PT600970E - Utilizacao de analogos ou antagonistas da interleucina-10 para tratar toxicidade induzida por endotoxinas ou superantigenios - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE ANÁLOGOS OU ANTAGONISTAS DA INTER-LEUCINA-10 PARA TRATAR TOXICIDADE INDUZIDA POR ENDOTOXINAS OU SUPERANTIGÉNIOS"

Campo do invento O presente invento está relacionado com um método de modulação das respostas imunes, incluindo tratamento de sintomas do tipo choque séptico ou tóxico, e.g., toxicidade induzida por endotoxinas ou por superantigénios, e estados auto-imunes pela administração de uma quantidade eficaz de interleucina-10 (IL-10) ou de um seu análogo ou antagonista, nos casos em que a inflamação ou a função imune mediada por células T é acompanhada de um nível anormal de factor de necrose tumoral alfa.

Fundamento Várias infecções podem resultar em alterações fisiológicas e metabólicas profundas. Os sintomas podem variar, mas incluem febre, hipotensão, acidose metabólica, necrose dos tecidos, disfunção generalizada dos orgãos e finalmente, quando não tratadas correctamente, morte. Ver, e.g. Berkow (ed) The Merck Manual. Rahway, New Jersey; Weatherall et al., (eds) Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, New York; Braunwald et al, (eds) Harrison's Textbook of Internai Medicine. Mcgrw-Hill, New York; ou Wyngaarden et al., (eds) Cecil's Textbook of Medicine, Saunders Co., Philadelphia; cada um deles sendo aqui incluído como referência. O choque séptico é um modelo de respostas induzidas por endotoxinas. O choque séptico é causado pela apresentação de uma endotoxina, tipicamente um componente do tipo lipopolissacárido (LPS) das paredes celulares das bactérias Gram-negativas, ao sistema imunitário. O choque tóxico é um modelo de respostas induzidas por superantigénios e é causado pela libertação de um componente proteico da parede celular das bactérias Gram-positivas, e.g. enterotoxina B de estafilococos (SEB). Se bem que ambas as respostas sejam inicialmente causadas pela infecção microbiana, o sistema imune responde diferencialmente ao produto microbiano causando a respectiva resposta.

Na resposta do tipo choque induzida pelas endotoxinas, e.g., LPS, demonstrou-se recentemente que uma proteína do hospedeiro, factor de necrose tumoral (TNF), induz muitos dos efeitos prejudiciais da septicémia por bactérias Gram-negativas. A imunização passiva com anti-soros contra NF pode evitar muitos dos efeitos letais da bacteriémia por Gram-negativas ou endotoxémia. Ver, e.g., Tracey et al. (1986) Science. 234:470-474; Beutler et al. (1986) Nature 320:584-588; e Tracey et al. (1987) Nature 330:662-664. Níveis elevados de TNF no soro também foram observados noutras infecções, incluindo meningite meningocóccica, malária e leishmaniose. Muitos doentes com níveis de TNF circulantes elevados possuem um aumento da disfunção dos orgãos juntamente com uma mortalidade mais elevada. Ver, e.g., Waage et al, (1987) Lancet 355-357; Girardin et al, (1988) New Engl. J. Med.. 319:397-400; Scuderi et al, (1988) Lancet 1364-1365; eKem et al. (1989) Am. J. Med.. 87:139-....

Foi descrito que a administração de TNF a animais ou ao homem resulta em níveis detectáveis de interleucina-6 (IL-6), no soro, 2-6 horas mais tarde. Mclntosh et al. (1989) J. Immunol. 143: 162-167; e Brouckaert et al, J. Exp. Med.. Vol. 169, pg. 2257 (1989). IL-6, também conhecida como factor estimulador de células B-2, interferão β2, ou factor estimulador de hepatócitos, foi identificada como uma glicoproteína derivada de células T que provoca maturação de células B. Ver, e.g., Kishimoto, Blood 74:1-10. Mais recentemente, demonstrou-se que IL-6 possui actividades biológicas pleiotrópicas, incluindo indução de proteínas da fase aguda em hepatócitos e acções em células progenitoras hematopoiéticas e células T. Ver, e.g., Geiger et al.. Eur. J. Immunol.. Vol 18, pg. 717 (1988); Marinjovic et ai, J. Immunol. Vol. 1.42, pg. 808 (1989); Morrone et al., J. Biol. Chem.. Vol. 263, pg 12554 (1988); e Perlmutter et al., J. Clin. Invest., Vol. 84, pg. 138 (1989). Stames et al., J. Immunol.. Vol. 145, pgs. 4185-4191 (1990), demonstraram que um anticorpo antagonista de IL-6 prolonga a sobrevivência em modelos de choque séptico de ratinho. A enterotoxina B de estafilococos (SEB) é um superantigénio e pode induzir uma reacção de choque tóxico. Estas reacções resultam da activação de uma subsérie substancial de células T, conduzindo a reacções imunes sistémicas graves mediadas pelas células T. Esta resposta é característica das respostas mediadas pelas células T, para as quais a IL-10, ou seus análogos ou antagonistas, serão úteis para o tratamento terapêutico. Mecanisticamente os superantigénios parecem interactuar directamente com o elemento νβ do receptor das células T e activar as células T com uma especificidade relativamente baixa de MHC classe II. Ver Herman et al, (1991) em An. Rev. Immunol. 9:745-772.

Actualmente, as condições sépticas, tais como septicémia, bacterémia e similares, são tipicamente tratadas com compostos antimicrobianos. A septicémia é comum nas instalações hospitalares, onde a infecção bacteriana muitas vezes ocorre a partir das inserções de catéteres ou de intervenções cirúrgicas. No entanto, quando tais condições estão associadas a choque não existem medidas terapêuticas adicionais eficazes para melhorar o síndrome de choque que é causado, em parte, pelas citocinas induzidas na resposta à infecção. Ver, e.g., Young (1985) " " pgs. 468-470, em Mandell et al, (eds) Principies and Practice of Infectious Diseases (2nd Ed.)· John Wiley & Sons, New York. Em particular, o tratamento com antibióticos conduz à morte microbiana e libertação de produtos bacterianos que causam a resposta de choque. A sepsis bacteriana e o choque séptico relacionado são frequentemente condições letais causadas por infecções que resultam de certos tipos de cirúrgia, trauma abdominal e supressão imune da terapia do cancro ou de transplantes, ou de outros estados clínicos. Nos Estados Unidos, cerca de 700 000 doentes por ano sofrem de choque séptico provocado por infecções bacterianas. Destas, cerca de 160 000 desenvolvem sintomas de choque séptico e cerca de 50 000 morrem como resultado disso. O choque tóxico atinge menos pessoas por ano, mas a gravidade da resposta é tipicamente mais ameaçadora da vida.

Face às consequências graves destas respostas imunológicas à infecção, são extremamente necessárias técnicas eficazes para o tratamento profilático ou terapêutico de choque induzido por microorganismos. O presente invento proporciona composições e métodos para o tratamento destas e de outras reacções imunológicas graves.

De acordo com o presente invento, é proporcionada a utilização de interleucina-10 ou um seu análogo, agonista ou antagonista, na produção de uma composição farmacêutica para administração a um hospedeiro, de forma a modular a inflamação ou função imune mediada por células T num hospedeiro, em que a referida inflamação ou imunidade mediada pelas células T é acompanhada de um nível anormal de factor de necrose tumoral alfa. -5-

Preferencialmente, a interleucina-10 é seleccionada do grupo consistindo em polipeptídeos maduros das grelhas de leitura definidas pelas sequências de aminoácidos que se seguem:

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cis Cis Leu Vai Leu Leu Tre Gli Vai Arg Ala Ser Pro Gli Gin Gli Tre Gin Ser Glu Asn Ser Cis Tre His Fen Pro Gli Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Fen Ser Arg Vai Lis Tre Fen Fen Gin Met Lis Asp Gin Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lis Glu Ser Leu Leu Glu Asp Fen Lis Gli. Tir Leu Gl i Cis Gin Ala Leu Ser Glu Met Ile Gin Fen Tir Leu Glu Glu Vai Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Asp Ile Lis Ala His Vai Asn Ser Leu Gli Glu Asn Leu Lis Tre Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cis His Arg Fen Leu Pro Cis Glu Asn Lis Ser Lis Ala Vai Glu Gin Vai Lis Asn Ala Fen Asn Lis Leu Gin Glu Lis Gli Ile Tir Lis Ala Met Ser Glu Fen Asp Ile Fen Ile Asn Tir Ile Glu Ala Tir Met Tre Met Lis Ile Arg Asn e

Met Glu Arg Arg Leu Vai Vai Tre Leu Gin Cis Leu Vai Leu Leu Tir Leu Ala Pro Glu Cis Gli Gli Tre Asp Gin Cis Asp Asn Fen Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Fen Ser Arg Vai Lis Tre Fen Fen G'ln Tre Lis Asp Glu Vai Asp Asn Leu Leu Leu Lis Glu Ser Leu Leu Glu Asp Fen Lis Gli Tir Leu Gli Cis Gin Ala Leu Ser Glu Met Ile Gin Fen Tir Leu Glu Glu Vai Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Glu Ala Lis Asp His Vai Asn Ser Leu Gli Glu Asn Leu Lis Tre Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cis His Arg Fen Leu Pro Cis Glu Asn Lis Ser Lis Ala Vai Glu Gin Ile Lis Asn Ala Fen Asn Lis Leu Gin Glu Lis Gli Ile Tir Lis Ala Met Ser Glu Fen Asp Ile Fen Ile Asn Tir Ile Glu Ala Tir Met

Tre Ile Lis Ala Arg, -6- em que é usada a abreviatura de três letras para indicar os L-aminoácidos, começando a partir do extremo N. Estas duas formas de IL-10 são por vezes referidas como IL-10 humana (ou factor inibidor da síntese de citocinas humano) e IL-10 virai (ou BCRF1), respectivamente. Ver, Moore et al., (1990) Science 248:1230-1234; Vieira et al, (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. 88: 1172-1176; Fiorentino et al. (1989) J. Exp, Med. 170:2081-2095; e Hsu et al. (1990) Science 250: 830-832. Os mutantes da sequência proteica natural, e.g., variantes alélicas e muteínas, incluindo variantes de deleção e inserção, são composições alternativas cujas utilizações são aqui incluídas.

Mais preferencialmente, a IL-10 madura usada no método do invento é seleccionada do grupo constituído por:

Ser Pro Gli Gin Gli Tre Gin Ser Glu Asn Ser Cis Tre His Fen Pr o Gli Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Fen Ser Arg Vai Lis Tre Fen Fen Gin Met Lis Asp Gin Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lis Glu Ser Leu Leu Glu Asp Fen Lis Gli Tir Leu Gli. Cis Gin Ala Leu Ser Glu Met Ile Gin Fen Tir Leu Glu Glu Vai Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Asp Ile Lis Ala His Vai Asn Ser Leu Gli Glu Asn Leu Lis Tre Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cis His Arg Fen Leu Pro Cis Glu Asn Lis Ser Lis Ala Vai Glu Gin Vai Lis Asn Ala Fen Asn Lis Leu Gin Glu Lis Gli Ue Tir Lis Ala Met Ser Glu Fen Asp Ile Fen Ile Asn Tir Ile Glu Ala Tir Met Tre Met Lis Ile Arg Asn e

Tre Asp Gin Cis Asp Asn Fen Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Fen Ser Arg Vai Lis Tre Fen Fen Gin Tre Lis Asp Glu Vai Ásp Asn Leu Leu Leu Lis Glu Ser Leu Leu Glu Asp Fen Lis Gli Tir Leu Gli Cis Gin Ala Leu Ser Glu Met Ile Gin Fen Tir Leu Glu Glu Vai Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Glu Ala Lis Asp His Vai Asn Ser Leu Gli Glu Asn Leu Lis Tre Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cis His Arg Fen Leu Pro Cis Glu Asn Lis Ser Lis Ala Vai Glu Gin Ile Lis Asn Ala Fen Asn Lis Leu Gin Glu Lis Gli Ile Tir Lis Ala Met Ser Glu Fen Asp Ile Fen Ile Asn Tir Ile Glu Ala Tir Met Tre Ile Lis Ala Arg. O presente invento baseia-se, em parte, na descoberta de que IL-10 inibe a síntese de várias citocinas que medeiam reacções inflamatórias indesejáveis (e.g. choque séptico) e a activação de células T por superantigénios, um acontecimento que conduz aos síndromes do tipo choque tóxico. Pelo contrário, os antagonistas de IL-10 aumentarão estas mesmas respostas imunes e tal aumento é, de facto, desejável noutras situações clínicas, e.g., em certos modelos de tumores e auto-imunidade.

Breve descrição das figuras

Figura 1. Ilustração do plasmídeo TRPC11. [ver exemplo 3].

Figura 2. IL-4, hIL-10 e vIL-10 inibem a síntese de (A) IFNy e (B) TNFa por células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) activadas por IL-2. ND, não determinado. As barras de erro mostram a gama de amostras em duplicado numa experiência. PBMC de dadores diferentes variaram na sua capacidade para produzir IFNy e TNFa quando estimulados por IL-2. Os efeitos inibidores de IL-4 e de IL-10 são revertidos por anticorpos neutralizantes (c) anti- -8- IL-4 e (d) anti-IL-10, respectivamente. PBMC foram cultivados como descrito na secção experimental com 200 U/ml de IL-2 recombinante (rIL-2) e quantidades variáveis de rIL-4 ou IL-10 produzida por células COS (COS-hIL-10), na presença de 10 pg/ml de imunoglobulinas neutralizantes anti-citocinas ou controlo de isotipo. O anticorpo e citocina foram incubados durante 30 minutos antes da adição aos PBMC.

Figura 3. (A) IL-4, mas não IL-10 humana (hIL-10) ou virai (vIL-10), inibe a actividade assassina de linfócitos activados (LAK) induzida por IL-2 em PBMC. PBMC de uma experiência semelhante à da Figura 2 foram colhidos juntamente com os sobrenadantes e testados quanto à citotoxicidade contra células COLO (carcinoma do cólon, Fig. 3A1) e Daudi (linfoma de Burkitt Fig. 3A2) marcadas com 51Cr. (B) A actividade LAK é expressa pelas células CD56+ em PBMC em cultura com IL-2 e IL-10. PBMC foram corados com anticorpo anti-CD56 conjugado com FITC, e separados num FacStar Plus (Becton-Dickinson, San Jose, CA). Testou-se a actividade citotóxica nas fracções CD56+ e CD56- (pureza 99,7%). Obtiveram-se resultados semelhantes com células derivadas das culturas de PBMC com IL-2 sozinha.

Figura 4. (A) A síntese de IFNy induzida por IL-2 por células NK purificadas é directamente inibida por IL-4 mas não por hIL-10 ou vIL-10. As células NK purificadas por FACS (pureza >99,5%) foram cultivadas a 106 células/ml com 200 unidades/ml de rIL-2 com 500 unidades/ml de rIL-4 ou COS-hIL-10, COS-vIL-10 ou sobrenadantes testemunha de COS (10%) em meio de Yssel durante 4-5 dias, depois os sobrenadantes de culturas em duplicado foram colhidos e misturados para medição de IFNy por ELISA. (B) A proliferação de células purificadas NK e PBMC induzida por IL-2 é inibida por IL-4 mas não por hIL-10/vIL-10 (Figura 4B1: NK separadas; Figura 4 B2: PBL).

Figura 5. (A) Adição de células aderentes, mas não células T, restaurou a inibição, mediada por IL-10, da síntese de IFNy induzida por IL-2 em células NK purificadas. (B) Adição de monócitos purificados restaurou a inibição, mediada por IL-10, da síntese de IFNy induzida por IL-2 em células NK purificadas. Os monócitos sozinhos produziram quantidades inferiores às detectáveis de IFNy. As barras de erro mostram a gama de amostras em duplicado de uma experiência. A produção de IFNy na ausência de IL-2 foi abaixo dos limites de detecção (Figura 2). As células NK de diferentes dadores variaram na sua capacidade para produzir IFNy. (C) Efeitos de IL-10 na síntese de TNFa pelas células NK, células CD14+ e ambos os tipos em conjunto. As células NK (106 células/ml) e/ou células CD 14+ (3 x 105 células/ml) foram cultivadas durante cinco dias na presença ou ausência de 400 U/ml de rIL-2 e 10% de sobrenadante de COS-hIL-10.

Figura 6. As cinéticas de produção de IL-10, IL-6, TNFa e GM-CSF por monócitos humanos, activados por LPS. Monócitos humanos, isolados por elutriação com centrifugação, foram cultivados em sacos de Teflon (4 x 106 células/ml) na ausência ou presença de LPS (1 pg/ml) e determinada a produção de (A) IL-10, (B) IL-6, (C) TNFa ou (D) GM-CSF nos sobrenadantes de cultura colhidos nos tempos indicados pelas ELISAS específicas de citocinas.

Figura 7. Produção de IL-10 por monócitos humanos como resposta a concentrações crescentes de LPS. Monócitos humanos (4 x 106 células/ml) foram cultivados em sacos de Teflon com concentrações crescentes de LPS durante 24 horas e a produção de IL-10 foi determinada por ELISA.

Figura 8. Efeitos de IL-10 na produção de citocinas por monócitos activados por IFNy, LPS ou LPS e IFNy. Monócitos humanos (4 x 106 células/ml) foram cultivados com IFNy (100 U/ml), 1, 10, 10 ou 1000 ng/ml de LPS e combinações de LPS (1, 10, 100 ou 1000 ng/ml) e IFNy (100 U/ml) na ausência (□) ou na presença (^) de IL-10 (100 U/ml) durante 24 horas e determinou-se a produção de (A) IL-Ια, (B) IL-Ιβ, (C) IL-6, (D) TNFa ou (E) GM-CSF por ELISA específico para as citocinas nos sobrenadantes.

Figura 9. Efeitos de IL-10 humano ou IL-10 virai na produção de TNFa e GM-CSF por monócitos activados por LPS. Monócitos humanos (4 x 106 células/ml) foram activadas por LPS (1 pg/ml) e cultivadas com IL-10 humana (100 U/ml) ou IL-10 virai na ausência ou na presença de mAb 19F1 neutralizante anti-IL-10 (10 pg/ml) durante 24 horas e a produção de (A) TNFa ou (B) GM-CSF foi determinada por ELISA específica para as citocinas.

Figura 10. Efeitos de IL-10 exógeno, IL-10 produzida endogenamente e IL-4 nos níveis de expressão de mRNA específico de citocinas em monócitos humanos activados por LPS. Monócito humanos (4 x 106 células/ml) foram cultivados em meio a 4°C e 37°C ou activados por LPS (1 μ g/ml) na ausência ou presença de IL-4 (100 U/ml), IL-10 (100 U/ml) e mAb 19F1 neuitralizante anti-ILlO (10 pg/ml) e isolou-se mRNA após 24 horas. A expressão de β-actina, IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF e G-CSF foi determinada por transcrição inversa de mRNA e análise por PCR, com escorvas específicas de citocinas, seguido de transferência Southern dos produtos de reacção e hibridação com sondas internas. O cDNA obtido a partir de um clone de células T CD4+ foi incluído como testemunha para a expressão de TNFa e GM-CSF.

Figura 11. Efeitos de IL-10 nos níveis de expressão de mRNAs específicos de citocinas em monócitos activados por LPS. mRNA isolado a partir de monócitos humanos (4 x 106 células/ml), activados por LPS (1 pg/ml) na ausência ou presença de IL-10 (100 U/ml) durante 7 horas e expressão de IL-6, IL-8, IL-10, TGFP e β-actina foram determinados por análise de Northern.

Figura 12. Efeitos de IL-10 exógena, IL-10 produzida endoge-namiente e IL-4 nos níveis de expressão de mRNA específico de IL-10 e TGF β em monócitos humanos activados por LPS. Monócito humanos (4 x 106 células/ml) foram cultivados em meio a 4°C e 37°C ou activados por LPS (1 μ g/ml) na ausência ou presença de IL-4 (100 U/ml), IL-10 (100 U/ml) e mAb 19F1 neutralizante anti-ILlO (10 μg/ml). Isolou-se mRNA após 24 horas. A expressão de (A) IL-10, ΤΰΡβ e β-actina foi determinada por análise Northern e (B) a expressão de IL-10 foi determinada por transcrição inversa de mRNA e análise por PCR, com escorvas específicas de citocinas, seguido de transferência Southern dos produtos de reacção e hibridação com sondas internas.

Figura 13. Efeitos de IL-10 produzida endogenamente na expressão de MHC classe II em monócitos humanos activados com LPS. Os monócitos humanos foram cultivados com (A) 0 ng/ml de LPS, (B) 0,1 ng/ml de LPS, (C) 10 ng/ml de LPS ou (D) 1000 ng/ml de LPS na ausência ou presença de mAb 19F1 neutralizante anti-IL-10 (10 pg/ml) durante 40 horas. A expressão de HLA-DR/DP (Q5/13) foi determinada por imunofluorescência indirecta.

Figura 14. Efeito de IL-10 na função APC das linhas celulares de macrófagos. Topo (Fig. 14A). Linhas celulares de macrófagos 1G18.LA ou PU5.1 (106 células/ml) foram activadas com IFNy (2 ng/ml). Estas APCs foram então lavadas e incubadas (105 células/alvéolo) com células Thl HDK.1 (5 x 104 células/alvéolo) e antigénio (TNP-KLH, 10 μg/ml), na presença (£2) ou ausência () de IL-10 purificada (200 unidades/ml). Os sobrenadantes foram colhidos após 48 horas e testados relativamente a IFNy. Fundo (Fig. 14B). Macrófagos 1G18.LA foram activados, como atrás, e depois incubados (10$ células/alvéolo) com células Thl HDK.l (5 x 104 células/alvéolo) mais TPN-KLH (10 pg/ml); ou o hibridoma de células T DO 11.0 (5 x 104 células/alvéolo) mais ovalbumina (2,5 mg/ml), na presença (^) ou ausência () de IL-10 purificada (em baixo) (200 unidades/ml). Os sobrenadantes foram colhidos após 20 h e testados relativamente a IL-2. Em todos os painéis estão apresentadas as médias e desvios padrão de culturas em triplicado.

Figura 15. IL-10 induz uma alteração morfológica em macrófagos peritoneais purificados. Os macrófagos peritoneais (Mac-l+,brilhante, B220-) foram purificados por FACS e depois incubados durante 72 h, na presença de IFNy (2 ng/ml) (em cima, Fig. 15A) ou IFNy (2 ng/ml) mais IL-10 (200 unidades/ml) (em baixo, Fig. 15B). Os sobrenadantes foram removidos, as células secas ao ar, fixadas e coradas com Wrighfs-Giemsa, secas e depois fotografadas.

Figura 16. IL-10 inibe a produção das proteínas IL-1, TNF-α e IL-6 induzida por LPS em linhas celulares de macrófagos. As linhas celulares de macrófagos 1G18.LA (Figs. 16A, B e C) e PU5.1 (Figs. 16D, E e F) foram incubadas (106 células/ml) com LPS (10 pg/ml); ou LPS (10 pg/ml) mais IFNy (2 ng/ml); na presença ou ausência de IL-10 ou IL-4 (nalguns casos) ambos a 200 unidades/ml, conforme indicado. Os sobrenadantes foram colhidos e testados relativamente aos seus níveis de IL-1, IL-6 ou TNF-a.

Figura 17 (partes A, Bl, B2 e C). IL-10 inibe a expressão de RNA de TNFa induzida por LPS numa linha celular de macrófago. A linha celular de macrófago 1G18.LA foi estimulada como na Figura 16. Os sobrenadantes foram removidos após 6 h e adicionou-se solução de isotiocianato de guanidina quando da colheita das células para a preparação do RNA. 10 pg de RNA total das amostras da linha celular 1G18.LA estimuladas do mesmo modo foi aplicado num gel, transferido para membrana e hibridado com uma sonda específica de TNFa e actina.

Figura 18. Estimulação de macrófagos peritoneais. IL-10 inibe a síntese da proteína IL-6 induzida por LPS em macrófagos peritoneais. Macrófagos peritoneais (Mac-1+, brilhante, B220-) foram purificados no FACS e depois novamente incubados sozinhos ou com LPS (10 pg/ml) na presença ou ausência de IL-10 (200 unidades/ml), anti-IL-10 (10 pg/ml) ou IFNy (2 ng/ml), a 7 x 105 células/ml. Os sobrenadantes foram colhidos e testados quanto aos seus níveis de IL-6, relativamente a um padrão conhecido usando um imuno-ensaio específico (ELISA).

Figura 19. IL-10 não regula negativamente um co-estimulador solúvel ou induz um inibidor solúvel em macrófagos. (A) Os sobrenadantes foram obtidos a partir da linha celular de macrófagos 1G18.LA (106 células/ml) após estimulação com IFNy durante 24 horas e depois ainda estimulados com células Thl (HDK-1, 2 x 105 células/ml) e antigénio (KLH, 500 pg/ml) durante 24 horas. Os sobrenadantes foram concentrados e eliminado IFNy e IL-2, e depois usados num ensaio CSIF. Estes sobrenadantes sozinhos não contêm níveis detectáveis de IFNy. APC macrófagos 1G18.LA activados com IFNy (105 células/alvéolo) foram incubados com células HDK-1 (5 x 104 células/alvéolo) e antigénio (TNP-KLH, 10 pg/ml) sozinho (Δ) ou na presença de doses variáveis de IL-10 mais (□) ou menos (A) os sobrenadantes atrás referidos (concentração final 25%). Os sobrenadantes do ensaio CSIF foram colhidos após 48 horas e testados quanto aos níveis de IFNy. Estão apresentadas as médias e desvios padrões de culturas em triplicado de uma experiência. (B) Doses graduais de macrófagos do baço purificados, na ausência () ou presença (□) de IL-10 (200 unidades/ml); ou uma mistura de doses graduais de macrófagos purificados juntamente com células B (2,5 x 103 células/alvéolo) na ausência (·) ou presença (O) de IL-10 (200 unidades/ml); ou células B sozinhas na ausência (<Φ>) ou presença (o) de IL-10 (200 unidades/ml); foram usados como APC para o clone Thl HDK-1 (104 células/alvéolo) com TNP-KLH (10 pg/ml). Após 48 horas os sobrenadantes foram colhidos e testados relativamente a IFNy. Estão apresentadas as médias e desvios padrões de culturas em triplicado.

Figura 20. IL-10 protege ratinhos BALB/c de toxicidade induzida por SEB; Figura 20A: 20 pg SEB/30 mg d-Gal; Figura 20B: IL-10/20 pg SEB/30 mg d-Gal; Figura 20C: 10 pg SEB/30 mg d-Gal; Figura 20D: IL-10/10 pg SEB/30 mg d-Gal; Figura 20E: 30 mg galactosamina; Figura 20F: 10 pg IL-10.

Figura 21. IL-10 protege ratinhos de endotoxémia letal. Grupos de 20 ratinhos BALB/c foram injectados intraperitonealmente (i.p.) com 350 pg de LPS ou 350 pg de LPS juntamente com doses variáveis de IL-10 recombinante purificada de murganho. A morte ocorreu ao longo dos seis dias que se seguiram.

Figura 22. Anticorpos anti-IL-10 neutralizam a capacidade de IL-10 para proteger ratinhos de endotoxémia letal. Grupos de 20 ratinhos BALB/c receberam 1 mg de anticorpo 2A5 anti-IL-10 (Figura 22A) ou 1 mg do anticorpo testemunha de isotipo GL113 (Figura 22B) intraperitonealmente uma hora antes da administração de LPS. Os ratinhos foram injectados com 350 pg de LPS i.p. sozinho ou juntamente com doses variáveis de IL-10, como descrito na Figura 21 legenda.

Figura 23. IL-10 protege ratinhos da endotoxémia letal quando administrada 30 minutos após a injecção de LPS. Grupos de 20 ratinhos BALB/c receberam 350 pg de LPS i.p. no tempo 0 e 1,0 pg de IL-10 recombinante i.p. no tempo 0, 0,5 hr, 1 hr, 2 hr ou 5 hr após injecção de LPS. Os ratinhos testemunha que receberam 350 pg de LPS i.p. na ausência de IL-10 morreram todos nesta experiência.

Figura 24. Análise por imunofluorescência da expressão de IgM e IgD de superfície em células totais de lavados peritoneais obtidas a partir de ratinhos tratados com anti-IL-10 e ratinhos testemunha. Ratinhos BALB/c foram injectados desde o nascimento até às 8 semanas com anticorpo anti-IL-10 SXC-1 (Fig. 24D), anticorpo testemunha do isotipo J5/D (Figura 24B), tampão de fosfatos salino (PBS) (Fig. 24C) ou nada (Fig. 24A, como descrito na secção experimental. Os resultados mostram as intensidades de fluorescência de 5000 células vivas contadas em cada grupo experimental.

Figura 25. Níveis de IgM no soro de ratinhos tratados com anti-IL-10 e testemunas testados após 8 semanas de tratamento. Os resultados mostram a média geométrica ± desvio padrão de cinco soros individuais em cada grupo e incluem dados de duas experiências diferentes. Três experiências adicionais deram os mesmos resultados.

Figura 26. Respostas in vivo de anticorpos em ratinhos tratados com anti-IL-10 e ratinhos testemunha a al,3-dextrano (fjg. 26B) ou fosforilcolina (Fig. 26A). Ratinhos BALB/c foram injectados desde o nascimento até às 9 semanas com anticorpo SXC.l anti-IL-10, anticorpo J5/D testemunha de isotipo, PBS ou não receberam tratamento. As 8 semans, os ratinhos foram injectados com al,3-dextrano ou com Streptococcus pneumoniae mortos pelo calor como fonte de fosforilcolina, como descrito na secção experimental.Os resultados mostram a média geométrica ± desvio padrão dos níveis de anticorpos específicos detectados em cinco soros individuais.

Figura 27. Análise por imunofluorescência da expressão de B220 e CD3 de superfície de células linfóides do baço vivas obtidas a partir de ratinhos tratados com SXC.l anti-IL-10 e ratinhos testemunhas. Para mais detalhes, ver Figura 24 legenda - partes A-D da Figura 27 correspondem às partes A-D respectivamente da Figura 24.

Figura 28. Resposta in vivo a TNP-KLH de ratinhos tratados com anti-IL-10 ou de ratinhos testemunha. Os ratinhos foram injectados desde o nascimento até às 10 semanas de idade com anticorpo anti-IL-10 (·), ou com um controlo do isotipo (O). A 8 semana, os animais foram injectados intraperitonealmente com 10 pg de TNP-KLH. Os níveis séricos de IgM específica de TNP (Fig. 28A) e de IgG (Fig. 28B) foram determinados 7 e 14 dias após imunização, respectivamente. Os resultados mostram três experiências separadas, cada círculo representando um ratinho individual.

Figura 29. Os anticorpos anti-IL-10 não são directamente citotóxicos para as células B de lavados peritoneais. Ratinhos BALB/c de 8 semanas de idade não sensibilizados foram injectados intraperitonealmente com 1 mg de anticorpo anti-IL-10 (SXC.l - Fig. 29 partes A, B e C), ou 1 mg de cada um isotipo testemunha (J5/D - Fig. 29 partes D, E e F). As células da lavagem peritoneal foram colhidas de diferentes animais 1, 2 ou 3 dias mais tarde e analisadas relativamente à co-expressâo de IgD e IgM de superfície. Os resultados mostram as intensidades de fluorescência de 5000 células vivas contadas de cada grupo experimental.

Figura 30. Níveis séricos de IFNy em ratinhos tratados com anti-IL-10 e em ratinhos testemunha. Os ratinhos BALB/c foram injectados desde o nascimento até às 8 semanas de idade com anticorpo anti-IL-10 (·) ou com um controlo do isotipo (O). Os soros colhidos às 8 semanas foram analisados relativamente a IFNy por imuno-ensaio. Os resultados mostram cinco experiências separadas, cada um dos círculos representa um ratinho individual.

Figura 31. Co-administração de anticorpos anti-IFNy reduz a capacidade de um tratamento anti-IL-10 para eliminar as células B peritoneais de ratinho. Ratinhos BALB/c foram tratados desde o nascimento até às 8 semanas com anticorpos anti-IL-10 (Fig. 31C); com anti-IL-10 mais anticorpos anti-IFNy (Fig. 31B); ou não foram tratados (Fig. 31A). As células do lavado peritoneal foram então analisadas relativamente à expressão de B220 e de IgM. Os resultados mostram as intensidades de fluorescência de 5000 células vivas contadas em cada um dos grupos experimentais.

Figura 32. Níveis séricos de TNFa em ratinhos tratados com anti-IL-10 às 8 semanas . Os ratinhos foram tratados desde o nascimento até às 8 semanas de idade com anticorpo SXC.l anti-IL-10 (·) ou com um controlo do isotiipo correspondente (O) como descrito na secção experimental. Os soros colhidos às 8 semanas foram analisados quanto ao teor em TNFa por ELISA. Os resultados mostram cinco experiências separadas, cada um dos círculos representa um ratinho individual.

Figura 33. Níveis séricos de IL-6 em ratinhos tratados com anti-IL-10. Soros colhidos de ratinhos tratados desde o nascimento até às 8 semanas de idade com o anticorpo SXC.l anti-IL-10 (·) ou com um controlo do isotipo correspondente (O) foram analisados quanto ao teor em IL-6 por ELISA. Os resultados mostram cinco experiências separadas, cada um dos círculos representa um ratinho individual.

Figura 34. Ratinhos tratados com anti-IL-10 mostram um aumento da susceptibilidade à morte resultante do choque induzido por LPS (500 pg de LPS na Fig. 34A, 400 pg de LPS na Fig. 34B, 100 pg de LPS na Fig. 34C, 50 pg de LPS na Fig. 34D, 50 pg de LPS na Fig, 34E e 1 pg de LPS na Fig. 34F). Os ratinhos foram tratados desde o nascimento até às 8 semanas de idade com anticorpo IgM de rato SXC.l anti-IL-10 (·), anticorpo IgG! de rato 2A5 anti-IL10 (A) ou anticorpos testemunha do isotipo adequado (Ο) (Δ). As 8 semanas, - 18- «!«»γιμ xj_^_L-Tmres. os ratinhos (5 ratinhos/grupo) foram injectados intraoperitonealmente com diferentes doses de LPS. A morte foi controlada durante os 14 dias seguintes.

Figura 35. Níveis séricos de isotipos de imunoglobulina em ratinhos tratados com anti-IL-10. Os ratinhos foram tratados desde o nascimento até às 8 semanas de idade com o anticorpo de rato anti-IL-10 SXC.l ou 2A5, anticorpos testemunha adequados para os diferentes isotipos ou PBS. Os soros colhidos às 8 semanas foram analisados relativamente ao teor de IgGl (Fig. 35A), IgG2a (Fig. 35C), IgG2b (Fig. 35E), IgG3 (Fig. 35B), IgE (Fig. 35D) ou IgA (Fig. 35F) tais de ratinho usando ELIS As com imunoglobulinas específicas de isotipo. Os resultados mostram quatro experiências independentes para cada análise do isotipo de imunoglobulina. entro de cada experiência, os resultados estão apresentados como a média geométrica ± desvio padrão dos níveis de imunoglobulina detectados em 5 soros individuais.

Figura 36. A depleção de células B Lyl em ratinhos tratados com IL-10 é transitória. Os ratinhos foram tratados desde o nascimento até às 8 semanas de idade com o anticorpo SXC.l anti-IL-10 e depois o tratamento foi interrompido. As células dos lavados peritoneais foram colhidas de diferentes grupos desses ratinhos (3 ratinhos/grupo) às 8 semanas (Fig. 36 A e D), 12 semanas (fig. 36B e E) e 16 semanas (Fig. 36 C e F). os resultados mostram a análise por imunofluorescência da expressão de IgM de superfície e B220 de superfície em células totais de lavado peritoneal vivas,contando 5000 células vivas em cada grupo experimental.

Figura 37. Análise por imunofluorescência sa expressão de Lyl de superfície e de IgM de superfície em células linfóides de lavado peritoneal obtidas a partir de ratinhos tratados com SXc.l anti-IL-10 (Fig. 37D) ou de ratinhos testemunha (tratados com o anticorpo para controlo do isotipo J5/D na -19-

Fig. 37C, tampão de fosfatos salino (PBS) na Fig. 37B ou sem tratamento na Fig. 37A). Os resultados mostram as intensidades de fluorescência de 5000 células vivas contadas em cada grupo experimental.

Figura 38. Análise por imunofluorescência da expressão de Lyl de superfície e de OgM de superfície em células totais vivas de lavado peritoneal obtidas a partir de ratinhos tratados com SXC.l anti-IL-10 ou de ratinhos testemunha (paralelo à Fig. 37). Os resultados mostram as intensidades de fluorescência de 5000 células vivas contadas em cada grupo experimental.

Figura 39. Resposta anticorpos in vivo de ratinhos tratados com anti-IL-10 ou ratinhos testemunha a TNP-Ficoll. Os ratinhos foram injectados desde o nascimento até às 9 semanas de idade com anticorpo SXC.l anti-IL-10 (O) ou com um anticorpo para controlo do isotipo (·). As 8 semanas, os animais foram injectados intraperitonealmente com 10 pg de TNP-Ficoll. Os níveis séricos de IgM ou IgG específicas de TNP foram determinados 5 ou 10 dias mais tarde respectivamente por ELISA. Cada um dos círculos representa um ratinho individual.

Figura 40. Tratamento com anticorpo anti-IL-10 retarda o estabelecimento de auto-imunidade em ratinhos NZB/W. Grupos de 20 ratinhos fêmea NZB/W foram injectados três vezes por semana desde o nascimento e ao longo de todo o estudo com anticorpo IgM de rato SXC-1 anti-IL-10 de ratinho (·) ou um anticorpo para controlo do isotipo designado J5/D (O). A sobrevivência dos animais foi controlada durante as 42 semanas que se seguiram.

Figura 41. Desenvolvimento de proteinúria (> 3+) em ratinhos fêmea NZB/W tratados com anticorpos anti-IL-10. Grupos de 22 ratinhos fêmea NZB/W F1 foram injectados três vezes por semana desde o nascimento e ao longo de todo o estudo com anticorpo SXC-1 anti-IL-10 (·) ou com um anticorpo para controlo do isotipo (O). O desenvolvimento de doença renal foi avaliado através da medição de proteinúria usando estiletes Albustix desde a semana 12 até à semana 42. Os resultados mostram a proporção de ratinhos com mais de 300 mg de proteína/dl na sua urina.

Figura 42. Exame histológico de rins de ratinhos NZB/W tratados com anti-IL-10. Fig. 42A mostra um rim de NZB/WF1 testemunha (coloração PAS): observa-se uma grave glomerulonefrite com deposição homogénea de complexos imunes e moldes de proteínas nos túbulos, indicando perda de proteína para os túbulos. A Fig. 42B mostra um rim NZB/WF1 tratado com anti-IL-10 (coloração de PAS).

Figura 43. Produção de auto-anticorpos em ratinhos NZB/W tratados com anti-IL-10. Ratinhos femea NZB/W foram injectados com o anticorpo anti-IL-10 SXC-1 (·) ou com um controlo do isotipo (O) de três em três dias desde o nascimento e ao longo de todo o estudo. Os soros colhidos aos 5 meses ou aos 6 meses foram avaliados relativamente ao teor em anticorpos IgG que se ligam a DNA de cadeia dupla usando um ELISA. Cada um dos círculos representa um ratinho individual.

Figura 44. Níveis séricos de TNFa em ratinhos NZB/WF1 tratados com anti-IL-10. Ratinhos femea NZB/W foram injectados com anticorpo SXC-1 anti-IL-10 (·) ou com um controlo do isotipo (O) de três em três dias desde o nascimento e ao longo de todo o estudo. Os soros colhidos aos 5 meses, 7 meses ou 8 meses foram avaliados relativamente ao teor em TNFa usando um ELISA específico para citocinas. cada um dos círculos representa um ratinho individual.

Figura 45. Anticorpos anti-TNFa revertem a protecção induzida -21 - por anti-IL-10 em ratinhos NZB/WF1. Grupos de 36 e 18 ratinhos fêmea NZB/W foram injectados duas vezes por semana com anticorpo 2A5 ANTI-IL-10 () (A) ou com um anticorpo para controlo de isotipo designado GL113 (□) respectivamente desde o nascimento e ao longo de toda a experiência. Metade dos animais injectados com o anticorpo anti-IL-10 receberam anticorpo XT22 anti-TNFa duas vezes por semana começando às 30 semanas após o nascimento (A). A sobrevivência dos animais foi controlada durante um período de 34 semanas.

Descrição detalhada do invento

Conforme indicado, o presente invento proporciona a utilização de interleucina-10 ou um seu análogo, agonista ou antagonista, na produção de uma composição farmacêutica para administração a um hospedeiro de forma a modular a inflamação ou função imune mediada por células T num hospedeiro, em que a referida inflamação ou imunidade mediada por células T é acompanhada de um nível anormal de factor de necrose tumoral alfa, particularmente para prevenir e/ou reduzir os efeitos prejudiciais de choque induzido por microrganismos ou controlar a diferenciação ou desenvolvimento de células B. A IL-10 para usar no invento é preferencialmente seleccionada do grupo de polipeptídeos maduros codificados pelas grelhas de leitura abertas definidas pelos insertos de cDNA de pH5C, pH15C e pBCRFl(SRa), os quais estão depositados na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, com o números de acesso 68191, 68192 e 68193, respectivamente. IL-10 inibe a síntese de TNFa e INFy em monócitos ou monócitos mais células assassinas naturais (NK), mas não em células NK por si sós. IL-4 inibe a secreção de citocinas directamente a partir de células NK activadas com IL-2. Isto sugere que IL-4 e IL-10 actuam sobre as células NK através de vias distintas, e.g., a acção de IL-10 requere a participação de monócitos. IL-10 inibe a secreção de citocinas em células NK activadas com IL-2 mas não a actividade LAIC, sugerindo que a síntese de citocinas induzida por IL-2 e a actividade de assassina de linfócitos activados são reguladas por mecanismos diferentes.

Está demonstrado que IL-10 possui uma actividade anti-inflama-tória, aparentemente por um mecanismo da sua capacidade para inibir a produção de citocinas pro-inflamatórias em monócitos e/ou macrófagos activados ou células NK. Esta inibição da produção de citocinas ocorre ao nível da transcrição.

Foi também aqui demonstrado que IL-10 modela as respostas induzidas por superantigénios, e.g., respostas mediadas por células T, em anirnais. A enterotoxina B estafilocóccica (SEB) pode induzir uma reposta de choque tócxico grave e estudos em ratinhos demonstraram eficácia in vivo. A administração de IL-10 simultaneamente com, ou mesmo após, exposição ao superantigénio é eficaz na prevenção da letalidade derivada da exposição a um nível elevado de SEB, O lipopolissacárido das bactérias Gram-negativas (LPS) induz uma resposta de choque séptico em mamíferos. Esta resposta de choque séptico induzida por endotoxinas resulta da libertação de TNFa, IL-1 e/ou IL-6 por macrófagos/monócitos estimulados, como descrito atrás. No entanto, a administração de IL-10 suprime a expressão induzida de IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 e GM-CSF. Os resultados apresentados estabelecem que IL-10 é capaz de proteger ratinhos do choque induzido por endotoxinas, mesmo se administrado após a apresenção do LPS. Inversamente, os anticorpos anti-IL-10 podem bloquear o efeito protector. Outros estudos indicam que ratinhos tratados com anti-IL-10 também apresentam níveis substancialmente elevados de factor de necrose tumoral alfa (TNFa) circulante e IL-6 circulante e uma grande susceptibilidade ao choque induzido por endotoxinas (e.g., induzido por LPS).

Os anticorpos anti-IL-10 também são úteis para tratar outros estados imunológicos. São apresentados dados indicando que a administração a longo termo de anticorpo anti-IL-10 a um ratinho jovem, pode eliminar a subclasse de células B Ly-1. Isto implica que IL-10 é um regulador do desenvolvimento de células B Ly-1 e proporciona um meio para eliminar as células B Ly-1. Esta observação lança alguma luz sobre o tratamento de estados de auto-imunidade. O desenvolvimento de uma resposta auto-imune requere uma complexa interacção de células T. A estirpe NZB/W de ratinhos está predisposta ao lupus (lupus sistémico eritematoso, SLE) e proporciona um modelo para testar reagentes terapêuticos no tratamento de estados de auto-imunidade. Ainda, estes ratinhos apresentam uma proporção invulgar de células B Ly-1 comparado com outros tipos de células B. São descritas experiências in vivo com ratinhos usando a estirpe NZB/W. O tratamento anti-IL-10 destes ratinhos retarda substancialmente o estabelecimento da resposta de auto-imunidade conforme avaliado pela sobrevivência global ou pelo desenvolvimento de proteinémia, nefrite ou títulos de autoanticorpos. Este resultado indica que o tratamento anti-IL-10 deverá ser útil no tratamento de outros mamíferos, e.g., humanos.

Uma larga gama de sistemas de expressão de células isoladas e multicelulares (i.e., combinações hospedeiro-vector de expressão) podem ser usados para produzir os polipeptídeos para usar nos métodos do presente invento. -24-

Os tipos celulares de hospedeiro incluem, mas não estão limitados a bactérias, leveduras, células de insecto, de mamífero e similares. Existem muitas revisões que proporcionam um guia para fazer escolhas e/ou modificações de sistemas de expressão específicos. Ver, e.g., de Boer e Shepard "Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli," pgs 205-247, em Kroon (ed.) Genes: Structure and Expression (John Wiley & Sons, New York, 1983), os quais fazem a revisão de vários sistemas de expressão para E. coli; Kucherlapati et al., Criticai Reviews in Biochemistiy, Vol.16, Issue 4, pgs. 349-379 (1984) e Banerji et al., Genetic Engineering, Vol. 5, pgs. 19-31 (1983), os quais fazem a revisão de métodos para a transfecção e transformação de células de mamífero; Reznikoff e Gold,eds., Maximizing Gene Expression (Butterworths, Boston, 1986) os quais descrevem tópicos seleccionados na expressão de genes em E. coli, levedura e células de mamífero; e Thilly, Mammalian Cell Technology (Butterworths, Boston, 1986) que revê os sistemas de expressão de mamíferos. Cada um destes é aqui incluído como referência. Igualmente, estão disponíveis muitas revisões que descrevem técnicas e condições para ligar e/ou manipular cDNAs específicos e sequências de controlo da expressão para criar e/ou modificar vectores de expressão adequados para usar no presente invento, e.g., Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratorv manual (2nd Ed; Vols 1-3), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; e Ausubel et al., (1987e suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology. Wiley and Sons, New York, os quais são aqui incluídos como referência.

Um sistema de expressão em E. coli está descrito por Riggs na Patente U.S. 4,431,739 que aqui é incluído como referência. Um promotor procariótico particularmente útil para uma expressão elevada em E. coli é o promotor tac, descrito por de Boer na Patente U.S. 4,551,433, o qual é aqui incluído como referência. Existem também vectores de expressão e secreção para hospedeiros E. coli. São particularmente úteis os vectores pIN-III-ompA, descritos por Ghrayeb et ai, em EMBO J., Vol. 3, pgs 2437-2442 (1984), em que o cDNA a ser transcrito é fundido com uma parte do gene OmpA de E. coli codificador do peptídeo sinal da proteína ompA que, por sua vez, provoca a secreção da proteína madura para o espaço periplásmico da bactéria. As Patentes U.S. 4,336,336 e 4,338,397 também descrevem vectores de expressão e secreção para procariotas. Assim, estas referências são aqui incluídas como referência.

Numerosas estirpes de bactérias são hospedeiros adequados para vectores de expressão procarióticos incluindo estirpes de E. coli, tais como W3110 (ATCC n° 27325), JA221, C6000, ED767, DH1, LE392, HB101, XI776 (ATCC N° 31244), X2282, RR1 (ATCC N° 31343) MRCI; estirpes de Bacillus subtilis\ e outras enterobactereáceas tais como Salmonella typhimurium ou Serrada marcescens e várias espécies de pseudomonas. Métodos gerais para a obtenção de estirpes bacterianas, tais como E. coli K12 X1776, úteis na expressão de proteínas eucarióticas está descrito por Curtis III na Patente U.S. 4,190,495. Assim, esta patente é aqui incluída como referência.

Para além de microrganismos procarióticos e eucarióticos, podem ser igualmente usados para produzir as proteínas do invento sistemas de expressão compreendendo células derivadas de organismos multicelulares. São de interesse particular, os sistemas de expressão de mamíferos uma vez que a sua maquinaria de processamento pós-tradução tem maior probabilidade de produzir proteínas de mamífero biologicamente activas. Têm sido usados vários vírus de DNA indutores de tumores como vectores para hospedeiros mamíferos. São particularmente importantes os numerosos vectores que compreendem as sequências de controlo da replicação, transcrição e/ou tradução do SV40 acoplados a sequências de controlo da replicação bacteriana, e.g., os vectores -26- pcD desenvolvidos por Okayama e Berg, descritos em Mol. Cell. Biol. Vol. 2, pgs. 161-170 (1982) e Mol. Cell. Biol., Vol. 3, pgs. 280-289 (1983) e melhorados por Takebe et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 8, pgs. 466-472 (1988). Assim, estas referências são aqui incluídas como referência. Outros vectores de expressão de mamífero baseados em SV40 incluem os descritos por Kaufman e Sharp, em MOL Cell. Biol., Vol. 2, pgs 1304-1319 (1982) e Clark et al., na Patente U.S. 4,675,285, ambos aqui incluídos como referência. As células de macaco são geralmente os hospedeiros preferidos para os vectores atrás referidos, tais vectores contendo as sequências ori de SV40 e um gene A intacto podem replicar-se autonomamente em células de macaco (para dar um número de cópias superior e/ou um número de cópias estáveis superior do que os plasmídeos de replicação não autónoma). Ainda, os vectores contendo as sequências ori de SV40 sem um gene A intacto podem replicar-se autonomamente dando origem a elevado número de cópias (mas não estáveis) em células de macaco COS7, descrito por Gluzman, Cell, Vol. 23, pgs 175-182 (1981) e disponível na ATCC (N° de acesso CRL 1651). Os vectores baseados em SV40 atrás referidos podem igualmente transformar outras células de mamífero, tais como células de ratinho, por integração no DNA da célula hospedeira.

Os organismos multicelulares podem também servir como hospedeiros para a produção dos polipeptídeos do invento, e.g., larvas de insectos, Maeda et al., Nature, Vol. 315, pgs 592-594 (1985) e Ann. Rev. Entomol., pgs. 351-372 (1989); e animais transgénicos, Jaenisch, Science, Vol. 240, pgs 1468-1474 (1988). Estas referências, tal como as outras são também aqui incluídas como referência. I. Ensaios para a interleucina-10 e análogos

Proteínas e peptídeos relacionados com interleucina-10, referidos colectivamente como IL-lOs, apresentam várias actividades biológicas que poderão constituir a base de ensaios e unidades. Em particular, IL-lOs possuem a propriedade de inibirem a síntese de pelo menos uma citocina do grupo constituído por IFNy, linfotoxina, IL-2, IL-3 e GM-CSF numa população de células T auxiliares induzidas para sintetizarem uma ou mais destas citocinas através de exposição a células apresentadoras de antigénio singeneicas (APCs) e antigénio. Nesta actividade, as APCs são tratadas de forma a serem incapazes de se replicarem, mas a sua maquinaria de processamento de antigénios permanece funcional. Isto é adequadamente conseguido através da irradiação das APCs, e.g., com cerca de 1500-3000 R (radiação gama ou raios X) antes de serem misturadas com as células T. Ver também a Tabela 2 para o ensaio da IL-10 de ratinho.

Tabela 2

Ensaio de IL-10 (CSIF) - Modificado para ensaio de proliferação Células apresentadoras de antigénios (APC1 -28- por alvéolo no ensaio para dar um total de 4 x 105/alvéolo).

Titular IL-10 em 100 μΐ de volume final em placa de microtitulação (ou em 50 μΐ de volume final se se pretender adicionar anticorpo anti-IL-10). Células Thl

1) Três dias antes do ensaio descongelar uma ampola de células HDK1 directamente em 2 x 25 ml de cRPMI contendo IL-2. 2) Observar as células no dia seguinte e se necessário dividir 1 em 2 ou 1 em 3. 3) No dia do ensaio centrifugar as células a 1200 rpm imediatamente antes de semear as células e ressuspender em 5 ml de cRPMI e contar (diluir a 1 para 2 em azul tripano). 4) Ajustar a concentração para 2 x 105 por ml e adicionar 50 μΐ por

alvéolo (final 104 células por alvéolo). Antes de semear adicionar KLH para dar uma concentração de 400 mg/ml. (Isto dará uma concentração final de 100 mg/ml).

Testemunhas 50 ml de células Thl sem KLH. 50 ml de células Thl + KLH. 50 ml de APC de baço. mais e menos IL-10 (provavelmente a concentração mais alta está bem). prefazer um volume final de 200 μΐ.

Ordem do ensaio.

1) Preparar APC 2) Distribuir IL-10 3) Preparar células Thl e distribuir. 4) Distribuir APC.

Após 48 horas remover 100 μΐ de sobrenadante para ELISA de IFNg; adicionar então 3H-timidina (1 mCi por alvéolo) e colher na manhã seguinte.

Como alternativa, a inibição de citocinas pode ser ensaiada em reacções de linfócitos mistos (MLR) primários ou, preferencialmente secundários, neste caso não é necessário usar APCs singeneicas. MLRs são bem conhecidas neste campo, ver e.g., Bradley, pgs 162-166, em Mischell et al., eds. Selected Methods in Cellular Immunology (Freeman, San Francisco, 1980); e Battisti et al., Meth. in Enzymol., Vol. 150, pgs. 83-91 (1987), os quais são aqui incluídos como referência. Resumidamente, duas populações de células linfóides alogénicas são misturadas, uma das populações tendo sido previamente tratada antes da mistura para evitar a proliferação, e.g., por irradiação, preferencialmente, as populações celulares são preparadas numa concentração de cerca de 2 x 206 células/ml em meio suplementado, e.g., RPMI 1640 com 10% de soro fetal de vitela. Para as testemunhas e culturas a testar, misturar 0,5 .ml de cada uma das populações para o ensaio. Para um MLR secundário, as células que ficam após 7 dias no MLR primário são re-estimuladas com células estimuladoras irradiadas preparadas de fresco. A amostra suspeita de conter IL-10 pode ser adicionada às culturas a testar na altura da mistura e e testemunhas e culturas a testar podem ser analisadas quanto à produção de citocinas entre 1 e 3 dias após mistura. A obtenção de populações de células T e/ou populações de APC para ensaios de IL-10 utiliza técnicas bem conhecidas que estão detalhadamente -30- descritas, e.g., em DiSabato et al, eds., Meth. in Enzymol., Vol. 108 (1984), a qual é aqui incluído como referência. As APCs para o ensaio de IL-10 preferido são monócitos do sangue periférico ou macrófagos dos tecidos. Estas são obtidos usando técnicas convencionais, e.g., como descrito por Boyum, Meth. in Enzymol., Vol. 108, pgs. 88-102 (1984); Mage, Meth. in Enzymol., Vol. 108, pgs. 118-132 (1984); Livin et al, Meth. in Enzymol., Vol. 108, pgs. 298-302 (1984); Stevenson, Meth. in Enzymol., Vol. 108, pgs. 242-249 (1984); e Romain et al, Meth. in Enzymol., Vol. 108, pgs. 148-153 (1984), referências estas que aqui são incluídas como referência. Preferencialmente, as células T auxiliares são usadas nos ensaios de IL-10, as quais são obtidas separando primeiro os linfócitos do sangue periférico, baço ou nódulos linfáticos, depois seleccionando, e.g., por adsorção ou citometria de fluxo, as células auxiliares usando um anticorpo anti-CD4, e.g., OKT4 descrito na Patente U.S. 4,381,295 e adquirida à Ortho Pharmaceutical orp. Anti-CD4 de ratinho é adquirido à Becton-Dickson ou Pharmigen. As técnicas usadas estão bem descritas em Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest., Vol. 21 (Suppl. 97), pg. 77 (1968); Meth. in Enzymol., Vol. 108 (referido atrás) e em Bram et al., Meth. in Enzymol., Vol.121, pgs. 737-748 (1986), cada um deles aqui incluído como referência. De um modo geral, os PBLs são obtidos a partir de sangue fresco por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll-Hypaque.

Pode ser empregue no ensaio uma variedade de antigénios, e.g., hemocianina de lapa (KLH), γ-globina de galinha ou similares. Mais preferencialmente, em vez do antigénio, as células T auxiliares são estimuladas com anticorpo monoclonal anti-CD3, e.g., OKT3 descrito na Patente U.S. 4,361,549, no ensaio.

As concentrações de citocinas nas amostras testemunha e a testar são medidas por ensaios biológicos e/ou imunoquímicos convencionais. A construção de ensaios imunoquímicos para citocinas específicas é bem conhecida quando se dispõe da citocina purificada. Ver, e.g. Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Tijssen, Practice and Theory os Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); e Patente U.S.

I 4,486,530, cada um deles aqui incluído como referência, sãp exemplos da numerosa literatura sobre o tema. Estojos de ELISA para IL-2 humana, IL-3 humana e GM-CSF humano podem ser adquiridos à Genzyme Corp. (Boston, MA); e um estojo de ELISA para IFNy pode ser adquirido comercialmente à Endogen, Inc. (Boston, MA). Anticorpos policlonais específicos para lifotoxina humana podem ser adquiridos à Genzyme Corp. os quais podem ser usados num radioimuno-ensaio para linfotoxina humana, e.g., Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques (Elsevier, Amsterdam, 1982).

Os ensaios biológicos para as citocinas referidas atrás podem ser igualmente usados para determinar a actividade de IL-10. Um ensaio biológico para a linfotoxina humana está descrito em Aggarwal, Meth. in Enzymol., Vol. 116, pgs. 441-447 (1985) e Matthews et al, pgs. 221-225, em Clemens et al., eds., Lymphokines and Interferons: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1987), cada um deles aqui incluído como referência. A IL-2 e GM-CSF podem ser testados com linhas celulares dependentes de factores CTLL-2 e KG-1, disponíveis na ATCC com os números de acesso TIB 214 e CCJL 246, respectivamente. A IL-3 humana pode ser testada quanto à sua capacidade para estimular a formação de uma larga gama de colónias de células hematopoiéticas em culturas em agar mole, e.g., como descrito por Metcalf, The Hemopoietic Colony Stimulating Factors (Elsevier, Amsterdam, 1984). IFNy pode ser quantificado com ensaios anti-virais, e.g., Meager, pgs. 129-147, em Clemens et al., eds. (referido atrás). Os equivalentes de ratinho podem ser igualmente testados com as linhas celulares adequadas. A produção de citocinas pode ser também determinada por análise de mRNAs. Os mRNAs de citocinas podem ser medidos por hibridação citoplasmática como descrito por White et al, J. Biol. Chem., Vol. 257, pgs. 8569-8572 (1982) e Gillespie et al., Patente U.S. 4,483,920. Assim, estas referências são aqui incluídas como referência. Outras abordagens incluem transferência para membranas usando RNA purificado, e.g., capítulo 6, em Hames et al, eds. Nucleic Acid Hybridization A Praticai Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1985). Podem ser igualmente usadas as técnicas de reacção em cadeia com polimerase (PCR), ver Innis et al. (ed.) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press, Inc., New York, que aqui é incluído como referência.

Nalguns casos, as amostras a serem testadas quanto à actividade de IL-10 serão previamente tratadas para remover certas citocinas que possam interferir com o ensaio. Por exemplo, IL-2 aumenta a produlção de IFNy nalgumas células. Assim, dependendo das células T auxiliares usadas no ensaio, IL-2 poderá ter de ser removida da amostra a ser testada. Tais remoções são convenientemente conseguidas passando a amostra numa coluna de afinidade anti-citocinas convencional.

Por conveniência, as unidades de actividade de IL-10 são definidas em termos de capacidade de 11-10 para aumentar a proliferação de células MC/9 induzida por IL-4, o que está descrito na Patente U.S. 4,559,310 e disponível na ATCC com o número de acesso CRL 8306. Uma unidade/ml é definido como a concentração de IL-10 que dá 50% de estimulação máxima da proliferação de MC/9 acima do nível de IL-4 no ensaio que se segue. Diluições em duplicado ou em triplicado de IL-4 e IL-10 são preparadas em 50 μΐ de meio por alvéolo numa placa de microtitulação convencional. O meio consiste em RPMI 1640, 10% de soro fetal de vitela, 2-mercaptoetanol 50 μΜ, glutamina 2 mM, penicilina (100 U/l) e estreptomicina (100 mg/l). Adicionar IL-4, 25 μΐ/alvéolo de 1600 U/ml (400 U/ml final) diluido em meio e incubado durante a noite, e.g., 20-24 horas. Adiciona-se 3H-timidina (e.g., 50 mCi/ml em meio) a 0,5-1,0 mCi/alvéolo e as células são novamente incubadas durante a noite, após o que as células são colhidas e medida a radioactividade incorporada.

Para as descrições gerais da preparação das citocinas IL-4 e IL-10, ver Patente U.S. N° 5,017,691 e U.S.S.N. 07/453,951, cada uma delas aqui incluída como referência. II. Agonistas e antagonistas

Os agonistas de IL-10 podem ser moléculas que simulam a interacção de IL-10 com os seus receptores. Podem ser análogos ou fragmentos de IL-10 ou anticorpos contra os epitopos dos sítios de ligação do ligando dos receptores de IL-10 ou anticorpos anti-idiotípicos contra anticorpos particulares que se ligam aos fragmentos de IL-10 que interactuam com os receptores.

Os antagonistas podem ter a forma de proteínas que competem para a ligação a receptores, e.g., os quais não possuem capacidade para activar o receptor enquanto bloqueiam a ligação de IL-10, ou moléculas que se ligam a IL-10, e.g., anticorpos.

Podem ser induzidos anticorpos contra a citocina IL-10, seus fragmentos e análogos, ambos nas suas formas naturais e nas suas formas recombinantes. Ainda, podem ser induzidos anticorpos contra IL-10 nas suas formas activas ou nas suas formas inactivas, a diferença sendo que os anticorpos contra a citocina activa reconhecerão com maior probabilidade os epitopos que estão presentes apenas na corformação activa. Os anticorpos anti-idiotípicos são também considerados nestes métodos e podem ser agonistas potenciais de IL-10.

Os anticorpos, incluindo fragmentos de ligação e versões de cadeia simples, contra fragmentos pré-determinados dos antigénios pretendidos, e.g., citoeinas, podem ser induzidos por imunização de animais com conjugados dos fragmentos com proteínas imunogénicas. Os anticorpos monoclonais são preparados a partir de células que secretam o anticorpo pretendido. Estes anticorpos podem ser despistados relativamente à ligação a análogos normais ou inactivos, ou despistados relativamente a actividade agonista ou antagonista. Estes anticorpos monoclonais de um modo geral ligar-se-ão com pelo menos um KD de cerca de 1 mM, mais geralmente a pelo menos cerca de 300 μΜ, tipicamente pelo menos cerca de 10 μΜ, mais tipicamente pelo menos cerca de 30 μΜ, preferencialmente a pelo menos cerca de 10 μΜ e mais preferencialmente a pelo menos cerca de 3 μΜ ou melhor. Se bem que nos tenhamos referido a IL-10, anticorpos semelhantes podem ser induzidos contra outros análogos, seus receptores e antagonistas.

Os anticorpos, incluindo fragmentos de ligação a antigénios, deste invento podem ter importância significativa em diagnóstico ou terapia. Podem ser potentes antagonistas que se ligam aos receptores de IL-10 e inibem a ligação de ligandos aos receptores ou que inibem a capacidade de IL-10 para induzir uma resposta biológica. IL-10 ou fragmentos podem ser ligados a outros materiais, particularmente polipeptídeos, como polipeptídeos fundidos ou ligados covalentemente, para serem usados como imunogénios. A citocina e seus fragmentos podem ser fundidos ou ligados covalentemente a uma variedade de imunogénios, tais como hemocianina de lapa, albumina sérica bovina, toxóde do tétano, etc. Ver Microbiologv. Hoeber Medicai Division, Harper and Row, 1969;

Landsteiner (1962) Specificitv of Serological Reactions, Dover Publications, New York and Williams et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistrv. Vol. 1, Academic Press, New York, cada um deles sendo aqui incluido como referência, para descrições dos métodos de preparação de anti-soros policlonais. Um método típico envolve a hiperimunização de um animal comi um antigénio. O sangue do animal é então colhido pouco tempo após as imunizações repetidas e isolada a gamaglobulina. Nalguns casos, é desejável preparar anticorpos monoclonais a partir de vários hospedeiros mamíferos, tais como ratinhos, roedores, primatas, humanos, etc. A descrição de técnicas para a preparação de tais anticorpos monoclonais pode ser encontrada em, e.g., Sites et al., íeds) Basic and Clinicai Immunology (4a ed.), Lange MedicalPublicatins, Los Altos, CA, e referência ali citadas; Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratorv Manual. CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2nd ed.) Academic Press, New York; Coligan et al., (eds; 1991 e suplementos periódicos) Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons, New York; e particularmente em Kohler e Milstein (1975) em Nature 256:495-497, os quais descrevem um método para a produção de anticorpos monoclonais. Cada uma das referências é aqui incluída como referência. Resumidamente, este método envolve a injecção de um animal com um imunogénio. O animal é então morto e retiradas as células do seu baço, as quais são fundidas com células de mieloma. O resultado é uma célula híbrida ou "hibridoma" que é capaz de se multiplicar in vitro em condições selectivas, ao contrário das células de mieloma parentais. A população de hibridomas é então despistada para isolar clones individuais, cada um dos quais secreta uma única espécie de anticorpo contra o imunogénio. Desta forma, a espécie de anticorpo individual obtida são produtos de células B isoladas imortalizadas e clonadas a partir do animal imunizado geradas como resposta a um sítio específico reconhecido na substância imunogénica. -36-

Outras técnicas adequadas envolvem exposição de linfócitos in vitro a polipeptídeos antigénicos ou, como alternativa, selecção de bibliotecas de anticorpos em fagos ou vectores semelhantes. Ver, Huse et al., (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda," Science 246:1275-1281; e Ward et al. (1989) Nature 341:544-546, cada um deles é aqui incluído como referência, os polipeptídeos e anticorpo do presente invento podem ser usados com ou sem modificação, incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados. Igualmente, podem ser produzidas imunoglobulinas recombinantes, ver Cabilly, Patente U.S. N° 4,816,567. Estas patentes são aqui incluídas como referência.

Os anticorpos induzidos contra a citocina ou seu receptor também serão úteis para induzir anticorpos anti-idiotípicos, os quais podem apresentar propriedades agonistas ou antagonistas. Estes serão úteis na modulação de várias respostas imunológicas conforme discutido atrás. III. Purificação e composições farmacêuticas

Quando os polipeptídeos do presente invento são expressos na forma solúvel, e.g., como um produto secretado de leveduras ou células de mamífero transformadas, eles podem ser purificados de acordo com processos convencionais, incluindo passos de precipitação com sulfato de amónio, cromatografia de permuta iónica, filtração em gel, electroforese, cromatografia de afinidade, e/ou similares, ver, e.g., "Enzyme Purification and Related Techniques, "Methods in Enzymology, 22:233-577 (1977), e Scopes, R., Protein Purification: Principies and Practice (Springer-Verlag, New York, 1982), os quais são aqui incluídos como referência, proporcionam intruções para tais purificações. Igualmente, quando os polipeptídeos do invento são expressos na forma insolúvel, por exemplo como agregados, corpos de inclusão, ou similares, podem ser puri- ficados por processos convencionais, incluindo separação por centrifugação dos corpos de inclusão das células hospedeiras rebentadas, solubilização dos corpos de inclusão com agentes caotrópicos e redutores, diluição da mistura solubilizada e redução da concentração do agente caotrópico e do agente redutor de forma a que o polipeptídeo adquira a conformação bilogicamente activa. Estes últimos processos estão descritos nas referências que se seguem, as quais são aqui incluídas como referência: Winkler et al, Biochemistry, 25: 4041-4045 (1986); Winkler et al, Biotechnology,. 3: 992-998 (1985); Koths et al, Patente U.S. 4,569,790; e Pedidos de patente europeia 86306917.5 e 86306353.3.

Conforme aqui é usado "quantidade eficaz" siginifica uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir um estado de choque, conforme determinado, por exemplo, por sintomas reconhecidos, tais como calafrios, vasoconstrição, confusão mental, hipoperfusão, hiperpirexia e similares. A quantidade eficaz para um doente particular pode variar dependendo de factores tais como o estado e tipo de sépsia a ser tratada, estado de saúde geral dodoente, método de administração, gravidade dos efeitos secundários e similares. De um modo geral, um reagente de IL-10 é administrado como uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do reagente e um veículo farmacêutico. Ver, e.g., Kaplan and Pasce (1984) Clinicai Chemistry: Theory, Analysis and Correlation, Mosby and Co., St. Louis, MO; e Gilman et al, (1990) Goodman and Gilmans: The Pharmacological Basis of Therapeutics (8a ed), Pergamon Press; os quais são aqui incluídos como referência. Em certas aplicações, o reagente terapêutico IL-10 pode ser combinado com um outro ingrediente farmaceuticamente activo, incluindo uma composição antibiótica.

Um veículo farmacêutico pode ser qualquer substância não tóxica compatível adequada para a administração das composições do invento a um doente. Muitas composições úteis para administração parenteral de tais drogas são conhecidas, e.g., Remington's Pharmaceutical Science, 15a Ed. (Mack Publishing Company, Easton, PA 1980). Como alternativa, as composições do invento podem ser introduzidas num doente através de um sistema de libertação de idroga implantável ou injectável. Ver, e.g., Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Vol. 24, pgs. 199-236 (1984); Lewis, ed. Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum Press, New York, 1981); Patente U.S. 3,773,919; Patente U.S.3,270,960; cada um deles sendo aqui incluído como referência, e similares.

Quando administrado parenteralmente, a IL-10 é formulada numa forma de dosagem unitária injectável (solução, suspensão, emulsão) em associação com um veículo farmacêutico. Exemplos de tais veículos são soro fisiológico normal, solução de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank. Veículos não aquosos, tais como óleos fixados e oleato de etilo, podem ser igualmente empregues. Um veículo preferido é 5% de dextrose/soro fisiológico. O veículo pode conter pequenas quantidades de aditivos tais como substâncias que aumentam a isotonicidade e estabilidade química, e.g., tampões e conservantes. O reagente de IL-10 é preferencialmente formulado na forma purificada substancialmente livre de agregados e outras proteínas numa concnetração de cerca de 5 a 20 mg/ml. Preferencialmente, IL-10 é administrado por infusão contínua de forma a que uma quantidade na gama de aproximadamente 50-800 mg seja libertado por dia (i.e., cerca de 1-16 mg/Kg/dia). A taxa de infusão diária pode variar com base no controlo dos efeitos secundários e contagens das células do sangue.

Considerações semelhantes são aplicáveis na determinação de uma quantidade eficaz de um agonista ou antagonista de IL-10, se bem que certos antagonistas possam requerer gamas de dosagem mais largas, e.g. nas gamas superiores. IV. Observações e mecanismos biológicos

Ainda que não vinculada aos mecanismos propostos que se seguem, a discussão a seguir proporciona algumas perspectivas sobre as utilizações e aplicações de análogos, agonistas e antagonistas de IL-10. Conhecimentos básicos úteis sobre o funcionamento, desenvolvimento e diferenciação do sistema imunitário podem ser adquiridos, e.g., em Paul (ed) (1989) Fundamental Immunologv (2a ed) Raven Press, New York, que aqui é incluído como referência. Os capítulos 26 sobre inflamação, 28 sobre sobre hipersensibilidade do tipo retardado e sobre auto-imunidade são particularmente relevantes para as utilizações aqui descritas.

Os efeitos de IL-4 e IL-10 na síntese de citocinas e actividade LAK induzida por IL-2 em PBMC humanos e células NK purificadas foram estudados, e.g., em Study A.. Enquanto que IL-4 e IL-10 inibem ambos a síntese de IFNy e TNFa em PBMC, apenas IL-4 inibe a síntese de IFNy induzida por IL-2 em células NK purificadas. Assim, 11-4 e IL-10 inibem a síntese de citocinas em células NK por mecanismos diferentes.

Os resultados de experiências para o estudo da produção de TNFa sugerem uma conclusão semelhante. No entanto, neste caso os monócitos também produzem esta citocina. IL-10 não tem um efeito directo na síntese de TNFa induzida por IL-2 em células NK, mas é capaz de bloquear a produção de TNFa em monócitos. A estimulação de culturas, contendo células NK e células CD14+, por IL-2 resultou num grande aumento da produção de TNFa e IL-10 bloqueou totalmente este aumento. Uma vez que IL-2 não activa as células CD14+ para produzirem TNFa adicional, o aumento sinergístico provavelmente representa o aumento da síntese de TNFa em células NK. Assim, parece que IL- 10 inibe a produção de TNFa em monócitos assim como os seus efeitos co-estimuladores na síntese de TNFa em células NK.

Se bem que IL-4 e hIL-10/vIL-10 suprimam a síntese de IFNy e TNFa em PBMC estimulados com IL-2, apenas IL-4 inibe a actividade LAK induzida por IL-2. Estas observações indicam que a produção de citocinas e a citotoxicidade de PBMC, induzidas por IL-2, são reguladas através de vias diferentes. Estes resultados são importantes na aplicação clínica de IL-2 e LAK. Problemas associados à terapia com IL-2 têm incluído efeitos cardiovasculares e um síndrome de derrame capilar. A causa destes efeitos secundários são desconhecidas, mas poderão envolver libertação de citocinas tais como TNFa induzida por IL-2 em doentes com cancro. O facto de IL-10 inibir a síntese de citocinas induzida por IL-2 mas não a actividade LAK sugere que esta citocina possa ser útil, emcombinação com IL-2, para o tratamento de tais doentes. Ainda, face aos dados que sugerem que TNFa pode induzir expressão do vírus da imunodeficiência humana em células T infectadas, a capacidade de IL-10 para inibir a síntese de TNFa é de possível interesse neste contexto.

Estes estudos também demonstram que IL-10 humana é produzida em quantidades relativamente grandes em monócitos após activação. Estudos cinéticos mostraram que níveis baixos de IL-10 foram detectados 7 horas após a activação dos monócitos e a produção máxima de IL-10 ocorreu 24-48 horas após activação. Esta foi relativamente tardia comparado com a produção de IL-Ια, IL-1 β, IL-6, IL-8 e TNFa , os quais foram secretados em níveis elevados entre 4 e 8 horas após activação. Também foi demonstrado que IL-10 humana possui fortes efeitos inibidores na produção de citocinas por monócitos após activação com IFNy, LPS ou combinações de IFNy e LPS. Estes efeitos inibidores são específicos de IL-10 uma vez que puderam ser totalmente neutralizados pelo mAb 19F1 que inibe tanto a actividade de IL-10 como de v-IL-10. IL-10 adicionada em concentrações de 100 U/ml reduziu a síntese de IL-Ια, TNFa , GM-CSF em mais de 90% após activação óptima dos monócitos por combinações de IFNy (100 U/ml) e LPS (1 pg/ml). Os efeitos inibidores na produção de IL-Ιβ, IL-6 e IL-8 foram menos pronunciados, particularmente quando os monócitos foram optimamente activados por combinações de IFNy e LPS. O mecanismo pelo qual IL-10 inibe a produção de citocinas por monócitos não é clara, e.g., ou seja desconhece-se se estes efeitos da IL-10 são directos ou mediados indirectamente através de outros factores. Uma vez que IL-1 pode induzir a produção e IL-6 em fíbroblastos, timócitos e monócitos, é, por exemplo, possível que a inibição parcial de IL-6 seja o resultado da produção reduzida de IL-1. IL-10 virai, que se demonstrou possuir actividades biológicas em células humanas, semelhante a IL-10, foi menos extensivamente testada. No entanto, v-IL-10 inibiu a produção de TNFa e de GM-CSF em monócitos activados com LPS no mesmo grau que IL-10 humana. Estes efeitos inibidores de v-IL-10 na produção de TNFa e de GM-CSF foram neutralizados pelo mAb 19F1, ilustrando a especificidade dos efeitos de v-IL-10. A inibição da secreção de IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF e G-CSF ocorreu a nível da transcrição. IL-10 inibiu fortemente a síntese de mRNA específico dé citocinas induzida por LPS, conforme determinado por análise de Northern e PCR. A análise por PCR foi realizada em condições que permitiram uma comparação dos produtos de reacção de amostras individuais de forma semi-quantitativa. Isto foi validado pelo facto da amplificação de cDNAs com escorvas específicas para β-actina ter resultado em quantidades equivalentes de produtos de reacção entre as amostras e resultados quantitativamente comparáveis foram obtidos quando a expressão do mRNA de IL-10 foi determinada nas mesmas amostras por análise Northern e PCR. Ainda, os níveis de expressão de mRNAs de citocinas são proporcionais aos níveis de proteína presente nos sobrenadantes destas culturas. IL-10 não afectou a expressão de TGFp em monócitos activados. No entanto, deverá notar-se que TGFp foi constitutivamente expresso em monócitos não activados e que a activação dos monócitos por LPS não afectou os níveis de mRNA de TGFp. Assoian et al. (1987) Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 84:6020-6024, demonstraram que os monócitos expressam constituivamente mRNA de TGFP e que a secreção de TGFp requere a activação de monócitos. No entanto, desconhece-se se IL-10 tem efeito na conversão de TGFP de uma forma latente para uma forma activa.

Demonstrou-se que a produção de IL-10 é inibida por IL-4 ao nível da transcrição. Se bem que os efeitos inibidores de IL-4 sobre a produção de IL-10 fossem consideráveis, IL-4 não foi capaz de bloquear a produção de IL-10 totalmente. IL-4 inibiu a produção de IL-10 apenas até 70%, mesmo quando foram usadas concentrações elevadas de IL-4 (400 U/ml), as quais eram suficientes para inibir totalmente a produção de IL-1, IL-6 e TNFa. Também já foi demonstrado que IL-4 é capaz de inibir a produção de IL-Ια, IL-ip, IL-6, IL-8 e TNFa em monócitos humanos. Estes resultados foram confirmados e demonstrou-se ainda que IL-4 também inibiu a produção de IL-8, GM-CSF e G-CSF em monócitos humanos activados com LPS. Esta inibição ocorreu ao nível da transcrição. Os resultados ilustram ainda que IL-4 e IL-10 têm efeitos semelhantes sobre a expressão de citocinas em monócitos humanos, o que sublinha os efeitos pleiotrópicos das citocinas e a redundância do sistema imunitário. É de salientar que IL-10 é uma citocina auto-reguladora, uma vez que inibe fortemente a síntese do mRNA de IL-10 em monócitos activados durante24 horas. Ainda, a activação de monócitos por LPS na presença de mAbs neutralizantes anti-IL-10 resultou num aumento da expressão de mRNA de IL-10 às 24 horas, indicando que a IL-10 produzida endogenamente também inibiu a síntese de mRNA de IL-10. O facto de IL-10 ser capaz de regular negativamente a sua própria produção por monócitos humanos toma-a a primeira citocina que é regulada por um mecanismo de retroacção negativa. Os efeitos auto-reguladores da IL-10 produzida endogenamente foram também observados na produção de IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF e G-CSF em monócitos activados por LPS com LPS na presneça de anticorpos anti-IL-10. No entanto, os efeitos inibidores da IL-10 endógena na produção destas citocinas foram menos pronunciados do que os da IL-10 exógena adicionada quando do estabelecimento da cultura. Isto está relacionado com o facto de IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, e G-CSF serem já produzidos em níveis elevados às 4-8 horas após activação, enquanto que a produção máxima de IL-10 endógena ocorre muito mais tarde às 24-48 horas após activação. Esta noção é suportada pela observação de que os efeitos inibidores mais fortes da IL-10 produzida endogenamente foram encontrados para a secreção de GM-CSF, que se observou ser produzida tardiamente após a activação dos monócitos. Assumindo que a síntese de mRNA de IL-10 reflete e precede a secreção da proteína IL-10 e que IL-10 pode interactuar apenas com o seu receptor na superfície celular, estes resultados sugerem que os efeitos inibidores de IL-10 produzida endogenamente ocorrem relativamente tarde e podem portanto ser de particular importância nas fases tardias de uma resposta imune. IL-10 foi inicialmente descrita no ratinho como um factor inibidor da síntese de citocinas (CSIF) produzido pelas células Th2, o qual inibia a produção de citocinas (predominantemente IFNy) pelas células Thl. Este efeito inibidor de m-IL-10 na produção de citocinas pelas células Thl necessitava da presença de macrófagos, ver e.g., Fiorentino et al, (1991) J. Immunol. 146:3444-3451; Trowbridge et al., (Ί98Π J. Epfl Med. 154:1517-1524; Lambert et al. (19891 Cell. Immunol. 120:401-418; e Hirsch et al. (1981) J. Ept1! Med. 154:713- -44- 725, os quais são aqui incluídos como referência. Aqui IL-10 e v-IL-10 inibem fortemente a proliferação de células T específica de antigénio quando os monócitos são usados como APCs. Ainda, a redução nas respostas proliferativas de células T específicas de antigénio é largamente devida à reduzida capacidade de apresentação de antigénio dos monócitos provocada pelos fortes efeitos reguladores negativos de IL-10 sobre a expressão do antigénio MHC classe II nestas células. Estes resultados juntamente com o facto de se ter encontrado que IL-10 é produzida na fase tardia em monócitos e que possui efeitos auto-reguladores sobre a secreção de IL-10 nestas células, indica que IL-10 possui fortes efeitos reguladores negativos nas referidas respostas de células T específicas de antigénio. Assim IL-10 pode desempenhar um papel essencial no refreamento de respostas proliferativas de células T induzidas por antigénios. A noção de que UL-10 produzida pelos monócitos pode também ter uma forte actividade de retroacção auto-reguladora sobre a activação das células T, é apoiada pela observação de que IL-10 produzida pelos monócitos após activação por LPS é responsável pela regulação negativa dos antigénios MHC classe II nestas células, uma vez que a expressão de MHC classe II não foi reduzida e sendo mesmo fortemente aumentada quando se realizaram estimulações com LPS na presença do mAb neutralizante anti-IL-10.

As citocinas pro-inflamatórias, IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 e TNFa, estão envolvidas em processos inflamatórios agudos e crónicos e em muitas doenças auto-imunes, incluindo artrite reumatóide. Estas citocinas modulam a activação e função de células do sistema imunitário, mas também as das células endoteliais, queratinócitos e hepatócitos. O facto de IL-10 ter fortes efeitos reguladores negativos na secreção destas citocinas sugere que IL-10 seja um inibidor potente da inflamação. Com base nestas propriedades descritas, as quais incluem inibição da proliferação de células T específica de antigénio atraveés darédução da capacidade APC dos monócitos através da regulação negativa dos antigénios MHC classe II nestas células e os efeitos inibidores sobre a secreção de citocinas pro-inflamatória em monócitos, parece que IL-10 desempenha um papel importante como supressor das respostas imune e inflamatória. Este papel é ainda confirmado por estudos em modelos in vitro e in vivo das respostas a superantigénios de endotoxina e enterotoxina. O presente estudo demonstra que IL-10 possui efeito inibidor sobre a produção de citocinas induzida por LPS em linhas celulares de macrófagos e macrófagos peritoneais. Assim, IL-10 não só tem um papel importante na regulação da resposta de células T, como também nas resposta inflamatórias induzidas durante a infecção ou ferimento. O efeito de IL-10 nas linhas celulares de macrófagos é mais pronunciado do que o induzido por quantidades semelhantes de IL-4, que se demonstrou previamente inibir a produção de citocinas em macrófagos e monócitos de ratinho e humanos. Estes resultados mostram uma inibição significativa, por IL-4, da produção de proteína TNFa induzida por LPS, mas uma inibição menos marcada da síntese de IL-6, nestas linhas celulares. No entanto, a inibição de TNFa por IL-4 não é tão grande quanto anteriormente descrito para monócitos humanos. Esta diferença pode ser explicada pela diferença das espécies, utilização de linhas celulares de macrófagos diferenciados em vez de monócitos ou porque estes estudos usaram 10 pg/ml de LPS em oposição à dose de 100 ng/ml usada num dos sistemas de monócitos humanos. Ao contrário de IL-4, IL-10 inibiu significativamente a produção de proteína IL-6, TNFa e IL-1 nesta concentração elevada de LPS. A estimulação das linhas celulares de macrófagos com LPS e IFNy induziu um nível muito superior de TNFa e IL-6 e, nalguns casos, este foi resistente à acção de IL-4, sugerindo que IL-4 e IFNy possuem efeitos opostos e que se contrariam em certos aspectos da activação de macrófagos. Novamente isto está em contradição -46- com os estudos em monócitos humanos, os quais foram realizados com quantidades mais baixas de LPS. Mais uma vez, a inibição mediada por IL-10 da produção de IL-6 e TNFa, induzida por IFNy mais LPS, foi mais significativa do que o observado com IL-4. A inibição da expressão de RN A codificadora de IL-6 e TNFa induzida por LPS ou IFNy mais LPS foi também observada usando um método semi-quantitativo de amplificação por PCR para o RNA sujeito a transcrição inversa. Nalguns casos, IL-4 inibiu a expressão num nível semelhante a IL-10, sugerindo que IL-10 possui um efeito semelhante na secreção ou estabilidade das proteínas traduzidas. Apesar de IL-10 ter os seus efeitos, parece que o seu papel inibidor final na produção de citocinas por macrófagos é mais potente do que o observado com IL-4. Os efeitos de IL-10 na produção de monocinas sugere que este forte poder inibidor possa ter potencial como agente anti-inflamatório talvez numa larga variedade de manifestações clínicas.

Uma vez que também se demonstrou que os macrófagos peritoneais foram inibidos por IL-10 de células T estimuladoras, testou-se se IL-10 inibiu a secreção de citocinas por esta população celular purificada. Macrófagos peritoneais purificados por FACS obtidos a partir de ratinhos BALB/c ou CBA/J, estimulados com LPS produziram níveis significativos de proteína IL-6 que foi apenas ligeiramente reduzida na presença de IL-10. Uma vez que dos preliminares de PCR sugeriram que os macrófagos purificados produziam IL-10, nalgumas das estimulações com LPS foi incluido um anticorpo anti-IL-10. A adição deste anticorpo às estimulações com LPS em ambas as estirpes de ratinho elevou a produção da proteína IL-6 para um nível muito superior (30-35 ng/ml por 7 x 10^ células/ml, em 20 horas). Isto foi consistente com a produção de citocinas por macrófagos sob estreito controlo autócrino ou que exista mais de uma população de macrófagos nos macrófagos peritoneais Mac-l+jbrilhante^ uma das quais tem controlo sobre as outras através da sua produção de IL-10. Os resultados obtidos paralelamente no sistema de monócitos humanos mostra que -47- IL-10 inibe a produção de citocinas induzida por LPS, incluindo a produção da própria IL-10, em monócitos humanos purificados por elutriação. De acordo com descrições anteriores de efeitos contrários de citocinas derivadas de células T auxiliares, tais como IL-4 e IL-10, com citocinas de células T auxiliares Thl, tais como IFNy, são proporcionados mais dados apoiando o facto destas citocinas poderem ter efeitos contrários umas sobre as outras. IFNy aumentou o nível de IL-6 produzida como resposta a LPS, até um nível quase tão alto quanto o conseguido por anti-IL-10, ao inibir ostensivamente a produção de IL-10 pelos mesmos macrófagos. Estes resultados sugerem que a produção de citocinas tais como IL-6 e TNFa seja regulada por IL-10, a qual por sua vez está sob o controlo de de IFNy produzido pelas células T activadas e células NK. Esta acção de de IFNy poderá explicar as observações anteriores mostrando que a incubação de macrófagos peritoneais com de IFNy, durante 24 horas, aumentou a sua capacidade para estimular as células Thl.

Desconhece-se o mecanismo de como IL-10 inibe a síntese de citocinas em macrófagos na presença de células estimuladoras. Face ao decréscimo significativo na síntese de citocinas observado quando os macrófagos são estimulados na presença de IL-10, IL-10 pode regular negativamente uma actividade co-estimuladora necessária a uma produção de citocinas óptima como resposta a macrófagos e antigénios. Usando sobrenadantes obtidos a partir de macrófagos 1G18.LA, foi possível ultrapassar o efeito inibidor de IL-10 em macrófagos e na estimulação de células Thl dependente de antigénio. Isto é consistente com um mecanismo em que IL-10 não medeia os seus efeitos na síntese de citocinas através da regulação negativa de um co-estimulador solúvel. É possível, apesar de improvável, que 11-10 interfira com a acção e não com a produção de tal factor, ou que tal co-estimulador seja altamente sensível ou absorvido e não esteja presente nas preparações de sobrenadante. Como alternativa, IL-10 pode inibir a expressão de um co-estimulador ligado a membranas, o qual poderá também explicar descrições anteriores sugerindo que a estimulação das células requeira uma APC/célula acessória que não possa ser substituída por um co-estimulador solúvel. Uma explicação alternativa para o mecanismo da inibição da síntese de citocinas por IL-10 poderá ser que IL-10 induza a produção de um ou mais factores inibidores pelo macrófago, os quais actuarão então sobre as células T para inibir a secreção de citocinas. A mistura de macrófagos e células B APC num sistema específico de antigénio para a estimulação de células Thl conduz a uma estimulação aditiva das células T, comparado com a estimulação por cada uma das APC individuais. A presença de IL-10 inibe a síntese de citocinas pela célula até ao nível que a célula B APC atinge sozinha. Isto sugere que o macrófago não induz a produção de um inibidor que actue directamente sobre a célula T ou célula B APC. Se bem que improvável, é possível que tal inibidor possa ser específico para interacções macrófagos-células T, ou que a célula B APC de alguma forma ultrapasse ou escape ao efeito de tal actividade. Os resultados obtidos no sistema humano sugerem que IL-10 não atinge a sua inibição de proliferação das células T auxiliares via um inibidor solúvel ou factor co-estimulador produzido pelo moriócito. No entanto, os seus efeitos podem ser explicados pela regulação negativa dos antigénios MHC classe II pela IL-10 em monócitos humanos, o que ainda não foi observado no sistema de ratinho.

Para além da regulação da função efectora, IL-10 poderá também desempenhar um papel na iniciação de uma resposta imune no sentido da produção de anticorpos ou de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH), por activação de diferentes sub-séries de células T auxiliares CD4 produtoras de diferentes padrões de citocinas. O facto de tanto as células B como os macrófagos produzirem IL-10 e também funcionarem como APC, sendo simultaneamente sensíveis a diferentes moduladores do tipo citocina (IFNy inibe muitas das funções das células B; IL-10 inibe a função APC dos macrófagos mas não das células B), dá apoio a esta teoria. Estes estudos mostram ainda que IL-10 tem um efeito inibidor sinificativo na síntese de citocinas em macrófagos, assim como provoca uma alteração morfológica marcada nos macrófagos peritoneais. Consideradas na sua globalidade estas observações sugerem um papel importante para IL-10, não só na regulação das respostas das células T como também como modulador importante das respostas inflamatórias agudas induzidas pela infecção ou ferimento.

No estudo D foi testada a capacidade de IL-10 para inibir in vivo a toxicidade mediada por superantigénios. IL-10 é capaz de inibir a produção de citocinas pelas células T, em parte através da inibição da capacidade dos macrófagos para activarem as células T. Os superantigénios têm sido definidos como moléculas que activam as células T formando uma "ponte" entre a cadeia V β do TCR e as moléculas MHC classe II presentes nas APCs. Estes resultados sugeriram que IL-10 poderá inibir a produção de citocinas pelas células T activadas por superantigénios apresentados pelos macrófagos. Os superantigénios podem ser endógenos, e.g., codificadas por vírus ou exógenos, e.g., enterotoxinas microbianas. Os superantigénios mais estudados do último grupo incluem as enterotoxinas de estafilococos. Sabe-se agora que a toxicidade apresentada por estas toxinas depende da sua capacidade para activar células T in vivo. Estas observações sugerem que os agentes que inibem a activação das células T prevenirão a toxicidade dos superantigénios. Isto é consistente com a observação de que a ciclosporina evita a toxicidade mediada por SEB. De acordo com este modelo, TNFa é o principal mediador da toxicidade. Os resultados aqui apresentados indicam que IL-10 é capaz de prevenir a toxicidade de SEB, provavelmente através da sua capacidade para inibir a produção de TNF pelas células T.

Estas observações têm implicações interessantes para o mecanismo de acção de IL-10 in vivo. Demonstrou-se que IL-10 inibe funções dos macrófagos, e.g., produção de citocinas, capacidade para activar células T e induzir a expressão de antigénio Ia nas células B. Mas uma vez que a toxicidade de SEB depende da expressão dos antigénios Ia por APC, o resultado destas experiências in vivo foi incerto. O facto de IL-10 prevenir a toxicidade induzida por SEB sugere que a principal APC in vivo é o macrófago, não a célula B.

Estes resultados têm implicações importantes para a utilização terapêutica de IL-10. Para além da contaminação de alimentos provocada por enterotoxinas de estafilococos, foi descrita uma série de doenças como sendo induzidas por superantigénios, e.g., síndrome do choque tóxico, doença de Kawasaki, doenças causadas por toxinas de estreptococos e doenças auto-imunes como sejam a artrite reumatóide. IL-10 é altamente eficaz na protecçâo de ratinhos da endotoxémia letal, um resultado que sugere que IL-10 pode ser útil no tratamento de sepsis bacteriana. Se bem que muitos outros reagentes, e.g., anticorpos contra TNFa ou contra endotoxinas, e a IL-lRa, sejam correntemente usados em ensaios clínicos para o tratamento de sepsis bacteriana, a maior parte necessita de ser dada antes da indução da sepsis nas experiências com modelos animais parauma protecçâo óptima. Uma excepção a isto, a IL-lRa, é eficaz quando administrada na altura da indução da sepsis em experiências com modelos animais, mas deve ser administrada em quantidades suficientemente grandes para bloquear todos os receptores de IL-1 endógenos. As doses farmacológicas de IL-10 também produzem uma série de efeitos na função do macrófago/monócito que deverão contribuir para a protecçâo da endotoxémia letal, muito possivelmente em quantidades inferiores às saturantes dos receptores.

Se bem que as discussões anteriores sejam dirigidas para os efeitos da administração de IL-10 na regulação e diferenciação de vários aspectos dos sistema imunitário, é possível ir mais longe através do bloqueio dos efeitos da citocina IL-10 usando anticorpos anti-IL-10.

Os resultados aqui apresentados indicam que o tratamento contínuo de ratinhos desde o nascimento até à idade adulta com anticorpos anti-IL-10 reduz drasticamente o número total e função das células B Ly-1, sem alteração do número, fenótipo ou imunocompetência das células B convencionais situadas nos baços destes mesmos animais. Várias observações apoiam a depleção proposta de células B Ly-1 em ratinhos tratados com anti-IL-10: (a) ratinhos tratados com anti-IL-10 contêm menos ou nenhumas células B nas suas cavidades peritoneais, um sítio de enriquecimento em células B Ly-1 nos ratinhos normais. (Células das lavagens peritoneais de ratinhos BALB/c de 8 semanas de idade no sistema de tratamento de animais DNAX contêm menos de 5% das células B convencionais por análise de fenótipo); (b) ratinhos tratados com anti-IL-10 contêm 0-10% dos níveis séricos normais de IgM, o que é consistente com experiências de reconstituição anteriores que identificaram as célulás B Ly-1 como a fonte predominante de IgM circulante; e (c) ratinhos tratados com anti-IL-10 produziram pouco ou nenhum anticorpo como resposta à injecção com fosforilcolina e al,3-dextrano, antigénios para os quais existem células B específicas na subsérie de células B Ly-1. Os dados sugerindo um compartimento de células B convencionais inalterado em ratinhos tratados com anti-IL-10 são igualmente convincentes, com números inalterados de células B do baço apresentando fenótipos de marcadores de superfície celular normais e respondendo normalmente a antigénio dependente do timo e a mitogénios das células B. A depleção selectiva decélulas B Ly-1 em ratinhos tratados com anti-IL-10 verificou-se ser transitória, uma vez que as células B Ly-1 reapareceram nas cavidades peritoneais destes animais várias semanas após paragem do tratamento com IL-10. - 52- - 52-

Foram considerados vários mecanismos possíveis para a explicação da depleção selectiva de células B Ly-1 em ratinhos tratados com anti-IL-10. Os resultados apresentados indicam que esta é, pelo menos em parte, a consequência do aumento de IFNy após o tratamento anti-IL-10, uma vez que a coadministração de anticorpos neutralizantes anti-IL-10 e anti-IFNy evitam substancialmente a depleção de células B peritoneais nestes estudos. A implicação de que IFNy directa ou indirectamente inibe o desenvolvimento de células B Ly-1 deriva de observações anteriores de que IFNy provoca supressão ligeira da proliferação induzida in vitro por IL-5 do linfoma B Ly-1+ BCL1. Ao prolongar-se estes estudos, observou-se supressão mediada por IFNy da proliferação de células peritoneais induzida por LPS, mas não células do baço de de ratinhos BALB/c normais. Não está totalmente compreendido se o aumento de IFNy nos ratinhos tratados com anti-IL-10 é totalmente devido à depleção de células B Ly-1 e se isto reflete uma acção directa do IFNy das células B Ly-1 ou algum efeito indirecto mediado por IFNy. Possivelmente, outras alterações nos ratinhos tratados com anti-IL-10 contribuem ainda para a depleção de células B Ly-1. O tratamento anti-IL-10 conduzirá provavelmente ao aumento dos níveis de monocinas endógenas. Os ratinhos tratados com anti-IL-10 são cerca de 50 vezes mais susceptíveis à morte pelo choque induzido por LPS, um caso conhecido como sendo mediado por citocinas, e 5 dos 32 ratinhos tratados com anti-IL-10 possuem níveis séricos substanciais de IL-6, uma monocina que não é geralmente encontrada em circulação nos animais normais e que não foi detectada nos soros de qualquer um dos 10 animais testemunha destas experiências. No entanto, ratinhos transgénicos IL-6, ou animais que possuem níveis muito elevados de monocinas séricas, quando da administração in vivo de LPS parecem possuir níveis séricos de IgM normais, sugerindo números inalterados de células B Ly-1. Resultados anteriores em que células B Ly-1, mas não células B convencionais produzem IL-10 constitutiva e induzível levou à sugestão de que IL-10 actua como um factor de crescimento autócrino. Isto agora parece improvável face aos números substanciais de células B Ly-1 peritoneais recuperados de ratinhos tratados com anticorpos anti-IL-10 e anti-IFNy. O ratinho sem células B Ly-1 criado por tratamento contínuo com anti-IL-10 é consideravelmente semelhante ao ratinho imunodeficiente xid, uma estirpe mutante espontânea derivada de ratinhos CBA/CaH que não possui células B Ly-1 e que não responde a uma subsérie de antigénios independentes do timo. Apesar destas semelhanças, os nossos estudos preliminares revelaram que ratinhos x]d produzem IL-10 normalmente e contêm receptores de IL-10 funcionais, distinguindo assim mecanisticamente ratinhos xid e ratinhos tratados com anti-IL-10. Ainda, uma propriedade que distinguiu ratinhos tratados com anti-IL-10 de ratinhos xid é a resposta in vitro de células do baço à estimulação anti-IgM, apresentada pelos primeiros mas não por estes últimos animais. O papel fisiológico de IL-10 foi estudado injectando ratinhos desde o nascimento até à idade adulta com anticorpos monoclonais que neutralizam especificamente IL-10. Tal tratamento conduz a numerosas alterações distintas no estado imune destes animais. Os animais são caracterizados por aumentos na circulação de TNFa, IFNy e em muitos casos IL-6. Estes efeitos são consistentes com as propriedades in vitro anteriormente descritas para IL-10, um supressor forte de IFNy e da produção de monocinas em experiências de culturas celulares. O aumento de IFNy endógeno parece ser responsável por outras consequências resultantes do tratamento anti-IL-10. Por exemplo, conduz à depleção de células B Ly-1 e isto por sua vez é responsável pela redução de anticorpos IgM e IgA circulantes e respostas de anticorpos específicas contra a fosforilcolina e al,3-dextrano. Os níveis elevados de IFNy são provavelmente também responsáveis pelos aumentos de IgG2a circulantes pois este isotipo é regulado positivamente por IFNy. As restantes alterações de aumentos nas células T peritoneais, granulócitos e IgG2b circulante não estão compreendidos mecanisticamente, mas podem ser consequência de pertubações de citocinas secundárias. Se bem que de um modo geral saudáveis, os ratinhos tratados com anti-IL-10 são altamente susceptíveis à morte resultante de choque induzido por endotoxinas. Esta reacção inflamatória letal é uma situação mediada por monocinas, que pode ser evitada pela transferência passiva de anticorpos específicos de TNF-α, IL-1, IL-6 ou endotoxina. Portanto, não é surpreendente que os ratinhos tratados com anti-IL-10, que apresentam regulação positiva de monocinas endógenas e que não possuem a população de células B muito provavelmente produzem anticorpos anti-endotoxina (i.e. células B Ly-1), sejam mais susceptíveis a esta reacção inflamatória. Estes dados sugerem um papel clínico para ÍL-10 como reagente anti-inflamatório. Consistente com esta noção, as experiências indicam que doses farmacológicas de IL-10 protegem os ratinhos da morte devido ao choque induzido por endotoxinas.

Ainda que, o fenótipo descrito para os ratinhos tratados com anti-IL-10 seja claramente consistente com as propriedades in vitro conhecidas para IL-10, está no entanto em oposição a descrições preliminares acerca de ratinhos deficientes em IL-10 por mutagenização de genes. Estes mutantes possuem níveis indetectáveis de IFNy, TNFa e IL-6 circulantes, números normais de células B Ly-1 na cavidade peritoneal e, numa primeira aproximação, níveis séricos de IgG normais. A explicação para esta discrepância não é clara, se bem que uma situação discrepante semelhante exista entre ratinhos não produtores de IL-2 e nalgumas descrições de ratinhos tratados desde o nascimento até à idade adulta com anticorpos contra os receptores de IL-2. Uma explicação envolve a redundância bem conhecida que existe dentro do sistema das citocinas. E possível que um embrião de ratinho em desenvolvimento compense a perda de um gene de citocina crítico através da amplificação da expressão de um gene codificador de uma citocina de função estreitamente relacionada. Por exemplo, uma vez que IL- -55- 4 partilha muitas propriedades com IL-10, esta citocina será um excelente candidato para compensar a perda total de IL-10 e assim a sua expressão pode ser regulada positivamente em ratinhos que não expressam IL-10. Pelo contrário, a neutralização de IL-10 endógena via tratamento com anticorpos de ratinhos desde o nascimento representará uma eliminação "falível" da citocina e portanto os vestígios de IL-10 endógena podem ser suficientes para evitar uma imunodeflciência profunda e uma activação reguladora de uma via compensatória das citocinas. Uma explicação alternativa é que os animais tratados com anticorpos montem respostas imunes artificial aos anticorpos xenogeneicos administrados e/ou que os complexos imunes resultantes não possam ser totalmente eliminados. No entanto, esta alternativa parece improvável uma vez que os anticorpos de controlo dos isotipos e os anticorpos contra outras citocinas, que também gerariam complexos imunes in vivo, não produzem as imunomodulações atribuídas a ratinhos tratados com anti-IL-10.

Se bem que o padrão de imunomodulação observado em ratinhos tratados com anti-IL-10 não esteja correlacionado totalmente com qualquer uma das doenças de imunodeficiência humana conhecidas, existem certas semelhanças com doentes Wiskott-Aldrich e doentes com síndrome de deficiência de IgA. Estas imunodeficiências humanas são caracterizadas por uma ausência de IgM ou IgA circulantes respectivamente, capacidades reduzidas para gerar respostas de anticorpos anti-bacterianos e frequentemente um aumento na circulação de IgGl, o principal isotipo de anticorpos humanos fixadores do complemento que provavelmente corresponde com IgG2a de ratinho. Aguarda confirmação se tais doentes apresentam produção reduzida de IL-10 ou falta de resposta a IL-10, e, caso assim seja, se esta por sua vez contribui para a sua imunodeficiência. O potencial papel de IL-10 no síndrome de deficiência de IgA é particularmente intrigante face a um estudo recente implicando,a IL-10 como um importante cofactor necessário às células B humanas naifes para se diferenciarem em células secretoras de IgA após a sua áctivação com anticorpo anti-CD40 interligados e TGFp. A incapacidade dos ratinhos tratados com anti-IL-10 para gerar resposta de anticorpos específicos a dois antigénios bacterianos apoia ainda a proposição de que IL-10 será um adjuvante eficaz na imunidade antibacteriana, como descrito atrás.

Para além de proporcionar informação acerca do papel fisiológico e potencial clínico de IL-10, os ratinhos tratados com anti-IL-10 proporcionam uma nova oportunidade para avaliar a contribuição das células B Ly-1 para o sistema imunitário. Conforme referido atrás, as consequências secundárias resultantes da depleção de células B Ly-1 em ratinhos tratados com anti-IL-10 confirmam muitas dás propriedades previamente atribuídas a esta subpopulação pequena de células B. No entanto estes dados proporcionam ainda novas perspectivas relativamente à contribuição das células B Ly-1 para o sistema imunitário. Em particular, é razoável concluir que as células B Ly-1 não são necessárias para o desenvolvimento de respostas IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 ou IgE, uma vez que os níveis séricos destes isotipos não baixam nos ratinhos tratados com anti-IL-10 e sem. células B Ly-1. De modo semelhante, se bem que as células B Ly-1 sejam essenciais para a resposta a alguns antigénios tipo II independentes do timo, e.g., fosforilcolina e ccl,3-dextrano, elas não são aparentemente necessárias para outros, e.g., TNP-Ficoll e anti-IgM. De facto, os níveis inalterados ou ligeiramente elevados de IgG3 circulante, um isotipo unicamente associado à resposta de células B a antigénios do tipo polissacárido, sugere que os ratinhos deficientes em células B Ly-1 sejam provavelmente capazes de responder à maior parte dos antigénios tipo II independentes do timo. Este aspecto dos ratinhos tratados com anti-IL-10 facilmente os distingue do ratinho xid, uma estirpe de ratinho com imunodeficiência espontânea que também não possui células B Ly-1, mas que não responde a todos os antigénio os antigénios tipo II independentes do

Para além de proporcionar informação acerca da contribuição das células B Ly-1 para o sistema imunitário, os ratinhos tratados com anti-IL-10 permitem-nos avaliar as consequências do aumento de TNFa in vivo. Os nossos dados ilustram claramente que o antagonismo in vivo de IL-10 conduz a um aumento substancial dos níveis séricos de TNFa. Se bem que as consequências desfavoráveis do aumento de TNFa tenham sido consideradas detalhadamente atrás (e.g., choque séptico, malária cerebral, etc.), também devem ser consideradas numerosas consequências favoráveis do aumento de TNFa. Estas incluem a demonstração em modelos animais de efeitos anti-tumorais directos, expansão de linhagens hematopoiéticas de granulócito-monócito, radioprotecção e protecção contra algumas doenças auto-imunes e infecciosas. Estas considerações implicam pois que os antagonistas de IL-10 sejam candidatos à intervenção terapêutica no tratamento destes tipos de doenças. De facto, confirmámos esta hipótese tendo demonstrado que os anticorpos anti-IL-10 podem retardar substancialmente o desenvolvimento de auto-imunidade em ratinhos NZB/W com predisposição para o lupus.

Resumindo, o presente invento está relacionado com a utilização de IL-10 ou antagonistas de IL-10 para regular a produção de monocinas quesejam mediadores importantes de muitas doenças. IL-10 e os seus agonistas provocarão uma supressão marcada de monocinas tais como TNFa e desta forma proporcionarão protecção contra reacções inflamatórias indesejáveis tais como sépsia bacteriana, choque tóxico, artrite reumatóide e psoríase. De modo semelhante, os antagonistas de IL-10 aumentarão o nível de monocinas tais como TNFa, as quais por sua vez podem actuar como agente ati-tumorais e proporcionar radioprotecção e protecção contra certas doenças auto-imunes e infecciosas.

Exemplos

Os exemplos que se seguem servem para ilustrar o presente invento. A selecção de vectores e hospedeiros, assim como a concentração de reagentes, temperaturas e valores de outros parâmetros variáveis são para exemplificar a aplicação do presente invento e não devem ser considerados como limitantes.

Exemplo 1. Expressão de IL-10 humana num hospedeiro bacteriano

Um gene sintético para IL-10 humana foi montado a partir de uma pluralidade de fragmentos de DNA de cadeia dupla, obtidos por síntese química, para formar um vector de expressão designado TAC-RBS-hIL-10. As clonagem e expressão foram realizadas num sistema bacteriano convencional, por exemplo E. coli K-12 estirpe JM101, JM103 ou similares, descritos por Vieira e Messing, em Gene, Vol. 19, pgs 259-268 (1982). As digestões com endonucleases de restrição e reacções com ligase foram tipicamente realizadas usando protcolos convencionais, e.g., Maniatis et al, (1982) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; Sambrook et al Molecular Cloning: A Laboratorv manual (2nd Ed; Vols 1-3), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; e Ausubel et al, (1987e suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology. Wiley and Sons, New York, os quais são aqui incluídos como referência.

O método de lise alcalina foi usado para as preparações de plasmídeo em pequena escala. Para as preparações em larga escala usou-se uma modificação do método de lise alcalina em que se usou um volume igual de isopropanol para precipitar os ácidos nucleicos a partir do lisado clarificado. A precipitação com acetato de amónio frio 2,5M foi usada para remover o RNA antes da centrifugação de equilíbrio em gradientes de densidade de cloreto de césio e detecção com brometo de etídio.

Para as hibridações em filtro usaram-se círculos de filtro Whatman 540 para transferir as colónias, que foram então lisadas e fixadas por tratamentos sucessivos com NaOH 0,5M, NaCl 1,5M; Tris-HCl 1M pH 8,0, NaCl 1,5M (2 min. cada); e aquecimento a 80°C (30 min). As hibridações foram em 6x SSPE, 20% formamida, 0,1% dodecilsulfato de sódio (SDS), 100 pg/ml de tRNA de E. coli e 100 pg/ml de Coomassie Brilliant Blue G-250 (Bio-Rad) a 42°C durante 6 horas usando DNAs sintéticos marcados com 32P (fosforilados). (20XSSPE foi preparado dissolvendo 174g de NaCl, 27,6 g de NaH2P049H20, e 7,4 g de EDTA em 800 ml de H20. O pH foi ajustado a 7,4 com NaOH. O volume foi ajustado a 1 litro e esterilizado por autoclavagem). Os filtros foram lavados duas vezes (15 min, temperatura ambiente) com lxSSPE, 0,1% SDS. Após auto-radiografia (filme Fuji RX), as colónias positivas foram localizadas alinhando as colónias que voltaram a crescer com as colónias coradas de azul nos filtros. O DNA foi sequenciado de acordo com o método didesoxi, Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei., Vol. 74, pg. 5463 (1977). Os moldes para as reacções didesoxi foram DNAs de cadeia simples de regiões importantes reclonadas em vectores M13mp, e.g., Messing et ai, Nucleic Acids Res., Vol. 9, pg. 309 (1981) ou DNA de cadeia dupla preparado pelo método minialcalino e desnaturado com NaOH 0,2M (5 min, temperatura ambiente) e precipitado do NaOH 0,2M, acetato de amónio 1,43M pela adição de 2 volumes de etanol. O DNA foi sintetizado através de química de fosforamidetos usando sintetizadores Applied Biosystems 380A . A síntese, desprotecção, clivagem e purificação (PAGE em ureia 7M, eluição, cromatografia em DEAE-celulose) foram realizados como descrito no manual do sintetizador 380A.

As cadeias complementares de DNAs sintéticos a serem clonados (400 ng de cada) foram misturadas e fosforiladas com cinase de polinucleótidos num volume de reacção de 50 ml. Este DNA foi ligado com 1 mg de DNA vector, digerido com as enzimas de restrição adequadas, e as ligações foram realizadas num volume de 50 μΐ à temperatura ambiente durante 4 a 12 horas. As condições de fosforilação, digestões com enzimas de restrição, reacções com polimerases e ligação foram já descritas (Maniatis et al., referido atrás). Contaram-se as colónias lacZ+ (quando necessário) semeando em agar L suplementado com ampicilina, isopropil-l-tio-beta-D-galactósido (IPTG) (0,4 mM) e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranosido (X-gal) (40 pg/ml). O vector TAC-RBS foi construído preenchendo com DNA polimerase o sítio BamHI do plasmídeo pDR540 portador de tacP (Pharmacia). Este foi então ligado a oligonucleótidos sintéticos não fosforilados (Pharmacia) que formam um fragmento de cadeia dupla codificador de um sítio de consenso de ligação aos ribossomas (RBS, GTAAGGAGGTTTAAC). Após ligação, a mistura foi fosforilada e religada com o adaptador SstI ATGAGCTCAT. Este complexo foi então clivado com SstI e EcoRI e o fragmento de 173 pb isolado por electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e clonado em pUC19 digerido com EcoRI-SstI (Pharmacia) (como descrito abaixo). A sequência das regiões RBS-ATG-poliadaptador da construção final (designada TAC-RBS) está descrita na Patente U.S. 5,017,691, a qual está aqui incluída como referência. O gene sintético de IL-10 foi montado num plasmídeo pUC19 em oito passos. Em cada um dos passos, fragmentos sem deleções e/ou fragmentos foram detectados após clonagem mantendo o gene lacZ(a) de pUC19 na grelha de leitura correcta relativamente ao codão de iniciação ATG inserido no passo 1. Os clones contendo alterações do tipo deleção e/ou inserção foram excluídos visualizando as colónias azuis em placas de L-ampicilina contendo X-gal e IPTG. Como alternativa, em cada um dos passos, as sequências dos fragmentos -61 - \ inseridos podem ser facilmente confirmadas usando uma escorva de sequenciação universal com minipreparações de DNA plasmídico.

No passo 1 o vector TAC-RBS foi digerido com SstI, tratado com DNA-polimerase de T4 (cuja actividade de exonuclease 3' digere as cadeias salientes 3' dos cortes com SstI para formar fragmentos com extremos cegos) e após desactivação da DNA-polimerase de T4, tratados com EcoRI para formar um fragmento de 173 pares de bases (pb). Este fragmento contem a região TAC-RBS e possui um extremo cerse no codão de iniciação ATG e um extremo EcoRI no extremo oposto. Finalmente, isolou-se o fragmento TAC-RBS de 173 pb.

No passo 2 o fragmento TAC-RBS isolado do passo 1 foi misturado com o plasmídeo pUC19 digerido com EcoRI/Kpnl e com o fragmento sintético 1A/B que, como se mostra abaixo, possui um extremo cerse no extremo a montante e um extremo coesivo correspondendo ao corte com Kpnl a jusante. Este extremo Kpnl é adjacente e a jusante do sítio BstEII. Os fragmentos foram ligados para formar pUC19 do passo 2.

No passo 3, os fragmentos sintéticos 2A/B e 3A/B (apresentado abaixo) foram misturados com pUC19 do passo 2 digerido com BstEII/Smal (após amplificação e purificação) e ligados para formar pUC19 do passo 3. Note-se que o extremo a jusante do fragmento 3 A/B contem bases extra que formam o extremo cerse Smal. Estas bases extra foram clivadas no passo 4. Também os fragmentos 2A/B e 3A/B possuem extremos de cadeia simples complementares de 9 resíduos que emparelham quando misturados, deixando o corte BstEII a montante de 2 A/B e o extremo cerse a jusante de 3 A/B para ligar ao pUC19.

No passo 4 pUC19 do passo 3 (após amplificação e purificação) digerido com AflII/Xbal foi repurificado, misturado com o fragmento sintético 4Α/Β (apresentado abaixo) e ligado para formar pUC19 do passo 4.

No passo 5, pUC19 do passo 4 (após amplificação e purificação) digerido com Xbal/Sall foi misturado com o fragmento sintético 5A/B (apresentado abaixo) e ligado à forma do pUC19 do passo 5. Note-se que o extremo coesivo Sall fragmento 5A/B é eliminado por digestão com Hpal no passo 6.

No passo 6, pUC19 do passo 5 (após amplificação e purificação) digerido com Hapal/PstI foi misturado com o fragmento sintético 6A/B (apresentado abaixo) e ligado para formar o pUC19 do passo 6.

No passo 7, pUC19 do passo 6 (após amplificação e purificação) digerido com Clal/Sphl foi misturado com o fragmento sintético 7A/B (apresentado abaixo) e ligado para formar o pUC19 do passo 7.

No passo 8, pUC19 do passo 7 (após amplificação e purificação) digerido com MluI/HindlII foi misturado com os fragmentos sintéticos 8A/B e 9A/B e ligado para formar a construção final. A construção final foi inserida em E. coli K-12 estirpe JM101, e.g., disponível na ATCC como número de acesso 33876, através de técnicas convencionais. Após cultura, a proteína foi extraída das células JM101 e diluições dos extractos foram testadas quanto à sua actividade biológica. As sequências dos fragmentos referidos estão apresentadas na tabela 1.

Tabela 1. As letras mnúsculas indicam que uma base difere da sequência nativa nesse sítio AGCCCAGGCC AGGGCACCCA GTCTGAGAAC AGCTGCACCC ACTTC-

TCGGGTCCGG TCCCGTGGGT CAGACTCTTG TCGACGTGGG TGAAG CCAGGtAACC ggtac AGGGTCCaTTGG c

Fragmento 1A/B

GtAACCTGCC TAACATGCTT CGAGATCTCC GAGATGCCTT CAG-GACGG ATTGTACGAA GCTCTAGAGG CTCTACGGAA GTC-

CAGAGTGAAGACTTTCTTT

GTCTCACTTC

Fragmento 2A/B

CAAATGAAGG ATCAGCTGGA CAACTTGTTc TtAAG TGAAAGAAA GTTTACTTCC TAGTCGACCT GTTGAACAAg AaTTC

Fragmento 3A/B

GAGTCCTTGC TGGAGGACTT TAAGGGTTAC CTGGGTTGCC AAGCC CTCAGGAACG ACCTCCTGAA ATTCCCAATG GACCCAACGG TTCGG

TTGTCTGAGA TGATCCAGTT TTAt AACAGACTCT ACTAGGTCAA AATaGAtC

Fragmento 4A/B

CTaGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC CAAGACCCAG ACATC GAtCTCCTCC ACTACGGGGT TCGACTCTTG GTTCTGGGTC TGTAG AAGGCGCATG TtAACg TTCCGCCTAC AaTTGcagct

Fragmento 5A/B AACTCCCTGG GGGAGAACCT GAAGACCCTC AGGCTGAGGC TACGG-TTGAGGGACC CCCTCTTGGA CTTCTGGGAG TCCGACTCCG ATGCC- CGCTGTCATC GATctgca GCGACAGTAG CTAg

Fragmento 6A/B CGATTTCTTC CCTGTCAAAA CAAGAGCAAG GCCGTGGAGC AGGTG-TAAAGAAG GGACAGTTTT GTTCTCGTTC CGGCACCTCG TCCAC- AAGAAcGCgT gcatg TTCTTgCGcA c

Fragmento 7A/B CGCGTTTAAT AATAAGCTCC AAGACAAAGG CATCTACAAA GCCAT-AAATTA TTATTCGAGG TTCTGTTTCC GTAGATGTTT CGGTA-

GAGTGAGTTT GAC CTCA

Fragmento 8A/B -65- ATCTTCATCA ACTACATAGA AGCCTACATG ACAAT-CTCAAACTG TAGAAGTAGT TGATGTATCT TCGGATGTAC TGTTA- GAAGATACGA AACTGA CTTCTATGCT TTGACTtcga

Fragmento 9A/B

Exemplo 2. Expressão de vIL-10 em células de macaco COS7

Um gene codificador da grelha de leitura aberta para vIL-10 foi amplificado por reacção em cadeia com polimerase, usando escorvas que permitiram inserir mais tarde o fragmento amplificado num vector pcD(SRa) digerido com EcoRI, descrito em Tabeke et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472. A cadeia codificadora do fragmento inserido está apresentada abaixo (à grelha de leitura aberta sendo atribuídas letras maiúsculas).

aattcATGGA TACCTGGCAC GACCTAAGAG CGAGGTAGAT ATGCCAGGCC CACAGGCTGA GGTGAAAATC CCTGCCGTGT TTAACAAGCT ATTTTTATTA GCGAAGGTTA GTGGTCACTC TGCAGTGCCT GGTGCTGCTT CTGAGTGTGG AGGTACAGAC CAATGTGACA ATTTTCCCCA ATGCCTTCAG TCGTGTTAAA ACCTTTTTCC AGACAAAGGA AACCTTTTGC TCAAGGAGTC TCTGCTAGAG GACTTTAAGG CTGTCAGAAA TGATCCAATT CTACCTGGAG GAAGTCATGC AACCAGGAC CCTGAAGCCA AAGACCATGT CAATTCTTTG TAAAGACCCT ACGGCTCCGC CTGCGCAGGT GCCACAGGTT GAGAACAAGA GTAAAGCTGT GGAACAGATA AAAAATGCCT GCAGGAAAAA GGAATTTACA AAGCCATGAG TGAATTTGAC ACTACATAGA AGCATACATG ACAATTAAAG CCAGGTGAg

Os clones portadores do fragmento inserido na orientação correcta foram identificados por expressão de vIL-10 e/ou padrão electroforético dos produtos de digestão. Um desses vectores portadores do gene vIL-10 foi designado pBCRFl(SRa) e foi depositado na ATCC com o número de acesso 68193. pBCRFl (SRa) foi amplificado em E. coli MC 1061, isolado por técnicas convencionais e usado para transfectar células de macaco COS7 como se segue: um dia antes da transfecção, aproximadamente 1,5 x 106 células de macaco COS 7 íaram semeadas em placas individuais de 100 mm em meio de Eagle modificação de Dulbecco (DME) contendo 5% de soro fetal de vitela (FCS) e glutamina 2mM. Para realizar a transfecção, as células COS 7 foram removidas das placas incubando-as com tripsina, lavadas duas vezes em DME sem soro e ressuspensas a 107 células/ml e m DME sem soro. Uma amostra de 0,75 ml foi misturado com 20 μg de DNA e transferido para uma cuvete de electroporação estéril de 0,4 cm. Após 10 minutos, as células foram sujeitas a um pulso de 200 volts, 960 mF numa unidade BioRad Gene Pulser. Após mais 10 minutos, as células foram removidas da cuvete e adicionadas a 20 ml de DME contendo 5% FCS, glutamina 2 mM, penicilina, estreptomicina e gentamicina. A mistura foi distribuída por quatro placas de cultura d etecidos de 100 mm. Após 12-24 horas a 37°C, 5% C02, o meio foi substituído com meio semelhante contendo apenas 1% FCS e a incubação continuou durante mais 72 horas a 37°C , 5% C02, após o que o meio foi colhido e testado quanto à sua capacidade para inibir a síntese de IFNy.

Quantidades de dez ml de leucócitos do sangue periférico (PBLs) isolados de fresco (cerca de 2 x 106 células/ml) foram incubadas a 37°C com fito-hemaglutinina (PHA) (100 ng/ml) em meio consistindo em (i) 90% DMEM suplementado com 5% FCS e glutamina 2 mM e (II) 10% de sobrenadante das células COS 7 previamente transfectadas com pBCRFl (SRa). Após 24 horas as células e os sobrenadantes foram colhidos para testar a presença de mRNA de IFNy ou proteína IFNy, respectivamente. As testemunhas foram tratadas identicamente, excepto os 10% do sobrenadante serem de culturas de COS7 previamente transfectadas com plasmídeo portador de um fragmento de cDNA não relacionado. As amostras tratadas com vIL-10 apresentaram uma inibição de cerca de 50% da síntese de IFNy relativamente às testemunhas.

Exemplo 3. Expressão de vIL-10 em Escherichia coli

Um gene codificador da vIL-10 madura que se segue pode ser expresso em E. coli.

Tre Asp Gin Cis Asp Asn Fen Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Fen Ser Arg Vai Lis Tre Fen Fen Gin Tre Lis Asp Glu Vai Asp Asn Leu Leu Leu Lis Glu Ser Leu Leu Glu Asp Fen Lis Gli Tir Leu Gli Cis Gin Ala Leu Ser Glu Met Ile Gin Fen Tir Leu Glu Glu Vai Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Glu Ala Lis Asp His Vai Asn Ser Leu Gli Glu Asn Leu Lis Tre Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cis His Arg Fen Leu Pro Cis Glu Asn Lis Ser Lis Ala Vai Glu Gin Ile Lis Asn Ala Fen Asn Lis Leu Gin Glu Lis Gli Ile Tir Lis Ala Met Ser Glu Fen Asp Ile Fen Ile Asn Tir Ile Glu Ala Tir Met Tre Ile Lis Ala Arg. O fragmento de cDNA inserido em pBCRFl(SRa) foi reclonado num plasmídeo Ml3 onde foi alterado duas vezes por mutagénese dirigida: primeiro para formar um sítio Ciai no extremo 5' da região codificadora do polipeptídeo vIL-10 maduro e segundo para formar um sítio BamHI no extremo 3' da região codificadora do polipeptídeo vIL-10 maduro. A sequência mutagenizada foi então facilmente inserida no vector de expressão TRPC11 descrito abaixo. O vector TRPC11 foi construído ligando um fragmento sintético do consenso RBS a adaptadores Ciai /ATGCAT) e clonando os fragmentos resultantes em pMTl lhe cortado com Ciai (o qual foi previamente modificado para conter o sítio Ciai). pMTllhc é um derivado pequeno do pBR322 (2,3 quilobases) de alto número de cópias, AMPR, TETS, portador da região poliadapatadora EcoRI-HindIII do pVX. (pVX está descrito por Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor. Este foi modificado de forma a conter o sítio Ciai cortando pMTllhc comEcoRI e BamHI, enchendo os extremos coesivos 5' e ligando ao adaptador Ciai (CATCGATG), restaurando assim os sítios EcoRI e BamHI e substituindo o sítio Smal por um sítio Ciai. Um transformante da construção TRPC11 possui uma sequência RBS em tandem flanqueada por sítios Ciai. Um dos sítios Ciai e parte da segunda cópia da sequência RBS foram removidos por digestão deste plasmídeo com PstI, tratamento com a nulease Bal31, corte com EcoRI e tratamento com DNA polimerase de T4 na presença dos quatro trifosfatos de desoxinucleótidos. Os fragmentos resultantes de 30-40 pb foram recuperados via PAGE e clonados em pUC12 cortado com Smal. Um fragmento EcoRI portador de trpP de E. coli de 248 pb derivado de pKClOl (descrito por nlchols et al. (1983) Methods in Enzymology 101:155-164, Academic Press, N.Y.) foi então clonado no sítio EcoRI para completar a construção TRPC11. Isto está ilustrado na Figura 1. TRPC11 foi empregue como vector para vIL-10, digerindo-o primeiro com Ciai e BamHI, purificando-o e depois misturando-o numa mistura de ligação convencional com o fragmento Clal-BamHI de Ml3 contendo a sequência de nucleótidos codificadora de BCRF1 madura. TRPC11 contendo o fragmento inserido, referido com TRPC11-BCRF1, foi propagado em E. coli Kl 2 estirpe JM101, e.g., disponível na ATCC com o número de acesso ESTUDO A. Efeitos diferenciais da interleucina-4 e -10 na síntese de interferão y. induzida por interleucina-2. e na actividade assassina activada por linfocinas

Os resultados apresentados nesta secção foram publicados após a data de prioridade em Hsu et al. (1992) Int'1 Immunology 4:563-569, sendo aqui incluídos na sua totalidade como referência.

Sumário A cultura de células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) humanas com interleucina-2 (IL-2), estimula a síntese de citocinas e a geração de actividade assassina activada por linfocinas (LAK). Tanto a interleucina-4 (IL-4) como a interleucina-10 (IL-10; factor inibidor da síntese de citocinas, CSIF) inibem a síntese de IFNy e de TNFa induzida por IL-2 em PBMC humanos. No entanto, ao contrário de IL-4,11-10 não inibe a proliferação de PBMC e de células assassinas naturais (NK) induzida por IL-2, nem a actividade LAK induzida por IL-2. Ainda, IL-4 inibe a síntese de IFNy induzida por IL-2 em células NK frescas purificadas enquanto, pelo contrário, o efeito inibidor de 11-10 é mediado pelas células CD14+ (monócitos/macrófagos). IL-10 inibe a síntese de TNFa em monócitos ou monócitos mais células NK, mas não em células NK sozinhas. Estes resultados mostram que 11-4 e IL-10 actuam sobre as células NK por vias distintas, e que a síntese de citocinas induzida por IL-2 e a actividade LAK são reguladas por mecanismos diferentes. A interleucina-10 (factor inibidor da síntese de citocinas, CSIF) inibe a síntese de citocinas, tais como IFNy, em linfócitos T e monócitos/macrófagos de ratinho e humanos. O efeito inibidor sobre a síntese de citocinas em células T é indirecto, mediado por monócitos/macrófagos na sua capacidade jgP&LÍb -70- como células apresentadoras de antigénio. Tanto IL-10 de ratinho como humana (mIL-10; hIL-10) são homólogas da grelha de leitura aberta BCRF1 do vírus de Epstein-Barr (IL-10 virai; v-IL-10), a qual apresenta também actividade de IL-10 em células de ratinho e humanas. Observou-se anteriormente que vIL-10 inibe a síntese de IFNy induzida por IL-2 em PBMC humanos. Devido às células NK terem sido descritas como a principal fonte de IFNy em PBMC estimulado com IL-2, os efeitos de hIL-10 e de v-IL-10 na síntese de citocinas induzida por IL-2 e actividade LAK foram estudados juntamente com a comparação destas citocinas com IL-4, um conhecido inibidor da actividade LAK. Os resultados mostram que IL-4, hIL-10 e vIL-10 inibem a síntese de IFNy e TNFa em PBMC estimulados com IL-2, mas apenas IL-4 inibe a síntese de IFNy em células NK purificadas. Ainda, ao contrário de IL-4, IL-10 não inibe a actividade LAK induzida por iL-2. Estes resultados apoiam um modelo de que iL-4 e IL-10 actuam sobre as células NK através de diferentes mecanismos e que a síntese de citocinas e a actividade LAK induzidas por IL-2 são reguladas por vias distintas.

Exemplo Al. Efeitos de IL-4 e IL-10 na síntese de citocinas e actividade LAK induzidas por IL-2

Citocinas. IL-2 humana recombinante (rIL-2) foi gentilmente preparada, usando processos convencionais, por S. Zurawski (DNAX) ou adquirida (Cetus, Emeryville, CA). rIL-4 humana foi adquirida à Biosource International (Camarillo, CA). hIL-10 recombinante e vIL-10 foram usadas como sobrenadantes para transfecção de células COS7; usaram-se como testemunas os sobrenadantes das transfecções com um cDNA irrelevante ou sem cDNA . Ver Vieira et al (1991) Proc. Nat'1 Acad. Sei., USA 88:1172-1176 e Hsu et al. (1990) Science 250:830-832, os quais são aqui incluídos como referência e outros já referidos. IFNy e TNFa (Endogen, Boston, MA) foram medidos por ELISA. A produção de citocinas na ausência de IL-2 foi abaixo dos limites de sensibilidade -71 - dos ensaios para IFNy e TNFa, os quais foram 0,3 ng/ml e 12 pg/ml, respectivamente.

Linhas celulares. Células de Daudi (linfoma de Burkitt) foram fornecidas pela Schering-Plough (Lyon, France). Células COLO (carcinoma do colon), cedidas pelo Dr. Lewis Lanier, foram cultivadas em RPMI 1640 mais 5% de soro fetal de vitela.

Anticorpos. Os anticorpos monoclonais contra antigénios de superfície celular de leucócitos (CD3, CD4, CD5, CD14, CD16, CD19, CD56) foram adquiridos à Becton-Dickinson (San Jose, CA). Os anticorpos para as experiências de depleção com esferas magnéticas (CD3, CD4, CD5, CD14, CD 19) foram preparados a partir de fluidos ascíticos de ratinhos SCID injectados com a linha celular adequada. Os anticorpos neutralizantes anti-IL-4 e anti-IL-10 estão descritos, e.g., em Chretien et al, (1989) J. Immunol. Methods 117:67-81; e Yssel et al J. Immuno. Methods 72:219-227, que aqui são incluídos como referência.

Preparação e cultura de PBMC. PBMC humanos foram isolados a partir do anel de PBMCs de dadores saudáveis por centrifugação sobre Ficoll-Hypaque e cultivados a 10^/ml ub de rIL-2 (200 unidades/ml) com ou sem outras citocinas em meio de Yssel com 1% de soro humano Ab+. As culturas foram realizadas durante cinco dias em placas de 24 (ou 96) alvéolos e os sobrenadantes foram colhidos. PBMC de diferentes dadores variaram na sua capacidade para produzir IFNy è TNFa quando estimulados por IL-2.

Purificações celulares PBMC foram lavados e incubados em placas de cultura de tecidos durante 40 min a 37°C. As células aderentes foram colhidas raspando com um raspador de borracha. As células não aderentes foram removidas, sedimentadas e aplicadas numa coluna de lã de nylon e incubadas durante 40 min a 37°C. Após eluição da coluna, as células foram sedimentadas e ressuspensas em 30% de Percoll com 10% de FCS/PBS e colocadas sobre 10%FCS/PBS e colocadas sobre uma camada de 40% Percoll. Após centrifugação durante 30 min à temperatura ambiente, os linfócitos granulares grandes na interface foram recuperados e lavados duas vezes. Estas células foram incubadas com anticorpo anti-CD56 (Becton-Dickinson, San Jose, CA) durante 30 min a 4°C, lavadas e depois coradas com anticorpos de cabra anti-ratinho marcados com FITC (Jackson Immunoresearch, Avondale, PA) antes da separação por FACS. As células CD:56+ compreendem cerca de 35-50% das células sujeitas a separação. As células separadas constituíam mais de 99,5% CD56+ quando de nova análise. 9 x 104 células NK purificadas foram misturadas com 3 x 104 células aderentes ou células T num volume final de 100 ml e cultivadas com 11-2 com ou sem outras citocinas.

As células NK purificadas e os monócitos do mesmo dador foram obtidos como se segue: PBMC foram incubados com eritrócitos de carneiro durante a noite; As células que deram rosetas "E+" (CD2+) e as células que não deram rosetas "E-" foram separadas por centrifugação sobre um gradiente de Ficoll-hypaque. As células E+ foram sujeitas ao mesmo processo de purificação como descrito para PBMC (ver atrás) para se obter células NK purificadas. As células E- foram incubadas subsequentemente com mAb anti-CD14 (LeuM3) e anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho marcado com FITC e as células CD14+ foram separadas num FACStar plus. A pureza destas células foi superior a 98%. 105 células NK purificadas foram misturadas com 104 monócitos puros em 100 ml e cultivados sozinhos ou com IL-2 e outras adições como descrito atrás. -73- 4 , , ui m ·ττ>

Como alternativa, células NK e monócitos foram enriquecidos por selecção com esferas magnéticas, depois separados como se segue: PBMC foram primeiro incubados com anticorpos monoclonais anti-CD3, -CD4, -CD5 e anti-CD19 para corar as células T e as células B. Após lavagem duas vezes com PBS, adcionou-se esferas magnéticas revestidas anticorpos de cabra anti-IgG de ratinho (Dynabeades M-450, Dynal Inc., Great Neck, NY) para remover as células T e as células B revestidas com anticorpo através de selecção magnética. As células resultantes enriquecidas em células NK e os monócitos foram corados com anti-CD56-PE e anti-CD14-FITC e isolaram-se as células CD56+ e CD14+ no separador de células. A pureza das duas populações de células separadas foi superior a 98,5%.

Ensaio de citotoxicidade. PBMCs foram incubados com 200 U/ml de IL-2 a 106 células/ml durante 3 dias em meio de Yssel's contendo 1% de soro humano AB+. As culturas foram realizadas em alvéolos de 1 ml de uma placa de 24 alvéolos Linbro (Flow Laboratories, McLean, VA). Após o período de cultura, as células foram colhidas, lavadas duas vezes e usadas como células efectoras num ensaio de libertação de 51Cr. Ver Spits et al. (1988) J. Immunol. 141:29- , que aqui é incluído como referência. 1000 células alvo marcadas com 51 Cr (COLO ou Daudi) foram misturadas com números variáveis de células efectoras em meio de Iscove contendo 0,25% BSA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em placas de 96 alvéolos em forma de U. As placas foram centrifúgadas durante 5 min a 50 xg antes da incubação durante 4 horas a 37°C numa atmosfera húmida de 5% de C02. As amostras foram colhidas e contadas num contador gama (LAB, Bromma, Sweden). hIL-10, vIL-10 e hIL-4 recombinantes foram testadas quanto aos seus efeitos na síntese de IFNy e TNFa e na actividade LAK induzida por IL-2 em células mononucleadas do sangue periférico (PBMC). PBMC foram cultivados em 200 U/ml de rIL-2 com rIL-4 (200 U/ml) ou sobrenadantes de COS7 contendo hIL-10, vIL-10 ou sem citocinas (testemunha) durante 5 dias, após o que a síntese de citocinas foi medida. A síntese de IFNy e TNFa induzida por 11-2 nas culturas contendo hIL-10, vIL-10 ou IL-4 foi substancialmente inibida (Figura 2A, 2B). O resultado obtido com IL-4 confirma as observações de que IL-4 inibe a expressão de mRNA e proteína de IFNy induzida por IL-2. A inibição da síntese de citocinas é dependente da dose de IL-4 e IL-10 e é revertida bloqueando com anticorpos monoclonais anti-hIL-4 e anti-hIL-10, respectiva-mente, mas não por imunoglobulinas do controlo do isotipo (Figura 2C, 2D). A actividade LAK foi também avaliada contra a linha celular Daudi de linfoma de Burkitt e contra a linha COLO de carcinoma do colon, as quais são eficazmente mortas pelas células LAK, mas não por células NK frescas. A actividade LAK induzida por IL-2 contra células Daudi e COLO foi inibida apenas em culturas contendo IL-4 e ficou inalterada, ou mesmo ligeiramente aumentada, nas culturas com hILlO e vIL-10 (Figura 3A). A actividade LAK induzida por IL-2 é mediada principalmente pelas células NK CD56(Leul9)+. A actividade LAK contra células COLO não foi inibida por IL-10 indicando que a citotoxicidade mediada por células NK activadas não foi afectada por esta citocina. No entanto, uma vez que as células T CD3+ gd+ podem matar as células Daudi, é possível que a citotoxicidade de células T gd+ induzida por IL-2 e estimulada por IL-10 contra as células Daudi bloqueie simultaneamente a actividade NK induzida por IL-2 contra estas células alvo.

Para determinar o fenótipo das células LAK anti-Daudi induzidas em PBMC cultivados com IL-2 e hIL-10, as populações CD56+ e CD56- foram separadas por FACS e testadas relativamente à citotoxicidade contra células

Daudi. A Figura 3B mostra que, como acontece com IL-2, observou-se actividade LAK significativa na população CD56+. Assim, enquanto IL-4 e IL-10 inibem a síntese IFNy e TNFa induzida por IL-2, apenas IL-4 inibe a citotoxicidade induzida por IL-2 em células NK activadas presentes em PBMCs.

Exemplo A2. IL-10 não inibe a síntese de IFNy ou a proliferação de células NK purificadas estimuladas por IL-2

Ensaio de proliferação. As células foram distribuídas a 10$ células/alvéolo em placas de fundo redondo de 96 alvéolos e incubadas na presença ou ausência de citocinas durante quatro dias num volume final de 200 μΐ /alvéolo. Em seguida, adicionou-se a cada alvéolo 1 mCi de 3H-timidina em 10 μ 1. Após seis horas as culturas foram colhidas e analisada a radioactividade incorporada por contagem de cintilação. A maioria da síntese de IFNy induzida por IL-2 em PBMC está descrita como derivada das células NK em vez das células T. Assim, o efeito de hIL-10, vIL-10 e IL-4 na síntese de IFNy induzida por IL-2 foi testada em células NK purificadas por FACS (pureza >99,5%). IL-4 inibiu a síntese de IFNy induzida por IL-2 nestas células; pelo contrário, nem hIL-10 nem vIL-10 suprimem a síntese de IFNy em células NK recentemente purificadas (Figura 4A). Ainda, IL-4 inibiu significativamente a proliferação induzida por IL-2 em PBMC ou células NK purificadas,enquanto IL-10 não tem efeito na proliferação mediada por IL-2 (Figura 4B).

Ao contrário de IL-4, IL-10 não afecta a célula NK directamente, mas inibe a capacidade dos monócitos para proporcionarem um sinal co-estiimulador. Esta conclusão é apoiada mais claramente pelos efeitos de IL-10 na produção de IFNy induzida por IL-2. Conforme referido atrás, preparações de -76- células acessórias não produzem IFNy (Figura 4A, 5A & 5B), a adição de células aderentes a plástico e de células CD14+ purificadas a células NK purificadas resultou num grande aumento da síntese de IFNy. A ausência de um efeito directo de IL-10 nas células NK (Figura 4A & 4B), sugere que 11-10 iniba a produção de IFNy induzida por IL-2 ao actuar sobre os monócitos. De forma semelhante, a inibição da síntese de citocinas em células T por IL-10 é mediada por células acessórias monócito /macrófago.

Exemplo A3. Os monócitos medeiam a inibição por IL-10 da síntese de IFNy e TNFa estimulada por IL-2 em células NK. O facto da síntese de IFNy ser inibida por IL-10 em culturas de PBMC mas não em células NK puras sugeriu que este efeito de IL-10 fosse mediado por células acessórias. Para estudar a natureza destas células acessórias, células NK foram purificadas separando as células CD56+ da fracção celular de baixa densidade obtida por centrifugação em gradiente de Percoll, ou a partir de PBMCs livres de células T, células B e monócitos, e foram misturadas com células aderentes a plástico ou com a população de células de alta densidade (98% células T) do gradiente de Percoll. A adição de células aderentes às células NK aumentou fortemente a produção de IFNy induzida por IL-2 em células NK; este efeito estimulador das células aderentes foi bloqueado por iL-10 (Figura 5A). A própria população de células aderentes não produziu níveis detectáveis de IFNy como resposta a 11-2. Pelo contrário, a fracção contendo células T não teve efeito na produção de IFNy induzida por IL-2 em células NK e não mediou a inibição da produção de IFNy por IL-10 (Figura 5A).

As células aderentes ao plástico estão enriquecidas em monócitos, mas podem conter outras populações celulares. Para confirmar que os monócitos aumentam a produção de IFNy induzida por IL-2 e medeiam a sua inibição por IL-10, as células NK e os monócitos CD 14+ foram purificados por separação e foram cultivados na presença de IL-2 e IL-10. A Figura 5B mostra que a adição de monócitos purificados às células NK aumentou a produção de IFNy induzida por IL-2 e que IL-10 inibiu este aumento.

Observaram-se resultados qualitativamente semelhantes para a síntese de TNFa. A Figura 5C mostra que, conforme esperado, as células NK produzem níveis detectáveis de TNFa como resposta a IL-2. As células CD14+ produzem TNFa independentemente de IL-2. IL-10 inibe a produção de TNFa por monócitos na presença (Figura 5C) e na ausência de IL-2. Pelo contrário, a síntese de TNFa em células NK não foi inibida por IL-10. A estimulação de células NK e CD14+ em conjunto resultou num nível de produção de TNFa substancialmente superior ao observado para qualquer uma das células sozinha e este aumento foi bloqueado por IL-10.

Observou-se que os monócitos e os seus produtos aumentam substancialmente a produção de IFNy nas células NK não activadas (Figura 5B). Várias monocinas, tais como IL-1 e TNFa, têm sido implicadas na co-estimulação da síntese de IFNy em células NK humanas e de ratinho em várias condições. O facto de IL-10 inibir a síntese de monocinas, tais como IL-1, IL-6 e TNFa por monócitos/macrófagos estimulados por LPS ou por IFNy sugere que os efeitos de IL-10 aqui descritos fossem devidos à inibição da produção de moléculas co-estimuladoras por IL-10 em células acessórias. Observou-se que os sobrenadantes das células aderentes (contendo principalmente monócitos) aumentam a produção de IFNy em células NK purificadas estimuladas com IL-2, enquanto os sobrenadantes das células aderentes cultivadas na presença de IL-10 não possuem esta capacidade, mesmo quando sem IL-10. Não é claro se esta actividade do sobrenadante é responsável por todo o efeito co-estimulador das células acessórias. Observou-se que IL-Ια e IL-Ιβ, mas não IL-6 ou TNFa, co- estimulam a produção de IFNy induzida por IL-2 em células NK; no entanto, a adição de até 1000 U/ml de IL-1 não reverte o efeito inibidor de IL-10 na síntese de IFNy em PBMC não fraccionados. Assim, existe a possibilidade de uma ou mais actividades adicionais funcionarem neste sistema, ou que IL-10 induza a síntese de um factor secundárioque inibe a síntese de citocinas em células NK.

Estudo B. IL-10 inibe a síntese de citocinas em monócítos humanos: um papel auto-regulador de IL-10 produzida por monócitos.

Os resultados apresentados nesta secção foram publicados após a sua data de prioridade em de Waal Malefy et al. (1990) J. Exptl. Med. 174:1209-1220, que é aqui inclui do na sua totalidade como referência.

Sumário

Esta secção demonstra que os monócitos humanos activados por LPS são capazes de produzir níveis elevados de interleucina-10 (IL-10), anterior-mente designado Factor Inibidor da Síntese de Citocinas (CSIF), de forma dependente da dose. IL-10 foi detectável 7 hrs após activação dos monócitos e níveis máximos de produção de IL-10 foram observados após 24 - 48 horas. Estas cinéticas indicaram que a produção de 11-10 em monócitos humanos foi relativamente tardia comparado com a produção de IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa e G-CSF, os quais foram todos secretados em níveis elevados 4- 8- horas após activação. A produção de IL-10 em monócitos activados por LPS foi, à semelhança de IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF e G-CSF, inibida por IL-4. Ainda, IL-10 adicionada a monócitos, activados por IFNy, LPS ou combinações de inibiu fortemente a produção de LPS e IFNy quando do estabelecimento da cultura, IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF e G-CSF a nível da transcrição. IL-10 virai, que possui actividades biológicas em células humanas, também inibiu a produção de TNFa e de GM-CSF em monócitos após activação com LPS. A activação de monócitos por LPS na presença de MAbs neutralizantes anti-IL-10 resultou na produção de quantidades superiores de citocinas relativamente ao tratamento com LPS sozinho, indicando que IL-10 produzida endogenamente inibiu a produção de IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF e G-CSF. Ainda, IL-10 tinha efeitos auto-reguladores uma vez que inibiu fortemente a síntese de mRNA de IL-10 em monócitos activados com LPS. Ainda, IL-10 produzida endogenamente é responsável pela redução da expressão de MHC classe II após activação dos monócitos com LPS. Considerados em conjunto estes resultados indicam que IL-10 possui importantes efeitos reguladores nas resposta imunológicas e inflamatórias devido à sua capacidade para regular negativamente a expressão de MHC classe II e para inibir a prodlução de citocinas pro-inflamatórias em monócitos. Interleucina-10 de ratinho foi recentemente identificada e o seu gene clonado com base na sua actividade Inibidora da Síntese de Citocinas (CSIF). Nos sistemas de ratinho, IL-10 foi produzido pela subsérie CD4+ Th2 e inibe a produção de citocinas, particularmente IFNy, em clones Thl. A inibição da produção de citocinas por IL-10 foi observada apenas quando os macrófagos, mas não as células B, foram usadas como células apresentadoras de antigénio (APC). Para além desta actividade de CSIF, IL-10 é pleiotrópica e actua em diferentes tipos celulares, incluindo timócitos, células T citotóxicas, mastócitos, células B e macrófagos. 11-10 humana também apresenta actividade CSIF. A produção de IFNy e de GM-CSF em PBMC activados por PHA ou por mAbs anti-CD3 foi fortemente inibida por IL-10 e esta inibição ocorreu ao nível da transcrição. Tanto IL-10 humana como de ratinho possuem uma extensa homologia de sequências com uma grelha de leitura aberta anteriormente não caracterizada do genoma do vírus de Epstein Barr, BCRF-1. A expressão desta grelhade leitura aberta deu uma proteína activa, designada IL-10 virai (v-IL-10), que partilha a maior parte das suas características com a IL-10 humana e de ratinho, incluindo a actividade de CSIF em células T de ratinho e humanas. IL-10 humana e v-IL-10 são capazes de inibir as respostas proliferativas de células específicas de antigénio ao reduzirem a capacidade apresentadora de antigénio de monócitos humanos através da regulação negativa das moléculas MHC classe II. Os resultados aqui apresentados mostram que os monócitos humanos são capazes de produzir níveis elevados de IL-10 após activação com LPS e quê esta produção é relativamente tardia comparado com a de outras monocinas. Ainda, é aqui descrito que IL-10 inibe fortemente a produção das citocinas proinflamatórias, e.g., IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa e os factores de crescimento hematopoiéticos, GM-CSF e G-CSF, em monócitos activados por LPS, IFNy ou LPS e IFNy. IL-10 produzida endogenamente não só tem efeitos auto-reguladores sobre a produção de IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNF a , GM-CSF e G-CSF pelos monócitos, como também regula negativamete a sua própria rodução e a expressão de MHC classe II em monócitos de forma auto-reguladora. Estes resultados indicam que IL-10 possui importantes efeitos auto-reguladores nas respostas imunológica e inflametória.

Exemplo Bl. IL-10 é produzido em monócitos humanos.

Isolamento e cultura de monócitos humanos. Monócitos do sangue periférico humano foram isolados a partir de 500 ml de sangue de dadores normais. As células mononucleadas foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade num separador de componentes do sangue, seguido de fraccionamento em linfócitos e monócitos por elutriação por centrifugação, a preparação de monócitos era >95% pura, conforme avaliado por coloração não específica com estearase e continha mais de 98% de células viáveis. Os monócitos forma cultivados em meio de Yssel contendo albumina sérica humana (HSA) suplementada com 1% de soro humano AB+ obtido de um conjunto de soros inactivados pelo calor. Este meio de cultura não tinha endotoxinas conforme determinado pelo ensaio de lisado de amebócitos de Limulus (<0,2 ng/ml de endotoxina). Os monócitos foram cultivados numa concentração de 4 x 106 células/ml em sacos de teflon (Jansen MNL, St Niklaas, Belgium), o que evitou a adesão destas células. Após cultura durante o tempo indicado, os monócitos foram colhidos e analisados relativamente à expressão na superfície celular por imunofluorescência indirecta ou analisados relativamente à expressão dos genes das linfocinas por análise Northern e PCR. Ainda, os sobrenadantes das culturas de monócitos foram colhidos para determinação da produção de IL-1 a, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF e G-CSF após activação destas células. A viabilidade das células após cultura excedeu sempre 95% conforme determinado por exclusão com azul tripano.

Reagentes. IL-10 humana recombinante e v-IL-10 foram expressos em E.coli como proteínas de fusão com a glutationa-S-transferase e digeridas com trombina para remover a parte N-terminal da fusão, resultando em IL-10 activa humana e virai. rIL-4 humana purificada e r-IFNy foram fornecidos pela Schering-Plough Research (Bloomfield, NJ). LPS (E. coli 0127:B8) foi adquirida aos laboratórios Difco (Detroit, MI). O mAb neutralizante anti-ILlO foi induzido contra v-IL-10 e neutralizou eficazmente IL-10 humana e virai.

Determinações de linfocinas. A produção de IL-Ια e TNFa em monócitos foi medida por ELISA específica de linfocinas adquirida à Endogen (Bosto, MA). O limite de detecção inferior destes ELIS As foi de 50 pg/ml e 10 pg/ml respectivamente. A produção de IL-Ιβ foi determinada por ELISA específica de linfocinas adquirida à Cistron (Pine Brook, NJ). A sensibilidade deste ELISA foi de 20 pg/ml. Os níveis de IL-6 foram determinados por ELISA específica de linfocinas adquirida à Genzime (Boston, mA). A sensibilidade deste ensaio foi de 0,313 ng/ml. ELISAs específicas para IL-8 e G-CSF foram adquiridas à R&D Systems (Minneapolis, MN) e usadas para quantificar a produção de IL-8 e G-CSF. A sensibilidade destes ELISAs foi de 4,7 pg/ml e 7,2 pg/ml, respectivamente. A produção de GM-CSF foi determinada por ELISA específico de citocinas. A sensibilidade deste ELISA foi de 50 pg/ml. A produção de IL-10 foi determinada por um ELISA específico em que um mAb anti-IL-10 (JES 9D7) foi usado como anticorpo de revestimento e um outro mAb anti-IL-10 (JES3-12G8) foi usado como anticorpo de detecção. A sensibilidade deste ELISA foi de 50 pg/ml. A IL-10 é produzida por clones de células T humanas activadas, células T e B activadas do sangue periférico, linhas celulares de células B transformadas por EBV e monócitos. Monócitos altamente purificados, isolados por elutriação por centrifugação, produziram IL-10 após activação por LPS. Ainda, demonstrou-se que estes monócitos humanos foram capazes de produzir níveis elevados de IL-6, TNFa e GM-CSF (Figura 6). As cinéticas dè produção de citocinas em monócitos activados por LPS indicou que a produção de IL-10 por monócitos activados por LPS foi relativamente tardia. Foi inicialmente detectada em sobrenadantes colhidos às 7,5 horas, mas a produção máxima foi observada 20-48 horas após activação. Pelo contrário, TNFa e IL-6 foram produzidos rapidamente quando da activação e atingiram níveis máximos de -83- produção às 3,5 e 7,5 horas após activação respectivamente (Figura 6). No entanto, a produção de GM-CSF foi também inicialmente detectada às 7,5 horas após activação dos monócitos por LPS, mas neste caso os níveis de produção máximos foram atingidos às 20 horas. Os estudos de dose-resposta indicaram que a activação dos monócitos por LPS a 10 ng/ml já tinha resultado em níveis significativos de produção de IL-10, enquanto que a síntese máxima de IL-10 foi observada em concentrações de LPS de 1 pg/ml. (Figura 7).

Exemplo B2. IL-10 inibe a produção de citocinas em monócitos humanos

Demonstrou-se que IL-10 inibe a produção de IFNy e GM-CSF em PBMCs activados. Para determinar os efeitos de IL-10 na produção de citocinaspor monócitos, monócitos altamente purificados foram activados durante 24 horas por LPS na ausência ou presença de iL-10. Ainda, os monócitos foram activados com LPS durante 24 horas na presença de IL-4 (100 U/ml) ou mAb neutralizante 19F1 anti-IL-10, o qual foi induzido contra v-IL-10 mas neutraliza eficazmente IL-10 humana e v-IL-10. A produção de citocinas foi determinada nos sobrenadantes destas culturas, colhidas 24 horas após activação, por ELISAs específicos das citocinas. Como se mostra na Tabela Bl, os monócitos que foram incubados em meio sozinho a 37°C não produziram IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-10, TNFa, GM-CSF e G-CSF. Nestas condições, foram sintetizados apenas níveis significativos de IL-8. A activação de monócitos com LPS (1 pg/ml) resultou na produção de níveis elevados de IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, IL-10, TNFa, GM-CSF e G-CSF. É interessante que IL-10 inibiu a produção de IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF e G-CSF em vários graus (Tabela Bl). Os efeitos inibidores mais fortes de IL-10 foram observados na produção de IL-la, TNFa, GM-CSF e G-CSF os quais foram bloqueados em 80-100%. A inibição de IL-Ιβ e IL-6 foi menos pronunciada, enquanto a síntese de IL-8 foi apenas ligeiramente afectada por IL-10.

Efeitos de IL-10 exógena, IL-10 endógena e IL-4 na produção de citocinas em monócitos humanos a I>-1

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Exemplo B3. IL-10 também inibe a produção de citocinas em monócitos activados por IFNy IL-10 também inibiu a produção de citocinas em monócitos activados por IFNy, ou combinações de IFNy e LPS. A Figura 8 mostra que IFNy em concentração óptima de 100 U/ml de um modo geral foi um indutor menos potente da secreção de citocinas do que LPS nas concentração óptima de 1 pg/ml. Ainda, demonstrou-se que os efeitos de combinações de IFNy e LPS na produção de citocinas em monócitos geralmente são aditivos. Os efeitos inibidores mais fortes de IL-10 foram observados sobre a produção de IL-Ια, TNFa e GM-CSF. A secreção de TNFa e GM-CSF foi suprimida em mais de 90%, mesmo após activação dos monócitos por concentrações óptimas de LPS e IFNy. Se bem que tenham sido observados efeitos inibidores consideráveis na secreção de IL-Ιβ e IL-6 em condições óptimas de estimulação, a sua inibição foi mais pronuciada quando os monócitos foram estimulados por concentrações subóptimas de LPS, quer na ausência quer na presença de concentrações óptimas de IFNy.

Exemplo B4. IL-10 virai inibe a produção de citocinas em monocitos. IL-10 virai e IL-10 humana têm efeitos semelhantes nas células humanas. A Figura 9 mostra que tanto IL-10 como v-IL-10 inibiram de forma semelhante a produção de TNFa e GM-CSF em monócitos. IL-10 e v-IL-10, adicionadas em concentrações de 100 U/ml, têm efeitos inibidores significativos na produção de TNFa e GM-CSF em monócitos após activação por LPS (1 μ g/ml). Estes efeitos inibidores de IL-10 e v-IL-10 sobre a secreção de TNFa e GM-CSF foram revertidos quando as incubações foram realizadas na presença de mAb 19F1 (Figura 9), demonstrando a especificidade dos efeitos inibidores de v-IL-10. De facto, a activação de monócitos por LPS na presença de IL-10 ou v- IL-10 e o mAb neutralizante anti-IL-10 resultaram mesmo num aumento da produção de TNFa e GM-CSF, indicando que IL-10 produzida endogenamente suprime a produção destas citocinas.

Os efeitos inibidores de IL-10 produzida endogenamente na produção de citocinas em monócitos foram ainda avaliados quantificando os níveis de citocinas produzidos por monócitos activados por LPS na presença de mAb neutralizante anti-IL-10. Na Tabela BI mostra-se que o tratamento de monócitos com LPS mais anti-IL-10 resultou em níveis de produção de citocinas superiores comparado com a activação por LPS sozinho, indicando que IL-10 produzida endogenamente para além dos seus efeitos inibidores na produção de TNFa e GM-CSF, bloqueou a produção de IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 e G-CSF. Os efeitos inibidores mais significativos foram encontrados na produção de IL-la, GM-CSF e TNFa, enquanto que os efeitos inibidores sobre a expressão de IL-Ιβ, IL-6, IL-8 e G-CSF foram consideráveis mas menos pronunciados. Considerados em conjunto estes resultados indicam que IL-10 exógena e endógena inibem a produção de IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8, TNFa, GM-CSF e G-CSF em monócitos activados com LPS.

Exemplo B5. IL-4 inibe a produção de IL-10 em monócitos activados. 11-4 inibe a produção de IL-Ιβ, IL-6 e TNFa em monócitos activados com LPS. Para determinar se IL-4 inibe também a produção de IL-10, os monócitos foram activados com LPS durante 24 horas e medida a secreção de IL-10. A Tabela BI mostra que IL-4 inibiu fortemente a produção de IL-10 em monócitos activados com LPS. Ainda, IL-4, para além dos seus efeitos inibidores sobre a secreção de IL-Ιβ, IL-6 e TNFa, bloqueia eficazmente a produção de GM-CSF e G-CSF. No entanto, conforme observado para IL-10, a produção de IL-8 foi apenas ligeiramente afectada por IL-4. Colectivamente estes resultados indicam que 11-4 e IL-10 possuem efeitos inibidores comparáveis na produção de citoeinas em monócitos activados.

Exemplo B6. A inibição da produção de monocinas ocorre ao nível da transcrição.

Sondas. As sondas que se seguem foram usadas para análise Northern: fragmento Smal de 600 pb (nt 1299-1899) de pCD-hTGFP, ver Yokota et al. (1987) em Lvmphokines vol. 13, Goeddel e Webb (eds.) Academic Press, New York; fragmento PstI de 1200 pb de pAL (β-actina), ver Vieira et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:1172-1176; fragmento BamHI-Xbal de 567 pb (nt 1-567) de pCD-hIL-6, ver Yokota et al. (1987); fragmento HindIII de 268pb (nt 29-297) de SP64-3-10c (IL-8), ver Schmidt et al. (1987) J. Immunol. 139:250 -; fragmento BglII- HindIII de 760 pb (nt 159-919) de pCD-SRa-hIL-10, ver Vieira et al. (1991). Os oligonucleótidos que se seguem foram usados na análise Southern dos produtos de PCR: IL-Ια: 5'-CATGGGTGCTTATAAGTCATC-3' (nt 500-521), ver March et al. (1985) Nature 315: 641- ; IL-Ιβ: 5'CGATCACTGAACTGCACGCTCCGGG-3' (nt 444-469), ver March et al. (1985) Nature: IL-6: 5'-GAGGTATACCTAGAGTACCTC-3' (nt 510-531), ver Hirano et al. (1986) Nature 324:73- ; IL-8: 5 'T AA AG AC AT ACTCC AAACCTT -3' (nt 200-221), ver Schmid et al. (1987) J. Immunol.; IL-10: 5'-CAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAA AGCCATGAGTGAGTTTGACATC-3' (nt 429-498), Vieira et al. (1991) Proc. Natl Acad. Sei. USA: TNFa: 5'-GGCGTGGAGCTGAGAGATAAC-3' (nt 500-521), ver Pennica et al, (1984) Nature 312:724- ; GM-CSF: 5'- CCGGCGTCTCCTGAACCT-3' (nt 150-168), ver Lee et al. (1985) Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 82: 4360-4364; actina: 5’-CTGAACCCTAAGGCCAACCGTG-3' (nt 250-272), ver Alonso et al. (1986) J. Mol. Evol. 23: 11- ; e G-CSF: 5'- -88- GCCCTGG-AAGGGATCTCCCCC-3' (nt 400-421), ver Nagata et al. (1986) Nature 319:415- . As sequências nucleotídicas estão também disponíveis no GENBANK, c/o Intelligenetics, Inc., Menlo Park, CA, e a base de dados BCCG e Universidade de Wisconsin Biotechnology Centre, Madison, Wisconsin. A biosíntese de nucleótidos sintéticos está descrita em Gait (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Praticai Approach IRL Press, Oxford, que aqui é incluído como referência.

Isolamento de mRNA e análise Northern. Isolou-se RNA total a partir de 20 x 106 monócitos seguindo o processo do tiocianato de gaunidina-CsCl. Para a análise Northern, 10 pg de RNA total por amostra foi separado de acordo com o tamanho em géis de 1% de agarose contendo 6,6% de formaldeído, transferido para membranas de nylon Nytran (Schleicher & Schuell, Keene, NH) e hibridadas com sondas, marcadas com elevada actividade específica (>108 cpm/mg). Os filtros foram hibridados, lavados em condições restringentes e revelados.

Análise por PCR. Um micrograma de RNA total foi sujeito a transcrição inversa usando oligo (dT) como escorva (Boehringer Mannheim, Indiana-polis, IN) e transcriptase inversa de AMV (Boehringer Mannheim) em 20 μΐ de reacção. Dois microlitros do produto da transcrição inversa (equivalente a 100 ng de RNA total) foi usado directamente para cada reacção de amplificação. As condições para PCR foram as seguintes: numa reacção de 50 μΐ, 25 nmoles de cada escorva, 125 μΜ para cada dGTP, dATP, dCTP e dTTP (Pharmacia, Uppsala, Sweden), KC1 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, 1 mg/ml de gelatina, 100 pg/ml de BSA não acetilada e 1 unidade de DNA-polimerase Vent (New England Biolabs, Beverly, MA). As escorvas usadas foram as seguintes: IL-Ια escorva directa 5'-CATCGCCAATGACTCAGAGGAAG-3' (nt 302-325); IL-Ια escorva inversa 5'-TGCCAAFCACACCCAGTAGTCTTGCTT-3' (nt 770- 743); IL-Ιβ escorva directa 5'-CCAGCTACGAATCTCGGACCACC-3' (nt 230-253); IL-Ιβ escorva inversa 5'-TTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGAA-GTCAGT-3' (nt 896-863); IL-6 escorva directa 5'-ATGAACTCCTTCTCCA-CAAGC-3' (nt 1-21); IL-6 escorva inversa 5'-CTACATTTGCCGAAGAGC-CCTCAGGCTGGACTG-3' ( nt 810-777); IL-8 escorva directa 5-ATGACTT-CCAAGCTGGCCGTG-3' (nt 1-21); 1L-8 escorva inversa 5-TTATGAATTCTC-AGCCCTCTTCAAAAA-CTTCTC-3’ (nt 302-269); IL-10 escorva directa 5'-ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA-3' (nt 323-349); IL-10 escorva inversa 5'-TCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA-3' (nt 674-648); TNFa escorva directa 5’-AGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGAC-3' (nt 310-333); TNFa escorva inversa 5'-TGAGTCGGTCACCCTTCTCCAG-3' (nt 782-760); GM-CSF escorva directa 5'-GCATCTCTGCACCCGCCC-GCTCGCC-3’ (nt 76-100); GM-CSF escorva inversa 5'-CCTGCTTGTACAGCTCCAGGCGGGT-3' (nt 276-250); G-CSF escorva directa 5'-GAGTGTGCCACCTACAAGCTGTGCC-3' (nt 233-258); G-CSF escorva inversa 5-CCTGGGTGGGCTGCAGGGCAGGGGC-3' (nt 533-508) β-actina escorva directa 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3' (nt 1-20); β-actina escorva inversa 5-GTCCTTAA-TGTCACGCACGATTTC-3' (nt 548-530). As reacções foram incubadas num termociclador de DNA Perkin-Elmer/Cetus durante 20 ciclos (desnaturação 30 s 94°C, emparelhamento 30 s 55°C, extensão 60s 72°C). As reacções foram extraídas com CHC13 e 40 μΐ por amostra foi aplicado em géis de 1% de agarose em tampão TAE. Os produtos foram visualizados por coloração com brometo de etídio. Subsequentemente, os géis foram desnaturados em NaOH 0,5M, NaCl 1,5M, neutralizados em acetato de amónio 10M e transferidos para membranas de nylon Nytran. As membranas foram pré-hibridadas em SSC 6x, 1% SDS, solução de Denhardt 10X (0,2% Ficoll, 0,2% polivinilpirrolidona, 0,% BSA, fracção pentax V) e 200 μg/ml de TRNA de E. coli (Boehringer, Mannheim, FRG) durante 4 horas a 55°C. Os oligonucleótidos sonda (200 ng), específicos para uma sequência interna relativamente às escorvas usadas na amplificação, foram marcados no extremo 5' com cinase de oligonucleótidos de T4 (New England Biolabs) e γ-32Ρ-ΑΤΡ (Amersham, Arlington Heigths, IL). As sondas foram separadas dos nucleótidos não incorporados por passagem através de uma coluna Nick (Pharmacia, Uppsala, Sweden) e adicionados à mistura de hibridação. Após hibridação durante 12 horas a 55°C, os filtros foram lavados em SSC Ο,ΙΧ (IX SSC: NaCl 150 mM, Na-citrato 15 mM pH = 7,0) e 1% SDS à temperatura e exposto a filmes Kodak XAR-5 durante 1-2 horas.

Para determinar a que nível IL-10 inibiu a produção de citocinas em monócitos, análises comparativas de PCR foram realizadas em RNA isolado a partir de monócitos, activados por LPS na ausência ou presença de IL-10, IL-4, ou mAb neutralizante anti-IL-10 durante 24 horas. As medições de citocinas desta experiência estão apresentadas na Tabela Bl. O mRNA isolado a partir destas amostras foi sujeito a transcrição inversa para se obter cDNA e subsequentemente amplificado com escorvas específicas das citocinas. Usou-se um número relativamente pequeno de ciclos na amplificação para assegurar que a quantidade do DNA amplificado foi proporcional ao número de ciclos e está correlacionado com a quantidade de mRNA específico na amostra original. A Figura 10 mostra que nestas condições foram amplificadas quantidades equivalentes de cDNA específico de β-actina. Os monócitos incubados a 4°C em meio sozinho durante 24 horas expressaram níveis muito baixos de mRNA de IL-8. A incubação destas células a 37°C resultou num aumento da expressão do mRNA de IL-8, mas não induziu a expressão do mRNA de IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-10, TNFa, GM-CSF ou G-CSF. A activação por LPS resultou numa expressão forte de IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 e G-CSF, enquanto que o mRNA de TNFa e GM-CSF foram moderadamente induzidos. Ainda, a Figura 10 mostra que a expressão de IL-la, IL-6, TNFa, GM-CSF e G-CSF foram fortemente inibidos por IL-10 e IL-4 ao nível do mRNA, enquanto que IL-Ιβ e IL-8 foram apenas ligeiramente afectados por IL-10. A activação de monócitos por LPS na preseça do mAb anti- IL-10 resultou num aumento moderado na expressão do mRNA de IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 e G-CSF e um forte aumento na síntese do mRNA de TNFa e GM-CSF. Os níveis de expressão de mRNA específico de citocinas e a sua modulação por IL-10 ou IL-4 exógena e endógena estão correlacionados com a secreção das proteínas correspondentes como se mostra na Tabela BI indicando que IL-10 e IL-4 inibiram a expressão de citocinas em monócitos activados com LPS ao nível da transcrição.

Exemplo B7. IL-10 regula a expressão de mRNA de IL-10 mas não a de mRNA de TGFB em monócitos activados.

Tendo demonstrado que monócitos humanos produziram IL-10 relativamente tarde após activação com LPS, determinou-se se IL-10 poderá afectar a síntese de mRNA de IL-10 endógena. Os monócitos humanos foram activados por LPS na presença ou ausência de IL-10 durante 7 horas e a expressão de mRNA foi analisada por Northern. A Figura 11 mostra que o mRNA de IL-10 foi detectado 7 horas após activação por LPS e que IL-10 não tem efeito inibidor sobre IL-10 ou tem um efeito inibidor mínimo na expressão de mRNA de IL-10 nesta altura. Pelo contrário, a expressão de mRNA de IL-6 e de IL-8 foi fortemente inibida por IL-10. No etanto, numa outra série de experiências em que os monócitos foram activados durante 24 horas por LPS, IL-10 reduziu fortemente a expressão de mRNA de IL-10 como se mostra por análise Northern na Figura 12. Ainda, a Figura 12 mostra que a activação de monócitos com LPS na presença de um mAb neutralizante anti-v-IL-10 resultou numa regulação positiva da expressão do mRNA de IL-10 às 24 horas. Estes resultados foram confirmados por análise por PCR com escorvas específicas de IL-10 uma vez que o RNA usado nesta última experiência foi também usado para as análises por PCR apresentadas na Figura 10. Mostra-se na Figura 12B que as diferenças quantitativas observadas na expressão de mRNA de IL-10 por análise Northern está correlacionado com a dose observada por análise comparativa por PCR. Ainda, uma análise mais sensível por PCR permitiu detectar níveis baixos de nnRNA de IL-10 que foram induzidos 24 horas após a cultura de monócitos em meio sozinho a 37°C. Estes resultados indicam que IL-10 tem efeitos auto-reguladores na síntese de mRNA de IL-10 e, se os níveis de mRNA refletem com precisão a produção de proteína IL-10, provavelmente também na produção de IL-10 em monócitos humanos. No entanto, a regulação negativa de IL-10 ocorreu muito tarde no processo de activação. mRNA de TGFP, que é expresso constitutivamente em monócitos não activados isolados de fresco, não foi aumentado pela activação por LPS durante 7 ou 24 horas (Figuras 11 2 12). Ainda, as Figuras 11 e 12 mostram que os níveis de mRNA de TGFp não foram afectados quando as activações foram realizadas na presença de IL-4, IL-10 ou mAbs neutralizantes anti-IL-10.

Exemplo B8. IL-10 tem efeitos auto-reguladores na expressão de MHC classe II em monócitos.

Análise por imunofluorescência. As células (105) foram incubadas em placas de microtitulação com fundo em V (Flow Laboratories, McLean, VA) com 10 μΐ de mAb purificado (1 mg/ml) durante 30 minutos a 4°C. Após duas lavagens com PBS contendo azida de sódio 0,02mM e 1% BSA (Sigma, St Louis, MO), as células foram incubadas com uma diluição a 1/40 de fragmentos F(ab')2 de anticorpos de cabra anti-ratinho marcados com FITC (TAGO, Inc. Burlingame, CA) durante 30 min a 4°C. Após três lavagens adicionais, as amostras de células marcadas foram analisadas por microfluorometria de fluxo num FCScan (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Os mAbs PdV5.2 (HLA-DR/DP/DQ), Q5/13 HLA-DR/DP e L243 (HLA-DR) anti-MHC ClasselI foram anteriormente descrito, ver Koning et al., (1984) Hum. Immunol. 9:221-; Quaranta et al. (1980) J. Immunol. 125:1421-1425; e Lampson et al. (1980) J. Immunol 125:293-. IL-10 regula negativamente a expressão de moléculas MHC Classe II na superfície celular de monócitos humanos. Mostrou-se que IL-10 regula negativamente a expressão constitutiva de MHC classe II induzida por IL-4 ou IFNy. Uma vez que os monócitos produzem níveis elevados de IL-10 após activação por LPS, estudou-se se IL-10 endógeno inibe a expressão de MHC classe II em monócitos activados por LPS. Os monócitos foram activados por várias concentrações de LPS na presneça ou na ausência de mAb neutralizante anti-IL-10. A Figura 13 mostra que a activação de monócitos com LPS reduziu a expressão constitutiva de HLA-DR/DP nestas células numa forma dependente da dose. No entanto, na presença do mAb neutralizante anti-IL-10 19F1 observou-se uma indução forte da expressão de HLA-DR/DP. Resultados idênticos foram obtidos com vários anticorpos específicos para HLA-DR ou HLA-DR/DP. Estes resultados indicam que a IL-10 produzida endogenamente, de forma auto-reguladora, é responsável pela regulação negativa da expressão de MHC classe II nos monócitos humanos após activação por LPS.

Estudo C. IL-10 inibe a produção de citocinas em macrófagos activados.

Os resultados apresentados nesta secção foram publicados após a sua data de prioridade em Fiorentino et al. (1991) J. Immunology 147:3815-3822, que aqui é incluído na sua totalidade como referência.

Sumário 11-10 inibe a capacidade dos macrófagos mas não das células B apresentadoras de antigénio (APC) para estimular a síntese de citocinas por clones de células T Thl. Estudaram-se os efeitos directos de IL-10 nas linhas celulares de macrófagos e em macrófagos peritoneais normais. A produção das -94- proteínas IL-1, IL-6 e TNFa induzida por LPS (ou LPS e IFNy) foi significativamente inibida por IL-10 em duas linhas celulares de macrófagos. Ainda, IL-10 parece ser um inibidor mais potente da síntese de monocinas do que IL-4 quando adicionada em concentrações semelhantes. A expressão de mRNA de IL-1, IL-6 e TNFa induzida por LPS ou LPS e IFNy foi também inibida por IL-10, como se mostra pela análise de PCR semi-quantitativo ou por Northern. A inibição por IL-10 da secreção de IL-6 induzida por LPS foi menos marcada em macrófagos peritoneais purificados por FACS do que em linhas celulares de macrófagos. No entanto, a produção de IL-6 em macrófagos peritoneais foi aumentada pela adição de anticorpos anti-IL-10, implicando que a presença nestas culturas de IL-10 endógena, a qual resulta numa redução intrínseca da síntese de monocinas após activação com LPS. Ainda, mostrou-se que os macrófagos peritoneais estimulados com LPS produzem directamente IL-10 detectável por ELISA. Encontrou-se que IFNy aumenta a produção de IL-6 em macrófagos peritoneais estimulados com LPS, e isto provavelmente resulta da supressão da produção de IL-10 por esta mesma população de células. Para além dos seus efeitos na síntese de monocinas, IL-10 também induz umaalteração significativa na morfologia dos macrófagos peritoneais estimulados com IFNy. A forte acção de IL-10 no macrófago, particularmente ao nível da produção de monocinas, indica um papel importante desta citocina não apenas na regulação das respostas de células T como também em resposta inflamatórias agudas. IL-10 foi inicialmente descrita como uma citocina produzida por clones de células T auxiliares Th2 que inibe a síntese de citocinas em macrófagos dependente de APC, e apresenta efeitos pleiotrópicos em várias outras células e é produzida por outras células. As células Thl secretam IL-2 e IFNy e preferencialmente induzem activação de macrófagos e hipersensibilidade do tipo retardado (DTH), enquanto que as células Th2 produzem IL-4 e IL-5 e proporcionam ajuda às respostas das células B. Uma vez activados, cada um dos tipos de células Th pode ser capaz de regular a proliferação e/ou função dos outros. Tal regulação cruzada é mediada por várias citocinas e oferece uma explicação para a observação de que algumas respostas de anticorpos e DTH podem ser mutuamente exclusivas. IL-10 actua nos macrófagos, mas não nas células B, para inibir a síntese de citocinas em clones de Thl e IL-10 exerce um efeito directo nos macrófagos.

Os produtos de macrófagos, tais como IL-1, IL-6 e TNFa têm sido implicados em muitas respostas inflamatórias e imunológicas induzidas durante a infecção ou destruição de tecidos. TNFa e IL-1 são pirogénios endógenos que, causam ainda uma série de alterações metabólicas numa variedade de tipos celulares. Ainda, IL-1 e IL-6 são os principais indutores da síntese de proteínas hepáticas da fase aguda. Os exemplos que se seguem mostram que IL-10 inibe a produção de citocinas tais como IL-1, TNFa e IL-6 em macrófagos activados por LPS. Assim, IL-10 desempenha um papel importante nas respostas inflamatórias regulando a função de macrófagos para além do seu papel na activação das células T.

Exemplo Cl. IL-10 inibe a função de APC de diferentes linhas de macrófagos.

Citocinas. mIL-Ια recombinante purificada foi generosamente oferecida por P. Lomedico, Hoffman-La Roche, Nutley, NJ. mIL-2 recombinante e mlFNy foram adquiridos à Schering Research, Bloomfield, NJ. IL-6 recombinante de ratinho purificada, cedida generosamente por M. Pearce, DNAX, foi expressa em células Cos/ e purificada por imunoafinidade. TNFa de ratinho foi adquirido à Genzyme Corporation (Boston, MA). IL-10 recombinante de ratinho (CSIF), obtida por transfecção de células Cos7 com o clone de cDNA F115 como descrito atrás e sobrenadantes testemunha de células sujeitas simulação de transfecção, foram usados numa concentração final de 2% a menos que de outra forma indicado. Como alternativa, IL-10 recombinante de ratinho, -96- generosamente fornecida por Warren Dang foi expressa em E. coli e purificada por afinidade usando o anticorpo SXC2 anti-IL-10.

Anticorpos. Usaram-se anticorpos monoclonais (mAbs) neutralizantes contra IFNy (XMG1.2) e IL-10 (SXC1), ver Cherwinski et al, (1987) J. Expt'1 Med. 166:1229-1244; e Mosmann et al. (1990) J. Jmmunol. 145:2938-2945. J5, um controlo de isotipo para SXC-1, foi gemerosamente cedido por Robert Coffman (DNAX). Os anticorpos monoclonais contra IL-6 (20F3 e 3201), ver Stames et al. Π990) J. Immunol. 145:4185-4191 e contra TNFa (MP6.XT3.il e XT22.11) foram purificados e cedidos generosamente por John Abrams (DNAX). Os anticorpos usados para separação por FACS incluíram o anticorpo de rato B220 anti-ratinho (RA3-6B2), ver Coffman et al. (19881) Nature 289:681-683 e anticorpo de rato anti-ratinho Mac-1 (Ml/70), ver Springer et al., (1978) Eur. J. Immunol. 8: 539-542. O anticorpo monoclonal de rato anti-ratinho contra Fc-gR foi 2.4G2, ver Unkeless (1979) J. Expt'1 Med. 150:580-596.

Meios. O meio de ensaio (cRPMI) consistiu em RPMI 1640 (J. R. Scientific Inc. Woodland, CA) com 10% de soro fetal de vitela (FCS) inactivado pelo calor (J.R. Scientific Inc.), 2-ME 0,05 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) e tampão Hepes 10 mM (Gibco Laboratories, Grand Isalnd, NY). Para o crescimento de células T, mIL-2 recombinante (330 U/ml) foi adicionado a cRPMI.

Antigénios. Hemocianina de lapa (KLH) adquirida à Pacific Bio-Marine Laboratories, Inc. (Venice, CA) ou Calbiochemicals Labs (La Jolla, CA) foi usada numa concentração final de 100-500 pg/ml e ovalbumina da Sigma foi usada numa concentração final de 1 mg/ml.

Linhas celulares. 0 clone Thl, HDK1, (específico para IAd/KLH), ver Cherwinski et al. (1987) J. Expt'1 Med., e o hibridoma de células T DO 11.10, (específico para IA^/ovalbumina), ver Kapples et al, (1981) J. Expt'l Med. 153:1198- , foram usados no ensaio de inibição da síntese de citocinas (CSIF). O clone Th2, D10.G4.1 (D10), AKR/J anti-conalbumina, obtido de C. Janeway (Yale University, New Haven, CT), ver Kaye et al. (1983) J. Expt'1 Med. 153:836-856, foi usado para um ensaio de IL-1, ver Suda et al., (1989) J. Immunol. Methods 120:173-178. Todos os clones foram mantidos por estimulação periódica com antigénio (Ag) e APC irradidadas, seguido de crescimento em meio com IL-2, ver Cherwinski et al. (1987) J. Expt'1 Med. A linha celular de macrófagos clonada IG.18.LA (H-2d) foi obtida a partir de culturas de células do estroma de timo e mantidas em 20% de sobrenadante de células L. A linha celular de macrófagos PU.5.1 (H-2d), ver Ralph et al. (1977) J. Immunol. 119:950-954, foi mantida em cRPMI co 10% FCS. Para usar como APC, as linhas celulares 1G.18. LA e PU5.1 foram activadas durante 20-24 horas com. IFNy (0,5-2 ng/ml). A linha celular WEHI.164.13, que responde a TNFa e a ΤΝΡβ, ver Espevik et al. (1986) J. Immunol. Methods 65:55-63, foi mantida em cRPMI/5% FCS.

Ensaios imunométricos para citocinas. Os níveis de citocinas (IL-6, IFNy e CSIF/IL-10) foram medidos num formato de ELISA em sanduíche.

Bioensaios. Usou-se um ensaio de proliferação celular colorimétrico com MTT para os bioensaios com TNFa (células WEHI 164.13 ), IL-2 (células HT-2) e IL-1 (células D10) (104 células/alvéolo para todos os ensaios). A actividade é expressa como Unidades/ml relativamente a um padrão conhecido ou em pg ou ng/ml. Em cada um dos casos, uma unidade por ml representa a quantidade de uma citocina particular que produz 50% da resposta máxima desse bioensaio.

Indução e medição da síntese de citocinas Thl. 1-5 x 104 células HDK.l, Thl, ou células de hibridoma de células T DO-11.10 foram combinadas com números variáveis de APCs vivas na presença ou ausência de antigénio em placas de microtitulação de fundo plano com 96 alvéolos num volume total de 200 μΐ/alvéolo. Os níveis de citocinas foram medidos em sobrenadantes de 20 ou de 48 horas.

Estimulação de linhas celulares de macrófagos. As linhas celulares de macrófagos 1G.18.LA e PU 5.1 foram colhidas por raspagem suave, lavadas e ressuspensas em cRPMI/5% FCS a 106 células/ml em placas de cultura de tecidos de 9,5 cm (Becton Dickinson, NJ) a 37°C em 5%C02/95% de ar, durante 6 horas para a expressão de RNA, ou 24 horas para a detecção de citocinas nos sobrenadantes. A estimulação com LPS foi a 10 pg/ml ou nalguns casos LPS e IFNy a 100 unidades/ml, na presença ou ausência de IL-10 (200 unidades/ml) ou de IL-4 (200 unidades/ml). Os sobrenadantes foram colhidos, centrifugados (800 xg) e guardados a -80°C, e depois usados para testar os níveis de IL-1, IL-6 ou TNFa. Ainda, as linhas celulares de macrófagos foram estimuladas com IFNy , durante 24 horas como atrás e nalguns casos ainda estimuladas durante 24 horas na presença do clone Thl HDK.l e do seu antigénio específico KLH. Neste caso os sobrenadantes foram inda concentrados usando um filtro AMICON com uma membrana de 10000 de peso molecular de exclusão e removidos IL-2 e IFNy usando colunas de imunoafinidade. Estes sobrenadantes e os volumes de exclusão do passo de concentração foram então testados quanto à sua capacidade para co-estimular a síntese de citocinas Thl dependente de APC e específica de antigénio. Ainda, para usar como APC, as linhas celulares de macrófagos 1G18.LA e PU5.1 foram primeiro activadas durante 20-24 horas com IFNy (0,5-2 IL-10 inibirá a capacidade de APC para estimular a produção de IFNy pelas células Thl quando são usadas como APCs macrófagos normais peritoneais ou de baço ou a linha celular de macrófagos 1G18.LA. IL-10 é também eficaz sobre a linha celular de macrófagos PU5.1 que tem uma origem diferente de 1G18.LA (Figura 14), se bem que a estimulação conseguida usando a linha celular PU5.1, como APC para as células Thl, não seja maior do que a observada com a linha celular de macrófagos 1G18.LA. A Figura 14B mostra que a linha celular 1G18.LA pode também mediar a indução, específica de antigénio, da produção de IL-2 pelo clone Thl e pelo hiridoma de células T específico de ovalbumina DO 11,10. Ambas as estimulações foram significativamente inibidas por IL-10.

Exemplo C2. IL-10 induz uma alteração morfológica em macrófagos peritoneais estimulados por IFNy.

Purificação e estimulação de macrófagos peritoneais. Células peritoneais foram obtidas por injecção e remoção de 7 ml de cRPMI/10% FCS e os macrófagos foram, separados com base em Mac-1 e B220 (os macrófagos são Mac-l+brilhante; B220-). As células foram estimuladas com 10 μg/ml de LPS na presença ou ausência de IL-10, anticorpos monoclonais anti-IL-10 ou IFNy. Os sobrenadantes foram colhidos após incubação durante 20 horas, a 8 x 105 células/ml, numa atmosfera de 5% de C02 a 37°C. Os sobrenadantes foram testados relativamente a TNFa e IL-6 usando um imuno-ensaio ligado a enzima.

Os macrófagos peritoneais purificados por FACS foram incubados com IFNy na presneça ou ausência de IL-10 durante vários períodos de tempo. Os sobrenadantes foram èntão removidos, as células secas ao ar, fixadas e coradas com Wright's-Giemsa. Como se mostra na Figura 15, IL-10 induz o arredondamento das célula e o descolamento, o qual pode ser significativo relativamente à inibição da função APC dos macrófagos. - 100 -

Exemplo C3. IL-10 regula negativamente a produção de citocinas biologicamente activas ou secretadas por linhas celulares de macrófagos activadas.

Dados anteriores sugerem que IL-10 tenha um efeito directo na capacidade dos macrófagos para funcionarem como APC e activarem a síntese de citocinas Thl. Testou-se o efeito directo de IL-10 na produção de monocinas por estas linhas celulares de macrófagos. Os sobrenadantes colhidos das linhas celulares de macrófagos estimulados com IFNy , LPS ou IFNy mais LPS, na presença ou ausência de IL-10, foram testados relativamente aos seus níveis de citocina(s). Sempre que possível IL-4 foi usada como testemunha, uma vez que se demonstrou que este factor inibe a produção de citocinas nos macrófagos activados. A estimulação das linhas celulares de macrófagos com IFNy sozinho não induziu níveis detectáveis das monocinas IL-1, IL-6 ou TNFa nos sobrenadantes. Pelo contrário, LPS ou LPS mais IFNy induziram níveis significativos destas citocinas (Figura 16). O ensaio de D10.G4.1 usado para detectar IL-1, realizado na ausência de Concanavalina A (ConA), não detecta outras citocinas expressas por macrófagos. As linhas celulares de macrófagos 1G18.LA e PU5.1 foram ambas significativamente inibidas na sua capacidade pra produzir bioactividade de IL-1 após indução com LPS (Figura 16). IL-10 também possui um efeito inibidor significativo na produção de TNFa induzida por LPS ou IFNy mais LPS, nos sobrenadantes de ambas as linhas celulares de macrófagos, conforme demonstrado no bioensaio WEHI.164.13 (encontrou-se que toda a actividade nestes sobrenadantes de macrófagos era atribuível a TNFa usando um anticorpo bloqueador específico). De modo semelhante, IL-10 inibe a produção da proteína IL-6 nas linhas celulares de macrófagos, estimuladas por IFNy mais LPS e/ou induzidas por LPS conforme medido num imuno-ensaio ligado a enzima para IL-6. Em todas as experiências a IL-10 testada tem um efeito inibidor muito mais significativo do que IL-4 na produção de monocinas induzida por LPS ou IFNy mais LPS (ao nível da proteína).

Exemplo C4. IL-10 regula negativamente a expressão de mRNA de citocinas em macrófagos activados.

Extraccão de RN A e análise do RNA. Extraiu-se RNA celular total das linhas celulares de macrófagos usando um processo com isotiocianato de guanidina. A concentração de RNA foi medida por absorção a 260 nm. A análise da transferência de RNA foi como descrito em Moore et al. (1990) Science 248:1230-1234 ou no caso de PCR de RNA sujeito a transcrição inversa como descrito por 0'Garra et al. (1990) Intn'l Immunol 2:821-832. Uma quantidade específica de cada amostra de cDNA (diluições de um vigésimo do cDNA) foi amplificada com 2,5 unidades de Thermalase (DNA-polimerase de Thermus aquaticus) (IBI) num termociclador Cetus/Perkin-Elmer nas seguintes condições: 94°C desnaturação, 30s; 55°C emparelhamento, 30s; e 72°C extensão, 1 min., usando escorvas específicas para HPRT (enzima de limpeza), TNFa e IL-6 como apresentado: HPRT directa: 5'-GTA ATG ATC AGT CAA CGG GGG AC-3' (nt 422-444); HPRT inversa: 5'-CCA GCA AGC TTG CAA CCT TAA CCA-3’ (nt 543-570); TNFa directa: 5'-GCG ACG TGG AAC TGG CAG AAG-3' (nt 4499-4519); TNFa inversa: 5'-GGT ACA ACC CAT CGG CTG GCA-3' (nt 58655845); sonda TNFa: 5'CAG TTC TAT GGC CCA GAC CCT C-3' (nt 5801-5821); IL-6 directa: 5'-CCA GTT GCC TTC TTG GGA CTG-3' (nt 1520-1540); IL-6 inversa; 5'-GGT AGC TAT GGT ACT CCA-3' (nt 6093-6075); sonda IL-6: 5'-GTG ACA ACC ACG GCC TTC CCT ACT-3' (nt 1547-1570).

Todas as escorvas abrangeram sequências de intrões no gene. A sensibilidade e especificidade foram ainda aumentadas fazendo o despiste de transferências para membrana dos produtos amplificados com oligonucleótidos internos, relativamente ao produto amplificado, marcados radioactivamente (32P, γ-ΑΤΡ). As transferências radioactivas foram quantificadas usando Ambis Image Scanner e visualizadas por exposição a filme de raios X. Nos diferentes casos incluiu-se uma curva padrão de RNA de P388D1 para assegurar a reprodutibilidade do ensaio e unidades arbitrárias relativas a pg de RNA introduzido numa transferência final foram obtidas a partir dele. Ainda, usou-se um padrão interno de enzima de limpeza HPRT para assegurar que se usou exactamente a mesma quantidade de RNA e que todas as amostras foram transcritas inversamente e amplificadas por PCR com a mesma eficiência. O RNA foi extraído das linhas celulares de macrófagos, 1G18.L e PU5.1, 6 hr após estimulação com LPS ou LPS mais IFNy, na presença ou ausência de IL-10 ou IL-4. A análise das transferências de RNA de 10 pg de RNA total revelaram que IL-10 regula negativamente a expressão de TNFa induzida por LPS ou LPS mais IFNy, em ambas as linhas celulares (Figura 17), apesar de num grau muito menor no último caso. Isto foi confirmado usando um PCR semi-quantitativo para análise do RNA sujeito a transcrição inversa apartir de ambas as linhas celulares. Ao incluir-se uma curva padrão para cada uma das citocinas descritas na Tabela Cl, foi possível obter unidades arbitrárias relativas a pg de RNA total padrão representado em cada ponto e portanto apresentar os resultados numericamente. A Tabela Cl mostra que IL-10 e IL-4 inibe a expressão de TNFa induzida por LPS e IFNy mais LPS na linha celular de macrófagos 1G18.LA. Isto é melhor ilustrado com valores obtidos a partir da parte linear da curva padrão e a legenda da tabela Cl explica o método usado para derivar os dados numérios. A análise da expressão de RNS pela linha celular de macrófagos PU5.1 em resposta a LPS e IFNy mais LPS, usando o mesmo método, também mostrou que a expressão de IL-6 e de TNFa foram igualmente inibidas por IL-10 (Tabela C2). I < I bo α *

Tabela IInibição, por IL-10 e IL-4, da expressão de TNFa induzida porLPS na linha celular de macrófagos IG18.LA £ & o * eu υ < z & Cu * £ Cl, o * £ CU O < § t>0 α * eu ο ° £ iCd o .t> Q ΰ 3 u cd ΓΟ O tu Ό Ό O 3 £ W PP o O O o >o cn o OL VL o Tf cn CN CN Tf Cl CN OO o cn oo LO Γ— CN o io cn O CN CN CN cn Γ O O cn i—, 1—, ΟΟ LO CN r- Tf cn Tf cn ,—, U cd P o r- O O O Em ÇQ LO cn LO LO +-» i—H cn cd cu (N CL CN Γ co co 00 LO ro ΟΟ o o LO r- co >o Tf Tf <N r**W r- O o o CN oo o i—< *—· CN Γ- C\ LO >—1 CN o o O O O CN o LO 1—1 1—1 CN Γ- ro CN o Tf CN Tf LO CN LO 00 CN CL r- CN CL Γ i—H OO Tf r- Γ- 1-H CL CN ΟΟ CL CN oo 1—1 1—, £ Uh + O0 00 &H eu J i-l

unidades arbitrárias, relativas a uma titulação do controlo positivo e corrigidas relativamente ao seu teor (*pg RNA/ponto) usando uma curva padrão (não apresentada). MECANISMO DE ACÇÃO DE IL-10

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Exemplo C5. IL-10 regula negativamente a produção da proteína IL-6 em macrófagos peritoneais activados com LPS

Macrófagos peritoneais (separados com base em Mac-1 e B220) (os macrófagos são Mac-1+ (brilhante); B220-) que já se demonstrou serem inibidos por IL-10 no que concerne à sua função de APC relativamente a células Thl, foram ainda testados quanto à sua produção de TNFa e IL-6 como resposta a LPS. TNFa não foi detectável nos sobrenadantes de macrófagos separados por FACS e estimulados com LPS (densidade celular, 7 x 105 células/ml). Pelo contrário, níveis significativos de IL-6 foram detectáveis nos sobrenadantes obtidos a partir de macrófagos peritoneais de ratinhos BALB/c ou CBA/J, estimulados com LPS como atrás (Figura 18). Os níveis de IL-6 eram reduzidos se as células fossem estimuladas por LPS na presença de IL-10, mas surpreendentemente, o nível de inibição foi menos marcado (Figura 18) do que o observado com as linhas celulares de macrófagos (Figura 16). No entanto, o nível de produção de IL-6 induzida por LPS puderam ser aumentados pela inclusão de um anticorpo monoclonal dirigido contra IL-10, na estimulação com LPS (Figura 18). A produção de IL-10 pelos macrófagos como resposta a LPS foi confirmada num ELISA específico para IL-10 (macrófagos peritoneais de ratinhos CBA/J ou BALB/c estimulados com LPS como atrás produziram 2 unidades/ml ou 4,5 unidades/ml de IL-10, respectivamente). A Figura 18 também mostra que macrófagos peritoneais de BALB/c produzem níveis mais elevados de IL-6 quando estimulados com LPS na presença de IFNy em oposição a quando são estimulados apenas com LPS. Isto pode ser explicado pelos resultados de uma outra experiênca sobre produção de IL-10 em macrófagos peritoneais de ratinhos BALB/c. Neste caso, os macrófagos estimulados com LPS produziram 12 unidades/ml de IL-10 e esta foi reduzida para menos de 3 unidade/ml se as células foram estimuladas com LPS na - 106 - presença de IFNy.

Exemplo C6. Teste para um mecanismo co-estimulador solúvel para a inibição por IL-10 da função APC dos macrófagos. 11-10 apenas inibirá a síntese de citocinas Thl na presença de células apresentadoras de antigénio (APC) (macrófagos) vivas. Um mecanismo possível de acção de IL-10 é a supressão da produção de um cofactor solúvel necessário à libertação óptima de citocinas pelas células Thl. Os sobrenadantes foram obtidos a partir de macrófagos estimulados com IFNy, na presença ou ausência de células Thl e antigénio específico. Tais sobrenadantes (Figura 19A), ou o volume de exclusão gerado durante a sua concentração foram incapazes de reverter a inibição mediada por IL-10 da função APC de macrófagos relativamente às células Thl. Estes dados não proporcionam evidência de que IL-10 regula negativamente um co-estimulador solúvel necessário à síntese de citocinas. Experiências semelhantes não proporcionam evidência de que IL-10 induza os macrófagos a produzirem um factor inibi dor solúvel que actue directamente nas células T, se bem que tal inibidor possa ser sensível ou esteja ligado a membranas. Para testar isto, realizou-se uma experiência de mistura de células como se segue. Células B e macrófagos do baço foram separados por FACS (com base em B220 e Mac-1). Doses graduais de macrófagos, na presença ou ausência de células B e também na presença ou ausência de IL-10, foram usados como APCs para a estimulação, específica de antigénio, de células HDK.l. A síntese de citocinas Thl esimulada por macrófagos, mas não por células B, foi inibida por IL-10 (Figura 19B). A mistura de doses graduais de macrófagos com um número constante de células B, deu uma estimulação aditiva da síntese de citocinas Thl (Figura 19B). No entanto, a adição de IL-10 a esta mistura de APCs levou o nível da síntese de citocinas Thl apenas até ao nível conseguido com APC de apenas células B, uma observação que argumenta contra a presença de um inibi dor de gama curta ou sensível que actue directamente na célula Thl, ou na célula B APC.

Estudo D. IL-10 protege os ratinhos contra o choque letal induzido por superanti génios.

Sumário

Estudou-se o papel de IL-10 na protecção contra o choque letal induzido pela enterotoxina B de estafilococos (SEB) num modelo de ratinho. O pré-tratamento do ratinho com IL-10 evitou a morte do ratinho posteriormente injectado com SEB e D-galactosamina (esta última foi necessária para ultrapassar a resistência natural dos ratinhos a SEB). Este efeito indica que IL-10 é capaz de inibir a activação de células T in vivo, provavelmente através da sua capacidade para inibir a capacidade dos macrófagos para activarem as células T.

Os superantigénios são mitogénios das células T que activam as células T de forma específica de VB do receptor das células T (TCR) ao ligar-se às cadeias VB de TcR e à cadeia B das moléculas de MHC classe II. Os superantigénios incluem moléculas endógenas produzidas por vírus dos tumores mamários de ratinho e superantigénios exógenos que incluem enterotoxinas como as produzidas por Staphylococcus aureus. O efeito tóxico dos superantigénios depende da presença de células paresentadoras de antigénio (APC). Nos últimos anos foi reconhecido que o efeito tóxico destas toxinas é devido à sua actividade mitogénica relativamente às células T, uma conclusão que foi demonstrada in vivo. IL-10 é uma citocina que apresenta actividades pleiotrópicas numa variedade de linhagens celulares. Estas incluem: cofactor de crescimento para as células T e mastócitos de ratinho, indução de Ia em células B e a capacidade para inibir a activação das células T. Este último efeito foi demonstrado como sendo indirecto, ao inibir a capacidade dos macrófagos para actuarem como APCs. Este efeito parece ser parte de um efeito inibidor geral da IL-10 sobre a função dos macrófagos, incluindo a sua capacidade para produzir citocinas tais como IL-1, TNFa e IL-6. O presente estudo usou o choque induzido por enterotoxina B de estaíEilococos (SEB) em ratinhos como modelo in vivo de choque letal mediado por células T. Neste modelo, os ratinhos são tomados sensíveis aos efeitos tóxicos de SEB através de pré-tratamento com D-galactosamina. Este tratamento baixa a resistência natural que os ratinhos possuem contra as enterotoxinas, provavelmente ao afectar os mecanismos de eliminação hepáticos. A administração subsequente de pequenas doses de SEB resulta na morte dentro de 2 dias. Neste modelo, demonstrou-se que a toxicidade é devida à activação massiva de células T em que a produção de TNFa pela célula T desempenha um papel crítico. O tratamento dos ratinhos com IL-10 inibe a toxicidade mediada por SEE1, provavelmente devido à sua capacidade para inibir a activação de células T dependente de macrófagos.

Exemplo Dl. IL-10 evita a toxicidade mediada por SEB in vivo

Ratinhos. Ratinhos BALB/c H-2^ de quatro a cinco semanas de idade, foram adquiridos à Simonson Laboratories, Gilroy, Califórnia.

Reagentes. Os materiais usados foram: interleucina-10 de ratinho (mIL-10) preparada segundo processos convencionais por Satish Menon do DNAX Research Institute (Paio Alto, CA). D(+)-Galactosamina (G-0500) foi adquirida à Sigma, St.Louis, MO. A enterotoxina B de estafilococos (SEB) usada na experiência inicial foi também adquirida à Sigma. A SEB usada em experiências subsequentes foi da Toxin Technology, Madison, WIS. graciosamente fornecida por P. Hugo (National Jewish Center for Immunology, Denver, Co.). Todos os materiais foram diluidos em solução de sais equilibrada.

Tratamento. Ratinhos macho de quatro a cinco semanas de idade foram injectados (i.p.) com várias concentrações de mIL-10. Três a quatro horas mais tarde os mesmos ratinhos forma injectados (i.p.) com D-galactosamina. Uma hora depois da segunda injecção, os ratinhos foram injectados com SEB em diferentes concentrações. Os ratinhos foram observados às 24, 36 e 48 horas após a injecção.

As experiências iniciais estabeleceram que IL-10 altera a toxicidade de SEB num modelo in vivo de ratinho. Projectaram-se experiências preliminares para determinar a dose minima de SEB necessária para observar uma mortalidade elevada neste modelo. Esta dose variou dependendo da origem (fornecedor) e lote de SEB. Uma vez determinada esta dose para um determinado lote de SEB, testou-se o pré-tratamento com IL-10 (10 pg/ratinho). A Figura 20 mostra que o pré-tratamento com IL-10 resultou na sobrevivência de todos os ratinhos injectados com 10 pg de SEB/ratinho. Se bem que o pré-tratamento com IL-10 não tenha evitado a morte eventual dos animais injectados com 20 pg de SEB/ratinho, ela prolongou a sua sobrevivência.

Estudo E. Interleucina 10 protege os ratinhos de endotoxémia letal

Sumário IL-10 decresce a produção de IL-1, IL-6 e TNFa in vitro e a neutralização de IL-10 em ratinhos conduz a um aumento das mesmas monocinas. O presente estudo testa se esta propriedade supressora de monocinas da IL-10 confere a capacidade para proteger os ratinhos de choque induzido por LPS, uma reacção inflamatória mediada por monocinas. Uma única injecção de 0,5-1 pg de IL-10 recombinante de ratinho protegeu de forma reprodutível ratinhos BALB/c de uma injecção intraperitoneal letal de endotoxina. Este resultado foi obtido quer a IL-10 fosse administrada simultaneamente com a injecção de endotoxina ou 30 minutos após a mesma. O efeito protector de IL-10 foi revertido com uma injecção prévia de anticorpos neutralizantes anti-IL-10 e está correlacionado com um decréscimo substancial da libertação de TNFa induzido pela endotoxina. Estes dados implicam que IL-10 seja um candidato para o tratamento de sépsia bacteriana e de um modo mais geral como um reagente anti-inflamatório eficaz.

As infecções bacterianas graves podem resultar em alterações fisiológicas produndas incluindo hipotensão, febre, necrose dos tecidos, disfunção generalizada dos orgãos e finalmente a morte. No caso das bactérias Gram-negativas, esta toxicidade é devida à endotoxina, um componente lipopolissácrido (LPS) da parede celular bacteriana. De facto, a injecção de doses adequadas de LPS em coelhos, ratinhos e outros animais produz alterações que são típicas do síndrome do choque séptico, resultando assim num modelo animal simples desta reacção inflamatória. A toxicidade induzida por endotoxinas parece ser devida à libertação de TNFa, IL-1 e/ou IL-6 pelos macrófagos/monócitos estimulados com endotoxina uma vez que os animais podem ser protegidos do choque induzido por bactérias e endotoxina através da neutralização destas monocinas, usando anticorpos monoclonais ou um antagonista fisiológico de iL-1 designado IL-1 Ra. A interleucina-10 (IL-10) tem numerosas propriedades in vitro incluindo a supressão da produção de IFNy pelas células T auxiliares e células - 111 - NK; co-estimulação do crescimento de timócitos, mastócitos e células B; e supressão da produção de monocinas. Relativamente a esta última propriedade, IL-10 suprime profundamente a produção induzida de TNFa, IL-la, IL-Ιβ, IL-6, IL-8 e GM-CSF em monócitos humanos e macrófagos peritoneais de ratinho. Pelo contrário, IL-10 não tem efeito na expressão constitutiva de TGFP em monócitos e de facto regula positivamente a produção de IL-lRa em monócitos. Estes resultados in vitro são apoiados por experiências in vivo mostrando que a neutralização de IL-10 usando anticorpos monoclonais específicos conduz a níveis elevados de TNFa e IL-6 circulantes em ratinhos. Testou-se se a capacidade de IL-10 para suprimir a produção de TNFa, IL-1 e IL-6, combinado com a sua capacidade para aumentar IL-lRa, tomará esta citocina capaz de proteger os ratinhos contra o choque induzido por endotoxinas.

Exemplo El. Efeito de IL-10 na endotoxémia letal em ratinhos.

Ratinhos. Ratinhos fêmea BALB/c de 8 semanas de idade foram adquiridos à Simonsen Laboratories (Gilroy, CA).

Reagentes. O lipopolissacárido (LPS) de Escherichia coli serotipo 0111:B4 foi adquirido à Sigma Chemical Co. IL-10 recombinante deratinho foi expressa em E. coli e purificada até uma actividade específica elevada por purificação por afinidade e cromatografia de permuta iónica. Este material continha um mínimo de endotoxina e permaneceu estável a 4°C durante pelo menos 4 meses. A actividade específica da IL-10 de ratinho foi avaliada elo ensaio de inibição da síntese de citocinas, ver Fiorentino et al., (1989) J. Expt'l Med. 170:2081-2095 e pelo ensaio de co-estimulação de mastócitos MC/9, ver Thompson-Snipes et al. (1991) J. Exp. Med. 173:507-510. As experiências com anticorpos neutralizantes utilizaram o anticorpo monoclonal IgGl de rato anti-IL-10 de ratinho, 2A5, ou um anticorpo para controlo de isotipo designado GL113.

Ensaio de TNFa. Os níveis séricos de TNFa foram avaliados usando um ELISA específico da citocina.

Grupos de 20 ratinhos BALB/c foram injectados intraperitoneal-mente com uma dose letal de LPS sozinho ou com a mesma quantidade de LPS juntamente com quantidades variáveis de IL-10 recombinante de ratinho. Em várias experiências deste tipo, os ratinhos foram totalmente protegidos damorte resultante do choque induzido por LPS quando foi administrado ao animal 0,5 μ g, 1,0 pg ou 10 pg de IL-10 juntamente com a LPS (Figura 21). Nalgumas destas experiências, também foi observada protecção parcial nos ratinhos que receberam 0,1 pg ou 0,05 pg de IL-10 na altura da administração do LPS (Figura 21).

Exemplo E2. Neutralização da protecção por anticorpos anti-IL-10. A protecção mediada por IL-10 relativamente à endotoxémia letal poderá ser bloqueada pela administração prévia de anticorpos neutralizantes anti-IL-10, mas não pelo anticorpo de controlo do isotipo (Figura 22), confirmando a especificidade deste efeito.

Exemplo E3. A administração retardada de IL-10 permanece eficaz na protecção

Um estudo cinético revelou que a protecção mediada por IL-10 relativamente à endotoxémia letal foi conseguida mesmo quando a IL-10 foi administrada 30 minutos após a injecção de LPS (Figura 23). No entanto, outros atrasos na administração de IL-10 reduzem substancialmente a protecção e não se observou protecção quando IL-10 foi administrada 5 horas após a injecção de LPS (Figura 23). - 113 -

Exemplo E4. Efeito de IL-10 sobre TNFa A endotoxémia letal é uma reacção inflamatória indesejável mediada por monocinas. Demonstrou-se que IL-10 suprime a produção de monocinas in vitro em macrófagos e monócitos activados, sugerindo que a protecçào mediada por IL-10 atrás referida reflectiu uma supressão da produção de monocinas na resposta induzida pela endotoxina. De facto, os soros colhidos às 1, 2 e 3 horas após a injecção de LPS ± IL-10 indicou uma profunda redução nos níveis de TNFa circulantes em animais protegidos por IL-10. Uma vez que os anticorpos anti-TNF protegem de forma semelhante os ratinhos da endotoxémia letal, é provável que a supressão de TNFa induzida por IL-10 pelo menos contribua para a protecção que esta citocina proporciona contra a endotoxémia letal. Outros efeitos de IL-10 na função dos macrófagos/monócitos poderão também contribuir para a sua capacidade em proteger contra endotoxémia letal. Estudos in vitro indicaram que IL-10 não só suprime IL-1 e IL-6, como também regula positivamente IL-lRa, consequências que também protegerão contra a endotoxémia letal, conforme sugerido por descrições usando anticorpos neutralizantes anti-citocina ou administração de IL-lRa.

Estudo F. A administração contínua de anticorpo anti-interleucina-10 a ratinhos elimina as células B Lv-1 mas não as células B convencionais

Sumário

As células B Ly-1 têm a característica única de auto-renovação contínua e, podem ainda distinguir-se das células B convencionais com base na produção constitutiva e induzível muito elevada da citocina, recentemente descrita, interleucina-10 (IL-10). Testou-se se IL-10 actua como factor de - 114- crescimento autócrino ou parócrino para as células B Ly-1 tratando ratinhos continuamente desde o nascimento até às 8 semanas de idade com um anticorpo monoclonal IgM de rato que neutraliza especificamente IL-10 de ratinho. Os ratinhos tratados desta forma não possuíam células B Ly-1 peritoneais residentes, continham níveis séricos extremamente reduzidos de imunoglobulina M e foram incpazes de gerar respostas de anticorpos significativas in vivo a injecções peritoneais de al,3-dextrano ou fosforilcolina, os antigénios para os quais residem células B específicas na sub-série de células B Ly-1. Pelo contrário, as células B convencionais do baço de ratinhos tratados com anti-IL-10 eram normais relativamente aos números totais, fenótipo e respostas in vitro a mitogénios de células B e ao antigénio dependente do timo trinitrofenil-hemocianina de lapa (TNP-KLH). O mecanismo de eliminação de células B Ly-1 parece estar relacionado com o aumento dos níveis de interferão y (IFNy) endógeno em ratinhos tratados com anti-IL-10, uma vez que a co-administração de anticorpos anti-IFNy substancialmente restaurou o número de células B Ly-1 residentes na cavidade peritoneal nestes ratinhos. Estes resultados implicam que IL-10 seja um regulador do desenvolvimento de células B Ly-1 e identificam um processo para eliminar especificamente as células B Ly-1, permitindo assim uma avaliação do papel destas células no sistema imune.

As células B Ly-1 compreendem cerca de 2% das células B totais de um ratinho adulto e apresentam várias propriedades intrigantes que as distinguem das células b convencionais: (a) ainda que dificilmente detectáveis na maior parte dos tecidos linfóides primários e secundários, elas estão grandemente enriquecidas nas cavidades peritoneal e pleural, assim como a sua progénie no tecido linfóide associado ao tubo digestivo; (b) desenvolvem-se e predominam na ontogenia precoce e são auto-renováveis durante a vida do animal; (c) produzem um reportório restricto de anticorpos de baixa afinidade que dão uma reactividade cruzada elevada com auto-determinantes e não parecem fazer a maturação por mutação somática; e (d) produzem a maior parte das IgM encontrada no soro e produzem toda a resposta de anticorpos induzida por vários determinantes bacterianos, tais como fosforilcolina e ocl,3-dextrano. Se bem que os seus papéis precisos na função do sistema imune sejam pouco claros, os vários modelos que têm sido avançados, baseados nas especificidades dos anticorpo produzidos pelas células B Ly-1, incluem papéis na imunidade anti-bacteriana; eliminação de detritos celulares do hospedeiro tais como eritrócitos sénescentes; e na modulação do repertório de anticorpos durante o desenvolvimento. Um resultado recente de que as células B Ly-1 são produtores potentes de IL-10, uma citocina imuno-supressora que regula negativamente a produção de várias monocinas e citocinas derivadas das células, levanta a possibilidade de um papel imuno-regulador mais vasto para as células B Ly-1. Muitas destas características únicas são difíceis de avaliar em humanos, mas foi identificada uma população de linfócitos B humanos portadores de Ly-1 com propriedades relacionadas.

Exemplo Fl. A neutralização contínua de IL-10 em ratinhos elimina as células B Lv-1.

Ratinhos. Ratinhos BALB/c prenhes a meio do tempo e ratinhos C3H/HeJ foram adquiridos à Simonsen Laboratory (Gilroy, CA).

Tratamento anti-IL-10. 5-10 ratinhos BALB/c com a mesma idade foram injectados intraperitonealmente três vezes por semana desde o nascimento até às 8 semanas de idade com o anticorpo neutralizante IgM de rato anti-IL-10 de ratinho, designado SXC.l (0,2 mg/injecção para a semana um, 0,5 mg/injecção para a semana dois, 1,0 mg/injecção para as semanas três a oito), quantidades equivalentes de um controlo do isotipo designado J5/D, ou volumes equivalentes (100 ou 200 μΐ), de tampão de fosfatos salino (PBS). ratinhos BALB/c da mesma idade não tratados foram incluídos em todas as experiências para comparação. Os anticorpos SXC.l e J5/D foram obtidos a partir de sobrenadantes de hibridoma sem soro e purificados através de dois passos sequenciais de precipitação com 35% de sulfato de amónio. Nalgumas experiências, os ratinhos receberam quantidades semelhantes de um anticorpo IgGl de rato anti-IL-10 de ratinho designado 2A5 ou o seu controlo de isotipo GL113. Estes últios anticorpos foram administrados intraperitonealmente a 0,5 mg/injecção durante a semana um, 1 mg/injecção durante a semana dois, 2 mg/injecção durante as semanas três a oito.

Imunofluorescência. As células lavadas foram coradas com combinações dos seguintes reagentes: anticorpo anti-IgM de ratinho marcado com fluoresceína (DS-1; Pharmingen, San Diego, CA); anticorpo de rato anti-IgD de ratinho (11-26c) produzido por J. Keamey); anticorpo anti-CD3 de ratinho marcado com fluoresceína (145-2C11, Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN; Caltag Labs., South San Francisco, CA). Os reagentes biotinilados foram usados em conjunto com estreptavidina conjugada com ficoeritrina (Becton-Dickinson & Co., Mountais View, CA). As várias células foram analisadas usando um FACScan e as células mortas foram excluídas com base do ângulo directo e desvio lateral. Os resultados mostram as intensidades de fluorescência de 5000 células vivas contadas em cada grupo experimental. ELISAs para anticorpos. Amostras de soro colhidas após 8 semanas de tratamento, foram testadas quanto à presença de IgM de ratinho usando uma ELISA em sanduiche onde anticorpos de rato anti-IgM de ratinho (R8-103, Pharmingen) foram usados para revestir, a 5 pg/ml, placas de microtitulação em PVC, sendo adicionadas diluições das amostras de soro ou uma mistura de várias proteínas IgM purificadas de mieloma de ratinho como padrão e os complexos imunes foram subsequentemente detectados usando anticorpos de rato anti-IgM de ratinho biotinilados (RI9-15, Pharmingen) e peroxidase de rábano silvestre - 117 - conjugado com avidina (CalBiochem Corp., La Jolla, CA), mais 1 mg/ml de substrato (ácido 2,2'-azinobis[3-etilbenzotiazolin]sulfórico; Sigma Chemical Corp.).

As respostas de anticorpos específicos contra fosforilcolina e al,3-dextrano foram determinados após injecção intraperitoneal dos ratinhos anti-IL-10 ou controlo com 0,5 ml de soro fisiológico, 50 pg de al,3-dextrano derivado de Leuconostoc mesenteroides fornecido por Dr. Slodki (U.S. Department of Agriculture Research Service) ou 2 x 108 Streptococcus pneumoniae mortos pelo calor como fonte de fosforilcolina. Os soros foram colhidos de todos os ratinhos 7 dias mais tarde e analisados quanto à presença de anticorpos específicos contra al,3-dextrano ou fosforilcolina usando ELISAs. As respostas de anticorpos específicas contra TNP-KLH foram determinadas após injecção intraperitoneal dos ratinhos com 10 pg de TNP-KLH e colheita dos soros 7 dias mais tarde para análise de IgM e 10 e 14 dias mais tarde para análise de IgG. Os anticorpos específicos de TNP foram quantificados usando um ELISA. Em todos os casos, o tratamento anti-IL-10 foi continuado entre a exposição ao antigénio e a colheita dos soros. ELISA para IFNv. As amostras de soro colhidas dos ratinhos tratados com anti-IL-10 e controlo foram testadas relativamente a IFNy de ratinho usando um ELISA específico da citocina.

Ratinhos BALB/c machos e fêmeas foram injectados três vezes por semana desde o nascimento até às 8 semanas de idade com doses graduais de um mAb IgM de rato anti-IL-10 de ratinho designado SXC.l e subsequentemente analisado relativamente ao número e função das células B Ly-1. Os grupos testemunha de ratinhos BALB/c com a mesma idade não receberam tratamento ou receberam injecções equivalentes de PBS ou de um controlo do isotipo da IgM de rato (designado J5/D) foram incluídos para comparação. Os anticorpos foram administrados intraperitonealmente ou subcutaneamente sem alteração significativa do desfecho. O regime de injecções do anticorpo usado deu um nível médio de IgM sérica de rato às 8 semanas de 50 mg/ml conforme medido por um ELISA específico de IgM de rato no caso dos anticorpos SXC. 1 e J5/D. Após 8 semanas de tratamento, os ratinhos tratados com anti-IL-10 não se distinguiam dos três grupos testemunha em termos dos seguintes critérios: Peso total do corpo, avaliação histológica grosseira do fígado, baço, timo, nódulos linfáticos, intestinos e pulmões; hematócrito; número total de células brancas do baço, timo, nódulos linfáticos e peritoneu; e proporções de células B, células T e células não B/não T no baço, nódulos linfáticos e timo. Pelo contrário, a fenotipagem por imunofluorescência das células obtidas nas lavagens peritoneais reunidas colhidas de 5-10 ratinhos compreendendo cada um dos quatro grupos experimentais descritos revelaram uma eliminação drástica de células IgM+ e IgD+ nos ratinhos tratados com anti-IL-10 (SXC.l), mas não em qualquer um dos animais testemunha (Figura 24). Resultados idênticos foram obtidos em 24 experiências independentes incluindo duas usando ratinhos C3H/HeJ e várias usando um anticorpo neutralizante IgGl de rato anti-IL-10. Nos animais tratados com anti-IL-10 foram também eliminadas as células peritoneais portadoras de B220, conforme avaliado por imunofluorescência, e as células peritoneais que respondem a LPS, conforme avaliado pela capacidade destas células para incorporar [3H]-timidina após 3 dias de cocultura com 50 pg/ml de LPS. Estes resultados sugerem que os ratinhos BALB/c tratados com anti-IL-10 não continham células B nas suas cavidades peritoneais, ao contrário das 1-5 x 106 células B que podem ser normalmente recuperadas deste local. E significativo que pela imunofluorescência de três cores as cavidades peritoneais de ratinhos BALB/c com 8 semanas de idade no nosso biotério possuíam muito poucas células B convencionais (<5%). Os resultados mostrados na Figura 24 representam portanto predominantemente uma depleção de células B Ly-1. - 119 - ***«»*»

Apesar desta eliminação drástica das células B peritoneais, o número total de células das cavidades peritoneais dos ratinhos tratados com anti-IL-10 não difere significativamente dos dos grupos testemuna. Posterior análise por imunofluo-rescência, juntamente com contagens de células hematopoiéticas diferenciais, mostrou que a perda das células B foi compensada com um aumento das células T CD4+ e granulócitos peritoneais nos animais tratados com anti-IL-10. Duas outras observações indicaram que a depleção de células B Ly-1 em ratinhos tratados com anti-IL-10 ocorreu em todo os sistema imunitário e não foi restringida à cavidade peritoneal. Primeiro, ratinhos tratados com anti-IL-10 apresentaram uma redução drástica de 90-100% nos níveis séricos de IgM comparado com os três grupos testemunha, conforme avaliado por um ELISA específica para IgM de ratinho (Figura 25). Segundo, os ratinhos tratados com anti-IL-10 eram profundamente deficientes nas suas capacidades para gerar respostas de anticorpos in vivo contra al,3-dextrano ou fosforilcolina (Figura 26), dois antigénios dependentes do timo para os quais as células B que respondem funcionalmente residem totalmente na subsérie de células B Ly-1.

Exemplo F2. Ratinhos tratados com anti-IL-10 contêm células B convencionais fenotipica e funcionalmente normais.

Face ao efeito drástico do tratamento anti-IL-10 sobre as células B Ly-1, foi importante avaliar cuidadosamente a situação das células B convencionais nestes animais. Conforme estabelecido atrás, o número total de células brancas nos baços de animais tratados com anti-IL-10 ou animais testemunha não diferiram significativamente em 24 experiências independentes. A Figura 24 mostra que as proporções de células B220+, células T CD3+ e células nãoB/nãoT (B220-CD3-) não diferem em qualquer um dos quatro grupos experimentais de ratinhos. Dados equivalentes fora, obtidos quando células B Ig+ ou células T CD4+ foram comparadas. Estes dados indicam que o número total de células B do baço em ratinhos tratados com anti-IL-10 são iguais aos dos outros grupos testemunha. A imunocompetência das células B convencionais em ratinhos tratados com anti-IL-10 foi testadas em dois dias. Primeiro, os ratimhostratados com anti-IL-10 desenvolveram anticorpos IgM e IgG normais como resposta à injecção de antigénios dependentes do timo TNP-KLH (Figura 28). Respostas secundárias a TNP-KLH foram também normais nos ratinhos tratados com anti-IL-10. Segundo, as células B do baço de ratinhos tratados com anti-IL-10 desenvolveram respostas proliferativas normais in vitro a 50 pg/ml de LPS ou anticorpos anti-IgM (Tabela Fl). As respostas proliferativas de fundo das células do baço para os ratinhos tratados com anti-IL-10 foram frequentemente três a cinco vezes superiores às dos controlos (Tabela Fl). Colectivamente, estes dados sugerem que as células B convencionais nos ratinhos tratados com anti-IL-10 são quantitativamente e funcionalmente indistintas das dos ratinhos testemunha.

Tabela Fl. Resposta proliferativa in vitro das células do baço de ratinhos tratados com anti-IL-10 e ratinhos testemunha a estimulação com LPS, anti-IgM e anti-CD3.

Grupo de animais* [3H] timidina +0 +LPS +anti-IgM +anti-CD3 cpm Não tratados 224 22570 3346 90093 PBS 320 42298 3821 115692 J5/D 547 46748 2897 135172 SXC.l 2779 61609 7218 96389

Os animais foram tratados desde o nascimento até às 8 semanas de idade como descrito na Figura 1. O conjunto de células do baço a 2x 106/ml obtidas a partir de três ratinhos em cada grupo foram cultivados durante 3 dias em meio sem aditivos ou em meio suplementado com LPS (50 mg/ml), anticorpos de cabra anti-IgM de ratinho (50 mg/ml) ou anticorpos de hamster anti--CD3 de ratinho (5 mg/ml). Para a estimulação anti-CD3, o anticorpo foi usado para revestir a placa de microtitulação antes da adição das células do baço. A proliferação foi avaliada através da incorporação de [3H]timidina, após um pulso de 16h com 1 mCi/alvéolo de [3H]timidina (NET 027; New England Nuclear, Boston, MA).

Exemplo F3. Mecanismo de eliminação de células B Lv-1

Ensaios de proliferação. As células do baço reunidas a 2x106 células/ml obtidas a partir de três ratinhos década grupo foram cultivadas durante 3 dias em meio sozinho ou meio suplementado com LPS (50 pg/ml), anticorpos de cabra anti-IgM de ratinho (0611-0201; Cappel Laboratories, Chranville, PA) (50 pg/ml) ou anticorpos de hamster anti-CD3 de ratinho (cedido por D. J. Bluestone, University of Chicago, Chicago, IL) (5 pg/ml). Para a estimulação anti-CD3, o anticorpo foi usado para revestir a placa de microtitulação antes da adição das células do baço. A proliferação foi avaliada através da incorporação de [3H]timidina, após um pulso de 16 horas com 1 mCi/alvéolo de [3H]timidina (NET 027; New England Nuclear, Boston, MA).

Foram considerados vários mecanismos possíveis como explicação para a eliminação de células B Ly-1 em ratinhos tratados com anti-IL-10. Este efeito não pareceu envolver citotoxicidade selectiva das células B Ly-1 devida aos anticorpos anti-IL-10, uma vez que a injecção dos mesmos anticorpos em ratinhos adultos não teve efeito nas recuperações subsequentes de células de lavado peritoneal ou células B peritoneais totais (Figura 29) 1, 2 ou 3 dias mais tarde. Como explicação alternativa, considerámos a possibilidade da eliminação de células B reflectir uma consequência secundária da perturbação de um outra citocina endógena. De facto, encontrou-se que de um modo geral os ratinhos tratados com anti-IL-10 possuíam níveis séricos elevados de IFNy (Figura 30) uma observação que foi consistente com a capacidade anteriormente descrita de IL-10 para suprimir a produção de IFNy em células Thl e NK in vitro. Para testar a possibilidade deste aumento de IFNy induzido por anti-IL-10 ser directa ou indirectamente responsável pela eliminação de células B Ly-1, os ratinhos foram injectados desde o nascimento até à idade adulta com uma combinação de anti-IL-10 anticorpos neutralizantes anti-IFNy ou anti-IL-10 e um anticorpo de controlo de isotipo adequado. Os resultados mostraram que os anticorpos anti-IFNy (Figura 31), mas não o controlo do isotipo, reduziu substancialmente a capacidade de tratamento anti-IL-10 para eliminar as células B Ly-1 peritoneais dos ratinos. É importante notar que a administração continuada de anticorpos anti-IFNy sozinhos ou a combinação de; anticorpos anti-IL-10 mais anti-IFNy, não altera a recuperação de células totais de lavagem peritoneal de ratinhos tratados com anti-IL-10 ou com o controlo do isotipo. Estes dados apoiam o conceito de que a eliminação de células B Ly-1 é pelo menos em parte uma consequência do aumento de IFNy em ratinhos tratados com anti-IL-10.

Estudo G. Situação imunológica modificada dos ratinhos tratados com IL-10

Sumário

Demonstrou-se atrás que o tratamento contínuo de ratinhos desde o nascimento até à idade adulta com anticorpos neutralizantes anti-IL-10 conduz a uma eliminação específica de células Ly-1, enquanto que as células B convencionais permanecem normais em termos de número, fenótipo e função, ver Study F. Prolongando a caracterização destes animais, estes resultados mostram

que os ratinhos tratados com anti-IL-10 podem ser distinguidos dos ratinhos não tratados ou tratados com o controlo do isotipo de acordo com outros critérios. Os ratinhos tratados com anti-IL-10 continham níveis substancialmente elevados de TNFa circulante e em muitos casos IL-6 circulante e eram profundamente susceptíveis à morte por choque induzido com LPS, uma reacção inflamatória mediada por monocinas. A análise dos níveis de imunoglobulinas séricas revelou um decréscimo dos níveis séricos de IgA para acompanhar a redução anteriormente descrita da IgM sérica, mais um aumento drástico dos níveis de IgG2a e IgG2b. Outros estudos sobre a eliminação de células B Ly-1 de ratinhos tratados com IL-10 revelou que este efeito foi transitório conforme evidenciado pelo retomo das células B Ly-1 aos números normais 8 semanas após paragem do tratamento anti-IL-10. Encontrou-se que a eliminação de células B Ly-1 que ocorreu durante o tratamento com anti-IL-10 foi compensada por um aumento das células T peritoneais e granulócitos. Finalmente, se bem que os ratinhos tratados com IL-10 tenham sido iincapazes de produzir anticorpos contra fosfòrilcolina e al,3-dextrano, eles desenvolveram respostas de anticorpos normais após injecções intraperitoneais de TNP-Ficoll. Este resultado sugere a existência de subcategorias dentro da família dos antigénios polissacáridos independentes do timo tipo II. Estes dados são discutidos dentro do contexto das suas implicações para os papéis de IL-10 e das células B Ly-1 no sistema imunitário. O sistema imunitário é regulado por uma família das glicoproteínas solúveis designadas citocinas que são produzidas por uma variedade de células hemopoi éticas e não hemopoiéticas. A caracterização exaustiva in vitro destes imuno-reguladores ao longo dos últimos cinco anos conduziu ao conceito de pleiotropia funcional extensa e redundância dentro do sistema de citocinas. Os imunologistas têm pela frente o desafio de avaliar se este conceito reflete com precisão os papéis fisiológicos das citocinas in vivo. O papel fisiológico da - 124 - citocina recentemente descoberta IL-10 foi estudado. Uma extensa lista de propriedades in vitro caracteriza IL-10 como um imuno-supressor forte capaz de regular negativamente a produção de várias monocinas e citocinas e de inibir a apresentação de antigénio por algumas, mas não todas as células apresentadoras de antigénio. Uma lista igulamente longa de propriedades estimuladores indicam a mesma citocina como um co-estimulador de crescimento de timócitos, células T periféricas, células B e mastócitos; um amplificador do desenvolvimento e função de células T citotóxicas; e um indutor da viabilidade e diferenciação de células T; e um indutor da viabilidade e diferenciação das células. Para avaliar o papel fisiológico de IL-10 in vivo, os ratinhos foram injectados duas a três vezes por semana desde o nascimento até à idade adulta com anticorpos monoclonais neutralizantes anti-IL-10. Uma análise inicial revelou que este tratamento conduz a uma eliminação drástica de uma subsérie pouco abundante de linfócitos B, designados células B Ly-1 ou B-l, implicando assim IL-10 como um regulador do desenvolvimento de células Ly-l/B-1.

As células B Ly-1 são uma subpopulação de linfócitos B que são altamente prevalentes nos tecidos linfóides fetais e neonatais do homem e ratinho, mas que são encontradas em pequenos números apenas no sistema imunitário adulto. Apesar de dificilmente detectáveis em tecidos linfóides adultos primários e secundários, as células B Ly-1 estão grandemente enriquecidas nas cavidades peritoneal e pleural de um ratinho adulto e encontram-se em pequenos números na circulação do homem adulto. A sua caracterização extensiva no sistema de ratinho revelou numerosas propriedades intrigantes, incluindo um reportório restricto de anticorpos de baixa afinidade que não sofrem facilmente mutação somática e que dão extensa reactividade cruzada com auto-antigénios e componentes da parede bacteriana.. Ainda, experiências de reconstituição em ratinhos indicaram que, ao contrário das células B convencionais, as células B Ly-1 são capazes de se auto-renovarem durante toda a vida do hospedeiro e geram a maior parte da IgM sérica e a resposta de anticorpos total a va'rios determinantes bacterianos tais como fosforilcolina e al,3-dextrano. A caracterização anterior de células B Ly-1 demonstrou que podem ser aida distinguidas das células B convencional com base numa produção de IL-10 induzível grandemente aumentada, colocando a possibilidade de um papel imuno-regulador vasto para estas células. Apesar destas propriedades estranhas, o papel preciso das células B Ly- 1 no sistema imune permanece obscura.

Os ratinhos que foram tratados continuamente desde o anscimento até à idade adulta com anticorpos neutralizantes anti-IL-10 ficaram sem células B Ly-1 conforme evidenciado pela sua ausência de células B peritoneais e o facto de terem drasticamente reduzido os níveis séricos de IgM e as respostas de anticorpos in vivo a al,3-dextrano e fosforilcolina. Encontrou.-se que a eliminação de células B Ly-1 é uma consequência secundária do aumento de IFNy endógeno e poderá ser evitada através da co-administração de anticorpos anti-IFNy. As consequências da eliminação específica de células B Ly-1 e da IL-10 endógena na subsequente situação imunitária destes ratinhos é aqui descrita.

Exemplo Gl. Efeito do tratamento anti-IL-10 sobre os níveis de citocinas endógenas em ratinhos.

Ratinhos. Ratinhos BALB/c prenhes a meio do tempo foram adquiridos à Simonsen Laboratory (Gilroy, CA).

Tratamento anti-IL-10. 5 a 10 ratinhos BALB/c da mesma idade foram injectados intraperitonealmente com um dos dois anticorpos anti-IL-10 desde o nascimento até às 8 semanas de idade de acordo com os protocolos que seguem. Nalgumas experiências, os ratinhos foram injectados três vezes por semana com anticorpo IgM de rato SXC.l anti-IL-10 de ratinho, ver Mosmann et al., (1990) J. Immunol. 145:2938-2945, (0,2 mg/injecção durante a semana um, 0. 5 mg/injecção durante a semana 2, 1,0 mg/injecção durante as semanas 3 a 8), quantidades equivalentes de um controlo do isotipo designado J5/D ou volumes equivalentes (100 ou 200 μΐ) de tampão de fosfatos salino (PBS). Noutras experiências, os ratinhos foram injectados duas vezes por semana com 2A5, um anticorpo IgGl de rato anti-IL-10 de ratinho (0,2 mg/injecção durante a semana 1, 0,5 mg/injecção durante a semana 2, 1 mg/injecção durantes as semanas 3 a 8), quantidades equivalentes de um controlo do isotipo designado GL113 ou volumes equivalentes (100 ou 200 μΐ) de tampão de fosfatos salino (PBS). Ratinhos BALB/c da mesma idade não tratados foram incluídos em todas as experiências para comparação. Todos os anticorpos foram obtidos a partir de sobrenadantes de hibridoma sem soro e purificados por precipitação com sulfato de amónio. Após este regime de tratamento, os baços, timos, nódulos linfáticos e células das lavagens peritoneais reunidos foram colhidos de cada um dos quatro grupos de ratinhos e analisados por citometria de fluxo ensaios funcionais. ELISAs para citocinas. Amostras de soros colhidas a partir de ratinhos tratados com anti-IL-10 ou ratinhos testemunha foram testados relativamente a TNFa de ratinho ou IL-6 de ratinho usando ELISAs específicas de citocinas. O tratamento contínuo de ratinhos anti-IL-10 desde o nascimento até à idade adulta leva à presença de quantidades substanciais de IFNy nos soros colhidos às 8 semanas, ao contrário dos ratinhos não tratados ou tratados com o controlo do isotipo, ambos sem níveis detectáveis de IFNy nos seus soros. Para explorar melhor as perturbações de citocinas endógenas resultantes do tratamento anti-IL-10, os soros colhidos após 8 semanas de tratamento foram avaliados quanto à presença de TNFa e IL-6, usando ELISAs específicas das citocinas. Os soros de ratinhos tratados com anti-IL-10 continham níveis de TNFa - 127- grandemente aumentados (Figura 32) e frequentemente continham níveis de IL-6 elevados (Figura 33). O aumento de TNFa e IL-6 nos ratinhos tratados com anti-IL-10 é consistente com a capacidade de suprimir a produção de monocinas in vitro descrita para IL-10.

Exemplo G2. Efeito do tratamento anti-ILlO nos níveis séricos de

Ig de ratinho

Choque induzido por endotoxinas. Os ratinhos foram injectados intraperitonealmente com doses de endotoxina (lipopolissacáridos de Escherichia coli serotipo 011:B4, Sigma Chemical Co.) variando entre 1 pg e 500 pg. A sobrevivência foi controlada ao longo de um período de 1-6 dias. O efeito do tratamento anti-IL-10 nos níveis de monocinas endógenas foi ainda analisado avaliando a susceptibilidade destes animais ao choque induzido por LPS, uma reacção inflamatória mediada por monocinas. Resultados apresentados anteriormente mostraram que os anticorpos monoclonais neutralizantes contra TNFa, IL-1 ou IL-6 e um antagonista fisiológico de IL-1 designado IL-1 Ra, protegem eficazmente os ratinhos do choque induzido por LPS. As experiências indicaram que os ratinhos injectados com os anticorpos anti-IL-10, SXC.l (IgM de rato) ou 2A5 (IgGl de rato), desde o nascimento até às 8 semanas eram profundamente susceptíveis à morte por choque induzido com LPS (Figura 34). Se bem que a LD100 para LPS nos ratinhos BALB/c de 8 semanas de idade nas instalações para animais da DNAX fosse >380 pg/ratinho i.p., 1 pg de endotoxina matou quase todos os ratinhos tratados com anti-IL-10 (Figura 34). Ainda não foi determinado o mecanismo preciso para este aumento de susceptibilidade, mas os dados são consistentes com uma regulação positiva generalizada das monocinas inflamatórias nos ratinhos tratados com anti-IL-10. - 128- ELISAs para anticorpos. As amostras de soros colhidas após 8 semanas de tratamento foram testadas quanto à presença de imunoglobulinas de ratinho de todos os isotipos usando ELISAs tipo sanduíche específicas de isotipo. Os anticorpos ligados às placas empregues para esta finalidade foram os seguintes: anticorpos de rato anti-IgGl de ratinho (3096, generosamente fornecidos por R. Coffman, DNAX); anticorpos de rato anti-IgG2a de ratinho (R8-103; Pharmingen, San Diego, CA); anticorpos de rato anti-IgG2b de ratinho (R9--91, Pharmingen); anticorpos de rato anti-IgG3 deratinho (R2-38, Pharmingen); anticorpos de rato anti-IgA de ratinho (R5-140, Pharmingen); anticorpos de rato anti-IgE de ratinho (EM95, generosamente fornecido por R. Coffman). Os anticorpos para revestimento de placas foram usados a 1-5 pg/ml. Os anticorpos da sanduíche usados nestas ELISAs foram anticorpos de rato biotinilados anti-IgGl de ratinho (3098B, graciosamente fornecidos por R. Coffman); anticorpos de rato biotinilados anti-IgG2a de ratinho (R19-15, Pharmingen); anticorpos de rato biotinilados anti-IgG2b (RI2-3, Pharmingen); anticorpos de rato biotinilados anti-IgG3 de ratinho (R40-82, Pharmingen), anticorpos de rato biotinilados anti-IgA de ratinho (2740B, generosamente fornecidos por R. Coffman); anticorpos de rato biotinilados anti-IgE de ratinho 8R35-118, Pharmingen). Estes anticorpos da sanduíche foram usados a 1-3 μ g/ml, conjuntamente com peroxidase de rábano silvestre conjugado com estreptavidina (CalBiochem, La Jolla, CA) mais 1 mg/ml de substrato [2,2-azinobis(ácido 3-etilbenzotiasolinsulfurico); Sigma]. Os ELISAs foram quantificados usando imunoglobulinas purificadas de mieloma de ratinho. O tratamento contínuo de ratinhos com anti-IL-10 desde o nascimento até à idade adulta conduziu a uma redução marcada dos níveis de IgM sérica comparado com os níveis de IgM séricos normais observados nos ratinhos tratados com o controlo do isotipo. A medição dos outros isotipos de imunoglobulina nos soros colhidos após 8 semanas de tratamento está apresentado na Figura 35. Os níveis de cada um dos isotipos de imunoglobulina nos três grupos de ratinhos testemunha (i.e. não tratados, tratados com PBS ou tratados com um anticorpo controlo do isotipo) não variaram significativamente das gamas anteriormente documentadas para os níveis de Ig séricas em ratinhos normais. No entanto, foram observadas numerosas alterações nos níveis de Ig sérica em ratinhos tratados com anti-IL-10. Estes ratinhos mostraram uma redução marcada nos níveis séricos de IgA semelhante à redução previamente descrita para a IgM sérica e um aumento drástico de IgG2a e ^Θ2β (Figura 35). Os restantes isotipos (IgGl, IgG3, IgE) ficaram inalterados ou aumentaram duas a quatro vezes nalgumas experiências.

Exemplo G3. A eliminação de células B Lv-1 em ratinhos tratados com anti-IL-10 é transitória.

Imunofluorescência. As células lavadas foram coradas com combinações dos seguintes reagentes: anticorpo fluoresceinado anti-IgM de ratinho (DS-1, Pharmingen, San Diego, CA); anticorpo de rato biotinilado anti-IgD de ratinho (ll-26c, produzido por J. Keamey, U. Birmingham, Ala.); anticorpo fluoresceinado anti-CD3 de ratinho (145-2C11, Boehringe-Mannheim, Indianapolis, IN); anticorpo biotinilado anti-B220 de ratinho (RA3-6B2; Caltag, S.F.); e um anticorpo de rato biotinilado anti-granulócitos/eosinófilos de ratinho (8C5; produzido por R. Coffman, DNAX). Os reagentes biotinilados foram usados conjuntamente com estreptavidina conjugado com ficoeritrina (Becton-Dickinson, Mountais View, CA). As células foram analisadas usando um FACScan e as células mortas foram excluídas com base no ângulo directo e no desvio lateral. Os resultados mostram as intensidades de fluorescência de 5000 células vivas contadas para cada grupo experimental.

Os ratinhos tratados com anti-IL-10 foram avaliados após paragem do tratamento anti-IL-10 para determinar se a eliminação de células B Ly-1 nestes animais era irreversível. Vários grupos de ratinhos foram injectados com anticorpos anti-IL-10 desde o nascimento até às 8 semanas de idade, após o que se parou o tratamento. Cada um dos grupos foi então analisado relativamente à presença de células B Ly-1 peritoneais imediatamente ou em tempos diferentes durante as 8 semanas após o termo do tratamento. E importante que não se observaram diferenças significativas nos rendimentos das células totais das lavagens peritoneais colhidas aos diferentes tempos. Em várias experiências desta natureza os ratinhos permaneceram sem células B Ly-1 peritoneais durante as 3 semanas iniciais após o termo do tratamento anti-IL-10. Após aquele intervalo de tempo, as células B Ly-1 começaram a aparecer na cavidade peritoneal, com um complemento normal de células B Ly-1 observado às 8 semanas após findo o tratamento anti-IL-10 (Figura 36). A reconstituição do compartimento de células B peritoneais foi caracterizado por um aparecimento inicial de células B B220brilhanteIgMdull aproximadamente 4 semanas após o tratamento anti-IL-10 ter parado, seguido algumas semanas mais tarde do aparecimento de células B B220dullIgMbrilhantes (Figura 36).

Exemplo G4. Aumento dos números de células T e granulócitos peritoneais em ratinhos tratados com anti-IL-10

Contagens diferenciais de células hemopoiéticas. Suspensões celulares derivadas dos baços e de lavagens peritoneais foram usadas para preparar sedimentos de células em lâminas para análise da morfologia celular. As amostras foram coradas com Wright's-Giemsa (Sigma, St. Louis) e analisadas pormicroscopia relativamente alinfócitos, macrófagos, granulócitos, eosinófilos e mastócitos.

Apesar dos ratinhos tratados continuamente desde o nascimento até às 8 semanas deidade ficarem sem células B peritoneais, o número total de células da lavagem peritoneal obtido de tais ratinhos não variou significativamente relativamente aos ratinhos testemunha. As contagens diferenciais de células hemopoiéticas realizadas nas células da lavagem peritoneal colhidas de ratinhos tratados com anti-IL-10 indicou que isto reflecte um aumento nos granulócitos/eosinófilos e aparentemente linfócitos não B (Tabela Gl). A fenotipagem com marcadores desuperficie das células da lavagem peritoneal dos ratinhos tratados com anti-IL-10 revelou aumentos das células Ig-negativas Ly-1 brilhante (Figura 37C), células Ig-negativas CD3-positivas, células Macl- right, Ig-negativas (Figura 38) e células 8C5-brilhante Ig-negativas. Estas análises indicam um aumento de linfócitos T Ly-1 -positivos, CD3-positivos e confirmam (Tabela Gl) um aumento nos granulócitos que expressam as marcas de superfície Macl e 8C5.

TABELA I: PROPORÇÕES DE SUBPOPULAÇÕES DE CÉLULAS HEMATOPOIÉTICAS EM RATINHOS TRATADOS COM ANTI-IL-10 OU EM RATINHOS TESTEMUNA

Linfó citos Macró- fagos Neutró- filos Eosinó- filos Mastó- citos Peritoneu* Não tratado 74 22 1,8 1,7 0,5 Tratado PBS 66 29 1,4 34,3 0,3 Tratado controlo 64 31 1,2 4,5 0,3 do isotipo Tratado anti-IL-10 44 22 18,0 16,0 0 Baco1 Não tratado 94 2,7 2,3 0,5 0 Tratado PBS 92 3,6 6,6 1,4 0 Tratado controlo 96 1,2 1,8 0,6 0 do isotipo Tratado anti-IL-10 92 2,4 5,0 0,9 0

Todos os grupos tinham aproximadamente o mesmo número de células peritoneais e do baço/ratinho; os números representam percentagem de células totais contadas)

Exemplo G5. Ratinhos tratados com anti-IL-10 respondem ao antigénio TNP-Ficoll independente do timo.

Respostas específicas de anticorpos. As respostas específicas de anticorpos contra TNP-Ficoll foram determinadas após injecção intraperitoneal dos ratinhos com 10 pg de TNP-Ficoll (Proporcionado pelo Dr. James Mond, USUHS) e colheita dos soros 5 ou 10 dias mais tarde. As injecções com anticorpos anti-IL-10 anti-IL-10 ou com anticorpo testemunha continuaram entre a exposição ao antigénio e a colheita do soro. Os anticorpos específicos de TNP foram quantificados usando um ELISA.

Os ratinhos tratados com anti-IL-10 são deficientes na sua capacidade para induzir respostas de anticorpos in vivo a dois antigénios tipo II independentes do timo, fosforilcolina e al,3-dextrano. A Figura 39 indica que os ratinhos tratados com anti-IL-10 desenvolvem in vivo respostas normais de anticorpos contra um terceiro antigénio tipo II independente do timo TNP-Ficoll. Esta resposta é consistente com as nossas observações anteriores de que as células B do baço de ratinhos tratados com anti-IL-10 desenvolvem uma resposta proliferativa normal após estimulação com anticorpos anti-IgM, o presumível análogo policlonal de antigénios tipo II independentes do timo.

Estudo Η. A administração contínua de anticorpos anti-IL-10 retarda o estabelecimento de auto-imunidade em ratinhos NZB/W

Sumário A administração contínua de anticorpos anti-IL-10 a ratinhos BALB/c modifica os níveis endógenos de auto-anticorpos, plex TNFa e IFNy, três imunomediadores que se sabe afectarem o desenvolvimento de auto- - 133 - imunidade em ratinhos NZB/W "predispostos para lupus". Para explorar as consequências da neutralização de IL-10 em ratinhos NZB/W, os animais foram injectados 2-3 vezes por semana desde o nascimento até aos 8-10 meses com anticorpos anti-IL-10 ou com anticorpos para controlo do isotipo. O tratamento com anti-IL-10 retardou substancialmente o estabelecimento de auto-imunidade em ratinhos NZB/W conforme controlado pela sobrevivência global como pelo desenvolvimento de proteinúria, nefrite renal ou auto-anticorpos. A sobrevivência aos 9 meses foi aumentada de 10% para 80% nos ratinhos tratados relativamente aos controlos. Esta protecção contra a auto-imunidade pareceu ser devida a uma regulação positiva, induzida por anti-IL-10, do TNFa endógeno, uma vez que os ratinhos NZB/W protegidos desenvolveram rapidamente auto-imunidade quando foram introduzidos anticorpos neutralizantes anti-TNFa às 30 semanas nos ratinhos tratados com anti-IL-10 a longo prazo. Estes dados indicam que os antagonistas de IL-10 serão benéficos no tratamento de lupus eritematoso sistémico humano. O ratinho híbrido (NZB x NZW) F1 desenvolve uma doença auto-imune grave que se assemelha muito ao lupus eritematoso sistémico em humanos. Os ratinhos NZB/W desenvolvem espontaneamente uma glomerulonefrite fatal mediada por complexos imunes por volta dos 6-9 meses em animais fêmea e 12-18 meses em animais macho. Tentativas anteriores para definir a causa subjacente à auto-imunidade em ratinhos NZB/W tem focado o papel potencial dos genes MHC. De facto, o interferão γ (IFNy), uma citocina que regula positivamente a expressão dos antigénios MHC classe II numa grande variedade de tipos celulares, acelera o desenvolvimento da auto-imunidade em ratinhos NZB/W. Vários estudos recentes sugeriram que o gene TNFa, que está situado dentro do complexo MHC, pode estar envolvido na patogénese de nefrite provocada por lupus em ratinhos NZB/W. Estes estudos revelaram que os ratinhos NZB/W produzem níveis excepcionalmente baixos de TNFa e que isto está correlacionado com um polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição no gene j de TNFa e com um polimorfismo em repetições em tandem de dinucleótidos na região reguladora 5' do gene de TNFa. A importância destas observações é apoiada pelo facto da terapia de substituição com TNFa recombinante retardar significativamente o desenvolvimento de nefrite em ratinhos NZB/W. IL-10 é uma citocina produzida por subséries de células T activadas, células e macrófagos, os quais medeiam uma variedade de propriedades imuno-estimuladoras e imuno-supressoras no ratinho e no homem em ensaios in vitro. Num esforço recente para avaliar o papel fisiológico de IL-10, ratinhos BALB/c foram tratados continuamente desde o nascimento até às 8 semanas de idade com anticorpos neutralizantes anti-IL-10. Consistente com as propriedades in vitro conhecidas de IL-10, ratinhos tratados com anti-IL-10 são caracterizados por níveis elevados de IFNy e TNFa endógenos. IFNy elevado por sua vezconduz à eliminação de uma subsérie numericamente pequena de linfécitos B, designados células B Lyl ou CD5 ou B-l, uma população da qual deriva a maior parte dos auto-anticorpos. Estes estudos em ratinhos normais sugerem que a neutralização de IL-10 pode produzir algumas consequências desejáveis em ratinhos NZB/W, i.e., aumento de TNFa endógeno e redução da produção de auto-anticorpos e algumas consequências indesejáveis, i.e., aumento do IFNy endógeno. Estuda-se aqui os efeitos globais deste tratamento contínuo anti-IL-10 sobre o desenvolvimento de auto-imunidade em ratinhos fêmea NZB/W. Os resultados sugerem que a neutralização de iL-10 retarda significaiivamente o estabelecimento de auto-imunidade nestes ratinhos devido a uma regulação positiva de TNFa endógeno.

Ratinhos. Ratinhos NZB/W F1 foram reproduzidos no biotério do DNAX Research Institute usando fêmeas NZB adquiridas à Jackson Laboratory - 135- (Bar Harbor, ME) e os machos NZW foram adquiridos à Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Apenas os ratinhos fêmea F1 foram utilizados devido ao rápido estabelecimento da auto-imunidade apresentado.

Tratamento anti-IL-10. Grupos de 17-23 ratinhos fêmea B/W F1 foram tratados com um mAb IgM ou mAb IgG de rato contra IL-10, designado SXC.l ou JES 2A5. 21-23 ratinhos fêmea B/W F1 com a mesma idade por grupo foram tratados com mAbs testemunha do isotipo correspondente, designados J5/D (IgM) ou GL113 (IgG). Os mAbs anti-IL-10 e os mAbs para controlo do isotipo foram colhidos como ascistes de ratinhos labro (nu/nu), purificados por duas precipitações diferenciais com sulfato de amónio, dialisados contra tampão de fosfatos salino (PBS) e quantificados por electroforese de proteínas e medição da densidade óptica. O tratamento consistiu em 3 partes: (a) desde o nascimento até à Ia semana, 0,2 mg de mAb por ratinho foi injectado intraperitonealmente (i.p.) 4 vezes em IgM ou duas vezes em IgG, (b) 2a semana 0,5 mg de mAb por ratinho foi injectado i.p. 3 vezes com IgM ou duas vezes com IgG e (c) desde a 3a semana até à idade adulta 1 mg de mAb por ratinho foi injectado i.p. 3 vezes com IgM ou duasvezes com IgG por semana. Estudos preliminares, indicaram que este regime poderá manter a concentração de IgM de rato em soro de ratinhos à volta de 50 pg/ml.

Avaliação da doença renal. Mediu-se a proteinúria colorimetrica-mente usando bastonetes Albustix (Miles Laboratores, Inc., Elkhart, IN) e graduado de acordo com o seguinte código: vestígios= 10 mg/dl; 1+ = 30 mg/dl; 2+ = 100 mg/dl; 3+ = 300 mg/dl 4+ = 1,000 mg/dl. A gravidade histológica da glomerulonefrite foi graduada numa escala de 0 a 2+ com base na intensidade e grau de alterações histopatológicas, 0 = rins sem lesões glomerulares; 1+ = lesões suaves, e.g. matriz mesangial aumentada, celularidade mesangial/glomerular, formação crescente ou presença de exudatos inflamatórios e adesões capsulares; sem moldes tubulares evidentes; 2+ = lesões graves, e.g., arquitectura glomerular obliterada em mais de 70% dos glomérulos com extensiva formação de moldes tubulares. ELISA para auto-anticorpos. Anticorpos séricos específicos para DNA de cadeia dupla ou simples (ds- ou ss-DNA) foram quantificados por ELISA, resumidamente, 5 mg/ml de ds- ou ss-DNA foi usado para cobrir placas de ELISA (Flow Laboratories, McLean, VA) numa incubação durante a noite a 4°C. As placas revestidas com antigénio foram subsequentemente bloqueadas durante 1 h com PBS contendo 0,05% de Tween 20, 0,02% de NaN3 e depois incubado durante 1 h à temperatura ambiente com os soros a testar ou com soros padrão diluídos a 1:100. As placas foram então lavadas com PBS0,05% Tween 20 e incubadas durante 1 h com 1 pg/ml de anticorpos anti-IgG ou anti-IgM de ratinho conjugados com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Zymed Laboratories, Inc. S. San Franscisco, CA). Mediu-se a absorvância usando um leitor de microplacas Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA) 30 min após a adição de 1 mg/ml de 2,2'-Azino-bis (ácido 3-etilbentiazolina-6-sulfónico); ABTS (Sigma Chemicals, St. Louis, MO). Os títulos de anti-DNA foram expressos como unidades, usando um padrão de referência consistindo num conjunto de soros reunidos de ratinhos MRL/MpJ-lpr-lpr de 4 meses de idade fornecido pelo Dr. Shelby Umland da Schering-Plough Corp. Uma diluição a 1:100 deste soro padrão foi assumida arbitrariamente como sendo 100 unidades/ml.

Concentração sérica de Ig e TNFa. Para ELISA de Ig, placas revestidas com 1 pg/ml de anticorpos de cabra anti-IgG de ratinho (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) foram incubados com soros dilui dos a 1:1000 ou 1:5000, depois com anticorpos de cabra anti-IgG ou anti-IgM conjugados com HRP (Zymed Laboratories, Inc.) e revelada a cor. As concentrações de IgG e de IgM, forma determinadas a partir de uma curva padrão construída incubando com concentrações conhecidas dos nossos lotes, os quais eram a mistura de proteínas de mieloma.

Para a ELISA de TNFa, as placas revestidas com 5 pg/ml de mAb anti-TNFa de ratinho (MP6-XT3.il) foram incubadas com os soros a testar diluidos a 1:10, em seguida com o mAb de rato anti-TNFa de ratinho (MP6-XT22) conjugado com HRP e revelada a cor.

Os requerentes depositaram culturas separadas de E. coli MC 1061 portadoras de pH5C, pH15C e pBCRFl(SRa) na Americn Type Culture Coollection, Rockville, MD, USA (ATCC), com os números de acesso 68191, 68192 e 68193, respectivamente. Estes depósitos foram feitos nas condições estabelecidas pela ATCC para depósitos de culturas para fins de patente, que assegura que o depósito estará disponível ao US Commissioner of Patents and Trademarks conforme 35 USC 122 e 37 CFR 1.14 e estará disponível ao público quando da publicação de uma patente U.S., a qual requere que o depósito seja mantido. A disponibilidade da estirpe depositada não deve ser pensada como uma autorização para realizar o invento em contravenção com os direitos garantidos sob a autoridade de qualquer governo de acordo com as leis sobre patentes. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Rene de Waal Malefyt, Di-Hwei Hsu, Anne 0'garra e Hergen Spits (ii) TÍTULO DO INVENTO: Utilização de Interleucina-10 para tratar o choque séptico (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA : (A) DESTINATÁRIO: Stephen C. Macevicz, DNAX Research Institute (B) RUA: 901 Califórnia Avenue (C) CIDADE:Palo Alto (D) ESTADO:Califomia

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 94304 (v) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquetes de 3,5 polegadas

(B) COMPUTADOR: Macintosh SE (C) SISTEMA OPERATIVO: Macintosh 6.0.1 (D) SOFTWARE: Microsoft Word 4.0 (vi) DADOS SOBRE O PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE ENTREGA: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS SOBRE PEDIDOS ANTERIORES: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE ENTREGA: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE PROCURADOR/AGENTE: (A) NOME: Stephen C. Macevicz (B) NÚMERO DE REGISTO: 30,285 (C) NÚMERO DA REFERÊNCIA/DOCKET: DX0221 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DAS SEQUÊNCIAS: -139- (A) COMPRIMENTO: 160 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:l:

Ser Pro Gli Gin Gli Tre Gin Ser Glu Asn Ser Cis Tre His Fen 5 10 15 Pro Gli Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Fen 20 25 30 Ser Arg Vai Lis Tre Fen Fen Gin Met Lis Asp Gin Leu Asp Asn 35 40 45 Leu Leu Leu Lis Glu Ser Leu Leu Glu Asp Fen Lis Gli Tir Leu 50 55 60 Gli Cis Gin Ala Leu Ser Glu Met Ile Gin Fen Tir Leu Glu Glu 65 70 75 Vai Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Asp Ile Lis Ala His 80 85 90 Vai Asn Ser Leu Gli Glu Asn Leu Lis Tre Leu Arg Leu Arg Leu 95 100 105 Arg Arg Cis His Arg Fen Leu Pro Cis Glu Asn Lis Ser Lis Ala 110 115 120 Vai Glu Gin Vai Lis Asn Ala Fen Asn Lis Leu Gin Glu Lis Gli 125 130 135

Ile Tir Lis Ala Met Ser Glu Fen Asp Ile Fen Ile Asn Tir Ile 140 145 150

Glu. Ala Tir Met Tre Met Lis Ile Arg Asn 155 160 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DAS SEQUÊNCIAS: (A) COMPRIMENTO: 147 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: - 140-

Tre Asp Gin Cis Asp Asn Fen Pro Gin Met Leu Arg Asp Leu Arg 5 10 15 Asp Ala Fen Ser Arg Vai Lis Tre Fen Fen Gin Tre Lis Asp Glu 20 25 30 Vai Asp Asn Leu Leu Leu Lis Glu Ser Leu Leu Glu Asp Fen Lis 35 40 45 Gli Tir Leu Gli Cis Gin Ala Leu Ser Glu Met Ile Gin Fen Tir 50 55 60 Leu Glu Glu Vai Met Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp Pro Glu Ala 65 70 75 Lis Asp His Vai Asn Ser Leu Gli Glu Asn Leu Lis Tre Leu Arg 80 85 90 Leu Arg Leu Arg Arg Cis His Arg Fen Leu Pro Cis Glu Asn Lis 95 100 105 Ser Lis Ala Vai Glu Gin Ile Lis Asn Ala Fen Asn Lis Leu Gin 110 115 120 Glu Lis Gli Ile Tir Lis Ala Met Ser Glu Fen Asp Ile Fen Ile 125 130 135 Asn Tir Ile Glu Ala Tir Met Tre Ile Lis Ala Arg 140 145

Lisboa, 10 de Fevereiro de 2000

JORGE CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES 1. A utilização de interleucina-10 ou um seu análogo, agonista ou antagonista na produção de uma composição farmacêutica para administração a um hospedeiro, de forma a modular a inflamação ou função imune mediada pelas células T num hospedeiro, em que a referida inflamação ou função imune mediada pelas células T é acompanhada de um nível anormal do factor de necrose tumoral alfa.
2. 2. A utilização da Reivindicação 1, em que a referida interleucina-10 ou um seu análogo, agonista ou antagonista, é usado na produção de uma composição farmacêutica para administração a um hospedeiro de forma a modular a inflamação, em que a referida inflamação é acompanhada de um nível anormal de factor de necrose tumoral alfa.
3. 3. Uma utilização da Reivindicação 1 ou Reivindicação 2, em que a interleucina-10 é usada na produção da referida composição.
4. 4. Uma utilização de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida administração também modula os níveis de interleucina-1 ou de interleucina-6.
5. 5. Uma utilização de qualquer uma das reivindicações anteriores. em que o referido nível anormal é elevado.
6. 6. Uma utilização de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido nível anormal é acompanhado de uma infecção micro-
7. 7. Uma utilização de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido nível anormal é acompanhado de febre, hipotensão, necrose dos tecidos, acidose metabólica ou disfunção de orgãos.
8. 8. Uma utilização da Reivindicação 6, em que a referida infecção microbiana provoca um estado de choque séptico, choque tóxico, meningite meningocóccica ou malária.
9. 9. Uma utilização de qualquer uma das Reivindicações 1 a 7, em que oreferido hospedeiro sofre de uma infecção bacteriana.
10. 10. Uma utilização da Reivindicação 9, em que a referida infecção bacteriana é por uma bactéria Gram-negativa.
11. 11. Uma utilização da Reivindicação 10, em que o referido hospedeiro apresenta sintomas de choque séptico.
12. 12. Uma utilização da Reivindicação 9, em que a referida infecção bacteriana é por uma bactéria Gram-positiva.
13. 13. Uma utilização da Reivindicação 12, em que o referido hospedeiro apresenta sintomas de choque tóxico.
14. 14. A utilização da interleucina-10 na produção de uma composição farmacêutica para tratamento de choque séptico num hospedeiro.
15. 15. Uma utilização de interleucina-10 na produção de uma composição farmacêutica para tratamento de choque térmico num hospedeiro. -3 -
16. 16. A utilização de um antagonista da interleucina-10 na produção de uma composição farmacêutica para tratamento de uma perturbação auto-imune num hospedeiro.
17. 17. Uma utilização da Reivindicação 16, em que a referida perturbação auto-imune é mediada pelas células B.
18. 18. Uma utilização da Reivindicação 16, em que a referida perturbação auto-imune é mediada por TNFa.
19. 19. Uma utilização de qualquer uma das Reivindicações 16 a 19, em que oreferido antagonista da interleucina-10 é uma molécula de anticorpo.
20. 20. Uma utilização da Reivindicação 19, em que a referida molécula de anticorpo é capaz de se ligar à interleucina-10.
21. 21. Uma utilização de qualquer uma das Reivindicações 16 a 20, em que a referida administração modula pelo menos um de entre factor de necrose tumoral alfa, interleucina-6 ou interleucina-1.
22. 22. Uma utilização de qualquer uma das Reivindicações 16 a 19, em que o referido hospedeiro é um ratinho.
23. 23. Uma utilização da Reivindicação 22, em que ao referido ratinho é um ratinho NZB/W. Lisboa, 10 de Fevereiro de 2000

    Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA