PT2371865T - ANTICORPOS QUE SE LIGAM À FOSFATASE TIROSINA DE PROTEÍNAS HUMANA BETA (FTPH-ß) E SUAS UTILIZAÇÕES - Google Patents

Description

DESCRI πϋΟ

"ΑΝΤΙ CORPOS QUE SE LI GAM u F05FATASE TI ROSI NA DE PROTEPNAS HUMMMA BETA ( FTPH- ó) E SUAS UTI LI ZAnuES"

CAIVPO DA INVENnuO

Esta inven'2o est ® r el aci onada com ant i cor pos e seus fragmentos de liga'2o ao antiglinio que se ligam fosfatase tirosina de prote°nas humana beta (FTPHbeta; 'hurran protein tyrosi ne phosphatase beta_, HPTPbeta) e suas utiliza' Pes.

ANTECEDENTES DA INVENnuO A angi ogUnese, a produ'2o de novos vasos sangu°neos a partir da vascul atura prU-exi st ent e, desenpenha um papel inportante numa larga gama de processos f i si ol Agi cos e patolAgicos ( Nguyen, L. L. et ai, I nt. Rev. Cytol., 204, 1-48, ( 2001)). A angi og^nese H um processo conpl exo, mediado pela conxinica'2o entre as clll ui as endoteliais que forramos vasos sangu°neos e o seu ambiente envolvente. Nas fases iniciais da angi ogUnese, tecido ou células turrorais produzem e secretam factores de crescimento pr/E-angi ogllni cos em resposta a est°rrulos ambientais, corro seja hi poxi a. Estes factores difundemse para as células endoteliais pr/tki mas e est i mui am recept ores que conduzem - produ'2o e secre'2o de proteases que degradam a matriz extracelular envolvente. As cHI ul as endoteliais activadas come'am a rrigrar e a proliferar no tecido envolvente e emdirec'2o _ fonte destes factores de crescimento (Bussolino, F., Trends Bi ochem Sei., 22, 251-256, ( 1997)). As cHI ul as endoteliais param ent2o a prolifera'2o e di f erenci am se em estruturas tubulares, que H o primeiro passo na forrra'2o de vasos sangu°neos est®/eis maduros. Subsequentemente, as cHI ul as per i endot el i ai s, tais corro peri eitos e cHI ul as de rrBseul o liso, s2o recrutadas para o novo vaso sangu°neo formado, num passo subsequente da mat ura '2 o do vaso. A angi ogUnese H regulada por um equi 10 br i o de factores naturais pr/E-angi ogUni cos e ant i - angi ogUni cos. O factor de crescimento endotelial vascular, o factor de crescimento dos fibroblastos e a angi opoei t i na representam alguns dos rroitos potenciais factores de crescimento pr/E-angi ogUni cos. Estes ligandos ligamse ao respectivo receptor ci nase de tirosina na superf°cie da célula endotelial e fazem a transdu'2o de sinais que promovem a nigra'2o e prolifera'2o celulares. Apesar de rruitos factores reguladores terem sido identificados, os mecanismos moleculares que conduzem este processo ainda η2 o est2o total mente compreendidos.

Existem muitos estados de doen'a conduzidos por angi ogUnese desregulada persistente ou inadequadamente regulada. Em tais estados de doen'a, a angi ogUnese desregulada ou inadequadamente regulada pode ser a causa de urna doen'a particular ou exacerbar uma condi '2o patol/lgica existente. Por exenpl o, a neovascul ari za'2 o vascular tem sido i npl i cada corro a causa mai s conum de cegueira e est® subjacente - patologia de aproxi madament e 20 doen'as dos olhos. Em det er rri nadas condi 'Pes pr H-exi st ent es, corro seja artrite, os novos vasos capilares sangu°neos formados invadem as articula'Pes e destroem a cartilagem Na diabetes, os novos capilares formados na retina i nvadem o hurror v°treo, causando hemorragia e cegueira.

Tanto o crescimento corro a metastiza'2o dos turrores s/H i dos podem tarrbUm ser dependentes da angi ogUnese, Foi krnan et al., "Turror Angi ogUnese, " Chapter 10, 206-32, in The Molecular Basi s of Câncer, IVbndelsohn et al., eds., W B. Saunders, ( 1995). Foi demonstrado que os turrores que crescem para al Hm dos 2 mm de di°metro devem obter a sua pr/Ipria fonte de sangue e fazemno atravHs da indu'2o do crescimento de novos vasos capilares sangu°neos. ApAs estes novos vasos sangu°neos ficarem errbebi dos no turror, eles proporcionam nutrientes e factores de crescimento essenciais para o crescimento dos turrores assim corro um meio para a entrada de c Hll u I as turrorais na circula'2o e rnest ast i za'2 o de locais distantes, tais corro f°gado, pulrrfo ou osso (Vtèidner, New Eng. J. IVfed., 324, 1, 1-8 (1991)). Quando usados corro f®rrracos nos animais portadores de turrores, os i ni bi dores naturais da angi ogHnese podem prevenir o crescimento de pequenos turrores ( O Rei I I y et al., Cel I , 79, 315-28 ( 1994)). Nalguns protocolos, a a pl i c a '2 o de tais i ni bi dores conduz regress2o e dorrrçncia do turror, mesmo ap/Is cessa'2o do tratamento ( O Rei I I y et ai., Cel I , 88, 277- 85 ( 1997)).

Ainda, o fornecimento de i ni bi dores da angi ogénese a deterrri nados tumores pode potenciar a sua resposta a outros regimes terap5uticos (ver, e. g. , Teischer et al . , I nt. J. Câncer, 57, 920-25 ( 1994)) .

Apesar de rrnitos estados de doen'a serem conduzidos por angi ogénese desregulada persistente ou

inadequadamente regulada, alguns estados de doen'a podem ser tratados através do aumento da angi ogénese. O crescimento e repara'2o de tecidos s2o eventos bi ο I /¾ i c os em que ocorrem a prolifera'2o celular e angi ogénese. Assi rq um aspecto inportante da repara'2o de feridas é a revascul ari za'2 o do tecido danificado através de angi ogénese.

As feridas cr/Bii cas que η2 o cicatrizam s2o uma das principais causas mo r bi I i da de prolongada na popula'2o humana idosa. Este é es peei al ment e o caso em doentes acamados ou diabéticos que desenvolvem β| ceras da pele graves que η2 o cicatrizam Emrruitos destes casos, o atraso na cicatriza'2o é um resultado de fornecimento inadequado de sangue corro resultado da press2o cont°nua ou do bloqueio vascular. A rr® circula'2o capilar devido a at eroscl erose das artérias pequenas ou a estase venosa contribui para a incapacidade de repara'2o dos tecidos danificados. Tais tecidos s2o frequentemente infectados com ni c r orga ni s rros que proliferam sem ser confrontados com os sistemas de defesa inatos do corpo, os quais requerem tecido bem vascul ar i zado para eliminar eficazmente os organismos pat ogéni cos. Como resultado, a maioria das i nt erven' Pes terap4uticas centramse na restaura'2o do fluxo sangu°neo em tecidos isquénricos, permitindo assi m que nutrientes e factores i rrunol /Igi cos tenham acesso ao local da ferida.

As lesPes at eroscl er/B i cas nos grandes vasos podem causar isquemia dos tecidos que pode ser melhorada através da rmdula'2o do crescimento de vasos sangu°neos no tecido afectado. Por exemplo, as lesPes at eroscl er/& i cas nas artérias coronárias podem causar angina e enfarte do rriocdrdio que poder2o ser evitados caso se restaure o fluxo sangu°neo através da estirrula'2o do crescimento de artérias colaterais. De forma semelhante, as lesPes at eroscl er/S i cas nas grandes artérias que fornecem as pernas podem causar isquerria no rrôscul o esquelético, o que limita a mobilidade e, nalguns casos, requer anputa'2o, o que também pode ser evitado através do melhoramento do fluxo sangu°neo com t erapi a angi ogéni ca.

Outras doen'as tais corro diabetes e hipertens2o s2o caract eri zadas por um decrésci mo no nBrnero e densidade de pequenos vasos sangu°neos tais corro arter°olas e capilares. Estes pequenos vasos sangu°neos s2o importantes para a entrega de oxigénio e nutrientes. Uma redu'2o no nBmero e densidade destes vasos contribui para as consequ, nci as adversas da hipertens2o e diabetes incluindo claudica'2o, β| ceras i squHnri cas, hipertens2o acelerada e falência renal. Estes distBrbios corruns e nviitas outras doen'as menos corruns, como seja a doen'a de Burgers, podem ser melhorados através do aumento do nBmero e densidade de pequenos vasos sangu°neos usando terapia angi ogUni ca.

Assim mantUmse a necessidade de identificar regul adores da angi ogUnese.

Face ao que foi dito, existe a necessidade de identificar alvos bioqu°rricos no tratamento dos distBrbios mediados por angi ogUnese. No entanto, a angi ogUnese envolve a actua'2o de rrfil t i pl os factores de crescimento e dos seus receptores cognatos ci nases de tirosina (RCT; 'receptor tyrosi ne ki nase_, RTKs), Yancopoul os et al., Nature, 407,242-248, 2000). O factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), por exenpl o, H inportante para a diferenciado de cHI ul as endoteliais em vasos sangu°neos nascentes na vascul atura errbr i on®r i a. Ainda, VEGF estinula o desenvolvimento de vasos sangu°neos na vascul atura adulta. A adrri ni st r a'2 o de VEGF ex/Igeno estirrula o desenvolvimento da vascul atura colateral e melhora o fluxo sangu°neo nos tecidos isquUnicos.

AtU agora, foram identificados tras VEGF RTKs, VEGFR1 (FLT-1), VEGFR2 ( KDR) e VEGFR3 (FLT-4). Apesar destes receptores ser em al t ament e conservados, baseado na caract er i za'2 o bioqu°rrica e na actividade bi ol /Igi ca, cada um possui fun'bes espec°ficas e η2 o sobrepon0vei s. Dos tr,s receptores, pensa-se que VEGFR2 desenpenhe um papel predoninante na media'2o das ac'Pes de VEGF no desenvolvimento da vascul atura e durante a angi ogUnese em adultos. No entanto, tanto VEGFR1 corro VEGFR3 s2o necess(grios para o desenvolvimento normal da vascul atura errbrionSHa e podem tarrbUm ser irrportantes para a angi ogUnese nos tecidos adultos. Quando da liga'2 o e dimeriza'2o de VEGF, uma altera'2o conformaci onal no dorrí ni o ci nase de VEGFR2 aumenta a sua actividade ci nase resultando em " aut of osf or i I a'2 o" do outro membro do par em res°duos tirosina espec°ficos. Estes eventos de aut of osf or i I a'2 o servem para estimular mai s a actividade de ci nase e proporei onam pontos de ancoragem para a assoei a'2o de rrol Hcul as de sinaliza'2o intracelular.

PorUm a activa'2o de uma βηι ca via angi ogUni ca pode η2 o ser suficiente para produzir vasos persistentes e funcionais que proporcionem perfus2o adequada ao tecido isquUnico. Estes resultados, juntamente com o facto de rrBI t i pl os RCTs estarem envolvidos na montagem da vascul atura errbri on®r i a, i ndi cam que os alvos bioqu°rricos que modul am as rrBI ti pias vias angi ogUni cas ter2o vantagens relativamente " adrri ni st r a'2 o de um Bni co factor de cresci rnent o.

As fosfatases de tirosina de prote°nas (FTPs) conpreendem uma grande farrflia de enzimas estreitamente relacionadas que desf osf or i I am prote°nas possuidoras de res°duos de f osf ot i rosi na. Evi d, nci a recente sugere que uma fun'2o das FTPs seja lirritar a fosforila'2o e activa'2o de RCTs. Por exenpl o, dermnst rou- se que HCPTPA, urna fosfatase tirosina de prote°nas de massa molecular baixa, est® associada a VEGFR2 e regula negativamente a sua activa'2o em cHI ul as endoteliais em cultura e a sua actividade biol/Igica nos ensaios de angi ogHnese, (Huang et a I . ,

Journal of Bi ol ogi cal Cherristry, 274, 38183-38185, 1999).

Para aI Hm de VEGFR2, a sinaliza'2o de uma outra RCT, Tie-2, o receptor das angi opoi et i nas (Ang1 e Ang2), H igual mente irrportante. A dele'2o do gene de Angi ou Tie-2 em murganhos pode resultar em letal idade embr i on® i a subsequente a anormalidades na vascul atura em desenvolvimento (Yancopoulos et al., Nature, 407, 242-248, 2000).

Ainda, a express2o excessiva de Angi na pele aumenta a vascul ar i dade da pele e a adrrinistra'2o de Angi ex/lgena aumenta o fluxo sangu°neo no rrBseul o esquelético isquHrrico (Surf et al . , Science, 282, 468-471, 1998). Ainda, a i ni bi '2 o da act i va '2 o de Ti e- 2 i ni be a angi ogHnese e I i nri t a a progress2o de tumores em rrodel os ani rrai s de cancro, ( Li n et al., J Cl i n. Invest., 100, 2072-2078, 1997). Para al Hm das suas actividades angi ogHni cas, a activa'2o de Tie-2 através da adrrinistra'2o exAgena de Angi bloqueia o vazamento vascular mediado por VEGF e efeitos pro-i nf I amat/fri os, mas estimula os seus efeitos angi ogHni cos (Thurston et al., Nature IVbdi c i ne, 6, 460-463, 2000).

Assi rrj os alvos biolAgicos que modulam a sinaliza'2o via VEGFR2 e Tie-2 podem originar melhores terapias pr/E-angi ogHni cas ou ant i angi ogHni cas. FTPHbeta (descrito pela primeira vez em Kruegar et al., EIVBO J ., 9, ( 1990)) foi sugerido para a modulado da actividade da ci nase de tirosina do tipo receptor da angi opoi et i na Tie-2, e. g., ΜΌ 00/65085). FTPHbeta foi igual mente sugerida para actividades reguladoras de VEGFR2, e.g. , Pat. U. S. Pub. No. 2004/0077065.

Ser® desej®/el desenvolver anticorpos, e.g. um anticorpo rronocl onal humanizado, que r egul em sei ect i vament e a actividade de FTPHbeta e assi m pot enci em a sinaliza'2o angi ogUni ca, estinxilem o crescimento de vasos sangu°neos (angi ogUnese), e/ou aumentem o fluxo sangu°neo em tecido isqullrrico ou reduzam a sinaliza'2o angi ogUni ca, reduzam o crescimento de vasos sangu°neos, e/ou reduzam o fluxo sangu°neo do tecido afectado. S2 o aqui descritos anticorpos e seus fragmentos que se ligam a FTPHbeta e regulam a sinalizado celular angi ogUni ca que, por sua vez, regula a angi ogUnese.

S UIVE RI O DA I NVENnuO A presente inven'2o est® relacionada com anticorpos que se li gama fosfatase tirosina de prote°nas humana beta, FTPHbeta, e assim regulam a s i na I i z a '2 o cel ul ar angi ogUni ca que, por sua vez, regul a a angi ogUnese. A inven'2o est® relacionada com um anticorpo rronocl onal isolado de acordo coma Rei vi ndi ca '2 o 1 ou com um fragmento de I i ga'2 o ao antigUnio isolado de um anticorpo rronocl onal de acordo com a Rei vi ndi ca'2 o 5. O anticorpo e fragmento de I i ga'2 o ao antigUnio ligamse a fosfatase tirosina de prote°nas humana beta, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de I i ga'2 o ao antigUnio regula a sinaliza'2o celular angi ogUni ca que, por sua vez, regul a a angi ogUnese. A inven'2o est ® r el aci onada com um ant i cor po ou fragmento de I i ga'2 o ao antigUnio de um anticorpo que se liga " primeira repeti '2o FN3 da fosfatase tirosina de prote°nas humana beta, em que a primeira repeti '2o FN3 da fosfatase tirosina de prote°nas humana beta possui a sequ3 nci a rrost rada emSEQID NG 11.

Numa real i za'2o, a i nven'2o est® rei aci onada com um anticorpo em que o anticorpo H o anticorpo rronocl onal R15E6 (Hibridoma de rrurganho, células do ba'o de Bal bc (cHlulas B) depositado na American Type Culture Collection (ATCC), P. O. Box 1549, IVhnassas, VA 20108 USA em 04 de IVhi o de 2006, designado ATCC No. PTA-7580).

Numa outra realiza'2o, o anticorpo ou fragmento de I i ga '2 o ao antig^nio H humanizado.

Numa outra real i za'2o, a inven'2o est® relacionada com um ant i cor po, em que o anticorpo corrpreende os res°duos da regi2o de I i ga'2 o ao a nt i gilni o do anticorpo rronocl onal R15E6 e % humanizado.

Numa outra realiza'2o, a inven'2o est® relacionada com um f r agment o de I i ga '2 o ao antigUnio de um anticorpo rronoclonal, em que o fragmento compreende as regimes vari ®/ei s das cadeias pesada e leve. A inven'2o est ® r ei aci onada com um f r agment o de liga'2o ao antigUnio de um anticorpo nonoclonal, em que o fragmento de I i ga'2 o ao antigUnio H umfragmento Fab. S2 o aqui igual mente divulgados métodos de tratamento de um distBrbio regulado pela angi ogUnese num indiv°duo, compreendendo: i dent i f i ca '2 o de um indiv°duo necessitado de regula'2o da angi ogUnese; e adrri ni st r a ’2 o ao indiv°duo de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou seu fragmento de I i ga'2 o ao antigUnio que se liga a FTPHbeta e regul a a angi ogUnese. S2 o t ambUm descri t os rr1||todos de tratamento de um distKrbio regulado por angi ogUnese num i ndi v° duo, em que o distBrbio regulado pela angi og^nese H um distBrbio por angi ogUnese elevada e H sei ecci onado do grupo que consiste em r et i nopat i a diabética, degeneresc, nci a macular, cancro, anemia das cHI ul as falei formes, sarcoi dose, s°filis, pseudoxantorna eld&tico, doen'a de Paget, oclus2o das veias, oclus2o das artérias, doen'a obstrutiva das car/Bidas, uve°te cr/Eii ca/vi t ri t e, infec'Pes por rri cobact Ur i as, doen'a de Lyme, I Bpus sistUrrico eritematoso, retinopatia de prematuridade, doen'a de Eal es, doen'a de Behcet, infec'Pes causadores de uma retini te ou coroidite, presurrtvel hi st opl as rrose ocular, doerfa de Best, rri opi a, fossetas col obomat osas, doerfa de Stargardt, pars planite, descolamento cr/Bii co da retina, s°ndrome da hi pervi scos i dade, t oxopl as rrose, trauma e conplica'hes ρ/6-laser, doen'as associadas comrubeose e v° t r eo-r et i nopat i a prol i f erat i va. S2 o igual mente descritos rrlUtodos de tratamento de umdistBrbio regulado por angi ogUnese num i ndi v° duo, em que o distBrbio regulado por angi ogUnese H um distBrbio por angi ogUnese elevada e H sei ecci onado do grupo que inclui, mas η2 o lhes est® I irritado, retinopatia diabética, degeneresc5 nci a macular, cancro, artrite reumat/Hde, hemangi ornas, doen'a de OsI er-V\èber-Rendu ou t el angi ect asi a henorr(Bgica heredit®ria, e tumores s/H i dos ou do sangue. S2 o igual mente descritos rrlUtodos de tratamento de umdistBrbio regulado por angi ogUnese num i ndi v° duo, em que o distBrbio regulado por angi ogUnese H um distBrbio por angi ogUnese elevada e H sei ecci onado do grupo de doen'as infla ma t /H" i a s intestinais corro sejam doen'a de Crohn e colite ulcerativa, psor°ase, sarcoi dose, artrite reumat/Hde, hemangi ornas, doen'a de OsI er-V\êber-Rendu ou t el angi ect asi a henor rdgi ca her edi t ®r i a, e tumores s/H i dos ou do sangue e s°ndrorre da i rrunodef i ci 5 nci a adquirida. S2 o igual mente descritos rrlUtodos de tratamento de umdistBrbio regulado por angi ogUnese num i ndi v° duo, em que o distBrbio regulado por angi ogUnese H um distBrbio por angi ogUnese reduzida e H sei ecci onado do grupo que inclui, mas η2 o lhes est®l irritado, isquem a do rriSscuI o esquelético ou do niocdrdio, derrame cerebral, doerfa das artérias corondrias, doerfa vascular periférica, doerfa das artérias corondrias, doen'a cerebrovascul ar, neuropatia diabética e ci cat ri za '2 o de feri das. S2 o igual mente descritos rrét odos de tratamento de umdistSrbio regulado por angi ogénese num i ndi v° duo, em que 0 distBrbio regulado por angi ogénese é um distBrbio por angi ogénese reduzida e é sei ecci onado do grupo consistindo isquem a do rriSscuI o esquelético ou do mocdrdio, derrame cerebral, doen'a das artérias corondrias, doen'a vascular periférica, doen'a das artérias corondrias. S2 o igual mente descritos métodos de tratamento de um distBrbio regulado por angi ogénese reduzida num 1 ndi v° duo, em que o distBrbio por angi ogénese reduzida é doen'a vascular periférica. S2 o igual mente descritos métodos de tratamento de um distBrbio regulado por angi ogénese reduzida num i ndi v° duo, em que o distBrbio por angi ogénese reduzida é doen'a das artérias corondrias.

Também s2o aqui descritas composi 'hes farma-c5uticas, compreendendo: um anticorpo ou um seu fragmento que se liga a fosfatase tirosina de prote°nas humana beta; e um ve°cul o aceit®/el emtermDS f ar macj ut i cos.

Também s2o aqui descritas composi't>es f ar rnac5 ut i cas, corrpreendendo: um anticorpo ou um seu fragmento que se liga a fosfatase tirosina de prote°nas humana beta, em que o anticorpo H o anticorpo rronocl onal R15E6; e um ve°cul o aceit®/el emterrros f ar rracj ut i cos. S2 o igual mente descritas conposi'Res farma-c5uticas, corrpreendendo: um anticorpo ou um seu fragmento que se liga a fosfatase tirosina de prote°nas humana beta, em que o anticorpo H um anticorpo rronocl onal tendo as mesmas, ou subst anci al ment e as mesmas, caract er° st i cas biol/lgicas de R15E6; e um ve°culo aceit®/el em termos f armacJ ut i cos. S2 o igual mente descritas corrposi'Res farrra^u-ticas, corrpreendendo: um anticorpo ou um seu fragmento que se liga a fosfatase tirosina de prote°nas humana beta, em que o anticorpo ou o seu fragmento de I i ga'2 o ao antigUnio H humanizado; e um ve°culo aceit®/el em termos f ar mac, ut i cos. S2 o igual mente descritas corrposi ' Res farrra-c4uticas, compreendendo: um anticorpo ou um seu fragmento que se liga a fosfatase tirosina de prote°nas humana beta, em que o anticorpo compreende os res°duos da regi2o de I i ga'2 o ao antigUnio do anticorpo rronocl onal R15E6 e H humanizado; e umve°culo a c e i t CÊVe I emterrros f armac5 ut i cos.

BREVE DESCRI n(jO DAS FIGURAS

Figura 1. Desenho e produ'2o da prote°na FTPH$ ECD. (Painel A) Represent a'2 o esquerriStica de FTPH<f de tamanho corrpleto e da prote°na de fus2o do dorrt ni o extracelular de FTPH£-6His. (Painel B) Colora'2o com prata dos eluatos de irridazole de uma coluna de Ni - MTA carregada com o sobrenadante de células HEK293 t ransf ect adas com um vector que dirige a express2o de <fECD-6His. § detectada uma Bni ca banda de alto peso molecular consistente coma prote°na HPTP-3 de clll ul as ext racel ui ares- 6Hi s.

Figura 2. R15E6 reconhece FTPH$ end/Igeno em c ill ui as endoteliais. (Painel A) Li sados de clll ul as endoteliais foram i rrunopr eci pi t ados com um anticorpo controlo (Pista 1), com R15E6 (Pista 2) ou com uma rristura de anticorpos anti-Tie2 e anti-VEGFR2 (Pista 3). Os i nxmopreci pi t ados foram resolvidos por SDS-PAGE, transferidos para uma membrana de PVDF e testados por t ransf er5 nci a western com uma mistura de anticorpos R15E6, a nt i - Ti e2 e ant i - VEGFR2. Observou-se uma Bni ca banda de massa molecular elevada consistente com FTPH£ usando R15E6 (Pista 2) e η2 o como anticorpo controlo (Pista 1) ou coma rristura de a nt i - Ti e2 e anti-VEGFR2 (Pista 3). (Painel B) As c ill u I as endoteliais f oram suj ei t as a an® i se por FACS com R15E6 (pico branco) ou com controlo sem anticorpo prirriErio (pico preto). A altera'2o robusta na f I uoresc, nci a indica que R15E6 se liga a FTPH$ na superf°cie das cHI ul as endot ei i ai s i nt act as.

Figura 3. R15E6 estirrula a activa'2o do receptor

Ti e2 em HUVEC. A activa'2o de Ti e2 foi medida em cHI ul as endoteliais humanas corro descrito no Exenpl o 4. R15E6 aumenta, de forma dependente da dose, tanto a activa'2o de Ti e2 basal corro a induzida por Ang1.

Figura 4. R15E6 estirrula a sobrevi vs nci a de HUVEC. A sobrevi vs nci a de c ill u I as endoteliais humanas com jejum de soro foi medida corro descrito no Exenpl o 4. Consistente cornos seus efeitos sobre a activa'2o de Ti e2, R15E6 aumenta, de forma dependente da dose, a sobrevi vs nci a cHI ul as endoteliais basais e induzidas por Ang1 (Painel A). Ainda, R15E6 t arrbUm aument a, de forma dependente da dose, a sobrevi v5 nci a de cHI ul as endoteliais mediada por VEGF e FGF ( Pai nHi s B e C). Um anticorpo controlo H incapaz de aumentar a sobrevi vs nci a de cHI ul as endoteliais (Painel D).

Figura 5. R15E6 estirrula a rrigra'2o de HUVEC. A rrigra'2o das cHI ul as endoteliais humanas foi medida corro descrito no Exenpl o 4. R15E6, numa forma dependente da dose, estirrula a rrigra'2o de cHI ul as endoteliais basais e das i nduzi das por VEGF.

Figura 6. R15E6 estirrula a rrorfogUnese de capilares no ensaio de HUVEC/For ma'2 o de rebentos em esferas. A rrorfogUnese de capilares de células endoteliais humanas foi medida no ensaio de forma'2o de rebentos em esferas corro descrito no Exenpl o 4. R15E6 estirrola a rrorfogUnese basal de capilares e a induzida por VEGF.

Figura 7. A an® i se por transferidas V\êstern localiza o epitopo de I i ga'2 o a R15E6 na repeti '2o N- terrrinal FN3 do dorrf ni o extracelular de FTPH<f (Painel A)

Por an® i se de transferidas Vtèstern, R15E6 liga-se a todos os rrutantes de t r uncagem C-1 er rri nal demonstrando que o epitopo de I i ga'2 o est® situado nas 2 repeti 'Pes FN3 N-terrrinais. (Painel B) An® i se de prote°nas qui rrlllr i cas rrurganho/humano tanrbUm localiza o epitopo de liga'2o do R15E6 na repeti '2o FN3 N-terrrinal de FTPH^.

Fi gura 8. A an® i se IVBD conf i rma a I ocal i za'2o do epitopo de liga'2o a R15E6 na repeti '2o FN3 N-terrrinal do dorrf ni o extracelular de FTPH£. (Painel A) AtravUs da an® i se IVBD, R15E6 liga-se a todos os rrutantes de truncagem C-terrrinal, confirmando que o epitopo de I i ga'2 o est® localizado nas 2 repeti 'Pes FN3 N-terrrinais. (Painel B) A an® i se de prote°nas qui rrlllr i cas nurganho/ humano ainda confirma a localiza'2o do epitopo de I i ga'2 o a R15E6 na repeti '2o FN3 N-terrrinal de FTPH<f.

Figura 9. A an® i se IVBD demonstra que o fragmento Fab rronovalente de R15E6 tarrbUmse I i ga repeti '2o FN3 N-terninal de FTPH£. (Painel A) de rrodo semelhante ao anticorpo R15E6, o fragmento Fab de R15E6 liga-se a todos os rrutantes de truncagem C-terrrinal confirmando que o epitopo de liga'2o est ® I ocal i zado nas 2 repeti 'Pes FN3 N- terrrinais. (Painel B) A an® i se das prote°nas quirrlUricas nxir ganho/hurra no ainda localiza o epitopo de I i ga'2 o do fragmento Fab do R15E6 na repeti '2o FN3 N-terninal de FTPHf.

Figura 10. O fragmento Fab rranovalente de R15E6 η2 o estirrula a activa'2o de Ti e2 e bloqueia a activa'2o de Ti e2 por R15E6 intacto.

Figura 11. O fragmento Fab de R15E6 potencialmente inibe a sobrevi vs nci a de cHI ul as endoteliais. (Painel A) Conparat i vament e com o fragmento Fab controlo, o fragmento Fab de R15E6 pot enci al ment e inibe a sobrevi vs nci a de c ill u I as endoteliais. (Painel B) O efeito i ni bi dor do fragmento Fab do R15E6 H reduzido por conpeti'2o comR15E6 i nt act o.

Figura 12. O fragmento Fab de R15E6 inibe a nigra'2o de cHI ul as endoteliais mediada por VEGF.

DESCRI n(jO DA LISTAGEM DE SEQUNNCIAS

Cada urra das sequ5 nci as de nucle/Sidos e proteicas na listagem de sequ5 nci as, juntamente como correspondente nBmero ou nBmeros de acesso Genbank ou Derv\ent, quando apl i c®/el , e espUcie de onde derivarq est® mostrado na Tabel a I.

Tabel a I

DESCRI πΰθ DETALHADA DA INVENnuO A presente inven'2o est® relacionada com anticorpos que se li gama FTPHbeta e suas utiliza'Pes. TUcni cas padronizadas podem ser usadas para DNA recorrbi nant e, s°ntese de ol i gonuc I e/S i dos, e cultura de tecidos e t r ansf or ma'2 o ( e. g. el ect r opor a'2 o, lipofec'2o). As tUcnicas de reac'2o enzirrÊtica e pu r i f i c a '2 o podem ser realizadas de acordo comas espeeifi ca ' Pes do fabricante ou corro normal mente realizado na arte ou corro aqui descrito. As tUcnicas e procedimentos s2o, de um rrodo geral, realizadas de acordo com rrlUtodos convencionais conhecidos na arte e corro descrito emv®rias refersncias gerais e mai s espec°ficas que s2o citadas e discutidas ao longo da presente es peei f i ca'2 o. A menos que defini 'Pes espec°ficas sej am dadas, a nomenclatura utilizada neste contexto e os procedimentos laboratoriais e tUcnicas de qu°rrica anal0-tica, qu°nica de s°ntese org°nica e qu°nica rrflldi c a e farmac5utica aqui descritas s2o as conhecidas e normal mente usadas na arte. Podem ser usadas tUcnicas convencionais para a s°ntese qu°rrica, an® i se qu°rrica, prepara'2o farma-csutica, forrmla'2o e entrega, e tratamento de doentes.

Qs termos que se seguerq a menos que de outra forma seja indicado, dever2o ser entendidos corro possuindo os seguintes significados: "Prote°na," H aqui usada de forma perrrot®/el com pUpt i do e pol i pUpt i do. FTPHbeta H fosfatase tirosina de prote°nas humana como definida na listagem de sequ, nci as. Nalgumas realiza'Pes, s2o usados vdfios fragmentos de FTPHbeta. Homffl ogos, ort/Hogos, fragmentos, variantes e rmtantes da prote°na e gene de FTPHbeta, corro descrito abaixo, s2o considerados dentro do °rrbito do termo "FTPHbeta".

Por "fragmento" pretende-se significar uma por'2o da sequ, nci a de nucle/Sidos ou de prote°na. Qs fragmentos podem manter a actividade bi ol /Igi ca da prote°na nativa. Qs fragmentos de uma sequ, nci a nucleot°dica s2o tarrbUm Bteis corro sondas de hi br i da'2 o e sequ, nci as iniciadoras ou para regular a express2o de um gene, e. g., RNA ant i - sent i do, si RNA ou nicro RNA. Uma por'2 o biologicamente activa pode ser preparada através do isolamento de uma por'2o de uma das sequ, nci as nucl eot0di cas da inven'2o, express2o da por'2o codificada (e. g., por express2o r econrbi nant e in vitro) e avalia'2o da actividade da prote°na codificada.

Qs f a rri I i ari zados coma arte t arrbUm reconhecer2 o que os genes e prote°nas de espUcies diferentes das listadas na listagem de sequ, nci as, part i cul ar ment e espécies de vertebrados, podem ser Bteis. Tais espUcies incluem mas η2 o lhes est2o linitadas, rmrganhos, ratos, cobaios, coelhos, c2es, porcos, cabras, vacas, macacos, chi rrpanzUs, ovelhas, hameters e peixe zebra. Qs familiarizados coma arte ainda reconhecer2o que para ut i I i z a '2 o de sondas das sequ, nci as de espUcies conhecidas, cDNA ou sequ, nci as gen/Bri cas homffl ogas da sequ, nci a conhecida poder2o ser obtidas da mesma espUcie ou de uma espUcie alternativa por rrlUtodos de cl onagem conhecidos. Tais hornffl ogos e ort/Hogos s2o considerados corro βΐ ei s na realizado da i nven'2 o.

Por "variantes" pretende-se significar sequ5 nci as si rri I ares. Por exenpl o, variantes conservadas podem incluir as sequ5 nci as que, devido - degeneresc5 nci a do c/ffli go genUtico, codificam a sequ5 nci a de arri no®ci dos de um dos pol i pUpt i dos da inven'2o. Variantes al Hl i cas naturais e variantes de ' s pl i c i ng _ podem ser identificadas como uso de tUcnicas conhecidas, e. g. com reac'2o em cadei a da pol i -merase ( PCR), an(U i se de pol i rrorf i srros de nucle/Sidos isolados (SNP) e tUcnicas de hi br i da'2 o. Para isolar ort/E-I ogos e hornffl ogos, s2o geral mente utilizadas condi 'Pes de hibrida'2o r est r i ngent es, ditadas por sequ5 nci as espec0-ficas, conpri mento da sequ5 nci a, teor de guani na + citosina ( GC) e outros par°metros. Sequs nci as nuc I eot0 di cas variantes tarrbUm incluem sequ5 nci as nucl eot0 di cas obtidas por s°ntese qu°rrica, e. g. derivadas através da utiliza'2o de rrutagUnese dirigida. As variantes podem conter sequ5 nci as adicionais apenas do I ocus gen/Eri co ou em corrt>ina'2o com out ras sequ5 nci as.

As rml Hcul as da inven'2o t arrbUm i nci uem prot e° nas truncadas e/ou rrutadas em que regi Pes da prote°na η2 o necessárias para a I i ga'2 o do ligando ou sinaliza'2o foram deletadas ou modificadas. De forma semelhante, podem ser rrutadas para modificar a sua liga'2o ao ligando ou actividades de sinaliza'2o. Tais nuta'Pes podem envolver rruta'Pes η2 o conservadas, dele'Pes ou adi'Pes de arri nodti dos ou donrf ni os da prote°na. As prote°nas variantes podem ou η2 o reter a actividade biolAgica. Tais variantes podem resultar de, e. g., polimorfismo genUtico ou da mani pul a '2 o humana.

As prote°nas de fus2o s2o igual mente aqui consideradas. Usando rrffltodos conhecidos, os familiarizados com a arte ser2o capazes de fazer prote°nas de fus2o das prote°nas da inven'2o; estas, ainda que diferentes da forma nativa, podem ser Bteis. Por exemplo, o parceiro de fus2o pode ser uma sequ, nci a de polipUptido sinal (ou l°der) que em co-1 radu'2 o ou em p/B-1 r adu'2 o dirige a t ransf er, nci a da prote°na do seu local de s°ntese para um outro local (e. g., 0 l°der do factor a de levedura). Como alternativa, pode ser adicionado para facilitar a purifica'2o ou 1 dent i f i ca'2 o da prote°na da inven'2o ( e. g., poli-His, pUpt i do FI ag ou prote°nas fluorescentes). O termo "antigUnio" refere-se a uma nol Hcul a ou uma por'2o de uma molécula capaz de ser ligada por um agente de I i ga'2 o selectivo, corno seja um anticorpo, e ai nda H capaz de ser usado num ani mal para produzi r anticorpos capazes de se ligarem a um epitopo daquele ant i gilni o. Umantig^nio pode ter um ou mai s epi topos. O termo "epitopo" inclui qualquer determinante antig^lnico, de prefer4ncia um determinante pol i pept0 di co, capaz de se ligar especi f i camente a uma i rrunogl obul i na ou a umreceptor de cHI ul as T. Em det er rri nadas r eal i za ' hes, os determnantes epit/fpicos incluem grupos de superf°cie qui rri cament e activos corro sejam a rri no(§ti dos, a'Scares, l°pidos, fosforilo ou sulfonilo e, em det er rri nadas r eal i za' hes, podem ter car act er° st i cas de estrutura tridimensional espec°fica, e/ou car act er° st i cas de carga espec°ficas. Umepitopo H uma regi2o de umantigUnio que H ligada por um anticorpo. Em det er rri nadas realizares, um anticorpo H referido corro se ligando es peei f i cament e a um antigUnio quando ele pref erenci al ment e reconhece o seu antigUnio alvo numa rristura corrpl exa de prote°nas e/ou macrorrol Hcul as. Um anticorpo H tarrbUm referido corro se ligando especi fi camente a um antigUnio quando apresenta maior afinidade para o antigUnio que para outras rrol Hcul as relacionadas e/ou η2 o relacionadas. O terno "anticorpo" (Ab) corro aqui usado inclui anticorpos rronoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos rru 11 i - es pec° f i cos ( e. g. anticorpos bi s pec° f i cos), anticorpos de cadeia si rrpl es, e. g. anticorpos de lama e camelo, fragmentos de anticorpo, e. g. fragmentos das regi hes vari(&amp;/eis e/ou constantes, desde que apresent em uma actividade biol/Igica pretendida, e. g. actividade de I i ga'2 o ao antig^nio. O terno " i rrunogl obul i na" (Ig) H aqui usado de forma perrrut®/el com " ant i cor po".

Um "anticorpo isolado" H um que foi identificado, e/ou separado, e/ou recuperado do seu arrbiente natural. A unidade b®si ca do anticorpo de quatro cadeias H urna gl i coprot e° na het erot et rarrlilri ca conposta por duas cadeias leves (L) id4nticas e duas cadeias pesadas (H) i d3 nt i c as (um anticorpo I gM consi st e em 5 unidades bG&amp;i cas de het erot et r° meros juntamente com um pol i pUpt i do adicional designado cadeia J, e portanto contUmlO locais de I i ga'2 o ao antigUnio, enquanto os anticorpos IgA secretados podem polimerizar para formar montagens polivalentes conpreen-dendo 2-5 das unidades b®si cas de 4 cadeias juntamente com uma cadeia J. No caso das IgGs, a unidade de quatro cadeias terp geral mente, cerca de 150 ki I o Dal tons (kDa). Cada cadeia L est® ligada a uma cadeia HatravUs de uma I i ga'2 o covalente di ssul f ur et o, ao mesmo terrpo que as duas cadeias H est2o ligadas uma " outra atravUs de uma ou mai s liga'Pes di ssul f uret o, dependendo do isotipo da cadeia H. Cada cadeia H e L t arrbUm possui pontes dissulfureto intracadeia regularmente espa'adas. Cada cadeia H possui no seu extremo N, um dorrt ni o vari®/el ( Vh) seguido de tr5s dorrtnios constantes ( Ch) para cada uma das cadeias e .·. e quatro dorrt ni os Ch para os isotipos i e . Cada cadeia L possui no extremo N, umdorrtnio va r i dVe I ( Vl) seguido de um dorrt ni o constante (Cl) no seu outro extremo. Vl est® alinhada comVH e Cl est® alinhado com o primeiro dorrt ni o constante da cadeia pesada (CH1). Cr3-se que res°duos de ani no@ti dos particulares formem uma interface entre os don? ni os va r i Ovei s da cadeia leve e da cadeia pesada. O errpa rei ha mento de Vh e Vl em conjunto forma um Bni co local de I i ga'2 o ao antigllnio. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, ver, e. g., Basic and

Clinicai I nminol ogy, 8t h edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton &amp; Lange, 1994, pdgi na 71 e Cap°tulo 6. A cadeia L de qualquer uitb das espUci es de vertebrado pode ser classificada como um de dois tipos claramente distintos, designados capa e I arrbda, com base nas sequ, nci as de arri nodti dos dos seus dorrí ni os constantes. Dependendo da sequa nci a de arri no(Bfci dos do donf ni o constante das suas cadeias pesadas ( Ch) , as i nxinogl obul i nas podem ser classificadas em classes ou isotipos diferentes. Existem ci nco cl asses de i rrunogl obul i nas: IgA, IgD, IgE, IgG e IglV) possuidoras de cadeias pesadas designadas , , .·. e i , respect i vament e. As classes .·. e s2o ainda divididas em subclasses com base emdiferen'as r el at i vament e menores na sequ, nci a e fun'2o de Ch, e. g. os seres humanos expressam as seguintes subclasses: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAI e I gA2.

Qs membros da f a rr? I i a Camel i dae, e. g. lama, camelo e dromed(§ri os, possuem um Bni co tipo de anticorpo, sem cadei as leves e ainda sem o dorr? ni o Cm ( Mjyl der mans, S., Rev. Mol . Biotechnol., 74, 277-302 ( 2001)). A regi2o vari®/el destes anticorpos de cadeia pesada H designada VHh ou VHH, e constitui o fragmento de I i ga'2 o ao antigUnio intacto mai s pequeno que se conhece (15 kDa) derivado de uma i rrunogl obul i na f unci onal . O termo "varidà/el" refere-se ao facto de deter- ninados segmentos dos dorrt ni os vari®/eis diferirem extensivamente em termos de sequ, nci a entre os diferentes anticorpos. O dorrt ni ο V medeia a I i ga'2 o ao antigilnio e define a especificidade de um anticorpo particular para o seu antigilnio. No entanto, a variabilidade η2 o est® aleatoriamente di s t r i bu° da ao longo dos 110 arri no®ci dos dos dorr? ni os vari®/eis. Pelo contr®rio, as regi Pes V consistem segmentos relativamente invariantes designados regi Pes estruturais ( 'f ramework_, FR) de 15-30 arri no®: i dos separadas por regi Pes curtas de extrema variabilidade designadas "regi Pes hi pervari ®/ei s" que tem cada uma 9-12 arri no®:i dos de conpri mento. Qs dorr? ni os vari®/eis das cadeias pesadas e leve nativas corrpreendem cada um quatro FRs, largamente adoptando uma configurado de folha §, ligados por tr,s regi Pes hi pervar i ®/ei s, as quais formam ansas que ligam e nalguns casos fazem parte, a estrutura de folha §. As regi Pes hi pervar i ®/ei s em cada uma das cadeias s2o mantidas juntas em estreita proximidade pelas FRs e, comas regi Pes hi pervar i ®/ei s da outra cadeia, cont ri buem para a forma'20 do local de I i ga'2 o ao antigUnio dos anticorpos. Qs dorrt ni os constantes η2 o est2o directamente envolvidos na I i ga'2 o de um anticorpo a um antig^nio, mas apresentam v®"ias fun'Pes efectoras, corro seja a participado do anticorpo na ci t ot oxi ci dade celular dependente de anticorpo (ADCC). O termo "regi2o hi pervari ®/el " quando aqui usado refere-se aos res°duos de arri no®:i dos de um anticorpo que s2o respons@veis pela ligado ao antigUnio. A regi2o hi pervari ®/el geral mente conpreende res°duos de arri no®ci dos de uma "regi2o deterrrinante de conpl ernent ar i dade" ou "CDR" (e. g. aproxi rradament e por volta dos res°duos 24-34 (L1), 50- 56 ( L2) e 89- 97 ( L3) em Vl, e aproxi rradament e por volta dos r es° duos 1-35 (H1), 50- 65 ( H2) e 95- 102 ( H3) em VH;

Kabat et al . , Sequences of Proteins of I nminol ogi cal Interest, 5t h Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) e/ou os res°duos de urna regi2o da "ansa hi pervar i ®/el". O termo "anticorpo rronocl onal " corro aqui usado refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma popula'2o de anticorpos subst anci al rnent e honogUnea, i . e. , os anticorpos individuais conpreendendo a popula'2o s2o id5nticos excepto as poss°veis rruta'Pes naturais que possam estar presentes em quant i dades rruito pequenas. Ao contr®rio das prepara'Pes de anticorpos policlonais, que incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes epi topos, cada anticorpo rronocl onal H dirigido contra um βηι co epi topo, i . e. um βηι co deterrrinante antigHnico. Para al Hm da sua especificidade, os anticorpos rronocl onai s s2o vantajosos por poderem ser sintetizados sem contam na'2o com outros anticorpos. O adjectivo "rronocl onal" η2 o deve ser considerado corro requerendo a produ'2o do anticorpo atravHs de qualquer niUtodo particular. Por exenpl o, os anticorpos rronocl onai s βΐ ei s na presente inven'2o podem ser preparados atravHs da metodologia de hibri domas ou podem ser produzidos usando rrliltodos de DNA recorrbi nant e em cHI ui as bacterianas, animais eucari/Sicos ou cHI ui as vegetais (ver, e. g. , Pat. U. S. No. 4,816,567). Qs "anticorpos mDnoclonais" podem t arrbUm ser isolados a partir de bibliotecas f (Sgi c as de anticorpos, usando as tUcnicas dispon°veis, e. g. Cl ackson et al., Nature, 352:624-628 ( 1991).

Qs anticorpos rronoclonais aqui tratados incluem anticorpos " qui rrlHr i cos" em que urra por'2o da cadeia pesada e/ou leve H id5ntica ou homffl oga de sequj nci as correspondentes em anticorpos derivados de urra espUcie particular ou pertencentes a urra classe ou subclasse de anticorpos particulares, enquanto o restante das cadeias H i d5ntico ou horrffl ogo de sequ5 nci as correspondentes em anticorpos derivados de urra outra espUcie ou pertencente a uma outra classe ou subclasse de anticorpos, assim corro fragmentos de tais anticorpos, desde que apresentem a actividade biol/lgica pretendida (ver Pat. U. S. No. 4,816,567; e IVbrrison et al., Proc. Nat I . Acad. Sei. USA, 81, 6851-6855 ( 1984)).

Um "fragmento de anticorpo" corrpreende urra por'2o de um anticorpo rru 11 i rrlHr i co, de prefe^ncia a regi2o de I i ga'2 o ao antigUnio ou vari®/el do anticorpo intacto. Exerrpl os de fragmentos de anticorpos incluem Fab, Fab', F( a b' ) 2, d° meros e tr° meros de conjugados Fab, Fv, scFv, rrini corpos,; diacorpos, triacorpos e tetracorpos; anticorpos lineares (Ver Hudson et al , Nature IVbd. 9, 129-134 (2003)). "Fv" H o fragmento de anticorpo rrf ni rm que possui um I ocal de liga'2o ao antigUnio completo. Este fragmento consiste numd°mero de umdorrtnio da regi2o vari(BVel de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve em assoei a'2o estreita η2 o covalente. Do enrolamento destes dois dorr? ni os surgem seis ansas hi pervar i (EVei s (3 ansas de cada uma das cadeias H e L) que cont ri buem com res° duos de arri no(Sti dos para a I i ga'2 o ao antigilnio e conferem ao anticorpo especificidade da I i ga'2 o ao antigUnio. No entanto, mesmo um dorrt ni o vari®/el si npl es (ou metade de um Fv corrpreendendo apenas tr5s CDRs espec°ficas de um ant i gilni o) tema capacidade de reconhecer e se ligar ao antigUnio, e H capaz de portanto estar i nel u°do na defi ni '2o de Fv. " Fv de cadeia simples" tarrbUm abreviado como "sFv" ou "scFv" s2o fragmentos de anticorpos que compreendem os dortfnios Vh e Vl de anticorpos ligados numa Bni ca cadeia pol i pept0 di ca. De prefer.ncia, o polipllptido sFv ainda corrpreende um elemento de liga'2o pept°dico entre os dorr? ni os Vh e Vl que permite ao sFv formar a estrutura pretendida para I i ga'2 o ao antigUnio.

Os termos "diacorpos, triacorpos e tetracorpos" referemse a pequenos fragmentos de anticorpos preparados através da constru'2o de fragmentos de sFv com pequenos elementos de I i ga'2 o (cerca de 5-10 res°duos) entre os dorrt ni os Vh e Vl de modo que H conseguido o emparei ha ment o intercadeias mas η2 o intracadeias dos dorrt ni os V, resultando numfragmento rru 11 i vai ent e. 0 termo "anticorpo humanizado" ou "anticorpo humano " refere-se a anticorpos que conpreendem sequ5 nci as das regi Pes vari®/eis das cadeias pesada e leve de uma es pilei e η2 o humana ( e. g. um rrurganho) mas em que pelo menos uma por'2o da sequ5 nci a Vh e/ou Vl foi alterada para ser mai s do "tipo humano", i . e. mai s semelhante a sequ5 nci as vari®/eis da linha gerrri nativa humana. Um t i po de anticorpo humanizado H um anticorpo enxertado com CDR, em que as sequ5 nci as CDR humanas s2o introduzidas em sequ5 nci as VH e VL η2 o humanas para substituir as correspondentes sequ5 nci as CDR η2 o humanas. Os meios para a prepara'2o de anticorpos quirrlUricos enxertados com CDR e humanizados s2o conhecidos dos f arri I i ar i zados coma arte (ver, e. g. , Pat. U. S. Nos. 4,816,567 e 5,225,539). Um rrfllt odo para a preparado de anticorpos humanos enprega o uso de animais t ransgUni cos, corro seja um rrurganho t ransgUni co. Estes animais t ransgUni cos possuem uma por'2o substancial do genoma produtor do anticorpo humano inserido no seu pr/Iprio genoma e a produ'2o dos anticorpos endógenos do animal H tornada deficiente relativamente - produ'2o de anticorpos. Mfltodos para a prepara'2o de tais animais t ransgUni cos s2o conhecidos na arte. Tais animais t ransgUni cos podem ser produzidos usando tecnologia XenolVbuseR™ ou usando uma abordagem de " rri ni I ocus". Mfltodos para a produ'2o de XenoM ceR™ est2o descritos nas Patentes U. S. Nos. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598 e 6,075,181. IVfflt odos para a produ'2o de animais t ransgUni cos usando a abordagem de "rri nil ocus" est2o descritos nas Patentes U. S. Nos. 5,545,807, 5, 545, 806 e 5, 625, 825, e V\0 93/12227. A humaniza'2o de um anticorpo η2 o humano tornou-se rotina nos β| t i rros anos, e est® agora dentro do conhecimento dos fanri I i ari zados com a arte. V®'ias corrpanhi as oferecem servi 'os para produzir um anticorpo humanizado, e. g. Xoma, Aries, IVfedarex, PDL, e Carrbridge Ant i body Technologies. Os protocolos de humaniza'2o est2o extensivamente descritos na literatura tUcnica, e. g. , Kipriyanov and Le Gal I , Mal ecul ar Biotechnol, Vol . 26, pp 39-60 ( 2004), Humana Press, Totov\a, NJ ; Lo, Mfltodos IVbl . Bi ol ., Vol. 248, pp 135- 159 ( 2004), Humana Press, Totowa, NJ ; V\0 et al, J. IVbl . Bi ol . 294, 151- 162 ( 1999).

Em deterrri nadas realiza'Pes, os anticorpos da presente inven'2o podem ser expressos em I i nhas celulares diferentes das linhas celulares de hibri domas. Sequ5 nci as codificadoras de anticorpos particulares podem ser usadas para t ransf or ma'2 o de uma cHI ul a hospedeira de marrtfero adequada por rrlUtodos conhecidos para a introdu'2o de pol i nucl e/S i dos numa cHI ul a hospedeira, incluindo, por exenpl o, encapsida'2o do pol i nuc I e/S i do num v°rus (ou num vector virai) e transdu'2o de uma cHI ul a hospedeira como v°rus (ou vector) ou através de processos de transfec'2o conhecidos na arte, corro exenpl i f i cado nas Pat. U. S. Nos. 4,399, 216, 4,912,040, 4,740,461, e 4,959,455. O processo de t ransf orrna'2 o usado pode depender do hospedeiro a ser transformado. Mfltodos para a introdu'2o de pol i nuc I e/S i dos heter/Hogos em cHI ul as de marrtfero s2o conhecidos na arte e i ncl uerp mas η2 o lhes est2o I irritados, transfec'2o mediada por dextrano, precipita'2o com fosfato de c® ci o, transfec'2o mediada por pol i breno, fus2o de pr ot opl ast os, el ect ropora'2 o, encapsulado de um ou rrai s pol i nuc I e/B i dos em I i poss ornas, nistura de (St i dos nucl ei cos com I 0 pi dos carregados positivamente e mcroinjec'2o directa do DNA nos nBcl eos.

Uma mol Hcul a de (Sti do nucl ei co codificadora da sequ, nci a de a rri no(Sti dos da regi2o constante da cadeia pesada, uma regi2o vari®/el da cadeia pesada, uma regi2o constante da cadeia leve, ou uma regi2o vari®/el da cadeia leve de um anticorpo ou um seu fragmento numa corrbina'2o adequada caso se pretenda, H/s2o inseridos numvector de express2o adequado usando tUcnicas de liga'2o convencionais. A regi2o constante da cadeia pesada ou da cadeia leve do anticorpo pode ser apensa ao extremo C da regi2o vari®/el adequada e H ligada a umvector de express2o. O vector H tipicamente sei ecci onado para ser funcional na cHI ul a hospedeira particular empregue (i . e. o vector H conpat°vel com a maquinaria da cHI ul a hospedeira de modo que a a rrpl i f i c a'2 o do gene e/ou express2o do gene possam ocorrer). Para uma revis2o dos vectores de express2o, ver Mfltodos Enzymol . vol . 185 (Goeddel, ed.), 1990, Acaderric

Press.

Qs anticorpos e seus fragmentos da presente inven'2o ligamse a FTPHbeta e regul am a angi ogUnese. Como definido acima, o termo anticorpo H usado para significar um fragmento de liga'2o ao antigUnio. Qs usos de tais anticorpos e fragmentos de I i ga'2 o ao antig^mo s2o ainda descri t os abai xo.

Ensaios de rastreio que usam rrodel os in vitro e in vivo de angi ogUnese

Os anticorpos da inven'2o podem ser testados em ensaios de angi ogUnese que s2o conhecidos na arte. Tais ensaios i ncl uem ensai os in vitro que medem subst i t ut os do crescimento de vasos sangu°neos em c^l ul as em cultura ou forma'2o de estruturas vasculares de expl antes de tecidos e ensaios in vivo que medem o crescimento de vasos sangu°neos directamente ou i ndi rect ament e ( Auer bach, R., et al . (2003). Cl i n Chem 49, 32-40, Vai I he, B., et al . (2001). Lab Invest 81, 439-452). IVbdel os in vitro de angi ogUnese. A maioria destes ensaios enprega cHI ul as endot el i ai s em cul t ura ou expl ant es de t eci dos e medi '2 o do efeito dos agentes nas respostas celulares " angi ogllni cas" ou na forrra'2o de estruturas do tipo capilares sangu°neos. Exenpl os de ensaios de angi ogUnese in vitro incluem mas η2 o lhes est2o lirritados, rrigra'2o e prolifera'2o de clll ul as endoteliais, forrra'2o de tubos capilares, forrra'2o de rebentos endoteliais, o ensaio do expl ante do anel a/frtico e o ensaio do arco a/frtico de pintos. IVbdel os in vivo de angi ogUnese

Nestes ensaios, os agentes ou anticorpos s2o adrrinistrados local mente ou si st erri carnent e na presen'a ou aus5 nci a de factores de crescimento (i . e. VEGF ou angi opoi et i na 1) e o crescimento de novos vasos sangu°neos H medido através da observa'2o directa ou através da medi '2o de um marcador substituto corro seja o teor de hemoglobina ou um indicador fluorescente. Exenpl os de angi ogUnese, i ncl uem mas η2 ο I hes est2 ο I i rri t a dos, ensai o da merrbrana cori oal ant/H ca de pintos, ensaio de angi ogUnese da c/frnea e o ensaio do tanp2o de MMRIGELu.

Tratamento de distBrbios regulados por angi ogUnese O terno "regular" H definido de acordo com os seus significados aceites dos dicionários. Assi rn o significado do terno "regular" inclui, mas η2 o lhes est® irritado, regular positivamente ou regular negat i va ment e, fixar, ordenar ou uni f or rri zar, governar, ou dirigir através de v®rios meios. Num caso, um anticorpo pode ser usado num rrlUtodo para o tratamento de um"distBrbio por angi ogUnese elevada" ou "distBrbio por angi ogUnese reduzida". Como aqui usado, um"distBrbio por angi ogUnese elevada" H aquele que envolve angi ogUnese i ndesej ada ou elevada nas rrani f est a ' hes biol/lgicas da doen'a, distBrbio e/ou condi '2o; na cascata biol/lgica que conduz ao distBrbio; ou corro um sintoma do distBrbio. De forma semelhante, o "distBrbio por angi o- gUnese reduzida" H um que envolve angi ogUnese desej ®/el ou angi ogUnese reduzida nas manifestares biol/lgicas. Este "envolvimento" da angi ogUnese numdistBrbio por angi ogUnese el evada/r eduz i da inclui, mas η2 o lhes est2o I irritados, os segui nt es: (1) A angi ogUnese corro uma "causa" do distBrbio ou manifesta'2o biol/lgica, em que o n°vel de angi ogUnese H elevado ou reduzido geneticamente, por infec'2o, por auto- i rruni dade, trauma, causas bi oqu° rri cas, estilo de vida ou por outras causas. (2) A angi ogUnese corro parte da manifesta'2o observ®/el da doen'a ou distBrbio. Ou seja, a doen'a ou distBrbio H medida em ternos da angi ogUnese aumentada ou reduzida. De um ponto de vista cl°nico, a angi ogUnese indica a doen'a; no entanto, a angi ogUnese η2 o necessita de ser "marca registada" da doen'a ou distBrbio. (3) A angi og^nese H parte da cascata bioqu°rrica ou celular que resulta na doen'a ou distBrbio. Neste contexto, a regula'2o da angi ogUnese pode interronper a cascata e pode controlar a doen'a. Exenpl os η2 ο I irritantes de distBrbios regulados por angi ogUnese que podem ser tratados pela presente inven'2o s2o aqui descritos abaixo.

Os anticorpos da presente inven'2o podem ser usados para tratar doen'as associadas a neovascul ar i za '2 o reti nal / coroi dal que i ncl uerq mas η2 o lhes est2o I irritadas, retinopatia diabética, degeneresc5 nci a macular, cancro, anerria das cHI ul as falei formes, sarcoi dose, s°filis, pseu-doxantorra e I ds tico, doen'a de Paget, oclus2o das veias, oclus2o das artérias, doen'a obstrutiva das car/Bidas, uve°te c r /Bn i ca/vi tri te, infec'hes por rri cobact Ur i as, doen'a de Lyme, I Bpus sistUnico eritematoso, retinopatia de prematuridade, doen'a de Eal es, doen'a de Behcet, infec'hes causadores de uma retinite o coroidite, presurrfvel hi st opl as rrose ocular, doen'a de Best, rri opi a, fossetas col obomat osas, doen'a de Stargardt, pars planite, descolamento cr/Bii co da retina, s°ndrome da hi pervi scos i dade, t oxopl as rrose, trauma e conplica'hes ρ/6-laser. Outras doen'as incluem mas η2 o lhes est2o I irritadas, doen'as associadas a rubeose ( neovaseul ar i za'2 o da °ris) e doen'as causadas pela prolifera'2o anormal de tecido f i brovaseul ar ou fibroso incluindo todas as formas de v° t r eo-r et i nopat i a pr ol i f er at i va, associada ou η2 o a diabetes.

Os anticorpos da presente inven'2o podem ser usados para tratar doen'as associadas a inflama'2o cr/Bii ca. As doen'as com sintomas de inflama'2o cr/Bii ca incluem doen'as i nf I amat/Bi as intestinais, corro doen'a de Crohn e colite ulcerativa, psor°ase, sarcoi dose e artrite reumat/Bde. A angi ogUnese H um elemento chave que estas doen'as i nf I amat/Bi as cr/Bii cas possuem em corrom A inflama'2o cr/Bii ca depende da forma'2o cont°nua de rebentos capilares para manter um influxo de clll ul as i nf I amat/Bi as. O influxo e presen'a das clll ul as i nf I amat/Bi as produzem granul ornas e, assim mant5 m o estado i nf I amat/Bi o cr/Bii co. A i ni bi '2 o da angi ogUnese pelas corrposi ' hes e rrlUtodos da presente inven'2o evitar® a forma'2o dos granul ornas e al i vi am a doen'a. A doen'a de Crohn e a colite ulcerativa s2o caracteri zadas por inflama'2o cr/6ii ca e angi ogllnese em v®"ios locais no tracto gastrointestinal. A doen'a de Crohn caract eri za-se por inflama'2o granul orratosa cr/Bii ca ao longo do tracto gastrointestinal consistindo em novos rebentos capilares rodeados por um cilindro de cHI ul as i nf I arrat/Eri as. A preven'2o da angi ogUnese inibe a forrra'2o dos rebentos e evita a forrra'2o de granul ornas. A doen'a de Crohn ocorre como una doen'a i nf I arrat/Eri a cr/Eriica transrrural que afecta pr i nci pal ment e o 01 eo distai e o c/0 on mas pode t anrbUm ocor r er em qual quer parte do tracto gastrointestinal desde a boca atU ao °nus e ®"ea perianal. Os doentes com doen'a de Crohn geral mente possuem di ar rei a cr/Eii ca associada a dor abdorri nal, febre, anorexia, perda de peso e incha'o abdorri nal . A colite ulcerativa H igual mente uma doen'a i nf I amat Ar i a cr/frii ca e ulcerativa, η2 o espec°fica, que surge na rrucosa do c/0 on e que se caracteriza pela presen'a de diarreia comsangue.

As doen'as i nf I amat/Eri as intestinais tambUm apresentam rnani festa'hes ext r a-i nt est i nai s tais corro leshes da pele. Tais leshes s2o caracteri zadas por inflama'2o e angi ogUnese e podem ocorrer em muitos locais para a I Hm do tracto gastrointestinal. Os anticorpos da presente inven'2o podem ser capazes de tratar estas leshes atravHs da preven'2o da angi ogUnese, reduzindo assim o influxo de cHI ul as i nf I amat/fri as e a forma'2o da les2o.

Sarcoi dose H urra outra doen'a i nf I amatAri a cr/Eni-ca que se caracteriza por umdistBrbio granui omatoso rrulti-sistema. Qs granul ornas desta doen'a podem forrrar-se em qualquer local do corpo e assim os sintomas dependem da local iza'2o dos granul ornas e se a doen'a est® activa. Os granul onas s2o criados pelos rebentos angi ogHni cos de capilares que proporcionam um fornecimento constante de cHI ul as i nf I arrat/Eri as.

Os anticorpos da presente inven'2o podem tarrbUm tratar as condi 'Pes i nf I arrat Ari as crAni cas associadas com psor°ase. A psor°ase, una doen'a da pele, H una outra doen'a crArii ca e recorrente que se caracteriza por p(§pul as e placas de v®ri os tamanhos. A preven'2o da forrra'2o de novos vasos sangu°neos, necess®ria para manter as leshes caract er° st i cas, conduz ao al°vio dos sintomas. A artrite reumat/Hde H uma doen'a i nf I arrat/íri a cr/Bii ca que se caracteriza pela inflama'2o η2 o espec°fica das articulares per i f Ur i cas. Pensa-se que os vasos sangu°neos no forro si novi al das articula'Pes sofram angi ogUnese. Para al Hm de ser formarem novas redes de vascul atura, as cHI ul as endoteliais libertam factores e espHcies de oxi gHni o reactivas que conduzem ao crescimento de pannus (tecido f i brovascul ar) e destrui '2o da cartilagem Qs factores envolvidos na angi ogUnese podem contribuir activamente para o estado de infla rra'2 o cr/Biica da artrite reurrat/Hde e ajudar a rran^-lo. Outras doen'as que podem ser tratadas de acordo coma presente inven'2o s2o os herrangi ornas, doen'a de OsI er-V\èber-Rendu ou telan-giectasia herrorrCSgica heredit®ria, e turrores s/H i dos ou do sangue e s°ndrome da i nxmodef i ci 5 nci a adquirida.

Os anticorpos da presente inven'2o podem tarrbUm ser usados para tratar um "distBrbio por angi ogUnese reduzida". Corro aqui usado, um"distBrbio por angi ogUnese reduzida" H aquele em que a angi ogUnese seria considerada benUfica para tratar uma doen'a, distBrbio e/ou condi '2o. O distSrbio H um que se caracteriza por tecido que sofre ou est®emrisco de sofrer danos i squllmi cos, infec'2o, e/ou rr® ci cat r i za ’2 o, que resulta quando o tecido H desprovido de uma fornecimento adequado de sangue oxigenado devido a circula'2o inadequada. Como aqui usado, "tecido" H usado no seu sentido mai s lato, para incluir, mas η2 o lhes est® I irritado, o seguinte: tecido card°aco, corro sej am rri oc®"di o e ventr°loquos card°acos; tecido e r Hc til; rrfiscul o esquel Ht i co; tecido neur ol/Igi co, corro seja o do cerebelo; /frg2os internos, corro sej am o cllrebro, cora'2o, p°ncreas, f°gado, ba'o e pulrrío; ou ®"eas generalizadas do corpo corro sejam os membros na sua totalidade, um pll ou ap, ndi ces distais tais corro os dedos da rrí o ou do PH- Métodos de vascul ar i za ’2 o de tecido i squUrri co

Os anticorpos da presente inven'2o podem ser usados num método de vascul ar i za '2 o de tecido isquénico. Corro aqui usado, "tecido isquénico, " significa tecido desprovido de fluxo sangu°neo adequado. Exerrpl os de tecido isquénico i ncl uerrj nas η2 o lhes est2o I irritados, tecido sem fornecimento de sangue adequado resultante de enfartes do moc(grdio e cerebrais, isquem a mesentérica ou dos membros, ou o resultado de uma oclus2o vascular ou estenose. Num exerrpl o, a interrup'2o do fornecimento de sangue oxigenado pode ser causada por oclus2o vascular. Tal oclus2o vascular pode ser causada por arteriosclerose, trauma, procedimentos cirBrgicos, doen'a e/ou outras etiologias. Técni cas de rotina convencionais est2o dispon°veis para determinar se um tecido est® em risco de sofrer danos isquémicos derivados de oclus2o vascular i ndesej ®i/el . Por exerrpl o, na doen'a do rrioc®rdio estes métodos i ncl uem uma variedade de técnicas de i rnagi ol ogi a ( e. g., metodologias com marcadores radi oact i vos, raios x, e IVRI) e testes f i si ol /Igi cos. Assi rp a indu'2o de angi ogénese é um mei o eficaz de prevenir ou atenuar isquenia em teci dos afectados ou em risco de serem afectados por oclus2o vascular. Ainda, o tratamento de isquenia do rrBseul o esquelético e do niocdrdio, derrame cerebral, doen'a das artérias coron®'ias, doen'a vascular periférica, doen'a das artérias coron®'ias, é total mente cont empl ado.

Qs familiarizados com a arte de ut i I i z a'2 o de técnicas convencionais podem medir a vascul ar i za '2 o do tecido. Exerrpl os η2 ο I irritantes da medi'2o da vascul a-riza'2o de tecidos numindiv°duo i ncl uem SPECT (torrografia conput ador i zada por eniss2o de fot2o Bnico); PET (torrografia por erriss2o de positrPes); IVRI (i magi ol ogi a de resson°ncia magnética); e conrbina'2o dos mesmos, atravUs da medi'2o do fluxo sangu°neo para o tecido antes e ap/6 o tratamento. A angiografia pode ser usada como uma avalia'2o da vascul ari dade rracrosc/Epi ca. A avalia'2o histol/lgica pode ser usada para quantificar a vascul ar i dade ao n°vel dos pequenos vasos. Estas e outras tUcnicas est2o discutidas em Si rrons, et al ., "Clinicai trials in coronary angi ogenesi s," Circulation, 102, 73-86 (2000). Métodos de repara'2o de tecidos

Os anticorpos da presente inven'2o podem ser usados numrrliltodo de repara'2o de tecidos. Como aqui usado, "repara'2o de tecidos" significa promo'2o da repara'2o de tecidos, regenera'2o, crescimento e/ou manuten'2o incluindo, mas η2 o lhes estando I irritados, repara'2o de feridas ou engenharia de tecidos. Os farri I i ari zados coma arte saber2o que a forma'2o de novos vasos sangu°neos H necessária para a repara'2o de tecidos. Por sua vez, o tecido pode ser danificado atravUs de lesPes traurriEticas ou condi 'Pes incluindo artrite, osteoporose e outros distBrbios esquel H-ticos e queimaduras, mas η2 o lhes est2o I irritados. O teci do pode tarrbUm ser danificado por lesPes causadas por procedimentos cirBrgicos, irradia'2o, lacera'2o, qu°rricos t /Bc i cos, infec'Pes virais ou bacterianas ou queimaduras. Tecido necessitado de repara'2o t arrbUm i ncl ui feridas η2 o ci cat ri zant es. Exenpl os de feridas η2 o ci cat r i zant es i ncl uem β| ceras da pele que η2 o ci cat ri zam resul t ant es de patologia diabética; ou fracturas que η2 o cicatrizam f aci I ment e.

Os anticorpos podem tarrbUm ser utilizados na repara'2o de tecidos no contexto de procedimentos de regenera'2o de tecidos guiados (GTR). Tais procedimentos s2o actual mente usados pelos f arri I i ar i zados coma arte para acelerar a cicatriza'2o de feridas ap/ts procedimentos ci rBrgi cos i nvasi vos.

Os anticorpos podem ser usados num rrlUtodo de prorm'2o da repara'2o de tecidos caract eri zado pela estirmla'2o do crescimento de tecidos durante o processo de engenharia de tecidos. Corro aqui usado, "engenharia de tecidos" H definido corro a cria'2o, desenho e fabrica'2o de dispositivos prostUticos biol/lgicos, em corrt>ina'2o com materiais sintáticos ou naturais, para aumentar ou substituir tecidos e /frg2os do corpo. Assi rq o presente rrlUtodo pode ser usado para aumentar o desenho e crescimento de tecidos humanos fora do corpo para posterior i rrpl a nt a'2 o na repara'2o ou substitui '2o de tecidos doentes. Por exenpl o, os anticorpos podem ser βΐ ei s na prorro'2o do crescimento de subst i t ui ' Pes de enxertos de pele que s2o usados corro terapia no tratamento de queimaduras.

Num outro caso de engenharia de tecidos, os anticorpos da presente inven'2o podem ser inclu°dos em dispositivos, com cHI ui as ou sem cHI ui as, que induzem a regenera'2o de tecidos humanos funcionais quando inplantados num local que requer regenera'2o. Corro ant er i or ment e discutido, a regenera'2o de tecidos conduzida por bi ornat er i ai s pode ser usada para promover novo crescimento /Bseo, por exenpl o em doen'a periodontal. Assi rq os anticorpos podem ser usados para promover o crescimento de tecidos r econst i t u° dos montados em conf i gur a ' Pes tridimensionais no local de uma ferida ou outro tecido necessitado de tal repara'2o.

Num outro caso de engenharia de tecidos, os anticorpos podem ser inclu°dos em sistemas externos ou internos contendo tecidos humanos destinados a substituir a fun'2o de tecidos internos doentes. Esta abordagem envol ve isolamento de cHI ul as do corpo, sua substitui '2o com matrizes estruturais e i rrpl a nt a'2 o do novo sistema dentro do corpo ou usando o sistema fora do corpo. Por exerrpl o, os anticorpos podemser inclu°dos num enxerto vascular forrado de cHI ul as para promover o crescimento das cHI ul as contidas no enxerto. Prev5-se que os rrlUtodos da inven'2o possam ser usados para aumentar a repara'2o, regenera'2o e engenharia de tecidos em produtos tais corro cartilageme osso, tecidos do sistema nervoso central, rrôscul o, f°gado e cHI ul as dos i I hHus pancre® i cos (produtoras de insulina).

Forrrula'Pes f ar macs ut i cas e rrlUtodos para o seu uso

Os anticorpos da inven'2o podemser adrri ni st r ados a indiv°duos para tratar ou prevenir doen'as ou d i st βτ bi os que s2o regulados pelos genes e prote°nas da inven'2o. O termo "tratamento" H aqui usado para significar que a adrri ni st r a'2 o de um composto da presente inven'2o mitiga uma doen'a ou umdistBrbio num hospedei ro. Assi rr) o termo "tratamento" inclui preven'2o da ocorr4ncia de umdistBrbio num hospedeiro, part i cul ar ment e quando o hospedeiro tem predi sposi '2 o para adquirir a doen'a mas ainda η2 o foi diagnosticado com a doen'a; inibi'2 o do distBrbio; e/ou al°vio ou revers2o do distSrbio. Na medida em que os rrlfltodos da presente inven'2o s2o dirigidos _ preven'2o de distBrbios, H entendido que o termo "prevenir" η2 o requer que o estado da doen'a seja corrpl et ament e contrariado. (Ver V\èbster' s Ni nt h Collegiate Dictionary.) Em vez disso, como aqui usado, o termo preven'2o refere-se ~ capacidade do familiarizado coma arte identificar uma popula'2o que que H suscept°vel aos distBrbios, de modo que a adrri ni st r a '2 o dos compostos da presenta inven'2o pode acontecer antes do estabelecimento de uma doen'a. O termo η2 o inplica que o estado de doen'a seja corrpl et ament e evitado. Os compostos identificados através dos rrlUtodos de rastreio da presente inven'2o podem ser administrados conjuntamente com outros corrpost os. A seguran'a e a eficdtia terapsutica dos compostos identificados podem ser determinadas atravUs de procedimentos convencionais usando tecnologias in vitro ou in vivo. Qs compostos que apresentam grandes °ndices terap5uticos podem ser preferidos, ainda que compostos com °ndices terap5uticos rnai s baixos possam ser βΐ ei s se o n°vel de efeitos secundários for aceitdVel. Qs dados obtidos a partir das tUcnicas t oxi col Agi cas de f ar rracol Agi cas in vitro e in vivo podem ser usados para forrrular a garra das doses. A ef i c®ci a de um conposto pode ai nda ser aval i ada em rrodel os ani rrai s ou em ensai os cl 0 ni cos de doent es com angi ogUnese desregulada ou inadequadamente regulada.

Corro aqui usado, "ve°culo aceit®/el em termos f ar rracs ut i cos" destina-se a incluir todos os solventes, meios de dispers2o, revestimentos, agentes ant i bact er i anos e ant i f βngi cos, agentes isotAriicos e retardadores da absor'2o e si ni I ares, conpat°veis com a adrri ni st ra'2 o f ar rrac5 ut i ca. O uso de tais meios e agentes para subst°ncias activas em termos f ar rracs ut i cos H conhecido na arte. Excepto se qualquer meio ou agente convencional for inconpat°vel com o conposto activo, tais meios podem ser usados nas conposi'bes da inven'2o. Conpostos activos suplementares podem ser igual mente incorporados nas conposi'bes. Urra conposi'2o farrrac5utica da inven'2o H forrrolada para ser conpat°vel coma via de adrri ni st r a'2 o a que se destina. Exenpl os de vias de adrri ni st r a'2 o incluem a adninistra'2o parent Uri ca, e. g. intravenosa, intrad^rnica, subcut°nea, a oral ( e. g., i na I a '2 o), t ransdUr ni ca (t/tpica), transrrocosal e rectal. As solu'bes ou suspensbes usadas para a pl i c a '2 o parent Uri ca, intradUrrrica ou subcut°nea podem incluir os seguintes conponentes: um diluente estUril, corro seja (Egua para injec'2o, soro f i s i ol Agi co, /H eos fixados, pol i et i I enogl i c/H s, glicerina, propile-nogl i col ou outros solventes sintáticos; agentes antibac-terianos tais corro O cool benz°lico ou met i I parabenos; ant i oxi dant es tais corro (Sei do ascórbico ou bissulfito de s/ffli o; agentes quel antes tais corro (Sei do etilenodiarrina-t et racHt i co; tanpPes tais corro acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para ajustar a tonicidade corro seja cloreto de s/ffli o ou dextrose. O pH pode ser ajustado com (Sei dos ou bases, corro seja (Sei do clor°drico ou hidróxido de s/ffli o. A prepara'2o parentUrica pode ser usada para encher anpol as, seringas descart ®/ei s ou reservatóri os de rrfiltiplas doses feitos emvidro ou pl (Estico.

As conposi 'Pes f ar rrac, ut i cas para uso inject®/el i nel uem sol u'Pes aquosas estareis (quando sol Bvei s em (Sgua) ou dispersPes e pós estareis para a prepara'2o exterrpor°nea de solu'Pes ou dispersPes inject®/eis estUreis. Para adninistra'2o intravenosa, ve°culos adequados i nel uem soro fisiol/^ico, dgua bacteri ost(Sti ca, CREIVDPHOR ELu (BASF, Parsi ppany, N.J.) ou soro fisiológico tarrponado com fosfatos (PBS). Em todos os casos, a corrposi'2o deve ser estUril e dever® ser fluida atU ao ponto de existir fdei I seri ngabi I i dade. Deve ser est®/el nas condi 'Pes de produ'2o e armazenamento e deve estar preservada contra a ac'2o contam nante de rri c ror gani s mos tais corro bactUrias e fungos. Ove°culo pode ser um sol vente ou meio de dispers2o contendo, por exemplo, (Sgua, etanol, pol i ol (por exerrpl o, glicerol, propi I enogl i col , e pol i et i I enogl i col l°quido e si rri lares), e suas msturas adequadas. A fluidez correcta pode ser mantida, por exenpl o, através do uso de um revestimento corro seja a lecitina, através da manuten'2o do tamanho de part°culas necessário no caso da dispers2o e através do uso de t ens i oact i vos. A preven'2o da ac'2o de rri crorgani srros pode ser conseguida através de v®rios agentes ant i bact er i anos e ant i f Bngi cos, por exenpl o, parabenos, cl orobut anol , fenol, (St i do asc/frbico, timerosal, e si rri I ares. Em rruitos casos, ser® prefer°vel incluir agentes isot/Biicos, por exenpl o, a'Bcares, pol i ® cooi s tais corro manitol, sorbitol e cloreto de s/ffli o na corrposi '2o. A absor'2o prolongada das corrposi 'hes inject®/eis pode ser conseguida através da inclus2o na corrposi '2o de um agente que retarde a absor'2o, por exenpl o, rronostearato de al urrí ni o e gel at i na.

As solu'hes inject®/eis estareis podem ser preparadas através da incorpora'2o do corrposto activo na quantidade necess®ria num solvente adequado com um ou uma corrbina'2o dos ingredientes acima enumerados, conforme necess®rio, seguido de esteri I i za'2o por f i I t r a '2 o. De um rrodo geral, as dispershes s2o preparadas através da incorpora'2o do corrposto activo num ve°culo estUril que contem um meio de dispers2o b®si co e os outros ingredientes necess®rios. No caso dos p/B estareis para a prepara'2o de solu'hes inject®/eis estareis, os niUtodos preferidos de prepara'2o s2o a secagemsob v®cuo e I i of i I i z a'2 o que d® um p/E do ingrediente activo mai s qualquer ingrediente adicionado pretendido a partir de uma solu'2o previ amente esterilizada por filtra'2o. A adrri ni st ra '2 o sistUrrica pode tambUmser atravUs de meios t ransrrucosai s ou t r ansdUr rri cos. Para adrri nistra'2o t ransrrucosal ou t r ansdUr rri ca, s2o usados na fornmla'2o penetrantes adequados " barreira a ser permeada. Tais penetrantes s2o de modo geral conhecidos na arte e incluerp por exenpl o, para adrri ni st r a'2 o t ransrrucosal , detergentes, sais biliares e derivados do dti do fus°dico. A adrri ni s-tra'2o transnxicosal pode ser conseguida usando sprays nasais ou suposi t/fri os. Para adrri nistra'2o t ransdUr ni ca, os conpostos activos s2o formulados em pomadas, b®l sarros, glis ou cremes corro conhecido de rrodo geral na arte.

Os conpostos podem t arrbUm ser preparados na forma de suposi t/fri os (e. g. com bases convencionais para suposi t/fri os corro sejam manteiga de cacau e outros glicUridos) ou enemas de reten'2o para entrega rectal.

Numa realiza'2o, os conpostos activos s2o preparados comve°culos que proteger2o o composto contra a elirrina'2o r®pi da do corpo, corro seja uma forrrula'2o de liberta'2o controlada, incluindo implantes e sistemas de entrega mi cr oencapsul ados. Podem ser usados pol° meros bi odegr ad®/ei s e bi ocorpat0 vei s, como sejam acetato de et i I enovi ni I o, pol i ani dr i dos, (Sti do pol i gl i c/H i co, col a-gUni o, pol i ort oUst er es e <St i do pol i I <§tt i co. MUtodos para a prepara'2o de tais formula'Pes ser2o aparentes para os farni I i ari zados com a arte. Os materi ai s podem também ser obtidos comer ci al ment e ~ AI za Corporation e - Nova Phar maceut i cal s, Inc. SuspensPes de I i poss ornas (incluindo I i poss ornas di recci onados para células infectadas com anticorpos rronoclonais contra anti génios virais) podem ser igual mente usados corro ve°culos aceit®/eis em ternos f armacj ut i cos. Estes podem ser preparados de acordo com rrlUtodos conhecidos dos f arri I i ar i zados com a arte, por exenpl o, corro descrito na Patente U. S. No. 4,522,811.

§ es peei ai rrent e vantajoso forrmlar conposi'Pes orais ou parent Uri cas na forma de dosagem uni t <®r i a para facilidade de adrri ni st r a'2 o e uniforrridade da dosagem "Forma de dosagem unitSria" corro aqui usado, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas corro dosagens unitárias para o indiv°duo a ser tratado, cada unidade contendo uma quantidade pr H-det er rri nada do composto activo calculada para produzir o efeito terap4utico pretendido em assoei a'2o com o ve°culo farma^utico adequado. A es peei f i ca '2 o para as formas de dosagem unit®rias s2o ditadas e est2o directamente dependentes das caracter°s-ticas βηι cas do corrposto activo e do efeito terap4utico particular a ser atingido, e das limta'Pes inerentes na arte de fornola'2o de tal corrposto activo para o tratamento de i ndi v° duos. EXEIVPL05

Exenpl o 1. Produ'2o do donf ni o extracelular da prote°na FTPH£. Métodos: FTPH$ de tamanho conpleto foi cl onada a partir de urna biblioteca de placenta humana de acordo com as i nst r u' Pes do f abr i cant e ( Or i gene). O cI one H i d5 nt i co a um cl one de cDNA ant er i or ment e descrito (acesso Genbank # X54131) excepto faltar a repeti '2o FNIII #5. Um cDNA codificador da totalidade do dorrf ni o extracelular sol Bvel ( ECD) de FTPH<f foi cl onado por PCR a partir do cDNA de tamanho conpleto (ver sequ5 nci a abaixo) codificador dos AA 1 - 1534 coma adi '2 o de Hi s - Hi s - Hi s - Hi s - Hi s - Hi s - Gl y ( 6 Hi s-Gl y) C-terrrinal (SEQ ID NG 1). O cDNA resultante foi cl onado nos vectores de express2o de marrtfero para a express2o transit/fria ( pShut 11 e-CIW) ou estdVel (pcDNA3. 1(-)) em células HEK293. Para obter FTPH<f ECD ((fECD) purificada, as cHI ul as HEK293 t r ansf ect adas comumvector de express2o de <fECD foram i ncubadas em Opt i IVEM sem soro (Gibco) durante 24 horas em condi 'Pes de crescimento normais. O meio condicionado foi ent2o recuperado, centrifugado para remover detritos ( 1000 rpmx 5 rrinutos), e 1 rrl de agarose Ni - ΝΓΑ lavada (Qiagen) ( 500 iL de material corrpactado) foi adicionado a 10 rrl de mei o clarificado e deixado a agitar durante a noite a 4éC. No dia seguinte, a rristura foi carregada numa coluna e lavada com 20 vol umes de col una de NaH2P04 50 rrM NaCI 300 rrM Irridazole 20 rrM pH 8. A prote°na do dorrt ni o extracelular de FTPH<f pur i f i cada ( SEQ I D NG 2) f oi ent2 o el u° da em sei s frac'Pes com 200 ι I / e I ui '2 o em NaH2P04 50 rrM NaCI 300 rrM Irridazole 250 rrM pH 8. As frac'Pes foram analisadas relativamente ao seu teor de prote°na usando el ect rof orese em gel de SDS- pol i acri I arri da desnaturante e redutor e detectado por colora'2o com prata (Invitrogen) e confirmado por espect romet ri a de massa.

Resultados: Para desenvolver um anticorpo contra o dorrt ni o extracelular de FTPH<f, foram desenvolvidos vectores de express2o que dirigem a express2o de urra prote°na do dorrt ni o extracelular de FTPH<f etiquetada com 6-Hi s (Figura 1, Painel A). Subsequentemente, a prote°na do dorrt ni o extracelular de FTPH<f etiquetada com 6-Hi s foi purificada atll perto da homogeneidade (Figura 1, Painel B) a partir do meio condicionado das cHI ui as HEK293 t ransf ect adas como vector de express2o.

Exenpl o 2. Gera'2o de anticorpos rronoclonais contra o dorr? ni o extracelular de FTPH<f.

Mfltodos: Para a produ'2o do i rrunogUni o donf ni o extracelular de FTPH^, a prote°na do dorrt ni o extracelular de FTPH<f etiquetada com6-His purificada foi conjugada com t i r ogl obul i na porcina (Sigrra) usando qu°rrica de acopl agem EDC (Hockfield, S. et al . , ( 1993) Col d Spring Habor

Laboratory Press. Volume 1 pp. 111-201, I nrnmocy-t oc herri st ry). O conj ugado do dorrt ni o extracelular de FTPH^-t i r ogl obul i na foi di al i sado contra PBS, pH 7,4. Mjrganhos Bal b/c adultos foram ent2o imunizados subcut aneament e como conjugado ( 100- 200 i g) e adjuvante completo de Freund nurra mistura de 1:1. ApAs 2-3 serranas, os murganhos foram injectados i nt raperi t oneal ment e ou subcut aneament e com adjuvante incompleto de Freund e o conjugado nurra rristura de 1:1. A injec'2o foi repetida _s 4-6 serranas. Os soros foram colhidos dos murganhos 7 dias apAs a terceira injec'2o e testados relativamente - i muno-r eact i vi dade contra o antigUnio dorrí ni o extracelular de FTPH$ por ELISA e t ransf er, nci a western. Qs nurganhos que apresent aram urra boa resposta contra o a nt i gllni o receberam um refor'o através de uma βηι ca injec'2o intra-ba'o com 50 ι I da prote°na doní ni o extracelular de FTPH$ purificada,

nisturada a 1:1 com hi dr/Bci do de alurffnio, usando uma agulha extra longa de 31 gauge (Godi ng, J. W, ( 1996) IVbnocl onal Antibodies: Principies and Practices. Thi rd Edition, Acadenic Press Linited. p. 145). Resurri dament e, os rrurganhos foram anest esi ados com 2, 5% de avertina, e criou-se uma incis2o de 1 cent°metro obl°qua na pele da parede do corpo esquerda. A rristura de antigUnio foi adrrinistrada atravUs da inser'2o da agulha da por'2o posterior para a por'2o anterior do ba'o numa injec'2o longitudinal. A parede do corpo foi suturada e a pele fechada com duas moías pequenas de metal. Qs rrurganhos f oram moni tori zados relativamente a uma recupera'2o segura. Quatro dias ap/B cirurgia o ba'o do ratinho foi removido e suspensPes de cHI ul as isoladas foram preparadas para fus2o com cHI ul as de rri el orna de rrurganho para a cria'2o das linhas celulares de hibridoma (Spitz, M, ( 1986) Métodos In Enzymol ogy, Volume 121. Eds. John J, Lagone and Hei en Van Vunakis. PP. 33-41 (Acaderric Press, New York, NY)). Qs hibri domas resultantes foram cultivados em meio modificado de Dul becco (Gibco) suplementado com 15 % de soro fetal bovino (Hyclone) e hipoxantina, arrinopterina e ti rri di na. O r as t rei o de hi br i domas posi t i vos come'ou 8 di as ap/B a fus2o e continuou durante 15 dias. Qs hibri domas produtores de anticorpos ant i - donfí ni o extracelular de FTPH<f f oram i dent i f i cados por ELISA em duas sUries de placas de 96 alvéolos: uma revestida como dorrí ni o extracelular de FTPH<f etiquetado com hi st i di nas e uma outra revestida com uma prote°na MjrA bacteriana etiquetada com hi st i di nas corro um controlo negativo. O segundo anticorpo H de burro anti-IgG de murganho marcado com peroxi dase de rdbano silvestre ( HRP) (J ackson I mnrunor esear ch). A i rruno-r eact i vi dade foi monitorizada nos alvllolos usando revela'2o de cor iniciada por corrpr i rri dos de ABTS dissolvidos emtarrp2o TBS, pH 7,5. As rristuras de reac'2o de HRP individuais foram paradas pela adi'2o de 100 rricrolitros de 1% SDS e leitura da absorv°ncia a 405 nm com um espect rof ot/Bret ro. Os hibri domas produtores de anticorpos que i nteragi ram com o dorrt ni o extracelular de FTPH<f-6Hi s, e η2 o com a prote°na rrurA-6His foram usados para posterior andlise. Realizaram se dilui'Pes I irrites (0,8 cHI ul as por alvéolo) duas vezes para os cl ones positivos em placas de 96 alvéolos, com cl onal i dade definida corro sendo rrai s de 99% dos alvéolos com r eact i vi dade positiva. Os isotipos dos anticorpos foram deterrri nados usando a tecnologia Iso-strip (Roche). Para obter anticorpo purificado para subsequente avalia'2o, os sobrenadant es de cultura de tecidos foram puri fi cados por afinidade usando colunas de prote°na A ou de prote°na G.

Resultados: Cinco anticorpos rronoclonais i rruno-reactivos com a prote°na dorrf ni o extracelular de FTPHjf foram i sol ados e receberam as seguintes designa'Pes R15E6, R12A7, R3A2, R11C3, R15G2 e R5A8. 0 anticorpo rronocl onal R15E6 foi depositado na American Type Culture Collection (ATCC), P. O. Box 1549, IVhnassas, VA 20108 USA on 04 IVhy 2006.

Exenpl o 3. R15E6 liga-se a FTPH<f endAgena nas cHI ul as endoteliais humanas. A. R15E6 liga-se a FTPH<f endAgena conforme demonstrado por i minopr eci pi t a '2 o e t ransf er, nci as Vtèstern. IVbteriais: CHI ul as endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs), meio EGM e solu'2o neut r al i zant e de tripsina da Carrbrex; OPTIIVEM I (Gibco), albumina sllrica bovina (BSA; Santa Cruz), soro fisiol/lgico tarrponado com fosfatos ( PBS; Gibco), Factores de crescimento incluindo Angi opoi et i na 1 (Ang1), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e factor de crescimento de fibroblastos ( FGF) ( R&amp;D Systerrc), anticorpo rronocl onal contra Ti e2 (Duke Uni versi ty/P&amp;GP), anticorpo pol i cl onal contra o receptor de VEGF 2 (VEGFR2) (Wiitaker et. al), prote°na A/G agarose (Santa Cruz), sistema de el ect rof orese emgHis prH-formados de Tri s-Gl i ci na/t ransf er5 nci a ( 6-8°Λ) (I nvi t rogen), merrbranas de PVDF (I nvi t r ogen), tanp2o de I i se (20 rmnTris-HCI , 137 mm Na Cl , 10% gl i c e r ol , 1 % t r i t on-X-100, 2 rrM EDTA, 1 rrM NaOV, 1 rrM NaF, 1 rrM PIV5F, 1 i g/ rri leupeptina, 1 i g/ rri pepst at i na).

Mfltodo: HUVECs foram prH-1 rat adas durante 30 rri n com anticorpo (em OPTIIVEIV) ou OPTIIVEM I apenas. Ap/Is reno'2o do prU-1 rat ament o, as cHI ul as foram tratadas com Ang1 (100 ng/ rrl) durante 6 rrinutos em PBS + 0,2% BSA e I i sadas emtanp2o de I i se. Os I i sados cor reram di rect ament e num gel de Tris-Glicina ou foram i rrunopreci pi t ados com 2-5 i g/ rrl de anticorpo Tie-2 ou 10 i g/ rrl do anticorpo R15E6 e prote°na A/G agarose. As amostras i rrunopreci pi t adas foram lavadas Ix comtanp2o de I i se e fervidas durante 5 rri n em tanp2o de amostra 1 x. As amostras foram resol vi das numgel de Tris-Glicina, transferidas para uma merrbrana PVDF, e detectadas por t ransf ers nci a v\estern usando os anticorpos indicados ( pTYR Ab ( PY99, Santa Cruz), Tie-2, VEGFR2 e/ou R15E6) .

Resultados: Por I P/t ransf ers nci a v\estern, R15E6 reconhece uma banda principal de alto peso molecular consistente com o tamanho de FTPH<f (Figura 2, Painel A, Lane 2). As bandas menos intensas de peso molecular mai s baixo provavelmente representam formas de precursor de FTPH<ji menos gl i cosi I adas. Uma i rrunopreci pi t a'2 o (IP) com IgG η2 o i nune controlo η2 o mostra bandas na gama dos pesos moleculares de FTPH<f (Figura 2, Painel A, Pista 1) e um IP com Ti e2/VEGFR2 corrbi nado mostra bandas do peso molecular esperado (Figura 2, Painel A, Pista 3). Este resultado demonstra que R15E6 reconhece e H espec°fico de FTPF$.

B. R15E6 liga-se a FTPH<f end/lgeno corro demonstrado pela an(SJ i se FACS IVhteriais: FlUVECs, meios EGM medi a, e solu'2o de neutralizado da tripsina da Carrbrex; segundo anticorpo marcado com Alexfluor 488 da Molecular Probes; solu'2o salina equilibrada de Hank (Gibco); cit/frnetro de fluxo FACSCAN e o programa Cel I Quest da Becton Di ckenson. Método: HUVECs f oram t r i psi ni zadas, tratadas com solu'2o de neut r al i za'2 o da tripsina e lavadas com HBSS. O anticorpo R15E6 (0,6 i g) foi adicionado a 250000 cHI ul as em 50 i I de HBSS e incubado em gel o durante 20 rrinutos. As cHI ul as foram lavadas com 1 rri de HBSS, seguido da adi '2 o de 2 ig do segundo anticorpo conjugado com f I uor esc, nci a durante 20 ninutos em gelo. As cHI ul as foram lavadas e ressuspensas em 1 rri de HBSS, depois de analisadas no cit/frnetro de fluxo as cHI ul as f oram t rat adas apenas como segundo anticorpo conj ugado com f I uoresc5 nci a.

Resultados: AtravUs da an® i se FACS, nas HUVECs intactas, R15E6 causa um desvi o robusto ( >90% das células) no sinal de f I uoresc5 nci a conparat i varnent e com o segundo anticorpo apenas (Figura 2, Painel B). Este resultado indica que R15E6 se liga a FTPH$ end/lgena apresentada na superf°cie de células endoteliais intactas.

Exenpl o 4. R15E6 estirmla a activa'2o de Ti e2 e promove rrBItiplas respostas angi ogUni cas ( sobrevi vs nci a das c ill ul as endoteliais, rrigra'2o e morfogUnese capilar). A. R15E6 estirrula a fosforila'2o de Ti e2 na aus5 nci a e presen'a da angi opoi et i na 1 (Ang1), o ligando de Ti e2.

Mfltodos: HUVECs f oram cul t i vadas em mei o semsoro corro acirra descrito na presen'a ou aus5 nci a de v®rias concentrares de R15E6 e com ou sem Angl adicionado. Prepararamse I i sados, i rronopreci pi t aram se com um anticorpo contra Ti e2, foram separados por el ect rof orese em gel de pol i acri I arri da e transferidos para urra merrbrana PVDF. As prote°nas i rronopreci pi t adas ligadas a merrbranas foram ent2o sequenci al ment e sujeitas a t ransf ers nci a v\estern com um ant i cor po ant i f osf ot i rosi na para quantificar a fosforila'2o de Ti e2 seguido de um anticorpo contra Ti e2 para quantificar Ti e2 total. A fosforila'2o de Ti e2 H expressa corro a raz2o entre o sinal de ant i f osf ot i rosi na e o si nal de Ti e2 t ot al .

Resultados: R15E6 estirrola a fosforila'2o de Ti e2 na aus5 nci a e na presen'a de Angl (Figura 3). Este resultado indica que a I i ga'2 o de R15E6 a FTPH13 na superf°cie das cHI ul as endoteliais rrodul a a sua fun'2o biol/tgica, resultando na estirrola'2o da activa'2o de Ti e2 na aus5 nci a ou presen'a de ligando. B. R15E6 estirrola a sobrevi vs nci a das cHI ul as endoteliais na aus5 nci a e na presen'a de factores de cresci rrent o endot el i al . IVbteriais: HUVECs, meios EGM e solu'2o neut ral i zant e da tripsina da Carrbrex; DIVEM ( CeI I Gro), BSA des I i pi di zada ( BD Falcon), Ensaio Cel I Ti ter Gl o ATP Assay (Prorroga), Factores de Crescimento (Angl, VEGF 165 e FGF) ( R&amp;D Syst erre), leitor de placas Victor V MjI tila be I (Perkin EI mer V\6I I ac). Método: HUVECs foram semeadas a 10000 cHI ul as/al vHol o, j ej uaram em DIVEIWO, 2% BSA semsoro e foram tratadas 72h na presen'a ou aus5 nci a de factor de crescimento (Angl, VEGF ou FGF), com ou sem v®rias concentrares do anticorpo R15E6. Ap/B 72 horas, as cHI ul as foram lavadas com DIVEM e as células que sobrevi veram foram quantificadas através da medi'2o dos n°veis de ATP usando o ensaio Cel I Ti ter Gl o Lurri nescence Assay de acordo comas instru'Pes do fabricante (Promega).

Resultados: Consistente com os resultados do ensaio de activa'2o de Ti e2, R15E6 estimula a sobrevi v4 nci a de cHI ul as endoteliais na aus, nci a de factor de crescimento adicionado nas concent r a' Pes entre 0, 5 e 5 nM (Figura 4, Painel A). De forma semelhante, R15E6 estimula a sobrevi v, nci a das cHI ul as endoteliais mediada por Angl (Figura 4, Painel A) assim como a sobrevi \/i nci a celular mediada por VEGF e FGF (Figura 4, Pai nlli s B e C). N2 o se observa aumento da sobrevi v, nci a com um anticorpo rronocl onal controlo (Figura 4, Painel D). Estes resultados denronst r am que a liga'2o de R15E6 a FTPH$ na superf°cie das cHI ul as endoteliais aumenta a sobrevi v, nci a da linha de base das cHI ul as endoteliais assim corro a sobrevi v5 nci a mediada por mSItiplas vias angi og^lni cas (Angl, VEGF, e FGF) . C. R15E6 es t i rru I a a rrigra'2o das cHI ul as endoteliais na aus, nci a e na presen'a de VEGF. IVbteriais: HUVECs, meios EGM e solu'2o neut r al i zant e da tripsina da Canrbrex; EBM sem vermel ho de fenol (PRF-EBM Carrbrex), BSA desI i pi di zada ( BD Falcon), sistema BD Falcon Bi ocoat Endothelial Cel I Mgration (BD Falcon), Calce0 na AM (IVblecular Probes); Factores de Crescimento (VEGF 165) (R&amp;D Systens), leitor de placas

Victor V MjI tila be I (Perkin EI mer VNà I I a c).

Mfltodo: HUVECs foram suspensas em PRF- EBIVH-O, 1 % BSA e semeadas a 50000 cHI ul as/t ransal vHol o ( BD Bi osci ence, 3 im tarranho do poro). Factor de Cresci mento/R15E6 foi colocado no alvéolo do fundo da c°rrara de t ransal vHol os e incubado 4-22h. As cHI ul as que rri graram at ravUs da merrbrana foram det ect adas através de rrarca'2o com4ig/rr1 de calce°na AM durante 90'. A f I uoresc, nci a foi medida usando um instrumento Victor V (485/535).

Resultados: Consistente com os resultados no estudo de sobrevi v5 nci a, R15E6 es t i rru I a a rrigra'2o de cHI ul as endoteliais da linha de base e mediada por VEGF ( Fi gura 5). D. R15E6 es t i rru I a a forrra'2o de rebentos endoteliais e a rrorfogUnese endotelial na aus5 nci a ena presen'a de factores de crescimento endoteliais. IVhteriais: HUVECs e mei o EGM da Carrbrex; esferas Cytodex e col agUni o t i po I da Si gira; PBS de Dul becco e mei o Ml 99 da Gi bco; VEGF da R&amp;D. Método: HUVECs passagem 4 (2x106 cHI ul as) foram cultivadas com 5 rrg de esferas de Cytodex em 10 rri de EGM em placas bact er i ol /Igi cas, η2 o tratadas para cultura de tecidos, de 100 mm durante 48 horas comagita'2o ocasional. Esferas revestidas com cHI ul as f oram t ransferi das para um tubo c/Bii co de 50 rri e ressuspensas em 380 il de D-PBS. Qs gUi s de col agUni o foram preparados pela adi'2o de 71,4 il de esferas revestidas com cHI ul as a 2, 8 rri de urra solu'2o de matriz consistindo em 3 ng/nrl de col agUni o em mei ο MI99 suplementado com Na OH 0,005 N, HEPES 20 rrM e NaHCQ 26 rrM Trezentos e cinquenta rricrolitros das esferas foram distribu°dos por alvUolo numa placa de cultura de tecidos de 24 alvUolos e a matriz deixada a solidificar durante 1 hora a 37éC/5% CQ2. Um rri de meio EGM com ou sem VEGF (10 ng/rrl) ou R15E6 (7,5 i g/ rri) foi adicionado por alvéolo e colocada novamente na incubadora. Ap/B 48 horas, um observador alheio ao estudo visualizou os rebentos comum rricroscApio invertido de contraste de fase e observou 50 esferas por alvéolo, em triplicados de alvéolos, relativamente - presen'a de rebentos de cHI ul as endoteliais. Qs resultados foram expressos como 0 nBmero de rebentos por esfera.

Resultados: Consistente com os resultados dos outros ensaios, R15E6 tarrbUm estirrvila a rrorfogUnese de capi I ares na I i nha de base e medi ada por VEGF no ensai o de forrna'2o de rebentos endoteliais nas esferas (Figura 6).

Exenpl o 5. O epitopo de I i ga'2 o a R15E6 situa-se na repeti '2o FN3 N-terrrinal do dorrt ni o extracelular de FTPH<f humana. A. A anO i se de t ransf ers nci as Vtèstern dos rrutantes recorrbi nant es truncados no extremo C e das prote°nas quirrlUricas rrurganho/humano mostra que o epitopo de I i ga'2 o a R15E6 se situa na repeti '2o FN3 N-terrrinal do dorri1 ni o extracelular de FTPH<f.

Mfltodos: CHI ul as HEK293 foram t ransfect adas com vectores de express2o codificadores dos rrutantes de truncagem de FTPH<f ou da quimera rrurganho/humano. As cHI ul as t ransfect adas foram ent2o incubadas em OptilVEM durante mai s 24 horas, ap/ls o que meio condicionado contendo o dorri1 ni o extracelular de FTPH<ji indicado foi colhido e guardado para uso futuro ou usado imediatamente em estudos de t ransf ers nci a V\èstern ou ECL (ver abaixo). Para a an® i se de t ransf ers nci as, 20 ι I de meio condicionado contendo a prote°na FTPH<f indicada ou semprote°na recorrbi nant e ( s i rru I a '2 o, vector vazio t ransfect ado) foram separados por PAGE, transferidos para uma merrbrana PVDF e t est ados com R1 5E6.

Resultados: AtravHs da an® i se de t ransf ers nci as v\estern, R15E6 liga-se a todos os rrutantes de dele'2o C- terrrinal FTPH<f (Figura 7A) indicando que o epitopo de I i ga'2o est® nas duas pri mei ras repeti 'Pes FN3 N-terrrinais. R15E6 H incapaz de se ligar ao donfí ni o extracelular de FTPH<f rruri no (SEQ ID NG 7) demonstrando especificidade para a prote°na humana (Figura 7B pista 6 vs. pista 2). A substitui '2o da 1t ou 11 e 21 repeti 'Pes FN3 N-terrrinais rruri nas comas sequ, nci as humanas restaurou a I i ga'2 o de R15E6 (Figura 7B pistas 3 e 5). Pelo contrdtio, a substitui'2o de apenas a 21 repeti '2o FN3 rruri na com a sequ, nci a humana falha a restaura'2o da I i ga'2 o (Figura 7B pista 4). Considerados em conjunto, estes resultados localizamo epit opo de I i ga '2 o de R15E6 na r epet i ’2 o FN3 N-terrrinal (SOO arri no(Sti dos) de FTPHf humana. B. A an®ise ECL ( el ect roqui rri ol urri nescent e) dos rrutantes de t r uncagem t er rri nal e das prote°nas quirrlUricas rrurganho/humano confirma que o epitopo de I i ga'2 o a R15E6 est ® na repet i '2 o FN3 N-1 er rri nal do donf ni o ext racel ul ar de FTPHf

Mfltodos: Qs sobrenadant es contendo a prote°na FTPH$ indicada foram usados para revestir placas de 96 alvUolos Hi gh Bi nd IVED (IVfeso Seal e Discovery), deixadas a secar e bloqueadas com 3% BSA durante 1 h. A prote°na foi ent2o incubada como anticorpo rronocl onal R15E6 ou corro o fragmento Fab de R15E6 (10 nM ou 1,5 i g/rri) durante 1 h, lavada e incubada com um ant i cor po de cabra a nt i - rrurganho com uma marca IVSD-Tag (10 nIV) durante 1 h. O excesso de anticorpo foi removido por I avagem e o tarrp2o de leitura IVED foi adicionado. A eniss2o de luz foi medida usando o leitor Sector 2400 (IVED). IVED utiliza detec'2o de el ect roqui rri ol uni nesc5 nci a para detectar eventos de liga'2o em arranjos padronizados. A tecnologia exclusiva de IVfeso Seal e Di scovery usa rricroplacas MJLTI - ARRAYu e MJLTI - SPOTu com el Hct r odos integrados no fundo da placa. Os elUctrodos IVED feitos de carbono e reagentes biol/lgicos podem ser ligados ao carbono s i rrpl es rnent e por adsor'2o passiva e rnant5 m um n°vel elevado de actividade biol/lgica. Qs ensaios IVED usam marcas el ect roqui rri ol uni nescent es para detec'2o ul t ra-sens0 vel . Estas marcas el ect r oqui rri ol uni nes cent es erritem luz quando estirruladas el ect roqui rri carnent e. O processo de detec'2o H iniciado nos elUctrodos errbutidos situados no fundo das rricroplacas de IVED e apenas marcas perto do elUctrodo s2o excitadas e a I uz detectada a 620 nm

Resultados: Consistente com os estudos de t ransf ers nci as western, R15E6 liga-se a todas as prote°nas FTPHjí t r une a das no ext remo C através da an® i se IVE D (Figura 8A). TarrbUm consi st ent e coma an® i se western, R15E6 falha a I i ga'2 o ao donf ni o extracelular de FTPH<f rruri na mas a I i ga'2 o H restaurada pela substitui '2o da repeti '2o FN3 N-t e r rri na I rruri na como dorri1 ni o FN3 N-terninal humano (Figura 8B). Estes dados confirmam que o epitopo de I i ga'2 o a R15E6 est® na repeti '2o FN3 N-terrrinal de FTPH<f humana. Corro esperado, o epitopo de I i ga'2 o do fragmento Fab R15E6 nonovalente poder® t arrbUm ser mapeado na repeti '2o FN3 mai s N-terrrinal de FTPH<f humana (Figura 9).

Exenpl ο 6. Um fragmento Fab R15E6 Fab rmnovalente bloqueia a activa'2o de Ti e2 mediada por R15E6 e inibe a sobrevi vs nci a e nigra'2o das cHI ui as endoteliais.

Mfltodos: A activa'2o de Ti e2 e os ensaios de sobrevi vs nci a e rrigra'2o de clll ui as endoteliais foram realizados corro descrito acima no Exenpl o 4. Fragmentos Fab de R15E6 nonoval entes foram preparados corro ant er i or ment e descrito. R15E6 purificado foi di ai i sado emTris-HCI 0, 1 M pH 8,0, contendo EDTA 2 rrM e ditiotreitol 1 rrM Papa°na (Pierce) a 1-2 rrg/rrl foi activada no tarrp2o acima referido durante 15 rrinutos a 37éC. R15E6 a 10 rrg/rrl foi incubado com papa°na no mesrro tarrp2o usando uma propor'2o de enzi ma: subst rat o de 1:100, durante Ih a 37éC. A digest2o foi terrrinada pela adi'2o de i odoacet arri da ( concent r a'2 o final 20 rrf/) e mantida em gel o durante 1 h, protegida da luz. O material di geri do com papa0 na foi dialisado durante a noite contra soro fisiol/lgico tarrponado com fosfatos, para remover a i odoacet arri da. O grau de digest2o foi monitorizado por SDS-PAGE como desaparecimento da cadeia pesada gama ( MN 55000 kDa) e o aparecimento do fragmento Fc de gama ( MN 27000 kDa) e cadeias leves ( MN 22000- 25000 kDa).

Resultados: Ao contr®rio do anticorpo R15E6 intacto, os fragmentos Fab η2 o estirrulam a activa'2o de

Ti e2 (Figura 10). Ainda, na presen'a de excesso do fragmento Fab, a activa'2o de Ti e2 mediada por R15E6 H bloqueada (Figura 10). Surpreendentemente, o fragmento Fab de R15E6 inibe rrarcadament e a sobrevivida das cHI ul as endoteliais conparat i vament e com um controlo Fab (Figura 11 A) e este efeito pode ser contrariado pela adi'2o de R15E6 intacto (Figura 11B). Consistente com o efeito negativo na sobr evi v, nci a endotelial, o Fab de R15E6 tanrbUm bloqueia a rrigra'2o de cHI ul as endoteliais mediada por VEGF (Figura 12). Estes resultados demonstram que o R15E6 intacto di rrlflri co H necess(Sdo para o aumento da sinaliza'2o a ngi ogUni ca e que R15E6 monorrlllr i co bloqueia estas ac'Res e de facto tem um efeito negativo nas respostas angi ogUni cas das células endoteliais. LISTAGEM DE SEQUNNCIAS <110> Aerpio Therapeutics, Inc.

<120> ANTICORPOS QUE SE LIGAM u FOSFATASE TIROSINA DE

PROTEÍNAS HUMANA Beta (FTPHBeta) E SUAS UTILIZAnu ES <130> P103352E P52 <140> 11 155518.1 <141 > 2007-04-05 <150> US 60/790,506 <151 > 2006-04-07 <150> US 60/798,896 <151 > 2006-05-09 <160> 11 <170> Patentln version3.5 <210> 1 <211> 4623

<212> D NA <213> Homo sapiens <220> <221 > CDS <222> (1)..(4623) <400> 1 atg ctg age cat gga gee ggg ttg gee ttg tgg ate aea ctg age ctg 48

Met Leu Ser His Gly Ala Gly Leu Ala Leu Trp Ile Thr Leu Ser Leu 1 5 10 15 etg cag act gga ctg geg gag cca gag aga tgt aac ttc acc ctg gcg 96

Leu Gin Thr Gly Leu Ala Glu Pro Glu Arg Cys Asn Phe Thr Leu Ala 20 25 30 gag tcc aag gee tcc age cat tet gtg tet ate cag tgg aga att ttg 144

Glu Ser Lys Ala Ser Ser His Ser Vai Ser Ile Gin Trp Arg Ile Leu 35 40 45 ggc tea ccc tgt aaç ttt age etc ate tat age agt gac acc ctg ggg 192

Gly Ser Pro Cys Asn Phe Ser Leu Ile Tyr Ser Ser Asp Thr Leu Gly 50 55 60 gee gcg ttg tgc cct acc ttt cgg ata gac aac acc aca tac gga tgt 240

Ala Ala Leu Cys Pro Thr Phe Arg Ile Asp Asn Thr Thr Tyr Gly Cys 65 70 75 80 aac ctt caa gat tta caa gea gga acc ate tat aac ttc aag att att 288

Asn Leu Gin Asp Leu Gin Ala Gly Thr Ile Tyr Asn Phe Lys Ile Ile 85 90 95 tet ctg gat gaa gag aga act gtg gtc ttg caa aea gat cct tta cct 336

Ser Leu Asp Glu Glu Arg Thr Vai Vai Leu Gin Thr Asp Pro Leu Pro 100 105 110 cct gct agg ttt gga gtc agt aaa gag aag acg act tea acc ggc ttg 384

Pro Ala Arg Phe Gly Vai Ser Lys Glu Lys Thr Thr Ser Thr Gly Leu 115 120 125 cat gtt tgg tgg act cct tct tcc gga aaa gtc acc tca tat gag gtg 43:2

His Vai Trp Trp Thr Pro Ser Ser Gly lys Vai Thr Ser Xyr Glu Vai 130 135 140 caa tta ttt gat gaa aat aac caa aag ata cag ggg gtt caa att caa 480

Gin Leu Phé Asp Glu Asn Asn Gin Lys Ilè Gin Gly Vai Gin Ile Gin 145 150 155 160 gaa agt act tca tgg aat gaa tac act ttt ttc aat ctc act gct ggt 528

Glu Ser Thr Ser Trp Asn Glu Tyr Thr Phe Phe Asn Lèu Thr Ala Gly 165 170 175 agt aaa tac aat att gcc ate aca gct gtt tct gga gga aaa cgt tct 576

Ser Lys Tyr Asn Ile Ala Ile Thr Ala Vai Ser Gly Gly Lys Arg Ser 180 185 190 ttt tca gtt tat acc aat gga tca aça gtg cca tct cca gtg aaa gat 624

Phe Ser Vai Tyr Thr Asn Gly Ser Thr Vai Pro Ser Pro Vai Lys Asp 195 200 205 att ggt att tcc aca aaa gcc aat tct ctc ctg att tcc tgg tcc cat 672

Ile Gly Ile Ser Thr Lys Ala Asn Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser His 210 215 220 ggt tct ggg aat gtg gaa cga tac egg ctg atg cLa atg gat aaa ggg 720

Gly Ser Gly Asn Vai Glu Arg Tyr Arg Leu Met Leu Met Asp Lys Gly 225 230 235 240 ate cta gtt cat ggc ggt gtt gtg gac aaa cat gct act tcc tat gct 768

Ile Leu Vai His Gly Gly Vai Vai Asp Lys His Ala Thr Ser Tyr Ala 245 250 255 ttt cac ggg ctg aed cct ggc tac ctc tac aac ctc act gtt atg act 816

Phe His Gly Leu Thr Pro Gly Tyr Léu Tyr Asn Leu Thr Vai Met Thr 260 265 270 gag gct gea ggg ctg caa aac tac agg tgg aaa cta gtc agg aca gcc 864

Glu Ala Ala Gly Leu Gin Asn Tyr Arg Trp Lys Leu Vai Arg Thr Ala 275 280 285 ccc atg gaa gtc tca aat ctg aag gtg aca aat gat ggc agt ttg acc 912

Pro Met Glu Vai Ser Asn Leu Lys Vai Thr Asn Asp Gly Ser Leu Thr 290 295 300 tct cta aaa gtc aaa tgg caa aga cct cct gga aat gtg gat tct tac 960

Ser Leu Lys Vai Lys Trp Gin Arg Pro Pro Gly Asn Vàl Asp Ser Tyr 305 310 315 320 áat ate acc Ctg tct cac aaa ggg acc ate aag gaa tcc aga gta tta 1008

Asn Ile Thr Leu Ser His Lys Gly Thr Ile Lys Glu Ser Arg Vai Leu 325 330 335 gea cct tgg att act gaa act cac ttt aaa gag tta gtc ccc ggt cga 1056

Ala Pro Trp Ile Thr Glu Thr His Phe Lys Glu Leu Vai Pro Gly Arg 340 345 350 ctt tat cáâ gtt act gtc age tgt: gtc tct ggt gaa ctg tct gct cag 1104

Leu Tyr Gin Vai Thr Vai Ser Cys Vai Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gin 355 360 365 aag atg gea gtg ggc aga aca ttc ccc ctg gct gtc Ctc cag ctt cgt 1152

Lys Met Ala Vai Gly Arg Thr Phe Pro Leu Ala Vai Leu Gin Leu Arg 370 375 380 gtc aaa cat gcc aat gaa acc tca ctg agt ate atg tgg eag acc cct 1200

Val Lys His Ala Asn Glu Thr Ser Leu Ser Ile Met Trp Gin Thr Pro 385 390 395 400 gta gea gaa tgg gag aaa tac ate att tcc cta gct gac aga gac ctc 1248

Val Ala Glu Trp Glu Lys Tyr Ile Ile Ser Leu Ala Asp Arg Asp Leu 405 410 415 tta ctg ate cae aag tca ctc tcc aaa gat gcc aaa gaa ttc act ttt 1296

Leu Leu Ile His Lys Ser Leu Ser Lys Asp Ala Lys Glu Phe Thr Phe 420 425 430 act gac ctg gtg cct gga cga aaa tac atg gct aca gtc acc agt att 1344

Thr Asp Leu Val Pro Gly Arg Lys Tyr Met Ala Thr Val Thr Ser Ile 435 440 445 agt gga gac tta aaa aat tcc tet toa gta aaa gga aga aca gtg cct 1392

Ser Gly Asp Leu Lys Asn Ser Ser Ser Val Lys Gly Arg Thr Val Pro 450 455 460 gcc caa gtg act gac ttg cat gtg gcc aac caa gga atg acc agt agt 1440

Ala Gin Val Thr Asp Leu His Val Ala Asn Gin Gly Met Thr Ser Ser 465 470 475 480 ctg ttt act aac tgg acc cag gea caa gga gac gta gaa ttt tac caa 1488

Leu Phe Thr Asn Trp Thr Gin Ala Gin Gly Asp Val Glu Phe Tyr Gin 485 490 495 gtc tta ctg ate cat gaa aat gtg gtc att aaa aat gaa age ate tcc 1536

Val Leu Leu Ile His Glu Asn Val Val Ile Lys Asn Glu Ser Ile Ser 500 505 510 agt gag aee age aga tac age ttc cac tet ctc aag tcc ggc age ctg 1584

Ser Glu Thr Ser Arg Tyr Ser Phe His Ser Leu Lys Ser Gly Ser Leu 515 520 525 tac tcc gtg gtg gta aca aca gtg agt gga ggg ate tet tcc cga caa 1632

Tyr Ser Val Val Val Thr Thr Val Ser Gly Gly Ile Ser Ser Arg Gin 530 535 540 gtg gtt gtg gàg gga agâ aca gtc cct tcc agt gtg agt gga gta acg 1680

Val Val Val Glu Gly Arg Thr Val Pro Ser Ser Val Ser Gly Val Thr 545 550 555 560 gtg aac aat tcc ggt cgt aat gac tac ctc age gtt tcc tgg ctg ctg 1728

Val Asn Asn ser Gly Arg Asn Asp Tyr Leu Ser Val Ser Trp Leu Leu 565 570 575 gcg cce gga gat gtg gat aac tat gag gta aca ttg tet cat gac ggc 1776

Ala Pro Gly Asp Val Asp Asn Tyr Glu Val Thr Leu Ser His Asp Gly 580 585 590 aag gtg gtt cag tcc ctt gtc att gcc aag tet gtc aga gaa tgt tcc 1824

Lys Val Val Gin Ser Leu Val Ile Ala Lys Ser Val Arg Glu Cys Ser 595 600 605 ttc age tcc ctc acc cca ggc ege ctc tac acc gtg acc ata act aca 1872

Phe Ser Ser Leu Thr Pro Gly Arg Leu Tyr Thr Val Thr Ile Thr Thr 610 615 620 agg agt ggc aag tat gaa aat cac tcc ttc age caa gag cgg aca gtg 1920

Arg Ser Gly Lys Tyr Glu Asn His Sor Pho Ser Gin Glu Arg Thr Vai 625 630 635 640 cet gac aaa gte cag gga gtc agt gtt age aac tea gee agg agt gac 1968

Pro Asp Lys Vai Gin Gly Vai Ser Vai Ser Asn Ser Ala Arg Ser Asp 645 650 655 tat tta agg gta tcc tgg gtg cat gee act gga gac ttt gat cac tat 2016

Tyr Leu Arg Vai Ser Trp Vai His Ala Thr Gly Asp Phe Asp His Tyr 660 665 670 gaa gtc acc att aaa aac aaa aac aac ttc att caa act aaa age att 2064

Glu Vai Thr Ile Lys Asn Lys Asn Asn Phe Ile Gin Thr Lys Ser Ile 675 680 685 ccc aag tea gaa aac gaa tgt gta ttt gtt cag cta gtc cct gga cgg 2112

Pro Lys Ser Glu Asn Glu Cys Vai Phe Vai Gin Leu Vai Pro Gly Arg 690 695 700 ttg tac agt gtc act gtt act aca aaa agt gga caa tat gaa gee aat 2160

Leu Tyr Ser Vai Thr Vai Thr Thr Lys Ser Gly Gin Tyr Glu Ala Asn 705 710 715 720 gaa caa ggg aat ggg aga aca att cca gag cct gtt aag gat cta aca 2208

Glu Gin Gly Asn Gly Arg Thr Ile Pro Glu Pro Vai Lys Asp Leu Thr 725 730 735 ttg ege aac agg age act gag gac ttg cat gtg act tgg tea gga gct 2256

Leu Arg Asn Arg Ser Thr Glu Asp Leu His Vai Thr Trp Ser Gly Ála 740 745 750 aat ggg gát gtc gac caa tat gag ate cag ctg etc ttc aat gac atg 2304

Asn Gly Áep Vai Asp Gin Tyr Glu Ile Gin Leu Leu Phe Asn Asp Met 755 760 765 aaa gta ttt cct cct ttt cac ctt gta aat acc gea acc gag tat cga 2352

Lys Vai Phe Pro Pro Phe His Leu Vai Asn Thr Ala Thr Glu Tyr Arg 770 775 780 ttt act toe cta aca cca ggc ege caa tac aaa att ctt gtc ttg acg 2400

Phe Thr Ser Leu Thr Pro Gly Arg Gin Tyr Lys Ile ;Leu Vai Leu Thr 785 790 795 800 att age ggg gat gta cag cag tea gee ttc att gag ggc ttc aca gtt 2448

Ile Ser Gly Asp Vai Gin Gin Ser Ala phe Ile Glu Gly Phe Thr Vai 805 810 815 cct agt gct gtc aaa aat att cac att tet ccc aat gga gea aca gat 2496

Pro Ser Ala Vai Lys Asn Ile Ilis Ile Ser Pro Asn Gly Ala Thr Asp 820 825 830 age ctg acg gtg aac tgg act cct ggt ggg gga gac gtt gat tcc tac 2544

Ser Leu Thr Vai Asn Trp Thr Pro Gly Gly Gly Asp Vai Asp Ser Tyr 835 840 845 acg gtg teg gea ttc agg cac agt caa aag gtt gac tet cag act att 2592

Thr Vai Ser Ala Phe Arq His Ser Gin Lys Vai Asp Ser Gin Thr Ile 850 855 860 ccc aag cac gtc ttt gag cac acg ttc cac aga ctg gag gee ggg gag 2640

Pro Lys His Vai Phe Glu His Thr Phe His Arg Leu Glu Ala Gly Glu 865 870 875 880 eag tac cag ate atg att gcc tca gtc age ggg tcc ctg aag aat cag 2688

Gin Tyr Gin Ile Met Ile Ala Ser Vai Ser Gly Ser Leu Lys: Asn Gin 885 890 895 ata aat gtg gtt ggg cgg aca gtt cca gca tct gtc caa gga gta att 2736

Ile Asn Vai Vai Gly Arg Thr Vai Pro Ala Ser Vai Gin Gly Vai Ile 900 905 910 gca gac aat gca tac age agt tat tcc tta ata gta agt tgg caa aaa 2784

Ala Asp Asn Ala Tyr Ser Ser Tyr Ser Leu Ile Vai Ser Trp Gin Lys 915 920 925 gct gct ggt gtg gca gaa aga tat gat ate ctg att cta act gaa aat 2832

Ala Ala Gly Vai Ala Glu Arg Tyr Asp Ile Leu Leu Léu Thr Glu Asn 930 935 940 gga ate ctt ctg ege aac aca toa gag cca gcc acc act aag caa cac 2880

Gly Ile Leu Leu Arg Asn Thr Ser Glu Pro Ala Thr Thr Lys Gin His 945 950 955 960 aaa ttt gaa gat cta aca cca ggc aag aaa tac aag ata cag ate cta 2928

Lys Phe Glu Asp Leu Thr Pro Gly Lys Lys Tyr Lys Ile Gin Ile Leu 965 970 975 act gtc agt gga ggc ctc ttt age aag gaa gcc cag act gaa ggc cga 2976

Thr Vai Ser Gly Gly Leu Phe Ser Lys Glu Ala Gin Thr Glu Gly Arg 980 985 990 aca gtc cca gca gct gtc acc gac ctg agg ate aca gag aac tcc acc 3024

Thr Vai Pró Ala Ala Vai Thr Asp Leu Arg Ile Thr Glu Asn Ser Thr 995 1000 1005 agg cac ctg tcc ttc ege tgg acc gcc tca gag ggg gag ctc age 3069

Arg His Leu Ser Phe Arg Trp Thr Ala Ser Glu Gly Glu Leu Ser 1010 1015 1020 tgg tac aac ate ttt ttg tac aac cca gat ggg aat ctc cag gag 3114

Trp Tyr Asn Ile Phe Leu Tyr Asn Pro Asp Gly Asn Leu Gin Glu 1025 1030 1035 aga gct caa gtt gac cca cta gtc cag age ttc tct ttc cag aac 3159

Arg Ala Gin Vai Asp Pro Leu Vai Gin Ser Phe Ser Phe Gin Asn 1040 1045 1050 ttg cta caa ggc aga atg tac aag atg gtg att gta act cac agt 3204

Leu Leu Gin Gly Arg Met Tyr Lys Met Vai Ilê Vai Thr His Ser 1055 1060 1065 ggg gag ctg tct aat gag tct ttc ata ttt ggt aga aca gtc cca 3249

Gly Glu Leu Ser Asn Glu Ser Phe Ile Phe Gly Arg Thr Vai Pro 1070 1075 1080 gcc tct gtg agt cat ctc agg ggg tcc aat cgg aac acg aca gac 3294

Ala Ser Vai Ser His Leu Arg Gly Ser Asn Arg Asn Thr Thr Asp 1085 1090 1095 age ctt tgg ttc aac tgg agt cca gcc tct ggg gac ttt gac ttt 3339

Ser Leu Trp Phe Asn Trp Ser Pro Ala Ser Gly Asp Phe Asp phe 1100 1105 1110 tat gag dtg att ctc tat aat cpc aat ggc aca aag aag gaa aac 3384

Tyr Glu Leu Ile Leu Tyr Asn Pro Asn Gly Thr Lys Lys Glu Asn 1115 1120 1125

Lqq aaa gac aaq gac cLq acq gag tgg cgg Ltt caa gge cLL gtt 3429

Trp lys Asp Lys Asp leu Thr Glu Trp Arg Phe Gin Gly Leu Vai 1130 1135 1140 cct gga agg aag tac gtg ctg tgg gtg gta act cac agt gga gat 3474

Pro Gly Arg Lys Tyr Vai Leu Trp Vai Vai Thr His Ser Gly Asp 1145 1150 1155 etc age aat aaa gtc aea gcg gag age aga aca get cca agt cct 3519 Léu Ser Asn Lys vai Thr Ala Glu Ser Arg Thr Ala Pro ser Pro 1160 1165 1170 ccc agt ctt atg tea ttt get gac att gea aac aca tcc ttg gee 3564

Pro Ser Leu Mot Ser Phe Ala Asp Ile Ala Asn Thr Ser Leu Ala 1175 1180 1185 ate acg tgg aaa ggg ccc cca gac tgg aca gac tac aac gac ttt 3609

Ile Thr Trp Lys Gly Pro Pro Asp Trp Thr Asp Tyr Asn Asp Phe 1190 1195 1200 gag ctg cag tgg ttg ccc aga gat geà ctt act gtc ttc aac ccc 3654

Glu Leu Gin Trp Leu Pro Arg Asp Ala Leu Thr Vai Phe Asn Pro 1205 1210 1215 tac aac aac aga aaa tea gaa gga ege att gtg tat ggt ctt Cgt 3699

Tyr Asn Asn Arg Lys Ser Glu Gly Arg Ile Vai Tyr Gly Leu Arg 1220 1225 1230 cca ggg aga tcc tat caa ttc aac gtc aag act gtc agt ggt gat 3744

Pro Gly Arg Ser Tyr Gin Phe Asn Vai Lys Thr Vai Ser Gly Asp 1235 1240 1245 tcc tgg aaa act tac age aaa cca att ttt gga tet gtg agg aca 3789

Ser Trp Lys Thr Tyr Ser Lys Pró Ile Phe Gly Ser Vai Arg Thr 1250 1255 1260 aag cct gac aag ata caa aac ctg cat tgc cgg cct cag aac tcc 3834

Lys Pro Asp Lys ile Gin Asn Leu His Cys Arg Pro Gin Asn Ser 1265 1270 1275 acg gee att gee tgt tet tgg ate cct cct gat tet gac ttt gat 3879

Thr Ala Ile Ala Cys Ser Trp Ile Pro Pro Asp Ser Asp phe Asp 1280 1285 1290 ggt tat agt att gaa tgc cgg aaa atg gac acc caa gaa gtt gag 3924

Gly Tyr Ser Ile Glu Cys Atg Lys Met Ãsp Thr Gin Glu Vál Glu 1295 1300 1305 ttt tcc aga aag ctg gag aaa gaa aaa tet ctg ctc aac ate atg 3969

Phe Ser Arg Lys Leu Glu Lys Glu Lys Ser Leu Leu Asn Ile Met 1310 1315 1320 atg cta gtg ccc cat aag agg tac ctg gtg tcc ate aaa gtg cag 4014

Met Leu Vai Pro His Lys Arg Tyr Leu Vai Ser Ile Lys Vai Gin 1325 1330 1335 teg gee gge atg acc age gag gtg gtt gaa gac age act ate aca 4059

Ser Ala Gly Met Thr Ser Glu vai Vai Glu Asp Ser Thr Ile Thr 1340 1345 1350 atg ata gac ege ccc cct cct cca ccc cca cac att cgt gtg aat 4104

Met lie Asp Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ile Arg Vai Asn 1355 13:60 1365 gaa aág gat gtg cta att age aág tet tcc ate aac ttt act gtc 4149

Glu Lys Asp Vai Leu Ile Ser Lys Ser Ser lie Asn Phe Thr Vai 1370 1375 1380 aae fcgc age tgg tte age gac acc aat gga gct gtg aaa tac ttc 4194

Asn Cys Ser Trp Phe Ser ASp Thr Asn Gly Ala Vai Lys Tyr Phe 1385 1390 1395 aca gtg gtg gtg aga gag gct gat gge agt gat gag ctg aag cca 4239

Thr Vai Vai Vai Arg Glu Ala Asp Gly Ser Asp Glu Leu Lys Pro 1400 1405 1410 gaa cag cag cac cct etc cct tcc tac ctg gag tac agg cac aat 4284

Glu Gin Gin His Pro Leu Pro Ser Tyr Leu Glu Tyr Arg His Asn 1415 1420 1425 gee tcc att cgg gtg tat cag act aat tat ttt gee age aaa tgt 4329

Ala Ser Ile Arg Vai Tyr Gin Thr Asn Tyr Phe Ala Ser Lys Cys 1430 1435 1440 gee gaa aat cct aac age aac tcc aag agt ttt aac att aag ctt 4374

Ala Glu Asn Pro Asn Ser Asn Ser Lys Ser Phe Asn Ile Lys Leu 1445 1450 1455 gga gea gag atg gag age cta ggt gga aaa tgc gat ccc act cag 4419

Gly Ala Glu Met Glu Ser Leu Gly Gly Lys Cys Asp Pro Thr Gin 1460 1465 1470 caa aaa ttc tgt gat gga cca ctg aag cca cac act gee tac aga 4464

Gin Lys Phe Cys Asp Gly Pro Leu Lys Pro His Thr Ala Tyr Arg 1475 1480 1485 ate age att cga gct ttt aca cag etc ttt gat gag gac ctg aag 4509

Ile Ser Ile Arg Ala Phe Thr Gin Leu Phe Asp Glu Asp Leu Lys 1490 1495 1500 gaa ttc aca aag cca ctc tat tea gac aca ttt ttt tet tta ccc 4554

Glu Phe Thr Lys Pro Leu Tyr Ser Asp Thr Phe Phe Ser Leu Pro 1505 1510 1515 ate act act gaa tea gag ccc ttg ttt gga gct att gaa ege gge 4599

Ile Thr Thr Glu Ser Glu Pro Leu Phe Gly Ala Ile Glu Arg Gly 1520 1525 1530 ege cat cat cat cat cat cac gga 4623

Arg His His His His His His Gly 1535 1540 <210> 2 <211 > 1541

<212> PRT <213> Homo sapiens <400 2

Met Leu Ser His Gly Ala Gly Leu Ala Leu Trp ile Thr Leu Ser Leu 1 5 10 15 teu Gin Thr Gly Leu Ala Glu Pro Glu Arg Cys Asn Phe Thr Leu Ala 20 25 30

Glu Ser Lys Ala Ser Ser His Ser Vai Ser Ile Gin Trp Arg Ile Leu 35 40 45

Gly Ser Pro Cys Asn Phe Ser Leu Ile Tyr Ser Ser Asp Thr Leu Gly 50 55 60

Ala Ala Leu Cys Pro Thr Phe Arg ile Asp Asn thr Thr Tyr Gly Cys 65 70 75 80

Asn Leu Gin Asp Leu Gin Ala Gly Thr Ile Tyr Asn Phe Lys Ile Ile 85 90 95

Ser Leu Asp Glu Glu Arg Thr Vai Vai Leu Gin Thr Asp Pro Leu Pro 100 105 110

Pro Ala Arg Phe Gly Vai Ser Lys Glu Lys Thr Thr Ser Thr Gly Leu 115 120 125

His Vai trp Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Vai Thr Ser Tyr Glu Vai 130 135 140

Gin Leu Phe Asp Glu Asn ASn Gin Lys Ile Gin Gly vai Gin Ile Gin 145 150 155 160

Glu Ser: Thr Ser Trp: Asu Glu Tyr Thr Phe Phe Asn Leu Thr Ala Gly 165 170 175

Ser Lys Tyr Asn Ile Ala Ile Thr Ala Vai Ser Gly Gly Lys Arg Ser 180 185 190

Phe Ser Vai Tyr Thr Asn Gly Ser Thr Vai Pro Ser Pro Vai Lys Asp 195 200 205 li® Gly Ile Ser Thr Lys Ala Asn Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser His 210 215 220

Gly Ser Gly Asn Vai Glu Arg Tyr Arg Leu Met: Leu Met Asp Lys Gly 225 230 2:35 240 ile Leu Vai His Gly Gly Vai Vai Asp Lys His Ala Thr Ser Tyr Ala 245 250 255

Phe His Gly Leu Thr Pro Gly Tyr Leu Tyr Asn Leu Thr vai Met Thr 260 265 270

Glu Ala Ala Gly Leu Gin Asn Tyr Arg Trp Lys Leu Vai Arg Thr Ala 275 280 285

Pro Met Glu Vai Ser Asn Leu Lys Vai Thr Asn Asp Gly Ser Leu Thr 290 295 300

Ser Leu Lys Vai Lys Trp Gin Arg Pro Pro Gly Asn Vai Asp Ser Tyr 305 310 315 320

Asn Ile Thr Leu Ser His Lys Gly Thr He Lys Glu Ser Arg Vai Leu 325 330 335

Ala Pro Trp Ile Thr Glu Thr His Phe Lys Glu Leu Vai Pro Gly Arg 340 345 350

Leu Tyr Gin Vai Thr Vai Ser Cys Vai Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gin 355 360 365

Lys Met Ala Vai Gly Arg Thr Phe Pro Leu Ala Vai Leu Gin Leu Arg 370 375 380

Vai Lys His Ala Asn Glu Thr Ser Leu Ser Ile Met Trp Gin Thr Pro 385 390 395 400

Vai Ala Glu Trp Glu Lys Tyr Ile Ile Ser Leu Ala Asp Arg Asp Leu 405 410 415

Leu Leu Ile His Lys Ser Leu Ser Lys Asp Ala Lys Glu phe Thr Phe 420 425 430 thr Asp Leu Vai Pro Gly Arg Lys Tyr Met Ala Thr Vai thr Ser Ile 435 440 445

Ser Gly Asp Leu Lys Asn Ser Ser Ser Vai Lys Gly Arg thr Vai Pro 450 455 460

Ala Gin Vai Thr Asp Leu His Vai Ala Asn Gin Gly Met Thr Ser Ser 465 470 475 480

Leu Phe thr Asn Trp Thr Gin Ala Gin Gly Asp Vai Glu Phe Tyr Gin 485 490 495

Vai Leu Leu Ile His Glu Asn Vai Vai Ile Lys Asn Glu Ser Ile Ser 500 505 510

Ser Glu Thr Ser Arg Tyr Ser Phe His Ser Leu: Lys Ser Gly Ser Leu 515 520 525

Tyr Ser Vai Vai Vai Thr Thr Vai Ser Gly Gly Ile Ser Ser Arg Gin 530 535 540

Vai Vai Vai Glu Gly Arg Thr Vai Pro Ser Ser Vai Ser Gly Vai Thr 545 550 555 560

Vai Asn Asn Ser Gly Arg Asn Asp Tyr Leu Ser Vai Ser Trp Leu Leu 565 570 575

Ala Pro Gly Asp Vai Asp Asn Tyr Glu Vai Thr Leu Ser His Asp Gly 580 585 590

Lys Vai Vai Gin Ser Leu vai Ile Ala Lys Ser Vai Arg Glu Cys Ser 595 600 605

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Arg Ser Gly Lys Tyr Glu Asn His Ser Phe Ser Gin Glu Arg Thr Vai 625 630 635 640

Pro Asp Lys Vai Gin Gly Vai Ser vai Ser Asn Ser Ala Arg Ser Asp 645 650 655

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Pro Lys Ser Glu Asn Glu Cys Vai Phe Vai Gin Leu Vai Pro Gly Arg 690 695 700

Leu Tyr Ser Vai Thr Vai Thr Thr Lys Ser Gly Gin Tyr Glu Ala Asn 705 710 715 720

Glu Gin Gly Asn Gly Arg Thr Ile Pro Glu Pro Vai Lys Asp Leu Thr 725 730 735

Leu Arg Asn Arg Ser Thr Glu Asp Leu His Vai Thr Trp Ser Gly Ala 740 745 750

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Lys Vai Phe Pro Pro Phe His Leu Vai Asn Thr Ala Thr Glu Tyr Arg 770 775 780

Phe Thr Ser Léu Thr Pro Gly Arg Gin Tyr Lys Ile Léu Vai Leu Thr 785 790 795 800 ile Ser Gly Asp Vai Gin Gin Ser Ala Phe Ile Glu Gly Phe Thr Vai 805 810 815

Pro Ser Ala Vai Lys Asn Ile His Ile Ser Pro Asn Gly Ala Thr Asp 820 825 830

Ser Leu Thr Vai Asn Trp Thr Pro Gly Gly Gly Asp Vai Asp Ser Tyr 835 840 845

Thr Vai Ser Ala Phe Arg His Ser Gin Lys Vai Asp Ser Gin Thr Ile 850 855 860

Pro Lys His Vai Phe Glu His Thr Phe His Arg Leu Glu Ala Gly Glu 865 870 875 880

Gin Tyr Gin Ile Met Ile Ala Ser Vai Ser Gly Ser Leu Lys Asn Gin 885 890 895

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<212> PRT <213> Homo sapiens <400>3

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Glu Ser Lys Ala Ser Ser His Ser Vai Ser Ile Gin Trp Arg Ile Leu 35 40 45

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Pro Ala Gly Asp Trp Glu Gin Tyr Arg Ile Leu Leu Phe Asn Asp Ser 405 410 415

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Met Asp Asp Thr Gly Lou Vai Pro Gly Arg Gin Tyr Glu Vai Glu Vai 435 440 445

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Tyr Ile Ile Ser Leu Ala Asp Arg Asp Leu Leu Leu Ile His Lys Ser 500 505 510 Léu Ser Lys Asp Ala Lys Glu Phe Thr Phe Thr Asp Leu Vai Pró Gly 515 520 525

Arg Lys Tyr Met Ala Thr Vai Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu Lys Asn 530 535 540

Ser Ser Ser Vai Lys Gly Arg Thr Vai Pro Ala Gin Vai Thr Asp Leu 545 550 555 560

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Gin Ala Gin Gly Asp Vai Glu Phe Tyr Gin Vai Leu Leu Ile His Glu 580 585 590

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Leu Leu Gin Gly Arg Met Tyr Lys Met Vai Ile Vai Thr His Ser 1145 1150 1155

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Met Ile Asp Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ile Arg Vai Asn 1445 1450 1455

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Gly Ala Glu Met Glu Ser Leu Gly Gly Lys Arg ASp Prô Thr Gin 1550 1555 1560

Gin Lys Phe Cys Asp Gly Pro Leu Lys Pro His Thr Ala Tyr Arg 1565 1570 1575

Ile Ser Ile Arg Ala Phe Thr Gin Leu Phe Asp Glu Asp Leu Lys 1580 1585 1590

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<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

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Asn Leu Gin Asp Leu Gin Ala Gly Thr Ile Tyr Asn Phe Lys Ile Ile 85 30 35

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Pro Ala Arg Phe Gly Vai Ser Lys Glu Lys Thr Thr Ser Thr Gly Léu 115 120 125 hís Vai Trp Trp Thr pro ser Ser Gly Lys vai Thr Ser Tyr Glu vai 130 135 140

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Gly Ser Gly Asn Vai Glu Arg Tyr Arg Leu Met Leu Met Asp Lys Gly 225 230 235 240

Ile Leu Vai His Gly Gly Vai Vai Asp Lys His Ala Thr Ser Tyr Ala 245 250 255

Phe His Gly Léu Thr Pró Gly Tyr Leu Tyr Asn Leu Thr Vai Met Thr 260 265 270

Glu Ala: Ala Gly Leu Gin Asn Tyr Arg Trp Lys Leu Vai Arg Thr Ala 275 280 285

Pro Met Glu Vai Ser Asn Leu Lys Vai Thr Asn Asp Gly Ser Leu Thr 290 295 300

Ser leu Lys Vai Lys Trp Gin Arg Pro Pro Gly Asn Vai Asp Ser Tyr 305 310 315 320

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Leu Leu Ile His Lys Ser Leu Ser Lys Asp Ala Lys Glu Phe Thr Phe 420 425 430

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Ser Gly Asp Leu Lys Asn Ser Ser Ser Vai Lys Gly Arg Thr Vai Pro 450 455 460

Ala Gin Vai Thr Asp Leu His Vai Ala Asn Gin Gly Met Thr Ser Ser 465 470 475 480

Leu Phe Thr Asn Trp Thr Gin Ala Gin Gly Asp Vai Glu Phe Tyr Gin 485 490 495

Vai Leu Leu Ile His Glu Asn Vai Vai Ile Lys Asn Glu Ser Ile Ser 500 sós 510

Ser Glu Thr Ser Arg Tyr Ser Phe His Ser Leu Lys Ser Gly Ser Leu 515 520 525

Tyr Ser Vai Vai Vai Thr Thr Vai Ser Gly Gly Ile Ser Ser Arg Gin 530 535 540

Vai Vai Vai Glu Gly Arg Thr Vai Pro Ser Ser Vai Ser Gly Vai Thr 545 550 555 560

Vai Asn Asn Ser Gly Arg Asn Asp Tyr Leu Ser Vai Ser Trp Leu Leu 565 570 575

Ala Pro Gly Asp Vai Asp Asn Tyr Glu Vai Thr Leu Ser His ASp Gly 580 585 590

Lys Vai Vai Gin Ser Leu Vai Ile Ala Lys Ser Vai Arg Glu Cys Ser 595 600 605

Phe Ser Ser Leu Thr Pro Gly Arg Leu Tyr Thr Vai Thr Ile Thr Thr 610 615 620

Arg Ser Gly Lys Tyr Glu Asn His Ser Phe Ser Gin Glu Arg Thr Vai 625 630 635 640 pro Asp Lys Vai Gin Gly vai Ser Vai Ser Asn Ser Ala Arg Ser Asp 645 650 655 tyr Leu Arg Vai Ser Trp Vai His Ala Thr Gly Asp Phe Asp His Tyr 660 655 670

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Leu Tyr Ser Vai Thr Vai Thr Thr Lys Ser Gly Gin Tyr Glu Ala Asn 705 710 715 720

Glu Gin Gly Asn Gly Arg Thr Ile Pro Glu Lys Gly Asn Ser Ala Asp 725 730 735

Ile Gin His Ser Gly Gly Arg Ser Ser Leu Glu Gly Pro Arg Phe Glu 740 745 750

Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr 755 760 765

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<212> PRT <213> Homo sapiens <400 5

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Leu Gin Thr Gly Leu Ala Glu Pro Glu Arg Cys Asn Phe Thr Leu Ala 20 25 30

Glu Ser Lys Ala Ser Ser His Ser Vai Ser Ile Gin Trp Arg Ile Leu 35 40 45

Gly Ser Pro Cys Asn Phe Ser Leu Ile Tyr Ser Ser Asp Thr leu Gly 50 55 60

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Ser Leu Asp Glu Glu Arg Thr Vai Vai Leu Gin Thr Asp Pro Leu Pro 100 105 110

Pro Ala Arg Phe Gly Vai Ser Lys Glu Lys Thr Thr Ser Thr Gly Leu 115 120 125

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Glu Ser Thr Ser Trp Asn Glu Tyr Thr Phe Phe Asn Leu Thr Ala Gly 165 170 175

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Ile Gly Ile Ser Thr Lys Ala Asn Sér Leu Leu Ile Ser Trp Ser His 210 215 220

Gly Ser Gly Asn Vai Glu Arg Tyr Arg Leu Met Leu Met Asp LyS Gly 225 230 235 240

Ile Leu Vai His Gly Gly Vai Vai Asp Lys His Ala Thr Ser Tyr Ala 245 250 255

Phe His Gly Leu Thr Pro Gly Tyr Leu Tyr Asn Leu Thr Vai Met Thr 260 265 270

Glu Ala Ala Gly Leu Gin Asn Tyr Arg Trp Lys Leu Vai Arg Thr Ala 275 280 285

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Ser Leu Lys vai Lys Trp Gin Arg Pro Pro Gly Asn Vai Asp Ser Tyr 305 310 315 320

Asn Ile Thr Leu Ser His Lys Gly Thr Ile Lys Glu Ser Arg Vai Leu 325 330 335

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Leu Tyr Gin Vai Thr Vai Ser Cys Vai Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gin 355 360 365

Lys Met Ala Vai Gly Arg Thr Phe Lys Gly ASn Ser Ala ASp Ile Gin 370 375 380

His Ser Gly Gly Arg Ser Ser Leu Glu Gly Pro Arg Phe Glu Gly Lys 385 390 395 400

Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His 405 410 415

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Leu Gin Thr Gly Leu Alá Glu Pro Glu Arg Cys Ash Phe Thr Léu Alá 20 25 30

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Gly Ser Pro Cys Asn Phe Ser Leu Ile Tyr Ser Ser Asp Thr Léu Gly 50 55 60

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Gly Asn Ser Tyr Lys Vai Ala Ile Thr Ala Vai Ser Gly Glu Lys Arg 180 185 190

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1 5 10 IS

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His His His His His His 770 <210> 11 < 211> 89

< 212> PRT < 213> Homo sapiens <400> 11

Leu Ala Glu Pro Glu Arg Cys Asn Phe Thr Leu Ala Glu Ser Lys Ala 1 5 10 15

Ser Ser His Ser Vai Ser Ile Gin Trp Arg Ile Leu Gly Ser Pro Cys 20 25 30

Asn Phe Ser Leu Ile Tyr Ser Ser Asp Thr Leu Gly Ala Ala Leu Cys 35 40 45

Pro Thr Phe Arg Ile Asp Asn Thr Thr Tyr Gly Cys Asn Leu Gin Asp 50 55 60

Leu Gin Ala Gly Thr Ile Tyr Asn Phe Lys Ile Ile Ser Leu Asp Glu 65 70 75 80

Glu Arg Thr Vai Vai Leu Gin Thr Asp 85

Lisboa, 9 de outubro de 2017

Claims (8)

REI VI NDICApuES

1. Umanticorpo isolado que se liga ” fosfatase tirosina de prote°nas humana beta (FTPH<f), em que o anticorpo isolado H um anticorpo rronoclonal, em que o anticorpo rronocl onal compreende duas cadeias pesadas id5nticas e duas cadeias leves i díticas, em que o referido anticorpo isolado regula positivamente a angi ogUnese, em que o ant i cor po i sol a do se I i ga " pr i mei r a r epet i '2 o FN3 de FTPH<f, em que a pri mei ra repeti '2o FN3 de FTPH<f possui a sequ5 nci a rrost rada em SEQ I D NO. 11.

2. O anticorpo rronocl onal de acordo com a rei vi ndi ca'2 o 1, o anticorpo rronoclonal sendo produzido pela linha celular de hibridoma ATCC Nt PTA-7580.

3. O anticorpo isolado de acordo com a rei vi ndi ca'2 o 1, em que o anticorpo isolado H humanizado.

4. O anticorpo isolado de acordo com a rei vi ndi ca'2 o 1, que compreende regi Pes determinantes de complementaridade do anticorpo rronoclonal produzido pela linha celular de hibridoma ATCC NI PTA-7580 e H humanizado.

5. Umfragmento de I i ga '2 o ao antigUnio isolado de umanticorpo rronoclonal que se liga - fosfatase tirosina de prote°nas humana beta (FTPHf), em que o fragmento de I i ga'2 o ao antigUnio do anticorpo rronoclonal H umfragmento Fab, em que o referido fragmento de I i ga '2 o ao a nt i g^lni o regula negativamente a angi ogllnese, em que o fragmento de I i ga'2 o ao antig^lnio liga-se - primeira repeti '2o FN3 de FTPH<f, em que a primeira repeti '2o FN3 de FTPH<f possui a sequ, nci a most rada em SEQ I D NQ 11.

6. O fragmento de liga'2o ao antigllnio de acordo com a r ei vi ndi ca'2 o 5, o fragmento de I i ga '2 o ao antigUnio do anticorpo monocl onal sendo produzido pela linha celular de hibridoma ATCC NI PTA-7580.

7. O fragmento de liga'2o ao antigUnio de acordo coma r ei vi ndi ca'2 o 5, em que o fragmento de I i ga'2 o ao a nt i gilni o H humanizado.

8. O fragmento de I i ga'2 o ao antigUnio de acordo com a rei vi ndi ca'2 o 5, o fragmento de liga'2o ao antig^nio do anticorpo monocl onal conpreendendo regi Pes deterninantes de conpl ement ar i dade do anticorpo monocl onal produzido pela linha celular de hibridoma ATCC Nt PTA-7580 e sendo hurrani zado. Lisboa, 9 de outubro de 2017