PT602686E - Concentrados de lectina de extractos de visco e correspondentes composicoes de lectina de visco estabilizadas normalizadas processo para a sua preparacao assim como medicamentos que os contem e sua utilizacao para aumentar a resistencia imune natural e/ou na terapia de tumores - Google Patents

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DESCRIÇÃO “CONCENTRADOS DE LECTINAS DE EXTRACTOS DE VISCO E CORRESPONDENTES COMPOSIÇÕES DE LECTINA DE VISCO ESTABILIZADAS, NORMALIZADAS, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO ASSIM COMO MEDICAMENTOS QUE OS CONTÊM E SUA UTILIZAÇÃO PARA AUMENTAR A RESISTÊNCIA IMUNE NATURAL E/OU NA TERAPIA DE TUMORES” A invenção refere-se a concentrados de lectinas de visco com uma elevada proporção de lectinas de visco específicas de galactósidos imunologicamente activas de extractos aquosos de visco e correspondentes composições que contêm fracções de lectinas de visco imunologicamente activas estabilizadas normalizadas e ainda a um processo para a sua preparação, em que se submetem extractos aquosos de visco a uma filtração fraccionada assim como medicamentos que contêm as composições estabilizadas normalizadas com um teor definido de fracções de lectinas de visco imunologicamente activas assim como à utilização destas lectinas de visco para a preparação de um medicamentos para aumentar a resistência imunológica natural em seres humanos e mamíferos e/ou na terapia de tumores. O visco (Viscum album) é desde há muito tempo conhecido como remédio e produto mágico; os seus extractos assim como misturas técnicas que contêm Herba visei são hoje em dia ainda utilizados como agente que diminui a tensão sanguínea e que actuam semelhantemente à colina assim como agente para o tratamento de artroses e doenças reumáticas. Além disso, a utilização de extractos de visco foi descrita na DD-A1-235 418 como agentes que inibem o cancro. Neste caso, o componente activo é designado como lectinas, tratando-se de proteínas albuminoides que podem reconhecer e ligar muito especificamente a sacáridos e polissacáridos também sob a forma ligada a lípidos ou proteínas. A especificidade das respectivas lectinas que interessam depende principalmente da sua origem e é para a sua utilização de interesse no diagnóstico do soro e outros métodos da bioquímica e da biologia molecular.

As plantas de visco e os seus extractos contêm três tipos de proteínas tóxicas com especificidade para a parte hidrocarbonada dos glucoconjugados e na realidade as lectinas ML I, ML II e ML ΙΠ [Franz, H., Ziska, P., Kindt, A. Biochem. J., 195 (1981) 481 a 484], A toxicidade dos extractos de visco foi pelo menos inicialmente atribuída à presença de uma lectina específica dos lactósidos (ML I) [Holtskog, R., Sandvig, K., Olsnes, S. Oncology, 45 (1988) 172 a 179]. A actividade citotóxica de ML I foi ensaiada com a utilização de culturas de células sanguíneas mononucleares periféricas humanas [PBMC] com a utilização de três métodos independentes uns dos outros. Neste caso, descobriu-se que a duração de vida de células é influenciada de maneira significativa por concentrações de lectina >10 ng/kg. Este valor da concentração de lectina corresponde apenas à sua parte biologicamente activa que responde à ligação de açúcar, a qual foi determinada por meio de um ensaio enzimático optimizado [Hajto, T., Hostanska, K., Gabius, H-J Câncer REs., 49 (1989) 4803 a 4808]. Na administração em pequenas dosagens não tóxicas mostrou evidentemente uma ligeira acção mitogénica e provocou assim uma aumento da citotoxicidade de células mortais naturais [NK] em relação a células alvo K562. Observou-se também um aumento semelhante de NK se para o sistema imunológico forem administradas doses não tóxicas de lectina. A utilização óptima de lectina activa que liga a açúcar em extractos de viso determinada por meio de ELLA fortalece diversos mecanismos de defesa do receptor e possibilita uma diminuição do crescimento do tumor em pacientes. A DE-U 92 08 913 descreve a lectina de visco I purificada a partir de extractos aquosos de visco. Esta lectina de visco é enriquecida com o auxílio de métodos cromatográficos de afinidade para originar o efeito imunomodulatório quantitativamente atingível. A acção citotóxica de extractos de visco, como já se mencionou, é principalmente atribuída à presença de ML I. Numa pequena parte, outros tipos de lectinas (ML Π e ML III) assim como um pequeno grupo de proteínas fortemente básicas com um peso molecular de aproximadamente 5 kd, e na realidade viscotoxina A2, A3 e B originam acção citotóxica de extractos de visco. ML I é específica para D-galactose e ML ΠΙ é específica para N-acetilaminogalactosamina, enquanto ML Π é específica não só para D-galactose mas também para N-acetilaminogalactosamina. A elevada toxicidade de lectinas de visco foi igualmente confirmada. Os valores de DL50 ficam compreendidos no intervalo de O, 001 a 0,0001 g/kg [Franz, H. Oncology, 43, Suplemento 1, (1986) 23 a 34 e Ziska, P. , Gelbin, M., Franz, H. Lectins, Vol. 8 (1991) em impressão]. Se no entanto se realiza a utilização com uma dosagem menor não tóxica para o sistema imune, semelhantemente como no caso das outras lectinas, existe a possibilidade de lectinas de visco poderem provocar uma resposta imunomoduladora [Franz, H. Oncology, 43, Suplemento 1 (I.c.) e Molzner, G., Franz, H., Kindt, A. Fahlbush, B., Súss, J. Immunbiol.» 169 (1985) 461 a 471]. De facto, dosagens optimizadas desta maneira de ML I purificada são capazes de estimular diversos parâmetros do sistema de defesa do receptor in vivo [Hajto, T., Hostanska, K., Gabius, H.-J. Câncer Res. 49, (1989) 4803 a 4808], o que pelo menos em parte é facilitado por uma secreção multiplicada provocada por lectina de fector de necrose de tumores ct [TNF-alfà], interleucina-1 [EL-1] e interleucina-6 [IL-6] [Hajto, T., Hostanska, K., Frei, K., Rordorf, C., Gabius, H.-J Câncer Res., 50 (1990) 3322 a 3326]. A presença do açúcar específico (D-galactose) evitou a libertação provocada por lectina de citotinas de células sanguíneas mononucleares periféricas humanas [PBMC] e confirma a co-acção da actividade do metabolismo proteína-açúcar nesta resposta imune : Haito, T., Hostanska, K., Frei, K., Rordorf, C., Gabius, H.-J. [Câncer Res., 50 (I.c.)].

Com base na intensa toxicidade dos extractos de visco ou das lectinas neles contidas, especialmente de ML I, assim como base no facto de que a actividade biológica e a acção sobre o sistema imune e por consequência a compatibilidade de extractos de visco e dos seus materiais contidos depende em grande medida do doseamento, especialmente do seu ajuste exacto e digno de confiança para a terapia e a profilaxia, é de importância decisiva que sejam colocados à disposição concentrados de extractos de visco de uma elevada proporção de lectinas de visco específicas do galactósido imunologicamente activo e de composição suficientcmcnte conhecida sobretudo com concentração exactamente 5 5

**" / conhecida do teor de conteúdo activo e se proporcionem composições tituladas com teor exactamente definido de fxacções de lectina de visco imunologicamente activas escolhidas. Porque se verificou que a introdução de lectinas de visco no campo da terapia de tumores se espera que seja coroada de êxito, verificou-sc uma forte procura de íracções de lectina de visco apropriadas e de composições que as contêm. O objecto da invenção é portanto, (a) concentrados de lectina com elevada proporção de lectinas de visco específicas do galactósido imunologicamente activas e correspondentes composições de lectina de visco estabilizadas correspondentemente normalizadas para utilização na terapia de tumores e para o aumento da resistência de imunidade natural que para a respectiva utilização terapêutica ou profiláctica possibilitam um doseamento exacto, assim como (b) um processo para a preparação dos concentrados de lectina de visco com uma elevada proporção em lectinas de visco específicas do galactósido imunologicamente activas, assim como (c) um processo para a preparação das correspondentes composições de lectina de visco normalizadas. O objectivo proposto é resolvido da seguinte forma: a) disponibiliza-se um concentrado de lectina proveniente de extractos de visco e correspondentes composições de lectina de visco correspondentemente normalizadas com um teor elevado bem definido de lectinas específicas de galactósido imunologicamente activas determinado como lectina de visco I padrão, em que a quantidade de lectina se refere apenas a lectinas biologicamente activas, 6

b) para a preparação de concentrados de lectina de visco com uma elevada proporção de extractos aquosos de visco com elevada proporção de lectinas de visco do galactósido, específicas activas imunologicamente se submete a uma filtração fraccionada com a utilização de diferentes filtros e diferentes líquidos de lavagem, em que se realizam duas fases de fraccionamento em que na primeira fase de fraccionamento se submete um ecxtracto aquoso de visco não fermentado pelo menos a uma ultrafiltração para recuperar uma fracção de substâncias com massas moleculares compreendidas entre 20 000 e 100 000, se submeter a ultrafiltrações o concentrado obtido na segunda fase de fraccionamento pelo menos a uma filtração esterilizante e o concentrado final assim obtido se diluir eventualmente até ao volume final pretendido e eventualmente se estabilizar com estabilizadores apropriados; e c) para a preparação de composições que contêm fracções de lectina de visco normalizadas imunologicamente activas, a actividade biológica (a) ser determinada nos concentrados de lectina de visco pelo processo descrito, a concentração das lectinas de visco específicas do galactósido imunologicamente activo ser determinada na fracção obtida, a fracção ser diluída com uma solução tampão fisiologicamente aceitável, eventualmente estabilizada com estabilizadores apropriados e para o teor de lectina necessário para a

utilização terapêutica prevista, em que o teor de lectina é proporcionado em unidades biológicas indicadas, em que cada quantidade parcial contém lectinas de visco específicas do galactósido biologicamente activas na quantidade de dose necessária em terapia e/ou profilaxia e as quantidades parciais serem liofílizadas individualmente ou embaladas sob condições estéreis em ampolas estéreis isentas de pirogénios ou eventualmente liofílizadas.

Uma forma de realização dos produtos descritos sob (a) são os concentrados de lectina de extractos de visco e correspondentes composições de lectina de visco estabilizadas correspondentemente standardizadas sob a forma de uma solução com um teor de 50 ng/ml a 350 ng/ml de lectinas de visco específicas da galactose imunologicamente activas e com um valor de pH de 7,0 a 7,5 e uma outra forma de realização é uma forma correspondentemente liofilizada.

Na realização do processo descrito sob (b) procede-se vantajosamente de tal forma que na primeira fase de fraccionamento se efectuam duas ultrafiltrações, em que para a primeira ultrafiltração se utiliza um filtro de polissulfona com 100 000 NMGT lavado com água bidestilada e se realiza a filtração sem a utilização de pressão e, em seguida, se lava o filtrado obtido duas vezes com uma solução tampão e para a segunda ultrafiltração se utiliza um filtro de acetato de celulose com 20 000 NMGT lavado com água bidestilada e se realiza a filtração sem utilização de pressão.

Depois da primeira fase de fraccionamento realiza-se convenientemente uma filtração de esterilização sob a utilização de um filtro com um limite de 8

selecção de 0,2 μηι a um máximo de 600 kPa como segunda fase de fraceionamento. Na segunda fase de fraceionamento realizam-se preferivelmente duas filtrações de esterilização.

Em geral, Uabalha-se no intervalo de pll dc 7,0 a 7,5.

Preferivelmente, realiza-se a primeira e a segunda fases de fraceionamento uma a seguir à outra durante 2 horas.

O concentrado final obtido no fim das duas fases de fraceionamento é vantajosamente diluído até um volume pretendido, eventualmente estabilizado por estabilizadores apropriados e para armazenagem é encerrado em ampolas esterilizadas isentas de pirogénios ou eventualmente liofilizado.

Para a estabilização da solução já diluída adicionam-se agentes

estabilizadores. Estes podem ser alcanóis, especialmente polióis e os seus derivados, como por exemplo hidratos de carbono como glucose, sacaros e, ciclodextrinas, ciclodextrinas derivatizadas, pentaeritrite, manite, sorbite e ácidos poli-hidroxi gordos como ácido poliláctico e ésteres de ácido poliláctico, como também outros polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona, álcool polivinílico, assim como também aminoácidos ou proteínas como glicina ou albumina, especialmente albumina humana.

Na realização do processo descrito sob (c) procede-se convenientemente de modo que a determinação da actividade biológica se realiza in vivo com o auxílio de três métodos de ensaio independentes, em que se determina a proporção de lectinas activas que ligam açúcar sob utilização de um ensaio enzimático optimizado, que mede a vitalidade das células numa cultura de células 9 9

mononucleares periféricas humanas [PMNC] por meio de azul de tripane e diacetato de fluoresceína que se hidrolisa com obteução de fluoresceína e se determina a absorção de [3H]-timidina nas células de leucemia sensíveis a lectina [K 562], A estabilização como variante em (c) pode realizar-se depois da diluição com uma solução tampão fisiologicamente aceitável e antes da regulação para o teor de lectina necessário para a utilização terapeuticamente prevista. A normalização das fracções de lectina de visco específicas do galactósido biologicamente activas assim obtidas realiza-se de maneira vantajosa com o auxílio da determinação da actividade biológica.

Na normalização garante-se que as unidades determinadas (1 ng) significam uma quantidade de lectina biologicamente activa e não o teor de proteína lectina de visco I-padrão presente. A actividade biológica mede-se entre outros por meio dos seguintes ensaios: 1) O teor de lectinas que ligam açúcar é determinado por um ensaio enzimático ELLA (ensaio de lectina ligada à enzima). 2) Medição da acção citotóxica sobre linfócitos humanos. 3) Medição da acção sobre células NK m vivo. A invenção é em seguida esclarecida com o auxílio da descrição a título de exemplo do processo de preparação e da descrição dos ensaios para a determinação da actividade biológica ou imunológica assim como com o auxílio do desenho. Este representa a absorção máxima da actividade citotóxica provocada por lectina de células NK in vivo depois de 24 a 72 horas a seguir a uma injecção por 10

10 ,/ V'\ & ·>"......J uma única vez de ML I, em representação esquemática.

DESCRIÇÃO DO PROCESSO DE PREPARAÇÃO

Preparação do concentrado de lectina de visco

Para a realização do processo, utiliza-se convenientemente um Sartocon-Mini-Crossflow-System de Sartorius GmbH. Este é um sistema modular de ultrafiltração e microfiltração para a concentração e separação de proteínas e uma série de outras substâncias. Neste caso, carrega-se um extracto de visco aquoso como se obtém por extracção de folhas de visco frescas ou secas com água ou, no caso de folhas frescas, com uma solução de tampão aquosa (PBS 1 %) por meio de uma bomba peristáltica com uma capacidade de carga de 100 a 900 litros/hora a partir de um recipiente de armazenagem para o sistema e faz-se passar através dos andares de filtração individuais. O filtrado obtido depois da passagem através de um ou mais filtros é recolhido num vaso de recolha ou recirculado para o vaso de armazenagem para posterior concentração e daí é de novo carregado para o sistema. O extracto aquoso carregado para o sistema que é regulado vantajosamente a pH 7, é primeiramente submetido a uma primeira ultrafiltração com a utilização de um filtro de polissulfona lavado em condições estéreis com água bidestilada com 100 000 NMGT. Esta ultrafiltração realiza-se convenientemente sem a utilização de pressão. O filtrado obtido é submetido a uma segunda ultrafiltração com a utilização de um filtro de acetato de celulose lavado, igualmente em condições estéreis, com água bidestilada com 20 000 NMGT, em que esta ultrafiltração é realizada sem a utilização de pressão. O concentrado assim obtido é colectado, eventualmente encerrado num dos perímetros intermédios em ampolas sob condições estéreis e pelo menos submetido a uma filtração de esterilização. A filtração de esterilização realiza-se convenientemente sob utilização dc um filtro de membrana com um limite de selecção de 0,2 pm.

Preparação da composição standardizada O extracto obtido de acordo com a filtração de esterilização é, depois de determinação do seu teor em lectina biologicamente activa ou em lectinas biologicamente activas, é regulado até à diluição óptima de acordo com a maneira descrita e embalado em ampolas sob as condições esterilizadas. A diluição depende nesse caso da actividade biológica determinada que se exprime em “unidades biológicas” e se anota nas ampolas e a partir da qual se tenciona para finalidades de emprego obter a composição preparada. As composições estandardizadas obtidas de acordo com a maneira de proceder descrita contêm quantidades exactamente definidas de lectinas de visco imunologicamente activas específicas do galactósido e permitem o seu doseamento exacto de modo que se excluam não só um lesionamento do paciente provocado por uma sobredosagem indesejada mas também uma inactividade provocada por doseamento demasiadamente pequeno.

As fases de fraccionamento a realizar para a preparação dos concentrados de lectina de visco do tipo mencionado antes são realizadas convenientemente imediatamente umas a seguir às outras, assim como na preparação subsequente das composições estandardizadas isoladas se tem de atender à estrita conservação de 12 :/ Ο condições estéreis.

Estabilização da solução previamente diluída on tamponizada

Para sc manter a actividadc dc lcctina de visco específica do lactósido adiciona-se um agente estabilizador numa quantidade compreendida entre 0,1 mg/ml e 10 mg/ml, de preferência 5 mg/ml.

Os estabilizadores apropriados para o efeito são alcanóis, especialmente polióis e os seus derivados, como por exemplo hidratos de carbono como glucose, sacarose, ciclodextrinas, ciclodextrinas derivatizadas, pentaeritrite, manite, sorbite e ácidos poli-hidroxi gordos como ácido poliláctico e ésteres de ácido poliláctico, como também outros polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona, álcool polivinílico, assim como aminoácidos ou proteínas como glicina ou albumina, especialmente albumina do soro humano.

DETERMINAÇÃO DA ACTIVTDADE BIOLÓGICA OU IMUNOBIOLÓGICA

Ensaios in vitro

Materiais e métodos

Para os ensaios utilizaram-se extractos obtidos a partir de plantas de visco a partir dos quais se isolaram lectinas de visco. O teor de lectinas que se ligam a açúcar foi determinado por meio de um ensaio enzimático - Ensaio de Lectina Ligada com Enzima [ELLA] como foi descrito antes por Hajto, T„ Hostanska, K., 13

Gabius, H.-J [Câncer Res., 49 (1989) 4803 a 4808], Para estes ensaios foram além disso utilizados anticorpos policlonais contra ML I e Aslalofetuin (Tipo I) oxiodato com periodato e tratado com formaldeído (de Sigma, St. Louis, USA).

Detenninacão da Vitalidade das Células

Isolaram-se células sanguíneas mononucleares periféricas Humanas (PBMC) de vários dadores por meio de centrifugação em gradiente de acordo com Ficoll. Depois da lavagem, os PMBC foram suspensos em meio de hibridoma isento de soro com pequeno teor de proteína (fornecido por GIBCO BRL AG, Basileia, Suíça), que foi completado com L-glutamina (2 mM) e 50 pg/ml de gentamicina. As células foram incubadas em placas de microtitulação de fundo plano (96 depressões) numa concentração de 1 x 106 células por depressão em presença ou em ausência de diferentes agentes como se indicam seguidamente na discussão dos resultados, durante 24 horas a 37°C numa atmosfera húmida com um teor de 5 % de C02. Independentemente disso, a vitalidade das células foi determinada por meio do ensaio de expulsão de azul de tripano assim como pela absorção de acetato de fluoresceína e sua subsequente hidrólise com obtenção de fluoresceína.

Determinação da Citotoxicidade O ensaio da citotoxicidade de células mortais naturais, em seguida designado como citotoxicidade NK, realizou-se como foi descrito pormenorizadamente por Hajto, T. Hostanska, K., Gabius, H.-J, [Câncer Res., 49 (I.c.)] e Hajto, T., Ilostanka, K. [Clín. Trials J., 22 (1985) 514 a 520], Para o efeito, iaolaram-se células mononucleares por meio de gradiente Ficoll-Hypaque Uma quantidade pré-determinada de células alvo K562 sensíveis a NK, nomeadamente 2,5 x 103 células, foram adicionadas a células efectuadoras em diferentes concentrações para, no efeito final, se obterem proporções de mistura de células efectuadores para células alvo de 100:1, 50:1, 25:1 e 10:1 num volume final de 200 μΐ por depressão. Imediatamente depois da preparação da suspensão de células foram introduzidas nas depressões 2 pCi de [metil-3H]-timidina (actividade específica : 25 Ci/mmol). Depois de uma duração de incubação de 18 a 20 horas recolheram-se as células e determinou-se quantitativamente a absorção de [3H]-timidina por meio de um contador de cintilações. A absorção espontânea da substância marcada estava em relação com a actividade das células alvo. A proporção percentual da inibição específica (Pi) expresso pelo índice fitotóxico das células efectuadoras foi calculado de acordo com a seguinte fórmula : ri_(1 Recepção de ensaio )::1QQ Recepção espontânea A incorporação de [3H]-timidina nas células efectuadores foi igualmente determinada de maneira semelhante. Porque o valor obtido neste caso, no entanto, foi deprezavelmente pequeno, pôde deixar-se este factor fora de consideração. O número dc cclulas efectuadoras que originaram uma inibição específica de 33 % (Pi - 33) foi calculado por meio de uma escala semi-logarítmica. Estes valores de Pi 33 foram utilizados como meio auxiliar valioso para a comparação de diferentes resul Lados experimentais c expressos como citotocixidade específica. Além disso, realizaram-se ensaios nas populações de células mononucleares isoladas para os ensaios NK. Para outras células como os linfócitos determinou-se um factor de correcção. Para ensaios in vivo da actividade NK foi utilizado um grupo de 12 coelhos New Zealand (NZW) brancos.

Excluiu-se rigorosamente uma contaminação por endotoxinas, como pormenorizadamente descrito por Hajto, T., Hostabska, K., Gabius, H.-J. [Câncer Res. 49 (I.c.)]. Todos os dados foram determinados com a utilização de um método estatístico e na realidade por meio do t-Teste de acordo com Student.

Durabilidade de células sanguíneas mononucleares periféricas humanas em presença de lectina de visco I (ML D

Para o esclarecimento da acção citotóxica e/ou citostática de ML I determinou-se a vitalidade de PBMC in vitro em presença de diferentes concentrações da lectina A vitalidade das células foi significativamente (p < 0,05) influenciada pelas concentrações de lectina > 10 ng/ml, veja-se : Hajto, T., Hostabska, K., Frei, K., Rordorf C., Gabius, H.-J. [Câncer Res. 50 (I.c.)]. Em utilizações de valores menores não tóxicos, ML I apresentou uma ligeira acção mitogénica o que está de acordo com os conhecimentos de outros autores [Franz, H., Oncology, 43, Suplemento 1, (1986) 23 a 24; Metzner, G., Franz, H., Kindt, A., Fahlbusch, B„ Súss, J., Immunbiol., 169 (1985) 461 a 471; Luther, P., Theise, H., Chatterjee, B., Karduck, D., Uhlenbruck, G. Int. J. Biochem., 11 (1980) 429 a 435], A resposta imune óptima relativamente à multiplicação dos linfócitos com um índice de estimulação de 1,7 foi encontrada com uma concentração de lectina de 0,01 ng/ml. Não só a actividade citotóxica como também a actividade mitogénica foram aumentadas pela presença do açúcar específico (D-galactose) por diminuição da ligação da lectina. Deste facto resulta a importância das acções de acção recíproca entre proteínas c substâncias hidrocarbonadas no decorrer das reacções celulares de ML I.

Accões de lectinas de visco sobre células alvo ÍK^l sensíveis a NK e sobre a citotoxicidade NK in vitro Células K562 são células de leucemia mielóicas humanas que são sensíveis em relação à citotoxicidade de células NK e são utilizadas em contexto mais vasto para a determinação da actividade de NK de PMBC. Na cultura de células K562 todos os três tipos de lectinas de visco mostraram uma comparativamente forte actividade citotóxica [Hajto, T., Hostabska, K., : Interlec Meeting, Berlim 1991], A hipersensibilidade mencionada antes em relação a lectinas foi também observada em culturas de outras células de leucemia (MOLT 4) [Ribereau-Gayon, G, Jung, M.L., DiScala, D., Beck, J-P. Oncology, 43, Suplemento 1, (1986) 35 a 41], Ao contrário destas linhas de células tumorais, ML I demonstrou na cultura de PMBC humano saudável actividades citotóxicas que foram menores em três a quatro ordens de grandeza do que as achadas em culturas de células leucémicas. Por consequência, não é surpreendente que lectinas de visco se forem incubadas em concentrações não tóxicas para os linfócitos e facilmente mitogénicas para as células alvo embora em concentrações tóxicas, podem aumentar a actividade de células NK em relação a células Ks«2, [Hajto, ΊΓ, Hostabska, K„ :

Interlec Meeting, Berlim 1991]. Foi portanto de interesse especial, investigar se a vigilância in vivo de células NK possibilita a dosagem de lectina óptima apropriada para o sistema imune não tóxico e para a utilização clínica que pode ser administradas sob a forma de extractos de visco em pacientes com tumores.

Ensaios in vivo

Actividade de Lectina de Visco I sobre a actividade citotóxica de células NK in vivo Para confirmar a utilização útil de lectinas de visco na utilização clínica ter a significação existente de maneira melhor do ensaio NK para a utilização de lectinas de visco foi investigada como fase mais próxima a acção de diferentes dosagens de ML I num grupo de coelhos NZW. O aumento máximo da actividade NK observou-se entre a 24a e a 72a horas depois de uma injecção intravenosa única e verificou-se que as respostas imunes dependentes da dosagem utilizada in vivo foram semelhantes às detectadas in vitro [Hajto, T., Hostabska, K., : Interlec Meeting, Berlim 1991], como é evidente a partir da figura que representa a dependência do aumento da actividade NK no sangue periférico de coelhos NZW entre a 24a e a 72a horas depois de uma injecção intravenosa única é dependente da dosagem administrada. Desse diagrama conclui-se que a diminuição das dosagens de lectina tóxicas para o sistema imune exerce uma acção de estimulação de NK resulta num aparecimento da acção de estimulação de NK com um óptimo a 0,8 ng/kg em coelhos que é de quatro a cinco ordens de grandeza menores do que o valor DLjo de ML I. Além disso, descobriu-se uma dosagem óptima semelhante destes componentes do extracto cm pacientes [1 ng/kg] que foram tratados com um extracto de visco standardizado com base no teor em lectina que liga açúcar : Hajto, T., Hostabska, K., Gabius, G.H. [Therapeutikon, 4 (1990) 136 a 145], Não só a actividade de NK como também a frequência das células LGL que circulam no sangue foram estimuladas por ML I : Hajto, T., Hostabska, K., Gabius, H.-J. [Câncer Res., 49 (I.c.)].

Comparação da actividade de lectinas de visco (ML I e ML III sobre a citotoxicidade NK in vivo

Verificou-se de maneira fundamentada que os três tipos de lectina (ML I, ML II e ML ΠΙ) contidos no extracto de visco estão sucessivamente em acção de troca. Este facto deve ser tomado em consideração na sua determinação por meio de ELISA ou ELLA : Ziska, P., Franz, H. [Lectins, Vol. IV (1985) 473 a 480], Não obstante o facto de a proporção de ML Π e de ML III em plantas de visco e numa grande parte dos seus extractos montar apenas a 15 % da quantidade total de ML I, veja-se Ziska, P., Franz, H. [Lectins, Vol. IV (I.c.)], podem-se verificar certas alterações das suas proporções de mistura como consequência do processo de preparação em diversos extractos (ISCADOR) e não sejam de excluir. Por consequência, para uma utilização terapêutica destes extractos é igualmente necessário um ensaio da actividade imunomoduladora de ML Π e de ML III. ML ΙΠ como se verificou como óptima para ML I não estão em condições de estimular significativamente a NK-citotoxicidade no sangue de coelhos (p > 0,05). Ao contrário de ML ΙΠ, ML Π apresentou signifícativamente (p < 0,025) embora quantitativamente em menor número, acções menos acentuadas sobre a actividade NK na administração em dosagens apropriadas em comparação com ML I : Hajto, T., Hostabska, K., Gabius, H.-J. [Câncer Res., 49 (I.c.)].

Accão de lectina de visco I sobre o entrelaçamento de Citoquinas e Lmfoqumas

Por observação de células NK descobriu-se uma utilização óptima de lectina de visco por meio de que podem ser estimulados os inúmeros parâmetros do sistema de defesa do receptor [Hajto, T., Hostanska, K., Gabius, H.-J. [Câncer Res., 49 (I.c.) e Hajto, T., Hostanska, K., Gabius, G.H., Therapeutikon 4, (I.c.)] e deixa de reduzir o papel possível das citoquinas. Esta absorção pôde ser verificada num estudo anterior : Hajto, T., Hostanska, K., Frei, K., Rordorf, C., Gabius, H.-J. [Câncer Res. 50 (I.c.)]. Na diminuição da concentração citotóxica de ML I numa cultura de PBMC humanos para uma gama que não é tóxica para linfócitos, observou-se uma secreção multiplicada de factor de necrose de tumores alfa (TNF-alfa), Interleucina-1 (IL-1) e Interleucina-6 (EL-6). Esta secreção de citoquinas multiplicada por lectina depende da ligação específica da lectina a glucoconjugado celular. Além disso, o teor no soro de TNF-alfa e de IL-6 em oito pacientes de cancro depois da injecção de um extracto com um teor óptimo de lectina (1 ng/kg) aumentou.

Estes ensaios que se referem ao entrelaçamento de citoquina não foram realizados até ao fim até hoje; no entanto, é muito provável que TNF-alfa, EL-1 e IL-6 desempenhem um papel decisivo na determinação de reforço induzido por lectina em diferentes mecanismos de defesa do receptor Uma última indicação de NK induzida por lectina pode lauibém ser ordenada pela libertação multiplicada de IL-1, IL-6 e TNF-alfa, que está em posição de reforçar a acção de troca entre IL-2-receptores em células NK e IL-2 (reforço da expressão CD25 e IL-2-síntese). Outros ensaios para clarificação desta pergunta estão em marcha.

Conexão entre acção imunomodulador mediada por lectinas de visco e actividade anti tumor

De acordo com a determinação da dose imunomoduladora óptima de lectina de visco levanta-se a questão de saber se a lectina pode provocar uma acção antitumor se for usada para uma utilização a longo prazo. No decorrer de ensaios com diferentes dosagens de ML I verificou-se que apenas a dosagem óptima (1 ng/kg) produz uma diminuição do desenvolvimento do tumor em ratos sem pelo com uma transplantação estranha de tumor humano [Stelberg et al., Universidade de Essen (BRD), dados não publicados]. De maneira semelhante, extractos de visco foram standardizados com base no teor de lectina que liga açúcar e correspondentemente foram administrados com um esquema de doseamento óptimo, estando em posição de induzirem uma actividade antitumor em pacientes com tumores no estágio adiantado da doença induzirem uma actividade antitumor [Hajto, T., Hostanska, K., Fomalski, M., Kirsch, A. Dtsch. Zeitschr. Onkol., 23 (1991) 1 a 6], Alem disso, ensaios em modelos de animais mostraram uma acção de protecção de ML I sobre o sistema NK na sua administração em combinação com uma terapia de radiação como dados não publicados que estão de acordo com as observações clínicas, mostraram : Hajto, T., Hostanka, K., Gablus G. H [Therapeutikon, 4 21

RESULTADOS E CONCLUSÕES FINAIS A TIRAR

As realizações mencionadas anles que no decurso dos ensaios descritos se apoiam nos resultados obtidos, tomam nítido que um hiperdesenvolvimento do sistema NK relativamente à actividade citotóxica e/ou à frequência das células NK que circulam no sangue, pode possibilitar que estão contidas dosagens óptimas para lectinas de visco muito tóxicas como se obtêm nos extractos de visco e podem exercer uma estimulação do mecanismo de defesa de um receptor.

Os mencionados resultados podem além disso, pressupor que para a actividade antitumor das lectinas de visco não só são necessárias a sua actividade citotóxica mas também a sua actividade imunomoduladora.

Os resultados obtidos deixam também reconhecer que a administração de composições de lectina de visco estabilizadas e estandardizadas com base na sua actividade biológica de teor exactamente definido de acordo com um plano dos elementos optimizado encontrar um valor aconselhável para utilização na terapia de tumores e na luta de outra doenças, por exemplo por aumento de resistência imune natural.

Lisboa, 21 de Dezembro de 2001 7 ί '( o AQeote Oficial da Propriedade Industriai

JOSE Dl Λ.

Rua do Salitre, 195, r/c-Drt. 1269-C63 LISSOA

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Concentrados de lectinas, obtidos a partir de extractos de visco e preparações das lectinas de visco correspondentes normalizadas tendo um teor dc 50 ng/ml a 350 ng/ml em lecitinas de visco imunologicarnente activas, específicas do galactósido, diluídas em função da actividade biológica procurada, determinadas como Standard I das lectinas de visco, nas quais a quantidade das lectinas se refere unicamente às lectinas biologicamente activas.
2. 2. Preparações de acordo com a reivindicação 1, sob a forma de uma solução que tem um pH de 7,0 a 7,5.
3. 3. Preparações de acordo com as reivindicações 1 a 2, nas quais se adicionam estabilizantes para conservar o potencial activo da lectina.
4. 4. Processo para a fabricação de concentrados das lectinas de visco de acordo com as reivindicações 1 a 3, obtidos a partir de extractos aquosos de visco por filtração fraccionada, caracterizado pelo facto de numa primeira fase operacional de fraccionamento a partir de um extracto aquoso de visco não fermentado, por ultrafíltração, se obter um concentrado que compreende substâncias que têm uma massa molecular de 20 kDa a 100 kDa, se submeter o concentrado a uma filtração de esterilização aquando de uma segunda etapa de fraccionamento, se determinar a actividade biológica do concentrado, se determinar a concentração das lectinas de visco imunologicamente activas, se diluir o concentrado de acordo com a actividade biológica pretendida e se estabilizar, caso assim se pretenda, se dosear o teor em lectinas necessário para uma utilização terapêutica, se dividir e se introduzem as doses em ampolas estéreis e isentas de substâncias pirogénicas.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de se efectuarem duas ultrafíltrações na primeira fase de fraccionamento, nas quais se utiliza para a primeira ultrafíltração um filtro de polissulfona que tem um limite nominal de separação de massa molecular (NMGT) igual a 100 000, se lavar o filtrado duas vezes com uma solução tampão e se utilizar para a segunda ultrafíltração um filtro de acetato de celulose que tem uma NMGT igual a 20 000.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo facto de na segunda fase de fraccionamento se efectuarem duas filtrações esterilizantes.
7. 7. Processo de acordo com uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo facto de se trabalhar numa gama pH de 7,0 a 7,5.
8. 8. Processo de acordo com uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo facto de se efectuar a primeira e a segunda fases operacionais de fraccionamento uma imediatamente a seguir à outra com um intervalo máximo de 3 7<r !? Vi duas horas.
9. 9. Processo de acordo com uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo facto de, como agentes estabilizantes, se utilizarem alcanóis, especialmente polióis e seus derivados tais como hidratos de carbono, por exemplo glucose, sacarose, ciclodextrinas, ciclodextrinas modificadas, pentaeritritol, manitol, sorbitol e ácidos gordos poli-hidroxilados, como ácido poliláctico e os ésteres de ácido poliláctico assim como outros polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona, álcool polivinílico, assim como aminoácidos como a glicina.
10. 10. Processo de acordo com as reivindicações 4, 8 e 9, caracterizado pelo facto de se adicionar os agentes estabilizantes numa quantidade que representa 0,1 mg/ml a 10 mg/ml, de preferência 5 mg/ml da solução diluída ou tamponizada.
11. 11. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de se efectuar a determinação da actividade biológica in vitro por meio de três métodos de ensaio independentes, nos quais se determina a proporção das lectinas activas que formam uma ligação com o açúcar utilizando uma dosagem enzimática optimizada, se medir a actividade celular numa cultura de células mononucleares com poros periféricas (PMNC) humanas por meio de azul de tripane e de diacetato de fluoresceína hidrolisado com obtenção de fluoresceína, e se determinar a absorção da [3H]-tímidina em células leucémicas [K562] sensíveis às lectinas. 4
12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de se efectuar a normalização das composições obtidas que contêm uma fracção das lectinas de visco específicas do galactósido biologicamente activo, com base nos valores obtidos na determinação da actividade biológica.
13. 13. Composições das lecitinas de visco estabilizadas e normalizadas tendo um teor definido de lectinas de visco específicas ao galactósido imunologicamente activo que possui uma actividade biológica definida obtidas de acordo com um processo de acordo com uma das reivindicações 4 a 12.
14. 14. Medicamento que contém lecitinas de visco normalizadas e estabilizadas de acordo com as reivindicações 1 a 3 ou 13.
15. 15. Utilização das lectinas de visco de acordo com as reivindicações 1 a 3 ou 13 para a fabricação de um medicamento que visa aumentar a resistência imunológica natural em seres humanos ou mamíferos e/ou para a terapia de tumores. Lisboa, 21 de Dezembro de 2001