PT820304E - Vacina contra clamidia - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "VACINA CONTRA CLAMÍDIA" O presente invento está relacionado com uma formulação de vacina para a prevenção das infecções por clamídia. Em particular, está relacionado com uma formulação contendo MOMP recombinantes combinados com os adjuvantes QS21 e 3D-MPL. A bactéria intracelular obrigatória Chlamydia trachomatis infecta células epiteliais da mucosa da conjuntiva e do tracto urogenital, causando um largo espectro de doenças humanas, tais como tracoma e infecções genitais, que podem resultar em sequelas a longo prazo. O tracoma, que é endémico em vários países subdesenvolvidos, é a principal causa de cegueira prevenível; infecções genitais, que representam cerca de 3 milhões de casos por ano nos Estados Unidos, tomam anualmente 200000 mulheres inférteis após salpingite por clamídia (1). Assim, este patogénio constitui um problema de saúde pública importante e têm sido feitos esforços para a produção de uma vacina contra as infecções humanas por clamídia.

Os ensaios de vacinas realizados no homem e em primatas não humanos, usando o organismo completo como imunogénio, deu uma protecção específica de serovar mas alguns dos vacinados desenvolveram reacções mais graves quando da reinfecção (2). Vários estudos demonstraram que a patologia associada à infecção por clamídia é mediada imunologicamente (3); ainda, demonstrou-se que uma proteína purificada de clamídia de 57 KDa (HspóO) induz uma patologia semelhante à reinfecção em animais anteriormente infectados (4,5). Esta observação levou à conclusão de que a protecção contra Chlamydia trachomatis poderá apenas ser conseguida usando uma vacina de subunidades. A espécie Chlamydia trachomatis é serotipada em 15 serovares que sâo colocados em 3 serogrupos: o complexo B (serovares B, Ba, D, E, LI e L2), o complexo intermédio (serovares F, G, K, L3) e o complexo C (serovares A, C, Η, I e J) (6). As doenças sexualmente transmitidas (DST) são causadas pelos serovares D a K que abrangem os 3 serogrupos. Assim uma vacina de subunidades contra DST provocada por clamídia deverá proteger contra vários serovares que estão mais ou menos relacionados antigenicamente.

Para a projecção de uma vacina de subunidades, os interesses têm-se focado no antigénio de serotipagem que consiste na principal proteína da membrana externa de 40 KDa (MOMP). Esta proteína, que se demonstrou funcionar in vitro como uma porina (7), está presente durante todo o ciclo de vida da bactéria (8); esta proteína principal da membrana é altamente imunogénica em humanos e animais. A MOMP apresenta 4 domínios variáveis (VD) rodeados por cinco regiões constantes que são altamente conservadas entre os serovares (9, 10). Os epítopos das células B neutralizantes in vitro e in vivo foram mapeados em VDs (11, 12, 13, 14, 15) enquanto os epítopos das células T foram identificados nos domínios variáveis e constantes (16, 17). MOMP recombinante foi expressa em E. coli por diferentes autores (18, 19, 10); no entanto, Manning et al. demonstraram que a sua proteína recombinante não reagia com um anticorpo monoclonal que reconhece um epítopo conformacional de MOMP (18).

As imunizações com MOMP recombinante, ou purificado, seguidas de infecção com clamídia, homotípica ou heterotípica, foram realizadas em diferentes modelos animais com efeitos variáveis nos parâmetros da infecção (21, -3- 22, 23). Um elegante modelo experimental para salpingite foi desenvolvido em ratinhos, nos quais a inoculação intra-uterina de uma estirpe humana de Chlamydia trachomatis levou à infertilidade a longo prazo (24, 25). Numa experiência de infecção heterotípica, Tuffrey et ai, demonstraram que a imunização parentérica e das mucosas com rMOMP adsorvida a al-hidrogel reduziu a gravidade da salpingite e a duração da colonização do tracto genital inferior, respectivamente. No entanto, a preparação não conferiu protecção contra a infertilidade resultante da infecção (23). Tendências futuras sobre vacinas contra clamídia estão discutidas em Ward, M.E., Journal of Infection, 1992, 25 Suplemento 1, 11-26.

Tanto a imunidade celular como humoral parecem desempenhar um papel protector nas patologias genitais provocadas por Chlamydia trachomatis. No entanto, o grupo de Rank sugere que nos ratinhos a imunidade mediada pelas células T é o principal mecanismo imunitário para o controle das doenças genitais provocadas por clamídias (26, 27, 28) e demonstrou-se que as células T CD4 e CD8 positivas contribuem para a imunidade anti-clamídia in vivo (29, 30). O monofosforil-lípido A 3-Des-O-acilado é conhecido da GB2 220 211B (Ribi). Quimicamente é uma mistura de monofosforil lípido A 3-desacilado com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas e é produzido pela Ribi Immunochem Montana. QS21 é uma fracção não tóxica, purificada por HPLC, de uma saponina da casca da árvore da América do Sul Quillaja saponaria molina e o seu método de produção está descrito (como QS21) na Patente US N° 5,057,540. Vacinas compreendendo tanto QS21 como 3D-MPL estão descritos na Publicação de Patente Internacional N° W094/00153. O presente invento proporciona pela primeira vez uma composição -4- de vacina que é eficaz para conferir protecção contra a infertilidade resultante das infecções por clamídia.

Assim, o presente invento proporciona uma formulação de vacina compreendendo 3D-MPL, QS21 e MOMP de clamídia. Em particular, a vacina contem MOMP do serogrupo do complexo B. Preferencialmente, a vacina contem pelo menos uma MOMP do serovar L2, mas adicionalmente contem antigénios de outros serovares, tais como D e E.

Numa realização preferida, QS21 é apresentado com um esterol uma vez que tais composições apresentam reactogenicidade e melhora a estabilidade de QS21 relativamente à hidrólise mediada por bases.

Nas composições preferidas do invento, QS21 é associado à estrutura de lipossomas contendo colesterol (daqui em diante referido como DQ). Tais composições de adjuvantes estão descritas nos Pedidos de Patente UK copendentes 9508326.7 e 9513107.4 (publicado como WO 96/33739) cuja descrição está aqui incluída como referência. O antigénio e o MPL estão, nesta formulação preferida, por fora da estrutura do lipossoma. A preparação de vacina está descrita de um modo geral em New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et al, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. A encapsulação em lipossomas está descrita, por exemplo, por Fullerton, Patente U.S. 4,235,877. A conjugação de. proteínas a macromoléculas está descrita, por exemplo, por Likhite, Patente U.S. 4,372,945 e por Armor et al, Patente U.S. 4,474,757. A quantidade de proteína de cada dose de vacina é seleccionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotectora sem efeitos -5- secundários adversos nos vacinados típicos. Tal quantidade variará de acordo com o imunogénio específico empregue e da forma como é apresentado. De um modo geral, espera-se que cada dose compreenda 1-1000 \ig de proteína, preferencialmente 2-100 pg, mais preferencial mente, 4-40 pg. Uma quantidade óptima para uma vacina particular, pode ser determinada através de estudos convencionais envolvendo a observação de respostas imunitárias adequadas nos indivíduos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou mais imunizações de reforço adequadamente espaçadas.

As formulações do presente invento podem ser usadas tanto para fins profiláticos como terapêuticos.

Assim, num aspecto, o invento proporciona um método de tratamento compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma vacina do presente invento a um doente.

Numa realização do invento o antigénio MOMP é do Serovar 2 e é produzido em E. coli por meio de técnicas de DNA recombinante. Em tais circunstâncias a proteína é produzida sem a sua sequência sinal.

No presente invento, a combinação do antigénio com o adjuvante MPL+QS21 influenciou fortemente a proporção de IgGl:IgG2a nos grupos imunizados; a imunização com MPL+QS21 foi associada a proporções baixas de IgGl:IgG21 protecção parcial enquanto que a imunização sem MPL+QS21 conduziu a uma proporção mais elevada de IgGl:IgG2a e não conferiu protecção. É interessante que a mudança para a produção do anticorpo IgG2a pelas células B é mediada por interferão gama o qual é produzido pela subsérie de linfócitos T-auxiliares, enquanto que a produção de IgGl é mediada por interleucina-4 secretada pelas células Th2 (40). Uma vez que a produção de IgG21 é controlada -6- por produtos das células Thl, parece provável que os grupos protegidos apresentaram uma activação das células Thl induzida por MPL+QS21. Em modelos humanos e de ratinho, as citocinas de Thl, IL-2 e IFN-gama, estão geralmente associadas com resistência à infecção por patogénios intracelulares enquanto que as citocinas de Th2, IL-4 e IL-10, estão associadas a doença progressiva. Isto pode ser ilustrado com a resistência ou susceptibilidade das estirpes singeneicas de ratinhos a Leishmania major que está correlacionado com a indução de resposta específica de Thl ou Th2 (41). Ainda, o interferão gama tem actividade anti-clamídia in vitro e está envolvido na resolução da infecção in vivo (42, 43). Assim, citocinas Thl induzidas por imuno-estimuladores poderão ser responsáveis pela protecção observada nesta experiência de vacinação.

Duas outras observações apoiam esta hipótese do estabelecimento de uma imunidade celular protectora nos grupos vacinados com rMOMP+MPL+QS21: em primeiro lugar, a ausência de IgA secretória específica nas secreções vaginais e a natureza não neutralizante da resposta forte de anticorpos séricos exclui a possibilidade de haver uma protecção humoral; em segundo lugar, o carácter heterotípico da protecção obtida usando dois serovares diferentes, diferindo consideravelmente a nível das sequências VDs de MOMP, sugere que os epítopos das células T derivados de domínios conservados de MOMP processados poderá ser o agente da protecção contra a infertilidade.

Segue-se a exemplificação do invento. 1. Materiais e Métodos 1.1 Estirpes de clamídia e animais

Usou-se neste estudo Chlamydia trachomatis serovar F estirpe NI1 -7-

isolada por Tuffrey et ai, e gentilmente cedida pelo Dr. J. Orfila e Chlamydia trachomatis serovar L2 estirpe 434 (ATCC, Rockville, Md). As clamídias foram inoculadas em células McCoy (ATCC, Rockville, Md) numa concentração de aproximadamente 106 unidades formadoras de inclusões/ml (IFU/ml) em MEM suplementado com 10% de soro fetal de vitela (FCS) (Gibco BRL). Após 1 hr de centrifugação (1500 g) e 2 h de incubação a 37°C (5% C02), o inoculo foi removido e as células foram novamente alimentadas com meio fresco suplementado com 0,5 pg/ml de ciclo-heximida (Sigma). Após incubação a 37°C durante 48 horas, as células foram rebentadas com esferas de vidro, colhidas em sucrose 250 mM, fosfato de sódio 10 mM, ácido L-glutâmico 5 mM pH 7,2 (SPG) até uma concentração aproximada de 107 a 108 IFU/ml e guardadas a -7 0°C.

Ratinhos fêmea C3H/HeOuJ (H-2k), 6-8 semanas de idade foram adquiridos à Iffa Credo (França). Para acasalamento usou-se machos da mesma estirpe (B & K, UK) com 8 a 10 semanas de idade. 1.2 Amplificação por PCR e construção de plasmídeos

Amplificação. DNA de MOMP serovar L2 foi obtido por lise de 10 μΐ de inoculo de clamídia em 240 μΐ de tampão de lise e a amplificação por PCR decorreu como descrito anteriormente por Denamur et al. (33). Escolheram-se oligonucleótidos sintéticos 5'-GAGACTCCCATGGATCCACTGCCTGTGGGG-AATCCTGC-3' e 5'-TTAGAAGCGGAATTGTGCATTTAC-3' (SB Biologicals, Bélgica) a partir da sequência publicada (34). O oligonucleótido 5' continha a sequência nucleotídica codificadora do extremo amina de MOMP madura (sublinhado) precedida de um sítio de restrição BamHI (a cheio). A amplificação foi realizada usando DNA polimerase Pfu (Stratagene) e um termociclador Koch Light NBS Thermal Cycler (New Brunswick). Um produto de PCR com o -8- tamanho correcto foi purificado a partir de um gel de 1% de agarose usando um estojo Geneclean II (Bio 101). 1.3 Clonagem O DNA amplificado de MOMP serovar L2 foi dotado de extremos cerses com o fragmento Klenow da DNA polimerase I, ligado a pGEM4Z (Promega) previamente digerido com Smal e usado para tmansformar E. coli JM109 usando o protocolo convencional com CaCl2. A análise de restrição foi realizada nos clones resultantes e uma construção de DNA correcta foi amplificada e purificada usando um estojo Nucleobond PC-100 (Macherey-Nagel). O DNA de MOMP foi então retirado do pGEM4Z-MOMP por digestão com BamHI e inserido em pET15 (Novagen) digerido com BamHI a jusante do promotor T7/Iac e da sequência da cauda de histidina. Os clones correctos foram seleccionados por análise com enzimas de restrição após transformação de E. coli estirpe DH10B (Stratagen); a sequência nucleotídica completa do DNA clonado foi verificada pelo método de terminação de cadeias didesoxi (35). Uma preparação do plasmídeo pET15-MOMP foi finalmente usada para transformar a estirpe BL21(DE3) (Novagen), que é capaz de promover a expressão do produto recombinante uma vez que possui uma polimerase de T7 induzível com IPTG. 1.4 Produção, caracterização, purificação e formulação de imunogénio. 1.4.1 Produção e caracterização. Bactérias BL21(DE3) transformadas com pET15-MOMP foram cultivadas em meio LB (Gibco BRL) suplementado com 200 pg/ml de ampicilina (Sigma). Induziu-se a expressão pela adição de IPTG 1 mM quando a densidade óptica da cultura, medida a 600 nm, atingiu 0,6 a 0,8. As células foram colhidas 3 hr após indução, lavadas 3 vezes -9- com PBS e lisadas em tampão de amostra contendo 2% de SDS e 5% de mercaptoetanol. As amostras foram aquecidas durante 3 min a 95°C e as proteínas totais foram separadas num gel de 12% SDS-PAGE usando marcadores de peso molecular separados no mesmo gel (Gibco BRL). Para imunotransferência, as proteínas separadas em 12% SDS-PAGE foram transferidas para nitrocelulose e detectadas usando mAbs L2 1-45 e L2 1-10 gentilmente cedidos pelo Dr. H. Caldwell e um anti-soro de cabra anti-MOMP (Chemicon). A localização celular de rMOMP foi determinada por fraccionamento celular como descrito em Maniatis et al. (36); o sedimento e os sobrenadantes foram ressuspensos ou ajustados em tampão de amostra e analisados tal como o lisado de células totais. 1.4.2 Purificação. Um volume de 100 ml de cultura de 3 h induzida com IPTG foi lisada com lisozima e desoxicolato como descrito anteriormente por Marston et al. (37). O lisado celular foi centrifugado (12000 g durante 15 min.), o sedimento foi ressuspenso em 2 ml de tampão de amostra para SDS-PAGE contendo 2% SDS mas sem mercaptoetanol e fervido durante 3 min. O lisado foi centrifugado (12000 g durante 15 min.), o sedimento foi regeitado e o sobrenadante ajustado às concentrações finais de Tris-HCl 20 mM pH 7,9, 0,5% SDS, NaCl 500 mM, imidazole 5 mM. A amostra foi então aplicada numa coluna de cromatografia contendo 2 ml de resina His.Bind (Novagen); a cromatografia de afinidade com iões metálicos foi então realizada de acordo com o processo do fabricante. A identidade e pureza do produto eluido foi analisada por SDS-PAGE, em condições redutoras, seguido de coloração com azul Coomassie ou imunotransferência (ver atrás). A concentração proteica foi determinada pelo método de Lowry. As fracções contendo rMOMP foram reunidas e dialisadas durante a noite contra PBS usando cassetes Slide A Lyser (Pierce). - 10-

Formulação do antigénio. Testaram-se três formulações:

1) MOMP+QS213DMPL 2) MOMP+SB62 emulsão de óleo em água

3) MOMP, SB62, QS21 3DMPL

Procedeu-se de acordo com o método descrito em WO 95/17210 e/ou W094/00153. Resumidamente rMOMP purificado e dialisado foi diluído em PBS a 25 pg/ml (200 μΐ) para injecção com 5 μg de MPL + 10 pg QS21 ou para 50 pg/ml (100 μΐ) para misturar com 100 μΐ de emulsão de óleo em água referido como SB62, com ou sem 5 μg MPL/10 μg QS21. Para cada uma das formulações prepararam-se vacinas como se segue: 1) MPL/QS21 formulado pela adição de MPL (como partículas de 100 nm) ao antigénio MOMP, seguido de tampão e depois QS21. 2) MPL/QS21/SB62 formulado pela adição de antigénio ao tampão, seguido de SB62, seguido de MPL como partículas de 100 nm, seguido de QS21. Nesta formulação pensa-se que o antigénio está por fora (i.e. fora da gotícula da emulsão), o MPL está por fora e a maior parte de QS21 está por fora. 3) SB62 formulado pela adição de SB62 ao antigénio em tampão. O antigénio fica por fora. l.S Vacinação no modelo de ratinho para salpingite, fertilidade e acompanhamento serológico

Grupos de dez fêmeas C3H/HeOuJ foram imunizados subcutanea-mente, na base da cauda, com 2 x 5 pg rMOMP em 200 μΐ das diferentes - 11 - formulações nas semanas 0 e 2; e o grupo testemunha foi sujeito a uma simulação de imunização seguindo o mesmo calendário com a emulsão contendo 5 pg de MPL e 10 pg de QS21. A inoculação foi realizada na semana 6 seguindo o protocolo descrito anteriormente por Tuffrey et al. (24). Resumidamente, os ratinhos receberam 2,5 mg de progesterona subcutaneamente (Depo-Provera, Upjohn) 7 dias antes da infecção, a qual foi realizada por inoculação intrauterina bilateral com 5 x 105 IFU de Chlamydia trachomatis NI1 em 100 pl de SPG ou 100 pl de extracto celular McCoy.

Na semana 10, ratinhos tratados foram engaiolados com machos durante 3 meses para avaliação da fertilidade (1 macho para 2 fêmeas, com rotação semanal do macho dentro de cada grupo). Os parâmetros que foram calculados ao longo do período de acasalamento foram o número médio de ratinhos nascidos por grupo (M) e o tamanho médio da ninhada (N).

Colheu-se sangue na semana 6 e os soros foram analisados relativamente a anticorpos específicos contra rMOMP, reconhecimento de inclusões de clamídia serovar F estirpe NI1 e neutralização da infecção heteróloga (NI1) in vitro. Colheram-se lavados vaginais na semana 6 pipetando 50 pl de PBS para dentro e para fora da vagina várias vezes e analisou-se quanto à presença de anticorpos IgA secretórios específicos contra rMOMP. 1.6 Análise serológica 1.6.1 Determinação de anticorpos anti-rMOMP. Os títulos de IgG ou IgA específicos de rMOMP foram determinados usando rMOMP como antigénio num ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA). As placas (Maxisorp, Nunc) foram revestidas durante a noite a 4°C com 5 pg/ml de uma solução de antigénio em tampão carbonato/bicarbonato 10 mM, pH 9,6, lavadas - 12- com 0,1% Tween 20 PBS (tampão de lavagem) e bloqueadas durante 1 h a 37°C com PBS 3% BSA (Sigma). Os soros a testar foram diluídos seriadamente em tampão de lavagem contendo 0,5% BSA (tampão de incubação) durante 1 h a 37°C. As placas foram lavadas e incubadas durante lha 37°C com anticorpos de cabra conjugados com peroxidase de rábano silvestre anti-IgG ou IgA de murganho (Sigma). Após lavagem, adicionou-se o substrato ortofenilenodiamina (Sigma) à temperatura ambiente durante 20 minutos: a reacção foi parada pela adição de H2S04 e leu-se a absorvância a 492 nm num Labsystems Multiskan. O título de IgG ou IgA anti-rMOMP foi expresso como o recíproco da diluição da amostra de soro que dá um valor médio de absorvância.

Para cada amostra de soro, a resposta de IgG específica de rMOMP foi descriminada em proporções de IgG2a, IgG2b e IgGl num ELISA directo como descrito atrás com algumas modificações. Os soros a testar foram incubados em triplicado, as placas foram lavadas e a cada série de triplicados adicionou-se anticorpos de cabra biotinilados anti-IgG2a, IgG2b ou IgGl (Amersham) diluídos em tampão de incubação. Após 1 h a 37°C, as placas foram lavadas e incubadas durante 1 h com um complexo de estreptavidina e peroxidase de rábano silvestre (Amersham). A revelação e a determinação do título foram realizadas como descrito atrás. A prevalência de cada um dos 3 subtitpos, expressa em percentagem, foi calculada como a proporção entre este subtipo de IgG e o total dos títulos determinado para os 3 subtipos.

1.6.2 Detecção heterotípica das inclusões de clamidia. Células MacCoy foram cultivadas em microplacas de 96 alvéolos de fundo plano estéreis (Nunc) e as monocamadas confluentes foram infectadas com aproximadamente 5 x 104 IFU de Chlamydia trachomatis serovar F estirpe NI1. 24 horas pós-infecção, as células foram lavadas com PBS e fixadas 10 min com metanol. A lavagem foi repetida e 100 μΐ das amostras de soro diluidas a 1/100 com PBS -13- foram incubados durante lha 37°C. As placas foram lavadas e tratadas com anticorpos de cabra anti-IgG de ratinho conjugados com peroxidase de rábano silvestre (Sigma) durante lha 37°C. Após lavagem com PBS, a ligação dos anticorpos foi visualizada pela adição de tetra-hidrocloreto de diaminobenzidina (DAB, Sigma). A presença de IgG anti-rMOMP revelou inclusões de NI1 na análise com microscópio óptico invertido. 1.6.3 Actividade neutralizante heterotípica in vitro. O ensaio de neutralização in vitro independente do complemento foi realizado como descrito por Su et al. (38) com algumas modificações. Resumidamente, 50 μΐ de diluição de duas vezes em SPG dos soros de ratinhos individuais descomplementados foram adicionados a 105 IFU do serovar F estirpe ΝΙ1 diluida em 50 μΐ de SPG. A mistura foi incubada 30 min a 37°C (5% C02) e em seguida os 100 μΐ foram inoculados em células de rim de hamster sírio (HaK, ATCC, Rockville, Md) lavadas com HBSS (Gibco BRL) e incubados durante 2 h a 37°C (5% C02). Em seguida, os inóculos foram removidos, as células foram lavadas com HBSS e adicionado MEM contendo 10% FCS, 50 μg/ml de gentamicina e 0,5 μg/ml de ciclo-heximida. Após 24 horas de incubação a 37°C as células foram fixadas e as inclusões foram detectadas imunoquimicamente como descrito atrás usando um anti-soro comercial de cabra anti-MOMP (Chemicon) e um anticorpo de coelho anti-cabra conjugados com fosfatase alcalina (Sigma). Usou-se 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato/nitro azul de tetrazólio (BCIP/NBT, Sigma) como substrato para a reacção enzimática. IFU foram quantificadas contando 5 campos com uma amplificação de 200x num microscópio invertido. O número médio de IFU por campo obtido com os soros das amostras foi expresso como redução percentual do número médio de IFU obtido com uma mistura de testemunhas negativas que continham soro de ratinhos não inoculados. Os títulos de neutralização (NT 50) foram calculados como o recíproco da diluição da amostra de soro que dá 50% de redução da infecciosidade. - 14- 1.7 Resultados 1.7.1 Expressão e caracterização do antigénio recombinante

Um fragmento de DNA amplificado por PCR contendo a sequência de nucleótidos codificadora de MOMP madura serovar L2 foi inserido na grelha de leitura e orientação correctas no vector de expressão pET15; a sequência de nucleótidos da proteína de clamídia e a fusão com o segmento polinucleotídico codificador do peptídeo His-Tag 5'-terminal foram como previsto pela estratégia de clonagem planeada. Após fraccionamento celular, o produto de expressão estava situado na fracção insolúvel de E. coli, sugerindo que foi expresso na forma de corpos de inclusão insolúveis. O sedimento contendo MOMP recombinante foi solubilizado em tampão com 2% de SDS e aplicado numa coluna de cromatografia de afinidade com iões metálicos em que iões níquel imobilizados foram usados para quelatar resíduos de histidina ligados ao peptídeo de caudas de histidina fundido com MOMP recombinante. A proteína purificada, que foi lavada e eluida em tampões sem SDS, apresentou o peso molecualr previsto e foi imuno-reactiva com anticorpos monoclonais e policlonais anti-MOMP, como se mostra por SDS-PAGE e análise de transferências Western respectivamente. Após diálise, a concentração de rMOMP situava-se entre 500 μ g/ml e 1 mg/ml e a pureza do produto recombinante foi calculada como sendo 90%. 1.7.2 Efeito da imunização com rMOMP combinado com adjuvante na resposta serológica e fertilidade após infecção heterotípica

Os resultados da experiência destinada a avaliar o potencial profilático de MOMP recombinante com diferentes adjuvantes estão apresentados - 15- como descrito na tabela 1. Os grupos 4 e 5 foram imunizados subcutaneamente com rMOMP combinado com 5 pg do adjuvante MPL e 10 pg de QS21; no grupo 4, a proteína recombinante com adjuvante foi preparada na emulsão de SB62 contendo esqualeno e alfa tocoferol como fase oleosa e Tween 80 como tensioactivo. O grupo 6 foi imunizado subcutaneamente com rMOMP combinado com a mesma emulsão de SB62 como no grupo 4 mas sem imuno-estimuladores. Projectou-se também três grupos testemunha. Um grupo de animais não tratados (grupo 1), um grupo de ratinhos com simulação de imunização usando imuno-estimulante combinado com a emulsão SB62 (grupo 2) e o grupo 3 que foi imunizado tal como o grupo 4 mas foi destinado a infecção simulada. Os grupos 2, 4, 5 e 6 foram infectados com Chlamydia trachomatis heterotípica estirpe BI1. 1.7.3 Efeito da imunização na resposta serológica. De forma a avaliar a imunogenicidade das diferentes preparações, os títulos de IgG foram medidos por ELISA em soros colhidos 4 semanas após a segunda dose de vacina (dia da infecção) e os títulos médios aritméticos (AMT) foram calculados para cada grupo. A imunização com duas injecções de 5 pg de rMOMP levou ao aparecimento de um nível elevado de IgG anti-rMOMP. Como se mostra na Tabela 1, AMTs foram virtualmente os mesmos para os grupos 4 e 6, mas a combinação da emulsão e de imuno-estimuladores resultou num aumento de duas vezes do título médio de IgG específica de rMOMP. Os animais com simulação da imunização, usando apenas adjuvante (grupo 2), não teve efeito significativo nos títulos de anticorpos contra o antigénio recombinante de clamídia. Em quaisquer dos grupos, não se detectou IgA secretória específica de rMOMP nos lavados vaginais colhidos imediatamente antes da infecção.

Como se mostra na tabela 1, observou-se uma diferença significativa no perfil das subclasses de IgG entre os grupos contendo imuno-estimuladores (4 e 5) e o grupo 6 que foi imunizado com rMOMP emulsionado -16- com SB62. A utilização de MPL + QS21 causou um aumento significativo do nível relativo de IgG21 e um decréscimo do nível relativo de IgGl; o efeito máximo deste fenómeno foi atingido com a preparação não emulsionada.

Para avaliar se IgG específica de rMOMP consegue reagir de forma cruzada com clamídia da estirpe infectante heterotípica, os soros foram diluídos a 1:100 e testados individualmente num ensaio imunoenzimático quanto à sua capacidade para reconhecer as inclusões de clamídia em células infectadas fixadas com metanol. Demonstrou-se que todos os soros de ratinhos de cada grupo imunizado contêm IgGs que reagem com Chlamydia trachomatis serovar F estirpe NI1 utilizada na infecção. Assim, foram todos testados quanto à actividade de neutralização in vitro, independente do complemento, contra esta estirpe, usando soros de ratinhos submetidos a imunização simulada como testemunhas negativas. Os resultados foram inconsistentes comparativamente com os obtidos por ELISA e ensaio imunoenzimático uma vez que nenhum dos soros imunes foi capaz de reduzir significativamente a infecciosidade de clamídia. 1.7.4 Efeito da imunização heterotípica na fertilidade após infecção. Oito semanas após a última imunização (ou imunização simulada) com rMOMP e 4 semanas após infecção intrauterina (ou infecção simulada), os ratinhos foram acasalados com machos de 2 meses. O desenlace da infecção com a estirpe heteróloga NI1 na fertilidade de ratinhos C3H/HeOuJ foi medida através dos seguintes parâmetros: o número médio de recém-nascidos por grupo (N) e o tamanho médio das ninhadas (M). Comparado com os ratinhos não tratados, a fertilidade dos ratinhos inoculados com clamídia no grupo 2 (imunização simulada) foi significativamente alterada; este resultado confirmou a validade do modelo animal neste caso particular. Os animais imunizados e sujeitos a infecção simulada (grupo 3) apresentaram parâmetros reduzidos de fertilidade comparado - 17- com os não tratados; este grupo, projectado para se tomar em consideração a alteração não patológica da fertilidade animal, foi usado como testemunha para avaliar o potencial profilático das formulações de rMOMP. Como se mostra na tabela 1 foram observadas diferenças significativas nos níveis de fertilidade entre os grupos covacinados com imuno-estimulantes (grupos 4 e 5) e o grupo 6 que foi imunizado com rMOMP emulsionado em SB62. O grupo 5 apresentou os melhores resultados com 7 dos 10 ratinhos dando origem ao nascimento de ninhadas e parâmetros máximos de fertilidade; o valor N atingiu 50% do valor atribuído ao grupo 3 testemunha e o valor de M foi comparável ao calculado para o mesmo grupo testemunha. Pelo contrário, os parâmetros de fertilidade apresentados pelo grupo 6 sem imuno-estimulantes são comparáveis aos obtidos no grupo de controlo 2 infectado. A imunização com rMOMP, combinando imuno-estimuladores e a emulsão SB62 também resultou na protecção contra a infertilidade, mas a utilização da emulsão de SB62 pareceu diminuir parcialmente as taxas de protecção. Assim, demonstrou-se que a utilização de MPL mais QS21 oferece uma protecção parcial contra a infecção do tracto genital superior por clamídia e o efeito máximo deste fenómeno foi atingido com a preparação não emulsionada. 1.8 Conclusão

Os nossos resultados mostram que a imunização parentérica com rMOMP combinada com o adjuvante MPL+QS21 evitou, parcialmente, a infertilidade provocada por uma infecção do tracto genital de ratinho com clamídia heteróloga; pelo contrário, a injecção de rMOMP emulsionada com SB62 sem imuno-estimulantes não induz qualquer protecção. Por outro lado, todas as preparações induziram uma resposta de IgG total específica de MOMP forte e relativamente homogénea nos soros de animais imunizados; estes anticorpos conseguiram dar reacção cruzada com inclusões de clamídia fixadas - 18- com metanol, da estirpe infectante heterotípica, mas foram incapazes de reduzir a infecciosidade da clamídia in vitro. Imediatamente antes da infecção, não se detectou IgA específica de rMOMP na secreção vaginal que é consistente com o método de administração parentérica do antigénio. Assim, uma comparação dos títulos de IgG específica total, ou dos títulos de neutralização, com o desenlace da patologia para todos os grupos imunizados não revelou uma correlação significativa para qualquer uma destas comparações.

Os resultados destes estudos demonstram que um MOMP recombinante combinada com imuno-estimuladores MPL+QS21 é capaz de induzir protecção imunológica contra infertilidade causada por Chlamydia trachomatis. 2. Segunda série de experiências com várias formulações de MOMP e adjuvante 2.1 Testes de materiais e métodos

As estirpes de clamídia e de ratinhos foram idênticas às utilizadas na experiência descrita no exemplo 1.

2.2 Produção e formulação de MOMP A produção e a utilização da construção de DNA pET15-MOMP para a produção de antigénio estão descritas no Exemplo 1. O protocolo de purificação de antigénio foi modificado de forma a produzir maiores quantidades de antigénio sem endotoxina. Resumidamente, lavou-se 10 ml de resina His.Bind (Novagen) com 25 volumes de 2% de SDS, ureia 6M em água antes da realização do passo de purificação, de acordo com o fabricante, enquanto que 250 ml do lisado induzido sedimentado por centrifugação foi lavado com ureia 4M, NaCl - 19- 2Μ seguido de 2% de Zwittergen (Calbiochem) antes da solubilização em tris-HC1 pH 7,9, 0,5% SDS, NaCl 500 mM, imidazole 5 mM. O antigénio foi eluido em Tris-HCl pH 7,9, imidazole 100 mM, extensivamente dialisado contra Tris-HC1 5 mM, pH 7,4 e filtrado através de um filtro esterilizante de 0,22 pm (Millipore). Usou-se então um teste de lisado de amebócito de limulus (Coatest, Chromogenix) para avaliar o teor de LPS. 2.3 Formulação O antigénio foi formulado como descrito no exemplo 1 excepto a quantidade de MPL por dose ser ajustada a 10 pg; um grupo utilizando QS21 modificado como descrito nos pedidos de patente UK copendentes 9508326.7, 9513107.4 (publicado como WO 96/33739 e referido como DQ) foi também testado e adicionado à vacina na proporção de 10 pg por dose. Mais detalhadamente a vacina foi formulada através da adição de antigénio ao tampão. Adicionou-se então MPL como partículas de 100 nm. Num tubo separado, QS21 foi misturado com pequenos lipossomas unilamelares compostos por dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) e colesterol (DOPCrcolesterol = 4:1 p/p) de forma a que a proporção de QS21 para colesterol é de 1:5. (Nestas condições todo o QS21 foi incorporado na membrana lipossomal). A mistura de QS21/SUV (designada DQ) é então adicionada à mistura de antigénio/MPL. Nesta formulação o antigénio fica de fora, o MPL fica de fora, o QS21 fica nos lipossomas. 2.4 Vacinação no modelo de saipingite de ratinho, acompanhamento de fertilidade, resposta imunológica e exame histológico. A imunização, infecção experimental e colheita de amostras foram programadas como descrito atrás, excepto o grupo do controlo ser sujeito a imunização simulada com a emulsão contendo 10 pg de MPL e 10 pg de QS21 e -20- ter-se adicionado um grupo extra, imunizado com o antigénio combinado com MPL+DQ. Os grupos eram compostos de 15 ratinhos, 10 dos quais foram acasalados durante um período de 8 semanas enquanto que 5 foram mortos 2 semanas após a infecção para análise histopatológica e imunocitoquímica. Os parâmetros usados para o cálculo da fertilidade dos grupos são: F (número de ratinhos que deram origem a ninhadas uma ou mais vezes dividido pelo número total de ratinhos), M (número de ratinhos recém-nascidos (mortos ou vivos) dividido pelo número de ninhadas) e N (número de ratinhos recém-nascidos (mortos ou vivos) dividido pelo número total de ratinhos).

Os soros e lavados vaginais foram analisados relativamente aos anticorpos específicos de rMOMP por ELISA, os soros foram também examinados relativamente ao reconhecimento das inclusões de clamídia serovar F estirpe NI1 e neutralização da infecção heteróloga (NI1) in vitro. Todas as técnicas estão descritas supra.

Metade do tracto genital superior (ovário, oviducto e topo da trompa uterina) foram embebidos em composto OCT (Tissue-TEK, Miles), congelados rapidamente e as secções congeladas (10 pm) foram montadas em lâminas de vidro (Superforst, Menzel-glaser). As secções foram secas ao ar, fixadas em acetona durante 5 minutos e depois guardadas a -70°C. Para análise histopatológica, as secções re-hidratadas com água foram coradas com hematoxilina (H) e eosina (E). Para a coloração imnocitoquímica, as secções foram re-hidratadas em PBS, incubadas durante 60 minutos com 2 pg de mAb de biotinilado de rato antiCD4 ou CD8 de ratinho (Serotec) em 100 pl de PBS, lavadas 2 vezes com PBS e reincubadas 30 minutos com uma diluição de 1/2000 de HRP-estreptavidina (Zymed). Após lavagem, a cor foi revelada com um estojo DAB líquido (Zymed), contrastadas com hematoxilina e montadas permanentemente em acritol (Surgipath). -21 - 2.5 Ensaio de interferão gama

Nas semanas 0 e 2 os ratinhos foram injectados subcutaneamente, na base da cauda, com 200 μΐ da formulação ; o grupo controlo foi sujeito a uma simulação de vacinação com 10 pg de MPL e 10 pg de QS21 combinados com a emulsão. Os animais foram sangrados para análise serológica e depois mortos na semana 4, os baços foram removidos assepticamente, reunidos e a suspensão de células isoladas foram preparadas para restimulação com 1 pg/ml de rMOMP ou com 4/ ml de ConA (Boerhinger Mannheim) como testemunha. Assim as culturas foram estabelecidas em placas de cultura de 24 alvéolos de fundo plano usando 106 células respondedoras por ml de RPMI 1640 com 10% de soro fetal de vitela (Gibco-BRL). Os sobrenadantes colhidos às 96 horas após restimulação foram testados relativamente a IFN-gama usando um estojo de ELISA comercial (Cytoscreen, Biosource). 2.6 Resultados 2.6.1 Antigénio

Após diálise, a concentração de rMOMP foi calculada como sendo de aproximadamente 2 mg/ml e a contaminação com endotoxinas foi abaixo de 0,05 EU/pg rMOMP/. 2.6.2 Efeito da imunização com rMOMP combinado com adjuvante na resposta imunológica humoral, na sua fertilidade após infecção heterotípica e no infiltrado inflamatório resultante da infecção.

Os resultados da experiência destinada a avaliar o potencial profilático de rMOMP combinado com diferentes adjuvantes estão apresentados na tabela 2. -22- 2.6.3 Efeito da imunização na resposta humoral. A resposta humoral após vacinação foi avaliada em soros e lavados vaginais colhidos no dia após a infecção. Todas as formulações do antigénio deram títulos médios geométricos (GMT) de IgG anti-rMOMP semelhantes de aproximadamente 30000. Os animais sujeitos a imunização simulada com adjuvantes não tiveram títulos de anticorpos significativos contra o antigénio recombinante de clamídia. Em qualquer um dos grupos não se detectou IgA secretória específica de rMOMP nos lavados vaginais colhidos imediatamente antes da infecção. A isotipagem da resposta de IgG específica de rMOMP revelou que a presença de MPL e QS21 ou DQ aumentou o nível relativo de IgG2a quando comparado com a resposta induzida por MOMP apenas com a emulsão. Demonstrou-se que todos os soros imunes continham IgG reactiva com inclusões fixadas em metanol do serovar FC estirpe tracomatis NI1 utilizada para a infecção. 2.6.4 Efeito da imunização heterotípica na fertilidade após a infecção. O desenlace da infecção com a estirpe heteróloga NI1, relativamente à fertilidade dos ratinhos, foi medida através dos parâmetros F, N e M definidos nos processos experimentais. Para cada um dos grupos, os valores daqueles parâmetros, calculados ao longo da duração do período de acasalamento, estão apresentados na Tabela 1. Em oposição ao grupo com infecção simulada, a infecção do grupo com imunização simulada conduziu a uma quase completa infertilidade, indicando que a infertilidade observada é induzida por C. trachomatis e não pela manipulação dos animais. Entre os grupos imunizados com rMOMP combinada com imuno-estimuladores, a formulação MPL+DQ do antigénio levou a uma protecção parcial: neste grupo os valores dos parâmetros F e N atingiram cerca de 80% dos registados no grupo com infecção simulada (controlo positivo). Pelo contrário, a imunização antes da infecção com rMOMP formulado na emulsão levou a valores baixos dos parâmetros de fertilidade F e N. 2.6.5 Alterações histopatológicas após infecção

No que respeita à parte histopatológica da experiência de fertilidade, realizou-se a coloração clássica HE nas secções de tecidos a qual não revelou diferença marcada nos níveis de inflamação dos oviductos e dos ovários entre grupos com imunização simulada e grupos vacinados. No entanto, quando se analisou a frequência das subséries de células TI por coloração imunocitoquímica, as células T CD4 positivas foram detectadas apenas no grupo vacinado MPL+DQ (4 de 4 ratinhos), enquanto as células T CD8 positivas foram detectadas nos grupos imunizados e com imunização simulada (tabela 3). Assim, nesta experiência, as células T infiltrantes CD4 positivas foram encontradas apenas no grupo vacinado com MPL+DQ, o qual foi o único grupo a ser protegido no que respeita à parte da fertilidade na experiência. 2.6.6 Efeito da formulação na secreção de IFN gama quando da restimulação in vitro. A activação celular induzida pelas formulações de antigénio (tabela 4) foi analisada em duas experiências separadas. Por um lado, as células do baço isoladas a partir dos animais vacinados com rMOMP combinado com MPL+QS21 ou MPL+DQ, e estimulados novamente in vitro com o antigénio, apresentaram concentrações de IFN-gama nos sobrenadantes de cultura comparáveis às obtidas por estimulação, durante o mesmo período, com 4 pg/ml de concanavalina A. Por outro lado, as células isoladas a partir de animais com vacinação simulada, ou vacinados com rMOMP sem imuno-estimulantes, não -24- produziram níveis detectáveis de IFN-gama, enquanto as suas contrapartes cocultivadas com ConA eram todas positivas para aquela citocina. A análise serológica realizada em lotes de soros de cada grupo revelou que a secreção de IFN-gama estava associada a um aumento da proporção de antigénio-IgG2a específica.

Conclusão

Na globalidade, os resultados dos testes com infecção e do ensaio de detecção do IFN-gama sugerem que, no ratinho, a combinação dos dois adjuvantes MPL e QS21 ou DQ com um MOMP recombinante induz uma resposta imunológica do tipo Thl específica de antigénio, determinada pela secreção de IFN-gama e pelas proporções elevadas de IgG2a, as quais podem resultar na protecção contra infertilidade resultante da infecção por clamídia.

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Tabela 2

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Tabela 3

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Tabela 4

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Gz -33-Lisboa, 25 de Agosto de 2000 Ί

JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição de vacina compreendendo uma proteína MOMP derivada de clamídia conjuntamente com QS21 e3DMPL.
2. 2. Uma vacina como reivindicado na reivindicação 1, em que a proteína deriva de clamídia serovar L2.
3. 3. Uma vacina como reivindicado na reivindicação 1 ou 2, compreendendo ainda uma proteína de um serovar diferente.
4. 4. Uma vacina como reivindicado na reivindicação 1 que ainda compreende um esterol.
5. 5. Uma vacina como reivindicado na reivindicação 4, em que o esterol é colesterol.
6. 6. Uma vacina como reivindicado na reivindicação 5, em que QS21 está associada comum lipossoma contendo colesterol.
7. 7. Uma vacina como reivindicado na reivindicação 6, em que o antigénio está por fora do lipossoma.
8. 8. Uma vacina como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 5 a 7 em que a proporção de QS21 relativamente a colesterol é de aproximadamente 1:5. -2-
9. 9. Um método para a produção de uma vacina compreendendo a adição de 3D-MPL ao antigénio MOMP e depois adição de QS21.
10. 10. Uma vacina como aqui reivindicado para usar como um medicamento.
11. 11. Utilização da proteína MOMP derivada de clamídia conjuntamente com QS21 e 3D-MPL na produção de uma vacina para reduzir a infertilidade induzida por clamídia. Lisboa, 25 de Agosto de 2000

    JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial. RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA