PT2539441T - Meio de cultura de células para o crescimento e diferenciação de células da linhagem hematopoiética - Google Patents

Meio de cultura de células para o crescimento e diferenciação de células da linhagem hematopoiética Download PDF

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Assist Publique Hôpitaux De Paris
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Description

DESCRIÇÃO "MEIO DE CULTURA DE CÉLULAS PARA O CRESCIMENTO E DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS DA LINHAGEM HEMATOPOIÉTICA"
Campo da invenção A presente invenção refere-se a um meio de cultura de células para o crescimento e/ou diferenciação de células da linhagem hematopoiética.
Antecedentes técnicos Há uma alta procura contínua de produtos sanguíneos instáveis, em particular para efeitos de transfusão, que não é preenchida satisfatoriamente pelos fornecimentos atuais de sangue humano natural. Como uma consequência, foram explorados numerosos substitutos de sangue natural.
No entanto, as hemoglobinas estabilizadas ou recombinantes têm apresentado desempenhos dececionantes, as indicações para transportadores de oxigénio artificiais são limitadas e o desenvolvimento de glóbulos vermelhos "universais" compatibilizados com o sistema ABO e/ou o antigénio RhD por tratamento enzimático ou dissimulação antigénica é lenta. Há assim uma necessidade de alternativas para estes métodos. A este respeito, tentativas para gerar células eritroides, tais como glóbulos vermelhos, a partir de células estaminais in vitro, são particularmente preferidas .
No entanto, é um desafio considerável reproduzir in vitro o que a natureza demora vários meses para construir in vivo. De facto, no decurso do seu desenvolvimento em humanos, a eritropoiese evolui a partir do mesoderma em duas ondas. A eritropoiese primitiva começa tão cedo quanto a terceira semana de gestação no saco vitelino (tecido extra-embrionário) e dá origem a eritrócitos nucleados primitivos, megaloblásticos, os quais sintetizam hemoglobina embrionária do tipo Gower Ι(ζ2ε2) e Gower II (α2ε2). A eritropoiese definitiva começa durante a quinta semana de gestação na região da aorta-gónada-mesonefro (AGM), antes de migrar para o figado fetal e depois para a medula óssea. As células eritroides produzidas amadurecem pouco a pouco, levando à produção de glóbulos vermelhos enucleados (RBC), normociticos e que contêm hemoglobina fetal (α2γ2) e depois adulta (α2β2).
Até à data foram descritas várias tentativas para produzir glóbulos vermelhos a partir de células estaminais embrionárias humanas, tal como descrito por Ma et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 105:13087-13092. No entanto, estas experiências baseiam-se geralmente num passo de cocultura na presença de células do estroma, o que torna o aumento de escala do processo dificil.
Sumário da invenção A presente invenção resulta da constatação inesperada, pelos inventores, que um meio de cultura de células que compreende insulina, transferrina e plasma ou soro, era útil para a produção maciça de glóbulos vermelhos ou reticulócitos a partir de células estaminais embrio-nárias humanas, células Estaminais Pluripotenciais induzidas (iPS) humanas, ou células estaminais hematopoiéticas humanas, sem o requisito de uma cocultura num estroma celular.
Assim, a presente invenção refere-se a um meio de cultura de células para o crescimento e/ou diferenciação de células da linhagem hematopoiética, que compreende: insulina a uma concentração desde 1 a 50 yg/mL; transferrina a uma concentração desde 100 yg/mL a 2000 yg/mL; e plasma ou soro a uma concentração desde 1% a 30%. A presente invenção refere-se também à utilização de um meio de cultura de células como definido acima para o crescimento e/ou diferenciação de células da linhagem hematopoiética. A presente invenção refere-se ainda a um método para fazer crescer e/ou diferenciar células da linhagem hematopoiética que compreende pelo menos um passo de cultivar células com um meio de cultura de células como definido acima.
Breve descrição das figuras A Figura 1 mostra a expansão e diferenciação de células eritroides. Amplificação de células CD34+ humanas obtidas por leucaférese mobilizada com G-CSF (LK) e cultivadas na presença de 5% de plasma humano de acordo com um protocolo de três fases (ver Materiais e Métodos) . Os pontos são os valores médios para quatro experiências independentes. A Figura 2 mostra a análise por citometria de fluxo da expressão de CD71, CD36, glicoforina A e RhD no dia 18. Os histogramas sólidos representam mAbs relevantes e os controlos negativos abertos com mAbs irrelevantes. Esta figura mostra uma experiência representativa de quatro análises independentes. A Figura 3 mostra os perfis de deformabilidade de reticulócitos derivados por LK no dia 18 de cultura (esquerda) e RBC de controlo (direita). Foi utilizada ectacitometria num gradiente osmolar para medir o alongamento de eritrócitos enucleados (ver Materiais e Métodos). As curvas definem as variáveis do osmoscan, i.e. o indice de def ormabilidade máximo (DImax) e Ohyper e Chin, determinados sob condições isotónicas, hipertónicas e hipotónicas, respetivamente. Os valores normais das variáveis foram obtidos testando amostras de 144 adultos normais e variaram desde 0,41 a 0,53 para o DImax, desde 143 a 163 mOsm/Kg para o Omin e desde 335 a 375 mOsm/Kg para o
Ohyper· A Figura 4 mostra o estado da hemoglobina dos reticulócitos do dia 18 determinado através de análise por HPLC (Bio-Rad Variant II). A percentagem de hemoglobina no pico de eluição é indicada para as frações de HbF, HbAlc, HbA2 e HbA total. A Figura 5 mostra as curvas tonométricas de ligação de oxigénio a 37 °C para uma suspensão de reticulócitos (triângulos) e uma suspensão de RBC de controlo a diferentes proporções de DPG/Hb4 em tampão Hepes 10 mM (pH 7,4) que contém NaCl 150 mM. As isotérmicas de RBC foram simuladas a partir dos parâmetros MWC médios para 10 amostras de sangue diferentes. A Figura 6 mostra uma representação esquemática dos passos de cultura sucessivos utilizados para a produção de células eritroides a partir de hESC. Agregados de hESC indiferenciadas foram cultivados em "meio de EB" durante 20 dias. Os EB do dia 15 a dia 20 dissociados foram em seguida cultivados num meio liquido durante até 28 dias na presença de cocktails sequenciais de citocinas (ver Materiais e Métodos). A Figura 7 mostra a percentagem de expressão dos marcadores hematopoiéticos CD45, CD34 e CD45/CD34 (eixo do y esquerdo) de células derivadas de hESC durante a diferenciação de EB e a cinética de formação de CFC (eixo do y direito) nos EB do dia 6 a dia 20 (uma experiência representativa). A Figura 8 mostra os marcadores eritroides CD71, CD36 e GlycoA de células derivadas de hESC durante a diferenciação de EB. A Figura 9 mostra a compromisso à linhagem eritroide em cultura líquida. Foram recolhidas alíquotas das culturas líquidas nos tempos indicados para análise morfológica das células. Proeritroblastos (ProE)/ eritro-blastos basófilos (BasoE); eritroblastos policromatófilos (PolyE); eritroblastos ortocromáticos (OrthoE); glóbulos vermelhos cultivados (cRBC). Uma experiência representativa . A Figura 10 mostra a expressão do antigénio RhD em cRBC derivados de EWC. Os cRBCs em enucleação gerados a partir da cultura de EBs foram marcados com um anticorpo anti-RhD (Biotest, Seraclone® Reagentes para Tipagem ABO do Sangue). As células são reveladas com um anticorpo anti-humano de coelho secundário conjugado com ficoeritrina (Beckman). A Figura 11 mostra o tamanho das células eritroides sob várias condições de cultura no dia 25 de cultura liquida. 0 tamanho das células foi medido com um micrómetro ótico em 100 células em cada case. AD (células aderentes); NA (células não aderentes); NA/MS5, NA/MSC, NA/MQ (células não aderentes cocultivadas em células MS5, MSC e macrófagos, respetivamente); PB (RBC de sangue periférico adulto). A Figura 12 mostra perfis de RP-HPLC representativos de cadeias de globinas identificadas através de análise por espetrometria de massa e HPLC da Hb, para os cRBC do dia 25 derivados de EWC. A Figura 13 mostra perfis de RP-HPLC representativos de cadeias de globina identificadas através de análise por espetrometria de massa e HPLC da Hb, para os cRBC do dia 24 derivados de células sanguíneas do cordão umbilical. A Figura 14 mostra a cinética de religação de CO após fotólise de relâmpago da hemoglobina de cRBC (curvas a preto com triângulos) e hemoglobina de RBC nativos de controlo (curvas a preto com circulos). As duas amostras exibem propriedades de ligação semelhantes, incluindo a transição alostérica. Através da variação da energia do impulso de fotólise, pode variar-se a fração total de hemoglobina dissociada e, desse modo, sondar em pormenor as várias populações parcialmente ligadas. A altos niveis de fotólise são produzidos mais tetrâmeros ligados de forma simples, que mudam para a conformação desoxilo (estado T) e religam os ligandos mais lentamente. A níveis intermédios (médios) pode sondar-se melhor os tetrâmeros duplamente ligados, uma forma difícil de estudar por técnicas de equilíbrio. A níveis de fotólise suficientemente baixos, o fotoproduto principal é tetrâmeros triplamente ligados que religam os ligandos rapidamente (estado R) . A percentagem de transição alostérica R -> T é mostrada a diferentes intensidades de fotodissociação de CO. A cinética de religação de CO pode ser simulada utilizando dois termos exponenciais para a velocidade rápida inerente à espécie tetramérica na conformação de estado R e a velocidade lenta inerente à conformação de estado T. A velocidade do estado R é tipicamente 6xl06/ms, enquanto a velocidade do estado T é cerca de 20 vezes mais lenta. A fração de tetrâmeros de estado T é muito mais alta para a HbF e a Hb dos cRBC-EWC em comparação com a HbA a diferentes intensidades de fotodissociação por laser, devido a um deslocamento da transição alostérica. O aumento na transição alostérica para os tetrâmeros de estado T de baixa afinidade após adição de IHP 1 mM (hexafosfato de inositol) é maior para a HbA do que para a HbF e a Hb dos cRBC-EWC. Isto pode ser explicado por uma menor afinidade da HbF para o IHP como já foi descrito para o 2,3 DPG e/ou pela maior percentagem de transição R -> T na ausência de efetor alostérico para a HbF em comparação com a HbA.
Descrição detalhada da invenção
Como aqui pretendido a expressão "células da linhagem hematopoiética" refere-se às células que se encontram no sangue de mamíferos, em particular de humanos, e às células responsáveis pela produção de tais células sanguíneas após diferenciação. Mais particularmente, a expressão "células da linhagem hematopoiética" de acordo com a invenção refere-se a células da linhagem eritro-citária, isto é glóbulos vermelhos (também chamados eritrócitos) e células que são responsáveis pela produção de glóbulos vermelhos após diferenciação, quer diretamente, i.e. num passo, ou indiretamente, i.e. em vários passos. Como é bem conhecido para um especialista na técnica, as células da linhagem eritrocitária compreendem especialmente, classificadas por grau crescente de diferenciação, células estaminais embrionárias, células estaminais hematopoiéticas (HSCs), proeritroblastos, eritroblastos, reticulócitos, células enucleadas, em particular reticu-lócitos enucleados, e glóbulos vermelhos. Assim, as células da linhagem hematopoiética de acordo com a invenção abrangem especialmente células estaminais, em particular células estaminais embrionárias (ESC), células estaminais adultas, tais como células estaminais hematopoiéticas (HSCs), células estaminais pluripotenciais induzidas (iPS) , bem como corpos embrioides, mas também proeritroblastos, eritroblastos, reticulócitos e células enucleadas, em particular reticulócitos enucleados. Preferencialmente, as células da linhagem hematopoiética da invenção são células humanas.
As células iPS são bem conhecidas para um especialista na técnica. Podem ser obtidas por numerosos métodos e a partir de numerosos tipos de células. A titulo de exemplo, as células iPS podem ser obtidas seguindo os ensinamentos de Takahashi & Yamanaka (2006) Cell 126:663-676 e Yamanaka et al. (2007) Nature 448:313-317
Como aqui pretendido, o termo "crescimento" refere-se à multiplicação de células cultivadas. Como aqui pretendido, o termo "diferenciação" refere-se à aquisição pelas células cultivadas num meio de cultura de caracteristicas celulares que não estão presentes nas células inicialmente utilizadas para semear o meio de cultura de células. Como aqui pretendido "diferenciação" indica especialmente a aquisição de caracteristicas que comprometem adicionalmente as células na via de diferenciação em glóbulos vermelhos. Assim, o meio de cultura de células da invenção é particularmente útil para crescer células indiferenciadas, tais como células estaminais embrionárias, células estaminais adultas, tais como células estaminais hematopoiéticas, células estaminais pluripotenciais induzidas (iPS), ou corpos embrioides, e diferenciá-las em reticulócitos, células enucleadas ou glóbulos vermelhos.
Como aqui pretendido a expressão "meio de cultura de células" refere-se a qualquer meio, em particular qualquer meio liquido, responsável por suportar o crescimento de células eucarióticas, em particular células de mamíferos, mais particularmente células humanas.
Preferencialmente, o meio de cultura de células da invenção é constituído por um meio de cultura base ao qual é adicionado: insulina a uma concentração desde 1 a 50 yg/mL; transferrina a uma concentração desde 100 yg/mL a 2000 yg/mL; e plasma ou soro a uma concentração desde 1% a 30%.
Preferencialmente, o meio de cultura base é responsável por si só por suportar em geral o crescimento de células eucarióticas, em particular de células de mamíferos, mais particularmente de células humanas. Tais meios de cultura base são bem conhecidos de um especialista na técnica. A título de exemplo, pode citar-se o Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) opcionalmente complementado com glutamina ou um péptido que contém glutamina. Assim, o meio de cultura de células de acordo com a invenção compreende ainda preferencialmente o Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) opcionalmente complementado com glutamina ou um péptido que contém glutamina.
Preferencialmente, a insulina de acordo com a invenção é insulina recombinante humana. Também preferencialmente, a insulina está a uma concentração desde 5 yg/mL a 20 yg/mL, mais preferencialmente a uma concentração desde 8 yg/mL a 12 yg/mL, e muito preferencialmente a uma concentração de cerca de 10 yg/mL.
Preferencialmente, a transferrina é transferrina humana. Preferencialmente, a transferrina é saturada em ferro. Preferencialmente, a transferrina está também a uma concentração desde 200 yg/mL a 1000 yg/mL, mais preferencialmente a uma concentração desde 300 yg/mL a 500 yg/mL, e muito preferencialmente a uma concentração de cerca de 330 yg/mL ou 450 yg/mL. A transferrina pode ser recombinante.
Preferencialmente, o plasma ou soro é plasma ou soro humano. Também preferencialmente, o plasma ou soro está a uma concentração desde 1% a 20%, mais preferencialmente a uma concentração desde 4% a 12%, ainda mais preferencialmente a uma concentração desde 5% a 10%, e muito preferencialmente a uma concentração de cerca de 5% ou 10%.
Numa forma de realização, o meio de cultura de células da invenção compreende ainda heparina, em particular a uma concentração de 0,5 UI/mL a 5 UI/mL, mais particularmente a uma concentração desde 1,5 a 3,5 UI/mL, e muito preferencialmente a uma concentração de cerca de 2 UI/mL. Preferencialmente, o meio de cultura de células da invenção compreende heparina quando está também compreendido soro no meio de cultura de células.
Noutra forma de realização, o meio de cultura de células da invenção compreende ainda eritropoietina (Epo), em particular eritropoietina recombinante humana, preferencialmente a uma concentração desde 0,5 UI/mL a 20 UI/mL, mais preferencialmente a uma concentração desde 2,5 UI/mL a 3,5 UI/mL, e muito preferencialmente a uma concentração de cerca de 3 UI/mL.
Noutra forma de realização, o meio de cultura de células da invenção compreende ainda o fator de células estaminais (SCF) , em particular fator de células estaminais recombinante humano, preferencialmente a uma concentração desde 50 ng/mL a 200 ng/mL, mais preferencialmente a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL, e muito preferencialmente a uma concentração de cerca de 100 ng/mL.
Noutra forma de realização, o meio de cultura de células da invenção compreende ainda interleucina-3 (IL-3), em particular interleucina-3 recombinante humana, preferencialmente a uma concentração desde 1 ng/mL a 30 ng/mL, mais preferencialmente a uma concentração desde 4 ng/mL a 6 ng/mL, e muito preferencialmente a uma concentração de cerca de 5 ng/mL.
Numa outra forma de realização, o meio de cultura de células de acordo com a invenção, compreende ainda hidrocortisona, preferencialmente a uma concentração desde 5,10-7 a 5,10-6 M, mais preferencialmente a uma concentração de cerca de IO-6 M.
Ainda noutra forma de realização, o meio de cultura de células de acordo com a invenção compreende ainda pelo menos um composto selecionado de:
Trombopoietina (TPO), em particular trombopoietina humana recombinante, preferencialmente a uma concentração desde 20 ng/mL a 200 ng/mL, mais preferencialmente a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL, muito preferencialmente a uma concentração de cerca de 100 ng/mL; ligando de tirosina-cinase 3 semelhante a FMS (FLT3), em particular ligando de FLT3 humano recombinante, preferencialmente a uma concentração desde 20 ng/mL a 200 ng/mL, mais preferencialmente a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL, muito preferencialmente a uma concentração de cerca de 100 ng/mL; proteina morfogenética do osso 4 (BMP4), em particular proteina morfogenética do osso 4 humana recombinante, preferencialmente a uma concentração desde 1 ng/mL a 20 ng/mL, mais preferencialmente a uma concentração desde 8 ng/mL a 12 ng/mL, muito preferencialmente a uma concentração de cerca de 10 ng/mL; fator de crescimento do endotélio vascular A165 (VEGF-A165), em particular VEGF-A165 humano recombinante, preferencialmente a uma concentração desde 1 ng/mL a 20 ng/mL, mais preferencialmente a uma concentração desde 4 ng/mL a 6 ng/mL, muito preferencialmente a uma concentração de cerca de 5 ng/mL; e interleucina-6 (IL-6), em particular IL-6 humana re-combinante, preferencialmente a uma concentração desde 1 ng/mL a 20 ng/mL, mais preferencialmente a uma concentração desde 4 ng/mL a 6 ng/mL, muito preferencialmente a uma concentração de cerca de 5 ng/mL.
Preferencialmente, o meio de cultura de células da invenção é utilizado para cultivar células estaminais hematopoiéticas (HSCs) e diferenciar as HSCs em reti-culócitos, células enucleadas e/ou glóbulos vermelhos. Também preferencialmente, o meio de cultura de células da invenção é utilizado para cultivar corpos embrioides (EBs), em particular obtidos a partir de células estaminais embrionárias, e diferenciar os EBs em reticulócitos, células enucleadas e/ou glóbulos vermelhos. Como será claro para um especialista na técnica, os reticulócitos, as células enucleadas e/ou os glóbulos vermelhos podem ser obtidos como populações de células substancialmente puras ou como misturas de reticulócitos, de células enucleadas e/ou de glóbulos vermelhos.
Preferencialmente, o método da invenção é para diferenciar HSCs em reticulócitos, células enucleadas, glóbulos vermelhos ou uma mistura dos mesmos, e compreende: num primeiro passo, cultivar HSCs durante 5 a 9 dias, em particular durante 7 dias, num meio de cultura de células que compreende: insulina a uma concentração de 8 a 12 yg/mL; transferrina a uma concentração desde 300 a 350 yg/mL; plasma a uma concentração desde 3% a 7%; heparina a uma concentração desde 1,5 UI/mL a 2,5 UI/mL; hidrocortisona a uma concentração desde 5, IO-7 a 5,10~6 M; SCF a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL; IL-3 a uma concentração desde 4 ng/mL a 6 ng/mL;
Epo a uma concentração desde 2,5 a 3,5 UI/mL; num segundo passo, cultivar as células obtidas no primeiro passo durante 2 a 5 dias, em particular durante 3 a 4 dias, num meio de cultura de células que compreende: insulina a uma concentração de 8 a 12 pg/mL; transferrina a uma concentração desde 300 a 350 pg/mL; plasma a uma concentração desde 3% a 7%; heparina a uma concentração desde 1,5 UI/mL a 2,5 UI/mL; hidrocortisona a uma concentração desde 5,IO-7 a 5,IO-6 M; SCF a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL;
Epo a uma concentração desde 2,5 a 3,5 UI/mL; num terceiro passo, cultivar as células obtidas no segundo passo durante 6 a 10 dias, em particular até ao dia 18 a 21 desde o início do primeiro passo, num meio de cultura de células que compreende: insulina a uma concentração de 8 a 12 pg/mL; transferrina a uma concentração desde 300 a 350 pg/mL; plasma a uma concentração desde 3% a 7%; heparina a uma concentração desde 1,5 UI/mL a 2,5 UI/mL; hidrocortisona a uma concentração desde 5,IO-7 a 5,IO-6 M;
Epo a uma concentração desde 2,5 a 3,5 UI/mL; obtendo-se desse modo reticulócitos, células enu-cleadas, glóbulos vermelhos, ou uma mistura dos mesmos.
Também preferencialmente, o método da invenção é para diferenciar EBs em glóbulos vermelhos, reticulócitos, células enucleadas, ou uma mistura dos mesmos e compreende: num primeiro passo, cultivar EBs durante 15 a 25 dias, em particular durante 20 dias, num meio de cultura de células que compreende: insulina a uma concentração de 8 a 12 pg/mL; transferrina a uma concentração desde 425 a 475 pg/mL; plasma a uma concentração desde 3% a 7%/ heparina a uma concentração desde 1,5 UI/mL a 2,5 UI/mL; SCF a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL; TPO a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL; ligando de FLT3 a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL; BMP4 a uma concentração desde 8 ng/mL a 12 ng/mL; VEGF-A165 a uma concentração desde 4 ng/mL a 6 ng/mL; IL-3 a uma concentração desde 4 ng/mL a 6 ng/mL; IL-6 a uma concentração desde 4 ng/mL a 6 ng/mL;
Epo a uma concentração desde 2,5 a 3,5 UI/mL; num segundo passo, dissociar as células obtidas no primeiro passo e cultivar as células dissociadas durante 6 a 10 dias, em particular durante 8 dias, num meio de cultura de células que compreende: insulina a uma concentração de 8 a 12 pg/mL; transferrina a uma concentração desde 425 a 475 pg/mL; plasma a uma concentração desde 8% a 12%/ heparina a uma concentração desde 2,5 UI/mL a 3,5 UI/mL; SCF a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL; IL-3 a uma concentração desde 4 ng/mL a 6 ng/mL;
Epo a uma concentração desde 2,5 a 3,5 UI/mL; num terceiro passo, cultivar as células obtidas no segundo passo durante 2 a 4 dias, em particular durante 3 dias, num meio de cultura de células que compreende: insulina a uma concentração de 8 a 12 pg/mL; transferrina a uma concentração desde 425 a 475 pg/mL; plasma a uma concentração desde 8% a 12%; heparina a uma concentração desde 2,5 UI/mL a 3,5 UI/mL; SCF a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL;
Epo a uma concentração desde 2,5 a 3,5 UI/mL; num quarto passo, cultivar as células obtidas no terceiro passo durante 2 a 4 dias, em particular durante 3 dias, num meio de cultura de células que compreende: insulina a uma concentração de 8 a 12 pg/mL; transferrina a uma concentração desde 425 a 475 pg/mL; plasma a uma concentração desde 8% a 12%; heparina a uma concentração desde 2,5 UI/mL a 3,5 UI/mL;
Epo a uma concentração desde 2,5 a 3,5 UI/mL; num quinto passo, cultivar as células obtidas no terceiro passo durante 8 a 12 dias, em particular durante 10 dias, (i) num meio de cultura de células que compreende: insulina a uma concentração de 8 a 12 yg/mL; transferrina a uma concentração desde 425 a 475 yg/mL; plasma a uma concentração desde 8% a 12%; heparina a uma concentração desde 2,5 UI/mL a 3,5 UI/mL;
Epo a uma concentração desde 2,5 a 3,5 UI/mL; ou (ii) numa camada de estroma aderente; obtendo-se desse modo glóbulos vermelhos, reticulócitos, células enucleadas ou uma mistura dos mesmos. EXEMPLOS:
Exemplo 1: Produção de reticulócitos in vitro a partir de células estaminais hematopoiéticas
Materiais e Métodos
Cultura de células
Sangue periférico normal mobilizado com G-CSF [células de leucaférese (LK)] foi obtido a partir de doadores saudáveis com consentimento escrito. As células CD34+ foram isoladas por seleção com microesférulas super-magnéticas utilizando colunas Mini-MACS (Miltenyi Biotech, Bergisch Glodbach, Alemanha) (pureza > 94 ± 3 %).
As células foram cultivadas em IMDM (meio de Dulbecco modificado por Iscove, Biocrom, Alemanha) suplementado com L-glutamina 2 mM (Invitrogen, Cergy-Pontoise, França), 330 yg/mL de transferrina humana saturada com ferro, 10 yg/mL de insulina (Sigma, Saint-Quentin Fallavier, França), 2 IU/mL de heparina Choay (Sanofi, França) e 5% de plasma inativado para virus com solvente/detergente (S/D). O procedimento de expansão compreendeu três passos. No primeiro passo (dias 0-7), 104/mL de células CD34+ foram cultivadas na presença de hidrocortisona IO-6 M (HC) (Sigma), 100 ng/mL de SCF (generosamente proporcionado por Amgen, Thousand Oaks, CA), 5 ng/mL de IL-3 (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido) e 3 IU/mL de Epo (Eprex, generosamente proporcionado por Janssen-Cilag, Issy-les-Moulineaux, França). No dia 4, um volume de cultura de células foi diluído em quatro volumes de meio fresco que continha HC, SCF, IL-3 e Epo. No segundo passo (3-4 dias), as células foram ressuspensas a 105/mL em meio fresco suplementado com SCF e Epo. No terceiro passo (até dia 18-21), as células foram cultivadas em meio fresco na presença de Epo sozinha. As contagens de células foram ajustadas a 5xl05 e l,5xl06 células/mL nos dias 11 e 14, respetivamente. As culturas foram mantidas a 37 °C em 5% de CO2 em ar e os resultados são apresentados em termos da velocidade efetiva de expansão após aplicação.
As células foram reveladas com os reagentes May-Grunwald-Giemsa e novo azul de metileno (Sigma) , para as análises morfológicas, enquanto as células enucleadas foram monitorizadas para os parâmetros hematológicos padrão incluindo o MCV (fL), MCHC (%) e MCH (pg/célula) utilizando um autómato XE2100 (Sysmex, Roche Diagnostics, Basel, Suiça).
Citometria de fluxo
As células foram marcadas com anticorpos não conjugados ou conjugados com isotiocianato de fluoresceina (FITC) ou ficoeritrina (PE) . Foram utilizados anticorpos contra CD71-FITC e CD36-FITC (Becton Dickinson, San Jose, CA) , glicoforina A-PE, CD45-FITC e CD34-PE (Beckman Coulter, Marseille, França) para fenotipagem. Um anticorpo anti-RhD humano primário e um anticorpo anti-humano de cabra secundário conjugado com PE (Beckman Coulter) foram utilizados para determinação de RhD. As análises foram realizadas num citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson) utilizando o software Cell Quest.
Medições da deformabilidade
Os reticulócitos obtidos no dia 18 de cultura foram separados das células nucleadas por passagem através de um filtro de desleucocitação (Leucolab LCG2, Macopharma, Tourcoing, França) e as células enucleadas foram examinadas por ectacitometria, um método de difração por laser. No ectacitómetro (Technicon, Bayer Corp., Diagnostics Division, Tarrytown, NY) , as células foram suspensas em solução de polivinilpirrolidona a 4% e expostas a um gradiente osmótico crescente (60 a 450 mOsm/Kg). A alteração no padrão de difração de laser das células foi registada. Esta medição fotométrica produz um sinal chamado o indice de deformabilidade (Dl) . A análise da curva Dl proporciona uma medição da deformabilidade dinâmica da membrana celular como uma função da osmolalidade a um esforço de cisalhamento aplicado constante de 170 dynes/cm2. O DImax, expressado em unidades arbitrárias e definido como o valor máximo do Dl, está normalmente relacionado com a área superficial média das células vermelhas. A Omin define a osmolalidade à qual é obtida um valor mínimo de Dl sob condições hipotónicas e depende da proporção superf ície/volume inicial. A OHyper é a osmolalidade à qual o Dl diminui para metade do valor de DImax na região hipertónica da curva e está inversamente relacionada com a MCHC.
Atividades enzimáticas
Foi adicionada digitonina (0,2%) aos eritrócitos obtidos após depleção dos leucócitos e a Hb foi quantificada por espetrofotometria utilizando reagente de Drabkin. As atividades glicose-6-fosfato-desidrogenase e piruvato-cinase foram determinadas medindo a velocidade de aumento na absorvância de NADPH a 340 nm, utilizando um espetrofotómetro Synchron CX4 Beckman e reagentes de Randox Laboratories (Crumlin, Reino Unido) e Roche Diagnostics, respetivamente. Os resultados foram expressos em unidades por grama de Hb.
Análises de Hb
As frações de Hb foram separadas e quantificadas por cromatografia liquida de alta eficiência de troca iónica. As análises foram realizadas sobre sedimentos celulares lavados utilizando o programa Bio-Rad Variant II dual (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) de acordo com as instruções do fabricante.
Equilíbrios de ligação de oxigénio em solução
As curvas de ligação de oxigénio foram determinadas por tonometria num 7 0 mL tonómetro com uma cuvete com 1 cm de percurso ligada. As medições espetrais foram realizadas com um espetrofotómetro Cary 50 e a temperatura foi controlada com um módulo Peltier. As análises foram realizadas a 37 °C em bis-Tris 50 mM (pH 7,2) contendo NaCl 140 mM e glicose 2 mM. Após desoxi-genação meticulosa sob azoto, as suspensões de glóbulos vermelhos foram equilibradas a diferentes pressões parciais de oxigénio por injeção de volumes conhecidos de oxigénio puro no tonómetro através de uma tampa de borracha utilizando uma seringa Hamilton. A saturação fracionada foi estimada por estimulação dos espetros de absorção nas regiões visível e Soret como uma combinação linear dos espetros totalmente desoxigenados e oxigenados de uma suspensão de RBC, utilizando uma rotina de ajuste de mínimos quadrados do Software Scientist (Micromath Scientific Software, Salt Lake City, UT).
Resultados 1.1. Diferenciação de células estaminais hemato-poiéticas em reticulócitos
Partindo de HSC CD34+ derivadas de sangue periférico de doadores saudáveis após mobilização com G-CSF (células LK) foi concebido um protocolo de três passos na presença de 5% de plasma inativado para vírus com solvente/detergente (plasma S/D) . Em primeiro lugar, a proliferação celular e o compromisso eritroide foram induzidos com SCF, IL-3 e Epo durante 7 dias. Em segundo lugar, a proliferação eritroide foi amplificada com SCF e Epo durante 3-4 dias. No terceiro passo, as células foram mantidas até à maturação final na presença de Epo sozinha até ao dia 18-21. Pelo dia 18, obteve-se um patamar com uma amplificação média de células CD34+ de 66 200 ± 24 000 vezes (Figura 1) e pelo dia 18 a percentagem de células enucleadas foi de 74 ± 5 %. Nesta etapa, todas as células exibiram características de reticulócitos como avaliadas por análise de fluxo de corante polimetine (XE2100-Sysmex) e por revelação com novo azul de metileno. O volume celular médio (MCV) foi de 141 ± 6 fL, a concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC) de 30 ± 2% e a hemoglobina celular média (MCH) de 42 ± 1 pg. A caracterização imunológica desta população confirmou o perfil de reticulócito das células (Figura 2), que expressavam glicoforina A (GPA), CD71 (recetor de transferrina) e CD36 (glicoproteína de plaquetas IV) a 99 ± 1 %, 44 ± 10 % e 11 ± 4 %, respetivamente. 1.2. Análise funcional dos reticulócitos gerados a partir de células estaminais hematopoiéticas A fim de realizar uma análise funcional exata, os reticulócitos obtidos no dia 18 de cultura foram separados das células nucleadas por passagem através de um filtro de desleucocitação (Leucolab LCG, Macopharma). Estes reticulócitos tinham um teor de glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD) de 65 ± 3 unidades e um nivel de piruvato-cinase (PK) de 94 ± 7 unidades por grama de hemoglobina (Hb), em concordância com a natureza de uma população de glóbulos vermelhos homogéneos jovens (Jansen et al. Am J Hematol 1985; 20, 203-215) . Isto indica que foram capazes de reduzir a glutationa e manter os niveis de ATP, assegurando desse modo niveis normais de 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG). A deformabilidade da membrana dos reticulócitos foi analisada por ectacitometria de varrimento osmótico que mede o alongamento de eritrócitos. Isto produz um sinal que se chama o indice de deformabilidade (Dl) e o alongamento máximo (DImax) refere-se à área superficial média das células (Clark et al. Blood 1983/ 61, 899-910 e Mohandas et al. J Clin Invest 1980/ 66, 563-573). O DImax (0,63) dos reticulócitos, que tinham um volume médio maior, correspondeu aos niveis esperados e confirmou a deformabilidade normal destas células (Figura 3) . A Omin inferior a 80 mOsm/kg indicou uma proporção superficie/volume aumentada e fragilidade osmótica reduzida dos reticulócitos, enquanto o valor normal de Ohyper (362 mOsm/kg) confirmou a sua hidratação normal. Estes dados mostram que as propriedades reológicas foram mantidas nos reticulócitos cultivados.
Os reticulócitos gerados in vitro continham hemoglobina A adulta (HbA) (96 ± 0,1 %), indicando um processo normal de síntese de Hb nestas condições (Figura 4).
As medições tonométricas de equilíbrio de oxigénio mostraram que uma suspensão de reticulócitos ligava e libertava oxigénio da mesma maneira que uma suspensão de RBC nativos. A afinidade para o oxigénio (P50) foi 28 mm de Hg para os reticulócitos em comparação com 26 ± 1 mm de Hg para os RBC nativos (Kister et al. J Biol Chem 1987/ 262, 12085-12091 e Girard et al. Respir Physiol 1987/ 68, 227-238), enquanto os coeficientes de Hill (nso) foram iguais a 2,4 ± 0,1 para ambas as amostras. A Figura 5 representa isotérmicas de ligação de oxigénio a diferentes proporções DPG/Hb4 (da esquerda para a direita: < 0,2/ proporção normal « 1/ 2,4) simuladas a partir das curvas de ligação de oxigénio utilizando os parâmetros do modelo MWC (Girard et al. Respir Physiol 1987; 68, 227-238). Estes resultados indicam que os niveis de 2,3-DPG nos reticulócitos são provavelmente próximos da concentração do tetrâmero de Hb, como se observa para as velocidades de glicólise dos RBC nativos. A depleção de 2,3-DPG em comparação com uma concentração normal diminui a P50 duas vezes, enquanto um aumento no 2,3-DPG após incubação prolongada dos RBC com glicose 10 mM aumenta a P50 em cerca de 60 %.
Exemplo de Referência 2: Produção in vitro de glóbulos vermelhos a partir de células estaminais embri-onárias
Materiais e Métodos
Culturas de hESC indiferenciadas A linha de células hES Hl (National Institute of Health [NIH] código WA01, passagens 23-45) foi mantida num estado indiferenciado por passagem mecânica semanal em células alimentadoras primárias de fibroblastos embrionários de murganho (MEF) tratadas com mitomicina (20 yg/mL; Sigma, Saint-Quentin Fallavier, França) em meio de Eagle modificado por Dulbecco inativado (DMEM, Invitrogen, Cergy Pontoise, França) suplementado com 20% de substituto de soro inativado (Invitrogen) e (rhu)FGF2 humano recombinante (10 ng/mL; Peprotech, Neuilly-sur-Seine, França).
Formação de corpos embrioides (EB)
No primeiro dia, hESC indiferenciadas foram tratadas com colagenase IV (1 mg/mL; Invitrogen) e transferidas para placas de baixa fixação (Nunc, Dutscher, Brumath, França) para permitir a formação de corpos embrioides (EB) durante incubação de um dia para o outro em meio de diferenciação (DMEM inativado suplementado com 20% de soro fetal bovino não termicamente inativado, 1% de aminoácidos não essenciais, L-glutamina 1 mM e β-mercaptoetanol 0,1 mM, Invitrogen). No dia seguinte, os EB foram suspensos em meio de cultura liquido (LCM) (IMDM-glutamax, Biocrom, Berlim, Alemanha) que continha 450 yg/mL de transferrina humana saturada com ferro (Sigma), 10 yg/mL de insulina (Sigma) , 5% de plasma humano e 2 U/mL de heparina, na presença de SCF, TPO, ligando de FLT3 (100ng/mL), proteína morfogenética do osso 4 rhu (BMP4; lOng/mL), VEGF-A165 rhu, IL-3, IL-6 (5ng/mL) (Peprotech) e Epo (3 U/mL) (Eprex, generosamente proporcionada por Janssen-Cilag, França) (subsequentemente referido como meio de EB). Os EB foram cultivados durante 20 dias a 37 °C numa atmosfera com 5% de C02 humidificada, com mudança do meio e citocinas a cada 2 ou 3 dias. As células foram dissociadas numa suspensão de células únicas por incubação com colagenase B (0,4 U/mL; Roche Diagnostics, Laval, QC, Canadá) durante 30 min a 37 °C e, em seguida, tampão de dissociação de células (Invitrogen) durante 10 min num banho-maria a 37 °C, seguido de pipetagem suave e passagem através de uma malha de 70ym.
Geração de cRBC
Dia 0 a dia 8: Os EB dissociados foram contados e aplicados a uma densidade de lxlO6 células/mL em LCM que continha 10% de plasma humano e 3 U/mL de heparina, na presença de SCF (100ng/mL) , IL-3 (5ng/mL) e Epo (3 U/mL) . No dia 1, as células não aderentes (NA) (4xl05/mL) e células aderentes (AD) (106/mL) foram aplicadas separadamente no mesmo meio e citocinas e cultivadas durante 8 dias. No dia 4, um volume da cultura de células foi diluído em quatro volumes de meio fresco que continha SCF, IL-3 e Epo. Dia 8 a dia 11: As células foram suspensas a uma densidade de 3xl05 células (NA) ou 105 (AD)/mL e cultivadas em meio fresco suplementado com SCF e Epo. Dia 11 a dia 15: As células foram suspensas a 106/mL (células NA e AD) e cultivadas em meio fresco suplementado com Epo. Dia 15 a dia 25: As células NA e AD foram suspensas a 2xl06 células/mL em LCM que continha 10% de plasma humano e Epo, ou cocultivadas numa camada de estroma aderente. As culturas foram mantidas a 37 °C em 5% de C02 em ar. Células do estroma
Foram avaliadas três fontes de camadas de células aderentes: (i) a linha de células de estroma MS-5, (ii) células de estroma mesenquimatosas (MSC) (Prockop Science 1997; 276, 71-74) estabelecidas a partir de medula óssea inteira de adulto normal em MEM alfa (Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) (MSC aderentes foram expandidas e purificadas através de pelo menos duas passagens consecutivas) e (iii) células do estroma de macrófagos estabelecidos a partir de células CD34+ da medula óssea em IMDM-glutamax que continha 20% de FCS, na presença de SCF (50ng/mL) , ligando de FLT3 (30 ng/mL) e TPO (15 ng/mL) durante 10 dias e de SCF (30 ng/mL), IL-3 (30 ng/mL) e M-CSF (30 ng/mL) durante uma semana. Foi utilizada revelação FACS das células aderentes para confirmar a expressão de CD14 e HLA-DR.
Ensaios em culturas semissólidas
Os progenitores BFU-E, CFU-E e CFU-GM foram analisados em culturas de metilcelulose. A concentração de EB dissociados foi de lxlO5 células/mL e as colónias foram pontuadas nos dias 7 e 14 de cultura.
Análise por citometria de fluxo de hESC indiferenciadas, EB e células diferenciadas
As células foram preparadas em PBS que continha 0,1% de BSA e marcadas com um cocktail de anticorpos monoclonais (mAbs). Amostras foram analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur com o software de aquisição CellQuest (Becton Dickinson, San José, CA, EUA) . Os seguintes anticorpos foram utilizados para análise por citometria de fluxo de hESC indiferenciadas, colhidas desagregadas de EB e células eritroides do dia 2 ao dia 20 durante diferenciação: SSEA4-PE (ficoeritrina) e SSEA1-PE (Clinisciences, Montrouge, França); TRA-1-60, TRA-1-81, IgM anti-murganho de cabra-PE e IgG anti-murganho de cabra-PE (Chemicon, Saint-Quentin en Yvelines, França); CD34-PE, CD45-PE, CD45-PC7, CD117-PE, CD71-FITC, CD36-FITC e CD235a-PE (glicoforina A) (Beckman Coulter-Immunotech, Marseille, França); CD133-PE (Miltenyi Biotech, Glodbach, Alemanha). As células viáveis foram selecionadas para análise e a revelação com mAbs de controlo de isotipo condizente apropriados foi utilizada para estabelecer limiares para revelação positiva e valores de base.
Composição de hemoglobina de cRBC por cromatografia e espetrometria de massa A percentagem das várias frações de hemoglobina foi medida por CE-HPLC utilizando um analisador de Hb Bio-Rad Variant II (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). A separação das diferentes frações de cadeias de globina contidas nos cRBC obtidos de células hES no D15 e D25 de cultura foi feita por cromatografia líquida de fase inversa (RP-LC) e análise espetral. As análises por RP-LC foram realizadas numa Uptisphere C4 (esférulas de sílica de 5 ym; tamanho de poro médio 300 Â) (Interchim, Montluçon, França) (4,6 x 250 mm). A eluição foi obtida por um sistema de dois solventes (A: 10% de CH3CN (acetonitrilo) em TFA a 0,3% (ácido trifluoroacético) , e B: 70% CH3CN em TFA a 0,3%). A integração dos diferentes picos de RP-LC permitiu determinar a percentagens de área de cada fração de cadeia de globina isolada. A sua identificação e caracterização foram realizadas por espetrometria de massa com ionização por eletropulverização (ESI-MS) após separação e recolha das cadeias de globina. Os resultados foram comparados com dados obtidos com cRBC gerados a partir de células sanguíneas CD34+ do cordão umbilical humano.
Funcionalidade da hemoglobina de cRBC A ligação de hemoglobina (Hb) com monóxido de carbono foi estudada por fotólise de relâmpago utilizando uma cuvete ótica de 4x10 mm (4 mm para a luz transmitida e 10 mm para o feixe de laser) . Resumidamente, a cinética da religação de CO aos tetrâmeros de Hb foi analisada a 436 nm após fotodissociação do ligando com um impulso de 10 ns a 532 nm (Marden et al. Biochemistry 1988; 27, 1659-1664). Os RBC foram sujeitos a lise numa solução tampão hipotónica sobre gelo durante 30 min. Após centrifugação a 15 000 g, o sobrenadante que continha a Hb foi removido das membranas e detritos celulares e foi adicionado IHP (hexafosfato de inositol, 1 mM) às amostras de Hb. As simulações de dados foram realizadas utilizando o programa de mínimos quadrados não lineares de Scientist (Micromath).
Resultados
2.1. Diferenciação de hESC em hEB condicionada para estabelecimento de compromisso eritroide do meio de cultura para EB A via eritropoiética foi induzida e estimulada muito cedo. Enquanto a adição de BMP4 parecia ser indispensável (Chadwick et al. Blood 2003; 102, 906-915) e do mesmo modo de VEGF-A165 (Cerdan et al. Blood 2004; 103, 2504-2512), foram realizadas oito experiências diferentes para testar o papel essencial de dois outros parâmetros, as citocinas e o tipo de soro. Após realização destas experiências, foi definido um meio de cultura para EB (referido como meio de EB) que condiciona o compromisso eritroide. Este contém 5% de plasma humano agrupado, uma concentração alta de transferrina (450 pg/mL) e um cocktail de 8 citocinas: SCF, TPO, ligando de FLT3 (100 ng/mL), BMP4 rhu (10 ng/mL), VEGF-A165 rhu, IL-3, IL-6 (5 ng/mL) e Epo (3 U/mL). Como descrito nas secções seguintes, estas condições de cultura permitiram obter no final da cultura um número máximo de RBC enucleados maduros.
2.2. Determinação do eritroide potencial de hEB
Primeiro, foram identificadas a etapa ou etapas de diferenciação de hEB que têm o melhor potencial eritroide. As cinéticas de diferenciação de hEB entre os dias 2 e 20 de cultura foram analisadas seguindo (1) a expressão de marcadores específicos de hematopoiese e eritropoiese por citometria de fluxo e (2) a formação de progenitores eritroides. Antes da diferenciação, as hESC expressavam níveis altos de marcadores específicos para células indiferenciadas e nenhum ou níveis baixos de marcadores hematopoiéticos. A expressão destes marcadores de células indiferenciadas decaiu progressivamente até ao dia 13 para permanecer fracamente positiva até ao dia 20. A CD34 foi expressa desde o dia 2 ao dia 20 com um máximo entre os dias 9 e 13 e a CD45 desde o dia 6 ao dia 20 com um máximo no dia 13 (Figura 7). Curiosamente, o recetor de transferrina CD71 foi expresso durante toda cultura e a um nivel alto entre os dias 6 e 20. Os marcadores eritroides CD36 e CD235a foram fracamente expressos pelo dia 13 (Figura 8). Na generalidade, entre os dias 15 e 20, os hEB expressavam significativamente os marcadores hemato-poiéticos e eritroides estudados: CD45, CD34, CD71, CD36 e CD235a. Entretanto o número de CFC permaneceu baixo com um ligeiro máximo no dia 15, que aponta para um fraco potencial clonogénico do hEB (Figura 7) . Face a estes resultados, a diferenciação eritroide foi prosseguida utilizando hEB dos dias 15 e 20 de cultura.
2.3. Diferenciação /maturação de hEB em cRBC -Protocolo para a geração de cRBC
Os inventores desenvolveram condições de cultura simples e ótimas que consistiam na cultura num meio liquido na presença de 10% de plasma humano e um cocktail de desenvolvimento de citocinas com base em SCF, IL-3 e Epo (Figura 6) . Na última fase de cultura pelo dia 15, foi testado o impacto na enucleação de três estromas diferentes conhecidos quanto à sua capacidade para suportar a hematopoiese: células MS5 de origem muridea, células estaminais mesenquimatosas (MSC) e macrófagos de origem humana versus condições sem estroma. Os hEB dos dias 15 e 20 de cultura foram dissociados e as células ressuspensas e cultivadas de acordo com o protocolo de cultura líquida para diferenciação/maturação de eritroblastos. No dia 1, podiam distinguir-se dois tipos de célula, não aderentes (NA) e aderentes (AD), que representam respetivamente 10% e 90% de todas as células. Os dois tipos de células foram cultivados em paralelo utilizando o mesmo protocolo. A maturação de eritrócitos foi avaliada regularmente de acordo com a morfologia celular após revelação com MGG e a expressão de antigénios da membrana eritroide como determinado por citometria de fluxo. 2.4. Geração de cRBC enucleados maduros partindo de hEB do dia 15 ou dia 20 0 compromisso eritroide dos hEB do dia 15 ou dia 20 foi completo após 4 dias de cultura líquida com produção de mais de 95% de eritroblastos. A diferenciação/maturação final foi conseguida progressivamente com o aparecimento de 3±2% de células enucleadas pelo dia 11, 17±4% pelo dia 15, 31+8% pelo dia 18 e 48+9% pelo dia 21. No final da cultura no dia 25, a população continha 58+2% de RBC perfeitamente enucleados (Figura 9). Os níveis de enucleação foram inteiramente comparáveis quaisquer que fossem as células cultivadas (NA ou AD) , as condições de cultura (com ou sem estroma) ou a natureza do estroma (MS5, MSC ou macrófagos). As células eritroides produzidas a partir dos hEB do dia 15 ou dia 20 foram capazes de gerar cRBC e foram chamadas "células da janela de enucleação" (EWC). A única diferença notável durante esta fase de cultura líquida foi que a amplificação de células NA era superior àquela de células AD (24 a 61 vezes vs 4 a 5 vezes pelo dia 20, respetivamente). Assim, partindo de 106 células derivadas de hEB, foram geradas 144x106 células eritroides ou 82x106 cRBC. 2.5. Análise dos cRBC gerados a partir de EWC -Marcadores de membrana de cRBC maduros A análise por citometria de fluxo dos antigénios da membrana de cRBC produzidos certificou o seu grau de maturidade. No final da cultura, todos os cRBC gerados expressavam fortemente CD235a e CD71. A expressão de CD36 diminuiu com a maturidade crescente das células (5%±1 no dia 11 vs 7 + 3% no dia 25) , enquanto uma expressão elevada do antigénio RhD em mais de 80% das células confirmou o alto nível de maturação da membrana dos cRBC (Figura 10).
2.6. Tamanho dos cRBC
No final da cultura líquida no dia 25, o tamanho dos cRBC foi medido por microscopia e comparado com o de RBC adultos de controlo do sangue periférico. Na ausência de estroma ou após cocultura em células MS5, MSC ou macrófagos, o tamanho dos cRBC foi comparável, com um diâmetro médio de 10 ym (Figura 11).
2.7. Análise da hemoglobina do cKBC
Para analisar o tipo de hemoglobina sintetizado pelos cRBC, um estudo das cadeias de globina por HPLC de fase inversa e espetrometria de massa foi combinado com a identificação de hemoglobina tetramérica por HPLC.
Identificação e quantificação das cadeias de globina em cRBC por KP-LC e espetrometria de massa A separação das cadeias de globina por RP-LC permitiu a quantificação da produção de hemoglobina dos cRBC: 1 a 5% de cadeias beta, 19 a 29% de gama-G, 36 a 43% de alfa e 11 a 21% de gama-A. Dois picos adicionais de intensidade variável em diferentes experiências, que variam desde ausente até menos de 15%, foram também observados e corresponderam às cadeias épsilon e zeta embrionárias. Assim, houve uma sintese amplamente predominante de cadeias fetais (35 a 50%), uma produção fraca de cadeias adultas (2%) e uma sintese variável de cadeias embrionárias (< 10%), com cerca de 40% de cadeias alfa. Estes resultados foram confirmados por identificação por espetrometria de massa das frações eluidas em RP-LC e foram idênticos àqueles obtidos para cRBC derivados de HSC CD34+ de sangue do cordão umbilical (Figuras 12 e 13).
Estudo da síntese de hemoglobina por CE-HPLC
Uma análise da Hb tetramérica por CE-HPLC mostrou a sintese de 2,5% de HbA e 74 a 80% de HbF e os perfis foram sobreponíveis com aqueles obtidos para cRBC derivados de HSC CD34+ de sangue do cordão umbilical (Figuras 12 e 13) . Estes resultados estão em concordância com as nossas observações utilizando RP-LC e espetrometria de massa e demonstram pela primeira vez a sintese de hemoglobina fetal na sua forma tetramérica em cRBC derivados de hESC.
2.8. Funcionalidade da hemoglobina de cRBC A funcionalidade da hemoglobina de cRBC foi avaliada pela cinética de ligação a ligando após fotólise de relâmpago (Figura 14). A cinética bimolecular após fotodissociação de CO proporciona uma sonda sensivel da função da hemoglobina. Assim, são observadas duas fases que correspondem aos dois estados quaternários de hemoglobina para ligação ao ligando. A componente rápida resulta dos tetrâmeros no estado R e a componente lenta dos tetrâmeros de estado T. A niveis altos de fotodissociação, as espécies principais estão ligadas de forma simples e duplamente ligadas, enquanto a niveis baixos mede-se principalmente a ligação de CO a espécies triplamente ligadas. Por conseguinte, o equilíbrio alostérico para as diferentes espécies parcialmente ligadas pode ser sondado variando o nivel de fotodissociação. A transição R->T na HbA normal ocorre após ligação de um segundo ligando ao tetrâmero de Hb. Na presença de um efetor alostérico tal como IHP, o ponto de troca ocorre mais tarde e as afinidades de R e T intrínsecas também diminuem. As cinéticas de religação de CO para a hemoglobina de cRBC (Figura 14) foram quase sobreponíveis com aquelas para uma amostra de sangue fetal, como esperado a partir da análise de HPLC que mostra uma grande quantidade de HbF no cRBC. Após adição de IHP, a transição R->T foi deslocada para os tetrâmeros de baixa afinidade numa extensão semelhante à do sangue fetal (mesma grandeza da fase de religação do estado T lento) . As experiências de fotólise de relâmpago de CO confirmaram assim que a HbF nos cRBC é funcional não só sob condições fisiológicas mas também em resposta a um efetor alostérico potente.
Lisboa, 28 de dezembro de 2016

Claims (12)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Meio de cultura de células para o crescimento e/ou diferenciação de células da linhagem hema-topoiética, que compreende: - insulina a uma concentração desde 1 a 50 yg/mL; - transferrina a uma concentração desde 100 yg/mL a 2000 yg/mL; - plasma ou soro a uma concentração desde 1 % a 30%; - heparina a uma concentração de 0,5 UI/mL a 5 UI/mL; - Epo; e que compreende ainda opcionalmente: - hidrocortisona; ou - SCF; ou - SCF e IL-3; ou - hidrocortisona e SCF; ou - hidrocortisona, SCF e IL-3; ou - SCF, TPO, FLT3, BMP4, VEGF-A165, IL-3 e IL-6.
  2. 2. Meio de cultura de células de acordo com a reivindicação 1, em que a insulina está a uma concentração de 8 a 12 pg/mL.
  3. 3. Meio de cultura de células de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a transferrina está a uma concentração desde 300 a 500 pg/mL.
  4. 4. Meio de cultura de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o plasma ou soro está a uma concentração desde 4 a 12%.
  5. 5. Meio de cultura de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a heparina está a uma concentração desde 1,5 a 3,5 UI/mL.
  6. 6. Meio de cultura de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, que compreende Meio de Dulbecco Modificado por Iscove opcionalmente complementado com glutamina ou um péptido que contém glutamina.
  7. 7. Utilização de um meio de cultura de células como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, para o crescimento e/ou diferenciação de células da linhagem hematopoiética na ausência de células alimentadoras.
  8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, para cultivar células estaminais hematopoiéticas (HSCs) e diferenciar os HSCs em reticulócitos, células enucleadas, e/ou glóbulos vermelhos.
  9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, para cultivar corpos embrioides (EBs) e diferenciar os EBs em reticulócitos, células enucleadas e/ou glóbulos vermelhos, na ausência de células alimentadoras.
  10. 10. Método para fazer crescer e/ou diferenciar células da linhagem hematopoiética na ausência de células alimentadoras que compreende pelo menos um passo de cultura de células com um meio de cultura de células como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
  11. 11. Método da reivindicação 10, para diferenciar células estaminais hematopoiéticas (HSCs) em reticulócitos, que compreende: - num primeiro passo, cultivar HSCs durante 7 dias num meio de cultura de células que compreende: - insulina a uma concentração de 8 a 12 yg/mL; - transferrina a uma concentração desde 300 a 350 yg/mL; - plasma a uma concentração desde 3% a 7%; - heparina a uma concentração desde 1,5 UI/mL a 2,5 UI/mL; - hidrocortisona a uma concentração desde 5,IO-7 a 5,IO-6 M; - SCF a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL; - IL-3 a uma concentração desde 4 ng/mL a 6 ng/mL; - Epo a uma concentração desde 2,5 a 3,5 UI/mL; num segundo passo, cultivar as células obtidas no primeiro passo durante 3 a 4 dias num meio de cultura de células que compreende: - insulina a uma concentração de 8 a 12 yg/mL; - transferrina a uma concentração desde 300 a 350 yg/mL; - plasma a uma concentração desde 3% a 7%; - heparina a uma concentração desde 1,5 UI/mL a 2,5 UI/mL; - hidrocortisona a uma concentração desde 5,IO-7 a 5,IO-6 M; - SCF a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL; - Epo a uma concentração desde 2,5 a 3,5 UI/mL; num terceiro passo, cultivar as células obtidas no segundo passo até ao dia 18 a 21 desde o inicio do primeiro passo, num meio de cultura de células que compreende: - insulina a uma concentração de 8 a 12 yg/mL; - transferrina a uma concentração desde 300 a 350 yg/mL; - plasma a uma concentração desde 3% a 7%; - heparina a uma concentração desde 1,5 UI/mL a 2,5 UI/mL; - hidrocortisona a uma concentração desde 5,10~7 a 5,IO-6 M; - Epo a uma concentração desde 2,5 a 3,5 UI/mL; - obtendo-se desse modo reticulócitos.
  12. 12. Método da reivindicação 10, para diferenciar corpos embrioides (EBs) em glóbulos vermelhos que compreende : - num primeiro passo, cultivar EBs durante 20 dias num meio de cultura de células que compreende: - insulina a uma concentração de 8 a 12 yg/mL; - transferrina a uma concentração desde 425 a 475 yg/mL; - plasma a uma concentração desde 3% a 7%; - heparina a uma concentração desde 1,5 UI/mL a 2,5 UI/mL; - SCF a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL; - TPO a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL; - ligando de FLT3 a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL; - BMP4 a uma concentração desde 8 ng/mL a 12 ng/mL; - VEGF-A165 a uma concentração desde 4 ng/mL a 6 ng/mL; - IL-3 a uma concentração desde 4 ng/mL a 6 ng/mL; - IL-6 a uma concentração desde 4 ng/mL a 6 ng/mL; - Epo a uma concentração desde 2,5 a 3,5 UI/mL; num segundo passo, dissociar as células obtidas no primeiro passo e cultivar as células dissociadas durante 8 dias num meio de cultura de células que compreende: - insulina a uma concentração de 8 a 12 yg/mL; - transferrina a uma concentração desde 425 a 475 yg/mL; - plasma a uma concentração desde 8% a 12%; - heparina a uma concentração desde 2,5 UI/mL a 3,5 UI/mL; - SCF a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL; - IL-3 a uma concentração desde 4 ng/mL a 6 ng/mL; - Epo a uma concentração desde 2,5 a 3,5 UI/mL; num terceiro passo, cultivar as células obtidas no segundo passo durante 3 dias, num meio de cultura de células que compreende: - insulina a uma concentração de 8 a 12 yg/mL; - transferrina a uma concentração desde 425 a 475 yg/mL; - plasma a uma concentração desde 8% a 12%; - heparina a uma concentração desde 2,5 UI/mL a 3,5 UI/mL; - SCF a uma concentração desde 80 ng/mL a 120 ng/mL; - Epo a uma concentração desde 2,5 a 3,5 UI/mL; - num quarto passo, cultivar as células obtidas no terceiro passo durante 3 dias, num meio de cultura de células que compreende: - insulina a uma concentração de 8 a 12 yg/mL; - transferrina a uma concentração desde 425 a 475 yg/mL; - plasma a uma concentração desde 8% a 12%; - heparina a uma concentração desde 2,5 UI/mL a 3,5 UI/mL; - Epo a uma concentração desde 2,5 a 3,5 UI/mL; - num quinto passo, cultivar as células obtidas no quarto passo durante 10 dias, (i) num meio de cultura de células que compreende: - insulina a uma concentração de 8 a 12 yg/mL; - transferrina a uma concentração desde 425 a 475 yg/mL; - plasma a uma concentração desde 8% a 12%; - heparina a uma concentração desde 2,5 UI/mL a 3,5 UI/mL; - Epo a uma concentração desde 2,5 a 3,5 UI/mL; ou (ii) numa camada de estroma aderente; - obtendo-se desse modo glóbulos vermelhos. Lisboa, 28 de dezembro de 2016
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