PT795018E - Sequências de adn codificando enzimas de síntese de polímeros de hidratos de carbono e método para a produção de plantas transgénicas - Google Patents

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ΡΕ795018 -1 - DESCRIÇÃO "SEQUÊNCIAS DE ADN CODIFICANDO ENZIMAS DE SÍNTESE DE POLÍMEROS DE HIDRATOS DE CARBONO E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÉNICAS"

Este invento refere-se a sequências nucleotidicas codificando enzimas de síntese de frutanos, uma sequência de ADN recombinante compreendendo uma ou mais das referidas sequências nucleotidicas, um método para produção de um organismo hospedeiro geneticamente transformado apresentando um perfil de frutanos modificado e plantas ou partes de plantas transformadas apresentando o referido perfil de frutanos modificado.

Os frutanos referem-se a um grupo de compostos hidratos de carbono nos quais uma ou mais ligações frutosil-frutose constituem a maioria das ligações. Os frutanos são polímeros de frutose com habitualmente, mas não necessariamente, uma unidade glicosil terminal [G-(F)n, G = opcional, n>2]. As ligações frutosil-frutose nos frutanos são do tipo de ligação β-2,6 ou β-2,1. Os frutanos com ligações frutosil-frutose predominantemente β-2,6 são habitualmente designados levano(s). Os frutanos com ligações frutosil-frutose predominantemente β-2,1 são habitualmente designados inulina(s). -2- ΡΕ795018 A biossíntese dos frutanos é vulgar em várias famílias de bactérias, fungos e algas e também em famílias específicas de plantas, tais como a Liliaceae (p. ex., Allium cepa), Poaceae (p. ex., Lolium perenne) e Asteraceae (p. ex., Helianthus tuberosus) . A função dos frutanos nas bactérias e nos fungos está pouco compreendida. Foi sugerido que os frutanos actuam como reservas extracelulares de hidratos de carbono que podem ser mobilizadas durante períodos de stress de hidratos de carbono (Jacques, 1993). Em plantas, os frutanos podem funcionar como reserva de hidratos de carbono que servem como fonte de carbono para (re)crescimento (Meier and Reid, 1982). Em espécies armazenadoras de frutanos, a síntese de frutanos está restringida não só a órgãos específicos (p. ex., os caules ou tubérculos de H. tuberosus, os bolbos de Allium sps, as bases das folhas e caules das ervas) como também a tipos celulares específicos dentro destes órgãos (habitualmente as células do parênquima). Nestes tipos celulares específicos, o vacúolo é provavelmente a localização tanto da biossíntese como do armazenamento dos frutanos (Darwen e John, 1989; Wagner et al., 1983).

Nas bactérias, exemplos de bactérias sinteti-zadoras de frutanos são Streptococcus mutans e Bacillus subtllus, a biossíntese de frutanos a partir de sacarose é catalisada apenas por uma enzima: levanossacarase (EC 2.4.1.10) em B. subtilus (Dedonder 1966) e levanossacarase, mas também designada frutosiltransferase, (FTF, EC -3- ΡΕ795018 2.4.1.10) em S. mutans (Carlsson, 1970). A síntese de frutanos bacterianos prossegue através da transferência directa da frutose de uma sacarose dadora (G-F) para uma sacarose ou outras moléculas aceitadoras de acordo com a seguinte reacção reversível: n(G-F) + aceitador -> n(G) + aceitador-(F) n, (1) onde n pode ser maior que 10000. A água, hexoses, sacarose, oligossacáridos e levano podem actuar como moléculas aceitadoras de unidades de frutosil da sacarose (dadora de frutosil).

As sequências de ADN bacteriano codificando FTF em S. mutans e de levanossacarase in B. subtilus estão já descritas na literatura (Sato e Kuramitsu, 1986; Steinmetz et al. 1985). Foram utilizados genes bacterianos de várias fontes para transformar plantas hospedeiras específicas que normalmente não podem sintetizar frutanos, induzindo deste modo a sintese de frutanos (ver por exemplo: Van der Meer et al., 1994; Ebskamp et al., 1994). Um método para aumentar o teor sólido dos frutos do tomateiro, utilizando o gene da levanossacarase de B. subtilus e o gene da dextranossacarase de Leuconostoc mesenteroides está descrito no pedido WO 89/12386. Um método para modificar o padrão de frutanos em plantas que normalmente não podem sintetizar frutanos, utilizando o gene ftf codificando a levanossacarase de S. mutans e o gene SacB codificando a -4- ΡΕ795018 levanossacarase de B. subtilus está descrito nos pedidos NL A 9300646 e WO 94/14970. A utilização de uma sequência de ADN codificando a levanossacarase de Erwínía amylovora, que após integração no genoma da planta hospedeira conduz à sintese de levanos, está descrita em DE 4227061 AI e WO A 9404692. Em todos os referidos pedidos, são descritas plantas transgénicas que são transformadas com genes de levanossacarase de bactérias. Concordantemente, estas plantas transgénicas sintetizam e acumulam frutanos estruturalmente comparáveis aos sintetizados pelas bactérias dadoras (Van der Meer et al.r 1994; Ebskamp et al., 1994). O presente pedido difere dos referidos pedidos por estar relacionado com sequências de ADN codificando frutosiltransferases derivadas de plantas. Estas enzimas são estruturalmente diferentes das enzimas bacterianas uma vez que não existe uma homologia significativa ao nivel dos aminoácidos nem do ADN. Para além disso, o mecanismo de biossintese dos frutanos em plantas é essencialmente diferente do das bactérias. Em contraste com a biossintese de frutanos em bactérias, a formação de frutanos em plantas é mediada por mais de uma enzima. Por exemplo, em Helianthus tuberosus (girassol-batateiro) , a biossintese de frutanos é catalisada por duas enzimas: a sacarose:sa-carose-frutosiltransferase (SST, EC 2.4.1.99) e a fru-tano:frutano-frutosiltransferase (FFT, EC 2.4.1.100). A SST e a FFT de H. tuberosus estão envolvidas na sintese de frutanos ligados em β-2,1 (inulina) e são portanto também designadas como 1-SST e 1-FFT. A 1-FFT foi purificada a -5- ΡΕ795018 partir de tubérculos de H. tuberosus (Luscher et ai., 1993; Koops e Jonker, 1994) . A purificação de SST provou-se ser mais difícil de alcançar. Foi purificada uma putativa SST a um rendimento muito baixo, a partir de várias fontes vegetais (Shiomi e Izawa, 1980; Praznik et al., 1990; Angenent et al., 1993). No entanto, em nenhum destes estudos a pureza da enzima foi convincentemente mostrada. Para além disso, não foi convincentemente mostrado nestes estudos que a enzima isolada não representa uma invertase.

Grandes quantidades de 1-SST e 1-FFT foram agora purificadas até à homogeneidade a partir de tubérculos de H. tuberosus (1-FFT: Koops e Jonker, 1994) e os seus mecanismos reaccionais foram extensivamente investigados. A 1-SST de H. tuberosus catalisa o passo inicial da biossíntese de frutanos, a síntese do trissacárido 1-cestose (1-[G-(F)2]) a partir de duas moléculas de sacarose (G-F), de acordo com a seguinte reacção: G-F + G-F - 1-[G-(F)2] + G, (2) em que G-F = sacarose, -F = unidade frutosil, -G = unidade glucosil, G = glicose A 1-SST pode também catalisar a formação do tetrassacárido 1,1—[G—(F) 3] e do pentassacárido 1,1,1-[G-(F) 4] (Fig. 3A). Por essa razão, a actividade de 1-SST pode ser descrita pela seguinte reacção geral: -6- ΡΕ795018 G-(F)n + G- (F)m - G-(F)n-i + G-(F)m+i, l<n<3, l<m<3 (3)

Verificou-se também que a 1-SST de H. tuberosus pode até certo ponto catalisar a transferência de uma unidade frutosil de G-(F)n, lén<3, para água. A segunda enzima, 1-FFT, catalisa a formação de frutanos com um maior grau de polimerização. Esta enzima catalisa uma reacção de polimerização através da transferência de unidades frutosil entre trissacáridos, tetrassacáridos e polímeros de frutose maiores de acordo com a seguinte reacção geral: G- (F) n + G-(F)m - G- (F) n-i + G-(F)m+1, n>2, m>2 (4)

Verificou-se também que 1-FFT catalisa a transferência de unidades frutosil entre hidratos de carbono [(Gal)n-G-F], também designados galactanos, contendo sacarose (G-F) e galactose (Gal). Por exemplo, a 1-FFT pode catalisar a transferência de uma unidade frutosil de G-(F)2 para rafinose (Gal-G-F) o que resulta na formação de [Gal-G— (F)2] - Não se pode excluir que tanto 1-SST como 1-FFT de H. tuberosus podem utilizar outros substratos como aceitadores de frutosil.

Embora 1-SST e 1-FFT tenham alguma actividade sobreponível - ambas as enzimas podem catalisar a formação de tetra e pentassacáridos (reacções 3 ou 4) - 1-SST e 1-FFT são enzimas distintamente diferentes. As proteínas -7- ΡΕ795018 1-SST e 1-FFT têm diferentes propriedades físicas e são codificadas por diferentes genes. 1-SST e 1-FFT têm essencialmente propriedades enzimáticas diferentes. 1-FFT não é capaz de catalisar o passo inicial da síntese de frutanos (reacção 2), enquanto que 1-SST não é capaz de catalisar a formação de polímeros de frutanos com um grau de polimerização superior a 5 [G-(F)n, n>4]. Em conclusão, apenas com a actividade de 1-SST, é apenas possível sintetizar oligofrutanos a partir de sacarose com um grau de polimerização até 5 [G-(F)n, 2<n<4]. Para sintetizar frutanos com um grau mais elevado de polimerização e utilizando sacarose como substrato, é necessário tanto 1-SST como 1-FFT. Apenas com a actividade de 1-FFT, não é possível sintetizar frutanos a partir de sacarose. Os presentes inventores verificaram que fracções proteicas contendo 1-SST purificada bem como a 1-FFT purificada podiam utilizar sacarose como único substrato para a síntese de frutanos com um grau de polimerização de pelo menos 15 [G— (F) i4, Fig. 3B] .

Os frutanos bacterianos diferem dos frutanos das plantas no grau de polimerização e no tipo de ramificação e, consequentemente, nas propriedades químicas e físicas. Em geral, os frutanos das plantas são montados a partir de menos de 1000 unidades frutosil. Os frutanos de H. tuberosus são montados a partir de menos de 100 unidades frutosil. Os frutanos sintetizados por bactérias podem compreender mais de 10000 unidades frutosil. Os frutanos vegetais e bacterianos diferem portanto nas suas possíveis aplicações. Para frutanos com um grau relativamente baixo -8- ΡΕ795018 de polimerização, tal como os isolados de Asteraceae (p. ex., girassol-batateiro, chicória ou dália), foi já feito um pedido como substituto de fosfato em agentes de ligação ao cálcio e detergentes (W091/17189) . Outros pedidos estão relacionados com as propriedades organolépticas dos frutanos. 0 poder adoçante dos frutanos G-(F)n diminui com um aumento do grau de polimerização (aumento do valor de n) . 0 poder adoçante dos oligofrutanos G-(F)2 e G-(F)3 aproxima-se do da sacarose (G-F). Os frutanos de cadeia muito longa tais como os que ocorrem em bactérias não são nada doces. Os frutanos de cadeia muito curta, tais como os que são sintetizados pela sacarose:sacarose-frutosiltrans-ferase podem por isso ser utilizados como adoçantes com a vantagem adicional de que estes frutanos de sabor doce não são carcinogénicos e podem resistir à digestão no tracto digestivo dos humanos, o que abre possibilidades quanto à utilização como adoçante de baixas calorias. Os frutanos de cadeia curta, e também os frutanos de cadeia mais longa, podem ser utilizados como a porção hidrófoba de bioten-sioactivos.

Em contraste com os genes bacterianos que codificam levanossacarase, que foram já clonados, os genes codificando SST e FFT ainda não foram isolados das plantas. Verificámos que os genes codificando SST e FFT de plantas, ao nivel dos aminoácidos, não têm uma semelhança significativa com as levanossacarases conhecidas e que ao nivel do ADN não têm um grau de homologia significativo com os genes de levanossacarases. Por esta razão não foi possível isolar os genes de frutosiltransferases de plantas utilizando sondas heterólogas de levanossacarases. Também não -9- ΡΕ795018 foi possível isolar os genes codificando SST e FFT a partir de plantas utilizando as sequências de aminoácidos das enzimas SST e FFT purificadas e seus iniciadores oligonu-cleotídicos deduzidos.

Em relação à enzima SST a razão para isto é que, embora tenham sido descritos métodos para a purificação de frutosiltransferases a partir de plantas, não foi possível até agora obter a enzima SST em quantidades suficientemente grandes e com graus de pureza suficientemente elevados. Em relação à enzima FFT, a sua purificação é conhecida de Koops e Jonker, 1994. 0 objectivo deste invento é proporcionar sequências nucleotídicas codificando SST.

Outro objectivo deste invento é proporcionar sequências nucleotídicas, obtidas através de recombinação ou mutagénese de sequências nucleotídicas codificando SST, que codifiquem enzimas possuindo actividade de frutosil-transferase.

Ainda outro objectivo deste invento é proporcionar um método para transformação de espécies não sinte-tizadoras de frutanos em espécies sintetizadoras de fru-tanos através da introdução dos genes que codificam SST.

Ainda outro objectivo deste invento é desligar (parcialmente) a síntese de frutanos em espécies que normalmente sintetizam frutanos. -10- ΡΕ795018

Concordantemente, este invento proporciona um fragmento de ADN possuindo uma sequência nucleotidica SEQ ID NO: 1, tal como mostrada na Fig. 4A, ou uma sequência homóloqa possuindo uma identidade de pelo menos 70% codificando uma proteína possuindo actividade de 1-saca-rose:sacarose-frutosiltransferase, que catalise a reacção geral: G-(F)n + G-(F)m - G- (F) n-i + G-(F)m+1, l<n<3, l<m<3 em que -G representa uma unidade glicosil e -F representa uma unidade frutosil.

Mais, este invento proporciona uma sequência de ADN recombinante compreendendo um ou mais destes fragmentos de ADN. Para além disso, este invento proporciona uma sequência de ADN recombinante compreendendo um ou mais dos fragmentos de ADN acima definidos e compreendendo ainda um fragmento de ADN possuindo uma sequência nucleotidica SEQ ID NO: 2 tal como mostrado na Fig. 4B ou uma sequência homóloga possuindo uma identidade de pelo menos 70% codificando uma proteína possuindo actividade de 1-fru-tano:frutano-frutosiltransferase, que catalise a reacção geral: G-(F)n + G-(F)m -> G- (F)n-1 + G-(F)m+i, n>2, m>2 em que -G e -F são tal como definido acima. A 1-sacarose:sacarose-frutosiltransferase (1-SST) e a 1-frutano:frutano-frutosiltransferase (1-FFT) foram -11 - ΡΕ795018 purificadas a partir de tubérculos de Helianthus tuberosus. As enzimas purificadas foram clivadas em péptidos através de digestão triptica e as misturas peptidicas resultantes foram separadas através de HPLC. A sequenciação dos aminoácidos N-terminais foi efectuada para os péptidos seleccionados. As sequências de aminoácidos especificas para 1-SST e 1-FFT foram utilizadas para desenhar iniciadores oligonucleotidicos degenerados específicos para 1-SST e 1-FFT, respectivamente, para utilização em RT-PCR. A PCR foi efectuada utilizando ADNc como molde, um iniciador específico da cauda e iniciadores degenerados específicos para 1-SST ou 1-FFT. 0 ADNc da primeira cadeia foi sintetizado a partir de ARN poli(A)+ isolado de tubérculos de H. tuberosus. Com o iniciador específico de 1-SST, a RT-PCR resultou num fragmento específico de 450 pb. Com o iniciador específico de 1-FFT, a RT-PCR resultou num fragmento específico de 800 pb. Os fragmentos de PCR de 450 e 800 pb foram subsequentemente utilizados para pesquisar uma biblioteca de ADNc feita a partir de tubérculos de H. tuberosus para isolar as sequências de ADNc inteiras codificando 1-SST e 1-FFT, respectivamente.

As sequências codificando SST e FFT de plantas do presente invento induzem, após inserção no genoma de um organismo hospedeiro, por exemplo uma planta, alterações nas concentrações de hidratos de carbono contendo pelo menos uma unidade frutosil (sacarose, oligofrutanos, fruta-nos ou galactanos) ou causam uma alteração no grau de polimerização dos oligofrutanos, frutanos ou galactanos. O -12- ΡΕ795018 presente invento está relacionado com os referidos hidratos de carbono, uma vez que a sacarose é o substrato para SST, os oligofrutanos são produtos de SST, os oligofrutanos e os frutanos com um grau mais elevado de polimerização são substratos e produtos de FFT. Para além disso as referidas enzimas frutosiltransferases podem também efectuar reacções de transfrutosilação com galactanos da série rafinose como aceitador de frutosil. 0 presente invento inclui sequências de ADN que são pelo menos 70% idênticas à sequência codificando 1-SST de H. tuberosus, independentemente de se as sequências homólogas são derivadas de outras fontes vegetais, ou obtidas através de mutagénese de sequências codificando frutosiltransferases de fontes vegetais ou de microrganismos. É preferível que o grau de homologia seja de pelo menos 80%, de maior preferência que o grau de homologia seja de pelo menos 85%, sendo ainda preferível que o grau de homologia seja de pelo menos 90%. É particularmente preferido que o grau de homologia seja de pelo menos 95%. O presente invento inclui sequências de ADN que são pelo menos 70% idênticas à sequência codificando 1-FFT de H. tuberosus, independentemente de se as sequências homólogas são derivadas de outras fontes vegetais, ou obtidas através de mutagénese de sequências codificando frutosiltransferases de microrganismos. É preferível que o grau de homologia seja de pelo menos 80%, de maior preferência que o grau de homologia seja de pelo menos 85%, -13- ΡΕ795018 sendo ainda preferível que o grau de homologia seja de pelo menos 90%. É particularmente mais preferido que o grau de homologia seja de pelo menos 95%. O presente invento inclui também sequências de ADN obtidas através de recombinação in vivo e in vitro utilizando sequências codificando SST e opcionalmente FFT de plantas e sequências codificando frutosiltransferases de outras fontes procarióticas ou eucarióticas, incluindo bactérias e fungos. O presente invento refere-se a sequências de ADN codificando SST de plantas, que após inserção no genoma de um organismo hospedeiro induzem a síntese de oligofrutanos compreendendo 2, 3 e/ou 4 unidades frutosil [G-(F)n, 2<n<4] . O presente invento refere-se também a sequências de ADN codificando FFT de plantas que após inserção no genoma de um organismo hospedeiro juntamente com sequências de ADN codificando SST, induzem a síntese de frutanos com um maior grau de polimerização [G-(F)n, n>4] . O presente invento refere-se também a construções génicas quiméricas compreendendo sequências codificando SST e opcionalmente FFT, ou parte das sequências, estando as sequências presentes na direcção anti-sentido. A introdução destas construções anti-sentido em plantas que podem sintetizar frutanos causará inibição das reacções catalisadas por SST ou FFT ou causará inibição da expressão de SST ou FFT. - 14- ΡΕ795018 0 presente invento refere-se a construções génicas quiméricas codificando SST, ou parte da sequência, estando a sequência de codificação presente na orientação anti-sentido. A introdução destas construções anti-sentido no genoma de plantas hospedeiras que podem sintetizar frutanos, tais como espécies das famílias Asteraceae, Liliaceae e Poaceae, reduz ou bloqueia a conversão de sacarose em oligofrutanos [G-(F)n, 2én<4] . Uma vez que apenas SST é capaz de catalisar o primeiro passo da síntese de frutanos (reacção 2), em tais plantas transgénicas também a síntese de frutanos com um maior grau de polimerização, [G-(F)n, n>4], será reduzida ou bloqueada e estas plantas acumularão sacarose em vez de frutanos. 0 presente invento refere-se a construções génicas quiméricas codificando FFT, ou parte da sequência, estando a sequência de codificação presente na orientação anti-sentido. A introdução destas construções anti-sentido no genoma de plantas hospedeiras que podem sintetizar frutanos reduz ou bloqueia a conversão oligofrutanos [G-(F)n, 2<n<4] em frutanos com um grau de polimerização mais elevado [G- (F)n, n>4]. As plantas transgénicas assim obtidas acumularão oligofrutanos em vez de frutanos, com um grau de polimerização mais elevado.

De acordo, o presente invento proporciona um método para a produção de uma planta geneticamente transformada apresentando um perfil de frutanos modificado, que compreende os passos de: -15- ΡΕ795018 i) preparação de uma construção génica quimérica compreendendo um ou mais fragmentos de ADN tal como acima definido ou os referidos fragmentos de ADN na orientação invertida, operativamente ligados a uma sequência promotora activa na referida planta e uma sequência terminadora activa na referida planta, ii) introdução da construção génica quimérica no genoma da planta, e iii) regeneração das células vegetais transformadas em plantas transgénicas.

Mais especificamente o método do invento compreende os seguintes passos: a. construção de um gene quimérico compreendendo essencialmente as seguintes sequências: - um promotor que assegura a formação de um ARN ou proteína funcional no organismo alvo, órgãos alvo, tecidos ou células pretendidos, uma sequência de ADN codificando SST e opcionalmente FFT,

- um terminador da transcrição operativamente ligado à sequência de ADN, estando a sequência de ADN - 16- ΡΕ795018 codificando SST e opcionalmente FFT funcionalmente ligada a um promotor, uma sequência de ADN codificando um sinal de direccionamento ou um péptido de trânsito que assegura o direccionamento de SST e opcionalmente FFT para um compartimento subcelular específico; b. introdução do gene quimérico no genoma de um organismo hospedeiro de modo a obter material genético compreendendo a sequência de ADN e c. regeneração do material genético num organismo hospedeiro transformado.

No ADN recombinante do presente invento, a sequência de ADN codificando SST e opcionalmente FFT está de preferência ligada a uma sequência reguladora que assegura a expressão correcta da sequência de ADN num organismo hospedeiro, tal como uma bactéria, uma levedura, uma alga ou uma planta, a um nível de expressão suficientemente elevado. As sequências reguladoras são um promotor, um sinal de terminação e um estimulador da transcrição ou da tradução. Um promotor pode ser o promotor de 35S do vírus do mosaico do tabaco (CaMV) ou um promotor indutível por açúcar semelhante ao promotor da patatina ou um promotor específico de um órgão semelhante ao promotor do inibidor II da proteinase de batata específico do tubérculo ou qualquer outro promotor indutível ou específico de tecido. - 17- ΡΕ795018

No ADN recombinante do presente invento, a sequência de ADN codificando SST e opcionalmente FFT está de preferência ligada a sequências reguladoras que são operativas em plantas e que asseguram uma expressão correcta da sequência de ADN nos diferentes órgãos, tecidos ou células da planta. Um promotor altamente preferido é um promotor que é activo em órgãos e tipos celulares que normalmente acumulam sacarose (o substrato primário para a síntese de frutanos). A produção de frutanos é particularmente vantajosa em órgãos que armazenam grandes quantidades de sacarose, tais como as raízes aprumadas da beterraba sacarina ou os caules da cana do açúcar. Para além das raízes, estão envolvidos outros órgãos ou tipos celulares na síntese, processamento, transporte e acumulação de sacarose. Portanto, as sequências codificando SST ou FFT são também adequadamente expressas em folhas, caules, raízes, tubérculos, órgãos reprodutores e sementes.

No ADN recombinante do presente invento, a sequência de ADN codificando SST e opcionalmente FFT contém ou está ligada a uma sequência codificando um péptido de trânsito que dirige a proteína madura SST e opcionalmente a FFT para um compartimento subcelular contendo sacarose. A produção de frutanos é particularmente vantajosa no vacúolo que pode acumular concentrações muito elevadas de sacarose (até 900 mol m“3) . Para além do vacúolo, outros compartimentos subcelulares estão envolvidos na síntese (citoplasma), processamento (citoplasma, mitocôndrias, plastos) e transporte (parede celular, citoplasma) da -18- ΡΕ795018 sacarose. 0 presente invento refere-se portanto à utilização de sequências que permitem o direccionamento do produto SST e opcionalmente FFT para compartimentos subce-lulares específicos, tais como o vacúolo, a parede celular, as mitocôndrias, os plastos e o citoplasma. 0 presente invento refere-se também a construções génicas, compreendendo uma sequência codificando SST e opcionalmente FFT, ou parte das sequências, estando a sequência de codificação presente na orientação anti- sentido. Nestas construções génicas, a sequência codi- ficando SST e opcionalmente FFT está de preferência ligada a um promotor que assegura a formação de um ARN anti-sentido nos tipos celulares que eram normalmente capazes de sintetizar frutanos.

Os ADNs recombinantes do presente invento podem também codificar proteínas possuindo resistência a herbicidas, propriedades de promoção do crescimento vegetal, inibição do crescimento vegetal, antifúngicas, antibacte-rianas, antivirais e/ou anti-nemátodes ou que confiram resistência ao stress. Os ADNs recombinantes do presente invento podem ainda codificar proteínas que induzam esterilidade. No caso de se pretender introduzir o ADN num organismo heterólogo este pode ser modificado para remover motivos conhecidos de instabilidade do ARNm (tais como regiões ricas em AT); e são utilizados sinais de polia-denilação e/ou codões que sejam preferidos pelo organismo, no qual se pretender inserir o ADN recombinante, de modo a que a expressão do ADN assim modificado no organismo - 19- ΡΕ795018 hospedeiro seja maior que a obtida através da expressão de ADN recombinante não modificado no mesmo organismo hospedeiro. 0 presente invento proporciona também uma planta transformada mostrando um perfil de frutanos modificado ou uma célula vegetal, semente, fruto, plântula ou qualquer parte da planta transformada, ancorando uma construção génica quimérica compreendendo um ou mais fragmentos de ADN tais como acima definidos ou os referidos fragmentos de ADN na orientação inversa, operativamente ligados a uma sequência promotora activa na referida planta e a uma sequência terminadora activa na referida planta. O invento inclui de preferência colheitas agrícolas, de forragem, legumes, ornamentais e de fruto, de maior preferência beterraba sacarina, cana do açúcar, batata, petúnia, alfafa, soja, arroz, azevém, rabo-de-gato, trigo, cevada, sorgo, milho, chicória, girassol-batateiro, túlipa, melão, cebola, alho, tomate, morango, maçã e pêra. Mais, este invento inclui a descendência das plantas transformadas que contenham o ADN estavelmente incorporado e transmissível de forma Mendeliana e/ou as sementes de tais plantas e tal descendência.

PARTE EXPERIMENTAL

Purificação de 1-SST

Tubérculos de Helianthus tuberosus "Colombia" foram utilizados para a extracção de 1-SST e 1-FFT. Os tubérculos foram colhidos em Agosto-Setembro, durante o -20- ΡΕ795018 período de crescimento rápido dos tubérculos e de acumulação massiva de frutanos. Os tubérculos foram lavados e congelados em azoto liquido. Quatrocentos gramas de tubérculos congelados (-80°C) foram pulverizados e imediatamente homogeneizados a partir dai num misturador Waring em 900 cm3 de tampão fosfato (P) 50 mol m~3, pH 6,5, contendo glicerol a 10% (p/v) , MgS04 1 mol m"3, Na2EDTA 1 mol m"3, PMSF 1 mol m~3 (Sigma, USA), DTT 1 mol m-3, PVPP 1,5% (w/v) e Na2S205 20 mol m"3. O homogenato foi filtrado através de três camadas de Miracloth e centrifugado a 17000 g durante 1 h. O extracto proteico foi mantido a 4°C e ajustado a uma saturação de 45% com (NH2)2S04. As proteínas insolúveis foram sedimentadas através de centrifugação (10000 g, 30 min) e descartadas. O sobrenadante a 45% foi levado até 70% de saturação através de mais adições de (NH4)2S04. O sedimento, obtido após um segundo passo de centrifugação, foi novamente dissolvido em 60 cm3 de tampão fosfato (P) 50 mol m“3, pH 6,5, DTT 1 mol m“3 e PMSF (Sigma, USA) 1 mol rrf3, e dessalinizado através de diálise contra tampão-P 10 mol m“3, pH 6,5, PMSF 1 mol m“3 e DTT 1 mol m“3, durante 16 h. Após substituição do tampão a diálise foi continuada durante mais 3 h. Todo o procedimento foi efectuado a temperaturas entre 0 e 4°C. O dialisado centrifugado (30000 g, 30 min) foi aplicado sobre uma coluna de Fluxo Rápido de Sepharose Q de 25x120 mm (4°C), que tinha sido pré-lavada com bis-Tris 10 mol m'3, pH 6,5, DTT 1 mol m“3, PMSF 1 mol m'3 e EDTA 5 mol m“3 em água Milli-Q. As proteínas ligadas -21 - ΡΕ795018 foram eluídas com um gradiente de NaCl (0-300 mol rrf3) no mesmo tampão a um caudal de 5 cm3 min'1. A 1-SST eluiu a NaCl 200-250 mol rrf3.

As fracções de Sepharose Q foram ajustadas a 400 mol m“3 com (NH2)2S04 sólido. Fracções de 20 cm3 foram carregadas numa coluna de 15><50 mm de Alta resolução de Fenil-Sepharose ou de Alta Substituição de Fenil-Sepharose, _ o que foram pre-equilibradas com tampão bis-Tris 10 mol m , pH 6,5, contendo (NH4)2S04 500 mol rrf3, DTT 1 mol rrf3, PMSF 1

mol rrf3, EDTA 2 mol rrf3 e CHAPS (tampão A) a 0,1% a 12°C. A eluição das proteínas ligadas foi realizada utilizando um gradiente linear de tampão A (100-0%) sem (NH4)2S04, contendo etilglicol a 25% (v/v), a um caudal de 1 cm3 min'1. A 1-SST eluiu a (NH4)2S04 100 mol m"3.

Fracções de Fenil-Sepharose até 10 cm3 foram injectadas numa coluna de Concanavalina A-Sepharose de 5*50 mm, pré-lavada em bis-Tris 20 mol m“3, pH 6,5, NaCl 250 mol rrf3, CaCl2 0,5 mol rrf3, MnCl2 0,5 mol m'3, DTT 1 mol rrf3 e PMSF 1 mol rrf3. A 1-SST ligada foi eluída com a-CH3-manopiranósido 500 mol rrf3 no mesmo tampão.

As fracções activas de uma corrida em Concana valina A foram reunidas e aplicadas numa coluna 5χ200 empacotada com hidroxilapatite esférica (15 ym) (Merck, Alemanha) . A coluna foi pré-equilibrada em CaCl2 2 mol rrf3, NaCl 10 mol rrf3, DTT 1 mol rrf3, PMSF 1 mol rrf3 e CHAPS (tampão A) a 0,1%. As proteínas ligadas à coluna foram -22- ΡΕ795018 eluídas com um gradiente em degraus de tampão A e tampão fosfato de potássio 500 mol m"3, pH 6,5, a um caudal de 0,5 ml min"1. A 1-SST eluiu a fosfato de potássio 75-100 molm“3.

As fracções activas de uma corrida em hidroxila-patite foram reunidas e aplicadas numa coluna Mono Q de 5x50 mm que foi pré-equilibrada com tampão-P 10 mol m“3, pH 6.5, DTT 1 mol m"3, EDTA 1 mol m"3 e CHAPS a 0,1%. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente de NaCl (0-500 mol m“3) a um caudal de 0,5 cm3 min"1. A 1-SST eluiu a NaCl 250 mol m”3.

Todas as colunas, empacotamentos de coluna e equipamento de cromatografia foram obtidos em Pharmacia (Suécia), a menos que indicado em contrário.

Purificação de 1-FFT

Foi obtido um extracto bruto de proteínas a partir de tubérculos de H. tuberosus tal como descrito para a purificação de 1-SST. O sobrenadante do extracto bruto de proteínas, tal como obtido após centrifugação foi ajustado a uma saturação de 45% com (NH^SCb e agitado durante 1 h. As proteínas insolúveis foram sedimentadas através de centrifugação a 10000 g durante 30 min. O sedimento foi novamente dissolvido em 60 cm3 de tampão-P 50 mol rrf3, pH 6.5, DTT 1 mol m"3 e PMSF 1 mol m"3, e dialisado de um dia para o outro contra tampão citrato/fosfato (C/P) 10 mol m~ 3, pH 4,5, contendo PMSF 1 mol m"3 e DTT 1 mol m“3. O conteúdo das tubagens de diálise foi reajustado para pH 6,5 -23- ΡΕ795018 com Na2HP04 0,2 M e as proteínas insolúveis foram removidas através de centrifugação a 30000 g durante 1 h. O sobrenadante foi carregado numa coluna de 25><120 mm de fluxo rápido de Sepharose Q (Pharmacia) pré-equilibrada com tampão-P 10 mol m'3, pH 6,5, DTT 1 mol rrf3 e PMSF 1 mol m'3 em água Milli-Q (Millipore B.V., Holanda). A coluna foi arrefecida para 4°C. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente positivo de NaCl a um caudal de 5 cm3 min’1. A 1-FFT eluiu a NaCl 200-250 mol m’3.

Foi adicionado (NH4)2S04 sólido às fracções de Sepharose Q para dar uma concentração final de 750 mol rrf3. As fracções de 5 cm3 foram carregadas numa coluna de 15x50 mm de Elevada Resolução de Fenil-Sepharose (Pharmacia) pré-equilibrada com tampão-P 10 mol m'3, pH 6,5, contendo (NH4)2S04 750 mol rrf3 e DTT 1 mol rrf3. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente negativo de (NH4)2S04, a um caudal de 1 cm3 min’1 a 12°C. A 1-FFT eluiu a (NH4)2S04 450-400 mol m’3.

As fracções de Fenil-Sepharose (até 4 cm3) foram injectadas numa coluna Hiload 16x600 mm Superdex 75 preparativa (Pharmacia) pré-lavada em tampão-P 10 mol rrf3, pH 6,5, e DTT 1 mol rrf3. As proteínas foram eluídas no mesmo tampão a um caudal de 0,5 cm3 min’1 a 20°C. A 1-FFT eluiu 95-105 min após a injecção.

Ensaios de 1-FFT e 1-SST A actividade de 1-FFT das fracções da coluna foi rotineiramente ensaiada a 35°C. Alíquotas de 25 mm3 foram -24- ΡΕ795018 misturadas com 25 mm3, 0,3 g de Neosugar P (Meiji Seika Kaisha, Ltd, Tokyo, Japão; Neosugar consiste em 1% de hexoses, 4% de sacarose, 42% de G-(F)2, 44% de G-(F)3 e 7% de G-(F)4) por cm3 de tampão-C/P 100 mol m'3, pH 6,5. Após 3 h, a reacção foi parada fervendo a mistura de incubação num banho-maria durante 5 min. Um ganho liquido de GF4 foi tomado como medida da actividade de 1-FFT.

Para a actividade de 1-SST, foram misturadas fracções de 15 mm3 da coluna com 15 mm3 de GF 500 mol m~3 em tampão-C/P 100 mol m“3, pH 5,0 e incubou-se durante 3 h a 35°C. A sintese de GF2 foi tomada como medida da actividade de 1-SST.

Análise de açúcares e frutanos

A sacarose e os oligofrutanos foram analisados através de RP-HPLC utilizando uma coluna Speri-5 RP 18 de 2,1x220 mm (Brownlee Labs, Santa Clara, USA). Foi utilizada água Milli-Q como eluente a um caudal de 0,3 cm3 min'1 a 37°C. A glicose e a frutose foram quantificadas numa coluna Shodex SC-1011 6,5χ300 mm (Millipore B.V., Waters Chroma-tography Division, Holanda) corrida a 85°C com água Milli-Q a 0,75 cm3 min'1. Os açúcares foram detectados com um detector do índice de refracção 2142 (RID, Pharmacia) . A identificação dos oligofrutanos foi feita através da comparação dos seus tempos de retenção com os dos oligofrutanos purificados a partir de Neosugar P ou de H. tuberosus e através das razões glicose/frutose de cada oligofrutano (Koops e Jonker, 1994). -25- ΡΕ795018

As análises de HPAEC dos oligofrutanos e frutanos com um grau mais elevado de polimerização foram efectuadas num cromatógrafo iónico Dionex Series 4000 equipado com uma coluna de permuta aniónica CarboPac PAI de 250><4 mm e uma coluna de guarda CarboPac PA de 25x3 mm. Os frutanos foram separados com um gradiente linear de 60 min de 0,25 a 0,4 mol m“3 de NaAc em NaOH 0,1 mol rrf3 a um caudal de 1 ml min“ 3. A detecção foi feita através de amperometria pulsada (PAD) com um eléctrodo de ouro. O potencial aplicado de um pulso foi mantido a 0,1, 0,6 e -0,6 V durante 0,5, 0,1 e 0,05 segundos, respectivamente. A ramnose foi utilizada como padrão interno. Os frutanos foram identificados através de comparação dos seus tempos de retenção com os dos padrões de frutanos isolados e purificados a partir de H. tuberosus de acordo com o método de Heinze e Praznik (1991).

Sequenciação dos aminoácidos de 1-SST e 1-FFT

As fracções de Mono Q de 1-SST ou as fracções de Superdex 75 de 1-FFT foram dessalinizadas e concentradas através de centrifugação em dispositivos de ultrafiltração Centricon-10 (2 cm3) (Grace B.V., Amicon division, Holanda) e subsequentemente recolhidas através de precipitação em acetona aquosa a 80% (v/v) a -20°C. 1-SST e 1-FFT (50 yg de cada) foram dissolvidas em tampão SDS (Laemmli, 1970) e separadas num ExcelGel SDS pré-polimerizado, gradiente 8-18. As proteínas foram coradas com Azul Brilhante de Coomassie de acordo com Rosenfeld et al. (1992). A 1-SST -26- ΡΕ795018 corada (2 bandas; devido à sua instabilidade intrínseca a 1-SST é clivada através do tratamento com SDS) e as bandas de 1-FFT foram excisadas com um bisturi e lavadas, secas e parcialmente re-hidratadas de acordo com o procedimento de Rosenfeld et ai. (1992). Foi adicionada tripsina com qualidade para sequenciação (0,5 yg; Boehringer, Alemanha) à fatia de gel e a digestão no gel das proteínas foi realizada durante 4 h a 30°C. Os péptidos resultantes foram recuperados através de duas extracções de 20 minutos cada, com 50 μΐ de acetonitrilo, água, ácido trifluoroacético e Tween 20 (60:40:0,001:0,0002, v/v). A mistura peptídica resultante foi separada através de RP-HPLC preparativa numa coluna SuperPac Pep-S de 9,3χ250 mm (Pharmacia) eluída com um gradiente linear de TFA a 0,1% em acetonitrilo aquoso a 0 a 60% a um caudal de 4 ml min"1. As fracções peptídicas individuais foram colhidas manualmente e armazenadas a -80°C. As sequências de aminoácidos dos péptidos seleccio-nados foram determinadas através de degradação de Edman, utilizando um sequenciador de pulsos líquidos modelo 477A, ligado em linha a uma unidade de RP-HPLC modelo 120A (Applied Biosystems). As sequências de aminoácidos específicas para 1-SST ou FTT foram traduzidas nas sequências de ADN degeneradas correspondentes (Exemplo 1, Tabela 1), que, por sua vez, foram utilizadas como iniciadores para PCR.

Metodologia de ADN O isolamento de ADN e ARN, a subclonagem, a análise de restrição e a sequenciação foram efectuados uti- -27- ΡΕ795018 lizando métodos padrão descritos em manuais de biologia molecular (Sambrook et al. 1989; Ausubel et al. 1994). Síntese de ADNc ARN poli(A)+ foi isolado a partir de tubérculos de H. tuberosus "Colombia". 0 ADNc de cadeia simples foi sintetizado através de transcritase reversa a partir de 10 yg de ARN poli (A)+ iniciando o ARN poli (A)+ com o seguinte iniciador especifico da cauda: 5'-CCGAATTCAATACGACTCACTATAGCG(T) i5-3' .

PCR

Os oligonucleótidos degenerados específicos para 1-SST ou 1-FFT e o iniciador específico da cauda, 5'-CCGAATTCAATACGACTCACTATAGCG-3' foram utilizados para amplificação do ADNc de cadeia simples. A PCR foi efectuada em 50 yl de tampão de PCR (Life Technologies), contendo 100 pmol de ADNc molde, 100 pmol do iniciador específico da cauda e 100 pmol dos iniciadores específicos para 1-SST ou 1-FFT. A amplificação envolveu 30 ciclos de desnaturação (1 min, 92°C) , ligação (1 min, 42°C) e amplificação (1 min, 72°C). Os fragmentos resultantes foram sujeitos a electro-forese em agarose a 0,7%, excisados do gel, isolados da matriz de agarose e subclonados no vector pMOSBlue (Amersham). Os fragmentos específicos de 1-SST e 1-FFT gerados através de PCR foram utilizados para pesquisar uma biblioteca de ADNc Uni-ZAP XR. -28- ΡΕ795018

Construção e pesquisa de uma biblioteca de ADNc 10 yg de ARN poli (A)+ isolado a partir de tubérculos de H. tuberosus "Colombia" foram utilizados como material de partida para a construção de uma biblioteca de ADNc Uni-ZAP XR (Stratagene). A construção, plaqueamento e pesquisa da biblioteca foram efectuados de acordo com os protocolos desenvolvidos por Stratagene (La Jolla, Califórnia, cat. n° 237211). As sondas de ADN marcadas com 32P especificas para 1-SST ou 1-FFT foram preparadas através de iniciação com oligonucleótidos aleatórios para pesquisar cerca de 100000 placas. A hibridação e lavagem da membrana Hybond-N foram efectuadas sob condições de elevado rigor (hibridação a 65°C, passo final de lavagem com SSC 0,1χ, SDS a 0,1%, 65°C). Os clones positivos foram purificados, os fagomídeos pBluescript excisados do vector Uni-ZAP utilizando o sistema Exassist/Solr (Stratagene) e as inserções analisadas através de análise com enzimas de restrição, hibridação e sequenciação.

Análise das plantas transgénicas

Análise de açúcares e frutanos 50 mg de tecido foliar foi congelado em N2 liquido e homogeneizado em 0,1 cm3 de água Milli-Q num tubo Eppendorf. O homogenato foi aquecido a 90°C durante 5 min, depois centrifugado a 14000 g durante 10 min. O sobrena- -29- ΡΕ795018 dante transparente foi analisado através de TLC: 2 μΐ do sobrenadante foram colocados numa placa de silica-gel G 1500 (Schleicher & Schuell). As placas TLC foram reveladas duas vezes com acetona, água (9:1, v/v), ou butan-l-ol, propan-2-ol e água (3:12:4, v/v). Os hidratos de carbono foram visualizados através de vaporização das placas TLC com ureia-ácido fosfórico (Wise et al., 1955).

Ensaio de 1-FFT

Tecido foliar (50 mg) foi congelado em N2 líquido e homogeneizado num tubo Eppendorf em 0,1 cm3 de tampão fosfato (P) 25 mol rrf3, pH 6,5, contendo, MgS04 2 mol m“3, Na2EDTA 2 mol m"3, PMSF 2 mol m"3 (Sigma, USA) , DTT 2 mol rrf 3, PVPP solúvel a 1,5% (p/v) (Merck) e Na2S20s 20 mol m~3. O homogenato foi centrifugado a 14000 g durante 10 min a 4°C. O sobrenadante transparente foi utilizado para o ensaio de 1-FFT. Foram misturados 50 μΐ do sobrenadante com 50 μΐ de uma mistura de ensaio, contendo G-(F)3 2 mol m“3, G-(F)4 80 mol rrf3, tampão citrato/fosfato 50 mol m“3, pH 5,5 e NaN3 0,02% (p/v). A mistura de ensaio foi incubada no escuro a 28°C. Foram tomadas amostras de 15 μΐ após 4, 20, 44 e 68 h de incubação e analisadas através de TLC.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Purificação da sacarose:sacarose-frutosil-transferase (1-SST) e da frutano-frutosiltransferase (1-FFT), e isolamento dos ADNcs codificando 1-SST e 1-FFT -30- ΡΕ795018 A 1-SST e a 1-FFT foram purificadas a partir de tubérculos de Helianthus tuberosus utilizando técnicas de precipitação, vários procedimentos sucessivos de cromato-grafia e electroforese. As fracções com actividade de 1-SST, que eluiram da coluna Mono Q deram uma banda após PAGE nativo. A 1-SST é clivada por SDS, portanto a análise através de SDS-PAGE produziu duas bandas de 27 e 55 kDa (Fig. 1, pista 2). As fracções com actividade de 1-FFT que eluiram da coluna de permeação em gel Superdex 75 deram em SDS-PAGE uma banda com um peso molecular estimado de 70 kDa (Fig. 1, pista 3) . A 1-SST sozinha foi capaz de sintetizar oligofrutanos a partir de sacarose como único substrato (Fig. 3A, 80 h de incubação). Através da recombinação de 1-SST purificada com 1-FFT purificada, a sacarose pôde ser convertida em frutanos com um grau de polimerização de pelo menos 15 [G-(F)i4, Fig. 3B, 80 h de incubação].

Para a sequenciação de aminoácidos através do método de degradação de Edman (fenilisotiocianato), as bandas proteicas de 27 kDa (1-SST), 55 kDa (1-SST) e 70 kDa (1-FFT) foram excisadas do gel de SDS-PAGE e sujeitas a digestão proteolitica através de tripsina. As misturas peptidicas resultantes foram separadas através de RP-HPLC em corridas separadas (Figs. 2A-C). Os péptidos que eluiram após 26 min e 37 min (ambos do fragmento de 25 kDa de 1-SST, Fig. 2A), 27 min, 34 min e 37 min (do fragmento de 55 kDa de 1-SST, Fig. 2B), 28 min e 32 min (de 1-FFT, Fig. 2C, a fracção que eluiu a 32 min continha os péptidos 7 e 8) foram recolhidos manualmente e sujeitos a sequenciação dos aminoácidos N-terminais (Tabela 1). -31 - ΡΕ795018

Tabela 1. Sequências de aminoácidos de péptidos seleccionados obtidos após digestão com tripsina de 1-SST (polipéptidos de 25 e 55 kDa) e 1-FFT, e separação das misturas peptídicas resultantes através de RP-HPLC.

Proteína Sequência de aminoácidos Sequência de ADN do iniciador de PCR 1 1-SST 0,25 kDa ADVLF? 7TTSEGSVAR 2 idem EQLPVYFYIAK 5'- GARCARYTNCCNGTNTAYTTYTAYATH GCNAAR-3' 3 1-SST 0,55 kDa VVLDLETK 4 idem FRDPSTLWL7PDGEY 5 idem GWANIL 6 1-FFT GWATVYNVGR 5'-GGNTGGGCNACNGTNTAYAAY-3' 7 idem LLVDHSIVEGFAQGGR 5'-ATHGTNGARGGNTTYGCNCAR-3 6 idem VGESDS

As sequências de aminoácidos 2 (1-SST, 25 kDa), 6 e 7 (1-FFT) foram utilizadas para desenhar iniciadores de ADN específicos para 1-SST ou 1-FFT que foram utilizados para PCR. A PCR que utilizou os iniciadores 2, 6 ou 7 produziu ADN de cerca de 450, 800 pb e 300 pb, respecti-vamente. PCR interna ("nested"), utilizando o oligonucleó-tido 7 como iniciador específico e o fragmento de PCR de 800 pb como molde, produziu novamente o fragmento de PCR de 300 pb o que indicou que o fragmento de 300 pb está incluído no fragmento de 800 pb. -32- ΡΕ795018

Uma biblioteca de ADNc Uni-ZAP construída a partir de tubérculos de H. tuberosus foi pesquisada com o fragmento de 450 pb de 1-SST ou o fragmento de 800 pb de 1-FFT. A pesquisa de cerca de 100000 clones de ADNc produziu cerca de 20 clones positivos que hibridaram com o fragmento de 450 pb e 5 clones que hibridaram com o fragmento de 800 pb. O ADN dos clones que hibridaram com o fragmento de 450 pb não hibridou com o fragmento de 800 pb e vice-versa. Os clones positivos foram purificados, os fagomídeos pBlue-script excisados do vector uni-ZAP e a inserção caracte-rizada através de análise com enzimas de restrição, hibri-dação e sequenciação.

As sequências de ADN de 1-SST e 1-FFT e suas sequências de aminoácidos correspondentes são apresentadas na Fig. 4A e Fig. 4B, respectivamente. A Sequência ID NO: 1, codificando 1-SST, tem um enquadramento de leitura aberto de 1800 pares de bases e codifica uma proteína de 630 resíduos de aminoácidos. Ao nível do ADN, a 1-SST mostra uma identidade de 68% com o ADNc da β-frutofurano-sidase ácida solúvel (= invertase ácida) de cenoura (Daucus carota). Ao nível dos aminoácidos, a 1-SST apresenta uma semelhança de 66% com a β-frutofuranosidase ácida solúvel de cenoura. A Sequência ID NO: 2, codificando 1-FFT, possui um enquadramento de leitura aberto de 1845 pares de bases e codifica uma proteína de 615 aminoácidos e um peso molecular de cerca de 69 kDa. Isto corresponde ao peso -33- ΡΕ795018 molecular da proteína 1-FFT purificada tal como estabelecido através de SDS-PAGE (Koops e Jonker, 1994) . Ao nível do ADN, a 1-FFT apresenta uma identidade de 65% com o ADNc da β-frutofuranosidase ácida solúvel (= invertase ácida) de cenoura. Ao nível dos aminoácidos, a 1-FFT apresenta uma semelhança de 60% com a β-frutofuranosidase ácida solúvel de cenoura.

Embora a 1-SST e a 1-FFT tenham um grau relativamente elevado de homologia com a invertase ácida mostrou-se que a 1-SST ou a 1-FFT e a invertase são enzimas distintamente diferentes. Mostrou-se que a 1-SST e a 1-FFT são incapazes de catalisar a hidrólise da sacarose (actividade de invertase). A actividade hidrolítica da 1-SST e 1-FFT purificadas contra a sacarose foi testada num intervalo de pH e de concentrações de sacarose. Não houve actividade de invertase significativa sob nenhuma destas condições (Koops e Jonker, 1994). Não foi observada qualquer homologia superior a 68% entre a sequência de ADN codificando 1-SST e qualquer sequência de ADN conhecida nas bases de dados de sequências nucleotídicas PDB, GENBANK, actualizações de GENBANK, EMBL e actualizações de EMBL. Não se observou uma homologia superior a 65% para a sequência de ADN codificando 1-FFT com qualquer sequência de ADN conhecida nas bases de dados de sequências nucleotídicas PDB, GENBANK, actualizações de GENBANK, EMBL e actualizações de EMBL. -34- ΡΕ795018

Exemplo 2. Construção de um gene sst quimérico 0 clone de ADNc de sst inteiro, designado pSST 103, foi utilizado para a introdução de um local Ncol no ATG (posição 34), e um local EcoRV a jusante do codão stop (na posição 1924) utilizando PCR. Do plasmideo pMOG18 (Pen et al., 1992) que contém o promotor CaMV35S estimulado, a sequência lider ALMV, o gene uidA e a sequência terminadora nos, a sequência de codificação de uidA foi substituída pelo ADNc de sst. pMOG18 foi digerido com BamRI, preenchido com ADN-polimerase Klenow, e digerido com Ncol. O fragmento de PCR de sst, cortado com Ncol e HcoRI, foi ligado neste vector, resultando no clone pSST217. O fragmento EcoRI/Hindll de pSST217 contendo a construção quimérica completa (enh.35S+ALMV-sst-nos) foi clonado no local NcoRI e HindiII de pBINPLUS (Van Engelen et al., 1995), um vector binário de transformação de plantas derivado de pBINl9 (Bevan, 1984) resultando no plasmideo pVSl (Fig. 5A).

Exemplo 3. Construção de um gene fft quimérico O clone de ADNc de fft inteiro, designado pFFT 111, foi utilizado para a introdução de um local Ncol no ATG (posição 29) e um local BamRl a jusante do codão stop (na posição 1874) utilizando PCR. Do plasmideo pMOG18 (Pen et al., 1992) que contém o promotor CaMV35S estimulado, a sequência líder ALMV, o gene uidA e a sequência terminadora nos, a sequência de codificação de uidA foi substituída pelo ADNc de fft. O fragmento de PCR digerido com Ncol e -35- ΡΕ795018

BamEI foi ligado no vector pM0Gl8 digerido com Nco I e BamEI, resultando no clone pFFT209. 0 fragmento HíndIII/EcoRI de pFFT209 contendo a construção quimérica completa (enh.35S+ALMV-fft-nos) foi clonado no local HíndIII e BcoRI de pBINPLUS (Van Engelen et al., 1995), um vector binário de transformação de plantas derivado de pBIN19 (Bevan, 1984) resultando no plasmideo pVFl (Fig. 5B) .

Exemplo 4. Transformação de plantas de Petúnia e batata

Os vectores binários pVSl e pVFl (Fig. 5) foram conjugados a partir de E. coli XLl-Blue com a estirpe AGLO de Agrobacterium tumefaciens através de cruzamento triparental (Ditta et al., 1980). Os exconjugados foram utilizados para transformar discos foliares de Petunia hybrida tal como descrito por Horsch et al., 1985. Os discos foliares foram preparados a partir de folhas do topo de plantas jovens que não floriam. A variedade W115 de P. hybrida foi utilizada para as experiências de transformação. Os exconjugados foram também utilizados para transformar explantes do caule de batateiros diplóides (Solanum tuberosum, variedade Kardal) tal como descrito anteriormente (Visser, 1991) . Após regeneração de rebentos e raizes em meio contendo canamicina, as plantas foram colocadas em solo e transferidas para a estufa. Plantas regeneradas (em meio sem canamicina) a partir de discos foliares e de explantes do caule tratados com a estirpe AGLO de Agrobacterium sem um vector binário serviram como controlo. -36- ΡΕ795018

Exemplo 5. Análise de plantas transgénicas expressando os genes sst e fft

Foram geradas cerca de 25 plantas transgénicas de Petunia e 25 batateiros transgénicos ancorando a construção pVSl e 25 Petunia e batateiros transgénicos ancrando a construção pVFl. Dez Petunia e dez batateiros foram transformados com a estirpe AGLO de Agrobacterium sem um vector binário. Estas plantas foram utilizadas como controlo. A análise de "Southern blot" do ADN genómico isolado a partir das plantas transformadas mostrou que em média eram integradas 1-5 cópias dos genes quiméricos introduzidos (dados não mostrados) . A composição em hidratos de carbono das plantas transgénicas foi analisada através de duas técnicas essencialmente diferentes: cromatografia de camada fina (TLC), que separa os hidratos de carbono com base na partição liquido-liquido (após TLC, os frutanos foram detectados através de uma reacção colorida especifica da frutose) e HPAEC, que separa os hidratos de carbono em condições alcalinas (pH 13) com base na carga e detecta hidratos de carbono através de oxidação com um eléctrodo de ouro. A análise dos extractos de folhas do batateiro e de Petunia ancorando a construção pVSl mostrou que ambas as espécies de plantas transgénicas contêm produtos que são o resultado da actividade de SST. A TLC mostrou a presença de pelo menos um trissacárido G—(F)2 e de preferência também o -37- ΡΕ795018 tetrassacárido G-(F)3 e o pentassacárido G-(F)4 em extrac-tos de folhas de batateiro, enquanto que estes oligofru-tanos estavam ausentes nas plantas de controlo (Fig. 6). A presença de G-(F)2 e G-(F)3 nos extractos de folhas de batateiro mas também de plantas de P. hybrida transgénicas foi demonstrada através de análise HPAE (Figs. 7 e 8). HPAEC, que é mais sensível e mais específica que TLC, revelou também uma pequena quantidade de G-(F)4 em batateiros transgénicos (Fig. 8). Os resultados das Figs. 6-8 indicam claramente que o gene sst é expresso numa proteína SST enzimaticamente activa tanto em p. hybrida como em batateiro.

As plantas transgénicas ancorando a construção pVFl não continham frutanos porque a FFT necessita de oligofrutanos (como G-(F)2 ou G-(F)3) como substratos iniciais para a síntese de frutanos. Os oligofrutanos não estão presentes em plantas sem actividade de SST tais como o batateiro ou a Petunia de tipo selvagem, ou plantas transgénicas contendo apenas a construção pVFl. A presença de actividade de FFT em plantas transgénicas ancorando a construção pVFl é portanto verificada através de medições da actividade de FFT. 0 ensaio de FFT utilizado para avaliar a presença de uma FFT activa em batateiro trans-génico foi baseado na capacidade da FFT para catalisar a síntese de G-(F)n, n>4, à custa de G-(F)4. 0 extracto proteico de folhas total de batateiro ancorando a construção pVFl, foi misturado com uma mistura de ensaio contendo G-(F)4 e a presença de frutanos com um maior grau -38- ΡΕ795018 de polimerização (G-(F)n, n>4) foi examinada através de TLC. Logo após 4 h de incubação, pôde-se detectar G-(F)5 e G-(F)6. Após 44 h de incubação, podiam ser detectados frutanos com um grau de polimerização superior a 4, incluindo G-(F)4, G-(F)5, G-(F)6, G-(F)7 e G-(F)8, enquanto que estes frutanos estavam ausentes das misturas de controlo (Fig. 9) . Isto indica que também o gene fft é expresso numa proteína FFT enzimaticamente activa.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Fig. 1. Análise das fracções de Mono Q da purificação de 1-SST e das fracções de Superdex HR 75 da purificação de 1-FFT em SDS-PAGE. Pista 1, marcador do Peso Molecular (PM é dado em kDa) ; pista 2, fracção de Mono Q com actividade de 1-SST; pista 3, fracções de Superdex HR 75 com actividade de 1-FFT.

Fig. 2. Separações em RP-HPLC de digeridos trípticos de: a. o polipéptido de 25 kDa de 1-SST (A); b. o polipéptido de 55 kDa de 1-SST (B); c. o polipéptido de 1-FFT de 70 kDa (C). As fracções de péptidos que eluem livres indicadas com setas foram colhidas manualmente e sujeitas a sequenciação de aminoácidos.

Fig. 3. Separações em HPAEC de oligofrutanos sintetizados a partir de sacarose através de 1-SST purificada (A) e através de uma mistura de 1-SST purificada e 1-FFT purificada (B) . As reacções foram efectuadas em -39- ΡΕ795018 sacarose 100 mol m~3, DTT 2 mol rrf3, tampão citrato/fosfato 10 mol m"3, pH 5,0, Na-azida a 0,01% a 25°C. O tempo da reacção foi de 80 h. A reacçào foi parada fervendo a mistura reaccional durante 5 min. A ramnose foi utilizada como padrão interno.

Fig. 4. Sequência nucleotidica e sequência de aminoácidos deduzida do ADNc isolado de 1-SST (A) e 1-FFT (B) . A sequência de aminoácidos determinada através de sequenciação dos aminoácidos (ver também Tabela 1) das proteinas 1-SST e 1-FFT purificadas está sublinhada.

Fig. 5. Construções génicas pVSl (A) e pVFl (B) .

As construções quiméricas consistem no promotor CaMV35S estimulado com o estimulador da tradução ALMV (X), a sequência de codificação de sst (Y) ou fft (W) , e o sinal de terminação nos (Z) . Os locais de restrição que foram utilizados no procedimento de clonagem estão indicados.

Fig. 6. Análise de TLC dos frutanos em batateiros transgénicos ancorando a construção pSFl. As placas de TLC foram reveladas duas vezes em acetona aquosa a 90%. S = padrão de sacarose, G = padrão de glicose, F = padrão de frutose, H = mistura padrão de frutanos de tubérculos de H. tuberosus, N = padrão de Neosugar, K = G-(F) 2-padrão. Os Nos 1-6 representam batateiros individuais ancorando a construção pVSl. C é a planta de controlo ancorando a construção AGL0. -40- ΡΕ795018

Fig. 7. Separações em HPAEC de hidratos de carbono extraídos a partir de folhas de Petunia hybrída ancorando a construção pVSl (a), uma mistura padrão de frutanos extraída de tubérculos de H. tuberosus (b), e hidratos de carbono de folhas da Petúnia de controlo ancorando a construção AGLO (c) .

Fig. 8. Separações em HPAEC dos hidratos de carbono extraídos de folhas de batateiro (Solanum tuberosum) ancorando a construção pVSl (a), uma mistura padrão de frutanos extraída de tubérculos de H. tuberosus (b) e hidratos de carbono de folhas do batateiro de controlo ancorando a construção AGLO (c) .

Fig. 9. Análise de TLC de frutanos sintetizados a partir de G-(F)4 através de extractos proteicos de folhas de batateiros transgénicos ancorando a construção pVFl. As placas de TLC foram reveladas duas vezes em butan-l-ol, propan-2-ol e água (3:12:4, v/v). S = padrão de sacarose; N = padrão de Neosugar, H = mistura padrão de frutanos de tubérculos de H. tuberosus. Os Nos 1-8 representam diferentes batateiros individuais transgénicos ancorando a construção pVFl. Ci e C2 são as plantas de controlo ancorando a construção AGLO.

DEFINIÇÕES E ABREVIATURAS A nomenclatura dos frutanos está de acordo com Lewis (1993) . -41 - ΡΕ795018

Unidade frutosil: uma molécula de frutose ligada a outra molécula de açúcar (p. ex., glicose, frutose ou galactose) . Abreviada como -F (p. ex., em G-F) ou -F- (p. ex., G-F-F) . Para moléculas consistindo em mais de uma unidade frutosil (p. ex., G-F-F-F-F-F-F) é utilizada uma designação condensada [G— (F)6] ou GF6. G— (F)e consiste numa unidade glicosil e 6 unidades frutosil. G-(F)6 consiste numa ligação frutosil-glicose e 5 ligações frutosil-frutose.

Oligofrutanos: Qualquer composto com uma, duas ou três ligações frutosil-frutose (pode estar presente uma glicose mas não é necessário). No presente pedido, o termo oligofrutanos foi utilizado para denominar os produtos de actividade de SST [G— (F)2, G-(F)3 e G—(F)4] . Os oligofrutanos são mais vulgarmente denominados como frutanos de cadeia curta ou frutanos com um baixo grau de polime-rização. No presente pedido os oligofrutanos incluem também compostos consistindo em 2, 3 ou 4 unidades frutosil, mas sem a unidade glicosil.

Frutanos: Qualquer composto no qual uma ou mais ligações frutosil-frutose constituem a maioria das ligações (uma glicose pode estar presente mas não é necessário). Frutano é utilizado como sujeito numerativo em que os materiais referidos são quimicamente distintos (p. ex., os frutanos G-(F)2 e G-(F)i3). no presente pedido, os frutanos são definidos como produtos de actividade de FFT (G-Fn, 2^n<±60). A menos que indicado de outro modo, os frutanos -42- ΡΕ795018 incluem também oligofrutanos. Para denominar um grupo restrito de frutanos é utilizada a denominação "G-Fn, n=.". No presente pedido os frutanos incluem também compostos consistindo em mais de 1 unidade frutosil, mas sem a unidade glicosil.

Inulina: Frutano que tem maioritariamente a ligação β-2,1-frutosil-frutose (pode estar presente uma glicose, mas não é necessário). A utilização cumulativa vs. numerativa como substantivo é a mesma que para o frutano acima.

Levano: Frutano que tem maioritariamente a ligação β-2,1-frutosil-frutose (é permitida uma glicose, mas não é necessário) . 0 levano é também utilizado para denominar os frutanos de origem bacteriana, embora os frutanos bacterianos não consistam sempre em ligações predominantemente β-2,6-frutosil-frutose. Por exemplo, os frutanos sintetizados através de levanossacarase de Bacillus subtilus têm predominantemente ligações β-2,1-frutosil-frutose (inulina). A utilização cumulativa vs. numerativa de levano como substantivo é a mesma que para frutano.

Levanossacarase: Enzimas de origem bacteriana que estão envolvidas na síntese de frutano.

Sacarose:sacarose-frutosiltransferase (SST):

Enzima derivada de plantas que catalisa o passo inicial da -43- ΡΕ795018 síntese de frutanos (reacçâo 2). A enzima pode também estar envolvida na sintese de oligofrutanos [G-(F)n, 2^n^4] (reacçâo 3) . No presente pedido, a designação SST pode incluir 1-SST, uma forma de SST envolvida na biossintese de oligofrutanos que possuem maioritariamente a ligação β-2,1-frutosil-frutose; ou 6-SST, uma forma de SST envolvida na biossintese de oligofrutanos que têm maioritariamente a ligação β-2,6-frutosil-frutose; ou 1-SST e 6-SST.

Frutano:frutano-frutosiltransferase (FFT): Enzima derivada de plantas envolvida na sintese de frutanos. Enzima capaz de catalisar a sintese de oligofrutanos e frutanos de um grau mais elevado de polimerização. A FFT de H. tuberosus tem actividade sobreponivel com a de SST de H. tuberosus (reacçâo 3), mas não pode catalisar o passo inicial da sintese de frutanos (reacçâo 2) . No presente pedido, a designação FFT pode incluir 1-FFT, uma forma de FFT envolvida na biossintese dos oligofrutanos que tem maioritariamente a ligação β-2,1-frutosil-frutose; ou 6-FFT, uma forma de FFT envolvida na biossintese de frutanos que tem maioritariamente a ligação β-2,6-frutosil-frutose; ou 1-FFT e 6-FFT.

Invertase: β-frutosidase ou β-frutofuranosidase.

Grau de polimerização (GP): termo para indicar a quantidade total de residuos frutosil e glicosil; por exemplo, G-(F)2 tem um GP de 3. 0 valor de n em G-Fn aumenta com um grau crescente de polimerização. -44- ΡΕ795018

Perfil de frutanos: termo para descrever o padrão do tamanho/distribuição dos frutanos ou, alternativamente, as quantidades relativas e os tipos de frutanos, num extracto derivado por exemplo de uma planta, de um órgão vegetal ou de uma célula vegetal. 0 método actualmente de maior confiança para analisar um padrão de frutanos de um extracto é através da cromatografia de permuta aniónica de alta resolução e a detecção amperométrica pulsada (Chatterton et al., 1990).

Helianthus tuberosus: girassol-batateiro.

Cichorium intybus: chicória. HPLC: Cromatografia Liquida de Alta Resolução. Técnica para a separação de misturas complexas de compostos. As variantes desta técnica são a cromatografia de alta resolução de fase reversa (RP-HPLC) ou a cromatografia de permuta aniónica de alta resolução em combinação com a detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD, ver por exemplo Fig. 3) .

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LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: Dr. Andries Jurriaan Koops (B) RUA: Droevendaalsesteeg 1 (C) CIDADE: Wageningen -50- ΡΕ795018 (E) PAIS: The Netherlands (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6708 PB (G) TELEFONE: 0317 477055 (H) TELECÓPIA: 0317 418094 (A) NOME: Dr. Ingrid Maria van der Meer (B) RUA: Droevendaalsesteeg 1 (C) CIDADE: Wageningen (E) PAÍS: The Netherlands (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6708 PB (G) TELEFONE: 0317 477142 (H) TELECÓPIA: 0317 418094 (A) NOME: Dr. Arjen Johannus van Tunen (B) RUA: Droevendaalsesteeg 1 (C) CIDADE: Wageningen (E) PAÍS: The Netherlands (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6708 PB (G) TELEFONE: 0317 477058 (H) TELECÓPIA: 0317 418094 (ii) TÍTULO DO INVENTO: Sequências de ADN codificando enzimas que sintetizam polímeros de hidratos de carbono e método para a produção de plantas transgénicas (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 16 (iv) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete -51 - ΡΕ795018

(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SUPORTE LÓGICO: Patent In Release #1. Versão #1.30 (EPO) (v) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: PCT/NL96/00012 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2116 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helianthus tuberosus (B) ESTIRPE: Columbia (D) ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Adulto (F) TIPO DE TECIDO: Tubérculo (G) TIPO CELULAR: parênquima de armazenamento -52- ΡΕ795018 (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, USA) (B) CLONE: pSST103 (ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 34..1923 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 89/12386 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21-UUN-1989 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 28-DEZ-1989 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 1 : DE 1 A 4100 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/04692 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09-AGO-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 03-MAR-1994 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 1: DE 1 A 1438 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/14970 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-DEZ-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 07-JUL-1994 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: -53- ΡΕ795018 GSCÁCCÀGAA AAMCCCTCC eTCAGSCCAC CfcC ATC ATS SCT TCA TC6 ACC ÁCC 54 M*fc Hat Ala §er sa* Thr ®tw 1 5 ACC ACC CCT CfC ATT CTC CAT GAf GAC CCT SM AAC CTC CCA. GAÃ CTC 101 The The Prô Leu IX® Leu His Asp ABp Pr o Giu. Aso Las Pr a Giu Leo 10 15 29 ÁCC CCT TCT CCS ACÃ ÃCT CS® CGT cm TCC ATC SCA AM STS CTT TOS ISO TA* GXy Ser Pro The Thr Arg Arg L8« Ser 11 e Ala Lyss Vai Leu §er 25 30 35 em ATC CTT GTT TCG GTT CTS GTT ATA sst CCT CTT GTT GCT TT.A ATC 19 S <*ΐ c, *SÍrY 40 lie 1)¾¾. Vai Ser Vai .La» Vai lie ely Áia Leu vai Ale Leu Ile 48 50 55 AAC AAC CM ÁCA TAT «AÁ TCC ccc mi ecc ACC ACA TTC SCA ACT CÃS 246 Asn Aso Gin The fyt «li! Ser Pr© Ser Ais Thr Tbr phe Vai Thr Gin 60 65 7C TTG CCÃ ÁÀT ATT GÃX €TS MS CS® STT CCA CSA m m ®AT TQQ MT a 94 Uu Pro Asa ile À?F Leu Lye Arg vai Pre «ly Lys Leu Asp Ser ser 75 90 ss GCT SÁS GTT GAA TSG CM CGA TCC ACT TAT CAT TTT CAA ccc GAC AAA 342 Ma clu Vai alu Ttrp GJr. Arg Ser Thr Tyr Mis Phe Gin Pró Asp Lys 90 95 109 AAT TTC ATT AGC GAT CCT GAT esc CCA ATS TAT CÂC ATS SGA TGG TAT 300 Asn Phe n« Ger Aep :Pro Asp Sly Pr© tísfc Tyr Mia «et Sly Trp Ty* 105 110 115 CAT CTA TTT T&T ChQ TAC AAC CCT CÃA TCT GCC ATC TGS esc AAC ATC 438 Bis Leu PM Tyr Gin Tyr ÁSO ?ré Gin Ser Ale Ile Trp Gly Asn Ue ue 125 130 135 ASA T®3· SCO CAC TCG GVft TCS &AA GAC ATS ATC AAC TGS TTC CAT CTC 4§β tiu: Trp eiy His Ser Vai Ser Lys Asp Mfifc lis AStt Trp Fhe Mis Lsti 140 14 â 150 CCT TTC GGC ATS GTT CCT CAC CAT TGG TAC GAC ATC GM SGT «TC ATC 534 Pr o pbâ Ala «et Vãl Pr o Asp Mias Trp Tyr Asp ns Glu sly vai Set ASS ISO 165 AOS «ST TCC- GCT AÇA GVC ÇTC CCT MT «ST CÂA ATC ATC ATS cw TÃC 582 Thr siy 8e* Ala Thr Vai leu Pro A»n siy Gin n« Ile Kftt Leu T>rr *70 175 ISO TCG ssc MC aos TAT £*AT CTC TCC CM 6TÃ CAA tgc TTC GCG TAC CCT 63-0 Ser Gly Aen Ala Tyr Asp Leu Ser Gin Vai Gin Cys Leu Ala Tyr AI a ISS ISO 195 GTC AAC TC® TCS «AT CCA CTT CTT ÁTA GAS fès AM AAA TAT SAA· GCT 67 S Vai Asrs ser a«r Asp Pra Leu Leu n« sla Trp Lys Lys Ty^ Glu Gly 300 205 210 215 -54- ΡΕ795018

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Ala 11a Oiy Ser Tyr Aap Ile Vai Aso Asp Lys Trp Tyr Pro Asp Asp 330 335 340 CCS GAA MT «AT ©TO ©ST ATO GOA TTA ASA TAT QAT TTí GOA AAA TW Pro Slu Asa Asp Vai Oiy Ife oiy Leu Aref Tyr Asp Phe cly iys Pfte 345 350 355 TAT GCS TCC M© AC© ΤΪΤ TAT GAC CM CAT MC AAS AS© ASA ©TC CTT Tyr Ala ser Lys Thr pte Tyr Asp Gin Hie Lys Lys Arg Aíxí v*d leu 3S0 365 370 ' 37.5 TOO 00C TAT GTO SOA GAA ACC GAT CCS CAA AAG TAT «AC CTT TC AAC Trp oiy tyr 3Tai Sly ©1« Tbr Asp Pre Gin Lys Tyr Asp Leu Ser Lyg 380 3ítS 390 «6A TOG OCT MC ATO TTG MT ATT CCA ASS AGC GTC OTO TOS ©AC CTC Gly rrp Ala Asn Ile Leu Asr» lie Pro Ajrg Thr Vai Vai Leu Asp Leu 395 400 405 GAA ACT AAA ACC MT TOS ATT GAA TOG CCA mC GA© GM ICC GAA. AAC GiU Tíir Lys Thr A»« Leu lis Gin Trp Pro Ile Clu ©lu Thr S1h AAft 410 415 430 CTO ACG TCG AAA AAG TAT G&T GAA TTT AAA SAC GTC GAG CTO CGA CCC Leu Arg Ser Lys Lys Tyr Aep Gl.u Phe Lys Asp Vai Glu Leu Arf fro 425 430 435 n$ 774 822 870 018 050 1014 1062 1110 115S 1206 1254 130:2 1350 13$$ 13$$ -55 ΡΕ795018 055 oiy OCA CTC ora ecc cra GAG ATA soe ACA oec ACA CAG TTG SAT ATA Ala Lera Vai Pro Léu Gltt n« Cly Thr Ala Thr Gin Leu Asp Ile 440 445 450 455 6ΪΪ SOS ACA rae SM ATC GAC CAA MG ATO TTG GAA TCA ÁCG CTA OAG Vai Mo Thr Pfce ΐϊ.3.ϊί ile ASP Gin Lys Met MU GlU ser fte Leu Glu 460 465 470 GCC G&T ora CIA rac MT TGC ACS ACT AGT CAA GCC TCG era GCA AGS Ala ®p Val Leu phe Asn Cys Tfer Thr Ser Glu Gly Sér val Ata Arg 475 480 485 AGT 01¾ txg OCA CCS TTT GST STS STG OXT CTA GCC GAT GCC CAO CSC Sor Vai Léu Gly Pre PA» Gly val Vãl val LM Ala Asp Ala Glu Arg 490 495 500 vcc GM CAA cra CCT STA TAC rac ΪΑΤ ATC GCA AM OAT ATT ΘΑΤ GSA Ser Glu 01a Leu Pre Vai Tyr PM fyr 11® AIa Lys ASp lie ÃSp Gly SOS 510 515 ACC TCA GGA ACT TÀT rar ra GCC GAC OAA ACA MA TCA TCC AAix GAT Thr ser Arg Thr Tyr Phs Cys Ala A8p Gl« Thr Arg Ser Ser Lys Aep £20 525 $30 535 G®fi MC STà esc AAà TGC CTC TAC GGA A«C ast ora CCT GTC CTC CCA Vai Ser Val Gly Lys frp Vai Tyr Gly Ser Ser Vai Pre Vai Leu FfO 540 54 S 550 GGC GAA AAG TAC MT ATS AÇG TTA rae GTS GAT CAT TCG ATA GTA GAG Gly Õlu Lys Tyr Asm mt Arg Mu Leu Val Asp Hís» Ser lie Val Glu SSS 5S0 565 e-SA ira OCA CM MC CGS AGA ACC 0TG GTG ACA TCA AGA STS TAT CCA ciy Fhs Ala Olit Asn Gly Arg Thr vai Vai Thr Ser Arg Val Tyr Pró 575 575 580 ACA AM OCO ATC TAC MC GCT SCO MG GTG TTT TTS rac AAC AAC GCG Thr Lys Ala Hí Tyr Asn Ala Ala Lys Vai PM Leu Fite AAO ÃSA Ala 585 590 595 ACT SOA ATC MT GTS MO· GCÒ tcs ATC AAG ATC TOS AAO ATG GGG GAA Thr Hiy Ue Ser vai Lys Ala ser Ile Lys Ile frp Lye Mè% Gly 01« 600 605 610 615 OCA ÓM crc AAT CCT ttc CCT cra CCT GGÇò TGG ACT rac GAA era Ala Leu Aso Pro Phs Pro Leu Pra Gly Trp Thr Phe Siu Leu «20 625 610 ναοοβηκτ atopmsacc ctatatatct eraffAwx TearseraAT Ararasoaec ctatatatgt eraítâfCA tsmscatm «TrasoAcro gaooggstat tattgtmtt

TTATATOCftT STTCTATTAC ΪΤβϊβΑόβΤΪ ATAGTATOTA ΜΤΑΜΪΤΑΤ TATATACSÃT

ATCAATTTCT AAT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 630 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 1446 1*94 1548 iSão isae 1686 1134 1782 1δ30 1878 1923 1983 2843 2103 2110 -56- ΡΕ795018 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Met Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Tfer Pro leu Ile teu His Asp Asp 1 s iõ 15

Pro Glu Asn Leu Pro Glu Leu Thr Gly Ser Pr© Thr Thr Arg Arg Leu 20 25 30

Ser Ile Ala Lys Vai Leu Ser Gly Ile Leu Vai Ser Vai Leu Vai Ile 35 40 4S

Gly Ala Leu Vai Ala Leu Ile As» Asn Gin Thr Tyr Glu Ser Pro Ser 50 55 $0

Ala Thr Thr Phe Vai -Thr Gin leu Pro As» ile Asp leu Lys Arg Vai

65 ?0 7:5 SO

Pro Gly Lys Leu Asp Ser Ser Ala Glu Vai Glu Trp Gin Ar§ Ser Thr 85 90 m

Tyr Sis Phe Gin Pro Asp Lys Assn Phe Ile Ser Asp pro Asp Gly Pro 100 105 110

Met Tyr sis Hat Gly Trp Tyr His teu Phe Tyr Gin Tyr Asn Pro Gin 115 120 125

Ser Ala Ile Trp Gly Asn Ile Thr Trp Gly His ser Vai Ser Lys Asp 130 ' 135 140

Met ile Ano Trp Phe His Leu Pro Phe Ala Met Vai Pro Asp His Trp 145 ISO 155 160

Tvr Asp Ile Glu Gly Vai Met Thr Gly Ser Ala Thr Vai Leu Pro Asn 165 170 175

Gly Gin lie Ile Met Leu Tyr Ser Gly Asn Ala Tyr Mp Leu Ser Gin ISO 165 190

Vai Gin Cys Leu Ala Tyr Ala Vai Asn Ser Ser Asp Pro Leu Leu Ile 195 200 205

Glu Trp Lys Lys Tyr Glu Gly Asn Pro Vai Leu Leu Pro Pro Pro Gly 210' 215 220

Vai Gly Tyr Lys Asp Phe Arg Asp Pro Ser Thr Leu Trp Ser Gly Pro 225 230 235 240

Asp Gly Glu Tyr Arg Met vai Ket Gly Ser Lys His Asn Glu Thr He 245 250 255 -57- ΡΕ795018

Gly cys Ala Leu tu Tyr His Thr Thr Asn Phe Thr His Phé Glu Leu 260 255 270 Lys GlU Glu Val Léu Ris Ala Val Pro Ris Thr Gly Met Trp Glu Cys 375 280 aes Vai Asp Leu Tyr Pre val Ser Thr Val ai» Thr Asa Giy Leu Asp Met 290 295 300 Vai Asp Ás» Gly Pre· Asn Val Lys Tyr val Leu Lys Gin Ser Gly ASp 3 OS 310 315 320 Glu Asp Arg Hiô Asp Trp Tyr Ala 11© Gly Ser Tyr Asp n* val Asn 325 330 335 Mp Lys Trp Tyr Pro Asp Asp Pr» Ôlu Asn Asp Val Gly U* Gly Leu 340 345 350 Arg Tyr Asp Ph# m Lys The Tyr Ala Ser Lys Thr Phe Tyr ASp Gin 353 360 365 HÍS Lys Lys Arg Arg val Leu Trp Gly Tyr val Gly Glu Thr Asp Pro 37 e 375 3S0 Glh, . Lys Tyr Asp Leu Ser Lys Gly Trp Ala Asn lie Leu Asb lie Pro 38S 390 395 400 Arg Thr vai val Leu Asp Leu. Glu Thr Lys Thr Asn Leu rie Gin Trp 405 410 415 Pre n* aiu Glu Thr Glu Asn Leu Arg Ser Lys Lys Tyr Asp GlU Fhé 420 425 430 Lys Asp Val Glu Leu Arg Pro Gly Ala Leu val Pro Leu Glu 11« Gly 4:35 440 445 Thr Ala Thr Gin Leu Asp 11* Val Ala Thr Phe Glu lie Asp Glh Lys 430 455 460 Met Leu Glu Ser Thr Leu GlU Ala Asp vai Leu Phe Asft cys Thr Thr 465 470 475 480 Ser Glu Gly Ser val Ala Arg Ser Val Leu Gly Pro Phè Gly Val Val 435 490 495 Vai Leu Ala Asp Ala Gin Arg Ser Glu GX» Leu Pro Val Tyr Ph© Tyr 500 505 510 n* Ala Lys sis Asp Xle Asp Gly Thr Ser Arg Thr Tyr Phe cys Ala ASp 520 525 Glu Thr Arg Ser Ser Lys Asp val Ser Val Gly Lys Trp val Tyr Gly 530· 535 540 ser Ser Val Fro Vai Letí Pro Gly Glu Lys Tyr Asn Met Arg Leu Leu m 550 555 560 -58- ΡΕ795018

Val Asp Eis ser Xle Vai siu çiy p&e Ala Gin Am bly Arg Thr Vai 565 570 S7S

Vai ftir Ser Arg Vai Tyx Pr o Thr Lys Ala Ile Tyr ASft Ala Ala Lys são s$s sm vai Fhe Leu Phe Asn Asn Ala Thr Sly Ile Ser Vai Lys Ala Ser lia 595 60 Q ¢05

Lys II® ftp Lye Met 6ly Cia Ala Cia Leu Aso Pr® Λ*· Pr® Leu Pr® 610- 615 620

Gly Trp Thr Fh® slu Leu 625 630 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2003 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helianthus tuberosus (B) ESTIRPE: Columbia (D) ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Adulto (F) TIPO DE TECIDO: Tubérculo (G) TIPO CELULAR: parênquima de armazenamento -59- ΡΕ795018 (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, USA) (B) CLONE: PFFT111 (ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 29..1873 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 89/12386 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21-UUN-1989 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 28-DEZ-1989 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 3: DE 1 A 4100 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/04692 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09-AGO-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 03-MAR-1994 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 3: DE 1 A 1438 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/14970 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-DEZ-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 07-JUL-1994 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: ΡΕ795018 -60- ©GOSeGàSTA ccagtccagt CAGTCACC AT© CAA ACC CCT CAA CCC TTT ACA tíet Gin Thr Pr» Gia Pré Ptie Thr 635 ©AC GTT ©AS CA? CAA CCC CAC ACA CCC CTA CTG ©AC mc CAC CAC AAC Asp Lee Glu Kis C.le Pro H.is Thr Pro teu Lea Asp Mia Mis Mis Asn 640 645 650 CCS CCS CCS ÇAA ACC ACC ACA ASA CCT TTG TTC ACC ASG STT GT6 tcc Pr» Pro Pro Cl n Thr Thr Thr Lys Pro iesu Pfee Thr Arg Vai Vai ser 635 660 685 670 ggt me acc ttt gtt tt& ttc TTC TTT CGT TTC GCT A'S‘C GTA TTC ATT Sly Vai ®t The Vai Leu Phe Phe Phe Gly Phe Ala 11« Vai Phe lie OT CTC MC 675 ma ©ss CAA CAG MT TGT TCT GTT CGT ATC GTC ACC AAT TC© GAC VbI Leu Asa ©In Gin Aso ser Ser Vai Arg Ile Vai Thr Asm Ser Gin 600 68:5 70Õ: MA TCP T'ÍT ATA AM TA? TC© CA© ACC GA? CG© TTG TC© XSC SAA CSC Lys Ser Phe lie A.rg Tyr ser Gin Thr Asp ?:10 Ara leu Ser Trp Glu Arg 705 715 ACC GCT TTT CAT TTT CAS COT CCC MG AAT TTT ATT TAC GAT CCA CAT Thr Ala Phe His Phe Gin Pro Ala Lys Aen phe ile Tyr Asp Pro Asp 720 725 730 ©GT CSC TTQ TTT CSC ATS MC TGG TAC CAT ATG TTC TAT CAA TAc MC Gly Gin Leu Pfe* Mia «et eiy Trp Tyr Kís mt Phe Tyr Gin Tyr Asn 735 740 745 750 CCA TAC GCA CCS GTT TOS CSC Mt atg tcs TSG fifiT CAC TCA ©T6 TCC Pro Tyr Ala Pr® Vai Trp Gly Asn Hat Ser Trp sly ais Ser Vai Ser 7 55 760 765 ÃAA SAC ATS ATC AAC TGG TAC GAG CTS CCA ©TC gct ATG CTC CCC ACC Lys Asg Met lie Asn Trp Tyr Cia teu Pro val Ala Ket Vai Pro Thr 770 775 780 BAÂ ?GG ΤΑΪ SAT ATC OAS mc ©TC TTA TCÇ ©CG TCT ACC AC© ©TC CTT ©1« Vrp Tyr Asp xie ei» Gly Vai Lee Ser Sly Ser Thr Thr Vai Leu 785 790 755 CCA AAC CGT CAG ATC TTT GCA TTC VAT ACT GCG AAC GCT AAT ©AT TTT Pro Asn eiy Gin lia Phe Ala Leu Tyr Thr sly Asn Ala Asn Asp Phe 800 605 SIS TCC CAA TTA CAA *ESC ASA SC? ©TA CCC ©TA SAC TTA TCT CAC CCS CTT Sor Gin ím Gin Cys Lys Ala vai j?ro Vai Aen too Ser As» Pre Leu 815 820 825 830 CTT ATT GAG T©S «TC MG TAT GA© ©AT AAC cm ATC CTG TAC ACT CCS Lao n& G3t« Trp Vai Lys Tyr Glu Asp Aon Pro lie Leu Tyr Thr Pr» 835 840 843 32 100 14 8 im 244 292 34© 188 436 484 $32 380 838 676 -61 - ΡΕ795018 OCA 666 MT ¢06 m MO 6AC XMX 066 CÂC CCS TCA AGA 6TC WC AC A ?«<

Prs fily Ile 6iy Leu Ly» Asp Tyr A*ff Asp Pr© Ser «*r VSl Ίτρ Tfer 850 8»§ 860 06f CCC «ME 6SA MS CSMP ue ATC «PC ATS JSGA AC* AM COT GCC MT 772 6ly Pro Asp Sly Lys Hís ftrg Mst lis Ksfc Gly Thr Lys Arg Gly Asn

8AS 870 87S Λ CA GSC ATS STk CTT GTT TAC TAT MC ACT GAT TAC ACG MC TAC 6&G 820

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Leu Leu Aôp Sltt Pm Leu His Ser Vai Pr© Asa TM Àsp Mst Trp Glu 895 900 90s 910 $ec STC 6AC TFT TAC CCS «ΜΡ TOS CTM ACC MT GAT MS» SCA CTT SAT «A*

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As« Asp Lys T.rp Thr Pr© Aep Asa Pr© 61a Leu Asp Vai Gly Sl« Gly 960 965 970 m 066 TSC GAT TAC 6SG AGG TTT TTT GOA TCA A&C AST CTT TAT GAC UO»

Leu Arg Oys Asp Tyr Gly Arg: PAe Ph» Aia Ser Lys Ser £ao Tyr Asp 97$ 980 985 990 CCA «RS AAG AM AGG AGS ATC ACf TSO GCT ΤΑΪ GST GOA. GAA TCA GAT M56

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Ser Ala A.sp Cie Asp Leu Ser Arg Gly frp Ala Thr Vai Tyr Asn Vai 1010 101» 1920 SCA AOA ACA ATT ©TA CTA GAT ÁCÂ AAG ACO 006 ACC CAT TTA CTT CXP 1282

Gly Arg TStr IU Vai Leu Aap Arg 3Ly» Thr Gly Thr Ris Mti » His 1025 1030 1035 TGG CCC CTT GAS GAA <3*C ©AG AGT TTG AGA TAC AAC βΟΤ CA« GAG m 1300

Trp Pro Vai 61o 61« Vã! Glu Ser Leu Arg Tyr Asn Gly Gin 05u Pfsa

1040 1045 I05G AAA. Sm A TC MG CTA OAG CCC SCT WÃ ATC ATT CCA C9PC GAC ATA SCO 1348

Lys Clu íls Lys t&u 6XU Pte Gly Ser lie lie pr© Leu Asp i.le Gly ÍÔS8 1060 1065 1070 -62- ΡΕ795018 ACG GCT ACA CAC TO SAC MA STT SCA ACA TH1 GM TO CAT CAA GOA 1396 Thr Ala mt em Leu M$> lie val &iã Thr Fhe siu VAI Asp Gin Ala 1075 1080 1085 GCQ TO AAC CCS ACA ACT SM ACC SAT GAT ATT TAT GGT TQC ACC ACT 1444 Ala Leu Asn Ala Thr ser GlU íte Asp ASJ! 11® Tyr ciy cys Thr Thr 1990 1995 uoo AOC m S«T ecA GCC C&Â ACG GOA AST TO GGA CCA TO SST CTT CCG 1492 S«T Í«U Sly Ala Ala Gin &rg Gly Ser Leu Sly Pw fhe Gly .Leu A.ia nos 1110 ms em CIA sec sat OõA ACC C1T TCT GAS TTA ACf CCS ®TT TAT TO TAT 1540 Val Leu Ala Ass eiy Thr Leu Ser Giy 1«« Thr Pr* v*i Tyr Fhe xyr 1139 112.5 U30 MA SC? SM MS SCÃ ÔAf SáA. GÊf TO TO &CÃ CAT TOf TGT ACC GAT 1508 Πβ Ais Lys Dys À1& Asp Gly Gly val ser Thr «is The cys Thr ASp UJ5 1140 1.14 í i 1150 AAG CTA ass TCR TCA CTA GAT TAT SÃT GGG GAG ÃGA TO GTS TAT GGG 163 S Lys Leu Arg Ser Lee. Asj> Tyr lep «ly Glú Atf Val Val Tyr Giy 215: > 1160 iláS GSC ACT GTT CCT ST® TTA GAT GAT GAA CM CTC ACA ATO ACG CTA TO 1634 <*ty Thr val Fs?a val Leu A8p Asp Slií Ciu Léu Thr Met Arg Leu Leu 1170 1175 5· usa GTG GAf CAT TCG ATA STG GAG G^GG TTT CCG CM 6GA GGA AGG ACG GTT 1732 Val Ásp Sís Ser ile Val Olu Óly Phe Ala <SÍ» ciy Gly Arg Thr Val 1185 un 3 U95 Am, ACA TCA AOS SOS TAT CCA ACA AAA gcg ATA TAC SAA ΟΛΑ CCS AAG imo 11«. Thr Ser Arg Ala Tyr Fra Thr Lys Ala n* Tyt Glu Gin Aia Lys 1300 l20t > 1210 CTG TTC TO « MC MC GOC ACA GSf ACG AGT STÇ AAA CCA. C-TC 1826 Lêw The LéU She Asm Asn Ala Thr Gly Thr Ser vai Lys Ala Ser Leu 1315 12 2 C 1 1325 1230 MS ATT TG3 CAA ATG GCT Ϊ0Ϊ GCA CCA ATT CAT CM T&e CCT TTT 15? 3 iys lie ?rp eln Met Aía Ser Ais Pro 11* His ®i« Tyr Pr* :?he 1235 124C \ 1.245 fAAmCCSC· CTATCS5CTAT CCTOTOTT ATOGTATTX AfGfATOXA ATOTCTTTT 1933 AAACCm^f ATOGATMA OTMW TB*T*Ft»T« éTTOASTAÂ TMATCAATG 1993 gttoatto soo 3 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 615 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear -63- ΡΕ795018 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Met Gin Thr Fro Glu Fr o Fhe Thr Mg Lm Glu Eis Giú Ptó Eis Thr 1 9 10 15

Fro Leu Leu Asp Bi® Kls Eis Asn Fro Fro Pro Gin Thr Thr Thr Lys 20 25 30

Fro Leu Phe Thr Arg Vai tal Ser· Gly Vai Thr Fhe Vai Leu The Ph© 35 40 45

Fhe âly Fhe Ala Ile Vai Fhe Ile Vai Leu Asn Gin Gin Asn Ser Ser 50 55 60

Vai Arg Ile Vai Thr Asn ser Glu Lys ser Phe lie Arg Tyr Ser Gin 95 70 75 m

Thr Asp Arg Leu Ser Trp Glu Arg Thr Alm Fhe Mis Phe Gin Fro Ala 85 90 95

Ly» Asn Fhe Ik Tyr Asp Fro Asp Gly Gin Leu Fhe Mis Set Gly Trp 100 105 110

Tyr Ele Het Fhe Tyr Gin Tyr Asn Fro Tyr Ala Pr O· Vai Trp Gly Aon lis 120 1?5

Set Ser Trp Gly His ser Vai s»r Lys Asp Set lia Asn Trp Tyr Glu 130 135 140

Leu pro vai Ala Met Vai Pro Thr Glu Trp Tyr Asp Ile Glu Gly vai 145 150 155 ' 160

Leu Ser Gly S«r Thr Thr Vai LeU Pro Asn Gly Gin Ile Fhe Ala Leu 195 170 175

Tyr Thr Gly Asn Ala Asm Asp Fhe Ser Gin Leu Gin Cys Lys Ala Vai ISO IBS· 190

Fro· Vai Asm Leu Ser Asp Pro Leu Leu. lio Glu Trp Vai Lys Tyr Glu 195 200 205

Asp Asn Fro Ile Leu Tyr Thr Fro Fro Gly Ile Gly Leu Lys Asp Tyr 210 215 220

Arg Asp Fro Ser Thr Vai Trp Thr Gly Fro Asp Gly Lys sis Arg Het 225 230 235 240

Ile Met Gly Thr Lys Arg Gly Asn Thr Gly Met Vai Léus Vai Tyr Tyr 245 250 255 -64- ΡΕ795018

Thr Thr Asp Tyr Thr Asn Tyr 61a Leu Leu Asp Glu Fro leu His Ser 260 265 270

Vai Fro Mn Thr Asp Mat Trp 61a Cys Vai Asp Fhe Tyr Fro Vai Ser 275 2SG 265

Leu Tísr Mn Mp ser Ala Leu Mp Mèt Alá Alá Tyr Gly ser Gly lie 2S0 295 300

Lys His Vai lie Lye Glu Ser frp Glu Gly His Gly Mèt Asp Trp Tyr 305 310 315 320

Ser 11» Gly Thr Tyr Asp Ala lie Mn Asp X»ys Trp Thr Fro ASp Asr 325 330 335

Pro Glu t>eu Asp Vai Gly lie Gly Leu Arg Cys Asp Tyr Gly Arg Fhe 340 345 350

Phe Ala ser Lys Ser Leu Tyr Asp Pro Leu Lys Lys Arg Arg 11« Thr 355 360 365

Trp Gly Tyr Vai Gly Giu ser Asp ser Ala Asp Gin Asp Leu Ser Arg 370 375 360

Gly Trp Ala Thr Vai Tyr Asn Vai Gly Arg Thr 11» Vai Leu Asp Arg 385 390 395 400

Lys Thr Gly Thr His Leu Leu His Trp Pro Vai Glu Giu Vai Glu Ser ' 405 410 415

Leu Arg Tyr Asn Gly Glu Glu Phe Lys Glu lie Lys Leu Glu Fro Gly 420 425 430

Ser lie lie Fro Leu Asp He Gly fhr Ala Thr Gin Leu Asp He vai 4.35 440 445

Ala Thr Phe Giu vai Asp Gin Ala Ala Leu Asn. Ala Thr Ser Glu Thr 450 455 460

Asp Asp Ile Tyr Gly Cys Thr Thr Ser teu Gly Ala Ala Gin Arg Gly 465 470 475 400

Ser Leu Gly Fjrs Phe Gly Leu Ala Vai Leu Ala Asp Gly Thr Le« Ser 46:5 490 495

Glu Leu Thr Fro Vai Tyr Fh© Tyr He Ala Lys Lys Ala Asp Gly Gly 500 505 510

Vai Ser Thr His Phe Cys Thr Asp Lys Leu Arg Ser Ser Leu Asp Tyr 515 520 525

Asp Gly Glu Arg Vai Vai Tyr Gly Gly Thr Vai Pr o Vai Leu Mp Asp 530 535 540

Glu Glu Leu Thr Mefc Arg Leu Leu Vai Asp His ser lio Vai Glu Gly §45 550 555 560 -65- ΡΕ795018 phe Ala GXn <Sly ôly ttwr Vai lie Tfcr 8«r Arej Ala Tyr P*r« Thr 565 57 Θ S75

Lys Ala Ile tyr 61« Gin Ala Lys Leu Phe Leu Fh© Asm As» Ala fhr 580 585 S9Ó

Gly Thr Ser Vai Lys Ala Ser Leu Lys Ile Trp Gin Met Alã Ser Ala 555 800 605

Pro Ile Hls Gin Tyr Pra Phe 610 615 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helianthus tuberosus (B) ESTIRPE: Columbia (D) ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Adulto (F) TIPO DE TECIDO: Tubérculo (G) TIPO CELULAR: parênquima de armazenamento (vii) FONTE IMEDIATA: -66- ΡΕ795018 (A) BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, USA) (B) CLONE: pSST103 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 89/12386 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21-JUN-1989 (U) DATA DE PUBLICAÇÃO: 28-DEZ-1989 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 5: DE 1 A 4100 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/04692 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09-AGO-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 03-MAR-1994 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 5: DE 1 A 1438 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/14970 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-DEZ-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 07-JUL-1994 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: GARCARYTNC CNGTNTAYTT YTAYATHGCN AAR 33 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: -67- ΡΕ795018 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helianthus tuberosus (B) ESTIRPE: Columbia (D) ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Adulto (F) TIPO DE TECIDO: Tubérculo (G) TIPO CELULAR: parênquima de armazenamento (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, USA) (B) CLONE: pFFTlll (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 89/12386 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21-JUN-1989 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 28-DEZ-1989

(K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 6: DE 1 A -68- ΡΕ795018 4100 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/04692 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09-AGO-1993 (U) DATA DE PUBLICAÇÃO: 03-MAR-1994 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 6: DE 1 A 1438 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/14970 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-DEZ-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 07-JUL-1994 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: GGNTGGGCNA CNGTNTAYAA T 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO -69- ΡΕ795018

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helianthus tuberosus (B) ESTIRPE: Columbia (D) ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Adulto (F) TIPO DE TECIDO: Tubérculo (G) TIPO CELULAR: parênquima de armazenamento (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, USA) (B) CLONE: pFFTlll (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 89/12386 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21-UUN-1989 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 28-DEZ-1989 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 7: DE 1 A 4100 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/04692 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09-AGO-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 03-MAR-1994

(K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 7 : DE 1 A 1438 -70- ΡΕ795018 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/14970 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-DEZ-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 07-JUL-1994 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: ATHGTNGARG GNTTYGCNCA R 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helianthus tuberosus (B) ESTIRPE: Columbia (D) ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Adulto (F) TIPO DE TECIDO: Tubérculo (G) TIPO CELULAR: parênquima de armazenamento -71 - ΡΕ795018 (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, USA) (B) CLONE: pFFTlll (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 89/12386 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21-JUN-1989 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 28-DEZ-1989 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 8: DE 1 A 4100 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/04692 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09-AGO-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 03-MAR-1994 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 8: DE 1 A 1438 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/14970 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-DEZ-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 07-JUL-1994 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: 27

CCGAATTCAA TACGACTCAC TATAGCG -72- ΡΕ795018 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helianthus tuberosus (B) ESTIRPE: Columbia (D) ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Adulto (F) TIPO DE TECIDO: Tubérculo (G) TIPO CELULAR: parênquima de armazenamento (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagen USA) (B) CLONE: pSST103 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 89/12386 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21-JUN-1989 -73- ΡΕ795018 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 28-DEZ-1989 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 9: DE 1 A 4100 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/04692 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09-AGO-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 03-MAR-1994 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 9: DE 1 A 1438 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/14970 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-DEZ-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 07-JUL-1994 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9:

Ma Mp Vai laa tm fhr íhr Míj çsi^ s&r vai Ma 1 5 10 13 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear -74- ΡΕ795018 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helianthus tuberosus (B) ESTIRPE: Columbia (D) ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Adulto (F) TIPO DE TECIDO: Tubérculo (G) TIPO CELULAR: parênquima de armazenamento (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, USA) (B) CLONE: pSSTl03 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 89/12386 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21-JUN-1989 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 28-DEZ-1989 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 10: DE 1 A 4100 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/04692 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09-AGO-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 03-MAR-1994 -75- ΡΕ795018

DE 1 A (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 10: 1438 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/14970 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-DEZ-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 07-JUL-1994 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10:

Giu Gin Leu Pro Vai Tyr Ph® Tyr lie Ala Lys i 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helianthus tuberosus ΡΕ795018 -76- (B) ESTIRPE: Columbia (D), ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Adulto (F) TIPO DE TECIDO: Tubérculo (G) TIPO CELULAR: parênquima de armazenamento (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, USA) (B) CLONE: pFFTlll (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 89/12386 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21-JUN-1989 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 28-DEZ-1989 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 11: DE 1 A 4100 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/04692 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09-AGO-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 03-MAR-1994 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 11: DE 1 A 1438 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/14970 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-DEZ-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 07-JUL-1994 -77- ΡΕ795018 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11: ?âl Vai Leu top L« Glu Thr Lye 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helianthus tuberosus (B) ESTIRPE: Columbia (D) ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Adulto (F) TIPO DE TECIDO: Tubérculo (G) TIPO CELULAR: parênquima de armazenamento (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, USA) -78- ΡΕ795018 (B) CLONE: pSSTl03 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 89/12386 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21-JUN-1989 (U) DATA DE PUBLICAÇÃO: 28-DEZ-1989 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 12: DE 1 A 4100 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/04692 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09-AGO-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 03-MAR-1994 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 12: DE 1 A 1438 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/14970 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-DEZ-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 07-JUL-1994 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12:

Asp Fro ii&r Thr Leu Xm P*re tóp eiy siu 1 I 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: -79- ΡΕ795018 (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helianthus tuberosus (B) ESTIRPE: Columbia (D) ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Adulto (F) TIPO DE TECIDO: Tubérculo (G) TIPO CELULAR: parênquima de armazenamento (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, USA) (B) CLONE: pSST103 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 89/12386 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21-JUN-1989 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 28-DEZ-1989 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 13: DE 1 A 4100 -80- ΡΕ795018 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/04692 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09-AGO-1993 (U) DATA DE PUBLICAÇÃO: 03-MAR-1994

DE 1 A (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 13: 1438 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/14970 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-DEZ-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 07-JUL-1994 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13:

Gly Trp Ma As π íia l 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO -81 - ΡΕ795018

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helianthus tuberosus (B) ESTIRPE: Columbia (D) ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Adulto (F) TIPO DE TECIDO: Tubérculo (G) TIPO CELULAR: parênquima de armazenamento (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, USA) (B) CLONE: pFFTlll (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 89/12386 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21-UUN-1989 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 28-DEZ-1989 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 14: DE 1 A 4100 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/04692 Al (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09-AGO-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 03-MAR-1994

(K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 14: DE 1 A 1438 -82- ΡΕ795018 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/14970 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-DEZ-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 07-JUL-1994 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: ôly Trp Ai» fhr vai Tyr Asn vai ôiy Arg

1 $ M (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helianthus tuberosus (B) ESTIRPE: Columbia (D) ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Adulto (F) TIPO DE TECIDO: Tubérculo ΡΕ795018 -83- (G) TIPO CELULAR: parênquima de armazenamento (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, USA) (B) CLONE: pFFTlll (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 89/12386 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21-JUN-1989 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 28-DEZ-1989 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 15: DE 1 A 4100 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/04692 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09-AGO-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 03-MAR-1994 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 15: DE 1 A 1438 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/14970 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-DEZ-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 07-JUL-1994 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15: -84- ΡΕ795018

Vai AíSfj níã Bm II® Vai <31tt «ly Rh® M® «in siy i § ίο Ι& (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Helianthus tuberosus (B) ESTIRPE: Columbia (D) ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Adulto (F) TIPO DE TECIDO: Tubérculo (G) TIPO CELULAR: parênquima de armazenamento (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: lambda Uni-Zap XR (Stratagene, USA) (B) CLONE: pFFTlll -85- ΡΕ795018 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 89/12386 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21-JUN-1989 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 28-DEZ-1989 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 16: DE 1 A 4100 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/04692 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09-AGO-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 03-MAR-1994 (K) RESÍDUOS RELEVANTES EM SEQ ID NO: 16: DE 1 A 1438 (x) INFORMAÇÃO DA PUBLICAÇÃO:

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: WO 94/14970 AI (I) DATA DE APRESENTAÇÃO: 28-DEZ-1993 (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: 07-JUL-1994 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: V«l Sltt s*r Mp 1 &

Lisboa, 11 de Dezembro de 2007

Claims (9)

1. ΡΕ795018 - 1 - REIVINDICAÇÕES 1. Fragmento de ADN possuindo uma sequência nucleotidica SEQ ID NO: 1 tal como mostrada na Fig. 4A ou uma sequência homóloga possuindo uma identidade de pelo menos 70% codificando uma proteína possuindo actividade de 1-sacarose:sacarose-frutosiltransferase, que catalisa a reacção geral: G-(F)n + G-(F)m - G-(F)n_i + G-(F)m+i, l<n<3, l<m<3 em que -G representa uma unidade glicosil e -F representa uma unidade frutosil.
2. 2. Fragmento de ADN de acordo com a reivindicação 1 possuindo uma identidade de pelo menos 85%.
3. 3. Sequência de ADN recombinante compreendendo um ou mais fragmentos de ADN tal como definidos na reivindicação 1 ou 2.
4. 4. Sequência de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 3, compreendendo ainda um fragmento de ADN possuindo uma sequência nucleotidica SEQ ID NO: 2 tal como mostrada na Fig. 4B ou uma sequência homóloga possuindo uma identidade de pelo menos 70% codificando uma proteína possuindo actividade de 1-frutano:frutano-frutosiltrans-ferase, que catalisa a reacção geral: -2- ΡΕ795018 G-(F)n + G-(F)m - G-(F)n-i + G-(F)m+i, n>2, m>2 em que -G e -F são tal como definidos na reivindicação 1.
5. 5. Sequência de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o referido fragmento ou fragmentos estão presentes na orientação inversa.
6. 6. Método para a produção de uma planta geneticamente transformada apresentando um perfil de frutanos modificado, que compreende os passos de: i) preparação de uma construção génica quimérica compreendendo um ou mais fragmentos de ADN tal como definidos nas reivindicações 1 ou 2, ou os referidos fragmentos na orientação inversa, operativamente ligados a uma sequência promotora activa na referida planta e uma sequência terminadora activa na referida planta, ii) introdução da construção génica quimérica no genoma da planta, e iii) regeneração das células vegetais transformadas em plantas transgénicas.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a construção génica quimérica preparada no passo i) compreende ainda um fragmento de ADN possuindo uma sequência nucleotidica SEQ ID NO: 2 tal como mostrada na Fig. 4B ou uma sequência homóloga possuindo uma identidade de pelo menos 70% codificando uma proteína possuindo -3- ΡΕ795018 actividade de 1-frutano:frutano-frutosiltransferase, que catalisa a reacção geral: G—(F)n + G-(F)m ^ G- (F) n-i + G-(F)m+i, n>2, m>2 em que -G e -F são tal como definidos na reivindicação 1.
8. 8. Planta transformada mostrando uma perfil de frutanos modificado ou uma célula vegetal, semente, fruto, plântula ou qualquer parte da planta transformada, ancorando uma construção génica quimérica compreendendo um ou mais fragmentos de ADN tal como definidos nas reivindicações 1 ou 2, ou os referidos fragmentos de ADN na orientação inversa operativamente ligados a uma sequência promotora activa na referida planta e uma sequência terminadora activa na referida planta.
9. 9. Planta transformada de acordo com a reivin dicação 8 em que a construção génica quimérica compreende ainda um fragmento de ADN possuindo uma sequência nucleotídica SEQ ID NO: 2 tal como mostrada na Fig. 4B ou uma sequência homóloga possuindo uma identidade de pelo menos 70% codificando uma proteína possuindo actividade de 1-frutano:frutano-frutosiltransferase, que catalisa a reacção geral: G—(F)n + G-(F)m - G-(F)n_i + G-(F)m+i, n>2, m>2 em que -G e -F são tal como definidos na reivindicação 1.