PT650374E

PT650374E - Utilizacao de um material poroso a base de carbonato de calcio como suporte para um factor de crescimento na preparacao de um implante bio absorvivel

Info

Publication number: PT650374E
Application number: PT94916275T
Authority: PT
Inventors: Jean-Louis Patat; Jean-Pierre Ouhayoun
Original assignee: Bio Holdings Int Ltd
Priority date: 1993-05-13
Filing date: 1994-05-11
Publication date: 2000-12-29
Also published as: DK0650374T3; ES2150492T3; DE69425358D1; AU6788794A; AU676056B2; FR2706768A1; DE69425358T2; EP0650374B1; WO1994026322A1; JPH08503157A; EP0650374A1; ATE194922T1; FR2706768B1; US5711957A; GR3034667T3; CA2139864A1; JP2957281B2; CA2139864C

Description

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tfXOk DESCRIÇÃO " UTILIZAÇÃO DE UM MATERIAL POROSO À BASE DE CARBONATO DE CÁLCIO COMO SUPORTE PARA UM FACTOR DE CRESCIMENTO NA PREPARAÇÃO DE UM IMPLANTE BIO ABSORVÍVEL " A invenção tem por objecto a utilização de um material à base de carbonato de cálcio como suporte para um factor de crescimento na preparação de um implante bio-absorvível destinado a ser colocado num organismo vivo.

Este tipo de material pode, nomeadamente, ser utilizado como implante ósteo-formador.

Sabe-se que a cirurgia óssea necessita muitas vezes da colocação de enxertos ósseos ou de implantes constituindo produtos de substituição artificial desses enxertos. A realização de aloenxertos levanta objecções, por razões evidentes de saúde pública, tendo em conta os riscos de transmissão de certas doenças virais graves ou de doenças provocadas por agentes transmissíveis não convencionais ou "priões".

Deste ponto de vista, a realização de auto-enxertos é mais satisfatória mas a recolha do enxerto implica riscos de morbidez importantes: ver, por exemplo, Christopher J. Damien e J. Russell Parsons, "Journal of Applied Biomaterials, Vol.2, 187-208 (1991). -2-

Por estas razões, preconizou-se a utilização de implantes à base de materiais biocompatíveis, como o fosfato tricálcico, a hidroxi-apatite, o gesso, o coral, os polímeros à base de poli(ácido láctico) e/ou poli(ácido glicólico), etc.

Alguns destes materiais, entre os quais o carbonato de cálcio, são bio-absorvíveis e permitem a formação progressiva de tecido ósseo recém formado à custa do material implantado em vias de reabsorção; ver, nomeadamente, a patente europeia 0 022 724.

Sabe-se, por outro lado, que a presença de certos factores ósteo-indutores nos implantes favorece o crescimento ósseo. Todavia, os especialistas calculavam, até agora, que era necessário juntar colagénio ao implante para servir de suporte aos factores ósteo-indutores; ver, a este respeito, o artigo de Damien e Russell Parsons atrás referido e o pedido de patente FR-2.637.502.

Descobriu-se agora que um material à base de carbonato de cálcio poroso, como o coral, pode servir de suporte a factores ósteo-indutores e, mais geralmente, a factores de crescimento, na preparação de implantes bio-absorvíveis e que a presença de colagénio não é nem necessária nem desejável no caso de o implante se destinar a ser utilizado como implante ósteo-formador. A presente invenção tem, portanto, como objecto a utilização de um material poroso constituído essencialmente por carbonato de cálcio, mesmo na sua superfície, como suporte para pelo menos um factor de crescimento, sendo o referido suporte livre de colagénio no caso de o referido factor de crescimento ser um factor ósteo-indutor, na preparação de um implante bio-absorvível destinado a ser colocado num organismo animal vivo, em particular num animal vertebrado, incluindo seres humanos. -3-

Quando os factores de crescimento são factores ósteo-indutores, os implantes são utilizáveis como implantes ósteo-formadores. Bem entendido, estes implantes podem conter, independentemente dos factores ósteo-indutores, outros factores de crescimento. Os implantes assim obtidos podem ser quer colocados como peças de preenchimento ósseo progressivamente absorvíveis, em proveito de um tecido recém formado, quer implantados num ponto não ósseo, por exemplo, um tecido conjuntivo, onde darão lugar a um tecido ósseo utilizável posteriormente como material de auto-enxerto ósseo.

Quando o suporte de carbonato de cálcio é carregado com um factor de crescimento que não é ósteo-indutor, pode nomeadamente ser utilizado como suporte para a cultura in vivo de células vivas. Consoante as células e os factores de crescimento utilizados, o implante, após colocação, pode nomeadamente servir de suporte para a obtenção de um tecido recém formado no local de implantação. Este tecido recém formado pode ser utilizado como elementos de substituição de porções de órgão enfraquecidas (ligação do pâncreas ao intestino, uretra, bexiga, pericárdio, etc.). O implante da invenção pode igualmente ser utilizado como suporte de cultura in vivo para células modificadas geneticamente, nomeadamente pela inserção de um gene apropriado, da maneira conhecida, para corrigir um defeito genético. As células modificadas podem eventualmente provir de uma recolha autóloga.. Os implantes assim obtidos constituem um "organóide" que serve de dispositivo de tratamento terapêutico cuja colocação permite substituir um órgão enfraquecido e, em particular, corrigir certas disfunções de origem genética. Trata-se, portanto, de uma nova forma de implementar terapias genéticas.

Por exemplo, pode-se fabricar uma peça oca em coral, munida de -4- uma abertura obturável por meio de uma tampa, aparafusada ou encaixada, igualmente realizada em coral. Por exemplo, para a implantação nos seres humanos, pode tratar-se de um cilindro oco tendo entre 2 e 10 cm de altura, com 1 a 3 cm de diâmetro externo e com 0,5 a 2 cm de diâmetro interno. A parede interna pode ser impregnada com um colagénio carregado de factores de crescimento como o TGF Beta. A parede externa pode ser impregnada com um soluto de um factor angiogénico (FG). As células autólogas (por exemplo, fibroblastos) modificadas são previamente cultivadas in vitro sobre um suporte sólido como uma rede de fibras de colagénio ou grânulos de coral. Introduz-se, na parte oca do implante, a cultura de células modificadas com o seu suporte sólido. Obtura-se, em seguida, com o auxílio da tampa e, depois, procede-se à implantação, por exemplo, intra-abdominal. As células implantadas organizam-se num tecido vascularizado rodeado por um tecido conjuntivo que substitui o coral à medida que este é absorvido.

As células introduzidas no implante podem ser células não diferenciadas cuja diferenciação se efectua graças a citoquinas endógenas ou exógenas. O material à base de carbonato de cálcio utilizável como suporte para os factores de crescimento é, de preferência, aragonite. Pode-se, em particular, utilizar o esqueleto de coral. Um dos interesses da utilização do esqueleto de coral é o de este conter poros comunicantes, o que favorece a neo-vascularização bem como a invasão do material pelas células ósseas ou por outras células previamente introduzidas ou recrutadas in situ.

De preferência, utiliza-se como material de suporte, um material com poros tendo um diâmetro compreendido entre 50 e 500 micrómetros, em particular entre 200 e 400 micrómetros. A porosidade, quer dizer, a proporção volúmica dos poros relativamente ao volume total do material, está igualmente compreendida entre 20 e 80%, por exemplo, entre 40 e 60%.

Podem obter-se materiais deste tipo utlizando nomeadamente o coral dos tipos Porites, Acropora, Goniopora, Lobophyllia, Simphyllia e Milipora.

Sabe-se que os factores de crescimento são polipéptidos que agem localmente sobre certas células influenciando a sua proliferação, a sua migração e/ou a sua diferenciação ou que estimulam a produção de outros factores de crescimento.

Conhecem-se, hoje em dia, numerosos factores de crescimento.

Por exemplo, são conhecidos os factores de crescimento tendo um efeito ósteo-indutor e os seus efeitos foram estudados nomeadamente in vitro sobre culturas de diversas células ósseas.

Entre os factores de crescimento cuja actividade é específica do meio ósseo, podem citar-se certas proteínas do osso desmineralizado, ou DBM ("Demineralized Bone Matrix", Matriz do Osso Desmineralizado) e, em particular, as proteínas designadas por BP ("Bone Protein", Proteínas dos Ossos) ou BMP ("Bone Morphogenetic Protein", Proteínas Morfogenéticas dos Ossos), que contém, com efeito, vários constituintes: nos seres humanos, por exemplo, isolaram-se, nomeadamente, os constituintes designados por ósteonectina e ósteocalcina. Outra proteína activa é a ósteogenina.

Entre os factores de crescimento que influenciam o crescimento celular em geral, incluindo o crescimento das células ósseas, podem citar-se, -6- nomeadamente, as somatomedinas ou IGF ("Insulin-like Growth Factor", Factor de Crescimento semelhante àlnsulina), o PDGF ("Platelet-Derived Growth Factor", Factor de Crescimento Derivado de Plaquetas), o FGF ("Fibroblast Growth Factor", Factor de Crescimento de Fibroblasto) a BDGF II (ou beta-2-mciroglobulina), os TGF ("Transforming Growth Factor", Factor de Crescimento Transformante), em particular o TFG beta (ou bTGF), etc.

As doses de factores de crescimento utilizáveis são conhecidas ou podem ser determinadas por experiências de rotina em modelos animais. Geralmente, utilizam-se os factores de crescimento, cuja acção é local, a doses de alguns microgramas ou de algumas dezenas de microgramas. A invenção visa, igualmente, a preparação dos suportes de carbonato de cálcio porosos carregados de factores de crescimento. Estes podem ser incorporados: por impregnação, seguida ou não de secagem, com o auxílio de um soluto ou de um gel contendo o factor de crescimento, por depósito de películas por capilaridade, com o auxílio de um soluto do factor de crescimento por ligação com o carbonato de cálcio ou por intermédio de um revestimento com potencial de superfície electronegativo (heparina, sulfato de heparano, sulfato de dextrano, sulfato de dermatano, sulfato de xilano, etc.). É possível facilitar a fixação e a retenção dos factores de crescimento no suporte de carbonato de cálcio aplicando-os sob a forma de uma associação com um agente ligante, nomeadamente um agente ligante capaz de formar um gel. Esses agentes ligantes são conhecidos. Trata-se, por exemplo, do colagénio ou de derivados de celulose como a metilcelulose, a hidroxipropilcelulose, a hidroxipropilmetilcelulose, a carboximetilcelulose, etc. Estes produtos são biocompatíveis. Estão disponíveis comercialmente. Podem ainda ser utilizados como agentes ligantes um precursor da fibrina, por exemplo fibrinogénio, ou uma cola biológica (crioprecipitado). O agente ligante tem por efeito nomeadamente favorecer a fixação do factor de crescimento e, eventualmente, a sua libertação progressiva..

Geralmente o agente ligante é progressivamente absorvido à medida que o implante é re-habitado por um tecido recém formado.

No entanto, constatou-se que, no caso de um implante ósteo-formador, a presença de colagénio com agente ligante não favorece a criação de um novo tecido ósseo mas que, pelo contrário, teria tendência a retardá-lo.

Os exemplos que se seguem ilustram a invenção. EXEMPLO 1

Utilizam-se, como material de partida, discos de coral tendo um diâmetro de 6 mm e uma espessura de 2 mm (origem: INOTEB).

Utiliza-se como factor ósteo-indutor um BP bovino tendo uma concentração em proteínas de 1,52 mg/ml.

Dilui-se o BP de maneira a obter doses de 10, 35 e 100 microgramas de princípio activo sob um volume de 20 microlitros. Impregna-se cada disco de coral com 20 microlitros de um dos solutos obtidos. Após -8- infiltração do soluto nos poros, os discos são congelados rapidamente e, depois, submetidos a liofilização.

Com os discos assim tratados efectuam-se implantes sub-cutâneos na região ventral em ratos. Utilizam-se três grupos de cinco animais que recebem, cada, um implante de coral impregnado com 10, 35 ou 100 microgramas de BP, respectivamente.

Ao fim de 27 dias, administra-se aos animais, por via sub-cutânea, uma dose de 20 mg/kg de um agente marcador constituído por calceína. No vigésimo-oitavo dia, os implantes são extraídos, pesados, fotografados e fixados em metanol. As amostras são envolvidas em poli(metacrilato de metilo) para exame histológico. As amostras são cortadas e coloridas com o reagente "Rapid Bone Stain" e com picro-fucsina Van Gierson. Os cortes são examinados ao microscópio.

Os pesos dos discos de coral antes da implantação e depois da explantação estão indicados no Quadro I que segue, no qual os resultados são expressos sob a forma de uma média de tipo desvio +.

QUADRO I

Grupo Peso dos discos (mg) antes da implantação depois da explantação Ganho de peso I 86,0±11,2 97,2+13,0 11,2±6,0 II 84,4+14,1 114,2+14,2 29,8±12,1 III 83,2+9,5 . 128,0±12,2 45,4± 10,1

No grupo I, o exame ao microscópio mostra uma formação óssea -9- ainda imatura e de medula hematopoiética através de todo o implante, bem como a formação de osso à superfície. O osso forma-se e a condução pelo material permite o cresciment do osso. Há harmonia entre a ósteo-indução e a ósteo-condução.

No grupo II, a mineralização é boa no conjunto do implante, o osso recém formado atingiu a maturidade e reveste o coral. A ósteo-indução domina a ósteo-condução e o osso é mais importante em redor do implante.

No grupo III, as amostras têm um rebordo externo espesso de osso que atingiu a maturidade com medula hematopoiética no centro. Em vários casos, pode-se observar a existência de cartilagem e cartilagem em vias de mineralização ao cabo de algumas semanas. EXEMPLO 2

Pratica-se uma trepanação, em ratos, por ablação de uma porção circular de 8 mm de diâmetro sobre o alto do crâneo. Aplica-se, na janela assim obtida, um disco de coral tendo 8 mm de diâmetro. Os discos de coral são impregnados, de maneira análoga à que foi descrita no exemplo anterior, com o factor ósteo-indutor (BMP-2 humano recombinante), à razão de 0,5 microgramas de BMP-2 para 1 mg de coral. No dia da operação injecta-se, por via intramuscular, calceína à razão de 20 mg/kg. No vigésimo-sétimo dia injecta-se, por via intramuscular, xilenol cor de laranja (90 mg/kg).

Estes corantes produzem uma fluorescência amarela e laranja que delimita as formações ósseas.

No vigésimo-oitavo dia retira-se uma parte da calota craniana, -10- incluindo o implante, e fixa-se a mesma em formol neutro a 10% para estudo histológico após se incluírem no metacrilato de metilo cortes não desmineralizados coloridos com o corante Giemsa-Paragon. A mineralização é evidenciada por micro-radiografias.

Os cortes mostram uma formação óssea a partir das bordas da lesão óssea e que se estende sobre o rebordo do disco de coral.

No caso do coral impregnado de BMP-2 há osso em todo o disco. A absorção do coral é mais rápida do que na ausência de BMP-2. EXEMPLO 3

Pratica-se, em coelhos, uma trepanação bilateral e simétrica do crâneo ao nível dos ossos parietais, por ablação de duas porções circulares de 10 mm de diâmetro.

Constituem-se cinco lotes de coelhos: quatro grupos de teste e um grupo de controlo. Nos indivíduos de cada grupo de teste, é tratado um único lado.

Grupo 1 (Símbolo MF): aplicam-se numa das janelas 50 microlitros de gel de metilcelulose centendo 1 mg de TGF beta.

Grupo 2 (Símbolo BF): aplicam-se numa das janelas 100 ml de cola biológica à qual se juntou 1 mg de TGF beta.

Grupo 3 (Símbolo BCF): aplicam-se 50 microlitros de uma mistura análoga à que foi aplicada ao grupo BF, mas contendo, por outro lado, 70 mg de granulados de coral Porites, comercializado sob a denominação BIOCORAL 450 pela Sociedade INOTEB.

Grupo 4 (Símbolo BC): aplica-se a mesma mistura utilizada para o grupo 3, mas sem factor de crescimento.

Segue-se a evolução da construção óssea por tomodensitometria craneana. Os diâmetros e superfícies das trepanações são medidos num analisador de imagens. Depois de se sacrificarem os animais estudados, ao fim de um mês, a calote craniana é extraída e, depois, preparada com um microtomo para análise histológica por histomorfometria e microscopia em fluorescência. Para marcar as superfícies de ósteo-formação, injectaram-se 2 ml de oxitetraquinol no décimo e no décimo terceiro dias antes do sacrifício.

Fizeram-se as seguintes observações:

Passados 30 dias, os grupos BC e BCF cobriram completamente a cicatriz com um tecido osteóide.

Para os outros grupos, a cobertura não é completa. O diâmetro do lado tratado é inferior ao do diâmetro do lado de controlo. O diâmetro do lado de controlo é inferior aos diâmetros observados no grupo de controlo. O volume das trabéculas ósseas (VTO) foi determinado por histomorfometria. O grupo BCF tem o VTO mais elevado, seguido pelo grupo BC. O estudo dos animais dos grupos tratados com coral mostra que os -12- granulados são progressivamente absorvidos. O coral permitiu a criação rápida de trabéculas ósseas entre estes granulados.

De maneira generalizada, a junção do factor de crescimento eleva a velocidade de remineralização. EXEMPLO 4

Cobre-se uma peça de coral (porosidade: 50%) com um gel de colagénio murino de tipo 1 contendo um factor de crescimento angiogénico (bFGF).

Utilizando um bFGF marcado com iodo radioactivo, foi possível demonstrar, por ensaios de precipitação, que a ligação do bFGF ao suporte de coral é muito forte. Esta ligação é ainda aumentada em presença de heparanos ou de heparinas.

As peças de coral assim tratadas são implantadas num ponto subcutâneo em ratos. Procede-se à observação macroscópica e histológica dos implantes durante um ano.

Passados alguns meses, o coral é absorvido. Dá lugar a um tecido conjuntivo do mesmo tamanho e da mesma forma que o implante. Ao fim de três meses, observa-se uma forte vascularização e a ausência de qualquer célula inflamatória relacionada com os resíduos de coral. O tecido conjuntivo é formado por células mesenquimatosas pouco densas.

Noutras experiências, substituiu-se o colagénio pela carboxi-metilcelulose ou pelo fibrinogénio. EXEMPLO 5

Fabrica-se um cilindro oco em coral.

Na parte oca, introduz-se uma rede de fibras de colagénio contendo fibroblastos autólogos geneticamente modificados por inserção de um gene com o auxílio do vector retroviral.

Previamente, impregnou-se a parede externa do cilindro com um gel de colagénio de tipo 1 associado a heparina. O coral assim pré-tratado é incubado em presença de um factor de crescimento angiogénico (bFGF). Finalmente, o cilindro é obturado com o auxílio de uma tampa de coral, e, depois, efectua-se uma implantação intraperitoneal, num cão de 25 kg.

Passados 45 dias, retira-se o implante. A vascularização deste é importante e comporta vasos de grande calibre. A absorção do coral já se iniciou. As células modificadas são viáveis e exprimem o gene inserido.

Estão organizadas num tecido vascularizado.

Conduz-se uma experiência análoga em ratos com deficiência em beta-glucuronidase e apresentando uma doença de sobrecarga lisossomal. Um cDNA humano codificador da beta-glucuronidase é inserido num vector retroviral que se utiliza em seguida para modificar células (autólogas) de ratos. As células modificadas são introduzidas numa rede de fibras de colagénio e o conjunto é introduzido num cilindro de coral tratado de maneira análoga à que foi atrás descrita. Os implantes assim preparados são inseridos no mesentério de ratos deficientes. - 14-

As células modificadas implantadas são capazes de segregar a enzima em falta que passa na circulação geral, conduzindo, assim, à regressão das consequências fisiológicas do defeito genético e, nomeadamente, a correcção das lesões hepáticas e esplénicas.

Lisboa, 9 de Outubro de 2000

JORGE CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um material poroso constituído essencialmente por carbonato de cálcio, mesmo na sua superfície, como suporte para pelo menos um factor de crescimento, sendo o referido suporte isento de colagénio no caso de 0 referido factor de crescimento ser um factor ósteo-indutor, na preparação de um implante bio-absorvível destinado a ser colocado num organismo animal vivo, em particular num animal vertebrado.
2. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o referido carbonato de cálcio estar sob a forma de aragonite e, em particular, de esqueleto de coral.
3. Utilização, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo facto de o referido factor de crescimento ser um factor ósteo-indutor.
4. Utilização, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada pelo facto de o referido implante se destinar a ser colocado como peça de preenchimento ósseo.
5. Utilização de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo facto de o referido implante se destinar a ser colocado num ponto não ósseo.
6. Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo facto de o referido factor de crescimento ser um factor não ósteo-indutor. -2-
7. Utilização, de acordo com a reivindicação precedente, caracterizada pelo facto de o referido implante se destinar à cultura de células in vivo.
8. Utilização, de acordo com a reivindicação precedente, caracterizada pelo facto de as referidas células serem células modificadas geneticamente, em particular células autólogas.
9. Utilização, de acordo com a reivindicação precedente, caracterizada pelo facto de as referidas células serem modificadas por inserção de um gene destinado a corrigir um defeito genético.
10. Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo facto de o referido implante se apresentar sob a forma de uma peça oca munida de uma abertura obturável por meio de uma tampa.
11. Utilização, de acordo com a reivindicação precedente, caracterizada pelo facto de pelo menos um factor de crescimento ser depositado por impregnação sobre a parede interna da referida peça oca.
12. Utilização, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo facto de se introduzir na parte oca do implante uma cultura de células a cultivar, obturando-se depois a referida parte oca com o auxílio da tampa antes de proceder à implantação. Lisboa, 9 de Outubro de 2000

JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA