014* AAC . CTG. AGT.TGG. GAC . ACC . CTG. CAC . CCA. CCT. CTG. GTG. TGG. GAG. AGG Asn-Leu-Ser-Trp-Asp-Thr-Leu-His-Pro-Pro-Leu-Val-Trp-Glu-Arg * 1015 1059» CCC.ACC.AAC.GTC.CGG.CTG.CCT.AAG.CTG.TAT.GTG.AAA.CAC.CAA.ATG Pro-Thr-Lys-Val-Arg-Leu-Pro-Lys-Leu-Tyr-Leu-Lys-His-Gln-Met x 1060 1104* GAC.CTG.GTG.GCC.ACC.CTC.AGC.CAG.CTG.GGC.CTG.CAG.GAG.TTG.TTC Asp-Leu-Val-Ala-Thr-Leu-Ser-Gln-Leu-Gly-Leu-Gln-Glu-Leu-Phe * 1105 ll49x CAG . GCC . CCA .GAC .CTG. CGT .GGG. ATC . TCC.GAG. CAG. AGC . CTG. GTG .GTG Gln-Ala-Pro-Asp-Leu-Arg-Gly-Ile-Ser-Glu-Gln-Ser-Leu-Val-Val K1150 1194* TCC .GGC .GTG.CAG.CAT.CAG.TCC .ACC .CTG.GAG.CTC .AGC .GAG.GTC .GGC ] Ser-Gly-Val-Gln-His-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu-Leu-Sar-Glu-Val-Gly 11

χ 1195 GTG.GAG.GCG.GCG.GCG. GCC.ACC.AGC.ATT.GCC.ATG.TCC.CGC.ATG.TCC Val-Glu-Ala-Ala-Ala-Ala-Thr-Ser-Ile-Ala-Met-Ser-Arg-Met-Ser x 124o 1284* CTG.TCC.TGC.TTC.AGC.GTG.AAC.CGC.CCC.TTC.CTC.TTC.TTC.ATC.TTC Leu-Ser-Ser-Phe-Ser-Val-Asn-Arg-Pro-Phe-Leu-Phe-Phe-Ile-Phe x 1285 1329x GAG. GAC. AC C. AC A. GGC . CTT. CCC . CTC . TTC . GTG. GGC . AGC . GTG. AGG. AAC Glu-Asp-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Leu-Phe-Val-Gly-Ser-Val-Arg-Asn x 1330 1374* CCC.AAC.CCC.AGT.GCA.CCG.CGG.GAG.CTC.AAG.GAA.CAG.CAG.CAT.TCC Pro-Asn-Pro-Ser-Ala-Pro-Arg-Glu-Leu-Ly s-Glu-Gln-Gln-Asp-Ser x 1375 l4l9x CCG.GGC.AAC.AAC.GAC.TTC.CTC.CAG.AGC.CTG.AAA.GGC.TTC.CCC.CGC Pro-Gly-Asn-Ly s-Asp-Phe-Leu-Gln-Ser-Leu-Ly s-Gly-Ph e-Pro-Arg x 1420 1464* GGA.GAC.AAG,CTT.TTC.GGC.CCT.GAC.TTA.AAA.CTT.GTG.CCC.CCC.ATG Gly-Asp-Lys-Leu-Phe-Gly-Pro -Asp-Leu-Lys-Leu-Val-Pro-Pro-Met x 1465 1509x GAG.GAG.GAT.TAC.CCC.CAG.TTT.GGC.AGC.CCC.AAG.TGA.GGG.GCC.GTG Glu-Glu-Asp-Tyr-Pro-Gln-Phe-Gly-Ser-Pro-Lys-xxx-Gly-Ala-Val x 1510 1554* GCT. GTG. GCA. TCC . AGA .GTG. CCT. GCC.TGG. ACC . AGC . CTC . TCC. ACT. CAT Ala-Vai-Ala-Ser-Arg-Vai-Pro-Ala-Trp-Thr-Ser-Leu-Ser-Thr-His * 1555 1599x

GTG . ACT. CTT. TCC. AAC. CTG. CTT. TGT. GGC. ACT. GGG. GCA. GGG. GCC. GGG νθ.1-Τ1ΐΓ-][*βα-8βΓ-Α8η-Ιίβα-Ε»βιτ·^8-ΰ^-Τ1ΐΓ-0^-Α1α-&^-Αΐβ-0^ x 1600 1644* GGC . AGT. CTG. AGA. GAG. GCC . ATT. CTT. TCC . CAA. OAC . CTC . TTG. GGG. AGT Gly-Ser-Leu-Arg-Glu-Ala-Ile-Leu-Ser-Gln-His-Leu-Leu-Gly-Ser x 1645 l689x TTA. GGG .TGG.GGG. GGG. GCG .GGG.CTG. GGA .GGA.GGG.GAG. GCA.TCG. GGG Leu-Gly-Trp-Gly-Gly-Ala-Arg-Leu-Gly-Gly-Gly-Gln-Ala-Ser-Gly x 1690 1734x AGC.CGG.GAG.CGT.GAC.CCT.CAT.CTT.TCT.TCC.AAA.CAG.GCT.CAG.AGG Ser-Arg-Glu-Pro-Asp-Pro-His-Leu-Ser-Ser-Ly s-Gln-Ala-Gln-Arg x 1735 1779x GTG.TCC.TGC.ACC.GGG.GCC.TGG.GCA.GGA.GGG.AGG.TGC.TTC.TAG.TTC Val-Ser-Cys-Thr-Gly-Ala-Trp-Ala-Gly;-Gly-Arg-Cys-Phè-x*x-Phe 12 ϊ ϊ

χ 1780 TGC.CAG.GAG.ACA.GGT.TAG.CTG.CTC.CCC.ACG.TCA.GCT.GGG.ACA.CCC Cys-Gln-Glu-Thr-Gly-xxx-Leu-Leu-Pro-Thr-Ser-Ala-Gly-Thr-Pro x 1825 1869* CGA.CTT.TTG.TTT.ACC.AGA.GAA.AAA.GGG.AGG.GGG.AGA.GGG.CTG.CCT Arg-Leu-Lett-Phe-Thr-Arg-Glu-Lys-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Leu-Pro * 1870 19l4x TTG. GAC .TTG.TCC .CGG.GAC .ACC .TAG. GCT.AGG. GTG. GGG.AGA .GAC .GGG Leu-Asp-Leu-Ser-Arg-Asp-Thr-xxx-Ala-Arg-Val-Gly-Arg-Asp-Gly * 1915 1959* CCC.TGG,TGG.TGG.CTC.GGG.AGG.CGA.ACG.TTG.TCC.TCA.GCC.CCG.CGT Pro-Trp-Trp-Trp-Leu-Gly-Arg-Arg-Thr-Leu Ser-Ser-Ala-Pro-Arg * 196o 2Q04x GGA.ACT.CGT.GTC.TGG.CAC.AGC.CTG.GCT.GTG.GCC.TAA.CGT.GCC.GAG Gly -Thr- Arg- Vai -Trp-Hi s - S er-^eu- Ala - Vai - Ala - xxx - Pro Ala-Glu x 2005 20^9* AGT.CCA.TCA.GCC.TCC,ATC.CTA.CCC.CCT.GTG.CCT.TGT.CAC.GCC.AGA Ser-Pro-Ser-Ala-Ser-Ile-Leu-Pro-Pro-Val-Pro-Cys-His-Ala-Arg x 2050 209^* CTT.CCC.ACG.GCT.CCT.CGA.GAT.CCC.AAC.ACT.GCC.AGC.ATT,TCC.CTT Leu-Pro-Thr-Ala-Pro-Arg-Asp-Pro-Asn-Thr-Ala-Ser-Ile-Ser-Leu x 2095 2139* CCT.TCC.TCT.CCT.GTC.TCC.CTC.CTC.TGC.CCG.GGA.GCT.CAG.GAA.CCG Pro-Ser-ser-Pro-Val-Ser-Leu-Leu-Cys-Pro-Gly-Ala-Gln-Glu-Pro x 2140 2184* AGG.CAG.GGA.AGG.ATC.CCA.TGA.GCT.CCT.TAA.GGC.TCT.TTT.GTA.AGG Arg-Gln-Gly-Arg-Ile-Pro-xxx-Ala-Pro-xxx-Gly-Ser-Phe-Val-Arg x 2185 2229* TTT.TTG.TAG.TGA.TTT.TTA.TGC.CAC.CTG.AAT.AAA.GAA.TGA.ATG.GGC Phe-Leu-xxx-xxx-Phe-Ltu-Cys-His-Leu-Asn-Lys-Glu-xxx-Met-Gly x 2230 AAA.AAA.AAA.AAA.AAA.AAA.AAA.GGA.ATT. Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Gly-Ile 0 número na Tabela é o número da base marcada x. 13 - t

Na sequência de base, as posições de nucleáti dos de 1 a 6 representam o sítio EcoRI derivado do ligante EcoRI utilizado na clonagetn, e as posições de 7 a 2^ represen tam a área não codificante. As posições de 25 a l4l representam a porção peptídica observada somente no percursor do ini-bidor de ΰ^-plasmina (chamada a porção âncora ou porção de se quSncia guia)· A sequência entre as posições 142 e 1497 é a porção que codifica para a substância pretendida semelhante a inibidor jX^-plasmina. A sequência TGA nas posições 1498 a 1500 é o codão de paragem. A sequência depois da posição 1501 é a área nãç codificante 3'» a sequência AATAAA nas posições 2212 a 2217 é o sinal de adição de poli A e ã sequência de poli A depois da posição 2250 é a área derivada da extremidade poli A, a qual normalmente existe em ÂRN mensageiro. A sequência de nucleátidos entre 2251 e 2256 é o sítio EcoRI derivado do ligante EcoRI empregado para a clonagem. 0 processo da presente invenção para a preparação do ADN descrito pode ser concretizado, por exemplo, pelo método apresentado seguidamente.

Cultivou-se a linha de células Hep G2 de acor do com o método convencional, e das células cultivadas foi se parado pelo método de isocianato de guanídio/cioreto de césio todo o ARN a partir do qual se isolou um ARN mensageiro de po li A por coluna de cromatografia de oligo dT. Poi construido um banco de cADN, o qual é complementar do ARN mensageiro de poli A, pelo método empregando Xgtll, foi transfectado para E. coli (Υ19θ) e em seguida foi cultivado.

Poi preparada uma sonda sintética descrita no Quadro 1, a qual é complementar da sequência de ADN correspon dente à sequência de ácidos aminados do Quadro 1 descrita por H.R. Lijnen et al. em Thromb Haemostas (stuttgart) 48 (3)1 311-314 (1982) como uma sequência parcial de ácidos aminados de inibidor de tfg-plasmina. Foram seleccionadas placas positi . vas utilizando a sonda. As placas foram cultivadas, tratadas - 14 - τ tf« sequência d· base* as posições d» nucleáti dse d· 1 a 6 representam o sítio EcoJU derivado do ligante fiooRI utilizado na clonagem* · as posições dt 7 a 2l represen tam a área não codifieante* As posições d* 25 a l*H representa» a porção peptídica observada somente no percursor do ini-bidor de Ag- pias nina {chamada a porção âncora ou porção de se qulneia guia;· A «equlncia entre as posições 1^2 e lh97 é a porção que codifica para a substância pretendida semelhante a inibidor /^-plaamina. A sequência TGA nas posições 1498 a 153 > I o eodão de paragem· A sequência depois da posição 1501 I a área não codifieante 3% a sequência ΑΛΤΑΑΑ nas posições 2212 a 2217 * o sinal de adição de poli A e a sequência de poli A depois da posição 2250 I a área derivada ua extremidade poli A* a qual normalmente existe em ARK mensageiro· A sequência de nucleátidos entre 2251 e 2256 é o sítio £coΙΪΧ derivado do ligante Ecofti empregado para a olonagem· 0 processo da presente invenção pana a preparação do AON descrito pode ser concretizado» por exemplo, pelo método apresentado seguidamente.

Cultivou-se a linha de células Hep >2 de acor do com o método convencional* e das células cultivadas foi se parado pelo método de isocianato de guanídio/cloreto de césio todo o A RN a partir do qual se isolou um AHN mensageiro de po li A por coluna de cromatografia de oligo dT. Foi con truido um banco de cAdK» o quel é complementar do ARN mensageiro de poli A* pelo método empregando ^gtll* foi transfeetado para Γ. ooli (YI90) § em seguida foi cultivado. 'oi preparada uma sonda sintética descrita no quadro 1* a qual é complementar da sequência de Ai)N eorre jp m dente & e -(uência de ácidos a minado-h do 'uadro 1 descrita por Η.Π* iijnen et al· em Thromb ílaemostas (Stuttgart) 48 (3), 311-31¾ (1982) como uma se^ência parcial de ácidos amlnados de inibidor de p^-plasmina* Foram seleccionadas nlacas positi . vas utilizando a sonda. As placas foram cultivadas» tratadas - l4 -

da maneira convencional e foram então digeridos os genomas fá gicos com EcoRI para produzir o fragmento de cADN de λΑΡΗ3^·»

Separadamente» um banco de cADN de fígado humano, comercialmente acessível da companhia Toyo Boseki K.K», designado por cADN de fígado humano (Agtll), foi sujeito a um processo de selecção utilizando a sonda do Quadro 1, e o ADN do genoma fágieo (XAPLl) resultante foi digerido com EcoRI» 0 APHL do fragmento de cADN pretendido foi preparado por fusão dos dois fragmentos de cADN (XAPH3^ e XAPLl) obtidos. No desenho junto é apresentado o mapa de restrição por enzimas do APHL. A presente invenção será descrita mais em por menor através dos seguintes exemplos:

Exemplo 1

Isolamento do ARN mensageiro A estirpe de células Hep G2 foi recebida da American Type Culture Colleotion (designada abreviadamente por MATCC”) e foi utilizada (Registo No. ATCC HB8065).

Foi confirmado por análise radioimunologica (chamada abreviadamente MRIAW) que a estirpe de células Hep G2 produz realmente inibidor de fl^-plasmina. Com efeito, anti corpos inibidores de dg-plasmina anti-humana de coelho recebi dos da Behringwerke A.G., Alemanha Ocidental, foram marcados com ^-2i>l jjg acor(jo com o método convencional e levou-se a efed. to uma RIA do sobrenadante de uma cultura de células Hep G2. Mo quinto dia da cultura de células Hep G2, um certo número de células atingiu 1,5 x 10' por placa de cultura (0 9 cm), quer dizer, o estádio confluente que nesse momento continha no sobrenadante inibidor de ot^-plasmina numa contagem total de 1380 cpm (base de O a 16 cpm) e numa quantidade de 190 ng/ . ml. Na base do progresso da quantidade de inibidor de d^-plas * mina no sobrenadante das células Hep G2 decidiu-se recolher - 15 -

cerca do dia 2 após o início da cultura as células Hep G2 que se esperava que contivessem a maior quantidade de um ABN mensageiro que codifica para a referida proteína, quer dizer, 6 quando o náraero das células foi de 4 x 10 por cápsula de cul tura (estádios logarítmicos iniciais), fcromeadamente, utiliza- 6 ram-se como fontes de ARN 4 x 10 células/cápsula de cultura x 40 cápsulas, i.e. 1 x 10 do ndmero total das células. Para recolher as células para as cápsulas de cultura, o fluido de cultura foi removido por aspiração e as células aderentes à superfície foram suspensas em solução GTC (uma solução aquosa composta por isotiocianato de guanidínio 6 M, citrato de sódio 5 mM, 0,5 % de sarcosina e A-mercaptoetanol 0,1 M) e reti radas. A suspensão de células em GTC foi passada três vezes por uma seringa de diâmetro 18 para destruir as células.A sus pensão de células destruídas (7 ml) foi despejada sobre 3 ml de uma solução de CsCl 5#7 M-EDTA 0,1 M e a mistura foi een-trifugada a 35 000 rev./min a 20°C durante 20 horas. As frac-ções de ARN de uma densidade mais alta foram recolhidas à superfície do tubo de centrifugação sob a forma de aglomerados. 0 aglomerado de ARN foi lavado uma vez com solução de guanidi na 8 M-acetato de sódio 10 mM (pH 5»2)-ditiotreitol (DTT) 1 mM e uma vez com uma solução de etanol a 75 $ e finalmente guardado numa solução de etanol a 75 $ contendo acetato de só dio 0,3 M (pH 5»2) a -80°C. 0 rendimento foi de 2,8 mg em ter mos do ARN das 1,6 x 10 células. 0 método de isocianato de guanidínio/cloreto de césio empregado anteriormente foi levado a cabo de acordo com "Molecular Cloning-A Laboratory Manual" (editado por Maniatis, T. et al. (1982) publicado por Cold Spring Harbor Laboratory), p. 196 e seguintes. Obtiveram -se deste modo 50 pg de ARN de poli A a partir do ARN total por cromatografia em coluna de oligo dT-celulose (manufactora da por Sigma) de acordo com os métodos convencionais.

Exemplo 2

Preparação do banco de Hep G2

Preparou-se um banco de cADN a partir do ARN - 16 -

mensageiro de poli A derivado das células Hep G2 obtidas no Exemplo 1 pelo método de Watson et al. /Referência: Glover, D. M. ed. "DNA cloning, vol. 1” (1985) , publicado por IRL Press Oxford/Washington D.C.; pags. 79-881.

Em 10 ^al de H20 foram dissolvidos 10 pg do ARN mensageiro poli A derivado de Hep G2. A solução foi aquecida a 65°C durante 5 min. e rapidamente arrefecida em gelo para desnaturar o ARN. A solução de ARN foi preparada a uma concentração final de 50 mM Tris. HC1 (pH 8,3)» 8 mM MgCl,, e 50 mM KC1, k mM cada dos dATP, dGTP e dTTP e 10 mM de DTT, e 60 unidades de um inibidor de ribonuclease RNasin (obtido de Takara Shuzo), 2 pg de oligo (dT). 1ft (obtido de Pharmacia) como iniciador, 10 pCi de Cfi p-dCTP (obtido de Amersham) como traçador e 100 unidades de transcriptase reserva (obtido de Takara Shuzo) para um volume líquido final de 100 pl, A solução reagiu a h2°C durante 2 horas para sintetizar AON, o qual era completamente do mARN (ADN complementar da primeira cadeia). A reacção foi levada a cabo por adição sucessiva à mis tura de reacção de 5 pl de EDTA 0,5 M (pH 8,0), 2,5 pl de SDS a 10 % (dodecilsulfato de sódio) , 50 ^il de f enol e 50 pl de clorofórmio. Adicionou-se à mistura de reacção (camada aquosa) um volume igual de acetato de amónio k M e quatro volumes de etanol para precipitar híbridos cADN-ARN. Repetiu-se a repre-cipitação dos hídridos por etanol seguida de dissolução em so lução TE (Tris-HCl 10 mM» pH 8,0, EDTA 1 mM)* Os precipitados dos híbridos cADN-ARN foram dissolvidos em 30 pl de TE e então a cadeia de ARN do híbrido cADN-ARN foi substituida por uma segunda cadeia de cADN da maneira descrita em baixo. A so lução do híbrido cADN-ARN foi preparada numa concentração final de HEPES de 100 mM (pH 7,6), MgClg h mM, /9-mercaptoetanol 1*5 mM e KC1 67,5 mM e cada um de dATP, dCTP, dGTP 0,5 mM, β--ADN 0,15 mM e 10 pCí de Op^-dCTP como marcador e 150 unidades de ADN-polimerase de E. coli I (obtido de Takara Shuzo) e 50 unidades de RNase IX (obtido de Takara Shuzó) para um volu me líquido final de 100 ^il. A mistura resultante foi feita reagir a l4°C durante 1 hora. 0 fim da reacção foi efectuado - 17 -

da mesma maneira como na síntese do cADN de primeira cadeia e por fim os cADNs de cadeia dupla foram precipitados por adição de um volume igual de acetato de amónio h mM e quatro volumes de etanol a -70°C. Ambas as extremidades dos ADNs de ca deia dupla foram sujeitos a uma reacção de preenchimento com ADN-polimerase T^· (obtido de Takara Shuzo) na presença de 0,7 mH de cada um de dATP, dCTP, dGTP e dTTP a fim de produzir ex tremidades não salientes. Levou-se a efeito uma metilação dos cADNs de dupla cadeia com 5 unidades de metilase de EcoRI (ob tido de Bethesda Res. Lab.) para proteger os sítios EcoRI da digestão por EcoRI e em seguida adicionou-se ligante de EcoRI (obtido de Takara Shuzo) com 200 unidades de ADN-ligase T4 (obtido de Takara Shuzo) às duas extremidades do cADN de cadeia dupla e por fim o EcoRI ligante foi cortado e removido com 200 unidades de EcoRI. Foi então preparado na série de re ações, um cADN de cadeia dupla contendo sítios EcoRI em ambas as extremidades. Os cADNs de dupla cadeia foram inseridos em genomas de fagos por utilização de um sistema de clonagem lam bda gtll (obtido de Seikagaku Kogyo sob a marca registada de Profcoclone GT). 0 cADN de cadeia dupla deste modo preparado com sítios EcoRI em ambas as extremidades foi ligado com um vector Agtll digerido com EcoRI por meio de ADN-ligase T^.Rea lizou-se um acondicionamento num fago utilizando um sistema de acondicionamento de ADN (marca registada Packagens®)para infectar o E. coli hospedeiro Y1090 (uma estirpe deficiente em protease intracelular, obtido de Seikagaku Kogyo ligada a gom Protoclone T>W) para construir um banco de cADN que con-κ siste em 2 x 10 fagos.

Exemplo 3

Selecção através da sonda sintética

Sintetizou-se uma sonda de oligonucleótido de 69 bases com um sintetizador de ADN automático (Quadro l) cor respondendo a uma extensão de 23 resíduos de ácidos aminados de acordo com a sequência parcial de ácido aminado do inibi- 18

dor de OC,-pias mina publicado por Lijnen et al. (Thromb Ha e mos tas (Estugarda) 48, (1982), pp. 311-314, op. cit.) e utilizou--se esta sonda. A sonda sintética, que foi sintetizada em con junto com uma cadeia complementar e planeado de tal maneira que as duas extremidades são um sítio EcoRI e um sítio PstI, foi inserida entre o sítio EcoRI e o sítio PstI do vector de clonagem M13-mpl9 comercialmente obtenível de Takara Shuzo. 0 ADN M13 reoombinante de cadeia simples foi preparado e foi 32 sintetizado uma cadeia complementar marcada com p por exten são iniciadora utilizando um iniciador sintético (também obti do de Takara Shuzo) e uma enzima de Klenow (Takara Shuzo) na

OO presença de CL- p-dCTP (Amersham, 3000 Ci/mmol). Poi digerido com o EcoRI e o PstI e sujeito a electroforese com 10$ de gel sequenciador de poliacrilamida. A banda de ADN da sonda maroa 32 da p detectada por autoradiografia foi isolada e purificada por electroeluição (170 V, durante a noite). A selecção do banco de cADN por utilização de sonda sintética marcada foi efectuada por hibridação em placa. Seguiu-se um método de acor do com a literatura "Molecular Cloning-A Laboratory Manual" (op. cit.), p. 326 e seguintes. Lavou-se com uma solução de pré-lavagem (50 mM Tris -HCL (pH 8,θ), 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 $ SDS) a 42°C durante 1 hora um filtro de nitrocelulose (0 82 mm) ligado a placa. Em seguida foram colocadas em sacos de plástico 4 folhas do filtro de nitrocelulose, adicionando--se 12 ml por saco de uma solução de pré-hibridação (50 $ de formamida, 5 x solução de Denhardt, 5 x SSPE, SDS a Ó,1 $, 100 g/ml de ADN de esperma de salmão degradado). Os sacos foram selados a quente e os filtros de ADN foram incubados a 42° C. A solução de pré-hibridação foi removida do saco, adicionando-se 10 ml por saco de solução de pré-hibridação fresca e / 32 300 μΐ da solução de sonda de ADN sintético marcado com p depois de desnaturação pelo calor a 100°C durante 5 min. e ar refecendo-se rapidamente. Poi realizada uma hibridação a 42°C durante 2 noites. Os filtros de nitrocelulose depois da hibri * dação foram lavados quatro vezes com solução de 6 x SSC à tem ^ peratura ambiente durante 10 min e duas vezes com solução de - 19 -

2 x SSC/0,1 % de SDS a 42°C durante 3o min e ar seco num filtro. Foi executada uma radiografia utilizando uma película de raios X (obtida de Fuji Film) durante a noite a -70°C.

Foram assim obtidos jh clones com sinais de moderado a forte. Através da determinação da sequência de ADN parcial, foi obtido um clone que contém um fragmento de cADN de 670 pb que codifica para o inibidor de C^-plasmina (chamado ΛΑΡΗ34). Simultaneamente uma selecção similar foi efectua-da com um banco de cADN de fígado humano obtenível de Toyo Bo seki, assim se obtendo 8 clones com a mesma sonda sintética. Supds-se que os 8 clones seriam clones irmãos com base nas análises de restrição.

Exemplo 4

Preparação de cADN com o comprimento integral do inibidor de pias mina 0 fragmento EcoRI inserto de AAPH3*l· obtido do banco de cADN G2 Hep e o fragmento EcoRI inserto (1570 pb de comprimento) de AA.PL1 obtido do banco de cADN de fígado humano foram fundidos para preparar APHL, o qual codifica para a proteína integral semelhante a inibidor 0C,-plasmina. 0 fragmento APHL foi inserido no sítio EcoRI do vector plasmídeo pHSG 299 (apresentado por Sato et al. de Hoechst Japan Ltd. na Conferência Anual de 1985 da Sociedade de Biologia Molecular do Japão (2-5 de Dezembro de 1985) o qual apresenta resis tência à Canamicina derivada do transposão Tn903 (Referenciai Oka» A. et al.t J* Mol. Biol. (l98l). 1^8. 217-226) e um poli ligante derivado de pUC19 (obtido de. Takara Shuzo) e o plasmí deo resultante foi designado por ρΛΑΡ3· 0 hospedeiro E. coli K12/0m 2lh foi transcrito com o plasmídeo ρθ£ΑΡ3· 0 E. coli transformado com o plasmídeo p#AP3 contendo APHL foi deposita do no Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology sob o número FERM BP-1350. Apresenta--se na figura anexa o mapa de restrição por enzimas do APHL. - 20 -

Exemplo 5

Determinação da sequência base do cADN (APHL) do inibidor de OC^-plasmina

Como o APHL tem sítios de enzimas de restriç ção como se mostra no desenho junto, foi feita uma subclona-gem nestes sítios na região poliligante de vector M13 e as se quências de ADN inseridas foram determinadas pelo método de dideoxi (Referências Sanger, P. et al. s Science (1981) 2lU s 1205-1210) utilizando um conjunto de sequenciação M13 de Taka ra Shuzo (Tabela 2). A comparação com a cadeia de peptídeos de inibidor de 0^-plasmina humano conhecido como descrito na literatura I como se segues

Cadeia A de peptídeos conhecida (Referência 3) x NH^-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro -Leu-Thr-Grly-Leu-Ly s (Correspondendo ao peptídeo codificado com as bases 1^2 a 177 no Quadro 2. A glicina na cadeia de peptídeos A é substituída por leucina)

Cadeia B de peptídeos conhecida (Referência l)

Leu-Gly-Ásn-Gln-Glu-Pro-Gly-Gly-Gln-Thr-Ala-Leu-Lys-Ser-Pro--Pro -Gly-Val-Cy s-Ser-Arg (Correspondendo ao peptídeo codificado com as bases 17B a 2ho no Quadro 2)

Cadeia C de peptídeos conhecida (Referência l)

Arg-Leu-Ala-Ala-Arg-Met-Tyr-Leu-Gln-Lys-Gly-Phe-Pro-Ile-Lys- x -Glu-Asp-Phe-Leu-Glu-Gln-Ser-Leu (Correspondendo ao peptídeo codificado com as bases 505 a 573 no Quadro 2» A leucina marcada na cadeia de peptídeos C I substituida por ácido glutâmico) • Cadeia D de peptídeos conhecida (Referência l) 21

Pro- Vai-Ser-Leu-Thr-Gly-Ly s-Gln-Glu-Asp-Asp-Leu-Ala-Asn-Ile--Asn-Gln-Trp-Val-Lys-Glu-Ala-Thr-Glu-Gly-Lys-Ile-Gln-Glu-Phe (Correspondendo ao peptídeo codificado com as bases 591 a 681 no Quadro 2)

Cadeia E de peptídeos conhecida (Referência l)

XX X

Ser-Leu-Lys-Phe-Asp-Pro-Ser-Leu-Thr-Gln-Arg-Asp-Ser-Phe-Leu- x -His-Asp-Glu-Gln-Phe-Thr-Val-Pro-Val-Glu-Met-Met-Gln-Ala-Arg- -Val-Tyr-Pro (Correspondendo ao peptídeo codificado com as bases 7&4 a 846 no Quadro 2· Os ácidos aminados marcados por x na cadeia de peptídeos E são substituídos por arginina, asparagina, histi-dina, leucina e treonina respectivamente.)

Cadeia P de peptídeos conhecida (Referência 4) Met-Ser-Phe-Val-Val-Leu-Val (Correspondendo ao peptídeo codificado com as bases 909 a 931 no Quadro 2)

Cadeia G de peptídeos conhecida (Referência 2)

Phe-Val-Gly-Ser-Val-Arg-Asn-Pro-Asn-Pro-Ser-Ala-Pro-Arg-Glu- -Leu-Lys-Glu-Gln-Gln-Asp-Ser-Pro-Gly-Asn-Lys (Correspondendo ao peptídeo codificado com as bases 1308 a 1386 no Quadro 2)

Peptídeo conhecido H (Referência l)

Lys-Gly-Phe-Pro-Arg-Gly-Asp-Lys-Leu-Phe-Gly-Pro-Asp-Leu-Lys--Leu-Val-Pro-Pro-Met-Glu-Glu-Asp-Tyr-Pro-Gln-Phe-Gly-Ser-Pro--Lys (Correspondendo ao peptídeo codificado com as bases 1405 a l497 no Quadro 2) 22

Claims (4)

1. Referência 1 H.R. Lijnen et al., Ihromb Haemostas SStuttgart) 48 (3) 311--314 (l982) Referência
2. 2 H.R. Lijnen et al., Thrombosis Research 2% (l) 83-89 (1982) Referência
3. 3 Afeitada Ichinose et al.» Pebs Letters 153 (2) 369-372. (1983) Referência
4. 4 B. Wiman, Methods in Enzymology 80 395-408 (1981) REIVINDICAÇÕES - 1 - - Processo para a preparação de uma proteína se melhante ao inibidor de plasminaiXg com a seguinte sequência de ácidos aminados 1) Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr- Leu-Leu-Lys-Leu-Gly-Asn-Gln-Glu-Pro-Gly-Gly-Gln-Thr-*Ala-Leu-Ly s-Ser-Pro-Pro-Gly-Val-Cys-Ser-Arg-Asp-Pix» -Thr-Pro -Glu-Gln-Thr-Hi s-Arg-Leu-Ala-Àrg-Ala-Met -Me t-Ala-Phe-Thr-Ala-Asp-Leu-Phe-Ser-Leu-Val-Ala-Gln-Thr-Ser-Thr-Cy s-Pro-Asn-Leu-Ile-Leu 23 -

   Ser-Pro-Leu-Ser-Val-Ala-Leu-Ala-Leu-Ser-His-Leu-Ala-Leu-Gly-Ala-Gln-Asn-His-Thr-Leu-Gln-Arg-Leu-Gln-Gln-Val-Leu-His-Ala-Gly-Ser-Gly-Pro-Cys-Leu-Pro-His-Leu-Leu-Ser-Arg-Leu-Cys-Gln-Asp-Leu-Gly-Pro-Gly-Ala-Phe-Arg-Leu-Ala-Ala-Arg-Met-Ty r-Leu-Gln-Lys-Gly-Phe-Pro-Ile-Lys-Glu-Asp-Phe-Leu-Glu-Gln-Ser-Glu-Gln-Leu-Phe-Gly-Ala-Lys-Pro-Vai-Ser-Leu-Thr-Gly-Ly s-Gln-Glu-Asp-Asp-Leu-Ala-Asn-Ile-Asn-Gln-Trp-Val-Ly s-Glu-Ala-Thr-Glu-Gly-Ly s-IIe-Gln-Glu-Phe-Leu-Ser-Gly-Leu-Pro-Glu-Asp-Thr-Val-Leu-Leu-Leu-Leu-Asn-Ala-Ile-His-Phe-Gln-Gly-Phe-Trp-Arg-Asn-Lys-Phe-Asp-Pro-Ser-Leu-Thr-Gln-Arg-Asp-Ser-Phe-His-Leu-Asp-Glu-Gln-Phe-Thr-Val-Pro-Val-Glu-Met-Met Gln-Ala-Arg-Thr-Tyr-Pro-Leu-Arg-Trp-Phe-Leu-Leu-Glu-Gln-Pro-Glu-XIe-Gin- Vai-Ala-His-Phe-Pro-Phe-Lys-Asn-Asn-Met-Ser-Phe-Val-Vai-Leu-Vai-Pro-Thr-Hi s-Phe-Glu-Trp-Asn-Val-Ser-Gln-Val-Leu-Ala-Asn-Leu-Ser-Trp-Asp-Thr-Leu-Hi s-Pro-Pro-Leu-Vai-Trp-Glu-Arg-Pro-Thr-Ly s-Vai-Arg-Leu-Pro-Ly s-Leu-Tyr-Leu-Ly s-Hi s-Gln-Met-Asp-Leu-Vai-Ala-Thr-Leu-Ser-Gln-Leu-Gly-Leu-Gln-Glu-Leu-Phe-Qln-Ala-Pro-Asp-Leu-Arg-Gly-Ile-Ser-Glu-Gln-Ser-Leu-Val-Vai*Ser-Gly-Val-Gln-His-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu-Leu-Ser-Glu- - 24 -

   Val-Gly-Val-Glu-Ala-Ala-Ala-Ala-Thr-Ser- Ile-Ala-Met-Ser-Arg-Met-Ser-Leu-Ser-Ser- Phe-Ser-Val-Asn-Arg-Pro-Phe-Leu-Phe-Phe- Ile-Phe-Glu-Asp-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Leu- Phe-Val-Gly-Ser-Val-Arg-Asn-Pro-Asn-Pro- Ser-Ala-Pro-Arg-Glu-Leu-Lys-Glu-Gln-Gln Asp-Ser-Pro-Gly-Asn-Lys-Asp-Phe-Leu-Gln- Ser-Leu-Lys-Gly-Phe-Pro-Arg-Gly-Asp-Lys- Leu-Phe-Gly-Pro-Asp-Leu-Lys-Leu-Val-Pro- Pro-Met-Glu-Glu-Asp-Tyr-Pro-Gln-Phe-Gly- Ser-Pro-Lys, caracterizado por se introduzir numa célula hospedeira um ADN que codifica para a referida proteína» provocar a expressão da proteína codificada na célula hospedeira e em seguida sepa rar a proteína expressa das proteínas da célula. - 2* - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado por o ADN ter a seguinte sequência básica AAC.CAG.GAG.CAG.GTG.TCG.CCA.GTT.ACC. CTC.CTC.AAG.TTG.GGC.AAC.CAG.GAG.CCT.GGT. GGC.CAG.ACT.GCC.CTG.AAG.AGT.CCC.CCA.GGA. GTC.TGC.AGC.AGA.GAC.CCC.ACC.CCA.GAG.CAG. ACC.CAC.AGG.CTG.GCC.CGG.GCC.ATG.ATG.GCC. TTC. ACT . GCC .GAC. CTG.TTC . TCC . CTG. GTG. GCT. CAA.ACG.TCC.ACC.TGC.CCC.AAC.CTC.ATC.CTG. TCA.CCC.CTG.AGT.GTG.GCC.CTG.GCG.CTG.TCT. 25

   CAC.CTG.GCA.CTA.GGT.GCT.CAG.AAC.CAC.ACG. TTG.CAG.AGG.CTG.CAA.CAG.GTG.CTG.CAC.GCA. GGC.TCA.GGG.CCC.TGC.CTC.CCC.CAT.CTG.CTG. AGC.GGC.CTC.TGC.CAG.GAC.CTG.GGC.CCC.GGC. GCG.TTC.CGA.CTG.GCT.GCC.AGG.ATG.TAC.CTG. CAG.AAA.GGA.TTT.CCC.ATC.AAA.GAA.GAT.TTC. CTG.GAA.CAA.TCC.GAA.CAG.CTA.TTT.GGG.GCA. AAG.CCC.GTG.AGC.CTG.ACG.GGA.AAG.CAG.GAA. GAT.GAC.CTG.GCA.AAC.ATC.AAC.CAA.TGG.GTG. AAG.GAG.GCC.ACG.GAG.GGG.AAG.ATT.CAG.GAA. TTC.CTC.TCT.GGG. CTG.CCG.GAA.GAC.ACC.GTG. TTG. CTT.CTC.CTC.AAC.GCC.ATC.CAC.TTC.CAG. GGT.TTC.TGG.AGG.AAC.AAG.TTT.GAC.CCG.AGC. CTT.ACC.CAG.AGA.GAC.TCC.TTC.CAC.CTG.GAC. GAG.CAG.TTC.ACG.GTG.CCC.GTG.GAA.ATG.ATG. CAG.GCC.CGC.ACG.TAC.CCG.CTG.CGC.TGG.TTC. TTG.CTG.GAG.CAG.CCT.GAG.ATC.CAG.GTG.GCT. CAT.TTC.CCC.TTT.AAG.AAC.AAC.ATG.AGC.TTT. GTG.GTC.CTT.GTA.CCC.ACC.CAC.TTT.GAA.TGG. AAC.GTG.TCC.CAG.GTA.CTG.GCC.AAC.CTG.AGT. TGG.GAC.ACC.CTG.CAC.CCA.CCT.CTG.GTG.TGG. GAG.AGG.CCC.ACC.AAG.GTC.CGG.CTG.CCT.AAG. CTG.TAT.CTG.AAA.CAC.CAA.ATG.GAC.CTG.GTG. GCC.AC C.CTC.AGC.CAG.CTG.GGC.CTG.CAG.GAG. TTG.TTC.CAG.GCC.CCA.GAC.CTG.CGT.GGG.ATC. TCC.GAG.CAG.AGC.CTG.GTG.GTG.TCC.GGC.GTG. CAG.CAT.CAG.TCC.ACC.CTG.GAG.CTC.AGC.GAG. GTC.GGC.GTG.GAG.GCG.GCG.GCG.GCC.ACC.AGC. 26 ATT.GCC .ATG.TCC .CGC .ATG.TCC .CTG.TCC .TCC . TTC.AGC.GTG,AAC.CGC.CCC.TTC.CTC.TTC.TTC. ATC.TTC.GAG.GAC.ACC.ACA.GGC.CTT.CCC.CTC. TTC.GTG.GGC.AGC.GTG.AGG.AAC.CCC.AAC.CCC. AGT.GCA.CCG.CGG.GAG.CTC.AAG.GAA.CAG.CAG. GAT.TCC.CCG.GGC.AAC.AAC.GAC.TTC.CTC.CAG. AGC.CTG.AAA.GGC.TTC.CCC.CGC.GGA.GAC.AAG. CTT.TTC.GGC.CCT.GAC.TTA.AAA.CTT.GTG.CCC. CCC.ATG.GAG.GAG.GAT.TAC.CCC.CAG.TTT.GGC. AGC.CCC.AAG. Processo de acordo com qualquer das reivindi-dações 1 ou 2, caracterizado por a célula hospedeira ser uma célula de mamífero. A requerente declara que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados no Japão em 27 de Agosto de 1986 e em 5 de Dezembro de 1986, sob os n*s 199056/86 e 288875/86, respectivamente. Lisboa, 26 de Agosto de 1987

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