PT759786E - Conjugados péptido-quelato metálico que se ligam a somatostatina - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "CONJUGADOS PÉPTIDO-QUELATO METÁLICO QUE SE LIGAM A SOMATOSTATINA"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Área da Invenção

Esta invenção refere-se a agentes terapêuticos, agentes radioterapêuticos, agentes de radiodiagnóstico e agentes de diagnóstico não radioactivos, e métodos para a produção desses agentes de diagnóstico e terapêuticos. A invenção também se refere a péptidos cíclicos que se ligam especificamente a receptores de somatostatina expressos à superfície das células de mamíferos, particularmente células de mamíferos neoplásicas ou metastáticas. A invenção, num aspecto, refere-se a agentes para imagiologia cintigráfica para visualização de sítios no corpo de um mamífero. Neste aspecto, os agentes de imagiologia compreendem um péptido de ligação específica que se liga, especificamente, a células que exprimem receptores de somatostatina in vivo, marcado com tecnécio-99m (Tc-99m) através de uma unidade que se liga a um radiomarcador que forma um complexo com Tc-99m. Noutro aspecto, a invenção proporciona agentes de imagiologia radioiodados. A invenção também proporciona agentes terapêuticos, incluindo agentes radioiodados, complexos metal radioactivo-reagente e complexos metal não radioactivo-reagente, de que todos eles têm utilidade terapêutica. A invenção proporciona reagentes para preparação de cada uma das formas de realização diagnósticas e 1 terapêuticas dos agentes de diagnóstico e terapêuticos da invenção, as formas de realização radiomarcadas e os seus complexos de metais não radioactivos, métodos para a marcação dos referidos reagentes e kits compreendendo as formas de realização não radioactivas dos reagentes da invenção e outros componentes para a preparação conveniente dos agentes de diagnóstico e terapêuticos radiomarcados da invenção. 2. Descrição da Técnica Anterior A somatostatina é um tetradecapéptido que é produzido endogenamente pelo hipotálamo e pâncreas em seres humanos e outros mamíferos. 0 péptido tem a fórmula:

Fórmula I

Ala-G ly-Cys* Lys-Asn· Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Sef-Cys I_| (As abreviaturas com uma só letra dos aminoácidos podem ser encontradas em G. Zubay. Biochemistry (2a ed.), 1988 (MacMillan

Publishing: New York), p. 33). Este péptido exerce uma grande variedade de efeitos biológicos in vivo. Sabe-se que actua fisiologicamente sobre o sistema nervoso central, hipotálamo, pâncreas e tracto gastrointestinal. A somatostatina inibe a libertação de insulina e glucagon do pâncreas, inibe a libertação de hormona do crescimento do hipotálamo e reduz as secreções gástricas. Assim, a somatostatina tem aplicações clinicas e terapêuticas para o alivio de diversas enfermidades e doenças, tanto em seres humanos como noutros animais. A somatostatina nativa tem, contudo utilidade limitada, 2 devido à sua semi-vida curta in vivo, onde é rapidamente degradada por peptidases. Por esta razão, foram desenvolvidos na técnica anterior análogos de somatostatina com estabilidade melhorada in vivo.

Freidinger, Patente U.S. N° 4235886, descreve análogos de somatostatina hexapéptidos cíclicos úteis no tratamento de várias doenças em seres humanos.

Coy e Murphy, Patente U.S. N° 4485101, descrevem análogos de somatostatina dodecapéptidos sintéticos.

Freidinger, Patente U.S. N° 4611054, descreve análogos de somatostatina hexapéptidos cíclicos úteis no tratamento de várias doenças em seres humanos.

Nutt, Patente U.S. N° 4612366, descreve análogos de somatostatina hexapéptidos cíclicos úteis no tratamento de várias doenças em seres humanos.

Coy et al., Patente U.S. N° 4853371 descrevem análogos de somatostatina octapéptidos sintéticos.

Coy e Murphy, Patente U.S. N° 4871717 descrevem análogos de somatostatina heptapéptidos sintéticos.

Coy et al., Patente U.S. N° 4904642 descrevem análogos de somatostatina octapéptidos sintéticos.

Taylor et al., Patente U.S. N° 5073541 descrevem um método de tratamento do cancro do pulmão de células pequenas.

Brady, Pedido de Patente Europeia N° 83111747.8, descreve 3 análogos de somatostatina hexapéptidos dicíclicos úteis no tratamento de várias doenças humanas.

Bauer et al., Pedido de Patente Europeia N° 85810617.2 descrevem derivados de somatostatina úteis no tratamento de várias doenças humanas.

Eck e Moreau, Pedido de Patente Europeia N° 90302760.5, descrevem análogos de somatostatina octapéptidos terapêuticos.

Coy e Murphy, Pedido de Patente Internacional N° de Série PCT/US90/07074, descrevem análogos de somatostatina para utilizações terapêuticas.

Schally et al., Pedido de Patente Europeia N° de Série EPA 911048445.2, descrevem péptidos cíclicos para utilização terapêutica.

Bodgen e Moreau, Pedido de Patente Internacional N° de série PCT/US92/01027, descrevem composições e métodos para tratamento de doenças proliferativas da pele. A somatostatina exerce os seus efeitos por ligação a receptores específicos expressos à superfície celular de células constituintes do sistema nervoso central, hipotálamo, pâncreas e tracto gastrointestinal. Verificou-se que estes sítios de ligação com alta afinidade para somatostatina são, abundantemente expressos à superfície celular da maioria dos tumores endocrino-activos provenientes destes tecidos.

Frequentemente, é clinicamente vantajoso para um médico ser capaz de localizar o sítio dos estados patológicos num doente utilizando meios não invasivos. Esses estados patológicos incluem doenças dos pulmões, coração, fígado, rins, ossos e cérebro, bem 4 como cancro, trombose, embolia pulmonar, infecção, inflamação e aterosclerose.

No campo da medicina nuclear, certos estados patológicos são localizados, ou a sua extensão é avaliada, por detecção da distribuição de pequenas quantidades de compostos marcadores marcados radioactivamente (chamados radiomarcadores ou radiofármacos) administrados internamente. Os métodos para detecção destes radiofármacos são genericamente conhecidos como métodos de imagiologia ou radioimagiologia.

Em radioimagiologia, o radiomarcador é um radionuclido que emite radiação gama e a marcação é localizada utilizando uma máquina fotográfica de detecção de radiação gama (este processo é frequentemente designado cintigrafia gama). 0 sitio observado na imagem é detectável porque o radiomarcador é escolhido para localizar num sitio patológico (designado contraste positivo) ou, alternativamente, o radiomarcador é escolhido especificamente para não se localizar nesses sitios patológicos (designado contraste negativo). Em muitas situações constitui uma vantagem especial utilizar um composto de ligação específica radiomarcado como um radiofármaco que se localiza especificamente no sítio patológico in vivo.

Por exemplo, a expressão de sítios de ligação com alta afinidade para somatostatina é um marcador de certas células tumorais, e a ligação específica com somatostatina pode ser explorada para localizar e identificar essas células tumorais in vivo.

Os métodos para radiomarcação de análogos de somatostatina que foram modificados de modo a conter um aminoácido de tirosina (Tyr ou Y) são conhecidos na técnica anterior. 5

Albert et al., Pedido de Patente UK 8927255.3, descrevem radioimagiologia utilizando derivados de somatostatina, tais como octreotido marcado com

Bakker et ai., 1990, J. Nucl. Med. 31:1501-1509 descrevem a iodação radioactiva de um análogo de somatostatina e a sua utilidade na detecção de tumores in vivo.

Bakker et al., 1991, J. Nucl. Med. 32:1184-1189 descrevem a utilidade de somatostatina radiomarcada para radioimagiologia in vi vo.

Bomanji et al., 1992, J. Nucl. Med. 33:1121-1124 descrevem a utilização de octreotido (Tyr-3) iodado para obtenção de imagens de tumores carcinóides metastáticos.

Alternativamente, foram descritos na técnica anterior métodos para radiomarcação de somatostatina por modificação covalente do péptido para conter um grupo quelante com um radionuclido.

Albert et ai., Pedido de Patente UK 8927255.3, descrevem radioimagiologia utilizando derivados de somatostatina tais como octreotido marcado com ^In através de um grupo quelante ligado ao terminal amino.

Albert et ai., Pedido de Patente Internacional WO 91/01144 descrevem radioimagiologia utilizando péptidos radiomarcados relacionados com factores de crescimento, hormonas, interferões e citoquinas e compreendendo um péptido de reconhecimento especifico ligado covalentemente a um grupo quelante com um radionuclido. 6

Albert et al., Pedido de Patente Europeia N° 92810381.1, descrevem péptidos de somatostatina com quelantes ligados ao terminal amino.

Faglia et ai., 1991, J. Clin. Endocrinol. Metab. 73: 850- 856, descrevem a detecção de receptores de somatostatina em doentes.

Kwekkeboom et al., 1991, J. Nucl. Med. 32:981 Abstract #305, refere-se a radiomarcação de análogos de somatostatina com 11]-In.

Albert et ai., 1991, Abstract LM10, 12th American Peptide Symposium: 1991, descrevem utilizações para análogos de somatostatina derivatizados com ácido dietileno- triaminopentaacético marcados com ^^In.

Krenning et ai., 1992, J. Nucl. Med. 33:652-658, descrevem cintigrafia clinica utilizando [ H^-In] [DTPA] octreotido .

Sabe-se que uma variedade de radionuclidos são úteis para radioimagiologia, incluindo ^Ga, 99mijc (Tc-99m) , H^-In, ^-^1, 125j^ 169YJ-, ou 186pe> Têm ser considerados vários factores

para radioimagiologia óptima em seres humanos. Para maximizar a eficiência de detecção, é preferido um radionuclido que emita energia gama no intervalo de 100 a 200 keV. Para minimizar a dose de radiação absorvida para o doente, a semi-vida fisica do radionuclido deve ser tão curta quanto o permitir o processo de imagiologia. Para permitir que os exames sejam realizados em qualquer dia e em qualquer altura do dia, é vantajoso ter uma fonte do radionuclido sempre disponível no local da clínica. O

Tc-99m é um radionuclido preferido porque emite radiação gama a 7 140 keV, tem uma semi-vida física de 6 horas, e está prontamente disponível no local utilizando um gerador de molibdénio-99/tecnécio-99m. Outros radionuclidos utilizados na técnica anterior são menos vantajosos do que o Tc-99m. Isto pode ser devido a que as semi-vidas físicas desses radionuclidos são mais longas, resultando numa maior quantidade de dose de radiação absorvida para o doente (e. g., índio-111). Além disso, muitos radionuclidos desvantajosos não podem ser produzidos utilizando um gerador no local. O Tc-99m é um metal de transição que é vantajosamente quelado por uma unidade complexante com metais. Unidades complexantes radiomarcadas capazes de se ligar a Tc-99m podem ser ligadas covalentemente a vários compostos de ligação específica para proporcionar meios para radiomarcação desses compostos de ligação específica. Isto é porque a espécie química de Tc-99m mais vulgarmente disponível, pertecnetato (Tc04-), não se pode ligar directamente à maioria dos compostos de ligação específica de forma suficientemente forte para ser útil como um radiofármaco. A complexação de Tc-99m com essas unidades complexantes radiomarcadas tipicamente implica a redução química do pertecnetato utilizando um agente redutor tal como cloreto estanoso. A utilização de agentes quelantes para complexação de Tc-99m é conhecida do estado da técnica.

Byrne et al., Patente U.S. N° 4 434 151, descrevem homocisteína contendo agentes quelantes de Tc-99m. em série de 2,3-

Fritzberg, Patente U.S. N° 4 444 690, descreve uma agentes quelantes de tecnécio baseados bis (mercaptoacetamido)propanoato.

Byrne et al., Patente U.S. N° 4 571 430, descrevem agentes quelantes contendo homocisteína para Tc-99m.

Byrne et al., Patente U.S. N° 4 575 556, descrevem agentes quelantes contendo homocisteína para Tc-99m.

Nosco et al., Patente U.S. N° 4 925 650, descrevem complexos quelantes de Tc-99m.

Kondo et al., Pedido de Patente Europeia, publicação N° 483704 Al, descrevem um processo para a preparação de um complexo de Tc-99m com uma unidade mercapto-Gly-Gly-Gly. O Pedido de Patente Europeia N° 84109831.2 descreve ligandos de Tc-99m bisamido, bistiol e os seus sais como agentes para monitorização da função renal.

Davison et al., 1981, Inorg. Chem. 20:1629-1632, descrevem complexos quelatos de oxotecnécio.

Fritzberg et al., 1982, J. Nucl. Med. 23:592-598, descrevem um agente quelante de Tc-99m com base em N, Ν'- bis (mercaptoacetil)-2,3-diaminopropanoato.

Byrne et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:P126, descrevem agentes quelantes de Tc-99m contendo homocisteína.

Bryson et al., 1988, Inorg. Chem. 27:2154-2161, descrevem complexos neutros de tecnécio-99 que são instáveis a ligando em excesso. 9

Misra et al., 1989, Tet. Lett. 30:1885-1888, descrevem compostos de bisamina bistiol para efeitos de radiomarcação. A utilização de agentes quelantes para radiomarcação de compostos de ligação especifica é conhecida na técnica.

Gansow et al., Patente U.S. N° 4472509, descrevem métodos de produção e purificação de anticorpos monoclonais conjugados com quelatos de Tc-99m.

Stavrianopoulos, Patente U.S. N° 4943523, descreve moléculas detectáveis compreendendo unidades quelantes de metais.

Fritzberg et al., Pedido de Patente Europeia N° 86100360.6, descrevem complexos de ácido ditiol, diamino ou diamidocarboxilico ou amina úteis para a preparação de agentes de imagiologia marcados com tecnécio.

Albert et ai., Pedido de Patente UK 8927255.3, descrevem radioimagiologia utilizando derivados de somatostatina tais como octreotido marcado com ^^In através de um grupo quelante ligado ao terminal amino.

Albert et al., Pedido de Patente Internacional N° WO 91/01144 descrevem radioimagiologia utilizando péptidos radiomarcados relacionados com factores de crescimento, hormonas, interferões e citoquinas e constituídos por um péptido de reconhecimento especifico ligado covalentemente a um grupo quelante de radionuclidos.

Fischman et al., Pedido de Patente Internacional N° W093/13317, descrevem péptidos quimiotácticos ligados a unidades quelantes. 10

Kwekkeboom et al., 1991, J. Nucl. Med. 32:981, Abstract #305 refere-se a radiomarcação de análogos de somatostatina com ^^In.

Albert et al., 1991, Abstract LM 10, 12th American Peptide

Symposium: 1991, descrevem utilizações para análogos de somatostatina derivatizados com dietileno-ácido triaminopentaacético marcados com ^^In.

Cox et ai., 1991, Abstract, 7th International Symposium on Radiopharmacology, p. 16, descrevem a utilização de análogos de somatostatina marcados com Tc-99m, 131j e Hlin em radiolocalização de tumores endócrinos in vivo por cintigrafia. Métodos para marcação de certos compostos que se ligam especificamente a Tc-99m são conhecidos na técnica anterior.

Hnatowich, Patente U.S. N° 4668503 descrevem radiomarcação de proteínas com Tc-99m.

Tolman, Patente U.S. N° 4732684 descrevem a conjugação de moléculas direccionantes e fragmentos de metalotioneína.

Nicolotti et al., Patente U.S. N° 4861869 descrevem agentes de acoplamento bifuncionais úteis na formação de conjugados com moléculas biológicas tais como anticorpos.

Fritzberg et al., Patente U.S. N° 4965392 descrevem vários quelantes à base de mercaptoacetilglicilglicina S-protegida para marcação de proteínas.

Schochat et al., Patente U.S. N° 5 061 641, descrevem a radio marcação directa de proteínas compreendendo, pelo menos, um 11 grupo sulfidrilo "pendente".

Fritzberg et al., Patente U.S. N° 5091514 descrevem vários quelantes à base de mercaptoacetilglicilglicina S-protegida para marcação de proteínas.

Gustavson et al., Patente U.S. N° 5112953 descrevem agentes quelantes de Tc-99m para radiomarcação de proteínas.

Kasina et al., Patente U.S. N° 5175257 descrevem várias combinações de moléculas direccionantes e grupos quelantes de Tc-99m.

Dean et al., Patente U.S. N° 5180816, descrevem métodos para radiomarcação de uma proteína com Tc-99m através de um agente quelante bifuncional.

Sundrehagen, Publicação do Pedido de Patente internacional N° WO85/03231, descrevem marcação de proteínas com Tc-99m.

Reno e Bottino, Pedido de Patente Europeia 87300426.1, descrevem a radiomarcação de anticorpos com Tc-99m.

Bremer et al., Pedido de Patente Europeia No. 87118142.6, descrevem radiomarcação de moléculas de anticorpos com Tc-99m.

Pak et al., Pedido de Patente Internacional WO 88/07382, descrevem um método de marcação de anticorpos com Tc-99m.

Goedemans et al., Pedido de Patente Internacional WO 89/07456, descrevem radiomarcação de proteínas utilizando compostos tiol cíclicos, particularmente 2-iminotiolano e derivados. 12

Dean et al., publicação do Pedido de Patente internacional N° W089/12625, descrevem agentes de condensação bifuncionais para marcação de proteinas com Tc-99m.

Schoemaker et al., publicação do Pedido de Patente internacional N° W090/06323, descrevem proteinas quiméricas compreendendo uma região de ligação a metais.

Thornback et al., Pedido EPC N° 90402206.8, descrevem a preparação e utilização de proteinas ou péptidos radiomarcados utilizando compostos contendo tiol, particularmente 2-iminotiolano.

Gustavson et al., publicação do Pedido de Patente internacional N° WO91/09876, descrevem agentes quelantes de Tc-99m para radiomarcação de proteinas.

Rhodes, 1974, Sem. Nucl. Med. 4:281-293, descreve a Marcação de albumina de soro humano com tecnécio-99m.

Khaw et al., 1982, J. Nucl. Med. 23:1011-1019, descrevem métodos para marcação de macromoléculas biologicamente activas com Tc-99m.

Schwartz et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2:333, descrevem um método para marcação de proteinas com Tc-99m utilizando um grupo hidrazinonicotinamida.

Na técnica anterior foram descritas tentativas para radiomarcação de péptidos.

Ege et al., Patente U.S. N° 4832940, descrevem péptidos radiomarcados para obtenção de imagens de linfócitos T 13 localizados.

Morgan et al., Patente U.S. N° 4986979, descrevem métodos para obtenção de imagens de sítios de inflamação.

Flanagan et al., Patente U.S. N° 5248764, descrevem conjugados entre uma unidade quelante radiomarcada e péptidos derivados do factor natiurético.

Ranby et al., 1988, PCT/US88/02276 descrevem um método para detecção de depósitos de fibrina num animal compreendendo um composto radiomarcado ligado covalentemente a fibrina.

Lees et al., 1989, PCT/US89/01854 descrevem péptidos radiomarcados para imagiologia arterial.

Morgan et al., Publicação do Pedido de Patente Internacional WO90/10463 descrevem métodos for obtenção de imagens de sítios de inflamação.

Flanagan et al., Pedido de Patente Europeia N° 90306428.5 descrevem a marcação com Tc-99m de fragmentos de péptidos sintéticos através de um conjunto de moléculas quelantes orgânicas.

Stuttle, Publicação Pedido de Patente Internacional WO 90/15818, descreve a marcação com Tc-99m de oligopéptidos contendo RGD.

Rodwell et al., 1991, PCT/US91/03116, descrevem conjugados de "unidades de reconhecimento molecular" com "domínios efectores".

Cox, Pedido de Patente internacional PCT/US92/04559, 14 descreve derivados de somatostatina radiomarcados contendo dois resíduos de cisteína.

Rhodes et al., Publicação do Pedido de Patente internacional W093/12819, descrevem péptidos compreendendo domínios de ligação a iões metálicos.

Lyle et al., publicação do Pedido de Patente Internacional WO93/15770, descrevem quelantes de Tc-99m e péptidos marcados com Tc-99m.

Coughlin et al., Publicação do Pedido de Patente Internacional W093/21151, descrevem agentes quelantes bifuncionais compreendendo grupos tioureia para radiomarcação de moléculas direccionantes.

Knight et al., 1990, 37th Annual Meeting of the Society of Nuclear Medicine, Abstract #209, reivindicam imagiologia de trombos utilizando péptidos marcados com Tc-99m.

Babich et al., 1993, J. Nucl. Med. 34:1964-1974 descrevem péptidos marcados com Tc-99m compreendendo derivados de hidrazinonicotinamida.

Os métodos para marcação directa de somatostatina, derivados de somatostatina, análogos de somatostatina ou péptidos que se ligam ao receptor de somatostatina e contêm pelo menos 2 resíduos de cisteína que forma um dissulfureto ou em que o dissulfureto está reduzido à forma de sulfidrilo, estão descritos na Patente U.S. N° 5225180 que é propriedade da requerente, publicada em 6 de Julho de 1993, que é aqui dada como integralmente incorporada por citação. A utilização de agentes quelantes para radiomarcação de 15 péptidos, e métodos para marcação de péptidos com Tc-99m são conhecidos do estado da técnica e estão descritos nos Pedidos de Patente U.S. copendentes N°s de Série 07/653012, 07/807062, 07/871282, 07/893981, 07/955466, 08/092355 e 08/095760.

Permanece a necessidade de análogos de somatostatina sintéticos (para tornar praticável a produção em rotina e facilitar a aceitação dos regulamentadores) com estabilidade aumentada in vivo, a ser utilizados terapeuticamente como agentes cintigráficos quando radiomarcados com Tc-99m ou outros radioisótopos detectáveis para utilização na obtenção de imagens de tumores in vivo, e como agentes radioterapêuticos quando radiomarcados com um radioisótopo citotóxico tal como rénio-188. São proporcionados por esta invenção pequenos análogos sintéticos de somatostatina que preenchem especificamente esta necessidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona análogos de somatostatina que compreendem péptidos cíclicos para aplicações terapêuticas, incluindo aplicações radioterapêuticas, e aplicações em diagnóstico, incluindo aplicações em radiodiagnóstico, em particular aplicações de imagiologia cintigráfica. Distintos da somatostatina nativa, os péptidos cíclicos da invenção não contêm uma ligação dissulfureto. A invenção também proporciona reagentes péptidos cíclicos compreendidos por péptidos cíclicos análogos de somatostatina em que esses péptidos incorporam uma unidade de ligação a iões metálicos ligada covalentemente. A invenção proporciona esses péptidos cíclicos, reagentes péptidos cíclicos e reagentes péptidos cíclicos radiomarcados que são agentes de imagiologia cintigráfica, agentes de radiodiagnóstico e agentes radioterapêuticos. Os agentes de imagiologia cintigráfica da invenção compreendem reagentes péptidos cíclicos radiomarcados 16 com um radioisótopo, de um modo preferido tecnécio-99m. Os agentes radioterapêuticos da invenção compreendem reagentes péptidos ciclicos radiomarcados com um radioisótopo citotóxico, de um modo preferido rénio-186 ou rénio-188. Também são proporcionados métodos para a preparação e utilização desses péptidos ciclicos, reagentes péptidos ciclicos e suas formas de realização radiomarcadas. A invenção proporciona composições de matéria compreendendo um péptido de ligação especifica que se liga especificamente a receptores de somatostatina no organismo de um mamífero, ligado covalentemente a uma unidade complexante de iões metálicos. As composições de matéria da invenção têm a fórmula ciclo(N-CR3)-Phe-Tyr-(p-Trp)-Lys-Val-Hcy.(CH2CO.X) em que X é uma unidade complexante de metais com a fórmula (aminoácido)n-B-(aminoácido)m-Z, em que B é uma unidade contendo tiol que é cisteína, homocisteína, isocisteína ou penicilamina; (aminoácido)n e (aminoácido)m são cada um independentemente qualquer a- ou β-aminoácido primário que não compreende um grupo tiol; Z é -OH ou -NH2; e n e m são cada um, independentemente, um número inteiro entre 2 e 5 e 0 e 5, respectivamente.

Nas fórmulas que descrevem as composições de matéria da invenção, a combinação do termo "ciclo" e uma sequência de aminoácidos sublinhada será entendida como significando que a sequência de aminoácidos está ciclizada através de uma ligação peptídica que liga a extremidade amino do primeiro aminoácido da sequência à extremidade carboxilo do último aminoácido da sequência. Quando seguida por um termo entre parêntesis tal como " (CH2CO.X)", o referido termo entre parêntesis será entendido como significando que a sequência em parêntesis está ligada 17 covalentemente ao átomo de enxofre da cadeia lateral de aminoácido do aminoácido contendo tiol na sequência de aminoácidos sublinhada, com ele formando uma ligação sulfureto. Assim, na estrutura química acima, entender-se-á que o grupo -CH2CO.X está ligado covalentemente ao átomo de enxofre da cadeia lateral de homocisteína. Um exemplo de uma dessas fórmulas químicas está ilustrado no Exemplo 2.

As composições de matéria da invenção têm utilidade para vários fins de diagnóstico e terapêuticos.

Assim, um aspecto da invenção proporciona reagentes para preparação de agentes de imagiologia cintigráfica radiomarcados para obtenção de imagens de sítios no corpo de um mamífero com sobre-abundância de receptores de somatostatina. Nessas formas de realização, a unidade que complexa com iões metálicos compreende uma unidade de ligação radiomarcada, e o reagente forma um complexo com o radiomarcador através da formação de um complexo com a referida unidade. Numa forma de realização deste aspecto da invenção, o agente de imagiologia cintigráfica é formado por complexação do reagente com Tc-99m em condições de redução.

Assim, a invenção também compreende agentes de imagiologia cintigráfica que são complexos dos reagentes da invenção com Tc-99m e métodos para radiomarcação dos reagentes. Os complexos radiomarcados com Tc-99m proporcionados pela invenção são formados por reacção dos reagentes da invenção com Tc-99m na presença de um agente redutor. Os agentes redutores preferidos incluem, mas não estão limitados a, ião ditionito, ião estanoso e ião ferroso. Os complexos da invenção também são formados por marcação dos reagentes da invenção com Tc-99m por permuta de ligandos de um complexo de Tc-99m pré-reduzido tal como aqui proporcionado. 18

Os agentes de imagiologia preferidos compreendem complexos de Tc-99m dos reagentes da invenção. A invenção também proporciona kits para preparação de agentes de imagiologia cintigráfica que são os reagentes da invenção radiomarcados com Tc-99m. Os kits para marcação dos reagentes proporcionados pela invenção com Tc-99m são constituídos por um frasco selado contendo uma quantidade pré-determinada de um reagente da invenção e uma quantidade suficiente de agente redutor para marcar o reagente com Tc-99m.

Num segundo aspecto da invenção são proporcionados agentes de imagiologia em que as composições de matéria da invenção são radiomarcadas com um radioisótopo de iodo, de um modo preferido 1-123, 1-125 ou 1-131. A invenção proporciona agentes de imagiologia radioiodados que são complexos dos reagentes da invenção com iodo radiomarcado.

Uma forma de realização preferida dos reagentes proporcionado pela invenção para preparação de agentes de imagiologia radioiodados é um composto tendo a fórmula: ciclo(N- metil)FYWpKV.Hcy. (CH2CO.GGCK.amida) .

Os agentes de imagiologia preferidos compreendem formas de realização radioiodadas deste reagente.

Num terceiro aspecto são proporcionados agentes de imagiologia marcados não radioactivamente compreendendo reagentes que são as composições de matéria da invenção complexadas com um ião metálico ou partícula paramagnéticos. Em formas de realização deste aspecto da invenção, o ião metálico paramagnético está complexado com a unidade complexante de iões metálicos. Em formas de realização onde é utilizada uma partícula, de um modo 19 preferido uma partícula metálica superparamagnética, as composições de matéria da invenção são ligadas à partícula superparamagnética covalentemente ou associativamente utilizando métodos descritos por Weissleder et al. (1992, Radiology 182:381-385) . A invenção proporciona esses agentes de imagiologia para utilização em imagiologia por ressonância magnética. Também são proporcionados métodos para a preparação destes agentes de imagiologia não radiomarcados.

Uma forma de realização preferida dos reagentes proporcionados pela invenção para a preparação desses agentes de imagiologia marcados não radioactivamente é um composto tendo a fórmula: ciclo(N-metil)FYWp.Hcy.(CH2CO.GGCK.amida).

Os agentes de imagiologia marcados não radioactivamente preferidos compreendem complexos com ião férrico deste reagente.

Também são aqui proporcionados agentes terapêuticos. Num quarto aspecto, a invenção proporciona as composições de matéria da invenção não complexadas com um ião metálico como um agente terapêutico per se.

Num quinto aspecto, a invenção proporciona agentes terapêuticos radiomarcados compreendendo um reagente para preparação do agente terapêutico que é uma composição de matéria proporcionada pela invenção. Nessas formas de realização, são proporcionadas composições de matéria da invenção em que a unidade complexante de iões metálicos está complexada com um radioisótopo emissor de partículas β ou um radioisótopo emissor de electrões de conversão. As formas de realização preferidas de radioisótopos emissores de partículas β são rénio-186 e rénio- 20 188. Um radioisótopo emissor de electrões de conversão preferido é estanho-117m. A invenção proporciona esses complexos com radioisótopos das composições de matéria da invenção para tratamento radioterapêutico de células e tecidos patológicos que exprimem receptores de somatostatina, particularmente células neoplásicas e metastáticas. Também são proporcionados métodos para a preparação desses complexos de radioisótopos terapêuticos das composições de matéria da invenção.

Uma forma de realização preferida dos reagentes da invenção proporcionados para a preparação desses agentes radioterapêuticos é um composto tendo a fórmula: ciclo (i\/-metil) FYWpKV. Hcy. (CH2 . CO. GGCK. amida) .

Os agentes radioterapêuticos preferidos compreendem complexos de iões metálicos emissores de partículas β ou emissores de electrões de conversão com este reagente.

Noutro aspecto dos agentes radioterapêuticos da invenção são proporcionados agentes radioterapêuticos em que as composições de matéria da invenção estão radiomarcadas com um radioisótopo de iodo, de um modo preferido 1-125 ou 1-131, ou com astatínio-211. A invenção também proporciona agentes terapêuticos radiomarcados eles próprios, bem como métodos para radiomarcação dos reagentes.

As formas de realização preferidas dos reagentes da invenção proporcionados para a preparação destes agentes terapêuticos radioiodados e radioastatinados são compostos tendo a fórmula: ciclo(N- metil)FYWpKV.Hcy. (CH2CO♦GGCK.amida) .

Os agentes radioterapêuticos preferidos compreendem formas 21 de realização radioiodadas e radioastatinadas deste reagente. São proporcionados agentes terapêuticos que são agentes complexados com átomos de metais, marcados não radioactivamente, compreendendo reagentes que são as composições de matéria da invenção complexadas com um átomo de um metal não radioactivo, tal como cobre, zinco ou rénio. Em formas de realização deste aspecto da invenção, o ião metálico não radioactivo está complexado com a unidade complexante de iões metálicos. A invenção proporciona esses agentes terapêuticos para utilização no tratamento de patologias em que os receptores de somatostatina são sobre expressos nas células constituintes de certos tecidos, e no tratamento de células neoplásicas que hiper exprimem receptores de somatostatina. Também são proporcionados métodos para a preparação destes agentes terapêuticos complexados com um átomo de metal não radiomarcados.

Uma forma de realização preferida dos reagentes da invenção proporcionados para a preparação de agentes terapêuticos marcados não radioactivamente é um composto tendo a fórmula: ciclo(N-metil)FYWpKV.Hcy.(CH2.CO.GGCK.amida).

Os agentes terapêuticos marcados não radioactivamente preferidos compreendem um complexo de rénio deste reagente.

Esta invenção proporciona métodos para a preparação de formas de realização péptidos dos reagentes da invenção por sintese química in vitro. Numa forma de realização preferida, os péptidos são sintetizados por síntese de péptidos em fase sólida.

Esta invenção proporciona métodos para utilização dos agentes de diagnóstico e radiodiagnóstico e agentes terapêuticos e radioterapêuticos da invenção. Para formas de realização 22 radiomarcadas dos agentes da invenção, por exemplo, agentes de imagiologia cintigráfica marcados com Tc-99m, é administrada uma quantidade eficaz em diagnóstico ou terapêutica do agente de diagnóstico ou radiodiagnóstico ou agente terapêutico ou radioterapêutico da invenção. Em formas de realização de radiodiagnóstico, a localização do radiomarcador é detectada utilizando metodologias convencionais tais como cintigrafia gama. Em formas de realização de diagnóstico não radioactivas, a localização dos sitios de acumulação dos agentes de diagnóstico marcados com metais paramagnéticos é alcançada utilizando metodologias de imagiologia por ressonância magnética. Os agentes de imagiologia proporcionados pela invenção têm utilidade na imagiologia de tumores, particularmente para imagiologia de sitios neoplásicos primários e metastásicos em que as referidas células neoplásicas exprimem receptores de somatostatina (SSTR), e em particular as células tumorais primárias e especialmente metastáticas que foram clinicamente recalcitrantes a detecção utilizando metodologias convencionais. Além disso, os agentes de imagiologia da invenção são úteis na detecção de sítios de acumulação de linfócitos T associados a doença ou patologia oculta, e. g., como sucede em doentes que sofrem de tuberculose. A invenção proporciona métodos para utilização dos análogos de somatostatina da invenção para aliviar doenças ou outras enfermidades em animais, de um modo preferido seres humanos. Estas doenças e enfermidades incluem mas, não estão limitadas a, diabetes e retinopatia relacionada com diabetes, cirrose do fígado e infecção pelo vírus da hepatite, úlceras hemorrágicas e outras hemorragia digestiva, pancreatite, doenças do sistema nervoso central, doenças endócrinas, doença de Alzheimer, acromegalia e outras doenças e patologias relacionadas com a produção de níveis inadequados de hormona do crescimento in vivo, e cancro, particularmente os cancros cujo crescimento está dependente ou é influenciado pela produção de hormona do 23 crescimento. As formas de realização não radiomarcadas também têm utilidade para tratamento de enfermidades relacionadas com a hiper expressão de SSTR, tais como diarreia causada por gastrinoma que hiper exprime SSTR. As dosagens dos análogos de somatostatina proporcionados pela invenção podem ser as mesmas que as dosagens de somatostatina nativa correntemente utilizada para tratamento das doenças referidas acima ou de outras doenças, ou podem ser administradas menores quantidades dos compostos da invenção devido à sua semi-vida mais longa in vivo.

As utilizações terapêuticas também incluem ablação radioterapêutica de células malignas neoplásicas e metastáticas em doentes com tumores cujas células exprimem o receptor de somatostatina. A utilização dos agentes radioterapêuticos da invenção inclui utilização terapêutica primária para tumores recalcitrantes a terapêuticas mais convencionais e para tumores que são inoperáveis, bem como terapêuticas adjuvantes suplementares de cirurgia, terapêutica com radiação ou quimioterapia convencional.

As formas de realização radiomarcadas da invenção também têm utilidade como guias cirúrgicos para identificação de tecido tumoral que exprime receptores de somatostatina durante a cirurgia. Para essa utilização em cirurgia orientada por radioisótopos, o tecido maligno de outro modo invisível para o cirurgião pode ser reconhecido e extirpado durante a cirurgia de outro modo convencional.

Formas de realização preferidas especificas da presente invenção tornar-se-ão evidentes da seguinte descrição mais pormenorizada de certas formas de realização preferidas e das reivindicações. 24

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra uma imagem de P587 marcado com 99mTc num rato com um tumor, indicado por uma seta, mostrando absorção elevada no sitio do tumor no membro inferior.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DE FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS A presente invenção proporciona péptidos cíclicos que são análogos de somatostatina e que não compreendem uma ligação dissulfureto. Esses análogos de somatostatina possuem por isso uma estabilidade acrescida in vivo em comparação com somatostatina nativa. Estes péptidos cíclicos são eles próprios agentes terapêuticos para alívio de doenças e outras enfermidades em animais incluindo seres humanos.

Também são proporcionados pela invenção péptidos cíclicos que podem ser radioiodados ou radioastatinados e que são por isso úteis em aplicações radioterapêuticas e de radiodiagnóstico.

Outra forma de realização destes péptidos cíclicos que é proporcionada por esta invenção são reagentes péptidos cíclicos em que os péptidos cíclicos da invenção estão ligados covalentemente a uma unidade complexante de iões metálicos. Esses reagentes péptidos cíclicos são capazes de ser radiomarcados para proporcionar agentes de radiodiagnóstico ou radioterapêuticos. Um exemplo de uma aplicação em radiodiagnóstico utilizando os agentes radiomarcados da invenção é em imagiologia cintigráfica, em que podem ser determinadas a localização e extensão de tumores com receptores de somatostatina. Os reagentes péptidos cíclicos da invenção também podem com vantagem ser radiomarcados com radioisótopos citotóxicos, tais como rénio-186 ou rénio-188 para 25 utilizações radioterapêuticas. Os reagentes péptidos cíclicos da invenção também são úteis na preparação de complexos com metais não radioactivos, sendo os referidos complexos úteis terapeuticamente. A marcação com Tc-99m é uma vantagem da presente invenção porque as propriedades nucleares e radioactivas deste isótopo o tornam num agente de imagiologia cintigráfica ideal. Este isótopo tem uma energia do fotão individual de 140 keV e uma semi-vida radioactiva de cerca de 6 horas, e está prontamente disponível a partir de um gerador de ^9p[0_99mij'C. Também podem ser utilizados outros radionuclidos na prática da invenção tal como aqui descrita. O termo agente de imagiologia cintigráfica tal como aqui utilizado pretende abranger um agente radiomarcado capaz de ser detectado com meios de detecção de radioactividade (incluindo mas não limitado a uma câmara gama, um contador Geiger-Muller e uma sonda detectora de cintilações) .

As formas de realização radioterapêuticas da invenção, por outro lado, são com vantagem marcadas com um radioisótopo acitotóxico, incluindo mas não limitado a cobre-67, iodo-125, iodo-131, rénio-186, rénio-188 e astatínio-211, de um modo mais preferido ou 188^e> Essas formas de realização são úteis no tratamento de doenças ou outras enfermidades relacionadas com somatostatina em animais, de um modo preferido seres humanos, incluindo mas não limitadas a cancro e outras doenças caracterizadas pelo crescimento de tumores malignos ou benignos capazes de se ligar a somatostatina ou análogos de somatostatina através da expressão de receptores de somatostatina à superfície celular das células constituintes desses tumores. 26 A presente invenção proporciona reagentes para preparação de agentes de diagnóstico e de radiodiagnóstico, e agentes terapêuticos e radioterapêuticos. Os reagentes proporcionados pela invenção compreendem uma unidade complexante de iões metálicos ligada covalentemente a um péptido de ligação especifica que se liga aos sitios dos receptores de somatostatina num organismo de mamífero.

Compostos pequenos, de um modo preferido com um peso molecular inferior a 10.000 dalton, têm vantagens comerciais nítidas. Esses compostos pequenos podem ser prontamente produzidos. Além disso, têm a probabilidade de não ser imunogénicos e de ser rapidamente eliminados da vasculatura, permitindo assim uma imagiologia melhor e mais rápida. Em contraste, as moléculas maiores tais como anticorpos ou os seus fragmentos, ou outros péptidos biológicos maiores do que 10.000 dalton, são dispendiosos de produzir e têm probabilidade de ser imunogénicos e de serem eliminados mais lentamente da corrente sanguínea, interferindo assim com diagnósticos rápidos in vivo.

Uma vantagem dos análogos de somatostatina proporcionados por esta invenção é que a ligação cíclica não dissulfureto neles contida é estável nas condições de radiomarcação da unidade ligada covalentemente que se liga a um radiomarcador. Em contrate, por exemplo, a conjugação de Tc-99m a uma unidade que se liga a Tc-99m ligada covalentemente a somatostatina nativa, ou a um análogo de somatostatina com uma ligação dissulfureto, pode resultar na redução do dissulfureto acompanhada por uma perda de actividade biológica. Essa perda de actividade biológica também pode ocorrer in vivo utilizando somatostatina nativa, ou a

qualquer análogo de somatostatina com uma ligação dissulfureto. A presente invenção não está sujeita a perdas semelhantes de actividade biológica in vivo porque as ligações cíclicas não 27 dissulfureto em cada um dos análogos de somatostatina da invenção compreende ligações covalentes estáveis.

Para efeitos desta invenção, o termo "péptido de ligação especifica" pretende significar gualquer composto péptido que se liga especif icamente a um sitio alvo no corpo de um mamífero definido por uma sobre-abundância de moléculas de receptores de somatostatina (SSTR). "Ligação específica" será entendido pelos especialistas nesta matéria como significando que o péptido se localiza em maior extensão no sítio alvo do que nos tecidos circundantes. Essa ligação específica é vantajosa em agentes de imagiologia para diagnóstico compreendendo esses péptidos de ligação específica porque são dispersados através de um corpo de um mamífero após administração e essa localização específica de radioactividade ligada ao reagente proporciona definição visual do alvo in vivo.

Cada forma de realização da invenção contendo um péptido de ligação específica é constituída por uma sequência de aminoácidos. 0 termo aminoácido tal como utilizado nesta invenção pretende incluir todos os aminoácidos l e D/ primários (X e β, de ocorrência natural, modificados, substituídos, alterados e outros. Formas de realização de péptidos de ligação específica dos reagentes da invenção compreendem péptidos de ligação específica com um peso molecular inferior a cerca de 5.000 dalton. Formas de realização particularmente preferidas dos péptidos de ligação específica da invenção incluem péptidos que se ligam especificamente e com afinidade elevada a receptores de somatostatina (SSTR) on células que exprimem SSTR, particularmente células tumorais e células de linfócitos T activados. Os reagentes compreendendo péptidos de ligação específica proporcionados pela invenção incluem, mas não estão limitados a, reagentes compreendendo as seguintes sequências de 28 aminoácidos (os aminoácidos nos péptidos seguintes são l-aminoácidos salvo indicação em contrário): ciclo(U-metil)FYWpKV.Hcy.(CH2CO.GGC.amida) ciclo (A/-metil) FYWpKV. Hcy. (CH2CO. GGCK. amida) ciclo (A/-metil) FYWpKV. Hcy. (CH2CO. GGCR. amida) ciclo(N-metil)FYWpKV.Hcy.(CH2CO.GGCRD.amida) cicl o(N-metil)FYWpKV.Hcy. (CH2CO.GGCRK.amida) cicl o(N-metil)FYWpKV.Hcy. (CH2CO.GGCRR.amida) cicl o(N-metil)FYWpKV.Hcy. (CH2CO.GGCKK.amida) ciclo(N-metil)FYWpKV.Hcy.(CH2CO.GGCKKK.amida) ciclo(N-metil)FYWpKV.Hcy.(CH2CO.GGC.Orn.amida) cicl o(Af-metil)FYWpKV.Hcy. (CH2CO.GGCKDK.amida) cicl o(N-metil)FYWpKV.Hcy. (CH2CO.GGC.Orn.D.Orn.amida) cicl o(Af-metil)FYWpKV.Hcy. (CH2CO.GGC.Orn.D.amida) ciclo(N-metil)FYWpKV.Hcy. (CH2CO.KKC.ami da) ciclo(N-metil)FYWpKV.Hcy. (CH2CO.KRC.ami da) cicl o(Af-metil)FYWpKV.Hcy. (CH2CO.RRC.amida) ciclo(Af-metil)FYWpKV.Hcy.(CH2CO.KKCK.amida) cicl o(Af-metil)FYWpKV.Hcy. (CH2 CO.GRCK.amida) cicl o(N-metil)FYWpKV.Hcy. (CH2 CO.GKCR.amida) (As abreviaturas com uma só letra para os aminoácidos podem ser encontradas em Zubay, ibid., p. 33; as outras abreviaturas são como na legenda da Tabela I). Esta lista de reagentes proporcionados pela invenção é ilustrativa e não pretende ser limitativa ou exclusiva, e será entendida pelos especialistas na matéria que reagentes compreendendo combinações dos péptidos aqui descritos ou os seus equivalentes podem estar ligados covalentemente a qualquer das unidades quelantes da invenção e estão dentro do seu âmbito. 29

Numa forma de realização preferida, o reagente da invenção tem a fórmula:

Os péptidos de ligação específica que constituem os reagentes da presente invenção podem ser sintetizados quimicamente in vitro. Esses péptidos podem genericamente com vantagem, ser preparados num sintetizador de péptidos. Podem ser sintetizados péptidos desta invenção em que a unidade complexante de iões metálicos está ligada covalentemente ao péptido durante a síntese química in vitro, utilizando técnicas aqui descritas (ver, por exemplo, Exemplo 2, subsecção 0).

Em formas de realização da invenção de imagiologia cintigráfica, é formado um complexo de tecnécio-99m com os reagentes desta invenção. Para realizar isto, faz-se reagir Tc-99m, de um modo preferido como um sal de pertecnetato de Tc-99m, com os reagentes desta invenção na presença de um agente redutor. Os agentes redutores preferidos são ditionite, iões estanoso e ferroso; o agente redutor mais preferido é um sal estanoso tal como cloreto estanoso. Numa forma de realização preferida adicional, o agente redutor é um agente redutor em fase sólida. 30

Os complexos e os meios para a preparação desses complexos são convenientemente proporcionados numa forma de kit compreendendo um frasco selado contendo uma quantidade pré-determinada de um reagente da invenção a ser marcado e uma quantidade suficiente de agente redutor para marcar o reagente com Tc-99m. Alternativamente, o complexo pode ser formado por reacção do reagente desta invenção com um complexo de tecnécio lábil pré-formado e outro composto conhecido como um ligando de transferência (tal como tartarato, citrato, gluconato ou manitol, por exemplo). Este processo é conhecido como permuta de ligandos e é bem conhecido pelos especialistas na matéria. Entre os sais pertecnetato de Tc-99m úteis com a presente invenção estão incluídos os sais de metais alcalinos, tais como o sal de sódio, ou sais de amónio ou de alquilamónio inferiores.

Os agentes de imagiologia cintigráfica marcados com tecnécio-99m de acordo com a presente invenção podem ser preparados pela adição de uma quantidade apropriada de Tc-99m ou de complexo de Tc-99m aos frascos e reacção em condições aqui descritas no Exemplo 3 adiante. 0 kit também pode conter materiais adjuvantes farmacêuticos convencionais tais como, por exemplo, sais farmaceuticamente aceitáveis para ajustar a pressão osmótica, tampões, conservantes e semelhantes. Os componentes do kit podem estar em forma líquida, congelada ou seca. Numa forma de realização preferida, os componentes do kit são proporcionados em forma liofilizada. Os reagentes radiomarcados para imagiologia cintigráfica de acordo com a presente invenção podem ser preparados por reacção nas condições aqui descritas no Exemplo 3 adiante.

Os reagentes marcados radioactivamente proporcionados pela presente invenção são proporcionados com uma quantidade adequada de radioactividade. Na formação, por exemplo, de complexos radioactivos de Tc-99m, é geralmente preferido formar complexos 31 radioactivos em soluções contendo radioactividade a concentrações desde cerca de 0,01 milicurie (mCi) a 100 mCi por mL.

Os reagentes de imagiologia proporcionados pela presente invenção podem ser utilizados para visualização de órgãos, tais como o rim para diagnóstico de patologias nesses orgãos, e tumores, em especial tumores gastrointestinais, mielomas, carcinoma do pulmão de células pequenas e outros APUDomas, tumores endócrinos tais como carcinomas medulares da tiróide e tumores da pituitária, tumores cerebrais, tais como meningiomas e astrocitomas, e também podem ser visualizados tumores da próstata, mama, cólon e ovários. De acordo com esta invenção, os reagentes péptidos marcados com Tc-99m são administrados numa única dose unitária injectável. Os reagentes péptidos marcados com Tc-99m proporcionados pela invenção podem ser administrados intravenosamente em qualquer meio convencional para injecção intravenosa tal como meio salino aquoso, ou em meio de plasma sanguíneo. Genericamente, a dose unitária a ser administrada tem uma radioactividade de cerca de 0,01 mCi a cerca de 100 mCi, de um modo preferido 1 mCi a 20 mCi. A solução a ser injectada com a dosagem unitária é desde cerca de 0,01 mL a cerca de 10 mL. Após administração intravenosa, a imagiologia in vivo pode ter lugar numa questão de alguns minutos. Contudo, a imagiologia pode ter lugar, se desejado, horas ou mais tarde, após o péptido radiomarcado ter sido injectado num doente. Na maior parte dos casos, uma quantidade suficiente da dose administrada acumular-se-á na área de que se pretende obter a imagem dentro de cerca de 0,1 até uma hora para permitir a obtenção de cintigrafias. Pode ser utilizado qualquer método de imagiologia cintigráfica convencional para fins de diagnóstico de acordo com esta invenção.

Os péptidos cíclicos que se ligam a receptores de somatostatina e os complexos de metais não radioactivos dos 32 reagentes péptidos cíclicos da invenção podem ser utilizados clinicamente como agentes terapêuticos para promover a regressão de certos tipos de tumores, particularmente os gue exprimem receptores de somatostatina. Os péptidos cíclicos análogos de somatostatina da invenção também podem ser utilizados para reduzir a hipersecreção hormonal que frequentemente acompanha certos cancros, tais como os APUDomas. Os péptidos da invenção utilizados como agentes terapêuticos podem ser administrados por qualquer via apropriada, incluindo intravenosa, intramuscular ou oral, e em qualquer veículo farmacêutico aceitável, em doses na gama desde cerca de 0,1 a cerca de 49 mg/kg de peso corporal/dia.

Esta invenção também proporciona péptidos radiomarcados com radioisótopos citotóxicos tais como rénio-186 ou rénio-188 que podem ser utilizados para radioterapia de certos tumores como descrito acima. Para este fim, pode ser administrada uma quantidade de isótopo radioactivo desde cerca de 10 mCi a cerca de 200 mCi através de qualquer via clínica adquada, de um modo preferido por injecção intravenosa.

Os métodos de preparação e marcação destes compostos estão ilustrados de forma mais completa nos Exemplos seguintes. Estes Exemplos ilustram certos aspectos do método descrito e resultados vantajosos descritos acima, e são apresentados a título ilustrativo e não limitativo. EXEMPLO 1 Síntese de Péptidos em Fase Sólida A síntese de péptidos em fase sólida (SPPS) foi realizada numa escala de 0,25 milimoles (mmoles) utilizando um Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems Modelo 431A e utilizando 33 protecção do terminal amino com 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), condensação com diciclo-hexil- carbodiimida/hidroxibenzotriazole ou hexafluorofosfato de 2-(lH-benzo-triazol-l-il)-1.1.3.3-tetrametilurónio/hidroxibenzotriazole (HBTU/HOBT), e utilizando p-hidroximetil-fenoximetilpoliestireno (HMP) ou resina Sasrin™ para ácidos na extremidade carboxilo ou resina amida Rink para amidas na extremidade carboxilo.

Fmoc.Hcy(S-tritilo) e Fmoc.Pen(S-tritilo) foram preparados a partir do aminoácido apropriado por tritilação com trifenilmetanol em ácido trifluoroacético, seguida por derivatização com Fmoc como descrito por Atherton et al. (1989,

Solid Phase Peptide Synthesís, IRL Press: Oxford) e ainda no Exemplo 2, subsecção J adiante. A Fmoc-S-(3-Boc-aminopropil)-cisteína foi preparada a partir de L-cisteína e brometo de Boc-aminopropilo em metóxido de sódio metanólico seguido por tratamento com carbonato de O-9-fluorenilmetil-O' -N-succcinimidilo (FmocOSu) a pH 10.

Os grupos 2-halogenoacetilo foram introduzidos por utilização do ácido 2-halogenoacético apropriado como o último residuo a ser condensado durante a SPPS ou por tratamento do amino livre da extremidade N do péptido ligado à resina com ácido 2-halogenoacético/diisopropilcarbodiimida/i\f-hidroxi-succinimida em NMP ou anidrido 2-halogenoacético/ diisopropiletilamina em NMP.

Fez-se reagir os péptidos contendo tiol com unidades complexantes de Tc-99m protegidas com tiol e contendo cloroacetilo a pH 10 durante 0,5-24 horas à temperatura ambiente, opcionalmente seguido por acidificação com ácido acético e evaporação da solução para dar o correspondente aduto péptido-sulfureto, como descrito com mais pormenor no Exemplo 2, 34 subsecção 0 adiante. A desprotecção e purificação foram realizadas em rotina como descrito para dar o conjugado quelante-péptido.

Os péptidos ligados a resina Sasrin™ foram clivados utilizando uma solução de TFA a 1% em diclorometano para dar o péptido protegido.

Quando apropriado, os precursores do péptido protegido foram ciclizados entre as extremidades amino e carboxilo por reacção da amina livre da extremidade amino de cadeia lateral protegida e do ácido livre da extremidade carboxilo utilizando difenilfosforilazida, como descrito com mais pormenor no Exemplo 2, subsecção M adiante.

Os produtos ligados a HMP ou resina amida Rink foram clivados de forma corrente e os péptidos ciclizados protegidos foram desprotegidos utilizando uma solução constituída por ácido trifluoroacético (TFA), ou TFA e cloreto de metileno, opcionalmente compreendendo água, tioanisole, etanoditiol, e triisopropilsilano nas proporções de 100:5:5:2,5:2, durante 0,5-3 horas à temperatura ambiente. Quando apropriado, os produtos foram re-S-tritilados em trifenolmetanol/TFA, e os grupos N-Boc re-introduzidos no péptido utilizando (Boc)20·

Os péptidos em bruto foram purificados por cromatografia liquida de alta pressão preparativa (HPLC) utilizando uma coluna C18 Waters Delta-Pak e eluição com gradiente de 0,1% de TFA em água modificada com acetonitrilo. Após eluição da coluna, o acetonitrilo foi evaporado das fracções eluidas, que foram então liofilizadas. A identidade de cada produto assim produzido foi confirmada por espectrometria de massa com bombardeamento por átomos rápidos (FABMS) ou espectroscopia de massa com electropulverização (ESMS). 35 EXEMPLO 2 Síntese de ciclo(N-CH3)fenilalanil-tirosil-p-triptofanil-lisil-valil-homocisteína.S-2-acetil-glicil-glicil-cisteinil-lisinamida (P587) A. Síntese de W-a-carbobenzoxi-W-ε-terc-butoxicarbonil- lisina, éster de N-hidroxi-succinimida A uma mistura de N-a-carbobenzoxi-.N-ε-terc-butoxicarbonil lisina (23 g, 60,5 mmol) e N-hidroxissuccinimida (7,1 g, 61,7 mmol) em 180 mL de tetra-hidrofurano (THF) seco arrefecida num banho de água fria adicionou-se diisopropilcarbodiimida (9,66 mL, 61,7 mmol). Esta mistura reaccional foi agitada de um dia para o outro e depois filtrada e o filtrado evaporado. O residuo do filtrado foi então redissolvido num mínimo de acetato de etilo, 200 mL de éter e 200 mL de hexanos. O composto em epígrafe precipitou desta mistura e foi recuperado por filtração, lavado com hexanos frios e seco para dar 28,1 g (58,9 mmol, 97% de rendimento). B. Síntese de W-a-carbobenzoxi-W-ε-terc-butoxicarbonil- lisil- valina, éster metílico A uma solução de éster metílico de valina (8,38 g, 50 mmol) e diisopropiletilamina (12,7 mL, 50 mmol) em 150 mL de THF adicionou-se I7-a-carbobenzoxi-.A^- terc-butoxicarbonil lisina, éster de N-hidroxissuccinimida (23,9 g, 50 mmol), seguido por mais 50 mL de THF. Após 2 h o solvente foi removido por evaporação e adicionou-se 50 mL de acetato de etilo ao resíduo. 36

Esta solução foi lavada sequencialmente com 200 mL de ácido cítrico a 5%, 200 mL de bicarbonato de sódio saturado e 200 mL de solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca sobre sulfato de magnésio anidro, filtrada e evaporada. O óleo resultante foi dissolvido no minimo de acetato de etilo, 200 mL de éter e 200 mL de hexanos. O composto em epígrafe foi isolado por filtração e seco para dar 20 g (40,5 mmol, 81% de rendimento). C. Sintese de Ν-ε-terc-butoxicarbonil-lisil-valina, éster metilico A uma solução de N-a-carbobenzoxi-N-e-terc-butoxicarbonil-lisil-valina, éster metilico (19 g, 38,5 mmol) e ácido acético (1 mL) em 100 mL de acetato de etilo adicionou-se catalisador de paládio a 10% sobre carvão (0,19 g) e agitou-se em atmosfera de hidrogénio de um dia para o outro. A mistura reaccional foi então filtrada através de Celite, o filtrado evaporado e o resíduo redissolvido em 100 mL de metanol contendo 1 mL de ácido acético. A esta solução adicionou-se paládio a 10% sobre carvão (0,19 g) e a mistura foi hidrogenada a uma pressão de 45 libras por polegada quadrada durante 2 h utilizando um hidrogenador Parr. A mistura reaccional foi novamente filtrada através de Celite e o filtrado evaporado para dar 13,56 g do composto em epígrafe (37,7 mmol, 98% de rendimento). D. Sintese de fluorenilmetoxicarbonil-D-triptofano, éster de W-hidroxissuccinimida A uma solução de hemidrato de N-a-fluorenilmetoxicarbonil-triptofano (25 g, 82,1 mmol) e N-hidroxissuccinimida (9,78 g, 85 mmol) em 250 mL de THF seco arrefecida num banho de água fria adicionou-se diisopropilcarbodiimida (13,3 mL, 85 mmol). A mistura reaccional foi agitada de um dia para o outro, filtrada e 37 o filtrado evaporado. 0 resíduo foi então redissolvido em tolueno e hexanos. 0 composto em epígrafe foi isolado por filtração e seco para dar 34 g (66,5 mmol, 81% de rendimento). E. Síntese de fluorenilmetoxicarbonil-D-triptofanil-W-ε-terc- butoxi-carbonil-lisil-valina, éster metílico A uma mistura de N-E-terc-butoxicarbonil-lisil-valina, éster metílico (13 g, 36,1 mmol) em 200 mL de THF adicionou-se fluorenilmetoxicarbonil-D_triptofano, éster de N-hidroxissuccinimida (18,9 g, 36,1 mmol). Adicionou-se diisopropiletilamina para ajustar o pH da mistura reaccional a pH 8, e a reacção foi agitada durante 2 dias. O solvente foi então removido por evaporação e o resíduo redissolvido em acetato de etilo, lavado com ácido cítrico a 5%, bicarbonato saturado e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, e depois seco sobre sulfato de sódio. A solução foi então filtrada e evaporada e o resíduo redissolvido em acetato de etilo. O composto em epígrafe foi recuperado de várias cristalizações desta solução para dar 17,3 g de produto (22,5 mmol, 62% de rendimento). F. Síntese de N- fluorenilmetoxicarbonil-O-terc- butiltirosina, éster de W-hidroxissuccinimida A uma solução de N-d-fluorenilmetoxicarbonil-O-terc-butiltirosina (25 g, 54,3 mmol) e N-hidroxissuccinimida (6,62 g, 57,5 mmol) em 250 mL de THF seco arrefecido num banho de água fria adicionou-se diisopropilcarbodiimida (9,0 mL, 57,5 mmol). A mistura reaccional foi agitada de um dia para o outro, filtrada e o filtrado evaporado. O resíduo foi então redissolvido em tolueno e hexanos. O composto em epígrafe foi isolado por filtração e seco para dar 27,7 g (49,7 mmol, 92% de rendimento). 38 G. Síntese de W-fluorenilmetoxicarbonil-O-terc-butiltirosil- D-triptofanil-W-ε-terc-butoxicarbonil-lisil-valina, éster metílico

Fluorenilmetoxicarbonil-D-triptof anil-IV-e-terc-butoxicarbonil-lisil-valina, éster metílico (17 g, 22,1 mmol) foi tratada com 40 mL de dietilamina e 40 mL de THF à temperatura ambiente durante 1,5 h. A mistura reaccional foi então evaporada, ressuspensa em 100 mL de THF e re-evaporada três vezes. O resíduo foi retomado em 120 mL de THF e adicionou-se N-fluorenilmetoxicarbonil-O-terc-butiltirosina, éster de N- hidroxissuccinimida (12,3 g, 22,1 mmol), seguido por 20 mL de THF seco e 4 mL de diisopropiletilamina resultando numa solução com um pH de 9. Após agitação de um dia para o outro, a reacção foi evaporada e o resíduo retomado em acetato de etilo. A solução de acetato de etilo foi lavada com ácido cítrico a 5%, bicarbonato de sódio saturado e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, depois seca sobre sulfato de magnésio e evaporada. O resíduo foi retomado em acetato de etilo, éter e hexanos e o composto em epígrafe precipitou. O composto precipitado foi isolado por filtração e seco para dar 14,6 g do composto em epígrafe (14,8 mmol, 67% de rendimento). H. Síntese de W-fluorenilmetoxicarbonil-W-metilfenilalanina, éster de N-hidroxíssuccinimida A uma solução de N-U-fluorenilmetoxicarbonil-W- metilfenilalanina (25 g, 62,3 mmol) e N-hidroxissuccinimida (7,5 g, 65 mmol) em 180 mL de THF seco arrefecido num banho de água

fria adicionou-se diisopropilcarbodiimida (10 mL, 64,2 mmol). A mistura reaccional foi agitada de um dia para o outro, filtrada e o filtrado evaporado. O resíduo foi então redissolvido em tolueno 39 e hexanos. 0 composto em epígrafe foi isolado por filtração e seco para dar 28,3 g (57 mmol, 91% de rendimento). I. Síntese de N-fluorenilmetoxicarbonil-íí-metilfenilalanina-0- terc-butil-tirosil-D-triptofanil-W-ε- terc-butoxicarbonil-lisil-valina, éster metílico

Fluorenilmetoxicarbonil-O-terc-butil-tirosil-D_triptofanil- Ν-ε-terc-butoxicarbonil-lisil-valina, éster metílico (14 g, 14,2 mmol) foi tratado com 35 mL de dietilamina e 35 mL de THF à temperatura ambiente durante 1 h. A mistura reaccional foi então evaporada, ressuspensa em 100 mL de THF e re-evaporada três vezes. O resíduo foi retomado em acetato de etilo e hexanos. O produto, O- terc-butiltirosil-D-triptof anil-A/-8- terc- butoxicarbonil-lisil-valina, éster metílico, foi precipitado, isolado por filtração e seco para dar 9,7 g (12,7 mmol, 90% de rendimento). O 0-terc-butiltirosil-D-triptofanil-W-ε-terc- butoxicarbonil-lisil-valina, éster metílico, foi dissolvido em 35 mL de THF seco e adicionou-se N-fluorenilmetoxicarbonil-N-metilfenilalanina, éster de N-hidroxissuccinimida (6,35 g, 14,2 mmol), seguida por 3 mL de diisopropiletilamina resultando numa solução com um pH de 9. Após agitação de um dia para o outro, a reacção foi evaporada e o resíduo retomado em acetato de etilo. A solução de acetato de etilo foi lavada com ácido cítrico a 5%, bicarbonato de sódio saturado e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, depois seca sobre sulfato de magnésio e evaporado. O resíduo foi retomado em acetato de etilo, éter e hexanos e o composto em epígrafe precipitou. O composto precipitado foi isolado por filtração e seco para dar 12,4 g do composto em epígrafe (11,5 mmol, 81% de rendimento). J. Síntese de N-fluorenilmetoxicarbonil-S-tritil- 40 homocisteina a. A cerca de 400 mL de amoníaco líquido arrefecido a -78 °C num banho de gelo seco/etanol adicionou-se pequenas quantidades de sódio elementar seguido por uma quantidade suficiente de homocisteina para desactivar a cor azul resultante da solução de sódio/amoníaco até 5,7 g (248 mmol) de sódio e 9,75 g (36,3 mmol) de homocisteina terem sido consumidos e a cor azul da solução de sódio/amoníaco ter persistido durante cerca de 15 min. Adicionou-se cloreto de amónio (0,5 g) para desactivar a cor azul final, e em seguida a reacção foi retirada do banho de arrefecimento e o amoníaco deixado evaporar sob um caudal de árgon. O balão foi aquecido ligeiramente para remover essencialmente todo o amoníaco residual.

Ao resíduo adicionou-se trifenilmetanol (23,6 g, 91 mmol) e o balão de reacção foi arrefecido num banho de gelo/água. Adicionou-se 250 mL de ácido trifluoroacético (TFA) e após 30 min a mistura foi evaporada e o resíduo redissolvido e re-evaporado três vezes com clorofórmio. O resíduo foi então redissolvido em 300 mL água e o pH ajustado para pH 4 com ácido cítrico a 5% e KOH 1 Μ. O produto precipitou como uma goma e foi recolhida por filtração. O resíduo foi então triturado com éter para dar S-tritil-homocisteína (7 g, 18,6 mmol, 26% de rendimento). Foi isolada uma segunda colheita do filtrado por cristalização de dimetilformamida (DMF)/água para dar um rendimento combinado de 24,2 g (64 mmo1, 89%). b. A uma solução de S-tritil-homocisteína (20 g, 53 mmol) em 150 mL de acetona/100 mL de água adicionou-se carbonato de sódio (11,5 g, 109 mmol) e depois O-fluorenilmetil-0'-(N- succinimidil)carbonato (17,5 g, 52 mmol) dissolvido em 200 mL de

acetona, sendo estas adições feitas ao longo de cerca de 1 h. A mistura reaccional foi então agitada durante cerca de 2 dias e em 41 seguida os solventes orgânicos foram evaporados. Ao residuo aguoso adicionou-se 300 mL de acetato de etilo e a mistura foi acidificada com HC1 1 Μ. A fase orgânica foi separada e lavada sequencialmente com HC1 1 M, HC1 0,5 M e HC1 0,25 M, depois seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e evaporada. O produto em bruto foi cromatografado em gel de silica (100% de clorofórmio -3% de metanol em clorofórmio) para dar o composto em epígrafe (19,4 g, 32 mmol, 62% de rendimento). K. Síntese de N- fluorenilmetoxicarbonil-S-tritil- homocisteina-N-metil-fenilalanina-0- terc-butiltirosil-D- triptofanil-.Ν-ε- terc-butoxicarbonil-lisil-valina, éster metílico

Fluorenilmetoxicarbonil-i7-metilf enilalanina-O- terc-butil-tirosil-D-triptofanil-W-ε-terc-butoxicarbonil-lisil-valina, éster metílico (9,8 g, 8,5 mol) foi tratado com 28 mL de dietilamina e 30 mL de THF à temperatura ambiente durante 1 h. A mistura reaccional foi então evaporada, ressuspensa em 100 mL de THF e re-evaporada três vezes. O resíduo foi retomado em acetato de etilo e hexanos. O produto, I7-metilf enilalanina-O-terc- butiltirosil-D-triptofanil-17-ε-terc-butoxicarbonil-lisil-valina, éster metílico foi precipitado, isolado por filtração e seco para dar 4,9 g (8,1 mmol, 95% de rendimento). A uma solução de N-fluorenilmetoxicarbonil-S-tritil-homocisteína em 50 mL de THF seco arrefecida num banho de

arrefecimento a -15 °C adicionou-se cloreto N,N'-bis(2-oxo-3-oxazolidinil) fosfínico (BOP-C1; 2,47 g, 9,7 mmol) e 1,7 mL de diisopropiletilamina (9,7 mmol) e a mistura reaccional foi agitada durante 30 min. Adicionou-se N-metilfenilalanina-O-terc-butiltirosil-D-triptofanil-W-ε-terc-butoxicarbonil-lisil-valina, éster metílico (7,48 g) em 50 mL de THF seco, seguido por 1,7 mL 42 adicionais de diisopropiletilamina. O volume da reacção foi reduzido em 50% por evaporação e depois agitado durante 2 dias à temperatura ambiente. O solvente foi removido por evaporação e o resíduo redissolvido em acetato de etilo, lavado com ácido cítrico a 5%, bicarbonato de sódio saturado e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, e seco sobre sulfato de magnésio. O resíduo foi retomado em acetato de etilo, éter e hexanos e o composto em epígrafe precipitou. O composto precipitado foi isolado por filtração para dar 10,2 g (6,77 mmol, 84% de rendimento). L. Síntese de S-tritil-homocisteina-N-metilfenilalanina-O-terc-butil-tirosil-D-triptofanil-W-ε-terc-butoxicarbonil-lisil-valina

Uma solução de N-fluorenilmetoxicarbonil-S-tritil-homocisteína-N-metilfenilalanina-O-terc-butil-tirosil-D- triptofanil-Ν-ε-terc-butoxicarbonil-lisil-valina, éster metilico (10 g, 6,6 mmol) e LÍOH.2H20 em 50 mL de THF e 4 mL de água foi agitada durante 3 dias. Adicionou-se mais 25% molar de LÍOH.2H20 e duas horas mais tarde o solvente foi evaporado e o resíduo redissolvido em acetato de etilo. Esta solução foi então lavada com ácido cítrico a 5%, bicarbonato de sódio saturado e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e evaporada. O resíduo foi redissolvido em acetato de etilo, éter e hexanos e o composto em epígrafe precipitou e foi isolado por filtração e seco. O produto impuro resultante foi submetido a cromatografia flash em gel de sílica utilizando clorofórmio/10% de metanol em clorofórmio para dar 3,46 g do composto em epígrafe puro (47 mmol, 41% de rendimento). M. Síntese de ciclo-W-metilfenilalanina-O-terc-butiltirosil- 43 p-triptofanil-Ν-ε-terc-butoxicarbonil-lisil-valil-S-tritil-homocisteina

Uma solução de S-tritil-homocisteína-N-metilfenilalanina-O-terc-butil-tirosil-D_triptofanil-//-8-terc-butoxicarbonil-lisil-valina (3,42 g, 2,69 mmol) dissolvida em 1740 mL de DMF foi arrefecida num banho de água gelada e adicionou-se 1,16 mL de diisopropiletilamina e difenil fosforilazida (DPPA; 5,4 g, 1,16 mmol). A reacção foi incubada a -20 °C durante 5 dias e adicionou-se mais 25% molar de DPPA, seguidos por mais 100% molar de diisopropiletilamina. O solvente DMF foi então removido por evaporação e o composto em epígrafe em bruto cristalizado de acetato de etilo, éter e hexanos para dar 2,43 g (1,9 mmol, 69%). N. Síntese de ciclo-N-metilfenilalanil-tirosil-p- triptofanil-lisil-valil-S-tritil-homocisteina ciclo-S-tritil-homocisteína-N-metilfenilalanina-O-terc-butil-tirosil-p-triptofanil-Ν-ε-terc-butoxicarbonil-lisil-valina (2,34 g, 1,9 mmol) foi tratada com 18,7 mL de TFA, 2 mL de diclorometano, 0,94 mL de água, 0,47 mL de etanoditiol e 0,37 mL de triisopropilsilano durante 1 h à temperatura ambiente, o TFA foi removido por evaporação e o resíduo redissolvido e re-evaporado de clorofórmio três vezes. O resíduo foi então redissolvido em 10 mL de clorofórmio e vertido em 400 mL de éter frio. O produto em bruto precipitado foi recolhido por filtração e purificado por HPLC de fase inversa preparativa numa coluna C18 (utilizando um gradiente de 30% de acetonitrilo-60% de acetonitrilo em água, contendo todos os solventes 0,1% de TFA) para dar o composto em epígrafe (1 g, 1,2 mmol, 62% de rendimento). A análise por espectrometria de massa com bombardeamento por átomos rápidos (FABMS) deu um MH+ de 855, 44 comparado com o valor teórico (média) previsto de 855,09. O. Síntese de ciclo-^-metilfenilalanil-tirosil-p-triptofanil-lisil-valil-5-tritil-homocisteína, S-2-acetil-glicil-glicil-cisteinil-lisinamida (P587) ciclo-N-metilfenilalanil-tirosil-D-triptofanil-lisil-valil-homocisteína (250 mg, 0,29 mmol) e 2-cloroacetil-glicil-glicil-S-tritil-cisteinil-lisilamida (preparada por SPPS como descrito no Exemplo 1: 238 mg, 0,35 mmol) foram dissolvidas em 7 mL de acetonitrilo e 7 mL de uma solução de 100 mM de carbonato de sódio/0,5 mM de EDTA, pH 10 e agitadas de um dia para o outro. A mistura reaccional foi então evaporada até à secura e desprotegida em TFA contendo triisopropilsilano como descrito acima no Exemplo 1. O composto em epigrafe foi então purificado por HPLC de fase inversa para dar 92,4% do rendimento teórico esperado. A análise por espectrometria de massa com bombardeamento por átomos rápidos deu um MH+ de 1258, comparado com o valor teórico (média) previsto de 1257,70. A estrutura deste produto, designado P587, é representada pela fórmula: 45 CH2C0-Gly-Gly-Cys-Lys-amida /

EXEMPLO 3 Métodos Gerais para Radiomarcagão 0,1 mg de um reagente péptido preparado como no Exemplo 1 foi dissolvido em 0,1 mL de água, ou cloreto de sódio a 0,9%, ou hidroxipropilciclodextrina (HPCD) a 10%, ou etanoltágua 50:50, ou soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), ou tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH = 5, 6 ou 7,4). Preparou-se gluceptato de Tc-99m por reconstituição de um frasco de Glucoscan 46 (E.I. DuPont de Nemours, Inc., Wilmington, DE) com 1,0 mL de pertecnetato de sódio e Tc-99m contendo até 200 mCi e deixou-se em repouso durante 15 minutos à temperatura ambiente. 25 pL de gluceptato de Tc-99m foram então adicionados ao reagente e a reacção foi deixada decorrer à temperatura ambiente ou a 100 °C durante 5-30 min e depois filtrada através de um filtro de 0,2 pm. A pureza do reagente péptido marcado com Tc-99m foi determinada por HPLC utilizando as seguintes condições: uma coluna analitica Waters Delta-Pak RP-18, com as dimensões de 5 pm x 4,6 mm x 220 mm, foi carregada com cada péptido radiomarcado, que foram então eluidos a um caudal de solvente de 1 mL/min. A eluição de gradiente foi realizada durante 10-20 min utilizando um gradiente linear começando com 100% de Solvente A (0,1% de TFA/água) e terminando com 100% de Solução B (0,1% de TFA/90% de acetonitrilo/água) . Os componentes radioactivos foram detectados por um detector radiométrico em linha ligado a um registador-integrador. O gluceptato de Tc-99m e o pertecnetato de sódio e Tc-99m eluem entre 1 e 4 minutos nestas condições, enquanto que o péptido marcado com Tc-99m eluiu após uma periodo de tempo muito maior. A Tabela seguinte ilustra a marcação com êxito de péptidos com Tc-99m preparados de acordo com o Exemplo 1 utilizando o método aqui descrito. 47

TABELA I Péptidos ciclo(N-metil)FYWpKV.Hcy. (CH2CO.GGC.amida) ciclo (N-metil) FYWpKV. Hcy. (CH2CO.GGCK.amida) ciclo (Jf-metil) FYWpKV. Hcy. (CH2CO.GGCR.amida) ciclo(N-metil)FYWpKV.Hcy. (CH2CO.GGCKK.amida) ciclo(N-metil)FYWpKV.Hcy. (CH2CO.GGC.Orn.amida) FABMS MH+ 1129 1258 1285 1386 1244

Rendimento Radioquimico (%)*982992 991 N. D.983 HPLC RT(min) 15,1, 17,2 15.0 15.1 N. D. 7,0 * Os índices superiores referem-se às seguintes condições de marcação: 1 = em 10% de HPCD à temperatura ambiente 2 = em etanol/água 50/50 à temperatura ambiente 3 = em NaCl a 0,9% a 100 °C Métodos de HPLC (indicados por um índice superior após Rt) : Coluna Waters-1, 100% de Solução A -> 100% de Solução B em 10 min As abreviaturas com uma só letra para os aminoácidos podem ser encontradas em Zubay, ibid. p. 33. 0 sublinhado indica a formação de uma ligação amida ou tiol entre os aminoácidos ligados dos grupos derivatizados. Acm é acetamidometilo; Orn é ornitina; Fp é p-fenilalanina; Υρ é p-tirosina; Wp é p-triptofano; Apc = p-[S-(3-aminopropil)cisteína; e Hcy é homocisteína. A radioiodação e radioastatinação são realizadas como descrito por Seevers et al. (1982, Chem. Rev. 82:575-590).Os complexos de rénio não radioactivos foram preparados por 48 co-dissolução dos reagentes péptidos da invenção com cerca de um equivalente molar de oxotetra-bromorrenato (+5) de tetrabutilamónio, preparado como descrito por Cotton et al. (1966, Inorg. Chem. 5: 9-16) em dimetilformamida ou acetonitrilo/água, e agitados durante 0,5-5 dias. Os complexos de rénio foram isolados por HPLC de fase inversa como descrito acima para péptidos marcados com Tc-99m e foram caracterizados por FABMS ou ESMS.

Os complexos de rénio radioactivos, utilizando por exemplo Re-186 ou Re-188, são preparados a partir dos sais perrenato apropriados utilizando o mesmo protocolo que para a marcação com Tc-99m, ou por adição de um agente redutor a uma solução do péptido e perrenato, ou opcionalmente utilizando um agente de transferência de ligandos tal como citrato e incubando a reacção a uma temperatura entre a temperatura ambiente e 100 °C durante entre 5 e 60 min. EXEMPLO 4

Inibição da Ligação de [125j_Tyrll]Somatostatina-14 a

Membranas Celulares de Tumor do Pâncreas do Rato AR42J A aptidão de vários reagentes de ligação a receptores de somatostatina da invenção para se ligarem a receptores de somatostatina in vitro foi demonstrada num doseamento da inibição da ligação mediada por reagente péptido de um análogo de somatostatina radiomarcada a membranas celulares contendo receptores de somatostatina. A linha celular AR42J de tumor de pâncreas do rato que exprime o receptor de somatostatina foi cultivada em meio 49 essencial modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 8 mM de glutamina numa atmosfera humidificada com 5% de C02 a 37 °C. As células colhidas foram homogeneizadas em tampão frio (50 mM de Tris-HCl, pH 7,4), e o homogeneizado foi então centrifugado a 39.000 g durante 10 min a 4 °C. Os sedimentos foram lavados uma vez com tampão e depois ressuspensos em tampão Tris-HCl 10 mM gelado (pH 7,4). Alíquotas iguais desta preparação de membranas celulares foram então incubados com [ 125 j_ij·yr 11 ] soma10sta.tina — 14 (Amersham, Arlington Heights, IL) numa concentração final de 0,5 nM a 750.000 cpm/mL, actividade especifica de 2000 Ci/mmol e ou um péptido ou um complexo péptido-rénio da invenção (a uma concentração final na gama desde 10“-*--*- M a 10“^ m em tampão HEPES 50 mM, pH 7,4, contendo 1% de albumina de soro de bovino, 5 mM de MgCl2, 0,02 mg/mL de bacitracina, 0,02 mg/mL de fluoreto de fenilmetil-sulfonilo e 200.000 UI de Trasilol durante 25 min a 30 °C.

Após a incubação, esta mistura de membranas foi filtrada através de um filtro GC/F lavado com polietilenoimina (Whatman Ltd., Maidstone, Inglaterra) utilizando um divisor de filtração, e o residuo que permaneceu no filtro foi lavado três vezes com 5 mL de tampão HEPES frio. O filtro e uma amostra das lavagens do filtro foram então contados num contador gama. Para avaliar a ligação não especifica, o ensaio também foi realizado essencialmente como descrito na presença de 200 nM de somatostatina-14 não marcada. A análise de dados incluiu gráficos de Hill dos dados para dar constantes de inibição como descrito por Bilund e Yamamura (1990, Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis, Yamamura et al., eds., Raven Press: N.Y.). Os resultados obtidos utilizando este ensaio com os reagentes da invenção são como se segue: 50

TABELA II Péptido Ki (nM} ciclo(IY-metil) iFYWdKV.Hcy.(CH2CO GGCKK.amida) 0,26 ciclo(IY-metil) 1FYWpKV.Hcy.(CH2CO GGCK.amida) 2,5 ciclo (IV-metil) iFYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGC.amida) 2, 6

Estes resultados demonstram que os reagentes péptidos da invenção se ligam com afinidade elevada a receptores de somatostatina in vitro. EXEMPLO 5

Localização e Imagiologia In Vivo de Tumores que Exprimem o Receptor de Somatostatina (SSTR) em Ratos A obtenção de imagens in vivo de receptores de somatostatina expressos por células de tumor de rato foi realizada essencialmente como descrito por Bakker et al. (1991, Life Sciences 49:1593- 1601). Células de tumor do pâncreas de rato CA20948, descongeladas de preparação de células tumorais colhidas e congeladas, foram implantadas intramuscularmente numa suspensão de 0,05 a 0,1 mL/animal, na coxa da pata traseira direita de ratos Lewis com 6 semanas. Deixou-se que os tumores crescessem até aproximadamente 0,5 a 2 g, foram colhidos e a correspondente preparação de células tumorais foi utilizada para implantar um segundo conjunto de ratos Lewis ingénuos. A passagem desta forma foi repetida para produzir gerações sucessivas de animais com tumores. Os animais com tumores utilizados para os estudos in vivo eram normalmente 51 da terceira à quinta passagem e tinham tumores de 0,2 a 2 g.

Para estudos de especificidade de localização de radiomarcadores nos tumores, administrou-se a animais seleccionados uma dose subcutânea bloqueadora de SSTR (4 mg/kg) de octreotido 30 minutos antes da injecção do radiomarcador. (Foi demonstrado por Bakker et al. que este protocolo resulta num abaixamento de 40% da absorção de mIn-[DTPA]octreotido pelo tumor).

Ratos Lewis com tumores CA20948 de terceira à quinta passagem foram contidos e injectados intravenosamente através da veia da cauda dorsal com uma dose de 0,15-0,20 mCi de péptido marcado com 99mic correspondente a 3 a 8 yg de péptido em 0,2 a 0,4 mL.

Em momentos seleccionados, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e efectuou-se necropsia seleccionada. As amostras de tecido colhidas foram pesadas e contadas juntamente com uma aliquota da dose injectada num contador de poços gama.

Os resultados da biodistribuição aos 90 minutos de péptidos radiomarcados seleccionados estão apresentados na Tabela III. É de notar que "mTc-P587, "mTc-P617, "mTc-P726 e "mTc-P736 apresentaram uma absorção pelo tumor muito elevada e proporções tumor/sangue que demonstram a sua absorção altamente especifica em tecido (tumoral) alvo. A Figura 1 mostra uma imagem de 99mTc-P587 num rato com tumor. A absorção elevada no tumor do membro inferior (seta) é claramente visível. A absorção de 99mTc-P587 em tumores em ratos foi comparada com e sem tratamento com pré-injecção de octreotido, um análogo 52 de somatostatina que se sabe que se liga ao receptor de somatostatina in vivo. Nestas experiências, o bloqueamento dos receptores por administração de octreotido antes da administração de 99mTc-P587 reduziu em 7 6% a absorção do péptido radiomarcado especifica do tumor. Estes resultados confirmaram que a ligação de 99mTc-P587 in vivo era especifica de SSTR.

TABELA III N° Péptidos Tumor 0 0 Sangue ID/g Tumor/Sangue P736 ciclo (N-metil) FYWdKV . Hcy. (CH2CO.GGCRK.amida) 2,1 0,25 9 P587 ciclo (N-metil) FYWdKV . Hcy. (CH2CO.GGCK.amida) 3,4 0, 61 6 P617 ciclo(N-metil)FYWdKV.Hcy. (CH2CO.GGCR. amida) 6,7 0,73 9 P72 6 ciclo(N- metil)FYWdKV.Hcy. (CH2CO.KKC. amida) 2,5 0,30 8 EXEMPLO 6

Imagiologia In Vivo de Tumores que Exprimem Receptores de Somatostatina (SSTR) Humanos com P587 Marcado com Tc-99m

Num ensaio clinico, realizou-se a imagiologia cintigráfica de doentes seres humanos com tumores que exprimem SSTR utilizando o reagente P587 marcado com Tc-99m.

Um total de 10 doentes, quatro mulheres e seis homens com 53 idades desde os 27 aos 69 anos, tinham sido previamente diagnosticados com adenoma hipofisário produtor de hormona do crescimento (4 doentes), melanoma (1 individuo) , cancro medular da tiróide (1 individuo), carcinoma do pulmão de células pequenas (SCLC; 1 doente), linfoma não Hodgkin (1 doente) ou tumor carcinóide do estômago (1 doente) . A cada um destes doentes foi administrado P587 marcado com Tc-99m a uma dose de 10-22 mCi por 0,2-0,5 mg por injecção intravenosa. A imagiologia cintigráfica foi realizada tal como aqui descrito em cada um dos doentes durante 4 horas pós-injecção. A imagiologia com câmara gama é iniciada ao mesmo tempo que a injecção. Foram adquiridas imagens anteriores como um estudo dinâmico (10 s de aquisições de imagem) durante os primeiros 10 min, e depois como imagens estáticas às 1, 2, 3 e 4 h pós-injecção. As imagens anteriores foram adquiridas durante 500.000 contagens ou 20 min (o mais curto dos dois) , a aproximadamente 10-20 min, e a aproximadamente 1, 2, 3 e 4 h pós-injecção.

Verificou-se que o agente de imagiologia cintigráfica era rapidamente eliminado da corrente sanguínea, resultando em que menos de 10% da dose injectada permanecia na circulação dentro de 30 minutos da injecção. Isto permitiu que a aquisição de imagens de sitios do tumor fosse conseguida tão cedo como 15-30 min depois da injecção do agente de imagiologia cintigráfica. Todos os tumores conhecidos foram detectados neste estudo, bem como duas lesões metastáticas anteriormente não detectadas que foram posteriormente confirmadas utilizando tomografia assistida por computador (exame por TAC).

Estes resultados demonstraram que os agentes de imagiologia cintigráfica desta invenção foram altamente eficazes na detecção de tumores primários e metastásicos que exprimem SSTR em seres humanos in vivo. 54

Deve entender-se que a descrição anterior realça certas formas de realização especificas da invenção e que todas as modificações ou alternativas a elas equivalentes estão dentro do espirito e âmbito da invenção como indicado nas reivindicações anexas.

Lisboa, 22 de Dezembro de 2006 55

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição de matéria compreendendo um péptido de ligação especifica ligado covalentemente a uma unidade complexante de iões metálicos, em que o péptido se liga especificamente a receptores de somatostatina, o reagente tendo a fórmula ciclo(N- CH3)-Phe-Tyr-(D-Trp)-Lys-Val-Hcy. (CH2CO.X); em que X é uma unidade complexante de metais tendo a fórmula -(aminoácido)n-B-(aminoácido)m-Z, em que B é uma unidade contendo tiol que é cisteina, homocisteina, isocisteina ou penicilamina; (aminoácido)n e (aminoácido)m são cada um independentemente qualquer a- ou β-aminoácido primário que não compreende um grupo tiol; Z é -OH ou -NH2; n é um número inteiro entre 2 e 5; e m é um número inteiro entre 0 e 5; com a condição de que o reagente não tem nenhuma das fórmulas seguintes: ciclo(N-metil)-FYWpKV.Hcy.(CH2CO.GGC.amida), ciclo(N-metil)-FYWpKV.Hcy.(CH2CO.GGCK.amida), ciclo(N-metil)-FYWpKV.Hcy.(CH2CO.GGCR.amida), 1 ci cl o (AZ-metil) -FYWpKV. Hcy. cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. cicl o(Af-metil)-FYWpKV.Hcy. cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. ou cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. (CH2CO.GGCRD.amida), (CH2CO.GGCRK.amida), (CH2CO.GGCRR.amida), (CH2CO.GGCKK.amida), (CH2CO.GGCKKK.amida), (CH2CO.GGC.Orn.amida), (CH2CO.GGCKDK.amida), (CH2CO.GGC.Orn.D.Orn.amida), (CH2CO.GGC.Orn.D.amida), (CH2CO.KKC.amida), (CH2CO.KRC.amida), (CH2CO.RRC.amida), (CH2CO.KKCK.amida), (CH2CO.GRCK.amida), (CH2CO.GKCR.amida). Reagente para a preparação de um reagente de imagiologia cintigráfica para obtenção de imagens de um sitio no corpo de um mamífero, opcionalmente um sitio de um tumor primário ou metastástico, que exprime receptores de somatostatina, compreendendo uma composição de matéria da reivindicação 1. Reagente de imagiologia cintigráfica compreendendo um reagente de acordo com a reivindicação 2 em que a unidade de ligação ao radiomarcador está ligada a tecnécio-99m. Complexo formado por reacção de um reagente da reivindicação 2 com tecnécio-99m na presença de um agente redutor, e. g. ião estanoso, ou por marcação de um reagente da reivindicação 2 com tecnécio-99m por permuta de ligandos de 2 um complexo de tecnécio-99m pré-reduzido.
2. 5. Kit para a preparação de uma preparação radiofarmacêutica, compreendendo o referido kit um frasco selado contendo uma quantidade pré-determinada de um reagente da reivindicação 2 e uma quantidade suficiente de agente redutor para marcar o reagente com tecnécio-99m.
3. 6. Método para a marcação de um reagente de acordo com a reivindicação 2 compreendendo a reacção do reagente com tecnécio-99m na presença de um agente redutor, e. g. ião estanoso.
4. 7. Composição de matéria compreendendo um péptido de ligação especifica ligado covalentemente a uma unidade complexante de iões metálicos, em que o péptido se liga especificamente a receptores de somatostatina, o reagente tendo a fórmula: ciclo(N- CH3)-Phe-Tyr-(D-Trp)-Lys-Val-Hcy. (CH2CO.X); em que X é uma unidade complexante de metais tendo a fórmula -(aminoácido)n-B-(aminoácido)m-z/ em que B é uma unidade contendo tiol que é cisteina, homocisteina, isocisteina ou penicilamina; (aminoácido)n e (aminoácido)m são, cada um, independentemente qualquer a- ou β-aminoácido primário que não compreende um grupo tiol; Z é -OH ou -NH2; 3 n é um número inteiro entre 2 e 5; e m é um número inteiro entre 0 e 5; em que a unidade complexante de iões metálicos está ligada a um ião metálico, e. g. rénio, zinco ou estanho; sendo opcionalmente o ião metálico um ião metálico emissor de partículas beta, e. g. rénio-186 ou rénio-188, ou um ião metálico emissor de electrões de conversão, e. g. estanho-117m; com a condição de que, quando o ião metálico é tecnécio-99m, o reagente não tem nenhuma das fórmulas seguintes: ciclo(N-metil) -FYWpKV.Hcy.(CH2CO.GGC.amida), ciclo(N-metil) -FYWdKV.Hcy.(CH2CO.GGCK.amida), ciclo(N-metil) -FYWdKV.Hcy.(CH2CO.GGCR.amida), ciclo(N-metil) -FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCRD.amida), ciclo(N-metil) -FYWpKV.Hcy.(CH2CO.GGCRK.amida), ciclo(N-metil) -FYWdKV.Hcy.(CH2CO.GGCRR.amida), ciclo(N-metil) -FYWdKV.Hcy.(CH2CO.GGCKK.amida), ciclo(N-metil) -FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCKKK.amida), ciclo(N-metil) -FYWdKV.Hcy. (CH2CO.GGC.Orn.amida), ciclo(AZ-metil) -FYWDKV.Hcy. (CH2CO.GGCKDK.amida), ciclo(W-metil) -FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGC.Orn.D.Orn.amida), ciclo(W-metil) -FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGC.Orn.D.amida), ciclo(N-metil) -FYWDKV.Hcy.(CH2CO.KKC.amida), ciclo(N-metil) -FYWDKV.Hcy.(CH2CO.KRC.amida), ciclo(W-metil) -FYWDKV.Hcy.(CH2CO.RRC.amida), 4 ciclo(N-metil)-FYWpKV.Hcy.(CH2CO.KKCK.amida) ciclo(N- metil)-FYWpKV.Hcy. (CH2CO.GRCK.amida), ou ciclo (Aí—metil) -FYWpKV.Hcy. (CH2CO. GKCR. amida) .
5. 8. Composição de matéria de acordo com a reivindicação 7 em que o reagente tem a fórmula: cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. ci clo(N-metil)-FYWpKV.Hcy. cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy. ou cicl o(N-metil)-FYWpKV.Hcy.
6. 9. Composição de matéria de reivindicação 8 que está modo preferido marcada co astatinio-211. (CH2CO.GGCK.amida), (CH2CO.GGCR.amida), (CH2CO.GGCRD.amida), (CH2CO.GGCRK.amida), (CH2CO.GGCRR.amida), (CH2CO.GGCKK.amida), (CH2CO.KKC.amida). acordo com a reivindicação 7 ou marcada radioactivamente, de um n iodo-123, iodo-125, iodo-131 ou
7. 10. Composição de matéria de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8 em que a unidade complexante de iões metálicos está ligada a um ião metálico paramagnético, e. g. ferro ou cobre, opcionalmente em que o reagente está ligado a uma partícula superparamagnética.
8. 11. Agente para imagiologia de diagnóstico compreendendo a composição de acordo com a reivindicação 9 ou a reivindicação 10. 5
9. 12. Composição farmacêutica compreendendo a composição de matéria da reivindicação 1, reivindicação 7, reivindicação 8, reivindicação 9 ou reivindicação 10 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
10. 13. Utilização de uma composição de matéria da reivindicação 1, revindicação 7, reivindicação 8, reivindicação 9 ou reivindicação 10, um reagente da reivindicação 2, um agente da reivindicação 3 ou um complexo da reivindicação 4 na preparação de um medicamento para obtenção de imagens de um sitio no corpo de um mamifero.
11. 14. Utilização de uma composição de matéria da reivindicação 1, revindicação 7, reivindicação 8, reivindicação 9 ou reivindicação 10, ou uma composição farmacêutica da reivindicação 12 na preparação de um medicamento para tratamento de um animal que tem um tumor maligno ou benigno ou células neoplásicas ou metastáticas que exprimem um receptor de somatostatina.
12. 15. Utilização de um agente de imagiologia da reivindicação 3 ou de uma composição de matéria da reivindicação 9 para a preparação de um medicamento para cirurgia orientada por radioisótopos em que é extirpado tecido contendo células neoplásicas ou metastáticas identificado por localização de radioactividade da composição de matéria administrada. Lisboa, 22 de Dezembro de 2006 6