PT534858E

PT534858E - Amplificacao selectiva de fragmentos de restricao um metodo geral para a obtencao de "impressoes digitais" do adn

Info

Publication number: PT534858E
Application number: PT92402629T
Authority: PT
Inventors: Marc Zabeau; Pieter Vos
Original assignee: Keygene Nv
Priority date: 1991-09-24
Filing date: 1992-09-24
Publication date: 2000-09-29
Also published as: PT969102E; GR3033895T3; DK0534858T4; AU2662992A; ES2299229T3; CZ291877B6; HU223760B1; DE69230873T3; FI941360A0; EP0534858B2; FI115402B; DE69233719D1; FI113184B; IL103267A; RU2182176C2; AU672760B2; ATE191510T1; DK0534858T3; EP0534858B1; JP4088403B2

Description

534 SSg

DESCRIÇÃO

AMPLIFICAÇÃO SELECTIVA DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO: UM MÉTODO GERAL PARA A OBTENÇÃO DE “IMPRESSÕES DIGITAIS” DO ADN

1. ÂMBITO DA INVENÇÃO

Esta invenção está relacionada com aplicações das “impressões digitais” do ADN e com a utilização de marcadores do ADN em várias áreas diferentes, incluindo, mas não estando limitadas a, criação de animais e produção de plantas, identificação de variedades ou cultivares, medicina de diagnóstico, diagnóstico de doenças em plantas e animais, identificação de doenças transmitidas geneticamente em seres humanos, análise de relações de parentesco, análise forense e tipagem microbiana.

Mais especificamente, esta invenção está relacionada com métodos para a obtenção de “impressões digitais” do ADN e para a detecção de marcadores específicos do ADN em genomas que variam de microrganismos a plantas, animais superiores e seres humanos. A invenção está também relacionada com moléculas sintéticas de ADN e com produtos baseados nelas que são usados nos métodos da invenção, nas diferentes áreas de aplicação.

2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

2.1 Obtenção de “impressões digitais” do ADN A obtenção de “impressões digitais” do ADN ou tipagem do ADN, assim como outros métodos de genotipagem, obtenção de perfis e análise de identificação do ADN referem-se à caracterização quer de semelhanças, quer de uma ou mais características distintas na constituição genética, ou genoma, de um indíviduo, de uma variedade ou raça ou de uma espécie. A regra geral é que quanto mais próxima for a relação genética, maior é a identidade ou, mais apropriado, a semelhança dos genomas e, consequentemente, serão mais raras características distintas no genoma. Estas características semelhantes ou distintas podem ser reveladas por análise do ADN de um organismo, após hidrólise do ADN com uma endonuclease de restrição. As endonucleases de restrição são enzimas que reconhecem sequências curtas de nucleótidos, geralmente com um comprimento entre 4 e 8 bases, e cortam as duas cadeias do ADN, produzindo, assim, fragmentos de 1 ADN com um comprimento discreto. Devido ao seu elevado grau de especificidade para as sequências, as endonucleases de restrição cortarão as moléculas de ADN de uma forma muito específica. O resultado é a produção de um conjunto reprodutível de fragmentos de ADN. Os fragmentos de ADN podem ser fraccionados, de acordo com o seu tamanho, em matrizes porosas, ou géis, originando padrões típicos de bandas que constituem uma “impressão digital” do ADN da constituição genética do organismo.

2.2 Polimorfismos do ADN

Quando se comparam as “impressões digitais” de espécies, variedades ou raças com uma relação muito próxima, as “impressões digitais” do ADN podem ser idênticos ou muito semelhantes. Quando se observam diferenças em “impressões digitais” do ADN que, de outra forma, são idênticas, essas diferenças são denominadas polimorfismos do ADN: estes são novos fragmentos de ADN que aparecem numa “impressão digital”. Diz-se que o ADN é polimórfico nessa posição, e o novo fragmento de ADN pode ser usado como um marcador do ADN. Os polimorfismos do ADN detectados em “impressões digitais” do ADN, obtidos por cortes com enzimas de restrição, podem resultar de qualquer uma das seguintes alterações na sequência do ADN: mutações que eliminam o local de restrição da endonuclease de restrição, mutações que criam novos locais de restrição, inserções, eliminações ou inversões entre os dois locais de restrição.

Estes polimorfismos do ADN são geralmente denominados RFLP, polimorfismo dos fragmentos de restrição (“Restriction Fragment Length Polymorphisms"). Estas alterações mutacionais comportar-se-ão como marcadores genéticos genuínos quando são transmitidos de uma forma mendeliana. Consequentemente, os polimorfismos do ADN podem ser usados como marcadores genéticos de uma forma muito semelhante a outros marcadores genéticos: na análise de ascendências, em estudos genéticos sobre a transmissão de traços característicos, na identificação de indivíduos.

2.3 Técnicas para a obtenção de “impressões digitais” do ADN

Para quase todos os organismos vivos, com excepção dos vírus, as digestões de restrição do ADN genómico total dos organismos originam tantas bandas que não é possível registar bandas individuais. Assim, todos os métodos para a obtenção de “impressões digitais” do ADN se baseiam no princípio de que só se visualiza uma pequena fracção dos 2 fragmentos de ADN, de forma a originar um perfil simples de bandas que constitui a “impressão digital" do ADN. O método mais amplamente utilizado envolve digerir o ADN do organismo com endonucleases de restrição, fraccionar os fragmentos de restrição por electroforese em gel, transferir e ligar os fragmentos de ADN fraccionados a membranas e hibridar a membrana com um fragmento específico de ADN (“sonda”). O fragmento de ADN formará moléculas de ADN de cadeia dupla com o fragmento (ou fragmentos) de ADN na membrana que possui (possuem) sequências nucleotídicas complementares. Quando a sonda é marcada com um marcador visível, pode visualizar-se o fragmento de ADN ao qual a sonda está ligada. Este procedimento é geralmente denominado “hibrídação de Southern". Quando se observam diferenças nos tamanhos dos correspondentes fragmentos de restrição aos quais a sonda se liga, em moléculas de ADN genómico com uma relação próxima, estas diferenças são denominadas polimorfismos do ADN, mais especificamente, polimorfismos dos fragmentos de restrição (“restriction fragment length polymorphisms”). As diferenças no tamanho dos fragmentos de restrição correspondem às diferentes formas alélicas do locus genético reconhecido pela sonda de ADN. Embora o método de hibridação de Southern para a obtenção de “impressões digitais” do ADN seja amplamente usado, ele é trabalhoso e longo.

Além disso, o método tem uma resolução baixa e, consequentemente, só pode ser usado para registar loci únicos ou, no máximo, alguns loci, numa única reacção. 2.4 Reacção da polimerase em cadeia A técnica da reacção da polimerase em cadeia (“Polymerase Chain Reaction” - PCR) é um método para sintetizar fragmentos específicos de ADN in vitro. O método baseia-se na utilização de oligonucleótidos específicos, que se ligarão a sequências únicas numa molécula de ADN, e da DNA polimerase termoestável. Os oligonucleótidos são desenhados de forma a poderem ligar-se às cadeias opostas do ADN e actuar como iniciadores numa reacção de síntese do ADN, de tal forma que cada um dirigirá a síntese de novas cadeias de ADN. Assim, num ciclo de síntese, produzir-se-á uma cópia completa da molécula de ADN entre os iniciadores, sendo duplicado o ADN entre estas moléculas. Cada ciclo de síntese do ADN resulta na duplicação da quantidade de ADN, conduzindo, assim, à amplificação do ADN compreendido entre os dois iniciadores. 3

Consequentemente, a técnica de PCR permite sintetizar um segmento preciso de ADN usando uma pequena quantidade de “ADN substrato". A Patente WO 90/11372 refere a detecção de um «nucleótido de teste» numa sequência conhecida de ADN. A detecção envolve a utilização de iniciadores que começam a partir da sequência de ADN adjacente ao «nucleótido de teste». A Patente WO 90/08821 está relacionada com a microdessecação de ADN cromossómico e a subsequente digestão do ADN obtido. Os hidrolisados são depois ligados, em ambas as extremidades, a oligonucleótidos de cadeia dupla, os quais são utilizados para ligar iniciadores correspondendo a uma das suas cadeias.

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Na presente invenção, concebemos um novo método para amplificar, através do método de PCR, fragmentos de restrição obtidos após o corte do ADN de um organismo com pelo menos uma enzima de restrição. Nesta nova aplicação do método de PCR, os oligonucleótidos utilizados não são dirigidos para uma sequência de ADN conhecida, sendo sim desenhados de forma a reconhecer as extremidades dos fragmentos de restrição. Para este fim, é necessário modificar as extremidades dos fragmentos de restrição por adição de moléculas de ligação (“linkers”) oligonucleotídicas (ou adaptadores) a estas extremidades. A razão para tal é que as extremidades das enzimas de restrição geralmente só possuem poucos nucleótidos em comum, isto é, 2 a 8 nucleótidos, o que é demasiado curto para ser usado no sentido de conceber iniciadores para a amplificação por PCR. A invenção baseia-se no uso de uma nova aplicação da técnica de reacção da polimerase em cadeia (PCR) para amplificar um ou mais fragmentos de restrição a partir de misturas complexas de fragmentos de ADN, obtidos por digestão das moléculas de ADN genómico com endonucleases de restrição. Uma vantagem particular da invenção é permitir a amplificação de fragmentos de restrição em situações em que a sequência nucleotídica das extremidades 5’ e 3’ dos fragmentos de restrição não está determinada. Nesses casos, não se podem definir os habituais iniciadores específicos para uma sequência, que hibridam com cada cadeia do fragmento de restrição a amplificar, e, portanto, não se podem usar os métodos conhecidos na técnica para fins de amplificação. 4 O método da invenção pode, por exemplo, ser usado de duas formas diferentes, conduzindo a dois tipos distintos de aplicações: (1) Métodos para a obtenção de “impressões digitais” do ADN de genomas através da selecção aleatória de subconjuntos de um ou mais fragmentos de restrição a amplificar pela técnica de PCR. A invenção também cobre os oligonucleótidos sintéticos a utilizar nos referidos métodos, e algumas aplicações destes métodos podem ser a tipagem forense, a identificação de microrganismos, a identificação de variedades, a análise do pedigree e o rastreio de marcadores do ADN ligados a traços genéticos característicos; (2) Métodos para a identificação de um ou mais fragmentos de ADN pré-seleccionados, que podem ser polimórficos, por amplificação por PCR. A invenção também cobre os oligonucleótidos sintéticos específicos a utilizar nos referidos métodos, e algumas aplicações destes métodos podem ser o rastreio de doenças geneticamente transmitidas em seres humanos, a monitorização da transmissão de traços agronómicos característicos na criação de animais e na produção de plantas e a detecção de agentes infecciosos em doenças.

4. BREVE DESCRICÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra uma representação gráfica do método geral de amplificação por PCR de fragmentos de restrição com cauda, obtidos por digestão de moléculas de ADN genómico com uma enzima de restrição. A Figura 2 representa a ligação de adaptadores a diferentes extremidades de fragmentos de restrição: extremidades lisas e extremidades coesivas. A Figura 3 representa a amplificação por PCR de fragmentos de restrição com cauda. As áreas dentro de caixas representam os adaptadores que estão ligados ao fragmento de restrição e os iniciadores que são utilizados na amplificação por PCR. As setas indicam a direcção da síntese do ADN. A Figura 4 mostra uma representação gráfica da amplificação por PCR de fragmentos de restrição com cauda. 5 A Figura 5 mostra a concepção geral dos iniciadores selectivos usados na amplificação por PCR de fragmentos de restrição com cauda. As caixas representam as sequências de repetição invertidas nas extremidades dos fragmentos de restrição. A selectividade dos iniciadores está ilustrada em dois exemplos nos quais existe, respectivamente, uma complementaridade perfeita e uma disparidade total entre a sequência selectiva de bases e a sequência do ADN de molde do fragmento de restrição. A Figura 6 mostra o princípio da amplificação selectiva por PCR usando um iniciador de PCR que selecciona moléculas de ADN de molde possuindo uma sequência trinucleotídica adjacente à sequência do adaptador. A Figura 7 representa a amplificação selectiva por PCR de fragmentos de restrição com cauda. A Figura 8 mostra o princípio da amplificação específica de fragmentos usando uma combinação de dois iniciadores de PCR, cada um compreendendo 6 bases selectivas. Cada iniciador forma uma estrutura de cadeia dupla na cadeia diferente do fragmento de restrição e, por isso, forma um complexo iniciador/molde a partir do qual se pode iniciar a síntese do ADN (representada pelas setas). A Figura 9 representa os elementos gerais de sequência que são reconhecidos no método da amplificação selectiva de fragmentos de restrição, incluindo as duas sequências nucleotídicas que são reconhecidas e a distância que separa as duas sequências. v. A Figura 10 representa os tipos de variações na sequência nucleotídica que são detectados no método de identificação de polimorfismos dos fragmentos amplificados. A Figura 11 mostra um gel de agarose a 1,0% com a análise dos resultados da amplificação do ADN de Tomate digerido com Pstl, usando iniciadores de selectividade crescente. A Figura 12 mostra um gel de agarose a 1,0% com a análise dos resultados da amplificação específica de 3 fragmentos Pstl diferentes do ADN de Tomate, usando iniciadores específicos para os fragmentos. 6 A Figura 13 mostra um gel de poliacrilamida a 2,5%/agarose a 1% com as “impressões digitais” do ADN obtidas por Amplificação Selectiva de Fragmentos de Restrição de duas linhas de Tomate. A Figura 14 mostra parte de um gel desnaturante de poliacrilamida a 4,5% com as “impressões digitais” do ADN de 4 linhas de Tomate, usando SRFA com a combinação de enzimas Pstl/Msel· A Figura 15 mostra parte de um gel desnaturante de poliacrilamida a 4,5% com as “impressões digitais” do ADN de 10 linhas de Lactuca. usando SRFA com a combinação de enzimas Pstl/Msel. A Figura 16 mostra parte de um gel desnaturante de poliacrilamida a 4,5% com as “impressões digitais” do ADN de 2 linhas de Milho, usando SRFA com as combinações de enzimas Pstl/Tagl e EcoRI/Tagl. A Figura 17 mostra parte de um gel desnaturante de poliacrilamida a 4,5% com as “impressões digitais” do ADN de 26 estirpes de Xanthomonas campestris. usando SRFA com a combinação de enzimas Apal/Taol. A Figura 18 mostra parte de um gel desnaturante de poliacrilamida a 4,5% com as “impressões digitais” do ADN de diferentes indivíduos de 4 animais domésticos - Galinha, Porco, Vaca e Cavalo -, usando SRFA com a combinação de enzimas Ssel/Msel.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 5.1 Definições

Na descrição e exemplos que se seguem, são utilizados vários termos. De forma a proporcionar uma compreensão clara e consistente das especificações e reivindicações, incluindo o âmbito a ser dado a esses termos, disponibilizam se as seguintes definições.

Endonuclease de Restrição: uma endonuclease de restrição ou enzima de restrição é uma enzima que reconhece uma sequência específica de bases (local-alvo) numa molécula de 7 ADN de cadeia dupla e que cortará ambas as cadeias da molécula de ADN em todos os locais-alvo.

Fragmentos de Restrição: as moléculas de ADN produzidas por digestão com uma endonuclease de restrição são denominadas fragmentos de restrição. Qualquer genoma será digerido por uma endonuclease de restrição particular num conjunto discreto.de fragmentos de restrição. Os fragmentos de ADN que resultam dos cortes com a endonuclease de restrição são separados e detectados por electroforese em gel.

Polimorfismo dos Fragmentos de Restrição (“Restriction Fragment Length Polymorphism”) (RPLF): o ADN genómico de dois organismos relacionados de forma próxima, por exemplo, exibirá diferenças na composição da suas sequências nucleotídicas em muitos locais. Quando estas diferenças surgem no local-alvo de uma endonuclease de restrição, o local de restrição modificado não será cortado nesse ponto. De forma semelhante, uma variação da sequência nucleotídica pode introduzir um novo local de restrição onde ele não existe no outro organismo, fazendo com que o ADN seja cortado pela enzima de restrição nesse ponto. Em alternativa, inserções ou eliminações de nucleótidos que ocorram num organismo entre dois locais-alvo para uma endonuclease de restrição modificarão a distância entre esses locais de restrição. Devido a isto, a digestão do ADN dos dois organismos produzirá fragmentos de restrição que possuem tamanhos diferentes. O resultado será um polimorfismo dos fragmentos de restrição produzidos por digestão do ADN dos dois organismos.

Electroforese em Gel: Para detectar fragmentos de restrição, é necessário um método analítico para fraccionar moléculas de ADN de cadeia dupla com base no seu tamanho. A técnica usada mais normalmente para conseguir esse fraccionamento é a electroforese em gel. A velocidade a que os fragmentos de ADN se movem nesses géis depende do seu tamanho; assim, as distâncias percorridas diminuem à medida que o comprimento do fragmento aumenta. Os fragmentos de ADN fraccionados por electroforese em gel podem ser visualizados directamente, através de um procedimento de marcação, se o número de fragmentos incluído no perfil for pequeno.

Ollgonucleótidos sintéticos: as moléculas de ADN de cadeia simples possuindo preferencialmente entre cerca de 10 e 50 bases, que podem ser sintetizadas quimicamente, são denominadas oligonucleótidos sintéticos. Em geral, estas moléculas 8 de ADN sintético são construídas para ter urna sequência nucleotídica única, embora seja possível sintetizar famílias de moléculas possuindo sequências relacionadas e que têm diferentes composições nucleotídicas em posições específicas da sequência. O termo oligonucleótido sintético será usado para denominar moléculas de ADN possuindo uma sequência nucleotídica única. O termo oligonucleótidos sintéticos mistos será usado para denominar famílias de oligonucleótidos sintéticos relacionados.

Ligação: a reacção enzimática catalisada pela enzima ligase na qual duas moléculas de ADN de cadeia dupla são ligadas covalentemente é denominada ligação. Em geral, ambas as cadeias de ADN são ligadas covalentemente, mas também é possível evitar a ligação de uma das duas cadeias através de modificação química ou enzimática de uma das extremidades. Nesse caso, a ligação covalenfe ocorrerá só numa das duas cadeias de ADN.

Adaptadores: moléculas curtas de ADN de cadeia dupla com um número limitado de pares de bases, por exemplo, um comprimento de 10 a 30 pares de bases, que são concebidas de forma a poderem ser ligadas às extremidades de fragmentos de restrição. Os adaptadores são compostos por dois oligonucleótidos sintéticos que possuem sequências nucleotídicas que são, em parte, complementares uma da outra. Quando se misturam os dois oligonucleótidos sintéticos, eles formam uma estrutura de cadeia dupla em solução, sob condições apropriadas. Uma das extremidades da molécula do adaptador é concebida de forma a poder ligar-se à extremidade de um fragmento de restrição; a outra extremidade é concebida de forma a não se poder ligar.

Reacção da Polimerase em Cadeia (“Polymerase Chain Reaction”) (PCR): a reacção enzimática na qual se sintetizam fragmentos de ADN a partir de um ADN substrato in vitro é denominada PCR. A reacção envolve a utilização de dois oligonucleótidos sintéticos que são complementares de sequências nucleotídicas nas moléculas de ADN, as quais estão separadas por uma curta distância de algumas centenas a alguns milhares de pares de bases, e a utilização de uma DNA polimerase termoestável. A reacção em cadeia consiste, por exemplo, numa série de 10 a 30 ciclos. Em cada ciclo, o ADN substrato é primeiro desnaturado a alta temperatura. Após o arrefecimento, os oligonucleótidos sintéticos que estão presentes em grande excesso formarão estruturas de cadeia dupla com as moléculas de ADN substrato em solução, em locais específicos desta molécula que possuem sequências nucleotídicas complementares. Os complexos de 9 oligonuc!eótido-ADN substrato servirão depois como locais de iniciação para a reacção de síntese do ADN catalisada pela DNA polimerase, resultando na síntese de uma nova cadeia de ADN complementar da cadeia de ADN substrato.

Amplificação do ADN: o termo amplificação do ADN será usado para referir a síntese de moléculas de ADN de cadeia dupla in vitro, usando a Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR). Os produtos da reacção de PCR serão denominados fragmentos de ADN amplificados.

Iniciadores: em geral, o termo iniciador refere-se a uma cadeia de ADN que pode iniciar a síntese de ADN. A DNA polimerase não pode sintetizar ADN de novo sem iniciadores: eles só podem estender uma cadeia de ADN já existente numa reacção na qual a cadeia complementar é usada como molde para dirigir a ordem dos nucleótidos a inserir. Designaremos as moléculas de oligonucleótidos sintéticos que são usadas na reacção de PCR por iniciadores.

Procedimento de Hibridação de Southern: o objectivo do procedimento de hibridação de Southern, também denominado “Southern blotting”, é transferir fisicamente ADN fraccionado por electroforese em gel de agarose para um suporte como uma membrana de nylon ou um papel de filtro de nitrocelulose, enquanto se retêm as posições relativas dos fragmentos de ADN resultantes do procedimento de fraccionamento. A metodologia utilizada para conseguir a transferência do gel de agarose para o suporte é arrastar o ADN do gel para o suporte por acção capilar.

Hibridação de Ácidos Nucleicos: a hibridação de ácidos nucleicos é utilizada para detectar sequências homólogas de ADN por hibridação de ADN de cadeia simples em suportes como membranas de nylon ou papéis de filtro de nitrocelulose. As moléculas de ácido nucleico que possuem sequências de bases complementares vão reconstituir a estrutura de cadeia dupla se forem misturados em solução, em condições apropriadas. A estrutura de cadeia dupla formar-se-á entre dois ácidos nucleicos complementares de cadeia simples, mesmo se um deles estiver imobilizado num suporte. No procedimento de hibridação de Southern, ocorre a última situação.

Sonda de Hibridação: para se detectar uma sequência de ADN particular no procedimento de hibridação de Southern, faz-se reagir uma molécula de ADN marcado, ou sonda de 10 hibridação, com o ADN fraccionado ligado a um suporte como uma membrana de nylon ou um papel de filtro de nitrocelulose. As áreas no filtro que transportam sequências de ADN complementares da sonda de ADN marcado tornam-se elas próprias marcadas em consequência da reacção de ligação. As áreas do filtro que exibem essa marcação podem ser detectadas, de acordo com o tipo de marcação usado. A sonda de hibridação é geralmente produzida por clonagem molecular de uma sequência específica de ADN do genoma do milho. A invenção está assim relacionada com um processo para a amplificação de pelo menos um fragmento de restrição obtido a partir de um ADN inicial, processo esse que compreende: (a) digerir o referido ADN inicial com pelo menos uma endonuclease de restrição para o fragmentar em fragmentos de restrição; (b) ligar os fragmentos de restrição obtidos a pelo menos um adaptador oligonucleotídico sintético de cadeia dupla, possuindo uma extremidade que é compatível para ser ligada a uma ou a ambas as extremidades dos fragmentos de restrição, para dessa forma produzir fragmentos de restrição com cauda; (c) contactar os referidos fragmentos de restrição com cauda, em condições de hibridação, com pelo menos um iniciador oligonucleotídico; onde o referido iniciador ou iniciadores incluem uma sequência nucleotídica complementar de parte da sequência alvo da endonuclease de restrição presente nos fragmentos de restrição com cauda e complementar de parte da sequência do adaptador; e onde pelo menos um dos referidos iniciadores inclui, na sua extremidade 3', uma sequência seleccionada que compreende pelo menos um nucleótido localizado numa posição imediatamente adjacente aos nucleótidos envolvidos na formação da referida sequência-alvo. (d) amplificar os referidos fragmentos de restrição com cauda, hibridados com o referido iniciador ou iniciadores, na presença dos nucleótidos exigidos e da DNA polimerase, ou prolongar os iniciadores hibridados ao longo daqueles fragmentos de restrição com cauda; e 11 (e) identificar ou recuperar os fragmentos de ADN amplificados ou prolongados produzidos no passo (d). 5.2 Descrição das formas de realização preferidas

Esta invenção está relacionada, mais particularmente, com um processo e com os meios que permitem que a reacção da polimerase em cadeia (PCR) seja aplicável à detecção de polimorfismos de fragmentos de restrição (RFPs), incluindo polimorfismos de tamanho. A invenção compreende métodos para detectar RFPs, oligonucleótidos sintéticos para utilizar nos métodos da invenção, kits compreendendo meios para detectar RFPs e aplicações dos métodos e procedimentos da invenção para a criação de animais e produção de plantas, para diagnósticos de doenças transmitidas geneticamente, para a identificação de organismos, para a tipagem forense, etc...

Especificamente, esta invenção disponibiliza meios para a identificação quer de fragmentos de restrição genómicos individuais, quer de conjuntos de fragmentos de restrição genómicos de qualquer organismo, microrganismo, planta, animal ou ser humano, que estão ligados individual e geneticamente a um ou mais traços característicos particulares ou que, colectivamente, proporcionam uma “impressão digital" do genoma que pode ser usada para identificar um organismo, uma variedade ou um indivíduo. O método geral da invenção para a produção e identificação de fragmentos de restrição envolve o uso de endonucleases de restrição, a ligação de oligonucleótidos sintéticos aos fragmentos de restrição e a amplificação por PCR de fragmentos de restrição (Figura 1). As endonucleases de restrição cortam as moléculas de ADN genómico em locais específicos, os locais-alvo, gerando dessa forma fragmentos de restrição. A amplificação por PCR dos fragmentos de restrição, independentemente de se conhecer ou não a sequência nucleotídica das extremidades dos fragmentos, pode ser conseguida, de acordo com a invenção, ligando primeiro oligonucleótidos sintéticos (adaptadores) às extremidades dos fragmentos de restrição, munindo, assim, cada fragmento de restrição com duas caudas comuns que servirão de âncora para os iniciadores utilizados na amplificação por PCR. 12

Tipicamente, as enzimas de restrição produzem extremidades lisas, nas quais os nucleótidos terminais de ambas as cadeias estão emparelhados, ou extremidades coesivas, nas quais uma das duas cadeias apresenta uma protuberância que origina uma extensão curta de cadeia simples (Figura 2). No caso dos fragmentos de restrição com extremidades lisas, utilizam-se adaptadores com uma extremidade lisa. No caso dos fragmentos de restrição com extremidades coesivas, usam-se adaptadores que possuem uma extensão em cadeia simples que é complementar da extensão em cadeia simples do fragmento de restrição. Consequentemente, para cada tipo de fragmento de restrição utilizam-se adaptadores específicos que diferem só numa das extremidades, de forma a permitir que o adaptador se ligue ao fragmento de restrição. Normalmente, os adaptadores usados são compostos por dois oligonucleótidos sintéticos que são, em parte, complementares um do outro, possuem normalmente comprimentos de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos, preferencialmente comprimentos de 12 a 22 nucleótidos e formam estruturas de cadeia dupla quando misturados em solução. Usando a enzima ligase, ligam-se os adaptadores à mistura de fragmentos de restrição. Quando se utiliza um grande excesso molar de adaptadores relativamente aos fragmentos de restrição, assegura-se que todos os fragmentos acabarão por transportar adaptadores em ambas as extremidades. Os fragmentos de restrição preparados por este método serão denominados fragmentos de restrição com cauda, e o método será denominado, daqui para a frente, inserção de caudas em fragmentos de restrição.

Os adaptadores podem agora servir de moldes para os iniciadores que possuem as características definidas acima, os quais são utilizados na subsequente reacção de amplificação por PCR. Numa forma de realização preferida da invenção, o fragmento de restrição transporta o mesmo adaptador em ambas as extremidades e pode usar-se um único iniciador de PCR para amplificar o fragmento de restrição, como ilustrado na Figura 3. Como nesse caso todos os fragmentos de restrição possuem uma mesma cauda, é óbvio que a amplificação por PCR de uma mistura de fragmentos de restrição com cauda amplificará todos os fragmentos de uma forma sincronizada. Noutra forma de realização que utiliza duas enzimas de restrição diferentes para cortar o ADN, ligam-se dois adaptadores diferentes às extremidades dos fragmentos de restrição. Neste caso, podem usar-se dois iniciadores de PCR diferentes para amplificar estes fragmentos de restrição. Noutra forma de realização preferida que usa duas enzimas de restrição, o adaptador para uma das extremidades da enzima está biotinilado. Isto permite que se seleccione entre a mistura complexa de fragmentos de restrição aqueles fragmentos que transportam 13 pelo menos uma extremidade para esta enzima de restrição, usando os métodos habituais para o isolamento de moléculas biotiniladas. Este passo reduz a complexidade da mistura inicial de fragmentos de restrição e constitui um passo de enriquecimento antes da amplificação por PCR, reduzindo assim, nalguns casos, o fundo. A amplificação simultânea de vários fragmentos diferentes é frequentemente denominada PCR de multiplex. O princípio da amplificação multiplex de fragmentos de restrição está ilustrado na Figura 4. A presente invenção baseia-se ainda na definição de iniciadores desenhados de forma específica e em métodos específicos para orientar a amplificação por PCR no sentido de ser possível uma amplificação controlada e, numa forma de realização particular da invenção, no sentido de ser amplificado só um pequeno subconjunto de fragmentos de restrição com cauda.

Em geral, a digestão por endonucleases de restrição do ADN genómico e, em particular, do ADN genómico animal, vegetal ou humano, origina um número muito grande de fragmentos de restrição. O número de fragmentos de restrição depende do tamanho do genoma e da frequência de ocorrência no genoma do local de restrição da endonuclease, que, pelo seu lado, é essencialmente determinada pelo número de nucleótidos neste local-alvo. O número de nucleótidos nos locais-alvo das endonucleases de restrição normalmente utilizadas varia entre 4 e 8. Os tamanhos dos genomas dos organismos variam grandemente entre alguns milhões de pares de bases, no caso de microrganismos, e vários milhares de milhões de pares de bases nos animais e plantas. Assim, o número de fragmentos de restrição obtido após o corte das moléculas de ADN genómico com uma enzima de restrição pode variar entre algumas centenas e vários milhões. Geralmente, o número de fragmentos de restrição é tão grande que não é possível identificar fragmentos de restrição individuais em digestões de ADN genómico fraccionado por electroforese em gel. Estas digestões normalmente produzem uma mancha de bandas. A amplificação por PCR de fragmentos de restrição com cauda deveria, assim, produzir também uma mancha de bandas, uma vez que todos os fragmentos deveriam ser co-amplificados de forma sincronizada na reacção de PCR. Numa forma de realização preferida da invenção, que pode ser aplicada a ADNs genómicos de grandes tamanhos, usámos um princípio geral para limitar o número de fragmentos de restrição que serão 14 amplificados. Tal é conseguido por pré-selecção de um subconjunto de fragmentos de restrição com cauda, de forma a que só um número relativamente pequeno destes fragmentos seja amplificado durante a reacção de amplificação por PCR. O princípio selectivo definido nesta forma de realização da invenção reside na concepção dos oligonucleótidos que são utilizados como iniciadores para a amplificação por PCR, como ilustrado na Figura 5.

Os fragmentos de restrição com cauda possuem a seguinte estrutura geral: uma Sequência variável de ADN (correspondendo ao fragmento de restrição antes da inserção da cauda) flanqueada em ambas os lados por uma sequência invertida de ADN (sequência constante). A sequência invertida de ADN (sequência constante de ADN) é composta por parte da sequência-alvo da endonuclease de restrição e pela sequência do adaptador ligado a ambas as extremidades do fragmento de restrição. As sequências variáveis dos fragmentos de restrição compreendidas entre as sequências constantes de ADN são geralmente desconhecidas e terão, portanto, uma composição sequencial aleatória. Consequentemente, as sequências nucleotídicas que flanqueiam a sequência constante de ADN serão totalmente aleatórias numa larga mistura de fragmentos de restrição.

Assim, a presente invenção também disponibiliza iniciadores específicos para PCR que compreendem uma porção de sequência nucleotídica constante e, na forma de realização da invenção que está relacionada com a amplificação de um subconjunto restrito dos fragmentos de restrição obtidos, uma porção de sequência variável. Na porção de sequência constante, a sequência nucleotídica é desenhada para o iniciador emparelhar perfeitamente com a sequência constante de ADN de uma das cadeias de ADN na extremidade do fragmento de restrição. A porção de sequência variável compreende uma sequência nucleotídica escolhida aleatoriamente que varia entre 1 e 10 bases. A expressão “sequência variável” designa, mais exactamente, uma sequência que consiste em nucleótidos seleccionados formando uma sequência que depois permanecerá constante para o objectivo de amplificar um subconjunto de fragmentos de restrição. Numa forma de realização particular da invenção, podem utilizar-se várias sequências de bases seleccionadas, de forma a definir vários iniciadores distintos. Nesse caso, os 15 iniciadores podem ter a mesma sequência constante e sequências variáveis constituídas por bases seleccionadas, as quais são diferentes entre os iniciadores assim formados. É a adição destas sequências variáveis (seleccionadas) à extremidade 3’ dos iniciadores que orientará a pré-selecção dos fragmentos de restrição com cauda que serão amplificados no passo de PCR: quando a reacção de PCR for executada em condições apropriadas, os iniciadores só começarão a síntese de ADN naqueles fragmentos de restrição com cauda em que a sequência variável de ADN pode emparelhar perfeitamente com a cadeia de molde dos fragmento de restrição com cauda, como ilustrado na Figura 5. A selecção é determinada pelo número de nucleótidos existentes na porção de sequência variável do iniciador: a selectividade dos iniciadores aumenta com o número de nucleótidos na porção de sequência variável (seleccionada). Usaremos também o termo bases selectivas para designar os nucleótidos na porção de sequência variável, mostrando assim que a selecção destas bases torna o iniciador seiectivo. Deve compreender-se que um fragmento de restrição com cauda só será amplificado quando as bases selectivas dos iniciadores utilizados reconhecerem ambas as sequências complementares nas extremidades do fragmento. Quando o iniciador for complementar só de uma extremidade, a amplificação será linear e não exponencial, e o produto não será detectado. É possível estimar previamente o grau de selectividade obtido com sequências variáveis possuindo diferentes números de bases selectivas, recorrendo à fórmula geral 42n, onde n é igual ao número de bases selectivas; usando 1 base selectiva, será amplificado 1 em 16 fragmentos com cauda; usando 2 bases selectivas, será amplificado 1 em 256; usando 3 bases selectivas, será amplificado 1 em 4 096; usando 4 bases selectivas, será amplificado 1 em 65 536 e em diante. Uma forma de realização preferida da presente invenção permite, assim, uma amplificação selectiva de um subconjunto aleatório de fragmentos de restrição com cauda resultantes de qualquer digestão de ADN genómico, independentemente do número de fragmentos produzido pela enzima de restrição utilizada.

Numa forma de realização preferida, o número de nucleótidos selectivos é escolhido de forma a que o número de fragmentos de restrição a amplificar esteja limitado entre 5 e 16 200. Embora este número possa ser calculado dividindo o número de fragmentos por 42n, não é possível uma previsão precisa porque nem todos os fragmentos de restrição podem ser amplificados com igual eficiência. Desta forma, na prática, encontram-se menos fragmentos resultantes da amplificação do que o número teoricamente esperado. Deve referir-se também que se podem usar misturas de dois (ou mais) iniciadores. Isto permitirá a amplificação dos fragmentos reconhecidos por cada iniciador e, além disso, dos fragmentos reconhecidos pelos dois iniciadores. Finalmente, deve referir-se que a selecção baseada no emparelhamento de bases entre os nucleótidos selectivos do iniciador e do molde complementar é fortemente influenciada pela temperatura escolhida para o passo de ligação na reacção de PCR; quando esta temperatura está abaixo ou demasiado próxima da temperatura de fusão do complexo iniciador/molde, os iniciadores ligar-se-ão às sequências molde de complementaridade imperfeita, permitindo que ocorra uma não-complementaridade no complexo. Isto deve ser evitado porque conduzirá à amplificação de muito mais fragmentos que o previsto, produzindo resultados mais variáveis.

Os produtos de PCR obtidos de acordo com a invenção podem ser identificados usando métodos de fraccionamento padrão para separar moléculas de ADN de acordo com o tamanho, seguidos da marcação das moléculas de ADN com agentes apropriados. Em alternativa, os iniciadores usados para a amplificação por PCR podem ter uma cauda com um marcador radioactivo ou um cromóforo fluorescente apropriados, permitindo assim a identificação dos produtos da reacção após o fraccionamento por tamanho. Numa forma de realização preferida da invenção, os produtos de PCR são fraccionados por electroforese em gel usando matrizes de gel padrão como, mas não estando limitadas a, agarose, poliacrilamida ou agarose/poliacrilamida misturadas. Os produtos de PCR obtidos de acordo com a invenção serão ainda denominados pelo termo Fragmentos de Restrição Amplificados (“Amplified Restriction Fragments”- ARF).

Os meios e método da presente invenção podem ser utilizados para gerar conjuntos de ARFs a partir da digestão por restrição de qualquer genoma complexo. A invenção permite que o número de fragmentos de restrição obtido seja ajustado de acordo com a resolução do sistema de fraccionamento em gel usado para separar os ARFs. Numa forma de realização particular, os iniciadores selectivos são concebidos para produzir 5 a 10 ARFs, que são depois separados por electroforese em gel de agarose. Outra forma de realização particular envolve o uso de iniciadores selectivos que são desenhados para 17 produzir 20 a 50 ARFs, os quais são depois separados num sistema de electroforese em gel de alta resolução como, mas não estando limitado a, géis de poliacrilamida ou géis mistos de poliacrilamida/agarose.

Numa forma de realização preferida, a enzima ou enzimas de restrição são seleccionadas para originar fragmentos de restrição com um tamanho no intervalo entre 20 e 1 000 pares de bases porque, como geralmente se sabe para a amplificação por PCR, este intervalo de tamanho dos fragmentos é o mais eficazmente amplificado. Embora muitos fragmentos possam ser fraccionados em várias matrizes de gel padrão, os melhores resultados são obtidos por fraccionamento em sistemas de gel desnaturante de poliacrilamida como os que são normalmente usados para a sequenciação do ADN.

De acordo com a invenção, obtêm-se diferentes conjuntos de ARFs com cada iniciador selectivo distinto na reacção de amplificação por PCR. Os perfis de ARFs identificados após a separação constituem “impressões digitais" únicas e perfeitamente reprodutíveis do ADN genómico. Estas “impressões digitais” podem ter várias aplicações como, mas não estando limitadas a, tipagem forense, identificação de diagnóstico de organismos e identificação de espécies, raças, variedades ou indivíduos. O grau de identificação será determinado pelo grau de semelhança (o grau de variabilidade) exibido por diferentes membros de um grupo específico. A variabilidade ou semelhança é determinada pelo grau de variação na composição nucleotídica dos genomas relacionados. O princípio subjacente à invenção é que em cada fragmento de restrição amplificado são detectadas duas sequências nucleotídicas que estão separadas uma da outra por uma dada distância, como está ilustrado na Figura 9. Cada uma das duas sequências nucleotídicas é composta por duas partes: (a) o local-alvo para a endonuclease de restrição e b) a sequência nucleotídica adjacente ao local de restrição que está incluída no iniciador selectivo. Em organismos, espécies, variedades, raças ou indivíduos relacionados, estes elementos da sequência e as suas distâncias relativas serão conservados em maior ou menor extensão. Assim, as “impressões digitais” constituem uma base para determinar o grau de relações de sequência entre os genomas. Por outro lado, podem usar-se as diferenças nos perfis dos ARFs para distinguir genomas uns dos outros. A vantagem particular da presente invenção sobre outros métodos para a obtenção de “impressões digitais” dos genomas é a elevada resolução que se pode obter com o método: podem comparar-se simultaneamente várias dezenas ou mesmo centenas de ARFs. 18

Outra aplicação particular da presente invenção envolve o rastreio e a identificação de polimorfismos dos fragmentos de restrição (“restriction fragment polymorphisms” - RFP). Variações na composição nucleotídica do ADN genómico resultam frequentemente em polimorfismo dos fragmentos de restrição: inserções ou eliminações afectam o tamanho dos fragmentos de restrição que as contêm (Figura 10) e variações nos nucleótidos podem resultar na eliminação de locais-alvo das endonucleases de restrição ou na criação , de novos locais de restrição das endonucleases. As técnicas usadas mais habitualmente para identificar essas variações são as experiências de “Southern blotting” usando sondas de ADN clonado, uma técnica normalmente designada por detecção de polimorfismo dos fragmentos de restrição (“restriction fragment length polymorphism” - RFLP). Esta técnica envolve o rastreio extenso de fragmentos de ADN clonados aleatoriamente, em experiências de “Southern blotting”, para detectar RFLPs associados entre diferentes genomas. De acordo com o método da presente invenção, os RFPs podem ser identificados directamente por comparação dos ARFs obtidos a partir de diferentes genomas. Em princípio, o método da presente invenção é mais sensível para detectar RFPs porque não só detecta diferenças nos locais-alvo da endonuclease de restrição, como também detecta diferenças nas sequências nucleotídicas adjacentes compreendidas nos iniciadores selectivos de PCR. Consequentemente, o método da presente invenção constitui um método bastante superior para detectar RFLPs.

Hoje em dia, os RFLPs são normalmente usados para várias aplicações, incluindo a tipagem forense,. a monitorização de doenças geneticamente transmitidas em seres humanos e a monitorização da transmissão de traços agronómicos característicos na criação de animais e produção de plantas. O princípio subjacente é que determinados polimorfismos do ADN, que estão intimamente ligados a traços genéticos específicos, podem ser utilizados para monitorizar a presença ou ausência de traços genéticos específicos.

De acordo com o método da presente invenção, a análise dos perfis dos ARFs pode ser usada para definir a ligação genética de ARFs polimórficos a traços genéticos específicos. Estes ARFs polimórficos serão subsequentemente denominados Polimorfismos de Fragmentos Amplificados (“Amplified Fragment Length Polymorphisms” - AFLP®) para os distinguir dos polimorfismos do ADN do tipo RFLP, detectados em experiências de “Southern blotting” usando sondas de ADN clonado. 19

Uma aplicação particular da presente invenção envolve a detecção de AFLPs ligados a traços genéticos específicos. A aplicação envolve a análise de padrões de ARFs, obtidos com diferentes iniciadores selectivos a partir de digestões de restrição do ADN genómico de indivíduos relacionados de forma próxima que exibem diferenças no traço genético , específico, e o uso de técnicas de análise que podem encontrar correlações entre a transmissão de um ou mais AFLP® e o fenótipo exibido pelos traços genéticos específicos.

Uma segunda forma de realização preferida da presente invenção envolve o uso do método da invenção para identificar um ou mais fragmentos de restrição específicos. Um fragmento de restrição específico pode ser amplificado a partir de uma mistura complexa de fragmentos de restrição com cauda, determinando primeiro a sequência nucleotídica das primeiras 8-12 bases em cada extremidade do fragmento de restrição. Com base nessas sequências, podem construir-se dois iniciadores, cada um com 5 a 10 nucleótidos selectivos, exibindo uma sequência complementar da sequência que flanqueia o local de restrição da cadeia complementar do fragmento de restrição. Usando conjuntos de iniciadores destes, pode obter-se, após amplificação por PCR, um único fragmento amplificado. O fragmento de restrição usado neste método pode ser um fragmento de restrição clonado ou um fragmento de restrição amplificado. Como poucos fragmentos de restrição podem ser amplificados de forma eficiente, o método preferido da invenção para identificar marcadores do ADN polimórficos envolve amplificar primeiro conjuntos de fragmentos escolhidos aleatoriamente e identificar AFLPs que originam bandas fortes após amplificação por PCR. Estes AFLP® podem ser caracterizados por sequenciação, para construir iniciadores específicos para os fragmentos de restrição. Normalmente, os AFLP® serão isolados por corte da correspondente banda de ADN no gel e determinação das sequências nucleotídicas em ambas as extremidades, para assim estabelecer a sequência dos primeiros 5 a 10 nucleótidos adjacentes aos locais-alvo da endonuclease de restrição. Uma vez conhecidas estas sequências nucleotídicas, podem conceber-se iniciadores específicos para os fragmentos de restrição que só amplificarão um único fragmento de restrição a partir de uma digestão do ADN genómico. Nesta forma de realização particular da invenção, pode utilizar-se um conjunto de dois iniciadores selectivos diferentes para detectar um fragmento de restrição específico. Em cada um dos dois iniciadores selectivos de um conjunto, as bases selectivas são escolhidas de forma a serem complementares da sequência nucleotídica adjacente ao local-alvo da endonuclease de restrição, como está ilustrado na Figura 8. O número de bases 20 selectivas a incluir em cada iniciador depende da complexidade da mistura de fragmentos de restrição. A técnica de PCR desenvolveu-se enormemente nos últimos anos e está rapidamente a tornar-se um dos métodos de diagnóstico mais amplamente usados em saúde humana. A sua aplicação inclui, entre outras, a detecção de doenças infecciosas e a detecção de doenças transmitidas geneticamente. Cada teste de diagnóstico baseia-se no uso de dois oligonucleótidos sintéticos específicos, que são utilizados como iniciadores na reacção de PCR, para se obter um ou mais fragmentos de ADN de tamanhos específicos. Na detecção de doenças, o teste detectará a presença de uma quantidade tão pequena como uma molécula de ADN por amostra, originando o fragmento de ADN característico. No caso de doenças transmitidas geneticamente, os iniciadores são concebidos de forma que os seus produtos possam discriminar entre alelos normais e alelos da doença. A distinção apoia-se quer em diferenças de sequência no segmento de ADN do genoma que é complementar do iniciador, quer em diferenças na distância entre os dois iniciadores.

Como os iniciadores apresentam um grau extremamente elevado de especificidade, é possível monitorizar doenças diferentes simultaneamente: um método frequentemente designado por PCR de multiplex. O método de PCR de multiplex tem, contudo, a limitação de geralmente só se poderem monitorizar simultaneamente poucos - 5 a 8 - traços característicos diferentes. A base científica para esta limitação é que as condições óptimas para a amplificação por PCR (temperatura de ligação, concentração de Mg+, concentração de iniciadores) variam consideravelmente dependendo do par de iniciadores usado. No PCR de multiplex, têm que se estabelecer condições de compromisso nas quais todos os pares de iniciadores originem produtos detectáveis. Adicionalmente, sobreposto a este fenómeno, existe o fenómeno de grandes diferenças na eficiência de amplificação de diferentes fragmentos. Consequentemente, tem-se frequentemente deparado com o problema de produtos de determinados pares de iniciadores não serem detectáveis nas reacção de PCR de multiplex.

Os métodos da presente invenção ultrapassam, na essência, estas limitações do PCR de multiplex porque todos os iniciadores usados na presente invenção possuem uma parte substancial da sua sequência nucleotídica em comum. Além disso, seleccionando AFLP®, seleccionamos marcadores do ADN que são amplificados com igual eficiência. Assim, os valores óptimos das condições de amplificação por PCR para os diferentes iniciadores 21 selectivos exibem muito menos variação do que a observada com os iniciadores específicos para determinadas sequências, que são normalmente usados. Na essência, há um compromisso ideal entre o número de bases no oligonucleótido sintético que é necessário para se obter a especificidade necessária para detectar um único fragmento de ADN de um determinado tamanho num genoma complexo, o qual está calculado acima, e o comprimento e composição do oligonucleótido que é óptimo para uma amplificação eficiente por PCR. O método da invenção proporciona, assim, um método muito superior para o PCR de multiplex. A presente invenção disponibiliza um método geral para isolar marcadores do ADN a partir de qualquer genoma e para usar esses marcadores do ADN em todas as aplicações possíveis das “impressões digitais" do ADN.

Os exemplos e figuras que se seguem proporcionam uma ilustração da invenção que não está, no entanto, limitada a estes exemplos.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: AMPLIFICAÇÃO SELECTIVA DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DO ADN DE TOMATE USANDO PSTI

A) Isolamento e modificação do ADN O ADN total de Tomate (Lvcopersicon esculentum c.v. Moneymaker) foi isolado a partir de folhas jovens como descrito por Bernatzski e Tanksley (Theor. Appl. Genet. 72, 314-321). O rendimento típico foi de 50- 100 μg de ADN por grama de material de folha fresca. O ADN foi digerido com Pstl (Pharmacia) e ligaram-se adaptadores-Pstl de cadeia dupla aos fragmentos de restrição, seguindo o procedimento descrito abaixo. Estes adaptadores possuíam a seguinte estrutura: 5 - CTCGTAGACTGCGTACATGCA - 3 3 - CATCTGACGCATGT - 5 A projecção TGCA-3’ nestes adaptadores liga-se às extremidades coesivas criadas por Pstl. A sequência de reconhecimento CTGCAG de Pstl não é reconstituída com a ligação 22 deste adaptador, porque o resíduo 5’-C é substituído por A. A reacção de ligação foi concebida de forma ao resultado final ser quase exclusivamente o produto fragmento de ADN-moléculas de adaptador. Tal foi conseguido: 1. usando adaptadores não fosforilados, 0 que exclui a ligação adaptador-adaptador, 2. executando a reacção de ligação e de restrição ao mesmo tempo. O último procedimento resulta na restrição de qualquer produto da ligação fragmento-fragmento, eliminando assim quase completamente estes produtos. Os produtos da ligação adaptador-fragmento não podem ser digeridos pela enzima de restrição porque a sequência de reconhecimento de Pstl não está reconstituída nestes produtos. As condições de reacção usadas para a ligação do adaptador foram: 2 pg do ADN de Tomate 0,2 pg de adaptadores 20 unidades de Pstl 1 unidade de T4 DNA-ligase

Tris.HAc 10 mM, pH 7,5; MgAc 10 mM, Kac 50 mM Ditiotreitol 2 mM, ATP 0,5 mM A reacção de ligação foi efectuada num volume de reacção de 20 pl durante 3 horas, a 37°C. Após a ligação do adaptador, os adaptadores que não se ligaram foram removidos por precipitação selectiva. Para este fim, aumentou-se o volume da mistura reaccional para 100 pl e adicionou-se NH4AC para uma concentração final de 2,5 M. Adicionaram-se 100 pl de etanol a -20°C e incubou-se a mistura durante 5 minutos, à temperatura ambiente. O ADN foi recolhido por centrifugação durante 10 minutos a 14 000 rpm, numa centrífuga para eppendorfs arrefecida a 4°C. O “pellet” de ADN foi lavado uma vez com 0,5 ml de etanol a 70% à temperatura ambiente, e dissolvido em 40 pl de T0.1E (Tris.HCI 10 mM, pH 8,0; EDTA 0,1 mM). O ADN foi armazenado a -20°C. O procedimento de precipitação selectiva aqui descrito remove eficientemente da mistura reaccional os adaptadores que não se ligaram, mas também se perdem fragmentos de ADN pequenos (< 200 pb). B) A reaccão de amplificação O ADN preparado acima foi usado como molde para a amplificação dos fragmentos-Pstl. A mistura reaccional para o PCR continha: 23 1 ng do ADN molde 150 ng de iniciador 1 unidade de Taq DNA polimerase (Perkin Elmer) 200 μΜ de todos os 4 dNTPs

Tris.HC110 mM, pH 8,5; MgCI21,5 mM, KCI 50 mM H20 para um volume total de 50 μΙ A mistura reaccional foi coberta com 20 μΙ de óleo mineral leve para evitar a evaporação durante a reacção de amplificação. O PCR foi efectuado num aparelho Perkin Elmer DNA Thermal Cycler, usando as seguintes condições para o ciclo: 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 60°C, um aumento de temperatura de 60°C para 72°C a uma velocidade de 1°C/5 segundos e 2½ minutos a 72°C. Efectuou-se um total de 33 ciclos. Após a reacção, adicionaram-se 20 μΙ de clorofórmio e 10 μΙ de corante de carga; neste caso, sacarose a 50% com 0,1% p/v do corante Orange G (Merck). Esta mistura foi, em seguida, bem misturada com a mistura reaccional e centrifugada de forma breve para separar a fase orgânica (óleo mineral e clorofórmio) da mistura reaccional suplementada com o corante de carga. Analisaram-se 20 μΙ desta mistura reaccional num gel de agarose a 1,0%. C) Amplificação do ADN de Tomate com iniciadores de selectividade crescente O ADN de Tomate restringido com Pst[ e munido de uma cauda com o adaptador-Pstl foi amplificado usando as condições especificadas acima. Seleccionaram-se quatro iniciadores diferentes com as sequências: 5 - CTCGTAGACTGCGTACA - 3 5 - GACTGCGTACAtgcagA - 3 5 - GACTGCGTACAtgcagAC - 3 5 - GACTGCGTACAtgcagACC - 3 1. 2. 3. 4. O iniciador 1 é parte da cadeia superior do adaptador usado para modificar o ADN e, portanto, deve amplificar todos os fragmentos-Pstl. O iniciador 2 contém parte da sequência do adaptador, a sequência de reconhecimento Pstl (letras minúsculas) e um nucleótido selectivo (negrito), devendo teoricamente amplificar cerca da 1/16 parte de todos os fragmentos-Pstl. Os iniciadores 3 e 4 são semelhantes ao iniciador 2, mas 24 contêm 2 e 3 nucleótidos selectivos, respectivamente, esperando-se, assim, que amplifiquem cerca de 1/256 e 1/4096 dos fraqmentos-Pstl. Parte das misturas reaccionais foram analisadas num gel de agarose a 1,0%, que está representado na Figura 11. As colunas 1 e 6 desta Figura contêm padrões de ADN, cujos tamanhos estão indicados à esquerda. As colunas 2, 3, 4 e 5 contêm os PCRs obtidos com os iniciadores 1, 2, 3 e 4, respectivamente. Os resultados indicam que só no caso do iniciador com 3 nucleótidos selectivos, o número de fragmentos amplificados permitiu obter um perfil de bandas claro. Os outros 3 iniciadores originaram perfis de bandas que não puderam ser resolvidos em géis de agarose porque foram gerados demasiados produtos de PCR. Entre estes numerosos produtos de PCR, alguns fragmentos predominam sempre e são vistos como bandas numa mancha de fundo dos outros produtos do PCR. Estes produtos mais fortes provavelmente estão presentes em maior número de cópias no genoma do Tomate ou amplificam de forma mais eficiente que os outros produtos. Antecipou-se que tinham que ser utilizados iniciadores com 3 nucleótidos selectivos para gerar um pefil de bandas claro em géis de agarose, devido ao número total de fraqmentos-Pstl do ADN genómico de Tomate (20 000 a 100 000). D) Análise dos fraqmentós amplificados em “Southern blots”

Os fragmentos amplificados foram testados em “Southern blots” para verificar que estes fragmentos correspondiam a fragmentos de restrição genuínos com o mesmo tamanho. Para este fim, cortaram-se do gel de agarose quatro fragmentos individuais obtidos com o iniciador 4. O ADN foi purificado a partir destes pedaços de gel por meio de absorção em esferas de vidro (Gene Clean, fabricante Bio 101), e parte do ADN purificado foi reamplificado para se obter cerca de 1 pg de cada um dos quatro fragmentos de ADN. As reacções de reamplificação foram subsequentemente sujeitas a electroforese em gel preparativo de agarose a 1,0%, e os fragmentos de ADN desejados foram purificados. Marcaram-se 200 ng de cada fragmento com (a-32P)dATP usando um kit de marcação aleatória de hexameros, de acordo com os procedimentos aconselhados pelo fabricante (Boehringer Mannheim). O ADN total de Tomate foi hidrolisado com Pstl e sujeito a electroforese em gel de agarose a 1,0%. Utilizaram-se quatro colunas claramente separadas, cada uma contendo cerca de 3 pg do ADN digerido. Em seguida, as bandas contidas no gel de agarose foram transferidas para uma membrana de hibridação Genescreen+, como indicado pelo fabricante (New England Nuclear). Após a transferência, a membrana foi cortada em quatro pedaços, cada um contendo uma coluna do ADN de Tomate digerido com Pstl. Cada um destes quatro pedaços foi hibridado com 25 uma das quatro sondas de ADN, seguindo o procedimento descrito por Klein-Lankhorst et ai. (Theor. Appl. Genet. 81, 661-667). As bandas transferidas e hibridadas foram autoradiografadas durante 40 horas, usando filmes Kodak XAR5. Os resultados obtidos mostraram que todos os fragmentos do ADN genómico reconhecidos pelas 4 sondas de ADN tinham o mesmo comprimento que estas sondas. Isto demonstrou que os fragmentos amplificados, utilizados como sondas, tiveram origem nos fragmentos . detectados nas bandas transferidas. E) Amplificação selectiva de um único fragmento de restrição

Construiram-se três conjuntos de iniciadores para 3 fraamentos-Pstl correspondentes e aleatórios do ADN genómico de Tomate, para os quais se conhecia a sequência vizinha da sequência de reconhecimento de Pstl. Os conjuntos de iniciadores com 5 nucleótidos selectivos foram construídos como ilustrado abaixo:

Conjunto de iniciadores 1:

Sequência 1: 5 - ctgcagCAGTACCAGC-----CCGGCACCTGctgcag - 3 5 - TGCGTAACATtgcagCAGTA - 3 3 - TGGACgacgtACATGCGT - 5

Iniciador 1.1 Iniciador 1.2

Conjunto de iniciadores 2:

Sequência 2: 5 - ctgcagCCGAATCTCT· 5 - TGCGTACAtgcagCCGAA - 3 Iniciador 2.1 AGTGAGTTAGctgcag - 3 3 - CAATCg acgtACATGCGT - 5 Iniciador 2.2

Conjunto de iniciadores 3:

Sequência 3: 5 - ctgcagAATACCAAGA· 5 - TGCGTACAtgcagTTATG - 3 Iniciador 3.1 GCAAGCACAGctgcag - 3 3 - GTGTCgacgtACATGCGT - 5 Iniciador 3.2 26 O ADN de Tomate foi digerido com Pstl e ligaram-se adaptadores às extremidades dos fragmentos de restrição, como descrito acima. Este ADN foi usado como molde nos PCRs com os conjuntos de iniciadores 1, 2 ou 3, usando as condições descritas numa das secções anteriores Os produtos de reacção de cada um dos PCRs foram analisados num gel de agarose a 1,0%. Este gel está ilustrado na Figura 12. A Figura 12 mostra 13 colunas, sendo as colunas 1, 2, 12 e 13 padrões de ADN. Os tamanhos em kilobases destes padrões estão indicados em ambos os lados do gel. As colunas 3, 6 e 9 mostram ADN plasmídico com cada um dos três fraamentos-Pstl digeridos com Pstl. o que origina o fragmento do vector, pUC18 (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103-119) e o fragmento-Pstl inserido. As colunas 4 e 5 mostram a amplificação com o conjunto de iniciadores 1 de ,5 fragmentos do correspondente ADN plasmídico e de 1 ng do ADN genómico total, respectivamente. As colunas 7 e 8 mostram a amplificação com o conjunto de iniciadores 2 de ADN plasmídico e de ADN genómico total, e as colunas 10 e 11 mostram a amplificação com o conjunto de iniciadores 3. Estes resultados demonstram que é possível amplificar um único fraamento-Pstl a partir de uma mistura com pelo menos 20 000 fragmentos, usando a técnica de amplificação selectiva de fragmentos de restrição com iniciadores possuindo 5 nucleótidos selectivos.

F) Identificação de polimorfismos do ADN usando SRFA

Nas secções anteriores demonstrou-se claramente que é possível amplificar fragmentos de restrição - fragmentos aleatórios ou específicos - quando está disponível informação sobre a sequência, através da técnica de amplificação selectiva de fragmentos de restrição. Assim, deveria ser possível procurar polimorfismos de locais de restrição entre dois indivíduos da mesma espécie. Isso está descrito abaixo para duas linhas de Tomate que estão muito relacionadas, mas diferem na presença do gene de resistência aos nematóides dos nós das raízes, Mi, numa das linhas. O gene Mi é originário de Lvcopersicon peruvianum. uma espécie relacionada de forma distante com o Tomate comestível L. Esculentum. O gene foi introduzido na linha L. Esculentum por "Crossing” e subsequente “back Crossing” por 12 vezes com o L. Esculentum original, seleccionando-se a descendência pela presença do gene Mi. Desta forma, as duas linhas de Tomate diferem unicamente numa pequena porção do seu material genético, isto é, o gene Mi e a região circundante. Calcula-se que a região Mi constitua < 1% do genoma desta linha, usando métodos da genética clássica. 27 O ADN foi isolado das duas linhas de Tomate (linha 83M-71392, Mi-sensível e linha 83M-71398, Mi-resistente, obtidas através de De Ruiter Seeds, Bleiswijk, Holanda), subsequentemente digerido com Pst[ e munido de adaptadores, como descrito acima. Efectuou-se um grande número de reacções de amplificação usando iniciadores que diferiam na sua extensão de nucleótidos selectivos. Foram utilizados três nucleótidos selectivos e, além dos iniciadores únicos, também foram utilizadas combinações de dois iniciadores diferentes. As reacções foram analisadas em géis mistos de poliacrilamida/agarose: usou-se poliacrilamida a 2,5% e agarose a 1,0%, com uma razão de acrilamida para bisacrilamida de 20:1. Os géis foram corridos numa unidade Protean II (Biorad), usando pentes de 1,5 mm. Utilizou-se um total de 16 iniciadores diferentes, originando 16 reacções com um iniciador único e 120 reacções com todas as combinações possíveis de dois iniciadores. Um exemplo típico de um gel com seis destas combinações está ilustrado na Figura 13. As colunas 1 e 14 deste gel contêm os padrões de ADN, cujos tamanhos em kilobases estão indicados no lado direito do gel. As colunas 2 e 3, 4 e 5, 6 e 7, etc. contêm amplificações das duas linhas de Tomate com um iniciador ou um par de iniciadores específico. O rastreio para polimorfismos do local de restrição originou um determinado número de fragmentos, três dos quais foram muito proeminentes e estão representados nas colunas 9, 11 e 12 da Figura 13 (indicados por um pequeno circulo). Esperava-se que as bandas polimórficas nas colunas 9 e 11 fossem a mesma, uma vez que estava presente o mesmo iniciador em ambas as reacções (a diferença é a presença de um segundo iniciador na coluna 11). Os dois fragmentos polimórficos das colunas 11 e 12 foram cortados do gel, as fatias do gel foram esmagadas forçando-as a passar através de uma agulha de calibre 18 é o ADN foi eluído das fatias do gel por difusão em 200 μΙ de Tris.HCI 100 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM. Usaram-se 2 μΙ para reamplificação destes fragmentos, como descrito acima. Transformaram-se 200 ng de cada fragmento em fragmentos de extremidades lisas, usando T4 DNA polimerase, e subsequentemente ligaram-se estes fragmentos a 100 ng do vector plasmídico pUC18 (Yanisch-Perron et ai, Gene 33, 103-119) digerido com Smal. A mistura de ligação foi transformada em E. coli e, para cada fragmento, seleccionou-se um clone recombinado de E. coli para análise da sequência. Todas estas manipulações foram efectuadas usando procedimentos normalizados como descrito por Sambrook, Fritsch e Maniatis em: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). 28

Sintetizaram-se dois conjuntos de iniciadores com 6 nucleótidos selectivos com base nas sequências dos dois fragmentos, como descrito acima. Conseguimos amplificar especificamente cada fragmento usando estes conjuntos de iniciadores. Os fragmentos só foram amplificados da linha de Tomate da qual eram originários. Assim, estes conjuntos de iniciadores exibiram o mesmo polimorfismo, inicialmente encontrado com os iniciadores com 3 nucleótidos selectivos utilizados para detectar o polimorfismo.

EXEMPLO 2: AMPLIFICAÇÃO SELECTIVA DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DO ADN DE TOMATE COM DUAS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

No exemplo 1, exemplifica-se o princípio da amplificação sélectiva de fragmentos de restrição (SRFA) usando o ADN de Tomate e a enzima de restrição Pstl. Neste exemplo, ilustrar-se-á a SRFA usando duas enzimas de restrição diferentes, Pst[ e Msel.

Isolamento e modificação do ADN

Isolou-se o ADN total de Tomate a partir de folhas jovens, como descrito no exemplo 1. Foram usados dois pares de linhas isogénicas como fonte do ADN, denominadas GemR e Gems e GCR26 e GCR151, respectivamente (estas linhas estão descritas nas seguintes referências: Denby and Williams (1962) Can. J. Plant Sei. 42, 681-685, Smith and Ritchie (1983) Plant Mol. Biol. Rep. 1, 41-45). Os dois indivíduos de cada par de linhas isogénicas são geneticamente muito semelhantes, mas diferem na presença de um traço característico que confere resistência ao patogene fúngico Verticillium albo-atratum. O primeiro passo da modificação dos ADNs compreendeu a sua restrição com as duas enzimas Pstl e Msel. A restrição do ADN, e também a ligação subsequente dos adaptadores aos fragmentos de ADN, foram efectuadas no mesmo tampão, que foi denominado tampão-RL (tampão de restrição-ligação) e continha: Tris.Hac 10 mM/MgAc 10 mM /Kac 50 mM /DTT5 mM, pH 7,5.

Restrição dos ADNs com Pstl e Msel

2.5 pg de ADN 12.5 unidades de Pstl (Pharmacia, 10 unidades/μΙ) 12.5 unidades de Msel (N.E. Biolabs, 4 unidades/μΙ) 29 5 μΙ 10χ tampão-RL Η20 para 50 μΙ A incubação foi efectuada a 37°C, durante 1 hora. O passo seguinte na modificação dos ADNs foi a ligação de moléculas adaptadoras às extremidades dos fragmentos de ADN. Primeiro, tiveram que se preparar moléculas adaptadoras de cadeia dupla adequadas.

Preparação dos adaptadores

Adaptador-Msel: 5 - GACGATGAGTCCTGAG - 3 3 - TACTCAGGACTCAT - 5

Para a preparação de uma solução de 50 pMoles/μΙ deste adaptador, misturaram-se 8 pg (1430 pMoles) de 5 - GACGATGAGTCCTGAG - 3, com 16 bases, com 7 pg (1430 pMoles) de 5 - TACTCAGGACTCAT - 3, com 14 bases, num volume total de 28,6 μΙ de H20.

Adaptador-Pstl: 5 - bio - CTCGTAGACTGCGTACATGCA - 3 3 - CATCTGACGCATGT - 5

Para a preparação de uma solução de 5 pMoles/μΙ deste adaptador, misturaram-se 5,25 pg (715 pMoles) de 5 - bio - CTCGTAGACTGCGTACATGCA - 3 biotinilado, com 21 bases, com 3,5 pg (715 pMoles) de 5 - TGTACGCAGTCTAC - 3, com 14 bases, num volume total de 143 μΙ de H20.

Ligação das moléculas adaptadoras

Adicionou-se ao ADN digerido 10 μΙ de uma mistura contendo: 1 μΙ de adaptador-bio-Pstl (= 5 pMol) 1 μΙ de adaotador-Msel (= 50 pMol)

1,2 μΙ de ATP 10 mM 30

1 μΙ de 10χ tampão-RL 1 punidade de T4 DNA ligase (Pharmacia, 5 unidades/μΙ) H2Opara10pl A mistura reaccional resultante com um volume de 60 μΙ foi incubada durante 3 horas, a 37°C.

Os adaptadores foram construídos de forma aos locais de restrição não serem reconstituídos após a ligação. Desta forma, evitou-se a ligação fragmento-fragmento, dado que se restringiu a concatenação de fragmentos, uma vez que as enzimas de restrição ainda estavam activas durante a reacção de ligação. A ligação adaptador-adaptador não foi possível porque os adaptadores não estavam fosforilados (ver também o exemplo 1).

Selecção dos fragmentos de ADN biotinilados A preparação dos ADNs molde para a SRFA utilizando duas enzimas de restrição envolve geraimente um passo extra que não é utilizado quando se efectua a SRFA com uma única enzima. Neste passo, os fragmentos de ADN aos quais se ligou um fragmento biotinilado foram separados de todos os outros fragmentos.

Os fragmentos biotinilados foram separados dos fragmentos não biotinilados (fragmentos-Msel-Msel) por ligação a esferas paramagnéticas de estreptavidina (Dynal). Lavaram-se 10 μΙ de esferas uma vez com 100 μΙ de STEX (NaCI 100 mM/Tris.HCI 10 mM /EDTA 1 mM/Triton X-100 a 0,1% pH 8,0) e ressuspenderam-se em 140 μΙ de STEX. As esferas foram subsequentemente adicionadas à mistura de ligação, para originar um volume final de 200 μΙ. Este volume foi incubado durante 30 minutos com agitação suave, à temperatura ambiente, para assegurar uma ligação adequada dos fragmentos de ADN biotinilados às esferas. As esferas foram recolhidas segurando os tubos que as continham perto de um íman. Este procedimento evitou que as esferas fossem pipetadas quando o sobrenadante foi transferido para outro tubo. As esferas foram lavadas uma vez e subsequentemente transferidas para um tubo novo. Em seguida, lavaram-se 3 vezes com 200 μΙ de STEX. Finalmente, ressuspenderam-se as esferas em 200 μΙ de T0.1E (Tris 10 mM /EDTA 0,1 mM, pH 8,0) e transferiram-se para um tubo novo. O ADN foi mantido a 4°C. 31

Os ADNs digeridos com as enzimas de restrição, munidos de adaptadores, ligados às esferas paramagnéticas de estreptavidina e purificados a partir dos fragmentos-Msel-Msel. preparados como descrito acima, serão denominados ADNs molde nos passos seguintes.

Amplificação dos fragmentos Pstl-Msel

Os ADNs molde preparados como descrito acima devem conter todos os fragmentos-Pstl-Msel das linhas de Tomate mencionadas e, adicionalmente, uma pequena quantidade de fraamentos-Pstl-Pstl sem quaisquer fraamentos-Msel internos. Nesta experiência, visualizou-se um certo número destes fraamentos-Pstl-Msel por amplificação, essencialmente como descrito no exemplo 1. A análise em gel dos produtos de amplificação foi efectuada em géis desnaturantes de acrilamida (Maxam and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74, 560-564), porque o tipo de fragmentos obtido através do procedimento descrito neste exemplo foi muito mais pequeno do que o descrito no exemplo 1. Além disso, estes tipos de géis permitiram a separação de até 100 bandas por coluna, o que foi cerca de dez vezes mais que os géis de agarose descritos no exemplo 1. Os fragmentos foram visualizados por marcação de um dos iniciadores de PCR, na extremidade 5', com (i-32P)ATP e polinucleótido cinase.

Marcacão do iniciador de PCR O iniciador seleccionado para marcação foi o 5 - GATGAGTCCTGAGTAAgaa - 3 com 19 bases, que foi denominado iniciador-Msel-1 e no qual os nucleótidos selectivos estão indicados em minúsculas. A marcação foi efectuada da seguinte forma: 3.0 μΙ de iniciador com 19 bases (da solução de 50 ng/μΙ =150 ng) 5.0 μΙ de (τ-32Ρ)ΑΤΡ (da solução de 10 μΟί/μΙ = 50 μΟϊ) 3.0 μΙ de Tris.HCI 250 mM /MgCI2100 mM /DTT 50 mM, pH 7,5 0,5 μΙ de T4-cinase (Pharmacia, 10 unidades/μΙ) 18,5 μΙ de H20 32

Esta mistura originou um volume total de 30 μΙ, que foi incubado a 37°C durante 30 minutos. Para cada PCR, adicionou-se 1 μΙ deste iniciador marcado na extremidade 5’.

Efectuou-se um total de 28 PCRs, nos quais cada um dos 4 ADNs molde foi amplificado com 7 combinações de iniciadores. Cada combinação de iniciadores tinha o mesmo iniciador-Msel (iniciador-Msel-1, descrito acima), mas variou na escolha do iniciador-Pstl. Escolheu-se um total de 7 iniciadores diferentes (tal como no caso do iniciador-Msel. os nucleótidos selectivos estão indicados por minúsculas): lniciador-Pstl-1: lniciador-Pstl-2: lniciador-Pstl-3: lniciador-Pstl-4: lniciador-Pstl-5: lniciador-Pstl-6: lniciador-Pstl-7: 5 - GACTGCGTACATGCAGga - 3 5 - GACTGCGTACATGCAGgt - 3 5 - GACTGCGTACATGCAGgg - 3 5 - GACTG CGTACATGCAGag - 3 5 - GACTGCGTACATGCAGat - 3 5 - GACTGCGTACATGCAGct - 3 5 - GACTGCGTACATGCAGta - 3

Todos os iniciadores de PCR foram dissolvidos em H20 para uma concentração de 50 ng/μΙ. A reaccão de amplificação A mistura para PCR consistiu em: 2.0 μΙ de ADN molde 1.0 μΙ de iniciador-Msel marcado na extremidade 5’ (5 ng) 0,5 μΙ de iniciador-Msel não marcado (25 ng) 0,6 μΙ de iniciador-Pstl (30 ng)

2.0 μΙ de Tris.HCI 100 mM/MgCI215 mM/KCI 500 mM, pH 8,5 0,8 μΙ de dNTPs 5 mM 0,1 μΙ de Taq polimerase (Cetus Perkin Elmer, 5 unidades/μΙ) .13,0 μΙ de H20 33

Todos os componentes da reacção foram adicionados e bem misturados; um componente essencial do PCR, normalmente a enzima, foi adicionada em último lugar. A reacção foi subsequentemente iniciada o mais depressa possível.

As amplificações foram efectuadas num aparelho Perkin Elmer 9600 Thermal Cycler. As condições do ciclo foram as seguintes: 1 ciclo: desnaturação: ligação: extensão:

30 seg a 94°C 30 seg a 65°C 60 seg a 72°C

11 ciclos: desnaturação: 30 seg a 94°C

baixar a temperatura de ligação 0,7°C em cada ciclo 64,3°C, 63,6°C, 62,9°C, 62,2°C, 61,5°C

60,8°C, 60,1°C, 59,4°C, 58,7°C, 58,0°C

57,3°C. Incubar durante 30 segundos a cada temperatura. Extensão: 60 seg a 72°C

30 seg a 94°C 30 seg a 56°C 60 seg a 72°C 23 ciclos: desnaturação: ligação: extensão:

Análise em gel dos fragmentos amplificados

Os produtos de reacção foram analisados em géis desnaturantes de poliacrilamida a 4,5%. Usaram-se géis de 50 x 38 cm, tendo os suportes para preparar estes géis sido comprados à Biorad. Utilizaram-se 100 ml da solução do gel contendo acrilamida a 4,5% p/v/bisacrilamida a 0,225% p/v/Ureia 7,5 M/Tris 50 mM/Ácido bórico 50 mM/EDTA 1 mM, pH 8,3. Misturaram-se 100 ml da solução do gel com 500 μΙ de persulfato de amónio a 10% e 100 μΙ de TEMED, imediatamente antes de se verter o gel para o molde. Usou-se um tampão de Tris/Ácido bórico/EDTA como tampão de electroforese, o qual continha: Tris 100 mM/Ácido bórico 100 mM/EDTA 2 mM, pH 8,3. As misturas reaccionais foram misturadas com um volume igual (20 μΙ) de formamida a 98%/EDTA 10 mM/azul de bromofenol a 0,01% p/v/Xileno-cianol a 0,01%. As misturas resultantes foram aquecidas 34 durante 3 minutos a 95°C e, em seguida, rapidamente arrefecidas em gelo. Aplicaram-se 2 μΙ de cada amostra no gel. Os géis foram corridos a uma potência constante de 110 Watts para originar um desenvolvimento constante de calor durante a electroforese. Nestas condições, a intensidade de campo dos géis correspondeu a 40 a 50 Volt/cm.

Os resultados das reacções de SRFA estão ilustrados na Figura 14. As colunas estão numeradas de 1 a 28 e contêm as quatro linhas de Tomate com uma das 7 combinações de iniciadores. A ordem das linhas de Tomate no gel é: 1. GCR26, 2. GCR151, 3. GemR, 4. Gems. As colunas 1 a 4 contêm estes ADNs amplificados com o iniciador-Msel-1 e o iniciador-Pstl-1, as colunas 5 a 8 contêm estes ADNs amplificados com o iniciador-Msel-1 e o iniciador-Pstl-2, as colunas 9 a 12 contêm estes ADNs amplificados com o iniciador-Msel-1 e o iniciador-Pstl-3, as colunas 13 a 16 contêm estes ADNs amplificados com o iniciador-Msel-1 e o iniciador-Pstl-4, as colunas 17 a 20 contêm estes ADNs amplificados com o iniciador-Msel-1 e o iniciador-Pstl-5. as colunas 21 a 24 contêm, estes ADNs amplificados com o iniciador-Msel-1 e o iniciador-Pstl-6 e as colunas 25 a 28 contêm estes ADNs amplificados com o iniciador-Msel-1 e o iniciador-Pstl-7. O gel não contém padrões de tamanho, mas os fragmentos de ADN visualizados correspondem a ± 200 nucleótidos no fundo da figura e a ± 500 nucleótidos no topo.

EXEMPLO 3: AMPLIFICAÇÃO SELECTIVA DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DO ADN DE VÁRIAS ESPÉCIES DE LACTUCA COM DUAS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

No exemplo 2, exemplifica-se o princípio da amplificação selectiva de fragmentos de restrição (SRFA) usando duas enzimas de restrição para o ADN de Tomate. Neste exemplo, ilustraremos como se obtêm resultados semelhantes usando ADNs de várias espécies de Lactuca e utilizando as mesmas duas enzimas de restrição, Pstl e Msel.

Isolamento e modificação do ADN

Os ADNs foram isolados como descrito no exemplo 1, usando o material de folhas jovens de várias espécies de Lactuca. Como indicado abaixo, estas plantas incluem uma variedade da alface comercial (L. sativa) e vários indivíduos de duas espécies selvagens de Lactuca, L. saliqna e L. Virosa. As plantas foram arbitrariamente designadas com os seguintes nomes: 35 1. L. saliana. n.° 21, planta 1 2. L. saliana. n.° 21, planta 2 3. L. saliana. n.° 22, planta 1 4. L. saliana. n.° 22, planta 2 5. L. virosa. n.° 01, planta 1 6. L. virosa. n.° 01. planta 2 7. L. virosa. n.° 02 8. L. virosa. n.° 03, planta 1 9. L. virosa. n.° 03, planta 2 10. L. sativa. uma variedade “butterhead” comercial O material genético analisado representou, assim, 6 tipos diferentes de plantas, incluindo dois indivíduos diferentes de 4 destas plantas. A modificação dos ADNs de Lactuca para gerar os moldes para a SRFA foi efectuada de forma idêntica ao procedimento descrito no exemplo 2.

Amplificação dos fragmentos Pstl-Msel

Os ADNs preparados como descrito acima foram usados como moldes para as reacções de SRFA. Utilizaram-se duas combinações de iniciadores, recorrendo a um único iniciador-Msel e a dois iniciadores-Pstl diferentes. Estes iniciadores (nucleótidos selectivos representados em minúsculas) foram:

Iniciador-Msel: 5 - GATGAGTCCTGAGTAAaca - 3 lniciador-Pstl-1: 5 - GACTGCGTACATGCAGaa - 3 iniciador-Pstl-2: 5 - GACTGCGTACATGCAGCa - 3 A amplificação dos fragmentos Pstl-Msel usando os iniciadores representados acima foi efectuada exactamente como descrito no exemplo 2, e os fragmentos gerados foram visualizados em géis desnaturantes de poliacrilamida, como descrio no exemplo 2. Os perfis de bandas obtidos estão ilustrados na Figura 15. As colunas 1 a 10 mostram os ADNs 1 a10 amplificados com o iniciador-Msel em combinação com o iniciador-Pstl-1 e as colunas 11 a 20 mostram os ADNs 1 a 10 amplificados com o iniciador-Msel em combinação com o iniciador-Pstl-2. Os padrões de tamanho (que não são visíveis nesta 36 figura) estão indicados à direita do gel. As diferenças nos perfis de bandas reflectem as diferenças na proximidade das várias plantas.

EXEMPLO 4: AMPLIFICAÇÃO SELECTIVA DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DE LINHAS CONGÉNITAS DE MILHO COM UMA VARIEDADE DE COMBINAÇÕES DE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Nos exemplos 2 e 3, exemplifica-se o princípio da amplificação selectiva de fragmentos de restrição (SRFA) usando duas enzimas de restrição para o ADN de Tomate e para os ADNs de Alface (espécies Lactuca), respectivamente. Neste exemplo, ilustrar-se-á como se obtêm resultados semelhantes com linhas de Milho (Zea mais). Além disso, ilustrar-se-á como se pode utilizar uma variedade de combinações de enzimas de restrição para obter “impressões digitais” do ADN, neste caso, de linhas de Milho.

Isolamento e modificação do ADN

Utilizaram-se duas linhas congénitas de milho, denominadas 1 e 2. A origem destas linhas é irrelevante porque, na nossa experiência, qualquer linha seleccionada originou boas “impressões digitais” do ADN usando SRFA. O ADN destas linhas foi isolado a partir do material de folhas jovens como descrito por Saghai-Mahoof et al. (1984) Proc. Natl, Acad. Sei. U.S.A· 81, 8014-8018. Foram usadas as seguintes combinações de enzimas de restrição para produzir os ADNs molde: Pstl/Taql. EcoRI/Taal. Asel/Taql. Sse8387-I/Taql. Todas as enzimas foram compradas à Pharmacia, excepto a Asei, que foi comprada à New England Biolabs, e a Sse8387-I. que foi comprada à Amersham. Os ADNs molde foram essencialmente preparados como descrito nos exemplos 2 e 3, com as excepções que se seguem: A restrição do ADN foi efectuada incubando primeiro com Taql a 65°C, durante uma hora, e incubando subsequentemente com a segunda enzima, Pst[, Asei. EcoRI ou Sse8387-I. durante mais uma hora, a 37°C. A ligação dos adaptadores foi como descrito no exemplo 2, usando os seguintes adaptadores:

Adaptador-Taql: 5 - GACGATGAGTCCTGAC - 3 3 - TACTCAGGACTGGC - 5 37

Adaptador-Pstl e Sse8387-I: 5 - bio - CTCGTAGACTGCGTACATGCA - 3 3 - CATCTGACGCATGT -5

Adaptador-Asel: 5 - bio - CTCGTAGACTGCGTACC - 3 3 -CTGACGCATGGAT - 5

Adaptador-EcoRI: 5 - bio - CTCGTAGACTGCGTACC - 3 3 - CTGACGCATGGTTAA - 3

Amplificação dos fragmentos de restrição A amplificação dos fragmentos de restrição foi efectuada como descrito no exemplo 2. Os iniciadores seleccionados para a marcação dos produtos amplificados foram os seguintes iniciadores-Taal possuindo 3 nucleótidos selectivos (indicados por letras minúsculas):

Iniciadores-Taal 1. 5 - TGAGTCCTGACCGAacc - 3 (marcados em 5’) 2. 5 - T GAGTCCTGACCG Aaca - 3 3. 5 - TGAGTCCTGACCGAcaa - 3 4. 5 - TGAGTCCTGACCGAcac - 3

Estes 4 iniciadores foram usados para a detecção de produtos de amplificação com todas as quatro combinações de enzimas. Para cada combinação de enzimas, seleccionaram-se 4 iniciadores para a outra enzima de forma a originar um total de 16 combinações para cada enzima. Estes iniciadores estão indicados abaixo (nucleótidos selectivos em minúsculas). Para a EcoRI e a Asei, seleccionaram-se iniciadores com 3 nucleótidos selectivos; para a Pst[, escolheram-se iniciadores com 2 nucleótidos selectivos; e para a Ssel. escolheram-se iniciadores com um único nucleótido selectivo. Para as enzimas que cortam menos frequentemente o ADN genómico do Milho, seleccionaram-se iniciadores contendo extensões com menos nucleótidos selectivos.

Iniciadores-EcoRI: 1. 5 - CTGCGTTACCAATTCcaa - 3 2. 5 - CTGCGTTACCAATTCaca - 3 3. 5 - CTGCGTTACCAATTCaac - 3 4. 5 - CTGCGTTACCAATTCcag - 3 38

Iniciadores-Asel: 1. 5 - GACTGCGTACCTAAT aac - 3 2. 5 - GACTGCGTACCTAATaag - 3 3. 5 - GACTGCGTACCTAATacc - 3 4. 5 - GACTGCGTACCTAATgaa - 3 Iniciadores-Pstl: 1. 5 - GACTGCGTACAT GCAGac - 3 2. 5 - GACTGCGTACATGCAGaa - 3 3. 5 - GACTGCGTACATGCAGca - 3 4. 5 - GACTGCGTACATGCAGcc - 3 I niciadores-Sse8387-l: 1. 5 - GACTGCGTACATGCAGGa - 3 2. 5 - GACTGCGTACATGCAGGg - 3 3. 5 - GACTGCGTACATGCAGGc - 3 4. 5 - GACTGCGTACATGCAGGt - 3 Efectuou-se um total de 128 PCRs (2 ADNs x 4 combinações de enzimas x 16 combinações de iniciadores), seguindo o protocolo descrito no exemplo 2. Os produtos de reacção destes PCRs foram analisados em 3 géis (contendo 48 colunas/gel), como descrito no exemplo 2. Todas as combinações de iniciadores originaram “impressões digitais” do ADN com 50 a 100 bandas por coluna, excepto a combinação Ssel/Taql. que originou só 10 a 15 bandas por coluna. Um exemplo de um dos géis está ilustrado na Figura 16. Esta figura mostra parte do gel com a análise das “impressões digitais” do ADN obtidas com as combinações de enzimas Pstl/Taal e EcoRI/Taal. As colunas 1 a 8 mostram “impressões digitais” do ADN dos dois ADNs de Milho obtidos por SRFA com o iniciador-Taql-3 e com os iniciadores-Pstl-1, -2, -3 e -4, respectivamente; as colunas 9 a 16 mostram “impressões digitais” do ADN dos dois ADNs de Milho obtidos por SRFA com o iniciador-Taql-4 e com os iniciadores-Pstl-1. -2, -3 e -4, respectivamente; a coluna 17 mostra o padrão do lambda-ADN digerido com Pstl. estando os tamanhos de alguns dos fragmentos, em nucleótidos, indicados à direita; e as colunas 18 a 25 mostram “impressões digitais” do ADN dos dois ADNs de Milho obtidos por SRFA com o iniciador-Taql-1 e com os iniciadores-EcoRI-1, -2, -3 e -4, respectivamente.

EXEMPLO 5: AMPLIFICAÇÃO SELECTIVA DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DE ADNs BACTERIANOS 39

Nos exemplos 2, 3 e 4, exemplifica-se o princípio da amplificação selectiva de fragmentos de restrição (SRFA) usando duas enzimas de restrição para os ADNs de Tomate, de Alface (espécies Lactuca) e de Milho, respectivamente. Neste exemplo, ilustrar-se-á como esta técnica também pode ser usada para caracterizar ADNs bacterianos. Obteve-se um determinado número de estirpes de Xanthomonas campestris do Laboratório de Microbiologia em Gent, Bélgica, para ilustrar a aplicabilidade da técnica em bactérias.

Isolamento e modificação do ADN

Todos os ADNs foram preparados a partir de estirpes de Xanthomonas campestris isoladas de uma variedade de organismos, principalmente de plantas infectadas. Estas estirpes, numeradas de 1 a 26 e referidas abaixo, podem ser obtidas através do Laboratório de Microbiologia em Gent, Bélgica. ADN subespécie var. patológica isolado 1. albilineans 494 2. fragariae 708 3. oryzae oryzae 5047 4. oryzae populi 5743 5. maltophilia 958 6. campestris campestris 568 7. campestris alfalfae 497 8. campestris coracanae 686 9. campestris citri 8655 10. campestris citri 9658 11. campestris citri 9181 12. campestris citri 8657 13. campestris citri 8654 14. campestris citri 8650 15. campestris citri 682 16. campestris citri 681 17. campestris citri 9325 18. campestris citri 9321 19. campestris citri 9176 40 20. campestris citri 9671 21. campestris citri 9665 22. campestris citri 9182 23. campestris citri 568 24. campestris citri 9167 25. campestris citri 9175 26. campestris citri 9160 O ADN destas estirpes bacterianas foi isolado como descrito por Marmur (J. Mol. Biol. 3, 208-218). Os ADNs foram hidrolisados essencialmente como descrito no exemplo 4, com excepção da Taql e da Apal terem sido escolhidas como enzimas de restrição. A ligação dos adaptadores foi como descrito no exemplo 4, usando os seguintes adaptadores:

Adaptador-Taal: 5 - GACGATGAGTCCTGAC - 3 3 - TACTCAGGACTGGC - 5

Adaptador-Apal: 5 — bio — TCGTAGACTGCGTACAGGCC — 3 3 - CATCTGACGCATGT - 5

Amplificação dos fragmentos de restrição A amplificação dos fragmentos de restrição foi efectuada como descrito no exemplo 2. Os iniciadores seleccionados para a SRFA foram o iniciador-Tagl 5 CGATGAGTCCTGACCGAg - 3 (possuindo um nucleótido selectivo indicado pela letra minúscula) e o iniciador-Apal 5 - GACTGCGTACAGGCCCg - 3 (possuindo um nucleótido selectivo indicado pela letra minúscula). O iniciador-Apal foi marcado na extremidade 5’ para detecção dos fragmentos amplificados, como descrito no exemplo 2.

Cada um dos 26 ADNs foi amplificado usando o conjunto de iniciadores descrito acima. As condições de amplificação foram como descrito no exemplo 2, exceptuando no que diz respeito à omissão dos últimos 9 ciclos do PCR, devido à menor complexidade dos ADNs em comparação com os ADNs de plantas nos exemplos 2, 3 e 4.

As “impressões digitais” do ADN obtidas com os ADNs bacterianos, como descrito neste exemplo, estão ilustradas na Figura 17. As colunas 1 a 26 representam os ADNs 41 bacterianos 1 a 26. Os tamanhos dos padrões do ADN (que não estão visíveis no gel), em nucleótidos, estão indicados à direita do gel. Esta figura mostra claramente que a proximidade das estirpes bacterianas é reflectida pela semelhança dos perfis de bandas.

EXEMPLO 6: AMPLIFICAÇÕES SELECTIVAS DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DO ADN DE VÁRIOS ANIMAIS COM DUAS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Nos exemplos anteriores, a amplificação selectiva de fragmentos de restrição (SRFA) foi exemplificada para o ADN de plantas de várias origens. Aqui, ilustramos a eficácia do procedimento usando amostras aleatórias de ADN obtido a partir de diferentes animais domésticos. As espécies de animais testadas são: Gallus domesticus (galinha), Susscrofa domestica L. (porco), Bos taurus (vaca), Eauus caballus (cavalo). As enzimas de restrição utilizadas são a Sse8387l e a Msel.

Isolamento e modificação do ADN

Os ADNs foram isolados a partir de amostras de sangue, seguindo os procedimentos descritos por Maniatis et al. (1982). As amostras de ADN 1 a 3 (galinha), 4 a 7 (porco), 8 a 11 (vaca) e 12 a 15 (cavalo) foram digeridas com as enzimas de restrição Sse8387l e Msel. Os fragmentos de ADN foram ligados a adaptadores como descrito no exemplo 2. Como as enzimas de restrição Sse8387l e JPstl geram protuberâncias 3' compatíveis, pudemos usar os adaptadores-Pstl e -Msel descritos no exemplo 2.

Amplificação dos fragmentos de restrição

Os ADNS molde referidos acima e preparados como descrito no exemplo 2 serviram como moldes nas reacções de SRFA. As combinações de iniciadores utilizadas consistiram num único iniciador-Mse], e em diferentes iniciadores-Ssel:

Iniciador-Msel: 5 — GATGAGTCCTGAGTAAtac — 3 lniciador-Sse8387l-1: 5 — GACTGCGTACATGCAGGaa — 3 lniciador-Sse8387l-2: 5 — GACTGCGTACATGCAGGag — 3 42 A amplificação dos fragmentos Sse8387l-Msel usando os pares de iniciadores descritos acima foi efectuada utilizando o protocolo descrito no exemplo 2. Os produtos de reacção foram corridos em géis desnaturantes de poliacrilamida, também descritos no exemplo 2. Uma autoradiografia mostrando “impressões digitais” das amostras acima está ilustrada na Figura 18. As linhas 1 a 15 mostram “impressões digitais” dos ADNs 1 a 15 amplificados com o iniciador-Msel em combinação com o iniciador-Sse8387l-1; as linhas 16 a 30 mostram perfis semelhantes obtidos com o iniciador-Msel combinado com o iniciador-Sse8387l-2. As diferenças nas “impressões digitais" entre os animais de uma espécie reflectem a heterogeneidade nas populações animais; os perfis gerais são característicos de uma espécie específica.

Numa forma de realização particular, a invenção está relacionada com um processo para a amplificação controlada de pelo menos uma parte de um ADN inicial, que contém uma pluralidade de locais de restrição para uma endonuclease de restrição específica e determinada e do qual pelo menos parte da sua sequência de ácido nucleico é desconhecida, processo esse que compreende: a) digerir o referido ADN inicial com a referida endonuclease de restrição específica para o fragmentar na correspondente série de fragmentos de restrição que compreendem, respectivamente, extremidades 5’ e extremidades 3’; b) excepto se os adaptadores 5’ e 3’ definidos a seguir estiverem já em formas separadas, digerir também com a referida endonuclease específica uma determinada molécula de ligação oligonucleotídica de cadeia dupla, possuindo na sua própria sequência nucleotídica um único local de restrição para a referida endonuclease específica, para assim cortar a referida molécula de ligação nos adaptadores 5’ e 3’, respectivamente; c) ligar, nas suas extremidades 5’ e 3’, os fragmentos de restrição obtidos a partir do ADN inicial aos referidos adaptadores 3’ e 5’, respectivamente, para, desta forma, produzir fragmentos de restrição com cauda a partir do ADN inicial, fragmentos estes que compreendem então, nas suas respectivas extremidades 5’ e 3’, caudas cuja sequência nucleotídica compreende as sequências dos adaptadores 3’ e 5’, incluindo os nucleótidos envolvidos no local de restrição específico; 43 d) excepto se os referidos adaptadores 5' e 3’ tiverem sido prolongados, antes da ligação anterior e quando apropriado para proporcionar moldes adequados para os iniciadores, por adição de segmentos oligonucleotídicos com sequências constantes determinadas nas respectivas extremidades 5’ e 3', prolongar, onde apropriado para o mesmo fim, as extremidades correspondentes dos referidos fragmentos de restrição com cauda com os referidos segmentos oligonucleotídicos, de forma a obter fragmentos de restrição com cauda prolongados, em ambas as extremidades, com as referidas sequências constantes; e) contactar os referidos fragmentos de restrição com cauda ou, quando apropriado, prolongados, em condições de hibridação, com dois iniciadores oligonucleotídicos; f) quando os referidos iniciadores incluírem sequências possuindo a mesma sequência nucléotídica que as porções terminais das cadeias das extremidades 5’ e 3’ dos referidos fragmentos de restrição com cauda ou, quando apropriado, prolongados, que são elas próprias complementares das cadeias que actuam como moldes para os referidos iniciadores, incluir nos referidos iniciadores os nucleótidos complementares daqueles envolvidos na formação do local de restrição da referida endonuclease de restrição específica e determinada na cadeia molde; g) amplificar os referidos fragmentos de restrição prolongados, hibridados com os referidos iniciadores, por PCR ou técnicas semelhantes, na presença dos nucleótidos e da polimerase necessários, para originar um maior prolongamento dos iniciadores hibridados ao longo daqueles fragmentos de restrição do ADN inicial com os quais os referidos iniciadores inicialmente hibridaram em todo o seu comprimento, e h) identificar ou recuperar os referidos fragmentos de restrição mencionados por último.

Numa forma de realização particular deste processo, o nucleótido terminal de pelo menos um dos referidos iniciadores no sentido do alongamento pretendido corresponde ao último dos nucleótidos envolvido no local de restrição para a referida endonuclease específica; este processo compreende identificar ou recuperar os fragmentos de restrição do referido ADN inicial que foram amplificados.

Noutra forma de realização particular deste processo, pelo menos um dos referidos iniciadores inclui uma sequência seleccionada compreendendo um número determinado 44 (um ou vários) de nucleótidos que se estende além do último dos nucleótidos envolvidos no local de restrição da referida endonuclease de restrição, no sentido do seu próprio prolongamento ao longo dos correspondentes fragmentos de restrição durante o passo de amplificação.

Numa forma de realização específica do processo acima descrito, a molécula de ligação de cadeia dupla contém vários locais para diferentes endonucleases específicas, que são todos distintos uns dos outros; este processo compreende repetir, num mesmo ADN inicial, os passos do processo definido acima para uma destas endonucleases de restrição, utilizando porém outra das referidas endonucleases específicas e distintas, e usar iniciadores cujas sequências nucleotídicas são seleccionadas como definido na descrição acima, mas em relação à outra endonuclease específica referida. O processo descrito acima ou o processo do oligonucleótido da invenção é apropriado para a identificação de polimorfismos em determinados ADNs originários das mesmas espécies vivas - por exemplo, ADNs genómicos de um microrganismo, planta ou animal, incluindo seres humanos - ou em fragmentos destes ADNs, quer entre eles próprios, quer em relação a um correspondente ADN padrão determinado; esta utilização compreende submeter os ADNs em estudo ao processo ou ao contacto do oligonucleótido, em condições que permitam uma reacção de amplificação ou prolongamento, comparando os perfis de restrição obtidos partindo de cada um dos referidos ADNs e, opcionalmente, do referido ADN padrão, e relacionar a existência e, quando apropriado, a localização desse polimorfismo do ADN com as diferenças observadas entre os tamanhos dos fragmentos de restrição dos diferentes ADNs. A invenção está também relacionada com um ADN fragmentado, cujos diferentes fragmentos possuem sequências que correspondem todas a digestões iniciais do ADN de partida não fragmentado a partir do qual eles foram produzidos com uma mesma endonuclease específica e determinada, caracterizado por todos os referidos fragmentos possuírem caudas nas suas extremidades 5’ e 3’ inseridas por meio de adaptadores, respectivamente, 3’ e 5' determinados que correspondem à porção cortada de uma mesma molécula de ligação de partida, a qual inicialmente incluía um único local de restrição para a referida endonuclease específica, e opcionalmente serem prolongados com sequências constantes determinadas. O ADN fragmentado pode estar na forma de um perfil de migração de bandas num suporte adequado, por exemplo, um suporte de gel, 45 no qual os seus fragmentos foram inicialmente obrigados a migrar sob a influência de um campo eléctrico. O ADN fragmentado também pode compreender porções terminais que incluem oligonucleótidos caracterizados pela seguinte composição, começando da extremidade 5’: i) uma sequência nucleotídica (sequência constante) com pelo menos 10 bases, mas não superior a 30 bases, complementar de uma sequência de ADN determinada que é usada como adaptador; imediatamente seguida por: ii) uma sequência nucleotídica complementar do local-alvo de uma endonuclease de restrição específica usada no passo (a), desde que essa sequência nucleotídica ou parte dela não esteja compreendida em (ii); imediatamente seguida por: iii) uma sequência nucleotídica seleccionada com pelo menos um nucleótido, mas inferior a 10 nucleótidos; por exemplo, possuindo 1 a 5 nucleótidos. A invenção está ainda relacionada com um kit para a fragmentação de determinados ADNs por pelo menos uma endonuclease de restrição específica e para a análise destes fragmentos, que compreende: - a endonuclease de restrição específica; - uma molécula de ligação oligonucleotídica de cadeia dupla possuindo na sua própria sequência nucleotídica um único local para a referida endonuclease específica, para assim cortar a referida molécula de ligação nos adaptadores 5’ e 3', respectivamente; onde a referida molécula de ligação de cadeia dupla possui um tamanho suficiente para originar porções 5’ e 3’ que podem subsequentemente proporcionar moldes para os iniciadores de PCR deste kit; - iniciadores de PCR que compreendem, respectivamente, por um lado, as mesmas sequências que as cadeias dos adaptadores 5’ e 3’ complementares das cadeias que subsequentemente actuam como moldes para os referidos iniciadores; onde os referidos iniciadores incluem ainda os nucleótidos complementares daqueles que estão envolvidos 46 na formação do local de restrição da referida endonuclease de restrição específica e determinada nas cadeias molde; - se apropriado, segmentos oligonucleotídicos com sequências (constantes) determinadas para gerar locais com um comprimento suficiente para a hibridação com os referidos iniciadores; para o alongamento das extremidades 5’ dos referidos adaptadores 5’, das extremidades 3’ dos referidos adaptadores 3’ ou de ambas, antes da digestão da referida molécula de ligação pela referida endonuclease de restrição específica para produzir os respectivos adaptadores 5’ e 3’; ou, alternativamente, para o prolongamento dos fragmentos com cauda obtidos após a ligação dos referidos adaptadores 5’ e 3’ às extremidades dos fragmentos do ADN inicial; - opcionalmente, um padrão de ADN fragmentado correspondendo ao ADN determinado sujeito a um estudo de fragmentação, onde os fragmentos do referido padrão de ADN foram obtidos digerindo-o com a referida endonuclease específica.

Uma forma de realização particular deste kit é tal que os referidos segmentos oligonucleotídicos para o prolongamento de ambos os adaptadores 5’ e 3’ ou de ambas as extremidades 5’ e 3’ dos fragmentos de ADN com cauda possuem sequências nucleotídicas idênticas.

Noutra forma de realização, a molécula de ADN de ligação do kit contém vários locais únicos para endonucleases específicas, todos diferentes uns dos outros, incluindo ainda o referido kit iniciadores que correspondem a cada um dos adaptadores 5’ e 3’ formados por corte da referida molécula de ADN de ligação com as referidas endonucleases diferentes; onde os referidos iniciadores são como definido na reivindicação 8, em relação aos adaptadores 3’ e 5’ que são produzidos a partir da referida molécula de ADN de ligação por hidrólise desta com cada uma das referidas endonucleases específicas.

Também numa forma de realização particular, o kit pode compreender padrões de ADN fragmentado, como definidos acima, em relação às correspondentes endonucleases de restrição específicas, onde cada um dos referidos padrões de ADN fragmentado está relacionado com cada uma das enzimas de restrição específicas e determinadas. 47

Lisboa, u 3 JUL. 2000

ENG? MANUEL MON1Z PEREIRA Agente Oficial da Propriedade Industrial Arco da Conceição, 3,1Í- 1100 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a amplificação de pelo menos um fragmento de restrição obtido a partir de um ADN inicial, processo este que compreende: a) digerir o referido ADN inicial com pelo menos uma endonuclease de restrição para o fragmentar em fragmentos de restrição; b) ligar os fragmentos de restrição obtidos a pelo menos um adaptador oligonucleotídico sintético de cadeia dupla, o qual possui uma extremidade que é compatível para ser ligada a uma ou ambas as extremidades dos fragmentos de restrição, para assim produzir fragmentos de restrição com cauda; c) contactar os referidos fragmentos de restrição com cauda, em condições de hibridação, com pelo menos um iniciador oligonucleotídico; onde o referido iniciador ou iniciadores incluem uma sequência nucleotídica que emparelha com parte da sequência:alvo da endonuclease de restrição presente nos fragmentos de restrição com cauda e que emparelha com parte da sequência do adaptador; e onde pelo menos um dos referidos inicjadores inclui, na sua extremidades 3’, uma sequência seleccionada compreendendo pelo menos um nucleótido situado imediatamente adjacente aos nucleótidos envolvidos na formação da referida sequência-alvo; d) amplificar os referidos fragmentos de restrição com cauda, hibridados com o referido iniciador ou iniciadores, na presença dos nucleótidos e da DNA polimerase necessários, ou prolongar os iniciadores hibridados ao longo daqueles fragmentos de restrição com cauda;e e) identificar ou recuperar os fragmentos de ADN amplificados ou prolongados produzidos no passo (d).
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, no qual, no passo (c), o iniciador ou iniciadores incluem sequências que possuem a mesma sequência nucleotídica que as porções terminais das cadeias nas extremidades dos referidos fragmentos de restrição com cauda, incluindo os nucleótidos envolvidos na formação da sequência-alvo da referida endonuclease de restrição e incluindo pelo menos parte dos nucleótidos 1 presentes nos adaptadores ligados; onde pelo menos um dos referidos iniciadores inclui, na sua extremidade 3’, uma sequência seleccionada que compreende pelo menos um nucleótido situado imediatamente adjacente aos nucleótidos envolvidos na formação da sequência-alvo da referida endonuclease de restrição.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, no qual, no passo (c), o iniciador ou iniciadores emparelham perfeitamente com uma sequência constante de ADN composta por parte da sequência-alvo da endonuclease de restrição e pela sequência do adaptador.
4. Processo da reivindicação 1 ou 2, no qual pelo menos um iniciador compreende uma sequência seleccionada com 1 a 10 nucleótido(s).
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, no qual os iniciadores compreendem 10 a 50 nucleótidos e no qual a sequência-alvo da endonuclease de restrição compreende 4 a 8 nucleótidos.
6 Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, no qual a sequência nucleotídica dos iniciadores que emparelha com o adaptador compreende entre 10 e 30 nucleótidos.
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, no qual os adaptadores são construídos de forma a que a correspondente sequência-alvo da endonuclease não seja reconstituída quando o adaptador híbrida com o(s) fragmento(s) de restrição com cauda; no qual o iniciador ou iniciadores são oligonucleótidos que compreendem uma sequência constante que emparelha perfeitamente com pelo menos uma extremidade da sequência de pelo menos um fragmento de restrição com cauda de uma mistura, sequência constante esta que compreende nucleótidos que emparelham com parte da sequência-alvo da referida endonuclease de restrição; e pelo menos um dos referidos iniciadores inclui, adjacente à extremidade 3’ dos nucleótidos envolvidos na formação da referida sequência-alvo, 1 a 10 nucleótidos seleccionados adicionais.
8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, no qual a sequência de ácido nucleico do ADN inicial é pelo menos em parte desconhecida. 2
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, no qual se utilizam duas endonucleases de restrição diferentes.
10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, no qual todos os iniciadores possuem a mesma sequência nucleotídica constante.
11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, no qual se usa uma mistura de iniciadores diferentes.
12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, no qual pelo menos um iniciador contém 1,2 ou 3 nucleótidos seleccionados na sua extremidade 3’.
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, no qual se utilizam duas endonucleases de restrição diferentes no passo (a) e no qual pelo menos um adaptador oligonucleotídico sintético de cadeia dupla para uma das endonucleases está biotinilado.
14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, no qual pelo menos um iniciador está marcado.
15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, no qual o número de nucleótidos selectivos é escolhido de forma a que o número de fragmentos de restrição que será amplificado esteja limitado a 5-200.
16. Processo para a preparação de um conjunto de fragmentos de restrição amplificados que compreende: a) amplificar um subconjunto de fragmentos de restrição a partir de uma mistura de fragmentos de restrição obtidos de um ADN inicial, usando um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, b) separar os fragmentos de restrição com cauda amplificados, c) identificar os fragmentos de restrição amplificados. 3
17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, no qual o referido ADN inicial a amplificar é ADN genómico de uma amostra biológica humana ou animal, especialmente uma amostra de tecido ou de sangue.
18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, no qual o referido ADN inicial a amplificar é ADN genómico vegetal ou de tecido vegetal.
19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, no qual o referido ADN inicial a amplificar é ADN de um microrganismo.
20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 para a identificação de polimorfismos entre diferentes ADNs iniciais originários da mesma espécie viva, que compreende identificar diferenças observadas entre os fragmentos de restrição amplificados dos diferentes ADNs iniciais.
21. Processo de qualquer uma das reivindicações 1 a 15 para a identificação de polimorfismos nos ADNs genómicos de um microrganismo, planta ou animal, incluindo seres humanos, ou nos seus fragmentos, quer entre eles próprios, quer em relação a um correspondente padrão de ADN determinado.
22. Processo reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 15 para identificar polimorfismos do ADN associados a traços característicos transmitidos geneticamente em seres humanos, polimorfismos do ADN associados a traços característicos transmitidos geneticamente nos animais, polimorfismos do ADN associados a traços característicos transmitidos geneticamente nas plantas e para identificar marcadores do ADN com base nessès polimorfismos do ADN.
23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, que compreende ainda a comparação de dois ou mais fragmentos de ADN amplificados ou prolongados, identificados ou recuperados no passo (e) do referido processo, para detectar semelhanças entre variedades, espécies ou cultivares de plantas ou animais, detectar semelhanças entre microrganismos ou para avaliar distâncias genéticas e caracterizar essas variedades, espécies ou cultivares de plantas ou animais e esses microrganismos. 4
24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, no qual os fragmentos de ADN amplificados ou prolongados, produzidos no passo (e), são identificados ou recuperados como “impressões digitais" do ADN.
25. Processo para a identificação de marcadores do ADN ligados a um traço genético característico, compreendendo o referido processo identificar polimorfismos, de acordo com a reivindicação 23, entre os ADNs iniciais, originários da mesma espécie viva, que exibem diferenças no referido traço genético característico e correlacionar os referidos polimorfismos com o fenótipo exibido pelo referido traço genético característico.
26. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 15, compreendendo ainda os passos de: f) isolar pelo menos um fragmento de ADN identificado ou recuperado no passo (e); g) determinar a sequência nucleotídica dos primeiros 8-10 resíduos nucleotídicos internamente adjacentes à sequência-alvo da endonuclease de restrição, em ambas as extremidades dos referidos fragmentos de ADN; h) construir iniciadores oligonucleotídicos possuindo uma sequência nucleotídica de acordo com os iniciadores do passo (c) da reivindicação 1, nos quais a sequência nucleotídica seleccionada compreende 5 a 10 resíduos nucleotídicos que correspondem aos primeiros 8-12 resíduos nucleotídicos internamente adjacentes aos locais de restrição em ambas as extremidades do referido fragmento de ADN. Lisboa, % JlíL Por KEYGENE N.V.

ENG? MANUEL MONIZ PEREIRA Agente Oficial da Propriedade Industrial Arco da Conceição, 3,1?- 1100 LISBOA 5