PT81418B - Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais e de antigenicos, para carcinomas do pulmao de celulas nao-pequenas humanas - Google Patents

Description

Descrição da arte anterior

Anticorpos monoclonais para antigénios do cancro do pui. mão estão descritos por Sikora et al., Br. 0. Câncer (l93l) 43: 696-700; Cuttitta et al., Proc. Natl. Acad. Sei, U.S.A, (l98l) 78:4591-4595; Varki et al., Câncer Research (1984) 44:681-687; Moody, T.W. et al., Science, (1981) 214:1246-1248; Minna, l.D. et al., In Vitro 17(12):1058-1070 (12-1981); Kennel, A.0. et

) ^al«, Câncer Research, 4l(9,PTl):3465-3470. Chem. Abst. 95(15):

1303502; Baylin, A.B, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 79:4650-4654 (8-1982); Carney, D.N. et al., Pathobioloqy Annual 1982, 12.:115-136 (1982); Gazdar, A.F.' et al., Seminars in Qncoloqy, 10:3-19(3-1983); Holl inshead, A.C» et al« , Câncer Detec. Prevent., 6.:185-191 (1983); Mulshine, O.T. et al., 1. Immunol. , 13l(l):497-502 (1983); Huang, L.C. et al., Arch. Bioch. Biophys. , 220(l):318-320 (1983) ; Saji, S, ef al., Hybridoma, 3(2): 119-130 (1984), Bio. Abst. 79005569; B csslet, K. et al., Behrinq Inst, Mitt., 74:27-34 (1984), Chem. Abst. CA10l(9):70668b? Rosen, A.T. et al., Câncer Research, 44(5):2052-2061 (1984), Bio. Abst. 79014658 ; Van Muijen, G.N.P. et al., Amer. 0. Pathcl.,

| 116(3): 363-369 (1984), Bio Abst. 79023605; Princler. G.3. et

al., Câncer Research, 42:843-848 (3-1982); Mazauric, T. et al., Câncer Research, 42:150-154 (1-1982); Braatz, O.A. et al,, Câncer Research, 42:849-855 (3-1982); e Sobol, R.E. et al.,

Fed. Proc., 41(3):409. Abst. 816 (4-1982).

Cúlturas contínuas de células fundidas segregando anticorpo de especificidade determinada estão descritas por Kohler et al., Nature (1975) 265:495-497. Métodos de produção de anti. corpos tumorais estão descritos na Patente U.S. NS. 4 172 124.

SUMARIO D0 INVENTO

0 presente invento diz respeito ao processo de preparação de novas composições antigénicas e anticorpos monoclonais

que definem locais determinantes em tais antigénios de células

de carcinoma dc·'pulmão, âe celúLss n&o-pequaiás humano (NSCLC), 0

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-Δtermo "células NSCLC" inclui células de carcinoma epidermóíde, células de adenocarcinoma, e células de carcinoma, indiferenciado de células grandes. Os locais determinantes podem também ser encontrados em antigénios de outros carcinomas, p.e. alguns carcinomas da mama, e, assim, os anticorpos do invento ligar-se-ão também a estas outras células carcinomatosas. Estes anticorpos monoclonais ligam-se num grau menor às células adultas normais gue às células tumorais. 0 termo "ligam-se num grau menor" significa que a ligação não será detectada por técnicas imunohistológicas ou que a ligação será cerca de quatro a cinco vezes menor que a ligação a células NSCLC, determinado por técnicas imunohistolégicas. Qs anticorpos monoclonais são segregados por hibridomas murinos.

0 invento diz também respeito a certos métodos diagnósticos utilizando os anticorpos monoclonais ou composições antigénicas do invento. Um tal método envolve o determinante da presença de células NSCLC numa amostra suspeita de conter tais células. A amostra é colocada em contacto com o anticorpo mono cional, o qual é capaz de distinguir tais células de outros tipos celulares que podem estar presentes na amostra. 0 contacto é efectuado sob condições para a ligação do anticorpo a tais c_é lulas. Após o contacto, determina-se a presença ou ausência de ligação do anticorpo às células na amostra. Esta ligação relaciona-se com a presença ou ausência das células NSCLC na amostra. Geralmente, a amostra é colocada em contacto com um parceiro de ligação específico marcado para o anticorpo monoclonal. Este marcador é capaz de produzir um sinal detectável.

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES ESPECIFICAS

0 presente invento diz respeito à preparação de certos novos antigénios na forma purificada e de anticorpos específicos para tais antigénios em células NSCLC humanas, e equivalentes funcionais, fragmentos de ligação e imunocomplexos de tais anticorpos e certos métodos de diagnóstico utilizando tais anti. corpos. Por exemplo, células de carcinoma do pulmão humano de derrames pleurais ou células cultivadas de carcinoma do. pulfrêo.

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de células nêo-peíjEnas humano, ou células de urn pulmão fetal normal, são utilizadas como o imunogênio. Estas células são injectadas num rato e, após tempo suficiente, o rato ê sacrificado e são obtidas células do baço. Os cromossomas das células do baço co dificendo as imunoglobulinas desejadas são imortalizadas fundiri do as células do baço com células de mieloma ou com células de linfoma, geralmente na. presença de polietileno glicol. As célu las resultantes, que incluem os hibridomas fundidos, são deixadas crescer num meio selectivo, tal como meio-HAT, e as células sobreviventes são cultivadas em tal meio utilizando condições de diluição limitantes. As células são deixadas crescer num recipiente adequado, p.e. depósitos de microtitulação, e o sobrenadante é seleccionado para anticorpos monoclonais possuindo a es. pecificidade desejada.

Existem várias técnicas para aumentar os rendimentos de anticorpos monoclonais, tais como injecçâo das células do hibri doma para dentro da cavidade peritoneal de um hospedeiro mamífe ro, que aceite as células, e recolhendo o fluido ascitico. Quaj} do se recolhe uma quantidade insuficiente do anticorpo monoclonal no fluido ascitico, o anticorpo ê recolhido a partir do sari gue do hospedeiro. Existem diversas formas convencionais para isolamento e purificação dos anticorpos monoclonais, de forma a libertar os anticorpos monoclonais das outras proteínas e dos outros contaminantes (ver Kohler e Milstein, supra).

Um tal anticorpo monoclonal do presente inventa ê exemplificado por um novo anticorpo designado L3. Este anticorpo monoclonal define um local determinante num antigénio associado a uma célula com Mr 76 000 por SDS-PAGE caracteristico de células NSCLC humanas, i.e., células malignas, e um local determinante em antigênios proteicos que são segregados para dentro do meio de cultura pelas células NSCLC (Antigénio da forma I, XI e líl), 0 anticorpo é do isotipo IgG^. 0 anticorpo L3 liga-se em menor grau a algumas células normais. 0 anticorpo L3 é produzido pelo hibridoma murino L3.

0 antigénio L3 forma I tem um Mr de 94 000 através de

electroforese em sulfato dodecil de sédio-poliacrilamida gel

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uni-direccional (SDS-PAGE). 0 antigénio L3 da Forma II tem um Mr de 76 000 por SDS-PAGE e o antigénio L3 da Forma III tem um Mr de 26 000 por SDS-PAGE.

0 antigénio L3 da Forma I pode ser purificado noventa vezes a partir do meio de cultura por cromatografia de afinidade (Quadro I) e cromatografia de afinidade seguida de técnicas em acrilamida gel para dar composições contendo mais de 70% e 90% (em peso), respectivamente, do antigénio L3 da Forma I, o qual ê uma glicoproteína. A composição obtida a partir de puri ficação com cromatografia de afinidade tem uma Actividade Específica de 46 500 Unidades/mg comparado com 522 Unidades/mg para o meio de cultura. A actividade Especifica é definida como a quantidade de antigénio necessária para inibir a ligação de anticorpo L3 marcado com I em 50% num ensaio de ligação competitiva utilizando monocamadas, fixas por formalina, de células Calu-1. A composição obtida a partir do meio de cultura por cromatografia de afinidade contêm mais de 70% de antigénio de Forma I e para a maior parte menos de 30% de material proteico não específico com Mr entre cerca de 50 000-200 000 por SDS-PAGE incluindo quantidades menores, cerca de 10 a 20% de antigénio da Forma II. Também presente na composição há quantidades vestigiais de antigénio da Forma III.

Para determinar a relação entre as formas celular e ex35

tracelular do antigénio L3, radio-marcaram-se células com 5

metionina e efectuou-se uma experiência de "pulse chase". As 35

células foram "pulse labeled" durante uma hora com S-metioni na, colocadas num meio contendo metionina não marcada por várias vezes e submetidas a análise por imunoprecipitação. Inicial^ mente, toda a radioactividade célula-associada superficialmente imuncprecipitável foi encontrada numa proteína Mr 76 000. As outras proteínas marcadaèencontradas estavam também em amostras das quais o anticorpo fora omitido. Durante o período de "chase" a radioactividade na forma Mr 76 000 diminuiu enquanto a ra dioactividade encontrada na forma libertada para dentro do meio (Mr 94 000) aumentou. A radioactividade na forma célula-associada desapareceu com a mesma cinética que radioactividade na

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-7forma libertada apareceu? o t para ambos os processos foi determinado por análise densitomátrica como sendo de aproximada mente 1,5 horas. Estes resultados sugerem que a forma célula associada Mr 76 000 do antigénio é um precursor da forma Mr 94 000 (antigénio L3 da Forma i).

Como o antigénio L3 é uma glicoproteína, modificações nos hidratos de carbono podem justificar de uma forma concebível o aumento aparente em tamanho do antigénio L3 observado durante a sua libertação da célula. Esta possibilidade foi exami. nada através do tratamento dos imunoprecipitados contendo as formas celulares e de libertação da molécula com glicosidases de especificidade conhecida, 0 tamanho do antigénio L3 associa do à célula foi reduzido para Mr 59 000 por tratamento com end_o glicosidase H (Endo H) mas não foi afectado pela neuraminidase, indicando que continha oligossacarideos N-ligados com elevado teor em nanose (ver Tarentino et al., 1974, 3. Biol. Chem., 249: 811-817). Este resultado é compatível com a verificação de que a maturação é sensível à tunicamicina, um inibidor conhecido da glicosilação N-ligada (Lehle, et al., 1976, FEBS Letters, 71: 167-170). Em contraste, o antigénio libertado era Endo H resis. tente, mas foi reduzido em tamanho para Mr. 80 000 por tratame_n to com neuramidase, indicando a presença de resíduos do ácido siálico no antigénio L3 da Forma I. Assim, a conversão do anti. gênio L3 de uma forma célula-associada para uma forma libertada é acompanhada por maturação de cadeias laterais de hidrocarbone to N-ligadas.

A sequência aminoácida terminal do antigénio L3 da Forma I foi determinada por técnicas convencionais na composição pu. rificada por uma combinação de técnicas de cromatografia de afi nidade e separação em acrilamida gel.

Esta sequência (<X) ê a seguinte:

15 10 15

V-N-D-G-D-M-R-L-A-D-G-G-A-T-N-Q

e é ainda definida por:

20 25 30

^_G-R-V-E-T-F-Y-R-G-Q-W-G-T-V

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-8Os símbolos ds uma letra, acima, para os aminoácidos têm o sgu significado convencional onde: V = valina, PJ = asparagina, D = ácido aspártico, G = glicina, M = metionina, R =

= arginina, L = leucina, A = alanina, T = treonina, Q = glutamina, E = ácido glutêmico, I = isoleucina, F - fenilalanina,

Y = tirosina e W = triptofano. A sequência acima á obtida como uma sequência isolada para a composição contendo o antigénio L3 da Forma I quer o antigénio L3 da Forma II esteja ou não preseri te.

A comparação dos 30 aminoácidos N-terminais acima do a_n tigénio L3 com sequências proteicas presentes no banco de proteínas National Biomedical Research Foundation (edição de Março de 1985) não revelou quaisquer homologias significativas.

A sequência do antigénio L3 da Forma I foi também compa rada com a de diversas proteínas sêricas correntemente não registadas nesta base de dados, incluindo inibidor da Cl-estearass humana e inibidor da alfa-2-tiolproteinase humana. Nenhuma destas sequências revelou quaisquer homologias significativas com a sequência N-terminal do antigénio L3 da Forma I.

Determinámos que o antigénio L3 da Forma I está presente no soro humano normal e purificámos o antigénio L.3 da Forma I a partir do soro. As propriedades do antigénio L3 do soro es. tão resumidas no Quadro III. 0 antigénio L3 da Forma I pode ser purificado mais de 3 000 vezes mais a partir do soro humano normal com um rendimento de 39% (Quadro II). A análise do matje rial purificado por SDS-PAGE revela os componentes principais como sendo proteínas que co-migram com os componentes da Forma I e da Forma II purificados a partir do meio de cultura; nenhu. ma das formas é um componente principal da amostra sérica inici al. Deve-se notar que ambas as Formas I e II do antigénio L3 do soro são decompostas em dois componentes distintos no gel original, indicando possivelmente microheterogeneidade devido a diferenças de glicosilação. Ambas as formas são reactivas a se guir a análise de irnuno-formação de mancha e apés radio-iodinação e imunoprecipitação. Tal como com o antigénio purificado a partir do meio de cultura, é detectada uma forma adicional Mr

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-926 000 (antigênio L3 da Forma III) após imunoprecipitação. A composição obtida por cromatografia de imunoafinidade contêm mais de 50/ em peso do antigênio L3 da Forma I, sendo o material restante antigênio L3 da Forma II, transferrina e proteínas não especificadas de Mr de cerca de 50 000-200 000 através de SDS-PAGE. Esta composição tem uma Actividade específica de 45 500 Unidades/ mg em comparação com 13,3 Unidades/mg para o soro humano normal.

Estes resultados indicam que a actividade antigênica L3 ê expressa em dois componentes (Forma I e II) encontrada em ambos meio de cultura e soro. Purificação posterior do antigênio L3 da Forma I a partir de soro através de SDS-PAGE preparativa, resultou em composições que continham predominantemente antigênio L3 da Forma I a um nível superior a 90/ em pesa e quantidades vestigiais variáveis de antigênio da Forma II, sendo o mate rial restante transferrina e proteínas não especificadas de Rr. de cerca de 50 000 a 200 000.

1?5

Compararam-se os antigênios marcados com "Is imunoprecipitados purificados a partir de ambos soro e meio de cultu ra através ds focagem isoelêctrica de duas dimensões-SDS PAGE.

As mobilidades de duas dimensões de ambos antigênios são bastari te semelhantes, migrando ambos os componentes da Forma I e da Forma II como espécies heterogéneas na variação de pH de 4,2-5,0. 0 antigênio L3 da Forma I de ambas as fontes revelou também dois componentes menores migrando a valores de pH aproximadamente de 5,8 e 6,2. A composição em hidrato de carbono de ambos os anti. gênios foi também examinada testando-a para a sua sensibilidade à glicosidase. Os antigênios L3 da Forma I e da Forma II de am bas as fontes mostraram ser Endo H resistentes, enquanto o tratamento com neuraminidase de ambos resultou no aparecimento do fragmento característica Mr 80 000 que se pode ver após tratamento de antigênio metabolicamente marcado. A sensibilidade à neuraminidase do antigênio da Forma II indica que ele ê diferen te da forma Rr 76 000 célula associado do antigênio L3.

Para confirmar que ambas as moléculas eram estruturalmeji

te semelhantes, submeteram-se as moléculas da Forma I de ambas

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as fontes a uma série de reacções ds clivagem parcial ds proteja se como descrito por Cleveland et al*, (1977) 3. Biol, Chem», 252: 1102-1106, Os antigénios da Forma I radiomarcados purificados a partir de ambos meio de cultura e soro sao retirados a partir ds um gel SDS-PAGE preparativo e submetidos a dactilosco pia com protease V8. Ambas as moléculas produziram padrões de clivagem parcial idênticos; observaram-se em ambos os casos p.e lo menos cinco produtos de clivagem parcial distintos (Rr = 76 000, 49 000, 31 000, 20 000 e 14 300). Estes resultados demonstram que antigênio L3 purificadas a partir de meios de cu tura e de soro humano estão fortemente relacionados.

Investigaram-se de seguida as relações entre as três formas de peso molecular de antigênio L3 a partir do soro. As impressões digitais globais para as formas I e II são bastante semelhantes, embora a molécula da Forma II não tenha produzido os fragmentos Rr 31 000 e Rr 14 300 derivados da molécula de Fcrma I, Os padrões sugerem que as moléculas da Forma I e da Forma II estão fortemente relacionadas. 0 antigênio da Forma III partilha um produto de clivagem parcial Rr 14 300 com as formas antigênicas maiores encontradas no soro, as quais podem indicar que o antigênio da Forma III está também estruturalmente relacionado com o antigênio da Forma I. As fortes semelhanças em estrutura entre as diversas formas sugere que as moléculas das Formas II e III são derivadas do antigênio da Forma I.

Para determinar se o antigênio L3 foi já descrito como um componente antigénico de um tipo de tumor que não o carcinoma do pulmão, efectuou-se uma pesquisa da literatura com auxílio ds computador para antigénios escoados ou segregados associados a tumor. Verificaram-se diversos relatórios de antigénios proteicos melanoma-segregados os quais tinham tamanho e composição de hidratos de carbono semelhantes aos do antigênio L3. Matali et al», (1982) Câncer Res. 42:583-589? Burnol et al., (1982) Hybridoma .1:283-292; e Wilson et al., (1981) Int. 3. Câncer 28:293-300.

Pequenas quantidades de um des anticorpos monoclonais

previamente descritos (465,125; Matali et al., supra) foram

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-11tornadas disponíveis para nós através da nossa participação no First International Workshop on Melanoma Associated Antigens.

Utilizámos este anticorpo numa experiência de imunoprecipitação sequencial para testar a identidade entre o antigênio L3 e o antigênio reconhecido pelo anticorpo 465,125. Ambos os anticorpos precipitaram especificamente uma espécie proteica Mr 94 000 a partir de meio de cultura de células metsbolicamente marcadas com S-metionina. Depleção do meio de cultura dos ari tigénio L3 ou 465,12S por imunoprecipitação resultou numa conc_o mitante depleção de actividade antigénica do antigênio alternativo. Isto mostra que os determinantes antigénicos reconhecidos por ambos os anticorpos são transportados na mesma molécula (Quadro III). Contudo, os epitopos reconhecidos pelos dois anticorpos são aparentemente diferentes visto que foram incapazes

de detectar a competição pelo anticorpo 465,125 para ligação do 1 25

anticorpo I-L3.

Outro anticorpo monoclcnal do invento, designado_j L5, de. fine um local determinante num antigênio proteico da superfície celular caracteristico de células NSCLC humanas. 0 peso molécu. lar da proteína, determinado através do método acima descrito e através de um método baseada na marcação com I ê de cerca de 135 000 daltons. Este anticorpo ê da classe IgM. 0 antico_r po L5 são se liga de forma detectável a células normais, tais como fibroblastos, células endoteliais, e células epiteliais nos órgãos principais. 0 anticorpo L5 ê produzido pelo hibridoma murino L5. 0 antigênio L5 tem dois fragmentos protease V8

caracteristicos de Mr 24 000 e 16 000 como mostrado por uma técnica descrita por Cleveland et al. (1977) 3. Biol. Chem. 252:1102-1106. Assim, o antigênio L5 ê distinguido de outros antigênios de peso molecular semelhante.

Outro anticorpo monoclonal do invento é designado por L18 e define um local determinante noutro antigênio proteico da superfície celular caracteristico de células NSCLC humanas. 0 peso molecular da proteína, determinado por ambos os métodos acima descritos, é de cerca de 72 000 daltons. Este anticorpo

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é do isotipo da Iq^Gj_· θ anticorpo L18 liga-se em menor grau a

* algumas células normais, particularmente no baço.

Também incluídos dentro do objecto do invento estão fragmentos de ligação úteis dos anticorpos monoclonais acima tais como os fragmentos Fab, FCab'^’ Mv ^e outros. Por exemplo, fragmentos de ligação úteis podem ser preparados por diges. tão com peptidase do anticorpo utilizando papaína ou pepsina. Com o termo fragmento de ligação útil quer-se dizer que o fragmento competirá com um anticorpo para locais de ligação no seu antigénio análogo.

Enquanto os exemplos específicos acima dos novos anticorpos do invento são dirigidos a anticorpos ligando-se a locais determinantes específicos nos antigênios respectivos e seri do de classes e isótopos específicos de uma fonte murina, isto não tenciona ser uma limitação.

Os anticorpos acima e aqueles anticorpos possuindo equivalência funcional com os anticorpos acima, quer seja de uma fonte murina, quer de uma fonte mamífera incluindo humana, quer de outras fentes, ou suas combinaçães, estão incluídas pelo objecto deste invento, bem como outras classes tal como IgM, IgA, IgE e semelhantes, incluindo isótopos dentro de tais clas) ses. Pelo termo "equivalência funcional" quer-se dizer que o

anticorpo é capaz de se ligar ao local determinante acima descrito e é capaz de competir com um determinado anticorpo do invento para tal local. Isto é, tal anticorpo, quando combinado com uma amostra contendo uma célula ou um fragmento celular pos. suindo tal local determinante, ligar-se-á ao tal local determinante e bloqueará um anticorpo do invento de se ligar a tal local.

Um método do invento envolve a determinação da presença de uma situação maligna no tecido pulmonar. 0 termo "situação maligna" refere-se à presença de células displãsicas, incluindo carcinoma in situ, neoplásicas, malignas ou tumorais, ou semelhantes. A amostra é colocada em contacto ou combinada com um anticorpo monoclonal do invento. 0 contacto é efectuado sob condiçães de ligação do anticorpo às células malignas. Após

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-13contacto, observa-se a presença de ligação do anticorpo às célu las malignas na amostra. Isto ê, o espécimen ê examinado para a detecção de imunocomplexos do anticorpo no local antigénico. Esta formação de complexo imune está relacionada com a presença de células malignas na amostra.

Um exemplo particular, por via de ilustração e não de limitação, de um método de acordo com o invento, é um método p_a ra a detecção de células tumorais em tecido excisado. 0 método acima ê aplicado a uma amostra que ê uma secção do tumor obtido apés remoção do tumor. 0 tumor que ê excisado é tratado para se obterem secçães, cujo tratamento envolve inicialmente a congelação do tecido tumoral, normalmente congelando imediatamente apés a excisão. A camada de tecido congelado é então cortada em secções utilizando, por exemplo, um crióstato.

A secção do tumor obtida da forma acima descrita é colo cada em contacto com um anticorpo monoclonal do invento e depois com um segundo anticorpo dirigido contra o anticorpo monoclonal acima, cujo segundo anticorpo ê marcada cora um marcador detectá vel.

A amostra excisada, p.e., a secção do tumor, é colocada em contacto com o primeiro anticorpo monoclonal sob condiçSes para a ligação do anticorpo às células malignas. A incubação é geralmente conduzida num meio aquoso tal como, por exemplo, fos, fato tamponado salino contendo uma pequena quantidade de azida de sédio num recipiente adequado tal como, por exemplo, uma pia ca de petri de vidro, durante um período de cerca de 15 a 30 mi nutos a uma temperatura de cerca de 20 a 30SC. A quantidade de anticorpo utilizado é geralmente suficiente para fornecer ligação detectável, i.e., para fornecer um número detectável de imu

nocomplexos entre o anticorpo e o local determinante ou antiqé nico em questão.

Após a incubação, a secção S lavada para reduzir ou eli,

minar anticorpo não especificamente ligado e depois ê examinada

para se observarem os complexos acima mencionados que resultam

da ligação do anticorpo monoclonal às células da amostra possuin

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do o local antigénico. fí ligação está relacionada com a presen ça de células malignas na secção. Consequsntemente, a ligação ê determinada, por exemplo, contactando a amostra com um parcei. ro de ligação específica marcado para o anticorpo monoclonal.

0 marcador ê capaz de produzir um sinal detectãvel e po. de ser um marcador radioactivo, um cromóforo tal como uma substância fluorescente, uma enzima, ou semelhantes.

Um exemplo de uma técnica utilizando a abordagem acima é coloração por imunofluorescência, Nesta técnica, secçães co_n geladas do tumor são fixadas numa placa de vidro com acetona e são incubadas com o anticorpo monoclonal em, por exemplo, uma placa de petri. fípés lavagem com um tampão apropriado tal como, por exemplo, fosfato-tamponado salino, a secção é colocada numa placa de petri e colocada em contacto com o parceiro de li gação específico marcado para o anticorpo monoclonal, o qual po. de ser, por exemplo, um anticorpo marcado específico para o anticorpo monoclonal utilizado. Como, para a maior parte, o anti. corpo monoclonal será derivado de uma fonte murina, pode-se uti. lizar uma imunoglobulina anti-rato marcada específica para o ari ticorpo monoclonal. Tais imunoglobulinas podem ser aumentadas de acordo com técnicas padrão, injectando um hospedeiro adequado com anticorpo murino, aguardando por um tempo apropriado, e recolhendo as imunoglobulinas anti-rato a partir do sangue do hospedeiro injectado.

fípés uma segunda lavagem da placa com, por exemplo, um tampão aquoso, as secçães podem ser cobertas cora um fluido de cobertura de anticorpo fluorescente e um cobre objecto de vidro e depois examinada com microscópio ds fluorescência para determinar a ligação do anticorpo monoclonal à secção. A determinação da ligação pode também incluir uma identificação da localização de tal ligação na amostra.

fí ligação do anticorpo monoclonal à amostra pode também

ser determinada utilizando um anticorpo monoclonal que seja covalentemente conjugado a um marcador capaz de produzir um sinal

detectãvel, tal como uma entidade radioactiva, um cromóforo inç

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-15luindo corantes e substâncias fluorescentes, ou uma enzima. 0 número de marcações utilizada por anticorpo ê geralmente determinada pelos requesitos do método de diagnóstico no qual o anticorpo marcado é utilizado e a disponibilidade de locais para ligaçao do marcador ao anticorpo.

Métodos para conjugar marcadores para anti-corpos e fragmentos de anticorpos são bem conhecidos na arte. Tais méto dos podem ser encontrados nas Patentes U.S. NSs. 4 220 450;

4 235 869; 3 935 074 e 3 996 345.

Outro exemplo de uma técnica na qual o anticorpo monoclonal pode ser utilizado é a marca de imunoperoxidase (Sternberger, Immunocytochemistry, Oohn Wiley & Sons, Meui York, 1979, ppil04-169 modificado por Garrigues et al., Int. 3, Câncer (1982) 29:511-515). 0 tecido a ser testado ê fixado com um sol

vente adequado, tal como acetona, num suporte, tal como uma pia ca de vidro. Seguidamente, o tecido é incubado com o anticorpo monoclonal e depois lavado isento de anticorpo não ligado. Depois, o tecido é incubado com IgG anti-rato de coelho, lavado para remover anticorpo não ligado, combinado com complexo peroxidase de rato-anti-psroxidase, lavado para remover produtos conjugados não ligados, s depois tratado com substrato para a enzima. Após este tratamento, a placa é examinada para um sinal detectável.

Gs anticorpos do invento podem ser usados num método de determinação da presença de uma situação maligna numa amostra celular esfoliativa do pulmão, tal como a expectoração. Pelo termo "esfoliativo” quer-se dizer que a amostra compreende célu las isoladas ou aglomerações de células obtidas através de raspagem ou lavagem da superfície do tecido, cujas células são removidas individualmente ou em escamas ou lâminas. A amostra ce lular esfoliativa deve ser distinguida do tecido excisado tal como o obtido por biópsia. 0 contacto entre a amostra e o anti. corpo é efectuado sob condições de ligação do anticorpo ao local antigénico. Após contacto, a presença ou ausência de ligação do anticorpo ao local antigénico é determinada e está relacionada com a presença de uma situação maligna no pulmão. '

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-16Para determinar a presença de uma situação maligna no pulmão, uma amostra de expectoração fornecerá a amostra celular ssfoliativa para ser utilizada no método. 0 método pode encontrar utilidade na detecção de uma situação maligna em amostras celulares esfoliativas dos bronquios, tubo digestivo incluindo faringe oral, boca, etc..

A amostra celular ssfoliativa é então contactada com c anticorpo atrás mencionado sob condiçães de ligação do anticorpo ao local antigénico específico na amostra para formar comple xos antigênio-anticorpo. Este local antigénico pode estar presente em células ou fragmentos celulares da amostra. Geralmente, a amostra é colocada num suporte adequado, tal como, por exemplo, uma placa, geralmente de vidro, ou outro material adequado. A amostra celular esfolistiva ê geralmente espalhada na placa de forma a fornecer uma camada fina da amostra na superfí cie desta lâmina. 0 contacto entre o anticorpo e a amostra é gsralmente efectuado num meio aquoso tamponado. Qs tampões que podem ser usados incluem fosfato, tris, bicarbonato, etc*. 0 pH está relacionado com a natureza da amostra e do anticorpo e está geralmente dentro da gama de cerca de 5 a 8. 0 meio aquoso pode conter adicionalmente solventes polares orgânicos numa quantidade de cerca de 0 a 40)5. Os solventes polares orgânicos são soláveis em água e têm geralmente de cerca de 1 a 10 átomos de carbono e de cerca de 1 a 4 átomos de oxigénio. 0 anticorpo estará presente no meio aquoso a urna concentração de cerca de 1 a 100 ycg/ml, de preferência de cerca de 10 a 20 yífg/ml. A tejg peratura durante o contacto da amostra com o anticorpo ê gsralmente de cerca de 4 a 4QSC, de preferência cerca de 10 a 302C.

0 período de contacto é geralmente de 15 a 120 minutos, de preferência de cerca de 30 a 60 minutos.

Apés o período de contacto entre a amostra e o anticorpo, o suporte ê geralmente tratado para remover anticorpo não reagido. Geralmente, isto ê conseguido lavando o suporte com um meio aquoso geralmente tamponado. Em geral, a quantidade de solução de lavagem deve ser suficiente para remover o anticorpo não reagido.

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De seguida, observa-se a presença de ligação do antico.r po ao local antigênico da amostra, cuja ligação está relacionada com a presença de uma situação maligna no locus. Isto á, a amostra, á examinada para determinar o número de complexos antigánio-anticorpo (imunes) formados. Note-se que em certas circunstâncias muito poucos locais antigánicos em questão podem ser encontrados na amostra celular esfoliativa. Contudo, numa situação maligna, grandes números de locais antigánicos estarão presentes e esta última situação ê prontamente distinguível por este método em relação a uma situação não maligna porque um grande número de complexos antigênio-anticorpo serão mensuráveis quando existe uma situação maligna. Para fazer a determinação da presença de ligação, um meio de produzir um sinal detectável ê incorporado no sistema de ensaio. Por exemplo, pode-se conju, gar o anticorpo utilizado no ensaio com um marcador que seja cja paz de produzir um sinal detectável. 0 marcador pode ser uma entidade radioactiva, um cromóforo incluindo corantes e substân cias fluorescentes, uma enzima, ou semelhantes. 0 número ds mar cadores utilizados para o anticorpo é geralmente determinado p£ los requesitos do método e da disponibilidade de locais para Ij. gar o marcador ao anticorpo.

Alternativamente, pode-se colocar em contacto a placa lavada com um parceiro de ligação específico rnarcado para o anticorpo, o qual pode ser, por exemplo, um anticorpo marcado espe, cífico para o anticorpo marcado. Quando o anticorpo monoclonal ê derivado de uma fonte murina, uma imunoglobulina anti-rato marcada específica para o anticorpo utilizado no método,; pode ser utilizado. Tais imunoglobulinas podem ser aumentadas de acordo com técnicas padrão, injectando um hospedeiro adequado com o anticorpo monoclonal, esperando um tempo adequado, e reco lhendo as imunoglobulinas anti-rato do sangue do hospedeiro injectado. Quando se utiliza um parceiro de ligação específico marcado para o anticorpo, a placa deve ser novamente lavada com um meio aquoso antes de examinar a placa para detectar fluorescência.

Para determinar a presença de ligação entre o anticoj?

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-18po e a amostra celular em que se utiliza um marcador fluorescen, te, pode-se examinar a placa para detectar fluorescência utilizando usualmente um microscópio de fluorescência. Quando se utiliza um marcador diferente de uma substância fluorescente, pocfe-se examinar a placa ou a amostra para detectar a formação de um precipitado, uma còr, ou semelhantes.

A descrição acima é dirigida principalmente à utilização dos anticorpos do invento em técnicas de imunofluorescência Contudo, os anticorpos do invento podem ser utilizados na maior parte dos ensaios envolvendo reacçães antigênio-anticorpo. Qs ensaios podem ser homogénios ou heterogénios, Numa abordagem de ensaio homogénio, a amostra pode ser um fluido biológico tal como soro, urina e semelhantes ou a amostra pode ser lisada e clarificada para remover fragmentos. 0 anticorpo L3 por exemplo, tem sido utilizado para medir a concentração do seu sntigé. nio análogo, i.e., Forma I, II ou II do antigénio L3, no soro de doentes cancerosos, e verificou-se que certos doentes cancerosos têm níveis álévados deste antigénio quando comparado com controlos normais. A reacção imunológica envolve geralmente o anticorpo específico um analito marcado, e a amostra em causa.

0 sinal produzido a partir do marcador é modificado, directa ou indirectamente, aquando da ligação do anticorpo ao analito marcado. Ambos a reacção imunológica e a detecção da sua extensão podem ser efectuados numa solução homogênia. Marcadores imunoquímicos que podem ser utilizados incluem radicais livres, corantes fluorescentes, enzimas, bacteriófagos, co-enzimas, e outros.

Numa abordagem de um ensaio heterogénio, os reagentes são geralmente a amostra, o anticorpo específico, e meios para produzir um sinal detectável. A amostra é geralmente colocada num suporte, tal como um prato ou uma placa, e colocada em contacto com o anticorpo numa fase líquida. Q suporte é então separado da fase líquida e ou a fase de suporte ou a fase líquida ê examinada para um sinal detectável utilizando meios para produzir tal sinal. 0 sinal está relacionado com a presença do analito na amostra. Meios para produzir um sinal detectável

incluem a utilização de marcadores radioactivos, fluorescentes, enzimas e semelhantes. Exemplo de imunoensaios heterogênios são o radioimunoensaio, métodos de imunofluorescência, imunoeri saias tipo-enzima, e semelhantes.

Para uma discussão mais detalhada das técnicas de imuno ensaio acima, ver "Enzyme-Immunoassay", por Eduard T. Maggio,

CRC Press, Ino., Boca Raton, Florida, 1980. Ver também, por exemplo, as Patentes U.S. NSs. 3 690 834; 3 791 932; 3 817 837 3 850 578; 3 853 987; 3 867 517; 3 901 654; 3 935 074;

) 2 984 533; 3 996 345 e 4 098 876, cuja listagem não pretende

ser exaustiva.

Os anticorpos do invento podem também ser utilizados pa ra detectar depósitos metastáticos em doentes humanos com NSCLC de uma forma análoga àquela descrita para o melanoma maligno no 8. Nucl. Med. (1983) 24-:123-129 e no 8. Clin. Invest. (1983) 72: 2101-2114. 0 anticorpo ou seus fragmentos são radiomarcados e

administrados intravenosamente a um doente o qual e subsequente mente observado utilizando, p.e. uma câmara gama ou semelhante.

0 invento inclui também equipamentos de diagnósticos p.a ra efectuar os métodos acima revelados . Numa concretização, o equipamento de diagnóstico compreende numa embalagem uma combinação de (a) um anticorpo monoclonal mais especificamente acima definido e (b) um conjugado de um parceiro de ligação específico para o anticorpo monoclonal acima e um marcador capaz de pro duzir um sinal detectável. Os reagentes podem também incluir agentes auxiliares tais como agentes tampão e agentes estabilizadores de proteína, p.e., polissacáridos e semelhantes, como necessário para conduzir tais métodos. 0 equipamento de diagnóstico pode ainda incluir, quando necessário, outros membros do sistema produtor de sinal, de cujo sistema o marcador é um membro, agentes para reduzir a interferência de fundo de um teste, reagentes de controlo, dispositivos para conduzir o teste e semelhantes. Noutra concretização, o equipamento ds diagnóstico compreende um conjugado de um anticorpo monoclonal do invento e um marcador capaz de produzir um sinal detectãvel. Podem estar presentes, como acima mencionado, agentes auxiliares.

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-20Os anticorpos do invento podem ser utilizados terapeuti camente. Os anticorpos com as propriedades biológicas adequadas são úteis directamente como agentes terapêuticos, fílternativamente, os anticorpos podem ser ligados a uma toxina para formar uma imunotoxina ou a um material radioactivo ou droga pa ra formar um produto radiofarmacêutico ou farmacêutico. Métodos para produzir imunotoxinas e produtos radiofarmacêuticos de anticorpos são bem conhecidos (ver, por exemplo, Câncer Treatment Reports (1984) 68:317-328).

Outra utilização terapêutica dos anticorpos monoclonais do presente invento é a imunização de um doente com um anticorpo anti-idiotípico produzido através da utilização de um dos ars ticorpos monoclonais presentes oomo um imunogénio. Tal imuniza ção pode induzir uma actividade anti-tumor activa (ver, por exem pio, Nepom et al.; Proc. Natl. fícad. Sei. U.S.fí. (1984) 81: 2864-2367). Numa abordagem semelhante, o doente pode ser imuni. zado corr, o antigénio na forma purificada, um fragmento péptido do antigénio, ou uma forma modificada do antigénio.

Um aspecto particularmente atraente do presente invento ê que o anticorpo L3 pode ser utilizado ern combinação com outros anticorpos, fí combinação pode ser eficaz na detecção de pelo me nos os tipos de carcinoma do pulmão acima mencionados, principal, mente, carcinoma do pulmão indiferenciado de células grandes, adenocarcinoma, e carcinoma epidermóide. Por exemplo, os anticorpos monoclonais L3 e L18 (revelados no N2. de Série U.S.

667 521, depositado em 2 de Novembro de 1984) podem ser combina dos em quantidades eficazes, i.e., quantidades quçàornarão a combinação capaz de detectar todos os carcinomas do pulmão atrás mencionados.

fílguns dos anticorpos monoclonais do invento definem também locais determinantes em antigénios associados com outros carcinomas tais como carcinoma da mama e carcinomas epidermóides da vulva. Consequentemente, os anticorpos presentes podem encontrar utilização em produtos diagnósticos e terapêuticos di. rígidos a tais carcinomas.

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	-21-

EXEMPLOS

0 invento ê ainda demonstrado pelos seguintes exemplos ilustrativos. Serão descritos primeiro um certo número de processos utilizados.

Materiais

Os meios de cultura são de Gibco. Q soro fetal bovino ê de Gibco ou Hyclone. As placas microscópicas de depósitos múltiplos revestidos com Teflon (12 depósitos) são de Meloy. Qs pratos de cultura de plástico sao de Corning ou Costar. A protease V8 e a albumina sárica bovina são de Sigma. Neuramidase e Pansorbin (S. aureus fixo em formalina) são de Calbiochem. A endoglicosidase H e de Miles. A nitrocelulose (BA85, 0, 4^u) ê de Schleicher e Schuell. A proteína A-Sepharose, CNBr-Sepharose activada 4B, Sephadex G-10, DEAE Sephacel e Proteína A Sepha rose conjugada CL4B são de Pharmacia. NP-40 é de Particle Data Ltd. Polietileno glicol, película de raios-X e o equipamento de coloração Kodavue são de Kodak. Acrilamida e os equipamentos de coloração pela prata são de BioRad. Marcadores de peso molecular prê-corados são de Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Maryland (BRL). Marcadores de peso molecular “ u metilados, H-glucosamina, S-metionina e I são de Amersham.

A imunoglobulina anti-rato de cabra FITC-conjugada é de Tago. 0 dispositivo de electroforese das proteínas sêricas Paragon ê de Beckman. As amfolinas são de LKB.

Técnica Imunohistolóqica

Para estudos imunohistológicos em secçães congeladas, utilizou-se a técnica de anticorpo não marcado de Sternberger ern Immunochemistry, Oohn Wiley & Sons, Neiu York, 1979, pp:104-169, modificada por Garrigues et al. em Int. 0, Câncer (1982) 29:511-515. Os tecidos alvo para estes testes foram obtidos na cirurgia e congelados dentro de 4 hrs após remoção em isopentano que tinha já sido prê-arrefecido em azoto líquido. Os tecidos foram então armazenados em azoto líquido ou a -7Q2C até à

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132/em

-22sua utilização. Utilizou-se IgG anti-rato de coelho (Sternbergsr-Meyer Immunochemicals, Inc., Oarettsville, MD) a uma diluição de l/50. 0 complexo peroxidase de rato-anti-peroxidase

(PAP, Sternberger-F^ieyer Immunochemicals, Inc.) contendo 2 mg/ml de PAP especificamente purificado, foi utilizado a uma diluição de l/θθ. Secções congeladas foram preparadas, secas, tratadas com acetona e secas (Garrigues et al., 1982). As secções a ser usadas para avaliação histológica foram coradas com hematoxilina. Para diminuir substâncias de fundo não específicas, as seç ções foram prê-incubadas com soro humano normal diluído a l/5 (Garrigues et al., 1982). Anticorpos de rato, IgG anti-rato de cabra, e PAP de rato foram diluídos numa solução de soro humano normal a 10/ e soro de coelho a 3/.

0 processo de corar consiste ern tratar secções seriadas com anticorpo ou específico ou de controlo durante 2,5 hrs, incubando durante 30 min com IgG anti-rato de coelho diluído a l/ /50, e expondo durante 30 min ao complexo PAP de rato diluído.a l/80. Após cada tratamento com anticorpo, as placas foram lava das duas vezes em fosfato tamponado salino (PBS). A reacção imunohistoquímica foi revelada com tetrahidroclcreto de 3,3'-diaminobenzidina a 0,05/ acabado de preparar (Sigma St. Louis, MO) e com peróxido de hidrogénio a 0,0l/ em 0,05 M de tampão tris, pH 7,6 durante 8 min. Nova exposição a uma solução de OsQ^ a ί/ em Sgua destilada durante 20 min intensificou o coraje te. As secções foram enxaguadas com âgua, desidratadas em ãlc£ ol, limpas em xileno e montadas em placas.

Cada uma das placas foi lida sob código e as amostras codificadas foram verificadas por um investigador independente. As placas típicas foram fotografadas utilizando aparelhos de óptica de contraste de interferência diferencial (Zeiss-Homarski). 0 grau de anticorpo corado foi avaliado como 0 (nenhuma reactividade), + (poucas cálulas positivas), ++ (pelo menos um terço das cálulas positivas), +++ (a maior parte das células p_o sitivas), ++++ (quase todas as cálulas fortemente positivas). Como as diferenças entre + e 0 de corante eram menos nítidas, que entre o corante ·η· e +, decidiu-se contar como "positivo"

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uma preparação corada graduada como *+ ou superior, Ambas as células neoplásicas e do estroma foram observados nas amostras de tumorJ a coloração registada referia-se à das células tumorais, visto que as células do estroma não ficaram coradas de to de, ou estavam mais fracamente coradas que as células tumorais.

Determinação da Localização de Antigênio

A localização subcelular de antigênios foi determinada

medindo a ligação de anticorpo às células antes ou depois da

permeabilização com detergente não-iónico. Os anticorpos que

se ligaram à superfície celular de células de cultura intactas

fcram identificados quer por ensaios de ligação directa com anticorpo marcado com "1 (Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sei.

U.S.A. (1981a) 78;539-543) quer por fluorescência indirecta

utilizando o seleccionador de células (FACS) II. Os anticorpos

ligando-se a localizações intracelulares foram determinados por 1 25

ligação directa de anticorpo marcado com " Ia células apés fi xação com paraformaldeído e subsequente permeabilização com o detergente não-iónico NP-40.

Ensaios de Ligação

(a) Para ensaios de ligação efectuados utilizando anti corpos radiomarcados (Brown et al», supra), incubaram-se células cultivadas (lO ) a 42C durante 30 min com 10 cpm de anticor

125 ~”

po marcado com I em 100 yM.1 de soro de vitelo fetal activado pelo calor (30 min a 56SC) em meio de cultura. Após a adição de 5 ml de PBS, as células foram agrupadas em bolinhas por centrifugação durante 10 min a 250 X g. 0 sobrenadante foi aspirado,

125

e as bolinhas foram observadas para detecção de I. Para medir ligação não específica, foram efectuadas incubações paralelas com 10 Λ9 ^de anticorpo não marcado como um competidor (Brown et al., supra). Nalguns casos os ensaios de ligação foram efectuados de uma forma análoga em monocamadas de células fixadas a pratos de cultura de plástico.

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-24(b) Para ensaios de ligação efectuados no seleccionador de células FACS II, as células foram removidas dos seus substractos utilizando PBS contendo 5 mM de ácido etilenodiamina tetracético (EDTA). As amostras contendo 1 x 10 células foram incubadas em primeiro lugar com anticorpo monoclonal a uma concentração de 2 yM.g/ml seguido de anticorpo anti-rato de cabra fluoresceína-conjugado a uma diluição de 1:200. As células foram então lavadas e re-suspensas no meio de cultura. Ime diatamente antes da análise FACS, adicionou-se iodeto de propidio com uma concentração final de lyKg/ml para corar as células não-viáveis. Durante a análise FACS, as células emitindo fluores. cência vermelha foram electronicamente retiradas de forma que sá foram examinadas células viáveis. A intensidade média de fluorescência de fluoresceína foi determinada para cada anticorpo.

Os controlos negativos consistiam de amostras nas quais o anticorpo monoclonal estava omitido; os controlos positivos consis tiam em anticorpos monoclonais para os antigénios de histocompa tibilidade HLA tipo 1. A fixação do corante foi considerada C£ mo positiva se a fluoresceína do canal média fosse pelo menos 3 vezes superior à do campo de fundo.

Determinação de Antigénio Proteico

Para identificar os antigénios proteicos, carcinoma do

pulmão ou células do pulmão embriónico humano foram radio-iodi35

zados à superfície ou metabolicamente marcadas com S-Metionina. Os antigénios foram isolados a partir de lisados celulares através de incubação com anticorpo monoclonal, adição de IgG anti-rato de cabra, e adsorção para S. aureus. Os imunoprecipi. tados foram lavados e analisados através de sulfato dodecil de sódio-gel electroforese em proliacrilamida (SDS-PAGE) (10-20% acrilamida) como descrito (Brown et al., supra).

35

Marcação com S-Metionina

Células do hibridoma produzindo um anticorpo particular

foram semeadas para dentro de um depósito de microtitulação em

Meio Essencial Mínimo de Dulbecco (DMEM) isento de metionina,

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contendo 25 mM de tampão Hepes, 4 mM de L-glutamina, 4,5 g/l de

glucose, 10 mM de aminoácidos não-essenciais, 100 unidades/ml

de penicilina, 100 y<g/ml de estreptomicina e 15% de soro de vi.

telo acabado de nascer inactivado pelo calor (NCS). As células 35

foram contactadas durante 6 hrs com 0,1 mCi S-metionina a 372C, o sobrenadante foi removido e centrifugado para remover as cêlu 1 as ·

Determinação da Isotipia

a) Imunodifusão de Ouchterlony

Uma porção de sobrenadante de células de hibridoma particulares foi colocada no depósito do centra de uma placa de agar a 2%. Colocaram-se anticorpos isotipos de Ig anti-rato de coelho monoespecíficos (Melov) nos depósitos periféricos e a placa foi incubada durante 2 h à temperatura ambiente e durante a noite a 42C.

b) Placas de 96 depósitos de cloreto de polivinilo fie,

xíveis (Costar) foram revestidas com 0,1 mg/ml de anticorpos Ig anti-rato de cabra durante 2 horas a 372C e contra revestidas com uma solução BSA a 3% durante 2 horas a 37SC. 0 hibridoma

sobrenadante foi então incubado a 372C durante 2 h. Após lavagem com PBS, as placas com albumina de soro bovina (BSA) foram incubadas a 372C durante 2 h com anticorpos de isotipo Ig anti-rato de coelho monoespecíficos ligados a peroxidase (Zymed). Após lavagem, as placas foram incubadas com 1 mg/ml de ortofenilenodiamina e 0,03% de HgO^ ^em ^^afnP“° citrato a pH

4,5. A densidade óptica a 630 nm foi determinada numa placa de leitura Dynatec ELISA.

Ensaio de Ligação de Proteína A Estafilocóccica

Depósitos de microtitulação foram incubados com 5% NCS

em PBS mais 0,02% da NaN^ e o sobrenadante foi aspirado. Adicionaram-se a cada depósito 25 /Al de uma suspensão de células

epidérmicas (2 x 10 cêlulas/ml) s incubaram-se com 25 /Al de

um anticorpo particular durante 1 hr ã temperatura ambiente. As

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-26«

placas foram centrifugadas a 1200 rpm durante 7 min, lavadas

duas vezes com 50$ MCS/PBS/Wai\U e adicionaram-se 25 u.1 de pro

Ί O C S

teína A I-estafilocóccica (cerca de 50 000 cpm/25 l). As placas forara incubadas durante 1 hora a 259C, lavadas duas vezes com 5$ NCS/PBS/NaN-j e secas. 0 fundo dos depósitos foi cortado e contado num contador de raios gama.

Cultura Celular

Células de carcinoma do pulmão Calu-1 foram obtidas a partir do American Type Culture Collection. As células foram mantidas em cultura de monocamada em Meio de Crescimento (Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 50 unidades de penicilina por ml, 50 yt<g de estreptomicina por ml, e 10/o (v:v) soro de vitelo fetal (FCS). As células foram recolhidas por tratamento com uma solução de 0,05$ de tripsina e 0,02$ ds EDTA e contadas com um hemacitómetro.

Imunofluorescência Indirecta

As células foram recolhidas por tripsinização e colocadas em placas a uma densidade de 5-20x10 por depósito (6 mm de diâmetro) em placas de depósitos múltiplas revestidas com teflon (Meloy Labs). As células foram mantidas a 372 durante aproxima damente 18 horas antes do início da experiência. 0 meio foi as. pirado e as células aderentes foram lavadas uma vez com fosfato tamponado salino (PBS, NaCl, 0,14M, KCI, 3 mM; f^HP0^7^0,

8 mM; e Kh^PO^, 15 mM) contendo 0,5 mM de CaC^ e 0,5 mM de MgClg. As células foram então fixas in situ pela adição de 25 microlitros de uma solução de paraformaldeído (0,5$ em PBS) durante 20-30 minutos a 233. 0s depósitos foram lavados e os antigênios intracelulares expostos pela adição de PBS contendo 0,2/ó (vív) MP4Q durante 5 min a 233, 0 excesso de grupos aldeí.

do foi então bloqueado pela adição de tampão de ligação (DMEM con

tendo 50 mM BES (ácido Ν,Ν-bis /"""2-hidraxietil_7-2-aminoetanosulfónico) a pH 6,8 0,1$ (p:v) BSA e 15$ FCS) durante um mínimo

de 15 minutos a 239. 0s anticorpos foram diluídos para uma co_n

centração de 10 Λ9 por ml em tampão de ligação e aplicados a

um volume total de 20-25 microlitros por depósito. As placas foram incubadas a 42 durante 1 hr e lavadas com tampão de ligação. Um anticorpo secundário fluoresceína isotiocianato conjugado (FITC) (igG e IgM anti-rato de cabra) foi então adicionado durante 1 hr a 42. A diluição do conjugado FITC usado foi determinada experimentalmente como a que produzia a proporção óptima de sinal-ruído de fundo. Após esta incubação, as placas foram lavadas, com tampão de ligação e l-^O e secas ao ar. Um pequeno volume de solução anti-desbotamento (Genetic Systems Corporation) e um envólucro foram adicionados, e as placas foram examinadas utilizando um microscópio de fluorescência Leitz Orthoplan. As placas foram examinadas sob uma objectiva de imersão em óleo 40X e fotografadas com película Tri X Pan Kodak

Marcação Metabólica

35

A. S-Metionina

As cálulas foram recolhidas por tripsinização. A viabi lidade, determinada por inclusão com azul tripan, foi geralment superior a 95/3, Foram recolhidas por centrifugação 4x10 células, e suspensas num volume de 1 ml de Meio de Crescimento, com

35

excepção do aminoácido metionina. Adicionou-se S-Metionina (800 Ci/mmole) para dar uma concentração final de 0,5 mCi/ml, e as células foram incubadas com rotação, a 372C, durante um períj do de 1-6 hrs. As células marcadas foram então recolhidas por centrifugação e lavadas antes de posterior manipulação. Nalguns casos, a suspensão celular radiomarcada foi diluída dez ve zes com Meio de Crescimento contendo metionina não-marcada e 10) FCS, adicionada a uma placa de cultura de tecido de 100 mm e in cubada a 372 durante 18 hrs adicionais. As células aderentes foram então lavadas com PBS antes da sua utilização,

3

B. H-qlucosamina

Um protocolo de marcação semelhante foi utilizado aquajç 3

do da marcação de células com H glucosamina. Os depósitos internos de glucose foram em primeiro lugar esgotados por incuba-

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-28ção em Meio de Crescimento isento de glucose contendo 10/ de FCS dializado durante um período de 4-24 hrs. Só se utilizaram para experiências subsequentes as populações celulares apresentando uma viabilidade > 90/ após privação de alimento. As células foram recolhidas da forma acima descrita e re-suspensas num volume de 1 ml de Meio de Cultura isento de glucose, contejn do 10/ de FCS dialisado, 0,01 M HEPES (ácido Ν-2-hidroxietilpiperazino-N-2-etanosulfónico) a pH 7,4, e 0,5 M Ci H-glucosamina /~40 Ci/mmole_7. Após marcação a 37S com rotação durante um período de 3 hrs, as células foram recolhidas por centrifugação e lavadas com PBS.

Iodinaçoes

125

As proteínas foram radiomarcadas com I utilizando o processo cloramina T como descrito por Greeniuood, et al. (1963) Biochem. 0. 89,:114-123. Amostras das proteínas (50 Ag) foram diluídas para 0,5 ml em PBS contendo 1-2 mCi ~ I (isento de transportador). Dez rnicrolitros de uma solução acabada de fazer de cloramina T (contendo 10 g) foi adicionada, e a reacção foi continuada durante um período de 5 min a 23S. A reacção foi terminada pela adição de soluções contendo 20y<g de Na₂S 0^, e 3 g de MI. não reagido foi removido por cromatografia

numa coluna de Sephadex G-10 equilibrada oom PBS contendo 1 mg/ /ml de albumina sérica bovina. A actividade específica dos anticorpos monoclonais marcados usados neste estudo foi de aproxi.

g

madamente 3x10 cpn por nanomole. Amostras contendo antigénio L3 foram cfessalgadas numa coluna centrifugadora de Sephadex G-10 antes da radiomarcação.

Análise de--Irnunoprecipitação

1 - Preparação do Extracto

Células metabolicamente marcadas foram recolhidas por

centrifugação e solubilizadas em tampão RIPA contendo NaCl, 0,15

Mj Na^PO^ , 0,05 Mj desoxicolato de sódio a 1/ (p:v)j Triton

X-100, 1/ (p:v), e SDS, 0,1/ (p:v), a uma proporção de 2-4x10°

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-29cêlulas por mililitro. Apôs incubação durante 10 min a 49, a mistura foi clarificada por centrifugação (147 000 χ g durante 30 min, Ti 70,1 rotor). 0 sobrenadante foi removido e a incorporação da radioactividade foi determinada por contagem por cin tilação líquida.

2 - Imunoprecipitação

7

Porções de lisado celular contendo 1-2x10 cpm (ácido precipitâvel) para, "o-metionina e I ou 4x10 cpm (ácido pre cipitável) para ^l-I glucosamina, foram incubados com 1 micrograma de anticorpo durante 0,5-1 hr a 4⁹C. Quando o meio de cultu ra marcado foi analisado, uma porção foi usada sendo equivalente à percentagem do extracto celular total analisado. Urna solu ção contendo imunoglobulina anti-rato de cabra purificada por afinidade (l-2 yág, preparado imunizando uma cabra com imunoglobulina de rato) foi adicionada e a incubação a 4SC foi conti nuada durante 10-60 min adicionais. Cinquenta microlitros de uma solução a 10% de Stapbylococcus aureus fixo com formalina (Pansorbin) foram adicionados, e apôs 5 min de incubação a 4SC, os imunoprecipitados foram recolhidos por centrifugação. (Antes da utilização, o Pansorbin foi lavado uma vez numa solução de 0,5% (v:v) de NP40, uma vez numa solução de 0,05% (v:v) de NP40 e re-suspenso no último tampão contenda 1 mg/ml de ovalbumina). Os precipitados foram lavados 3-4 vezes em tampão TNEN (Tris hi droximetilaminometano pH 8,0, 0,02Hj NaCl, 0,lM; EDTA, 0,01M; e NP-40, 0,5/ (p:v)) e armazenado congelado a -20SC atá sua uti. lização.

Electroforese

1 - SDS-Electroforese em Poliacrilamida Gel (SDS-PAGE):

SDS-PAGE foi efectuado de acordo com Laemmli supra. 0

gel resolvente (0,75 mm) usado mais frequentemente foi acrilami.

da linear com um gradiente 10-20/ e o gel empilhador continha 5)

de acrilamida. As amostras foram fervidas numa amostra tampão

contendo 5/ de 2-mercaptoetanol, e o imunoabsorvente foi removi

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132/em

30do por centrifugação antes da electroforese. Os padrões de peso molecular eram ou uma mistura proteica ^^C-metilada (Amersham) ou padrões pré-corados (BRL). Os pesos moleculares das proteínas padrão usadas foram a miosina (200 000), fosforilase b (92 400), albumina de soro bovino (BSA) (69 000), ovalbumina (46 000), quimotripsinogênio (26 000), betalactoglobulina (18 400), lisosima (14 300) e citocrómio c (12 300). Após ele_ç troforese, os geles são secos in vacuo e as posições das prote_í nas radiomarcadas foram determinadas por airforradiograf ia em película de raios-X Kodak.

2 - Focagem isoeléctrica Bi-dimensional (IEF)-SDS PAGE:

125

Os imunoprecipitados contendo antigénio L3 I marcado foram preparados da forma descrita, e re-suspensos em 50 microlitros de uma solução contendo 5/ (v:v) de 2-mercaptoetanol e l/ (v:v) de NP4Q. As amostras foram aquecidas a 95SC durante 5 min e o imunoabsorvente foi removido por centrifugação. As amos, tras foram misturadas com amfolinas (variação de pH de 3,5-10; concentração final de 4/) e adicionou-se ureia sólida até à saturação. A focagem isoeléctrica e a SDS PAGE foram efectuadas de acordo com o processo de 0'Farrell (1975) 0. Biol. Chem. 250:4007-4021. Marcadores proteicos padrão (BioRad) foram usados para controlar a separação na dimensão IEF. 0 gradiente de ρΗ resultante foi determinado a partir de um gel sem nada efectu ado em paralelo. 0 gel foi cortado em fatias de 0,5 cm, as fatias foram ensopadas em 1 ml de l-^O destilada durante 1 hr e o pH da solução resultante foi determinado.

3 - Electroforese Paraqon:

A electroforese das proteínas sêricas foi conduzida uti, lizando agarose geles pré-formados num dispositivo Paragon (Beckman) de acordo com as instruções do fabricante.

Imuno-formação de mancha

As proteínas a ser analisadas foram separadas ou por

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132/em

-31SDS-PAGE ou por Paragon. As amostras separadas por SDS-PAGE fo ram electroforeticamente transferidas para nitrocelulose da fo.r ma descrita por Burnette (l98l) Anal. Biochem. 112:195-203 a 5 W/cm durante um período de aproximadamente 18 hr a 42C. As amostras separadas por Paragon foram transferidas para nitrocelulose cobrindo o electroforetograma com uma folha de papel de nitrocelulose. A nitrocelulose foi hidratada no tampão de transferência de Burnette, supra, sem SDS sem utilização. Um maço de papéis com aproximadamente 2,54 cm de espessura foi colocado sobre a nitrocelulose e carregado com uma placa de vidro e um frasco de reagente. A transferência ficou completa dentro de um período da 1 hora, como avaliado pela fixação de corante pelo gel após transferência. As manchas de nitrocelulose foram bloqueadas por uma incubação de 1 hr em Blotto, um cocktail à base de leite (Johnson et aí., Gene Anal. Technol. (1984) 1.:3-8) (PBS contendo 1$ (p:v) de leite seco sem gordura Carnation e 0,2Jj (v:v) de NP-40). 0 antigénio L3 foi revelado por incubação

das manchas com 1-4x10 cpm/ml de anticorpo r-L3 em Blotto durante 1 hr a 232. fís manchas foram lavadas extensivamente eom Blotto, e secas antes de exposição autorradiográf ica.

1?5

Ligação de anticorpo ~ I-L3

Células Calu-1 (4-10xl0⁴) foram semeadas em pratos de cultura de células de 48 depósitos 18 hrs antes do início da ex. periência. As células foram lavadas com PBS e fixadas com uma solução de 0,5$ de paraformaldeído em PBS durante um período de 20 min a 232C. As monocamadas foram lavadas com PBS e permeabi lizadas por tratamento com PBS contendo 0,2$ NP-40 durante 5

1 95

min a 232. Diversas concentrações de anticorpo marcado com I foram adicionadas num volume final de 0,1 ml durante um período de 60 min a 232. As monocamadas foram então lavadas extensivamente com tampão ds ligação, e solubilizadas pela adição de 0,5 M de NaOH. A radioactividade ligada ã célula foi determinada num contador de raios gama. As amostras foram ensaiadas em duplicado; as amostras duplicadas variaram geralmente em menos de 20$. Para medir ligação de anticorpo não-específica, depósi.

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132/em

-32tos idênticos foram incubados com 50 a 100 vezes em excesso de

anticorpo L3 não-marcado, o qual reduziu de uma maneira geral

a ligação do anticorpo I-marcado em mais de 90;j. Quando os

dados de ligação foram analisados de acordo com Scatchard (1949)

Ann. N.Y. Acad. Sei. 51:660-672, uma constante de afinidade (K„)

de aproximadamente 1x10 M foi determinada para o anticorpo 125

I-L3. A ligação do anticorpo ficaria reduzida em mais de 10 vezes caso as monocamadas de células não fossem tratadas com NP

40 antes da adição de anticorpo

125

I-L3.

Ensaio de ligação competitiva

A actividade antigênica L3 foi medida determinando a ca 125

pacidade do antigénio de inibir a ligação do anticorpo L3 I-marcado a monocamadas de células Calu-1 fixadas com formalina. As monocamadas celulares foram preparadas da forma acima descri, ta. 0 anticorpo I-L3 foi adicionado a células a uma concentração de 6,4y<g/ml na presença ou ausência de soluçães conten, do actividade antigênica L3. 0 volume final do ensaio foi de

0,1 ml. Sob estas condições, a ligação do anticorpo ' I-L3 foi mais de 95$ específica, como avaliado pela capacidade de a_n ticorpo L3 não marcado de competir para a ligação. Diversas dj. luicãss das soluçães de teste foram adicionadas e a lioação do

anticorpo

125

I-marcado foi medida da. forma acima descrita. As

curvas de inibição típica para as diversas etapas de purificação do antigénio L3 encontrado em meio de cultura e em soro humano normal, estão apresentados na. Figura 1, Material Suplementar. Uma unidade de actividade antigênica L3 é definida como a

quantidade necessária para inibir em 50$ a ligação de anticorpo

125 /

I-L3 adicionado a 0,4 y4g/ml.

Tratamentos com qlicosidase

35,

12

Imunoprecipitados de S-metionina ou de antigénio L3

I-marcado foram preparados da forma descrita. 0 imunoabsorvente em bolinhas foi re-suspenso num volume de vinte e cinco

microlitros ds tampão de digestão, adicionou-se um volume de

cinco microlitros contendo 5 miliunidades da enzima apropriada

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132/em

-53e as amostras foram incubadas a 372 durante 18 hrs, Uma amostrai tampão SDS-PAGE concentrada foi adicionada, e as amostras foram submetidas a electroforese. Para o tratamento com neuramidase, o tampão ds digestão continha: NaCl 0,15 Mj acetato de sódio a pH 5,3, 0,05 Mj CaCl^, 0,1/ (p:v)? e fluoreto de fenilmstilsulfonilo, 0,1% (p:v). Pars o tratamento com endogliccsidase H (Endo Η) o tampão ds digestão continha: Tris-HCl a pH 6,5: 0,025 R, SDS, 0,2% (p:v)j e fluoreto ds fenilmetil

sulfonilo, 0,1/ (p:v).

Datsrmínaçãc da Proteína

As concentrações de proteína foram determinadas pelo método de Bradford (1976) Anal. Biochem. 72:248-254 utilizando albumina de soro bovino como um padrão.

Preparação de Sspharose L3

Sspharose 4B CNBr-activada liofilizada foi reconstituída em 1 mM de HCl a 45 durante um período ds 30-60 min. A resi, na fei lavada urna vez na mesma solução, recolhida por centrifugação, misturada com antigênio L3 a 3,5 mg/ml numa solução de 1 M de NaCl e 0,2 M de bicarbonato de sódio a pH 8,3. A mistura foi incubada a 49, com rotação, durante um período de 16 hrs, A resina foi recolhida por centrifugação e os grupos activos em excesso foram blequeados pela adição de 1-4 volumes ds uma solu, ção de 0,25 M de glicina a pH

da por centrifugação e lavada

A resina foi então recolhidiversas vezes em PBS antes de ser utilizada. A eficiência da ligação foi avaliada medindo a 280 nm da solução de anticorpo antes e após a ligaabsorção

ção, e foi determinada corno sendo aproximadamente de 10 mg ds anticorpo L3 por ml de resina compacta»

Coloração do gel

Após SDS PAGE, as posiçoes das bandas de proteínas foram determinadas corando com azul Coomassie, ou sobre dispositi,

vos corantes comerciais baseados em prata (Bioílad) ou níquel

(Kodak).

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-34Sequência firaino-Terminal por Degradação ds Edman

Antigênio L3 ds meio de cultura foi reduzido com ditio trsitol (20 mM) num volume ds 0,1 ml de uma solução contendo 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 e 0,l/ SDS (p:v) durante 2 hrs.a 503. 0 antigênio foi então S-carboxamidometilado por tratamento com iodoacetamida (45 mH) durante 30 min a 202 e submetido a SDS-PAGE preparativa numa acrilamida gel a 10/ (l,5 mm de espessura). Após electroforese, o gel foi corado com Azul Brilhante Coomassie (0,5/? em peso ern ácido acético a 10/ e isopropanol a 30/) e descorado numa solução de ácido acético (5/5 v:v) e metanol ('17$ υ:ν). A banda de antigênio L3 corada foi excisada com uma lâmina e submetida imediatamente a electroeluição s electro diálise com um Electroeluidor/Concentrador ECU-040 (C.B.S. Scientific Co., San Biedo, Ca), Antigênio L3 derivado de soro foi processado de forma idêntica, com a excepção de que a amostra não foi carboxamidometilada. A recuperação global do processo foi de aproximadamente 80$ baseada no cálculo da quantidade de proteína através de SDS-PfiGE analítica com coloração pela prata.

A degradação automatizada de Edman foi efectuada com aproximada mente 100 pmol ds antigênio L3 derivado de meio condicionado S-carboxamidometilado (baseado no rendimento de Met-6 identifica do) e 38 pmol de antigênio L3 não modificado derivado do soro (baseado no rendimento de Ual-1 identificada) num sequenciador de fase de gás (Modelo 470A, Applied Biosystems, Inc. Foster Ci ty, Ca). Os aminoácidos feniltiohidantoína foram analisados por HPLC de fase invertida (Unidade de detecção, 2 pmole) com uma coluna Cyano I3M Instruments usando um gradiente tampão ace tato de sêdio/tetrahidrofurano/acstonitrilo para eluição (Applied Biosystems, Protein Sequence Users Bulletin ΝΞ. 2, 1984).

EXEMPLO 1

Preparação de Anticorpos Monoclonais

Produziram-se anticorpos monoclonais imunizando ratos

BALB/c com 3 meses de idade com tecidos humanos de uma de quatro

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132/em

-35 fontes diferentes: (l) derrames pleurais de doentes eom carcinoma do pulmão dé células nã>-psquenas mstastático, (2) células cul. tivadas de um carcinoma do pulmão de'células'não-pequena e (3) tecido pulmunar de embriões humanos com 3-4 meses de idade. As

imunizações foram efectuadas injectando os ratos intraperitone7

almente 3-4 vezes com cerca de 10 células. Três dias depois da última imunização, os baços foram removidos, suspensos em meio de cultura a fundidos com células de mieloma de rato NS1 (Kohler e Milstein, supra). As misturas foram semeadas para formar culturas de baixa densidade originando de células fundidas isoladas (clones); as técnicas usadas para a hibridização foram já previamente descritas por Yeh, et al., Int. 0. Câncer (1979) 29:269-275.

Os sobrenadantes de células híbridas foram seleccionados utilizando ambos o ensaio ELISA e c ensaio aufcoiradiográfico indirecto da proteína A I-marcada (Broun et al., 0. Immunol. Meth. (1979) 31:201-209, contra extractos dos tumores usados pa ra imunização que/continham, i.a., membranas celulares. Estes extractos foram preparados utilizando um processo modificado de Colcher et al., Câncer Res., (l98l) 42:1451-1459; Yeh et al., supra. Para isto, os tecidos foram lavados com PBS e suspensos, o que para tumores intactos foi feito pressionando através de um crivo de aço inoxidável. Depois disto, adicionou-se 1 mM de NaHCO^ contendo 1 mM de fenilmetilsulfonilfluoreto (Calbiochem-Behring Corp., San Diego, CA), e o material foi então homogeni zado em gelo, com 50 batidas do pilão B de um homogenizador de Dounce. Apás centrifugar durante 15 min a 27 000 x g, 0 sobrenadante foi removido e a bolinha foi re-suspensa em PBS, fez tratamento sonoro durante 1 min e armazenada a -7Q2C.

Os hibridomas que produziram anticorpos ligando-se aos extractos de membrana celular foram clonados, expandidos in vitro, e testados depois para expecificidade do anticorpo. Este teste foi efectuado usando a Técnica Imunohistolôgica acima des. crita, na qual a capacidade dos anticorpos se ligarem a secções congeladas de carcinomas do pulmão, outros tumores e tecidos hu manos normais foi testada. Aqueles hibridomas que produziram

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anticorpos de especificidades aparente para cancro do pulmão hu mano foram re-clonados, expandidos e injectados em ratos BALB/c de 3 meses de idade Pristane-principais onde cresceram como tumores ascíticos.

Os anticorpos segregados para dentro da ascite foram pu rificados em Sepharose de Proteína A (Ey et al., Immunochemistry (1978) 15:429) ou por filtração em gel em Sephacryl S-300. Os anticorpos purificados foram usados para posterior caracteri zação a qual inclui testes de especificidade adicional por imunohistologia, ensaios de ligação em células intactas para detejr minar quais os anticorpos ligados à superfície celular, e os testes de radioimunoprecipitação como acima descritos.

Os anticorpos monoclonais L3, L5 e L18 foram produzidos a partir dos hibridomas correspondentes como acima descrito. Es, tes anticorpos exibiam as propriedades acima indicadas nesta es pecificação.

As linhas celulares designadas L3, L5 e L18, foram depo, sitadas no A.T.C.C. (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr,, Rockville, Maryland 20852) em 4 de Outubro de 1984, e receberam respectivamente os números de entrada HB8626, HB8627 e HB8628. A linha celular L3 foi re-depositada em 25 de Outubro de 1984.

EXEMPLO 2

Purificação do Antigénio L3 a partir de Meio de Cultura Isento

de Soro

1 - Preparação do meio condicionado isento de soro

Células Calu-1 foram cultivadas atê ficarem confluentes em frascos rolantes (850 cm; na presença de Meio de Crescimen, to. As monocamadas foram lavadas 3 vezes com 50 ml de Meio de Crescimento isento de soro, sendo a segunda lavagem deixada nas células durante 30 min a 3720. As células foram então incubadas na presença de 150 ml de Meio de Crescimento isento de soro. 3 dias depois, o meio foi recolhido, centrifugado para recolher

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-37as células flutuantes e armazenado congelado a -702C atê à sua utilização.

2 - Preparação do concentrado

0 meio isento de soro (790 mis) foi concentrado para um volume de 17 ml por ultrafiltração (Amicon, membrana PM10). 0

concentrado foi removido e a membrana foi lavada uma vez com PBS (ll ml). 0 líquido da lavagem e o concentrado foram combinados e a mistura foi centrifugada a 147 000 xg durante 30 min num rotor Ti70 (Beckman). Verificou-se que o sobrenadante continha a maior parte da actividade antigênica L3 e ê daqui em di ante referido como o concentrado.

3.- Cromatografia de Imunoafinidade

0 concentrado foi passado sobre uma coluna (l,5 ml) de Sepharose C14B para remover substâncias possuindo afinidade para a Sepharose. A coluna foi então lavada com 3 ml de PBS. 0 fluido de escoamento foi combinado com o líquido da lavagem e adicionado a volume compacto de 1 ml de Sepharose 4B conjugada com anticorpo L3 (10 mg L3/ml de resina). A mistura foi mantida

a 42C com rotação por um período de 18 hr, e depois vertido para coluna

dentro de uma/rerta a partir de uma seringa hipodêrmica. 0 flui, do de escoamento foi recolhido e a resina foi lavada com PBS (lO ml), e com solução de 5M NaCl (5 ml) e 0,02M acetato de amó nia (10 ml). 0 antigênio L3 foi eluído a partir da coluna pela adição de uma solução acabada de fazer de trietilamina (75 mM). Como a actividade antigênica L3 era lábil a pH elevado, 0 pH da porção efluente foi ajustado recolhendo fracções (0,5 ml) em tubos contendo 0,1 ml de 2M de acetato de amónia. As fracções contendo actividade L.3 foram identificadas utilizando um ensaio de ligação competitiva, acumulado e armazenado congelado a -2QSC. Os resultados estão resumidos no Quadro I.

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132/em

-38

EXEMPLO 3

Purificação do Antigênio L3 a partir do soro

1 - Recolha do Soro

Recolheu-se sangue de doentes com tumor ou de indivíduos normais e deixou-se coagular durante 10 a 90 minutos à tempe, ratura ambiente. As amostras foram então armazenadas a 4-6SC de 30 min a 5 hrs antes da centrifugação de 10 min a 1600 rpm numa centrifugadora Sorvall Clinicai. 0 soro foi separado do coágulo, dividido em partes e armazenado congelado a -70SC atá à sua utilização. Os níveis de actividade antigánica L3 não di, feriram significativamente no soro ou plasma do mesmo indivíduo As partes descongeladas não foram de uma maneira geral re-conge ladas, visto que a actividade antigánica mostrou-se sensível a congelação-descongelação repetidas. Para purificação da activi dade antigánica L3, uma porção de 10 ml de soro acabado de congelar foi descongelada e clarificada, antes da utilização, por centrifugação a 147 000 x g durante 60 min (Ti 70,1 rotor).

2 - Cromatografia DEAE Sephacel

Uma coluna de 10 ml de DEAE Sephacel foi vertida a equi librada com tampão PE (0,02 M de fosfato de sódio, pH 7,12 e 0,005 M de EDTA). 0 soro clarificado foi diluído para um volume de 130 ml com tampão PE antes de aplicação à coluna permutadora de iães. Uma velocidade de fluxo de 0,5 ml/min foi mantida durante a aplicação e eluição da amostra. 0 fluxo de escoamento da coluna continha 54/ da proteína do soro inicial (avali ado pela absorção a 280 nm) e nenhuma actividade antigánica L3 detectável. A coluna foi então lavada com 10 volumes de coluna de tampão PE. A eluição da actividade antigánica L3 foi conseguida com um gradiente de 50 de 0 a 0,5 M de NaCl em tampão PE. Fracções de 1 ml foram recolhidas durante a eluição. Após a aplicação do gradiente, a coluna foi lavada com 0,5 M de NaCl em PE e finalmente com 1,5 M de NaCl no mesmo tampão. As fracções contendo actividade antigánica L3 foram identificadas uti-

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132/em

-39lizando o ensaio de inibição competitiva e acumulado» A actividade antigénica L3 foi arrastada ligeiramente atrás^rcio volume das proteínas sêricas eluídas.

Nalgumas experiências a actividade antigénica de L3 foi parcialmente purificada antes das análises de radiomarcação e imunoprecipitação por um processo ligeiramente diferente. As proteínas sêricas foram precipitadas em primeiro lugar com sulfato de amónia a 30$. 0 precipitado foi dissolvido em H?0 e des

salgado (em Sephadex G-25) entes de aplicação a uma coluna ds DEAE Sephacel. A eluição da actividade L3 foi conseguida pela adição passo a passo de solução de NaCl. Uma fracção eluindo entre 0,25 e 0,5 π de NaCl, ficou enriquecida com actividade an tigênica L3, e foi usada para radiomarcação subsequente de L3.

0 antigênio preparado desta forma, era indistinguível por impres. são digital ds protease do antigênio radiornarcado precipitado a partir de preparações mais de 3 000 vezes purificadas.

3 - Cromatografia de ímunoafinidade

As fracções acumuladas a partir de uma coluna DEAE Sephacel (14 ml) foram aplicadas a uma coluna de 8,4 ml de Sephacel CL 48 e a coluna foi lavada com 17 ml de PBS. 0 produto de

lavagem foi então combinado com o fluxo de escoamento e a mistu ra foi equilibrada durante 18 horas com 1,5 ml de volume compaç to de Sepharose conjugada, com anticorpo L3 (lO mg L3/ml de resina) por rotação a 42C. A mistura foi vertida para uma coluna e ε resina foi lavada sequencialmente com PBS (42 ml), PBS contendo 0,2$ (vsv) de NP-40 (28 ml) PBS (14 ml), 0,02 f-í de acetato de amónia (28 ml), 5 M de NaCl (28 ml e finalmente, 0,02 M de acetato ds amónia (5 ml), 0 antigênio L3 foi eluído por adi

não

,4 ml de 0,075 f-Ί de trietilamina comc acima descrito.

Gs resultados estão resumidos no Quadro II

nl.

Quer anticorpo 465,125 não marcado quer anticorpo L3 não

EXEMPLO 4

Ligação competitiva do Anticorpo L3 s do Anticorpo 465,125

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132/em

- 4 ΟΙ? 5 .

marcado foram misturados con anticorpo “ I-L.3 (concentração fi nal 0,35 J4. g/ml) s adicionados a células de carcinoma do pulmão H125 fixado com formalina (50 000/depõsitc). Utilizaram-se anticorpos não marcados como sobrenadantes de hibridoma; cada um foi diluído pare, metade do volume original no ensaie finai. A solução de anticorpo 465,123 utilizada continha anticorpo sufi.rnts para precipitar, a parti

de extractos celulares marcados com "'"'S-metionina, uma quantidade ds antigénio equivalente àquela precipitada por um raicrograma de anticorpo L3 purificado.

Os resultados apresentados no Quadro IV indicam que o 465,125 1 25

não competiu para a ligação do anticorpo “ I-L3. Assim, os

dois anticorpos reconhecem epitopos distintos e sao portanto an ticorpos diferentes e não equivalentes funcionais.

EXEMPLO 5

Fragmentos de Clivagem ds Antigénio L5

Células de carcinoma de pulmão humano CALU-1 foram marcadas à superfície usando i iodação catalisada por lactoperoxidase como descrito por Broun et al. (0, Immunol. 127:539-546, 1981). G antigénio L5 (isto é o antigénio definido pelo anticorpo L5) foi precipitado a partir ds extractos celulares e ana lisado por SDS-PAGE efectuada sob condições redutoras. Quando consequentemente analisado, o antigénio L5 migrou como urna cadeia polipéptida simples de Mr 135 000. A região do gel contejg do o antigénio L5 foi excisada, tratada com a quantidade indica da de protease V8 de 5taphylococcus aureus, e analisada novamen te por SDS-PAGE, como descrito por Cleveland et al., supra. As "impressões digitais" resultantes dos fragmentos ds clivagem V3 iodados ds superfície celular são diagnósticos para o antigénio L5, i.e., fragmentes ds Mr 24 000 e 16 000 são característi cos do antigénio L5 e distinguem o antigénio L5 de outros antigénios de peso molecular semelhante.

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132/em

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132/em

Características do antigénio L3 em Soro Humano Normal

-42Quadrc III

Concentração:	5,8 + 2	,6 yA.g/ml1
Peso molecular:	94 000	Forma I
	76 000	Forma II
	26 000	Forma III
Mobilidade	alfa-2
pH:	4,2-5,0	(Formas I e
Aminoácido N-terminal	Vai	(Forma l)

Determinado como o valor médio (*, desvio padrão) a partir de sete indivíduos normais saudáveis. Os soros foram testados a uma concentração final de 5,7)6 sm volume no ensaio de ligação competitiva, utilizan do antigénio L3 purificado por imunoafinidade a partir do meio de cultura como um padrão. Os valores foram corrigidos em relação ã pureza da preparação padrão a qual foi calculada (por exploração densitométrico de um gel SDS-PAGE corado pela prata) como sendo de 66/.

Quadro IV

Anticorpo não marcado

Anticorpo

(cpm)

ligado

Nenhum

465,123

L3

9524 (100) 10028 (105) 1194 ( 12)

0 invento foi descrito em detalhe com particular referên

cia às concretizações acima. Entender-se-á, contudo, que se pjo

dem fazer variações e modificações dentro do espírito e objecto

do invento.

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-43-

Claims (34)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Processo para a preparação de um anticorpo monoclonal, compreendendo:

   (a) propagar uma linha celular continua hibrida como depositada na A.T.C.C. possuindo o número de entrada HB8626, ou um seu mutante, recombinante ou derivado tratado por engenharia genética; e

   (b) recolher o anticorpo produzido pela linha celular continua, cujo anticorpo se liga a um local determinante num antigénio proteico da superfície celular de carcinoma do pul. mão de células não-pequenas humano e se liga também a um local determinante num antigénio proteico segregado pelo carcinoma do pulmão de células não-pequenas humano.
2. 2 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto do anticorpo monoclonal compreender L3.
3. 3 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto do antigénio proteico da superfície celular ter um peso molecular de cerca de 76 000 daltons, como determinado por electroforese em poliacrilamida gel.
4. 4 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto do local determinante segregado pelas células do carcinoma compreender uma glicoproteina possuindo um peso molecular de cerca de 94 000 daltons, uma proteína possuindo um peso molecular de cerca de 76 000 daltons, ou uma proteína possuindo um peso molecular de cerca de 26 000 daltons, como dje terminado por electroforese em poliacrilamida gel.
5. 5 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto da linha celular continua ser propagada na cavidade peritoneal de

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   132/em

   -44um hospedeiro mamífero e do anticorpo monoclonal ser recolhido a partir do líquido ascítico ou do sangue do hospedeiro mamífero.
6. 6 - Processo para a preparação de um anticorpo monoclonal, compreendendo:

   (a) propagar uma linha celular contínua híbrida como depositada na A.T.C.C. possuindo o núme. ro de entrada HB8627, ou um seu mutante, recombinante ou derivado tratado por engenharia genética; e

   (b) recolher o anticorpo produzido pela linha ce lular contínua, cujo anticorpo se liga a um local determinante num antigénio proteico da superfície celular de carcinoma do pulmão de células não-pequenas humano, possuindo um pç so molecular de cerca de 135 000 daltons, cjg mo determinado por electroforese em poliacrtoL amida gel.
7. 7 - Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto do anticorpo monoclonal compreender L5.
8. 8 - Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto da linha celular contínua ser propagada na cavidade peritoneal de um hospedeiro mamífero e do anticorpo monoclonal ser recolhido a partir do liquido ascítico do mamífero hospedeiro.
9. 9 - Processo, para a preparação de um anticorpo monoclonal, compreendendo

   (a) propagação de uma linha celular contínua híbrida como depositada na A.T.C.C. possuindo

   o número de entrada HB8628, ou um seu mutante, recombinante ou derivado tratado por engenharia genética; e

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   (b) recolha do anticorpo produzido pela linha celular continua, cujo anticorpo se liga a um local determinante num antigénio proteico da superfície celular de carcinoma do pulmão de células não-pequenas humano, possuindo um peso molecular de cerca de 72 000 daltons como determinado por electroforese em poliacrilamida gel.
10. 10 - Processo, de acordo com a reivindicação 9, carajs terizado pelo facto do anticorpo monoclonal compreender L18.
11. 11 - Processo, de acordo com a reivindicação 9, carac, terizado pelo facto da linha celular contínua ser propagada na cavidade peritoneal de um hospedeiro mamífero, e do anticorpo monoclonal ser recolhido a partir do líquido ascítico ou do sangue do mamífero hospedeiro.
12. 12 - Processo para a produção de anticorpos monoclonais contra células de carcinoma humano, compreendendo:

    (a) propagar um hibridoma formada fundindo (i) uma célula capaz de produzir anticorpos contra um local determinante num antigénio proteico da superfície celular de carcinoma do pulmão de células não-pequenas humano com (ii) numa célula de mieloma; e

    (b) recolha dos anticorpos produzidos pelo hibridoma.
13. 13 - Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto do local determinante do carcinoma humano compreender uma proteína possuindo um peso molecular de cerca de 76 000 daltons como determinado por electroforese em polieacrilamida gsl.
14. 14 - Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto do local determinante do carcinoma huma-

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    -46no compreender uma proteina possuindo um peso molecular de cerca de 135 000 daltons, como determinado por electroforese em pjo liacrilamida gel.
15. 15 - Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto do local determinante do carcinoma humano compreender uma proteina possuindo um peso molecular de cerca de 72 000 daltons, como determinado por electroforese em poliacrilamida gel.
16. 16 - Processo de produção de anticorpos monoclonais contra células de carcinoma humano, compreendendo:

    (a) propagar um hibridoma formado fundindo (i) uma célula capaz de produzir anticorpos contra um local determinante de um antigénio segregado por um carcinoma do pulmão de células não-pequenas humano com (ii) uma c.é lula de mieloma; e

    (b) recolha dos anticorpos produzidos pelo hibridoma.
17. 17 - Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto do local determinante segregado pelo cajr cinoma compreender uma glicoprotelna possuindo um peso molecular de cerca de 94 000 daltons, como determinado por electroforese em poliaorilamida gel.
18. 18 - Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto do local determinante segregado pelo cajr cinoma compreender uma proteina possuindo um peso molecular de cerca de 76 000 daltons como determinado por electroforese em poliaorilamida gel.
19. 19 - Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto do local determinante segregado pelo car. cinoma compreender uma proteina possuindo um peso molecular de cerca de 26 000 daltons como determinado por electroforese em

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    -47poliacrilamida gel.
20. 20 - Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo faeto da sequência aminoácida terminal da gl.i coproteína de 94 000 daltons compreender:

    V-N-D-G-D-M-R-L-A-D-G-G-A-T-N-Q.
21. 21 - Processo, de acordo com a reivindicação 20, carac

    terizado pelo facto da sequência aminoácida terminal compreender ainda: -G-R-V-E-I-F-Y-R-G-Q-W-G-T-V.
22. 22 - Processo para a detecção de células malignas numa amostra suspeita de conter tais células, compreendendo:

    (a) contactar a amostra com um anticorpo monoclonal, ou seu fragmento, dirigido contra um local determinante de um antigênio proteico da superficie celular de carcinoma do pulmão de células não-pequenas humano; e

    (b) detectar a formação de complexos anticorpo-antigénio na amostra.
23. 23 - Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto do antigênio proteico da superfície celjj lar compreender uma proteina possuindo um peso molecular de cer ca de 76 OOD daltons como determinado por electroforese em poliacrilamida gel.
24. 24 - Processo, de acordo com a reivindicação 22, carac. terizado pelo facto do antigênio proteico da superficie celular compreender uma proteína possuindo um peso molecular d0:erca de 135 000 daltons como determinado por electroforese em poliacril. amida gel.
25. 25 - Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto do antigênio proteico da superficie celular compreender uma proteína possuindo um peso molecular de

    cerca de 72 000 daltons como determinado por electroforese em

    poliacrilamida gel.

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    -4826 - Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto do anticorpo monoclonal compreender L3.
26. 27 - Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto do anticorpo monoclonal compreender L5.
27. 28 - Processo, de acordo com a reivindicação 22, carac terizado pelo facto do anticorpo monoclonal compreender L18.
28. 29 - Processo, para a detecção de células malignas nu ma amostra suspeita de conter tais células, compreendendo:

    (a) contactar a amostra com um anticorpo monoclonal, ou seu fragmento, dirigido contra um local determinante de um antigénio segregado por um carcinoma do pulmão de células não-pequenas humano; e

    (b) detectar a formação de complexos antigénio-anticorpo na amostra.
29. 30 - Processo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo facto do antigénio segregado pela célula do carcinoma compreender uma glicoproteina possuindo um peso molecular de cerca de 94 000 daltons como determinado por electrofo rese em poliacrilamida gel.
30. 31 - Processo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo facto do antigénio segregado pela célula do carcinoma compreender uma proteína possuindo um peso molecular de cerca de 76 000 daltons, como determinado por electroforese em poliacrilamida gel.
31. 32 - Processo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo facto do antigénio segregado pela célula do carcinoma compreender uma proteína possuindo um peso molecular de cerca de 26 000 daltons como determinado por electroforese em poliacrilamida gel.
32. 33 - Processo, de acordo com a reivindicação 32, ca64 306

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    -49racterizado pelo facto da sequência aminoácida terminal da proteína de 94 000 daltons compreender:

    V-N-D-G-D-M-R-L-A-D-G-G-A-T-N-Q.
33. 34 - Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo facto da sequência aminoácido terminal compre ender ainda:

    -G-R-V-E-I-F-Y-R-G-Q-W-G-T-V.
34. 35 - Processo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo facto do anticorpo monoclonal compreender L3.

    L ι s b o a, ζ' 4 pi · -1«I. · j

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