JPH05339169A

JPH05339169A - 経口ワクチン

Info

Publication number: JPH05339169A
Application number: JP4036493A
Authority: JP
Inventors: Harutsugu Tsuchiya; 晴嗣土屋; Yukihiko Aramaki; 幸彦新槇; Hisashi Hara; 寿史原; Hiroshi Kikuchi; 寛菊池; Kiyoto Yanai; 清人谷内; Kiyoshi Ikeuchi; 澄池内
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1992-03-03
Filing date: 1993-03-02
Publication date: 1993-12-21

Abstract

(57)【要約】【目的】経口投与後効率的に抗体を産生せしめ感染防
御効果が得られる経口ワクチンを提供する。【構成】抗原と脂質からなる複合体であって、脂質と
してマンノースを結合している糖脂質および／またはホ
スファチジルセリンである燐脂質を含んでいる経口投与
用ワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、経口投与後効率的に抗
体を産生せしめる経口ワクチンに関する。本発明の経口
ワクチンは、生体に経口投与後、保持した抗原に対する
抗体を効率的に産生せしめ、感染防御効果が得られるも
のである。

【０００２】

【従来の技術】現行のワクチンのほとんどは皮下に接種
する注射剤であるが、少頻度で起こる副作用や投与時の
疼痛が臨床上問題となっている。これを改良するための
様々な投与方法の検討がなされてはいるが、経口ワクチ
ンは安全性と投与方法の便利さから、その早期開発が最
も望まれている剤形である。

【０００３】経口ワクチンの検討は、従来より緩衝剤、
腸溶コーティング錠剤、マイクロパーティクル、ナノパ
ーティクル、アジュバント物質などを用いて行われてき
たが、未だ成功には至っていない(International Journ
al of Pharmaceutics,75, 1(1991)、Journal of Clinica
l Pharmacy and Therapeutics,16,309 (1991))。また、
これら総説においては、オーソドックスな膜組成のリポ
ソームを用いた経口ワクチンへの応用例も紹介されては
いるが、多少の抗体価の上昇は認められたものの、実用
化にはほど遠いことが記されている。

【０００４】いずれにしても、従来技術においては、経
口投与後、抗体を効率的に産生せしめる手段はなかった
といえる。

【０００５】ホスファチジルセリンで膜を修飾したリポ
ソームを静脈注射した例は知られており（Cancer Resea
rch, 40,4460 (1980))、また、マンノース誘導体または
マンナン誘導体で膜を修飾したリポソームが肝臓や肺に
集積性があるとの報告がある(Biochimica et Biophysic
a Acta 632,562 (1980) 、病態生理 6, 771 (1985))。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、生体に経口
投与後、保持した微生物抗原もしくは弱毒化微生物等の
抗原に対する抗体を効率的に産生することができる経口
ワクチンを提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、抗原と脂質の
複合体である経口投与用ワクチンに関するが、この複合
体は、脂質としてマンノースを結合している糖脂質およ
び／またはホスファチジルセリンである燐脂質を含んで
いることにより経口投与によっても抗体価を上げること
ができる。

【０００８】複合体は、抗原である蛋白質や糖蛋白質と
脂質とが疎水結合および／または水素結合により不規則
に配列した集合体である場合と脂質膜構造体である場合
とに分けることができる。

【０００９】本発明の脂質膜構造体は広い意味で解釈す
べきであり、脂質を有し脂質が膜を形成している場合ま
たは油成分と水成分が境界として膜を形成している場合
があり、両親媒性脂質の極性基が界面の水相側に向かっ
て配列した膜構造を有する粒子ということもでき、具体
的にはリポソーム、エマルジョンあるいは水溶性ミセル
が例示される。本発明は、この複合体が脂質としてマン
ノースを結合している糖脂質および／またはホスファチ
ジルセリンである燐脂質を含んでいることにより、上記
課題を解決できるとの知見に基づいてなされたのであ
る。

【００１０】本発明のワクチンは、場合によっては更に
アジュバント物質が添加されていてもよい。

【００１１】ワクチンに使用する抗原はこの分野の研究
者が良く理解しているものであるが、例えば微生物の抗
原もしくは弱毒化微生物としては、インフルエンザウイ
ルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、インフルエン
ザウイルスＣ型、ロタウイルス、サイトメガロウイル
ス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、エイズウイルス
（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ
型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペス
ウイルス１型・２型、ＡＴＬ（成人型Ｔ細胞白血病）ウ
イルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、突
発性発疹ウイルス（ＨＨＶ−６）、麻疹ウイルス、風疹
ウイルス、ムンプス（おたふくかぜ）ウイルス、ポリオ
ウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルスなどのウ
イルス類、虫歯連鎖球菌、コレラ菌、インフルエンザ
菌、肺炎球菌、百日咳菌、ジフテリア菌、破傷風菌など
の菌類、クラミジアなどのリケッチア類、マラリア病原
虫などの原虫類等の微生物の蛋白質抗原、もしくはこれ
ら微生物そのものの病原性を弱めた弱毒化微生物等を挙
げることができる。なお、微生物の蛋白質抗原として
は、インフルエンザウイルスの場合には、ヘマグルチニ
ン（ＨＡ）やノイラミニダーゼ（ＮＡ）の単品もしくは
混合物を、本発明の経口ワクチンに保持させるものとし
て例示することができる。

【００１２】これらの抗原は、微生物から加工、精製す
る等の方法で得ることができるが、合成によって得るこ
ともでき、さらに遺伝子工学的に製造することもでき
る。

【００１３】また、本発明の経口ワクチンが保持しうる
抗原は、脂質膜構造体の種類によっても異なる。例え
ば、リポソームが保持しうるものとしては特に制限がな
く、水溶性あるいは脂溶性の微生物抗原もしくは弱毒化
微生物等を挙げることができる。またエマルジョンの場
合には脂溶性の抗原を、ミセルの場合には水難溶性の抗
原を保持可能なものとして挙げることができる。

【００１４】本発明にかかわるホスファチジルセリンと
しては、大豆、卵黄等の天然物に由来するホスファチジ
ルセリン、これらを水素添加した水素添加ホスファチジ
ルセリン、または、大豆、卵黄等の天然物に由来するホ
スファチジルコリンから半合成により得られるホスファ
チジルセリン、これらを水素添加した水素添加ホスファ
チジルセリン、さらに半合成もしくは全合成のジミリス
トイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファ
チジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン等
が挙げられるが、好ましくは水素添加ホスファチジルセ
リン、ジパルミトイルホスファチジルセリンおよびジス
テアロイルホスファチジルセリンである。

【００１５】本発明にかかわるマンノースを結合してい
る糖脂質としては、マンノース残基を有するホスファチ
ジルエタノールアミンの誘導体（Biocheimica et Bioph
ysica Acta, 632 562 (1980)) やコレステロールの誘導
体 (Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77,4430 (1980)) 、ジ
マンノシルジグリセリド (Biochemical and Biophysica
l Research Communications, 110,140 (1983))、マンノ
ビオース脂肪酸エステル及びアミド（特開平 1-104088
号）、ホスファチジルマンノース等、多糖であるマンナ
ンに脂肪酸やコレステロールが部分的に置換された誘導
体（病態生理、6,771 (1985)）等を挙げることができ
る。さらに具体的な化合物としては、4-0-(6-O- エイコ
サノイル- β-D- マンノピラノシル)-D-マンノピラノー
スおよびN-(2-N'-コレステリルカルボキシメチル）カル
バミルメチルマンナンを挙げることができる。

【００１６】これら膜成分としての燐脂質（ホスファチ
ジルセリン）および糖脂質は、単品もしくは混合物とし
て、ホスファチジルコリン類（レシチン）、スフィンゴ
ミエリン等の他の膜成分を主体とした脂質膜構造体に添
加すれば良いが、これらのみで脂質膜構造体を形成して
も良い。

【００１７】即ち、ホスファチジルセリン類はこれ単独
でもリポソームやエマルジョンを形成することは可能で
あるし、マンノースを結合している糖脂質（マンノビオ
ース脂肪酸エステルやアミド）はこれ単独でエマルジョ
ンやミセルを形成することが可能である。したがって、
本発明においては、本脂質膜構造体に膜成分として用い
られるホスファチジルセリン、マンノースを結合してい
る糖脂質の添加比率は上限においては何ら限定されるも
のではない。下限については、全脂質膜成分に対しモル
分率で１％以上とするのがよく、 5〜50％添加すること
が望ましい。

【００１８】他の膜成分としては、ホスファチジルコリ
ン類（レシチン）、例えば、ホスファチジルコリン、大
豆や卵黄等の天然物由来のホスファチジルコリンに水素
添加した水素添加ホスファチジルコリン、半合成もしく
は全合成ジミリストイルホスファチジルコリン、半合成
もしくは全合成ジパルミトイルホスファチジルコリンお
よび半合成もしくは全合成ジステアロイルホスファチジ
ルコリン等や、スフィンゴミエリン等の脂質を挙げるこ
とができる。

【００１９】また、他の脂質として荷電脂質を加えてリ
ポソームの物理的安定化を図ることもできる。荷電脂質
の例としては、ジアルキルホスフェート、ジアシルホス
ファチジン酸、ステアリルアミン、ホスファチジルグリ
セロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジ
ルエタノールアミンまたはイオン性界面活性化剤（酸性
または塩基性）を示すことができる。

【００２０】さらに、リポソームの物理的および生物学
的安定を図るためにコレステロール等のステロール類を
加えることもある。

【００２１】本発明において、場合によっては更にアジ
ュバント物質を添加することもできる。アジュバント物
質としては、例えば、結核菌の細胞壁にあるアジュバン
ト物質の最少有効物質である(N-アセチルムラモイル)-L
-アラニル-D-イソグルタミン（ムラミルジペプチド、Ｍ
ＤＰ）並びにその誘導体、例えば、6-O-(2-テトラデシ
ルヘキサデカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-アラニ
ル-D-イソグルタミン（Ｂ30−ＭＤＰ）、6-O-(2-テトラ
デシルヘキサデカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-ア
ラニル-D-グルタムアミド（Ｂ30−ＭＤＰアミド体）、N
²-[(N-アセチルムラモイル)-L-アラニル-D-イソグルタ
ミニール]-N⁶-ステアロイル-L-リジン（ＭＤＰ−Lys[L1
8]）等を挙げることができる。水溶性であるムラミルジ
ペプチドの場合には、脂質膜構造体としてはリポソーム
が適用でき、リポソームの内水相に保持させれば良い。
このムラミルジペプチドの添加量は何ら限定されるもの
ではなく、水性溶媒への飽和溶解度まで添加可能であ
る。また脂溶性であるムラミルジペプチド誘導体の場合
には、脂質膜構造体としてはリポソーム、エマルジョ
ン、ミセルが適用できる。全脂質膜成分に対する添加比
率は何ら限定されるものではないが、モル分率で0.1 ％
以上とするのがよく、 1〜30％添加することが好まし
い。

【００２２】本発明のワクチンは、経口投与によって抗
体価をあげ感染を防御することに特徴を有するが、用量
としては成人一人一回当りインフルエンザワクチンで50
μg乃至 5mg、通常は 200μ乃至 2mg である。これを
一回投与するか、または一週間間隔で２回投与するか、
二週間間隔で２回投与するか、三週間間隔で２回投与す
るか、もしくは一か月間隔で２回投与するように応用す
ることもできる。さらに、同様な間隔で３回投与、４回
投与、５回投与、６回投与することもある。通常は単回
投与または一か月間隔での２〜４回投与である。また、
Ｂ型肝炎ワクチンの場合には用量としては成人一人一回
当たり20μg 乃至5mg 通常は50μg 乃至2mg である。用
法としては注射用ワクチンと同様に考えることができ
る。これ以外の抗原に対するワクチンに関しても、注射
用のワクチンの同量から20倍量で、用法もこれらに準じ
て適宜投与すれば良い。もちろん、投与される個人の免
疫応答性や年令等に応じて適宜増減する場合があっても
よい。

【００２３】本発明で使用するホスファチジルコリン、
ホスファチジルセリンおよびコレステロール等は生体成
分であることから毒性は低いと考えられる。Y.M.Rustum
らが卵黄由来のホスファチジルコリン、ホスファチジル
セリンおよびコレステロールで調製したリポソームの急
性毒性を試験しているが、50% 致死毒性は5.5g/kg 以上
である(Cancer Research 39,1390〜1395 (1979) 参
照）。次に本発明のワクチンの製造法を説明する。

【００２４】ａ）リポソーム型ワクチンの製造法微生物の抗原もしくは弱毒化微生物そのものと、ホスフ
ァチジルセリン類（レシチン）、スフィンゴミエリン等
の膜成分物質と、ホスファチジルセリン及び／またはマ
ンノースを結合している糖脂質と、場合によっては更に
アジュバント物質とを用いて、公知の方法（例えば、Ann
ual Review of Biophysics and Bioengeneering, 9, 46
7 (1980))に従いリポソームの水分散液を調製する。か
かるリポソームには安定化剤としてコレステロール等の
ステロール類、ジアルキルホスフェート、ジアシルホス
ファチジン酸、ステアリルアミン等の荷電脂質及びα−
トコフェロール等の酸化防止剤を含ませても良い。

【００２５】ｂ）エマルジョン型ワクチンの製造法微生物の抗原もしくは弱毒化微生物そのものと、レシチ
ン、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Twe
en) 等の両親媒性物質と、大豆油等の油脂と、ホスファ
チジルセリンおよび／またはマンノースを結合している
糖脂質と、場合によっては更にアジュバント物質とを用
い、公知のエマルジョン調製方法に従ってエマルジョン
を調製する。

【００２６】ｃ）ミセル型ワクチンの製造法微生物の抗原もしくは弱毒化微生物そのものと、ポリオ
キシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Tween) 、脂肪
酸ナトリウム、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等のミ
セル形成界面活性物質（ミセル形成臨界濃度以上の濃度
で水性溶媒に加える）と、ホスファチジルセリンおよび
／またはマンノースを結合している糖脂質と、場合によ
っては更にアジュバント物質とを用い、公知のミセル調
製方法に従ってミセルの水分散液を調製する。

【００２７】

【発明の効果】本発明の経口ワクチンは、生体に経口投
与後、保持した抗原に対する抗体を効率的に産生せしめ
るものである。したがって、従来経口では吸収されず、
その抗体産生が不可能であった微生物抗原もしくは弱毒
化微生物の経口ワクチンを可能ならしめたのである。

【００２８】

【実施例】本発明を、微生物の蛋白質抗原のモデルとし
て牛血清アルブミン（ＢＳＡ）並びにインフルエンザウ
イルス抗原およびＢ型肝炎ウイルス抗原を用いて実施例
及び試験例により説明するが、本発明はこれによって限
定されるものではない。なお、実施例において、脂質膜
構造体に封入されることなく、脂質膜構造体と遊離して
抗原蛋白の存在する場合あるいは別な形の複合体が存在
することもあるが、必要に応じてこれを超遠心分離法、
ゲル濾過法等の操作により除去して用いても、除去せず
に用いてもかまわない。

【００２９】実施例１〜４：牛血清アルブミン(BSA) を
保持したリポソーム型経口ワクチンａ）ＢＳＡ封入リポソームの調製膜組成比がジステアロイルホスファチジルコリン(DSP
C)：水素添加ホスファチジルセリン (H-PS)：コレステ
ロール (Chol) ＝1:1:2（モル比）からなる脂質160mg
に、クロロホルム：メタノール＝9:1 混液を20ml加えて
溶解し、ロータリーエバポレーターを用いて37℃で加温
しながら溶媒を留去した。更に真空下で２時間乾燥し、
リピドフィルムを調製した。これに生理食塩液に溶解し
たそれぞれの濃度のＢＳＡ（表１参照）を 4ml加え、ボ
ルテックスミキサーで50℃、10分間の撹拌を行い、多重
層リポソーム (MLV 、multilamellar vesicle) を調製し
た。引きつづき、遠心分離(35,000 ×ｇ、 4℃、20分）
を行い、上清を除去し、沈澱物に生理食塩液4ml を加え
て再懸濁した。この遠心分離操作を３回繰り返し、遊離
のＢＳＡを除去した。このように調製したリポソーム懸
濁液を0.1 μｍのポリカーボネート製メンブランフィル
ターを用いて３リットルの生理食塩液に対して１２時間
透析を行い、粒子径が0.1 μｍ以下のリポソームを除去
して、最終的に表１右に示すＢＳＡ封入リポソーム型経
口ワクチンとした。

【００３０】

【表１】

【００３１】最終リポソーム懸濁液：DSPC/H-PS/Chol＝
54.4/51.2/54.4 (mg) マウス１匹あたり１回 0.5ml投与するので、脂質投与量
は10μmol、ＢＳＡ投与量は50μg（実施例１）〜400 μ
g （実施例４）となる。

【００３２】ｂ）免疫試験調製したＢＳＡ封入リポソーム懸濁液もしくは対照例と
してのＢＳＡ単独水溶液（ＢＳＡ投与量をリポソーム群
と一致させた）を表２に示すスケジュールに従い、胃ゾ
ンデを用いてＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、７週齢）に１回
あたり0.1ml ずつ経口投与した（１群６匹）。血中及び
唾液中の抗体価を測定するために、血液は眼窩採血によ
り採取し、唾液は、マウスに12mg/ml のペントバルビタ
ールを0.1ml腹腔内投与して麻酔し、0.2mg/mlピロカル
ピンを腹腔内投与した後、パスツールピペットを口内に
挿入し採取した。

【００３３】

【表２】

【００３４】ｃ）抗体価測定血清中のＩｇＧ、ＩｇＡ及び唾液中のＩｇＡ抗体価は下
に示すＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。

【００３５】［ＥＬＩＳＡ法］炭酸緩衝液(pH 9.4)に溶
解した 100μg/mlのＢＳＡをマイクロプレートの各ウエ
ルに50μl ずつ加え、４℃で一夜放置し抗原であるＢＳ
Ａをマイクロプレートに固定した後、0.05％のTween 20
を含むリン酸緩衝液(PBST) 100μl/wellで３回洗浄し余
分なＢＳＡを除去する。次に、３％スキムミルクでブロ
ッキングを行い、ＰＢＳＴで３回洗浄し余分なスキムミ
ルクを除去した後、マウスから採取した血清をＰＢＳＴ
で倍倍希釈したものを50μl/wellずつ加え、25℃で２時
間インキュベーションする。ＰＢＳＴ 100μl/wellで３
回洗浄して血清を除去し、500ng/mlの濃度の抗マウス抗
体ＩｇＧ、あるいはＩｇＡコンジュゲート・ホースラデ
イッシュ・パーオキシダーゼ50μl を各ウエルに加え、
２５℃で２時間インキュベーションする。ＰＢＳＴ 10
0 μl/well で３回洗浄し、余分な抗マウス抗体を除去
し、0.015 ％過酸化水素を含む2,2'-アジノ−ビス(3-エ
チルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）(500ng/ml)を50
μl/well加え、37℃で20分間インキュベーション後、マ
イクロプレートリーダーで405nm における吸光度を測定
する。抗体価(antibody titer)は、吸光度が血清では0.
2、唾液では0.1 を越える最大の希釈倍率を 2nとし、ｌ
ｏｇ₂2ⁿ で表す。

【００３６】ｄ）試験結果表２に示すスケジュールで試験した時の血清中ＩｇＧ、
ＩｇＡ抗体価並びに唾液中のＩｇＡ抗体価を表３−１〜
４及び表４−１〜３に示す。試験例１の５日間連続投与
の場合（表３−１〜４）、対照例のＢＳＡ水溶液経口投
与群では血清中ＩｇＧ抗体価は若干の上昇傾向が認めら
れたものの、実施例の経口ワクチン投与群の方が明らか
にその抗体価の上昇は大きかった。また血清中ＩｇＡ抗
体価については、ＢＳＡ水溶液群では投与量を増加させ
ても全くその変化が認められなかったが、経口ワクチン
投与群では確実な抗体価の上昇を認めることができた。

【００３７】

【表３】

【００３８】

【表４】

【００３９】

【表５】

【００４０】

【表６】

【００４１】試験例２の１週間ごと５回投与の場合（表
４−１〜３）の結果は以下の通りであった。即ち、対照
例のＢＳＡ水溶液経口投与群では、血清中ＩｇＧ抗体価
は試験例１と同様の若干の上昇傾向しか認められず、投
与方法に基づく差も特に認められなかった。これに対し
て、実施例のリポソーム経口投与群では、試験例２の投
与スケジュールの方が更にその抗体価が上昇する傾向が
認められ、対照のＢＳＡ水溶液群と比較して明らかに抗
体価が高かった。また血清中ＩｇＡ抗体価については、
ＢＳＡ水溶液群では、試験例１と同様、投与量を増加さ
せても全くその変化が認められなかったが、リポソーム
投与群では確実な抗体価の上昇を認めることができた。
唾液中ＩｇＡ抗体価についても、ＢＳＡ水溶液投与群に
比べ、明らかにリポソーム投与群の方が高い価が得られ
た。

【００４２】

【表７】

【００４３】

【表８】

【００４４】

【表９】

【００４５】以上から、モデル抗原として牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）を用いて製造された本発明のワクチン
は、経口投与することにより、生体に対して効率的に抗
体を産生せしめることが明らかとなった。

【００４６】実施例５〜８：ａ）インフルエンザＨＡ抗原封入リポソーム型経口ワク
チンの調製膜組成比がジステアロイルホスファチジルコリン(DSP
C)：水素添加ホスファチジルセリン(H-PS)：コレステロ
ール(Chol)＝1:1:2（モル比）からなる脂質160mgに、ク
ロロホルム：メタノール＝9:1混液を20ml加えて溶解
し、ロータリーエバポレーターを用いて37℃で加温しな
がら溶媒を留去する。更に真空下で２時間乾燥し、リピ
ドフィルムを調製する。これにリン酸緩衝化生理食塩液
（ＰＢＳ、pH7.4)に分散したそれぞれの濃度のインフル
エンザＨＡ抗原（表５参照）を4ml 加え、ボルテックス
ミキサーで10分間の撹拌を行い、多重層リポソーム(ML
V、multilamellar vesicle) を調製する。最終的には、
これらをＰＢＳにより3.5 倍希釈して、表５右に示すイ
ンフルエンザＨＡ抗原封入リポソーム型経口ワクチンと
する。

【００４７】

【表１０】

【００４８】最終リポソーム懸濁液：DSPC/H-PS/Chol＝
54.4/51.2/54.4 (mg) マウス１匹あたり１回0.5ml 投与するので、脂質投与量
は10μmol 、ＨＡ抗原投与量は10μg （実施例５）〜80
μg （実施例８）となる。

【００４９】ｂ）免疫試験調製したインフルエンザＨＡ抗原入リポソーム懸濁液も
しくは対照例としてのＨＡ抗原単独のＰＢＳ液（ＨＡ抗
原投与量をリポソーム群と一致させる）を表６に示すス
ケジュールに従い、胃ゾンデ用いてＢＡＬＢ／ｃマウス
（雄、７週齢に１回あたり0.5ml ずつ経口投与する（１
群６匹）。血中及び唾液中の抗体価を測定するために、
血液は眼窩採血により採取し、唾液は、マウスに12mg/l
のペントバルビタールを0.1ml 腹腔内投与して麻酔し、
0.2mg/mlピロカルピンを腹腔内投与した後、パスツール
ピペットを口内に挿入し採取する。

【００５０】

【表１１】試験例３のＨＡ抗原投与量：10、20、40、80 μg/１回／マ
ウス

【００５１】ｃ）抗体価測定血清中のＩｇＧ、ＩｇＡ及び分泌型のＩｇＡ抗体価の測
定は、ＢＳＡ封入リポソーム型ワクチンの場合と同様に
行い、ＨＡ抗原封入リポソームの抗体価の上昇が優れて
いることが認められる。

【００５２】実施例９〜１１：ａ）インフルエンザウイルス抗原またはＢ型肝炎ウイル
ス抗原封入リポソーム型経口ワクチンの調製ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)19.3mg、コ
レステロール(Chol)19.3mgおよび水素添加大豆ホスファ
チジルセリン(HSPS) 18.2mg にクロロホルム：メタノー
ル混液(9:1 体積比) を50ml加えて溶解し、ロータリー
エバポレーターを用いて50℃に加温しながら溶媒を留去
した。次いで真空下で２時間乾燥しリピドフィルムを調
製した。これにリン酸緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ）に懸
濁した抗原（表７参照）を 2ml加え、ボルテックスミキ
サーで50℃、10分間撹拌した。これを50℃に加温しつ
つ、孔径0.6 μのポリカーボネート製メンブランフィル
ターで２回加温濾過し、多重層リポソームを調製した。

【００５３】

【表１２】

【００５４】得られたリポソーム型経口ワクチンの粒子
径を準弾性光散乱法（ダイナミック光散乱計DLS-700、
大塚電子株式会社製）により測定した。結果を表８に示
す。抗原蛋白の不在下で調製したリポソームを対照例と
した。

【００５５】

【表１３】

【００５６】これらの経口ワクチンの形態をネガティブ
染色法により染色し、透過型電子顕微鏡観察を行った。
実施例と対照例ともリポソームとしての形態をしている
ことを確認した。

【００５７】ホスファチジルセリンとして、水素添加卵
黄ホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジ
ルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパ
ルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホス
ファチジルセリンもしくは牛脳由来のホスファチジルセ
リンを用いた経口ワクチンも同様に調製できる。

【００５８】実施例１２：4-0-(6-O-エイコサノイル-
β-D- マンノピラノシル)-D-マンノピラノース 6.4mg、
ジステアロイルホスファチジルコリン 32.0mg、コレステ
ロール 19.3mg、ジセチルホスフェート 5.5mgを、抗原と
してA/PR/8(H1N1)由来のインフルエンザウイルス不活化
抗原(2mg/ml)を2ml 用いて実施例９と同様にして多重層
リポソームを調製した。

【００５９】実施例１３：膜成分にマンナン誘導体を含
有する経口ワクチンの調製ジステアロイルホスファチジルコリン32.0mg、コレステ
ロール19.3mgおよびジセチルリン酸5.5mg を、抗原とし
てA/PR/8(H1N1)由来のインフルエンザウイルス不活化抗
原(2mg/ml)を2ml 用いて実施例９と同様にして多重層リ
ポソームを調製した。

【００６０】ＰＢＳ10mlにN-(2-N'-コレステリルカルボ
キシアミノメチル）カルボキシメチルマンナン 10.0mg
を溶解し、これを上記のリポソーム懸濁液に加え、液温
を20℃に保ちながら２時間攪拌し、膜成分にマンナン誘
導体を含有するリポソーム型経口ワクチンを得た。

【００６１】実施例１２および１３で得た経口ワクチン
の粒子径を前記と同様にして測定した。重量平均粒子径
±標準偏差(nm)は実施例１２が443.7 ±208 (nm)実施例
１３が450.7 ±211 (nm)であった。また、透過型電子顕
微鏡観察を同様に行ってリポソームとしての形態を取っ
ていることを確認した。

【００６２】マンノース誘導体として、マンノース残基
を有するホスファチジルエタノールアミンの誘導体、マ
ンノース残基を有するコレステロールの誘導体、ジマン
ノシルジグリセリド、ホスファチジルマンノースを用い
る経口ワクチンも同様に調製できる。

【００６３】実施例１４：膜成分にマンノース誘導体ま
たはマンナン誘導体およびホスファチジルセリンを含有
する経口ワクチンの調製水素添加大豆ホスファチジルセリン20.0mg、ジステアロ
イルホスファチジルコリン20.0mgおよびコレステロール
19.3mgを用いて実施例９と同様にして多重層リポソーム
を製した。

【００６４】N-(2-N'-コレステリルカルボキシメチル）
カルバミルメチルマンナン10.0mgをＰＢＳ 10 mlに溶解
し、これを上記のリポソーム懸濁液中に添加し、液温を
20℃に保ちながら、２時間撹拌し経口ワクチンを得た。

【００６５】得た経口ワクチンの重量平均粒子径±標準
偏差は476.9 ±206 (nm)であった。また、透過型電子顕
微鏡観察によりリポソームとしての形態を取っているこ
とを確認した。

【００６６】実施例１５：ａ）アジュバント物質を添加した経口ワクチンの調製 (6-O-(2-テトラデシルヘキサデカノイル)-N-アセチルム
ラモイル)-L-アラニル-D-グルタミン 10mg 、水素添加
大豆ホスファチジルセリン20.0mg、ジステアロイルホス
ファチジルコリン20.0mgおよびコレステロール19.3mgを
実施例９と同様に処理し多重層リポソームを調製した。
重量平均粒子径±標準偏差は461.2 ±210 (nm)であっ
た。また、透過型電子顕微鏡観察によりリポソームとし
ての形態を取っていることを確認した。

【００６７】アジュバント物質として、(6-O-(2-テトラ
デシルヘキサデカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-ア
ラニル-D-グルタムアミドおよびN²-[N-アセチルムラモ
イル)-L-アラニル-D-イソグルタミニール]-N⁶-ステアロ
イル-L-リジンを用いて同様に経口ワクチンを調製でき
る。

【００６８】ｂ）免疫試験実施例９で得たインフルエンザウイルス不活化抗原(ina
ctivated whole virusparticles、0.05%ホルマリンで固
定）入りリポソーム懸濁液を表９に示すスケジュールに
従い、マウス用胃ゾンデを用いてBALB/cCr Slcマウス
（雌、７週齢）に１回あたり0.2ml ずつ経口投与した
（１群５匹）。免疫投与開始３週後（21または22日）に
各群のマウスから血清および腸管洗浄液を採取し、それ
らの投与した抗原に特異的なＩｇＧおよびＩｇＡ抗体価
をＥＬＩＳＡを用いて測定した。

【００６９】血清および腸管洗浄液の調製は以下の手
順、手法を用いた。エーテル麻酔下、マウスの腋下静脈
を切断し採血した。得た血液は3000rpm で10分間遠心し
て血清分離し、抗体測定に供した。採血後、同一マウス
を開腹し、腸を摘出し、回腸と盲腸の結合部で腸を切断
した。胃、十二指腸結合部から25針付き注射筒(10ml
用) でサンプリング液(ELISAmate: ＫＰＬ社のDiluent/
BlokingSolution) 5ml をゆっくり注入し、回腸末端部
から出てくる腸管洗浄液をシャーレに受けた。その洗浄
液を2000rpm で10分間遠心後、上清を抗体測定に供し
た。各サンプルは測定時まで-20 ℃に保存した。

【００７０】

【表１４】

【００７１】ｃ）抗体価測定血清中および腸管洗浄液の、投与した抗原に特異的なＩ
ｇＧおよびＩｇＡ抗体価測定は、ＫＰＬ社 (Kirlegaard
& Perry Lab.Inc.)のＥＬＩＳＡ測定用キット(ELISAma
te) を用い、そのプロトコールに記載してある方法に準
じておこなった。

【００７２】その結果、血清中に抗原に特異的なＩg
Ａ、Ｉg Ｇの産生が、腸管洗浄液中にＩg Ａの産生が認
められた。

【００７３】［ＥＬＩＳＡ法］コーティング緩衝液に溶
解した2.5 μg/mlの抗原を96穴マイクロプレートの各ウ
エルに50μlずつ加え、室温で１時間静置し、抗原をマ
イクロプレートに固定する。各ウエルの液を捨て、ペー
パータオル上でプレートを良くはたいて完全に液を除去
した後、ブロッキング液100 μl ずつを各ウエルに加
え、室温で５分間静置する。ウエルの液を除去後、マウ
スから調製した、血清および腸管洗浄液の２倍段階希釈
液各50μl ずつを各ウエルに加え、室温で１時間静置す
る。ウエルの液を除去後、洗浄液 200〜300 μl で４回
洗浄を繰り返す。ウエルの液を除去後、ペルオキシダー
ゼ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体あるいはペルオキシダ
ーゼ標識抗マウスＩｇＡ（α）抗体の200 倍希釈液、50
μl ずつを各ウエルに加え、室温で１時間静置する。ウ
エルの液を除去し、 200〜300 μl の洗浄液で４回洗浄
後、洗浄液でウエルを満たし、室温でさらに５分間静置
する。ウエルの液を除去後、ペルオキシダーゼ基質溶液
50μl ずつを各ウエルに加え、室温で20分静置後、ペル
オキシダーゼ反応停止液50μl ずつを各ウエルに加えて
反応を停止し、プレートミキサーで撹拌する。各ウエル
の405nm における吸光度をELISA READER(Multiskan PLU
S: Titertek社）で測定する。抗体価は、同時に測定す
る標準サンプル（抗体価が既知のサンプル) の各希釈で
の吸光度を式１に示すlogit-log変換式でＹを求め、縦
軸にlogit Y を横軸に抗体価の対数値をプロットし、標
準直線を引き、その標準直線を基に、各サンプルの抗体
価を算出する。

【００７４】

【式１】

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 47/24 Ｄ 7433−4Ｃ 47/36 Ｄ 7433−4Ｃ (72)発明者菊池寛東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号第一製薬株式会社東京研究開発センタ−内 (72)発明者谷内清人東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号第一製薬株式会社東京研究開発センタ−内 (72)発明者池内澄東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号第一製薬株式会社東京研究開発センタ−内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗原と脂質からなる複合体であって、脂
質としてマンノースを結合している糖脂質および／また
はホスファチジルセリンである燐脂質を含んでいること
を特徴とする経口投与用ワクチン
【請求項２】複合体が脂質膜構造体である請求項１の
経口投与用ワクチン
【請求項３】脂質膜構造体がリポソームである請求項
２の経口投与用ワクチン
【請求項４】脂質膜構造体がエマルジョンである請求
項２の経口投与用ワクチン
【請求項５】脂質膜構造体がミセルである請求項２の
経口投与用ワクチン
【請求項６】マンノースを結合している糖脂質が、4-
0-(6-O-エイコサノイル-β-D-マンノピラノシル)-D-マ
ンノピラノースまたはN-(2-N'-コレステリルカルボキシ
メチル）カルバミルメチルマンナンである請求項１乃至
請求項５の経口投与用ワクチン
【請求項７】膜成分としてマンノースを結合している
糖脂質および／またはホスファチジルセリンである燐脂
質のほかに更に他の脂質を含有することを特徴とする請
求項２乃至請求項６の経口投与用ワクチン
【請求項８】他の脂質が大豆由来もしくは卵黄由来の
ホスファチジルコリン、水素添加ホスファチジルコリ
ン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミト
イルホスファチジルコリンまたはジステアロイルホスフ
ァチジルコリンであるホスファチジルコリン類および／
または荷電脂質類および／またはスフィンゴミエリン類
である請求項７の経口投与用ワクチン
【請求項９】他の脂質が荷電脂質である請求項７また
は請求項８の経口投与用ワクチン
【請求項１０】荷電脂質がジアルキルホスフェート、
ジアシルホスファチジン酸、ステアリルアミン、ホスフ
ァチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、
ホスファチジルエタノールアミンまたはイオン性界面活
性化剤である請求項９の経口投与用ワクチン
【請求項１１】脂質が大豆由来ホスファチジルコリ
ン、卵黄由来ホスファチジルコリン、水素添加ホスファ
チジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンも
しくはジパルミトイルホスファチジルコリン、およびホ
スファチジルセリン、場合によっては更にコレステロー
ルである請求項１乃至請求項１０の経口投与用ワクチン
【請求項１２】抗原が微生物の抗原もしくは弱毒化微
生物である請求項１乃至請求項１１の経口投与用ワクチ
ン
【請求項１３】抗原がインフルエンザウイルス抗原、
Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原またはＣ
型肝炎ウイルス抗原である請求項１乃至請求項１２の経
口投与用ワクチン
【請求項１４】抗原がインフルエンザヘマグルチニン
である請求項１乃至請求項１３の経口投与用ワクチン
【請求項１５】抗原と脂質のほかにアジュバント物質
が添加された請求項１乃至請求項１４の経口投与用ワク
チン
【請求項１６】アジュバント物質がムラミルジペプチ
ド（ＭＤＰ）の誘導体であるる請求項１５の経口投与用
ワクチン
【請求項１７】アジュバント物質が(N-アセチルムラ
モイル)-L-アラニル-D-イソグルタミン、6-O-(2-テトラ
デシルヘキサデカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-ア
ラニル-D-イソグルタミン、6-O-(2-テトラデシルヘキサ
デカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-アラニル-D-グ
ルタムアミドまたはN²-[(N- アセチルムラモイル)-L-ア
ラニル-D-イソグルタミニール]-N⁶-ステアロイル-L-リ
ジンである請求項１５乃至請求項１６の経口投与用ワク
チン
【請求項１８】抗原と脂質からなる複合体であって、
脂質としてマンノースを結合している糖脂質および／ま
たはホスファチジルセリンである燐脂質を含んでいる経
口投与用ワクチンを経口投与し、投与された個体の免疫
性を上げる方法
【請求項１９】複合体が脂質膜構造体である請求項１
８の方法
【請求項２０】脂質膜構造体がリポソームである請求
項１８の方法
【請求項２１】脂質膜構造体がエマルジョンである請
求項１８の方法
【請求項２２】脂質膜構造体がミセルである請求項１
８の方法
【請求項２３】マンノースを結合している糖脂質が、
4-0-(6-O-エイコサノイル-β-D-マンノピラノシル)-D-
マンノピラノースまたはN-(2-N'-コレステリルカルボキ
シメチル）カルバミルメチルマンナンである請求項１８
乃至請求項２２の方法
【請求項２４】膜成分としてマンノースを結合してい
る糖脂質および／またはホスファチジルセリンである燐
脂質のほかに更に他の脂質を含有する脂質膜構造体であ
る請求項１８乃至請求項２３の方法
【請求項２５】他の脂質が大豆由来ホスファチジルコ
リン、卵黄由来のホスファチジルコリン、水素添加ホス
ファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリ
ン、ジパルミトイルホスファチジルコリンまたはジステ
アロイルホスファチジルコリンであるホスファチジルコ
リン類および／または荷電脂質類および／またはスフィ
ンゴミエリン類である請求項２４の方法
【請求項２６】他の脂質が荷電脂質である請求項２４
または請求項２５の方法
【請求項２７】荷電脂質がジアルキルホスフェート、
ジアシルホスファチジン酸、ステアリルアミン、ホスフ
ァチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、
ホスファチジルエタノールアミンまたはイオン性界面活
性化剤である請求項２５または請求項２６の方法
【請求項２８】脂質が大豆由来ホスファチジルコリ
ン、卵黄由来ホスファチジルコリン、水素添加ホスファ
チジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンも
しくはジパルミトイルホスファチジルコリン、およびホ
スファチジルセリン、場合によっては更にコレステロー
ルである請求項１８または請求項１９の方法
【請求項２９】抗原が微生物の抗原もしくは弱毒化微
生物である請求項１８乃至請求項２８の方法
【請求項３０】抗原がインフルエンザウイルス抗原、
Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原またはＣ
型肝炎ウイルス抗原である請求項１８乃至請求項２９の
方法
【請求項３１】抗原がインフルエンザヘマグルチニン
である請求項１８乃至請求項３０の方法
【請求項３２】抗原と脂質のほかにアジュバント物質
が添加されている請求項１８乃至請求項３１の方法
【請求項３３】アジュバント物質ががムラミルジペプ
チド（ＭＤＰ）の誘導体であるる請求項３２の方法
【請求項３４】アジュバント物質が(N-アセチルムラ
モイル)-L-アラニル-D-イソグルタミン、6-O-(2-テトラ
デシルヘキサデカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-ア
ラニル-D-イソグルタミン、6-O-(2- テトラデシルヘキ
サデカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-アラニル-D-
グルタムアミドまたはN²-[(N-アセチルムラモイル)-L-
アラニル-D-イソグルタミニール]-N⁶-ステアロイル-L-
リジンである請求項３２乃至請求項３３の方法