PT2310509E - Moléculas de tnfsf em cadeia simples - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "Moléculas de TNFSF em cadela simples"

Descrição A presente invenção refere-se a proteínas de fusão em cadeia simples compreendendo três domínios de citocina da superfamília TNF (TNFSF) solúveis e moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas de fusão. As proteínas de fusão são substancialmente não agregáveis e são adequadas para aplicações terapêuticas, de diagnóstico e/ou de investigação

Estado da técnica

Sabe-se que a trimerização de citocinas TNFSF, e.g., o ligando de CD95 (CD95L), é necessária para ligação de receptor e activação eficientes. Contudo, os complexos triméricos das citocinas da superfamília TNF, são difíceis de preparar a partir de unidades monoméricas recombinantes. WO 01/49866 e WO 02/09055 divulgam proteínas de fusão recombinantes compreendendo uma citocina TNF e uma componente de multimerização, nomeadamente uma proteína da família de proteínas Clq ou uma colectina. Uma desvantagem destas proteínas de fusão é, contudo, que o domínio de trimerização tem habitualmente um elevado peso molecular e/ou que a trimerização é bastante ineficaz.

Schneider et al. (J Exp Med 187 (1989), 1205-1213) descrevem que trímeros de citocinas TNF são estabilizados pelos motivos de estabilização posicionados em N-terminal. Em CD95L, a estabilização do trímero de domínio de ligação de receptor é presumivelmente causada pelos domínios de aminoácidos N-terminais que se localizam perto da membrana citoplasmática.

Shiraishi et al. (Biochem Biophys Res Commun 322 (2004), 197-202) descrevem que o domínio de ligação de receptor de CD95L pode ser estabilizado pelos motivos artificiais de espiral enrolada em hélice (cremalheira de leucina) posicionados em N-terminal. Verificou-se, contudo, que há grande dificuldade em prever a orientação relativa das cadeias de polipéptido entre si, e.g. orientação paralela ou antiparalela. Além disso, é difícil determinar o número óptimo de repetições heptaméricas no motivo de cremalheira de espiral enrolada. Além disso, as estruturas em espiral enrolada têm tendência a formar agregados macromoleculares após alteração de pH e/ou força iónica. WO 01/25277 refere-se a polipéptidos oligoméricos em cadeia simples gue se ligam a um domínio de ligação de ligando extracelular de um receptor celular, em que o polipéptido compreende pelo menos três locais de ligação de receptor dos quais pelo menos um é capaz de se ligar a um domínio de ligação de ligando do receptor celular e pelo menos um deles é incapaz de se ligar eficazmente a um domínio de ligação de ligando de receptor celular, pelo que os polipéptidos oligoméricos em cadeia simples são capazes de se ligar ao receptor, mas são incapazes de activar o receptor. Por exemplo, os monómeros são derivados de ligandos de citocina da família TNF, nomeadamente de TNF- WO 2005/103077 divulga polipéptidos de fusão em cadeia simples compreendendo pelo menos três monómeros de um membro ligando de uma família TNF e pelo menos dois ligantes de péptido que ligam entre si monómeros dos membros da família de ligandos TNF. Contudo, experiências recentes demonstraram que estes polipéptidos de fusão em cadeia simples apresentam agregação não pretendida.

Foi um objecto da presente invenção proporcionar proteínas de fusão em cadeia simples compreendendo pelo menos três domínios de citocina TNF que permitem fabrico recombinante eficaz combinado com a boa estabilidade relativa a agregação.

Sumário da invenção A presente invenção refere-se a um polipéptido de fusão em cadeia simples compreendendo: (i) um primeiro domínio de citocina de família TNF solúvel, (ii) um primeiro ligante peptídico,

(iii) um segundo domínio de citocina de família TNF solúvel, (iv) um segundo ligante peptídico, e (v) um terceiro domínio de citocina de família TNF solúvel, que é substancialmente não agregável, em que o domínio de citocina de superfamília TNF solúvel é seleccionado de domínios TRAIL. A invenção refere-se adicionalmente a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão tal como aqui descrita e a uma célula ou a um organismo não humano transformado ou transfectado com uma molécula de ácido nucleico tal como aqui descrita. A invenção também se refere a uma composição farmacêutica ou de diagnóstico compreendendo como um agente activo uma proteína de fusão, uma molécula de ácido nucleico ou uma célula tal como aqui descrito. A invenção também se refere a uma proteína de fusão, uma molécula de ácido nucleico ou uma célula tal como aqui descrito, para uso em terapia, e.g., o uso de uma proteína de fusão, uma molécula de ácido nucleico ou uma célula tal como aqui descrito para a preparação de uma composição farmacêutica na profilaxia e/ou tratamento de doenças causadas, associadas e/ou acompanhadas por disfunção de citocinas TNFSF, particularmente doenças proliferativas, tal como tumores, e.g. tumores sólidos ou linfáticos; doenças infecciosas; doenças inflamatórias; doenças metabólicas; doenças auto-imunes, e.g. doenças reumatóides e/ou artríticas; doenças degenerativas, e.g. doenças neurodegenerativas tal como esclerose múltipla; doenças associadas a apoptose ou rejeições de transplante.

Descrição das figuras

Figura 1 Estrutura de domínio do polipéptido de fusão em cadeia simples da invenção, I., II., III. domínios de citocina da família TNF solúveis.

Figura 2 Figura esquemática representando a estrutura geral das proteínas TNF-SF. membrana celular, N-termina localizado no interior da célula, 1. Enrolamento antiparalelo do domínio de ligação de receptor (RBD), 2. interface de RBD e membrana celular, 3. Local de clivagem de protéase.

Figura 3 Figura esquemática representando a estrutura do trímero TNF-SF nativo. As estruturas cilíndricas representam RBD, os terminais N ligam RBD à membrana celular.

Figura 4 Figura esquemática representando a estrutura de três domínios solúveis compreendendo o domínio de ligação de receptor uma citocina TNF. I., II., III. domínios de citocina da família TNF solúveis.

Figura 5 Trimerização dos domínios solúveis compreendendo o RBD de uma citocina TNF, caracterizado por os terminais N e C dos três domínios solúveis formarem uma superfície.

Figura 6 Figura esquemática representando a estrutura do TNF-SF em cadeia simples compreendendo toda ou uma parte da região de haste ilustrando a necessidade de ligandos mais longos para compensar a distância ao terminal N do próximo domínio solúvel.

Figura 7 Proteína de fusão scFv-TNF-SF conhecida na especialidade.

Figura 8 Proteína de fusão Fc-TNF-SF conhecida na especialidade.

Figura 9 9A Polipéptido de fusão em cadeia simples

compreendendo um fragmento de anticorpo Fab adicional. 9B

Polipéptido de fusão em cadeia simples compreendendo um fragmento de anticorpo scFv adicional.

Figura 10 Dimerização de dois polipéptidos de fusão scFc unidos pelo N-terminal através de ligações dissulfureto

Figura 11 Dimerização de dois polipéptidos de fusão scFc unidos pelo C-terminal através de ligações dissulfureto

Figura 12 Dimerização de polipéptidos de fusão em cadeia simples através de um ligante.

Figura 13 Polipéptido de fusão em cadeia simples compreendendo um fragmento de anticorpo Fab adicional adicionalmente fundido com um segundo polipéptido de fusão ou a um polipéptido de fusão scFv.

Figura 14 Dimerização de dois polipéptidos de fusão scFab através de ligações dissulfureto.

Figura 15 Polipéptidos de fusão scFc fundidos por N-terminal compreendendo adicionalmente um fragmento de anticorpo Fv e/ou Fab.

Figura 16 Polipéptidos de fusão scFc fundidos por C-terminal compreendendo adicionalmente um fragmento de anticorpo Fv e/ou Fab.

Figura 17 Análise SEC de membros TNF-SF purificados e expressos de forma recombinante em condições nativas. Apresentam-se a titulo de exemplo duas análises SEC de membros TNF-SF purificados numa coluna Superdex200 em condição nativa (e.g.: PBS, pH 7,4) . 0 diagrama apresenta a absorção a 280nm (mAU) representada em função do volume de eluição (ml). A seta preta representa o pico de eluição da fracção contendo proteína TNF-SF trimérica, solúvel, definida. 0 triângulo indica o pico de eluição para a TNF-SF oligomerizada. A seta a branco indica o volume vazio da coluna SEC que contém agregados de proteína, que são demasiado grandes para serem separados (>800kDa).

Figura 17 A: Agregação de proteína TNF-SF 0 diagrama A apresenta um exemplo de análise de uma preparação de proteína TNF-SF que contém um elevada quantidade de proteína oligomerizada/agregada (indicada pela elevada quantidade de proteína que elui no volume vazio e pela elevada quantidade de proteína oligomérica).

Figura 17 B: proteína definida solúvel de proteína TNF-SF 0 diagrama B apresenta um exemplo de análise de uma preparação de proteína TNF-SF que contém quase exclusivamente proteína solúvel definida (indicada pela ausência de proteína que elui no volume vazio e pela quantidade muito limitada de proteína que elui como oligómero).

Figura 18 Análise SEC de Fab-scTRAILR2-SSSS expressa de forma recombinante e purificada por afinidade. Análise SEC de Fab-scTRAILR2-SSSS numa coluna Superdex200 usando PBS, pH 7,4. 0 diagrama apresenta a absorção a 280nm (mAU) representado em função do volume de eluição (ml). A proteína elui como um pico distinto com um volume de eluição de 14,56 ml, correspondente a um peso molecular aparente de 68 kDa. Não se puderam observar picos de proteína adicionais com menor volume de retenção, indicativos de proteína oligomerizada/agregada.

Figura 19 Análise SEC de Fab-scTRAILR2-SNSN expressa de forma recombinante e purificada por afinidade. Análise SEC de Fab-scTRAILR2-SNSN numa coluna Superdex200 usando PBS, pH 7,4. 0 diagrama mostra a absorção a 280nm (mAU) representada em função do volume de eluição (ml) . A proteína elui com um pico distinto com um volume de eluição de 14,12 ml, correspondente a um peso molecular aparente de 87 kDa. Não se puderam observar picos de proteína adicionais com menor volume de retenção, indicativos de proteína oligomerizada/agregada.

Figura 20 Análise SEC de Fab-scTRAILwt-SNSN expressa de forma recombinante e purificada por afinidade. Análise SEC de Fab-scTRAILwt-SNSN numa coluna Superdex200 usando PBS, pH 7,4. O diagrama mostra a absorção a 280nm (mAU) representada em função do volume de eluição (ml) . A proteína elui com um pico distinto com um volume de eluição de 13,99 ml, correspondente a um peso molecular aparente de 94 kDa. Pode observar-se um pequeno pico de proteína adicional a 12,00 ml. O peso molecular aparente deste pico corresponde a cerca de 270 kDa, indicando uma trimerização definida de Fab-scTRAILwt-SNSN. A quantidade de proteína total do pico a 12,00ml representa <3% da proteína total. Mais de 97% da Fab-scTRAILwt-SNSN analisada tem um estado solúvel definido (montagem correcta dos três módulos de ligação de receptor) . O pico a 16,12 ml correspondente a um peso molecular de 28 kDa contém polipéptido de cadeia leve de Fab e não se incluiu para análise das áreas dos picos.

Figura 21 Glicosilação de ligante scTRAIL humano

Figura 21 A Sequência de aminoácidos do(s) ligante(s) usados para combinar os módulos de ligação receptor das construções TRAIL em cadeia simples. Gly281 codifica o último aminoácido do respectivo módulo de ligação receptor, a sequência GSGN/SGN/SGS codifica a sequência ligante, Argl21 codifica o primeiro aminoácido do domínio de ligação de receptor TRAIL seguinte. A sequência de ligação concebida contém dois possíveis locais de glicosilação ligada a N na posição 1 ou 2 tal como indicado. Estas posições foram permutadas tal como indicado (versão I, II, III).

Figura 21 B Combinação de posições de ligante: as moléculas scTRAIL contêm três módulos homólogos (barris a cinzento) que estão ligados com o ligando 1 e ligando 2 tal como indicado. Cada um dos dois ligantes, pode conceber-se para glicosilação ligada a N tal como descrito em "A". Pode conceber-se um conjunto completo de 9 proteínas diferentes contendo todas as combinações possíveis de ligandos, com base nas sequências apresentadas em B para ligante 1 e 2. (Seis dessas proteínas foram expressas - consultar "C").

Figura 21 C Nomenclatura de construções scTRAIL expressas para testar a influência de diferentes sequências ligantes na glicosilação

Figura 22 Análise de hibridação "western" de construções scTRAIL recombinantes

Proteínas TRAIL em cadeia simples com diferentes sequências de ligante foram expressas de forma recombinante, separadas por SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de PVDF. Detectaram-se as proteínas ligadas com um anticorpo monoclonal de ratinho que reconhece o marcador Strep seguido por um anticorpo secundário anti-ratinho conjugado com peroxidase. Carregaram-se diferentes variantes TRAIL tal como indicado. Note-se a variação de peso molecular indicando glicosilação diferencial das variantes scTRAIL-ligante.

Figura 23 Recolheu-se sobrenadante de cultura de células de células HEK293, que expressam transitoriamente scCD95L (SEQ-ID NO:27) e usou-se para estimular células Jurkat a várias concentrações. Adicionou-se o sobrenadante quer directamente sem modificações adicionais, quer como anticorpo anti-marcador Strep (2 micrograma/ml) para reticular a proteína scCD95L. Incubaram-se células Jurkat com cultura de células HEK293 durante três horas a 37 °, lisou-se e analisou-se para actividade de caspase. Apenas o sobrenadante celular que continha scCD95L-St reticulado aumentou a actividade de caspase em células Jurkat, indicando que scCD95L sozinho não forma agregados de ordem mais elevada capazes de serem pró-apoptóticos.

Figura 24 A proteína scCD95L (SEQ ID NO:27) pode ser produzida por transfecção transitória de células HEK293, transfecção estável de outras células eucarióticas ou por expressão usando células procarióticas. A proteína recombinante pode ser purificada por afinidade usando matriz StrepTactin Sepharose. Podem eluir-se as proteínas ligadas com um tampão contendo destio-biotina. A figura 2 apresenta um SDS-PAGE corado com prata das fracções de eluição (pistas 1 a 5; a fracção 2 é positiva) da purificação por afinidade. A fracção de eluição contendo scCD95L pode ser aplicada a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Espera-se que a proteína apresente apenas um reduzido conteúdo em agregados.

Figura 25 Recolheu-se sobrenadante de cultura de células de células HEK293, que expressam transitoriamente proteínas TRAIL em cadeia simples com diferentes ligandos (derivados de SEQ ID 28) e usou-se para estimular células Jurkat a diferentes diluições (como exemplo, apresenta-se nesta figura uma diluição de 1:8). Adicionaram-se os sobrenadantes directamente sem modificações adicionais ou adicionou-se um anticorpo anti-marcador Strep (2 micrograma/ml de Strep MAB Immo) para reticular as proteínas scTRAIL. Incubaram-se células Jurkat com sobrenadante de cultura de células HEK293 durante três horas a 37 °, lisou-se e analisou-se para actividade de caspase. Apenas o sobrenadante celular que continha proteínas scTRAILwt reticuladas induziu um aumento de actividade de caspase em células Jurkat, indicando que as proteínas scTRAILwt sozinhas formam apenas uma pequena quantidade de agregados de ordem mais elevada capazes de serem pró-apoptóticos.

Figura 26 Influência da sucessão de módulos das componentes de construções scTRAIL na sua taxa de expressão de proteínas de fusão Fab-scTRAIL. Transferência "western" de sobrenadantes de cultura de células HEK293T a partir de experiências de expressão transitória. As cadeias de polipéptido necessárias para a formação das proteínas Fab-scTRAIL foram expressas separadamente (pistas 1 a 10) ou alternativamente efectuaram-se experiências de co-expressão (pistas 11-13). Após SDS-PAGE redutor, transferiram-se proteínas para uma membrana de nitrocelulose e detectaram-se proteínas contendo um marcador Strep, usando um mAb específico anti-marcador Strep como anticorpo primário. As proteínas de cadeia leve de scTRAIL(específica de R2) foram excretadas mesmo na ausência de uma cadeia pesada acessória (pistas 1-4) . Contrariamente, as proteínas de fusão de cadeia pesada de scTRAIL(específica de R2) não foram excretadas na ausência de uma cadeia leve acessória (pistas 5-8). Tal como exemplificado na pista 13, as proteínas de fusão de cadeia pesada de scTRAIL(específica de R2) foram apenas excretadas na presença da cadeia leve.

Figura 27 Recolheram-se sobrenadantes de cultura de células HEK293T, que expressam transitoriamente proteínas de fusão scTRAILwt-Fc com diferentes ligandos e usaram-se para estimular células Jurkat a diferentes diluições. Adicionaram-se os sobrenadantes directamente sem modificações adicionais (Figura XX-A). Incubaram-se células Jurkat com sobrenadante de cultura de células HEK293T durante três horas a 37 °, lisaram-se e analisaram-se para actividade de caspase. Já havia uma capacidade pró-apoptótica pronunciada presente nos sobrenadantes contendo scTRAILwt-Fc, indicando que as proteínas de fusão scTRAILwt-Fc sozinhas formam conjuntos diméricos capazes de serem pró-apoptóticos.

Figura 28 É bem conhecido que o uso de ligando da superfamília TNF reticulado artificialmente ou de ligando ligado à membrana tem uma bioactividade superior comparativamente a ligando homotrimérico, solúvel. Assim, o enriquecimento local em construções TRAIL em cadeia simples (scTRAIL) em células que expressam o antigénio Her2 através do fragmento de Fab selectivo para Her2 ("Pertuzumab") fundido a estas proteínas scTRAIL deve aumentar a sua bioactividade citotóxica. De igual modo, o bloqueamento dos locais de ligação Her2 em células pela sua pré-incubação com o fragmento de Fab específico para Her2 (Pertuzumab-Fab) deve apenas aumentar a bioactividade citotóxica em proteínas de fusão Fab-scTRAIL. Tal como apresentado na figura 28A, as construções scTRAIL induzem a morte de células HT1080, dado que a viabilidade decresce com o aumento da concentração de proteína. Consequentemente, a pré-incubação de células HT1080 com o fragmento Fab (Pertuzumab-Fab) , seguido de co-incubação com as construções Fab-scTRAIL (Fab-scTRAILR2-SNSN ou Fab-scTRAILwt-SNSN) durante a noite, reduziu a actividade citotóxica das construções Fab-scTRAIL (figura 28B), ao passo que Fab sozinho não induziu qualquer morte celular (Pertuzumab-Fab). Isto significa que as construções Fab-scTRAIL se ligam a células HT1080 através do fragmento Fab, aumentando assim a bioactividade citotóxica sCTRAIL *

Descrição detalhada da invenção

De acordo com a presente invenção, proporciona-se um polipéptido de fusão substancialmente não agregável compreendendo pelo menos três domínios de família TNF solúveis ligados por dois ligandos peptídicos. A expressão "não agregável" refere-se a um conteúdo em monómero da preparação de > 50%, de preferência > 70% e com maior preferência > 90%. A razão entre o conteúdo em monómero e o conteúdo em agregado pode ser determinado analisando-se a quantidade de formação de agregado usando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Pode determinar-se a estabilidade relativamente a agregação por SEC após períodos de tempo definidos, e.g. desde alguns dias a vários dias, a semanas e meses em diferentes condições de armazenamento, e.g. a 4 °C ou 25 °C. Para a proteína de fusão, de modo a poder ser classificada como substancialmente não agregável, prefere-se que o conteúdo em monómero seja como definido anteriormente após um período de tempo de vários dias, e.g. 10 dias, com maior preferência após várias semanas, e.g. 2, 3 ou 4 semanas e com a maior preferência após vários meses, e.g. 2 ou 3 meses de armazenamento a 4 °C ou 25 °C.

Dado que um aumento de e.g. o potencial de indução de apoptose no caso de scCD95L em células Jurkat humanas se correlaciona com o seu estado de agregação, a estabilidade do polipéptido de fusão relativamente a agregação pode também ser determinado por análise da actividade biológica do polipéptido de fusão. O polipéptido de fusão em cadeia simples pode compreender domínios adicionais que se podem localizar nos seus terminais N e/ou C. Os exemplos de domínios de fusão adicionais são e.g. anticorpos em cadeia simples ou fragmentos de anticorpos em cadeia simples ou outras moléculas de direcção ao alvo ou um domínio de citocina adicional, e.g. uma interleucina. 0 polipéptido de fusão em cadeia simples pode compreender domínios adicionais que se podem localizar nos seus terminais N e/ou C. Os exemplos de domínios de fusão adicionais são e.g. anticorpos em cadeia simples ou fragmentos de anticorpos em cadeia simples ou outras moléculas de direcção ao alvo ou um domínio de citocina adicional, e.g. uma interleucina. A proteína de fusão em cadeia simples compreende três domínios solúveis derivados de uma citocina da superfamília TNF. Preferentemente, esses domínios solúveis são derivados de uma citocina de mamífero, nomeadamente de uma citocina humana, incluindo as suas variantes alélicas e/ou derivados. Os domínios solúveis compreendem a parte extracelular de uma citocina TNFSF incluindo o domínio de ligação de receptor sem domínios localizados na membrana. As proteínas da superfamília TNF estão ancoradas à membrana através de uma parte N-terminal de 15-30 aminoácidos, a denominada região de haste. A região de haste contribui para a trimerização e proporciona uma certa distância relativamente à membrana celular. Contudo, a região de haste não faz parte do domínio de ligação de receptor (RBD). É importante o RDB ser caracterizado por uma localização específica dos seus aminoácidos N e C terminais. Os referidos aminoácidos estão exactamente adjacentes e localizam-se numa posição central relativamente ao eixo do trímero. Os primeiros aminoácidos N-terminais do RBD formam uma folha beta antiparalela com os aminoácidos C-terminais da RBD (figuras 2 e 3) .

Assim, a folha beta antiparalela da RBD forma uma interface com a membrana celular, que está ligada e ancorada no interior da membrana celular através dos aminoácidos da região de haste. É muito preferido que os domínios solúveis da proteína de fusão em cadeia simples compreendam um domínio de ligação de receptor da citocina TNF-SF isento de quaisquer aminoácidos da região de haste (figuras 4 e 5) . De outro modo, seria necessário um ligante mais longo a ligar o C-terminal de um dos domínios solúveis ao N-terminal do próximo domínio solúvel para compensar a região de haste N-terminal do próximo domínio solúvel (Figura 6), o que poderia resultar em instabilidade e/ou formação de agregados.

Uma vantagem adicional de tais domínios solúveis é que os aminoácidos N-terminais e C-terminais da RBD não estão acessíveis a nenhuns anticorpos anti-fármaco.

Preferentemente, o polipéptido de fusão em cadeia simples é capaz de formar uma estrutura trimérica ordenada compreendendo pelo menos um local de ligação funcional para o respectivo receptor de citocina. 0 polipéptido de fusão pode compreender um, dois ou três locais de ligação de receptor de citocina adicionais, i.e. sequências de aminoácido capazes de formar um complexo com um receptor de citocina. Assim, pelo menos um dos domínios solúveis é capaz de se ligar ao receptor de citocina correspondente. Numa concretização, pelo menos um dos domínios solúveis é capaz de activação do receptor, para que possa ocorrer actividade apoptótica e/ou proliferativa. Numa concretização adicional, seleccionam-se um ou mais dos domínios solúveis como não sendo capazes de activação do receptor.

Descreve-se que o domínio solúvel pode ser derivado de membros da superfamília TNF, e.g. TNFSF-1 a TNFSF-18 humanos e EDA-A1 a EDA-A2 tal como indicado na tabela 1, de preferência de LTA (SEQ ID NO: 1) , TNF (SEQ ID NO: 2) , LTB (SEQ ID N0:3), 0X4OL (SEQ ID NO:4), CD40L (SEQ ID N0:5), CD27L (SEQ ID N0:7), CD30L (SEQ ID NO: 8), CD137L (SEQ ID NO: 9), RAN KL (SEQ. ID NO:11), TWEAK (SEQ ID N0:12), APRIL 1 (SEQ ID N0:13), APRIL 2 (SEQ ID NO:14), BAFF (SEQ ID N0:15), LIGHT (SEQ ID N0:16), TL1A (SEQ ID NO:17), GITRL (SEQ ID N0:18), EDA-A1 (SEQ ID N0:19) e EDA-A2 (SEQ ID NO:20). Indicam-se na tabela 1 os domínios solúveis preferidos das respectivas proteínas (NH2-aa a C00H-aa) e e.g., compreendem os aminoácidos 59-205, 60-205 ou 64-205 de LTA (SEQ ID NO:1), 86-233 de TNF[alfa] (SEQ ID NO:2), 82-244 ou 86-244 de LTB (SEQ ID NO:3), 52-183 ou 55-183 de OX40L (SEQ ID NO:4), 112-261, 117-261 ou 121-261 de CD40L (SEQ ID NO:5), 51-193 ou 56-193 de CD27L (SEQ ID NO:7), 97-234, 98-234 ou 102-234 de CD30L (SEQ ID NO:8), 86-254 de CD137L (SEQ ID NO:9), 161 -317 de RANKL (SEQ ID NO:ll), 103-249, 104-249, 105-249 ou 106-249 de TWEAK (SEQ ID NO:12), 112-247 de APRIL 1 (SEQ ID NO:13), 112-250 de APRIL 2 (SEQ ID NO:14), 140-285 de BAFF (SEQ ID NO:15), 91-251, 93-251 ou 97-251 de TL1A (SEQ ID NO:17), 52-177 de GITRL (SEQ ID N0:18), 245-391 de EDA-A1 (SEQ ID N0:19), 245-38 9 de EDA-A2 (SEQ ID NO:20) . O domínio solúvel pode ser e.g. derivado de LIGHT. Numa concretização especialmente preferida, o domínio solúvel é seleccionado de TRAIL humano, nomeadamente com início nos aminoácidos 120-122 e compreende especificamente os aminoácidos 120-281, 121-281 ou 122-281 de SEQ ID NO:10. Opcionalmente, o aminoácido Lysl45 de SEQ ID NO: 6 pode ser substituído por um aminoácido não carregado, e.g. Ser ou Gly. Opcionalmente, o aminoácido Argl21 de SEQ ID NO:10 pode ser substituído por um aminoácido não carregado, e.g. Ser ou Gly. Além disso descrevem-se os domínios solúveis a seleccionar de LIGHT humana, nomeadamente com início nos aminoácidos 93, 94 ou 95 de SEQ ID NO:16 compreende especificamente os aminoácidos 93-240, 94-240 ou 95-240 de SEQ ID NO:16.

Tal como indicado anteriormente, os domínios solúveis podem compreender as sequências de tipo selvagem tal como indicadas em SEQ ID NO: 1-20. Refira-se, contudo, que é possível introduzir mutações em um ou mais desses domínios solúveis, e.g. mutações que alteram (e.g. aumentam ou diminuem) as propriedades de ligação dos domínios solúveis. Numa concretização, podem seleccionar-se domínios solúveis que não se podem ligar ao receptor de citocina correspondente. Um exemplo de tal mutação é uma substituição do aminoácido Y218 em CD95L humano (SEQ ID NO:6) por outro aminoácido, e.g. R, K, S ou D. Além disso, pode introduzir-se uma mutação que altere a ligação de outras componentes celulares e/ou extracelulares, e.g. a matriz extracelular. Um exemplo de tal mutação é a substituição do aminoácido K177 em CD95L (SEQ ID NO: 6) por outro aminoácido, e.g. E, D ou S.

Numa concretização adicional preferida da invenção, o domínio solúvel de citocina (i) compreende um mutante da citocina da superfamília TNF ou um seu domínio de ligação de receptor que liga e/ou activa o receptor 1 de TRAIL (TRAILR1) e/ou o receptor 2 de TRAIL (TRAILR2). A ligação e/ou actividade do mutante pode ser, e.g., determinada pelos ensaios tal como descrito em van der Sloot et al. (PNAS, 2006, 103:8634-8639), Kelley et al. (J. Biol. Chem., 2005, 280:2205-2215) ou MacFarlane et al. (Cancer Res., 2005, 65:11265-11270). 0 mutante pode ser gerado por qualquer técnica e é conhecido do perito na especialidade, e.g., as técnicas descritas em van der Sloot et al. (PNAS, 2006, 103:8634-8639), Kelley et ai. (J. Biol. Chem., 2005, 280:2205-2215) ou MacFarlane et al. (Cancer Res., 2005, 65: 11265-11270) e pode compreender qualquer tipo de mutações estruturais, e.g., substituição, deleção, duplicação e/ou inserção de um aminoácido. Uma concretização preferida é a geração de substituições. A substituição pode afectar pelo menos um aminoácido da citocina da superfamília TNF ou um seu domínio de ligação de receptor tal como aqui descrito. Numa concretização preferida, a substituição pode afectar pelo menos um dos aminoácidos de TRAIL, e.g., TRAIL humano (e.g., SEQ ID NO: 10). As substituições preferidas neste aspecto afectam pelo menos um dos seguintes aminoácidos de TRAIL humano de SEQ ID NO:10: R130, G160, Y189, R191, Q193, E195, Ni 9 9, K201, Y213, T214, S215, H264, 1266, D267, D269. As substituições de aminoácidos preferidas de TRAIL humano de SEQ ID NO:10 são pelo menos uma das seguintes substituições: R130E, G160M, Y189A, Y189Q, R191K, Q193S, Q193R, E195R, N199V, N199R, K201R, Y213W, T214R, S215D, H264R, I266L, D267Q, D269H, D269R ou D269K.

As substituições de aminoácidos podem afectar a ligação e/ou actividade de TRAIL, e.g., TRAIL humano ao TRAILR1 ou TRAILR2 ou em qualquer destes. Alternativamente, as substituições de aminoácidos podem afectar a ligação e/ou actividade de TRAIL, e.g., TRAIL humano ao TRAILR1 ou TRAILR2 ou em qualquer destes. A ligação e/ou actividade de TRAILR1 e/ou TRAILR2 podem ser afectadas positivamente, i.e., ligação mais forte, mais selectiva ou mais específica e/ou mais activação do receptor. Alternativamente, a ligação e/ou actividade de TRAILR1 e/ou TRAILR2 podem ser afectadas negativamente, i.e., ligação mais fraca, menos selectiva ou ligação menos específica e/ou menor activação ou ausência de activação do receptor.

Podem encontrar-se exemplos de mutantes de TRAIL com substituições de aminoácidos da invenção que afectam a ligação e/ou activação tanto de TRAILR1 como de TRAILR2, e.g., na tabela 1 de MacFarlane et al. (tal como anteriormente) e podem compreender um mutante de TRAIL humano com as seguintes duas substituições de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 Y213W e S215D ou com a seguinte substituição de aminoácido: Y189A.

Podem encontrar-se exemplos de mutantes de TRAIL com substituições de aminoácidos da invenção que afectam a ligação e/ou activação de TRAILR1, e.g., na tabela 1 de MacFarlane et al. (tal como anteriormente) e podem compreender um mutante de TRAIL humano com as seguintes quatro substituições de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 N199V, K201 R, Y213W e S215D ou com as seguintes cinco substituições de aminoácidos: Q193S, N199V, K201 R, Y213W e S215D ou podem encontrar-se na tabela 2 de Kelley et al. (tal como anteriormente) e pode compreender um mutante de TRAIL humano com as seguintes seis substituições de aminoácidos: Y213W, S215D, Y189A, Q193S, N199V, e K201R, ou com Y213W, S215D, Y189A, Q193S, N199R e K201R.

Podem encontrar-se exemplos de mutantes de TRAIL com substituições de aminoácidos da invenção que afectam a ligação e/ou activação de TRAILR2, e.g., na tabela 1 de MacFarlane et al. (tal como anteriormente) ou na tabela 2 de Kelley et al. (tal como anteriormente) e podem compreender um mutante de TRAIL humano com as seguintes seis substituições de aminoácidos de SEQ ID NO:10: Y189Q, R191K, Q193R, H264R, I266L e D267Q ou podem encontrar-se na tabela 2 de van der Sloot et al. (tal como anteriormente) e pode compreender um mutante de TRAIL humano com a seguinte substituição de aminoácido único: D269H ou com as seguintes duas substituições de aminoácidos: D269H e E195R ou D269H e T214R.

Assim uma concretização preferida é uma proteína de fusão tal como aqui descrita em que pelo menos um dos domínios solúveis compreende um mutante de TRAIL ou de um seu domínio de ligação de receptor que liga e/ou activa TRAILR1 e/ou TRAILR2.

Exemplos adicionais de mutantes de TRAIL, que apresentam redução na agregação de receptor induzida por TRAIL são Hl68 (S, T, Q), R170 (E, S, T, Q) e H177 (S, T) .

Uma concretização preferida de uma proteína de fusão compreendendo um mutante de TRAIL ou de um domínio de ligação de receptor tal como aqui descrito é uma proteína de fusão em que a componente (i) compreende pelo menos uma substituição de aminoácido, particularmente tal como indicado seguidamente.

Tal substituição de aminoácido afecta pelo menos uma das seguintes posições de aminoácidos de TRAIL humano (SEQ ID NO: 10) : R130, G160, H168, R170, H177, Y189, R191, Q193, E195, N199, K201, Y213, T214, S215, H264, 1266, D267, D269.

Tal substituição de aminoácido é pelo menos um dos seguintes: R130E, G160M, H168 (S, T, Q) , R170 (E, S, T, Q) , Hl7 7 (S,T), Y189A, Y189Q, R191K, Q193S, Q193R, E195R, N199V, N199R, K201R, Y213W, T214R, S215D, H264R, I266L, D267Q, D269H, D269R ou D269K.

Um domínio selectivo TRAIL-R2 preferido compreende substituições de aminoácidos Y189Q, R191K, Q193R, H264R, I266L e D267Q.

Um domínio selectivo TRAIL-R1 preferido compreende substituições de aminoácidos Y189A, Q193S, N199V, K201R, Y213W e S215D. A molécula de fusão em cadeia simples da presente invenção compreende adicionalmente três domínios solúveis de citocinas, nomeadamente as componentes (i) , (iii) e (v) . De acordo com a presente invenção, revelou-se surpreendente o aumento de estabilidade contra agregação do polipéptido de fusão de citocina de família TNF em cadeia simples, se o segundo e/ou o terceiro domínio de citocina solúvel é um domínio encurtado no terminal N que compreende opcionalmente mutações da sequências de aminoácidos. Assim, de preferência, tanto o segundo como o terceiro domínios de citocina solúveis de família TNF têm domínios encurtados no terminal N que compreendem mutações da sequência de aminoácido opcionalmente nas regiões N-terminais, de preferência entre os primeiros cinco aminoácidos do N-terminal do domínio solúvel de citocina. Estas mutações podem compreender substituição de aminoácidos carregados, e.g. aminoácidos acídicos ou básicos, aminoácidos neutros, nomeadamente serina ou glicina.

Contrariamente, a selecção do primeiro domínio de citocina solúvel de família TNF não é tão crítico. Aqui, pode usar-se um domínio solúvel apresentando uma sequência N-terminal completa. Deve contudo notar-se, que igualmente o primeiro domínio solúvel de citocina pode ter uma sequência encurtada no terminal N e opcionalmente mutada.

Também se descreve que os domínios de citocina solúveis de família TNF (i), (iii) e (v) são domínios CD95L solúveis, nomeadamente domínios CD95L humanos solúveis. 0 primeiro domínio CD95L solúvel (i) pode ser seleccionado de sequências nativas, encurtadas e/ou mutadas. A sequência N-terminal do primeiro domínio (i) pode e.g. iniciar-se entre os aminoácidos Glul42 e Vall46 de CD95L humano, em que Argl44 e/ou Lysl45 podem ser substituídos por um aminoácido neutro, e.g. por Ser ou Gly. 0 segundo e terceiro domínios CD95L solúveis (iii) e (v) contudo, são seleccionados de sequências encurtadas e/ou mutadas. Pelo menos um dos domínios CD95L solúveis (ii) e (v), podem ter uma sequência N-terminal que se inicia entre o aminoácido Argl44 e Vall46 de CD95L humano e em que Argl44 e/ou Lysl45 podem ser substituídos por um aminoácido neutral, e.g. por Ser e/ou Gly. O segundo e terceiro domínio de CD95L solúvel pode iniciar-se com uma sequência N-terminal seleccionada de: (a) Argl44 - (Gly/Ser) 145 - Vai (146) (b) (Gly/Ser) 144 - Lysl45 - Vai (146) e (c) (Gly/Ser) 144 - (Gly/Ser) 145 -Vai (146) .

Além disso, o domínio CD95L pode terminar com o aminoácido

Leu 281 de CD95L humano. 0 domínio CD95L solúvel pode compreender uma sequência de mamífero, e.g. uma sequência humana de tipo selvagem. Em determinadas concretizações, contudo, a sequência CD95L pode compreender uma mutação que resulta numa redução ou inibição completa da ligação à matriz extracelular, e.g. uma mutação na posição Lysl77, e.g. Lysl77 Glu, Asp ou Ser e/ou uma mutação que reduz e/ou inibe a ligação ao receptor CD95L, e.g. uma mutação na posição Tyr218, e.g. Tyr218 Arg, Lys, Ser. Asp.

Uma das três moléculas CD95L solúveis pode ser um variante de sequência com uma ligação de receptor reduzida. Duas das moléculas podem conter mutações que resultam em ligação de receptor reduzida.

Numa concretização preferida adicional da presente invenção, os domínios de citocina solúveis de família TNF (i), (iii) e (v) são domínios TNF solúveis, nomeadamente domínios TNF solúveis. 0 primeiro domínio TRAIL solúvel (i) pode ser seleccionado de sequências nativas, encurtadas e/ou mutadas. Assim, o primeiro domínio TRAIL solúvel (i) tem uma sequência N-terminal que pode começar entre o aminoácido Glull6 e VaM 22 de TRAIL humano e em que Argl21 pode ser substituído por um aminoácido neutro, e.g. por Ser ou Gly. 0 segundo e terceiro domínios TRAIL solúveis (iii) e (v) têm uma sequência N-terminal encurtada que se inicia de preferência entre o aminoácido Glyl20 e VaM 22 de TRAIL humano e em que Argl21 pode ser substituído por qualquer aminoácido, e.g. Ser ou Gly.

Preferentemente, a sequência N-terminal dos domínios de TRAIL solúveis (iii) e (v) é seleccionada de: (a) Argl21 -Vall22 - Alal23 e (b) (Gly/Ser)121. 0 domínio de TRAIL solúvel termina de preferência com o aminoácido Gly281 de TRAIL humano. Em determinadas concretizações, o domínio TRAIL pode compreender mutações internas tal como descrito anteriormente.

Os domínios de citocina de família TNF solúveis (i), (iii) e (v) descrevem-se como domínios LIGHT solúveis, e.g. domínios LIGHT humanos solúveis. 0 primeiro domínio LIGHT solúvel (i) pode ser seleccionado de sequências nativas, encurtadas e/ou mutadas. Assim, o primeiro domínio LIGHT solúvel (i) tem uma sequência N-terminal que pode iniciar-se entre o aminoácido Glu91 e Ala95 de LIGHT humana. 0 segundo e terceiro domínios LIGHT solúveis (iii) e (v) têm uma sequência N-terminal encurtada que de preferência se inicia entre o aminoácido Pro94 e Ala95 de LIGHT humana. 0 domínio LIGHT solúvel finaliza de preferência com o aminoácido Val240.

As componentes (ii) e (iv) do polipéptido de fusão em cadeia simples são elementos de ligante de péptido localizados entre as componentes (i) e (iii) ou (iii) e (v), respectivamente. Os elementos de ligante flexível têm um comprimento de 3-8 aminoácidos, nomeadamente um comprimento de 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos. Os elementos de ligante são de preferência ligantes glicina/serina, i.e. ligante de péptido consistindo substancialmente dos aminoácidos glicina e serina. Nos casos em que o domínio solúvel de citocina termina com S ou G (C-terminal), e.g. TRAIL humano, o ligante inicia-se após S ou G. Nos casos em que o domínio solúvel de citocina se inicia com S ou G (N-terminal), o ligante termina antes deste S ou G.

Deve referir-se que o ligante (ii) e ligante (iv) não têm de apresentar o mesmo comprimento. De modo a diminuir a potencial falta de imunogenicidade, pode preferir-se usar ligantes mais curtos. Além disso acabou por se constatar que ligantes mais curtos levam a moléculas em cadeia simples com tendência reduzida para formar agregados. Enquanto ligantes que são substancialmente mais longos do que os aqui divulgados podem apresentar propriedades de agregação desfavoráveis.

Caso pretendido, o ligante pode compreender um resíduo de asparagina que pode formar um local de glicosilação Asn-Xaa-Ser. Em determinadas concretizações, um dos ligantes, e.g. ligante (ii) ou ligante (iv) compreende um local de glicosilação. Noutras concretizações, ambos os ligantes (iv) compreendem locais de glicosilação. De modo a aumentar a solubilidade das proteínas scTNF-SF e/ou de modo a reduzir a potencial falta de imunogenicidade, pode preferir-se que o ligante (ii) ou o ligante (iv) ou ambos compreendam um local de glicosilação.

Seleccionam-se sequências ligantes preferidas de GSGSGSGS (SEQ ID NO: 52) , GSGSGNGS (SEQ ID NO:53), GGSGSGSG (SEQ ID NO:21), GGSGSG (SEQ ID NO:22), GGSG (SEQ ID NO:23), GGSGNGSG (SEQ ID NO:24) , GGNGSGSG (SEQ ID NO:25) e GGNGSG (SEQ ID NO:26) A proteína de fusão pode compreender adicionalmente um domínio de péptido de sinalização N-terminal, que permite processamento, e.g. excreção extracelular, numa célula hospedeira adequada. Preferentemente, o domínio de péptido de sinalização N-terminal compreende um local de clivagem de protéase, e.g. um local de clivagem de peptidase de sinalização e assim pode ser removido após ou durante a expressão para obter a proteína madura. Além disso, a proteína de fusão pode compreender adicionalmente um elemento C-terminal, com um comprimento de e.g. 1-50, de preferência 10-30 aminoácidos que pode incluir ou ligar-se a um domínio de reconhecimento/purificação, e.g. um domínio FLAG, um domínio de marcador Strep ou um domínio de marcador II de Strep e/ou um domínio poli-His.

Além disso, o polipéptido de fusão pode compreender adicionalmente um domínio adicional no terminal N ou no terminal C, e.g. um domínio de direcção ao alvo tal como um anticorpo em cadeia simples ou um domínio de fragmento de anticorpo. Os exemplos específicos de anticorpos adequados são anticorpos anti-tumor, tal como anticorpos contra membros da família EGFR. Exemplos adequados de outras moléculas de direcção ao alvo são citocinas, tal como interleucinas.

Os exemplos de proteínas de fusão específicas da invenção são SEQ ID NOs: 27, 28, 29, 43, 45, 47, 49 e 51. Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão tal como aqui descrito. A molécula de ácido nucleico pode ser uma molécula de ADN, e.g. uma molécula de ADN em cadeia dupla ou em cadeia simples ou uma molécula de ARN. A molécula de ácido nucleico pode codificar a proteína de fusão ou um seu precursor, e.g. uma pró-proforma ou pré-proforma da proteína de fusão que pode compreender uma sequência de sinalização ou outras partes de aminoácido heterólogas para excreção ou purificação que se localizam de preferência no terminal N ou no terminal C da proteína de fusão. As partes de aminoácido heterólogas podem estar ligadas por um primeiro e/ou um segundo domínio através de um local de clivagem de protéase, e.g. um local de clivagem de protéase de Factor Xa, trombina ou IgA.

Os exemplos de sequências de ácido nucleico específicas da invenção são SEQ ID NOs: 30, 31 32, 44, 46, 48 e 50. A molécula de ácido nucleico pode estar ligada operacionalmente a uma sequência de controlo de expressão, e.g. uma sequência de controlo de expressão que permite expressão da molécula de ácido nucleico numa célula hospedeira pretendida. A molécula de ácido nucleico pode localizar-se num vector, e.g. um plasmídeo, um bacteriófago, um vector vírico, um vector de integração cromossómica, etc. Descrevem-se exemplos de sequências de controlo de expressão e vectores adequados em, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press e Ausubel et al. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &amp; Sons ou suas edições mais recentes.

Podem usar-se vários sistemas de vector de expressão/célula hospedeira para expressar sequências de ácido nucleico que codificam as proteínas de fusão da presente invenção. As células hospedeiras adequadas incluem, células procarióticas tais como bactéria, e.g. E.coli, células hospedeiras eucarióticas tais como células de levedura, células de insecto, células vegetais ou células animais, de preferência células de mamífero e com maior preferência, células humanas, não se lhes limitando.

Além disso, a invenção refere-se a um organismo não humano transformado ou transfectado com uma molécula de ácido nucleico tal como descrito anteriormente. Tais organismos transgénicos podem gerar-se por métodos conhecidos de transferência genética incluindo recombinação homóloga.

Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica ou de diagnóstico compreendendo como agente activo pelo menos uma proteína de fusão, um ácido nucleico seu codificante respectivo ou célula transformada ou transfectada, todos tal como aqui descritos.

Pelo menos uma proteína de fusão, um ácido nucleico seu codificante respectivo ou célula transformada ou transfectada, todos tal como aqui descritos, podem ser usados em terapia, e.g., na profilaxia e/ou tratamento de doenças causadas por ou associadas com e/ou acompanhadas por disfunções de citocinas TNF-SF, nomeadamente doenças proliferativas, tais como tumores, e.g. tumores sólidos ou linfáticos; doenças infecciosas; doenças inflamatórias; doenças metabólicas; doenças auto-imunes, e.g. doenças reumatóides e/ou artríticas; doenças degenerativas, e.g. doenças neurodegenerativas tais como esclerose múltipla; doenças associadas a apoptose ou rejeições de transplante. A expressão "disfunção de citocinas TNF-SF" tal como aqui usada deve entender-se com qualquer função ou expressão de uma citocina TNF-SF que se desvia da função ou expressão normal de citocina TNF-SF, e.g., sobrexpressão do gene TNF-SF ou proteína, expressão reduzida ou abolida do gene ou proteína da citocina TNF-SF comparativamente com o nível de expressão fisiológica normal da referida citocina TNF-SF, actividade aumentada da citocina TNF-SF, actividade reduzida ou abolida da citocina TNF-SF, ligação aumentada da citocina TNF-SF a quaisquer parceiros de ligação, e.g., a um receptor, nomeadamente um receptor CD95 ou TRAIL ou outra molécula de citocina, ligação reduzida ou abolida a qualquer parceiro de ligação, e.g. a um receptor, nomeadamente um receptor CD95 ou TRAIL ou outra molécula de citocina, comparativamente com a actividade ou ligação fisiológica normal da referida citocina TNF-SF. A composição pode ser administrar-se como monoterapia ou como terapia de combinação com medicação adicional, e.g. agentes citostáticos ou quimioterapêuticos, corticosteróides e/ou antibióticos. A proteína de fusão é administrada a um indivíduo que dela necessita, nomeadamente um doente humano, numa dose suficiente para o tratamento das condições específicas por meios adequados. Por exemplo, a proteína de fusão pode ser formulada como uma composição farmacêutica conjuntamente com transportadores, diluentes e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Pode determinar-se a eficácia terapêutica e a toxicidade de acordo com protocolos padrão. Pode administrar-se a composição farmacêutica sistemicamente, e.g. intraperitonealmente, intramuscularmente ou intravenosamente ou localmente, e.g. intranasalmente, subcutaneamente ou intratecalmente. Prefere-se administração intravenosa. A dose da proteína de fusão administrada será obviamente dependente do indivíduo a tratar, do peso do indivíduo, do tipo e gravidade da doença, do modo de administração e da opinião do médico assistente. Para a administração de proteínas de fusão, é adequada uma dose diária de 0,001 a 100 mg/kg.

Exemplos 1. Produção de uma proteína de fusão CD95L em cadeia simples (scCD95L) (para referência)

No que se segue, mostra-se como exemplo a estrutura secundária das proteínas recombinantes (Figura 1) para o domínio de ligação de receptor do ligando CD95 humano. 1.1 Estrutura de polipéptido A) Aminoácidos Metl-Ser21 Péptido de sinalização IgKapa, local de clivagem de pepetidase de sinalização após o aminoácido Gly20 B) Aminoácidos Glu22 -Leul61

Primeiro domínio solúvel de citocina do ligando CD95 humano (CD95L; aminoácidos 142-281 de SEQ ID NO: 6 incluindo uma mutação K145S). C) Aminoácidos Glyl62-Glyl69 Primeiro elemento peptídico ligante. D) Aminoácidos Argl70-Leu307

Segundo domínio solúvel de citocina do ligando CD95 humano (CD95L; aminoácidos 144-182 de SEQ ID NO: 6 incluindo uma mutação K145S). E) Aminoácidos Gly308-315 Segundo elemento peptídico ligante. F) Aminoácidos Arg316-Leu453

Terceiro domínio solúvel de citocina do ligando CD95 humano (CD95L; aminoácidos 144-281 de SEQ ID NO: 6 incluindo uma mutação K145S). G) Aminoácido Gly457-Lys472 Péptido ligante com um motivo de marcador II de Strep.

Apresenta-se a sequência de aminoácidos de sc CD95L em SEQ ID NO. 27. 0 polipéptido de fusão compreende o primeiro e o segundo péptidos ligantes com a sequência GGSGSGSG.(SEQ ID NO: 21). As sequências de ligante preferidas adicionais são SEQ ID NOs: 22-26 tal como descrito anteriormente. Deve notar-se que a primeira e segunda sequências de péptido ligante não necessitam ser idênticas. A sequência de péptido de sinalização (A) pode ser substituída por qualquer outra adequada, e.g. sequência de péptido de sinalização de mamífero. 0 motivo Strep-tag II (G) pode ser substituído por outros motivos, caso pretendido, ou deletado.

Tal como apresentado na figura 23, recolheu-se o sobrenadante de cultura celular de células HEK293, que expressam transitoriamente scCD95L (SEQ ID NO:27) e usou-se para estimular células Jurkat a diferentes concentrações. Usou-se o sobrenadante quer directamente sem modificações adicionais, quer com adição de um anticorpo anti-Streptag (2 micrograma/ml) para reticular a proteína scCD95L. Apenas o sobrenadante celular que continha scCD95L-St reticulado aumentou a actividade de caspase em células Jurkat, indicando que scCD95L sozinho não forma agregados de ordem superior capazes de serem pró-apoptóticos. 1.2 Cassete génica que codifica o polipéptido 0 gene sintético pode ser optimizado relativamente ao seu uso de códão para a expressão em células hospedeiras adequadas, e.g. células de insecto ou células de mamífero. Apresenta-se uma sequência de ácido nucleico preferida em SEQ ID NO: 30. 1.3 Estratégia de clonagem O gene sintético pode ser clonado, e.g. através de hidrólise por uma enzima de restrição, para um vector de expressão adequado. 2. Fabrico de uma proteína de fusão TRAIL em cadeia simples (sc TRAIL wt) 2.1 Estrutura de polipéptido A) Aminoácidos Metl-Gly20 Péptido de sinalização Ig-kapa, local assumido de clivagem de peptidase de sinalização após o aminoácido Gly 20. B) Aminoácidos Gln21 - Glyl82

Primeiro dominio solúvel de citocina do ligando TRAIL humano (TRAIL, aminoácido 120 - 281 de SEQ ID NO:10) C) Aminoácidos Glyl83 - Ser 190

Primeiro elemento de ligante peptídico, em que os dois aminoácidos denominados X são ambos S ou um é S e o outro é N. D) Aminoácidos Argl91 - Gly351

Segundo dominio solúvel de citocina do ligando TRAIL humano (TRAIL, aminoácidos 121 - 281 de SEQ ID NO:10) E) Aminoácidos Gly 352 - Ser359

Segundo elemento de ligante peptídico, em que os dois aminoácidos denominados X são ambos S ou um é S e o outro é N. F) Aminoácidos Arg360 - Gly520

Terceiro domínio solúvel de citocina do ligando TRAIL humano (TRAIL, aminoácidos 121 - Gly281 de SEQ ID NO:10) G) Aminoácidos Gly521 - Lys538

Elemento de ligante peptídico com um motivo Streptag II. A sequência de aminoácidos de sc TRAIL wt apresenta-se SEQ ID NO: 28.

Os ligantes indicados podem ser substituídos por outros ligantes preferidos, e.g. tal como apresentado em SEQ ID NO: 21.26. Deve salientar-se que o primeiro e o segundo ligantes peptídicos não têm de ser idênticos. A sequência de péptido de sinalização (A) pode ser substituída por qualquer outra adequada, e.g. sequência de péptido de sinalização de mamífero. O motivo Strep-tag II (G) pode ser substituído por outros motivos, caso se pretenda, ou deletado.

Recolheram-se os sobrenadantes de cultura celular de células HEK293, que expressam transitoriamente proteínas TRAIL em cadeia simples com ligantes diferentes (derivados de SEQ ID 28, num total de nove combinações de ligantes diferentes) e usaram-se para estimular células Jurkat a diferentes diluições (como exemplo, apresenta-se na figura 25 uma diluição de 1:8). Usaram-se os sobrenadantes quer directamente sem modificações adicionais, quer com adição de um anticorpo anti-Streptag (Strep MAB Immo a 2 micrograma/ml) para reticular as proteínas scTRAILwt. Incubaram-se células Jurkat com sobrenadante de cultura de células HEK293 durante três horas a 37 °, lisaram-se e analisaram-se para actividade de caspase. 0 sobrenadante de cultura celular que continha proteínas scTRAILwt reticuladas induziu uma actividade de caspase aumentada em células Jurkat (resultados apresentados no lado direito do gráfico), indicando que as proteínas scTRAILwt sozinhas formam apenas uma pequena quantidade de agregados de ordem superior capazes de serem pró-apoptóticos. 2.2 Cassete genica que codifica o polipéptido 0 gene sintético pode ser optimizado relativamente ao seu uso de códão para a expressão em células hospedeiras adequadas, e.g. células de insecto ou células de mamífero. Apresenta-se uma sequência de ácido nucleico preferida em SEQ ID NO: 31. 3. Fabrico de uma proteína de fusão TRAIL em cadeia simples mutada (scTRAIL (específica para R2))

Seguidamente, apresenta-se a estrutura de um polipéptido TRAIL em cadeia simples compreendendo uma mutação para ligação selectiva a receptor R2 de TRAIL. 3.1 Estrutura de polipéptido A) Aminoácidos Meti- Ser29 Péptido de sinalização Ig-kapa, local assumido de clivagem de peptidase de sinalização após o aminoácido Gly 20 e ligante peptídico. B) Aminoácidos Arg29 - Glyl90

Primeiro domínio solúvel do ligando TRAIL humano (TRAIL, aminoácidos 121 - 281 de SEQ ID NO: 10 incluindo as mutações Y189Q, R191K, Q193R, H264R,1266L e D267Q) C) Aminoácidos Glyl91 - Serl98

Primeiro elemento de ligante peptídico, em que os dois aminoácidos denominados X são como indicado no exemplo 2. D) Aminoácidos Argl99 - Gly359

Segundo domínio solúvel de citocina do ligando TRAIL humano (TRAIL, aminoácidos 121 - 281 de SEQ ID NO: 10 incluindo as mutações indicadas em B) E) Aminoácidos Gly360 - Ser367

Segundo elemento de ligante peptídico, em que os aminoácidos X são como indicado no exemplo 2. F) Aminoácidos Arg368 - Gly528

Terceiro domínio solúvel de citocina do ligando TRAIL humano (TRAIL, aminoácidos 121-281 de SEQ ID NO:10 incluindo as mutações indicadas em B) G) Aminoácidos Gly529 - Lys546

Ligante peptídico com um motivo Strep-tag II. A sequência de aminoácidos de scTRAIL(específico para R2) apresenta-se em SEQ ID NO: 29.

Os ligantes indicados podem ser substituídos por outros ligantes preferidos, e.g. tal como apresentados em SEQ ID NO: 21-26. Deve salientar-se que o primeiro e o segundo ligantes peptídicos não têm de ser idênticos. A sequência de péptido de sinalização (A) pode ser substituída por qualquer outra adequada, e.g. sequência de péptido de sinalização de mamífero. O motivo Streptag II (G) pode ser substituído por outros motivos, caso se pretenda, ou pode ser deletado. 3.2 Cassete genica que codifica o polipéptido 0 gene sintético pode ser optimizado relativamente ao seu uso de códão para a expressão em células hospedeiras adequadas, e.g. células de insecto ou células de mamífero. Apresenta-se uma sequência de ácido nucleico preferida em SEQ ID NO: 32. 4. Expressão e purificação a) Clonagem, expressão e purificação de polipéptidos de fusão

Cultivaram-se células Hek293T em DMEM + GlutaMAX (GibCo) suplementado com FBS a 10%, penicilina a 100 unidades/ml e estreptomicina a 100 pg/ml e transfectaram-se transitoriamente com um plasmídeo contendo uma cassete de expressão para um polipéptido de fusão. Nos casos em que são necessárias várias cadeias de polipéptido para conseguir o produto final, e.g. para as proteínas de fusão Fab-scTNF-SF (figura 9A) , as cassetes de expressão foram combinadas num plasmídeo ou posicionadas em diferentes plasmídeos durante a transfecção. Recolheu-se o sobrenadante de cultura celular contendo o polipéptido de fusão recombinante três dias após transfecção e clarificou-se por centrifugação a 300 x g seguido por filtração através de um filtro estéril de 0,22 pm. Para purificação por afinidade empacotou-se Streptactin Sepharose numa coluna (leito de gel de 1 ml) , equilibrou-se com 15 ml de tampão W (Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0) ou PBS pH 7,4 e aplicou-se o sobrenadante de cultura celular à coluna com um caudal de 4 ml/min. Subsequentemente, lavou-se a coluna com 15 ml de tampão W e eluiu-se o polipéptido ligado em etapas por adição de 7 x 1 ml de tampão E (Tris HC1 100 mM, NaCl 150 mM, Destiobiotina 2,5 mM, pH 8,0). Alternativamente pode usar-se para esta etapa PBS pH 7,4 contendo Destiobiotina 2,5 mM. Quantificou-se a quantidade de proteína das fracções eluídas e concentraram-se as fracções de pico por ultrafiltração e purificaram-se adicionalmente por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC).

Efectuou-se SEC numa coluna Superdex 200 usando um sistema de cromatografia Akta (GE-Healthcare) . Equilibrou-se a coluna com solução salina tamponada de fosfato e carregou-se o polipéptido concentrado purificado em Streptactin na coluna de SEC a um caudal de 0,5 ml/min. Monitorizou-se o perfil de eluição do polipéptido pela absorvância a 280 nm.

Para determinação do peso molecular aparente do polipéptido de fusão purificado em condições nativas, carregou-se uma coluna Superdex 200 com proteínas padrão de peso molecular conhecido. Com base no volume de eluição das proteínas padrão, representou-se graficamente uma curva de calibração e determinou-se o peso molecular aparente do polipéptido de fusão purificado. 5. Ensaio de apoptose

Usou-se um ensaio celular com uma linha de células T Jurkat A3 permanentes para determinar a actividade de indução de apoptose de diferentes ligandos de CD95 (CD95L) e construções de polipéptido de fusão TRAIL. Cultivaram-se células Jurkat em frascos com meio RPMI 1640 + GlutaMAX (GibCo) suplementado com FBS a 10%, penicilina a 100 unidades/ml e estreptomicina a 100 pg/ml. Antes do ensaio, inocularam-se 100 000 células por poço numa placa de microtitulação de 96 poços. A adição de diferentes concentrações de péptidos de fusão aos poços foi seguida por uma incubação de 3 horas a 37 °C. Lisaram-se as células por adição de tampão de lise (HEPES 250 mM, MgCl2 50 mM, EGTA 10 mM, Triton-X-100 a 5%, DTT 100 mM, AEBSF 10 mM, pH 7,5) e colocaram-se as placas em gelo durante 30 minutos a 2 horas. A apoptose é acompanhada por um aumento da actividade de caspases, e.g. Caspase-3. Assim, a clivagem do substrato específico de caspase Ac-DEVD-AFC (Biomol) foi usada para determinar a extensão de apoptose. De facto, a actividade de caspase correlaciona-se com a percentagem de células apoptóticas determinada morfologicamente após coloração das células com iodeto de propídio e Hoechst-33342. Para o ensaio de actividade de caspase, transferiu-se 20 μΐ de lisado celular para uma placa de microtitulação de 96 poços preta. Após a adição de 80 μΐ de tampão contendo HEPES 50 mM, sacarose a 1%, CHAPS a 0,1%, Ac-DEVD-AFC 50 μΜ e DTT 25 mM, pH 7,5, transferiu-se a placa para um leitor de placas de microtitulação Tecan Infinite 500 e monitorizou-se o aumento da intensidade de fluorescências (comprimento de onda de excitação de 400 nm, comprimento de onda de emissão de 505 nm). 5.1 Ensaio de morte celular

Para a determinação da morte celular em células de fibrossarcoma HT1080, plaquearam-se 15000 células em placas de 96 poços durante a noite em meio RPMI 1640 + GlutaMAX (GibCo) suplementado com FBS a 10% (Biochrom) . Co-incubaram-se as células com ciclo-heximida (Sigma) a uma concentração final de 2,5 g/ml. Quantificou-se a morte celular por coloração com tampão KV (violeta de cristal a 0,5%, metanol a 20%) . Após coloração, lavaram-se os poços com água e secaram-se ao ar. Eluiu-se o corante com metanol e mediu-se a densidade óptica a 595 nm com um leitor de ELISA: 6. Ensaio de estabilidade/agregação 6.1. Principio da análise de agregação (Definição para proteína solúvel) O conteúdo de monómeros (montagem trimérica definida de módulos de ligação de receptor de TNF-SF) e agregados é determinado por SEC analítica, tal como descrito no exemplo 4. Para este objectivo em particular, a análise é efectuada em tampões contendo concentrações de sal fisiológicas a pH fisiológico (e.g. NaCl a 0,9%, pH 7,4; PBS pH 7,4). Efectua-se uma análise de agregação típica numa coluna Superdex200 (GE Healthcare). Esta coluna separa proteínas na gama entre 10 e 800 kDa.

Para a determinação do peso molecular aparente do polipéptido de fusão purificado em condições nativas, carrega-se uma coluna Superdex 200 com proteínas padrão de peso molecular conhecido. Com base no volume de eluição das proteínas padrão, representou-se graficamente uma curva de calibração e determinou-se o peso molecular aparente do polipéptido de fusão purificado. A análise de SEC de proteínas solúveis e não agregadas, e.g. TNF-SF trimérico, apresenta tipicamente um pico de proteína único distinto a um volume de eluição definido. Este volume de eluição corresponde ao peso molecular nativo aparente da proteína específica e está aproximadamente em conformidade com o peso molecular teórico calculado com base na sequência de aminoácidos primária.

Caso ocorra agregação de proteína, a análise por SEC apresenta picos de proteína adicionais com volumes de retenção menores. Para os membros da família TNF-SF a agregação de proteínas solúveis ocorre de uma forma característica. As proteínas tendem a formar oligómeros dos "trímeros", formando nonameros (3x3) e 27 meros (3x9). Estes oligómeros servem como núcleos de agregação e um conteúdo elevado de oligómeros leva potencialmente à agregação da proteína. Os oligómeros de elevado peso molecular e os agregados eluem no volume vazio da coluna de Superdex200 e não podem ser analisados por SEC relativamente ao seu peso molecular nativo. Os exemplos para análise por SEC de uma preparação de proteínas TNF-SF triméricas solúveis definidas e oligomerizadas/agregadas apresenta-se na figura 17.

Devido à indução de agregação (completa) , as preparações purificadas de proteínas de fusão TNF-SF devem conter de preferência apenas proteínas triméricas definidas e apenas uma muito pequena quantidade de proteína oligomerizada. 0 grau de agregação/oligomerização de uma determinada preparação de proteína TNF-SF determina-se com base na análise por SEC através do cálculo das áreas de pico do diagrama de DO280 para a fracção trimérica definida e para a fracção de oligómero/agregado, respectivamente. Com base na área total de pico, calcula-se a percentagem de proteína trimérica definida da seguinte forma: % conteúdo de trímero=[Área de pico de trímero]/[Área de pico total] x 100 A definição de proteína solúvel tal como usada neste texto, descreve uma preparação de proteína de proteína TNF-SF purificada num tampão de concentrações fisiológicas de sal a pH fisiológico que contém um conteúdo de proteína solúvel definida (montagem trimérica de domínios TNF-SF) >90% dentro de uma gama de concentração de proteína típica de 0,2 a 10,0 mg/ml. 6.2 Análise de agregação por SEC para variantes sc-TRAIL purificadas

Transfectaram-se três variantes sc-TRAIL diferentes e purificadas por afinidade tal como descrito. As proteínas purificadas foram analisadas subsequentemente para o seu conteúdo de proteína solúvel definida usando análise por SEC tal como descrito em 6.1. No caso particular de proteínas de fusão em cadeia simples, um trímero descreve uma montagem trimérica de três domínios TNF-SF codificados, codificados para uma única cadeia de polipéptido, (formalmente as proteínas TNF-SF em cadeia simples são monómeros, dado que as montagens em cadeia simples apenas formam interacções intramoleculares [todos os domínios de proteína são codificados por uma única cadeia de polipéptido] e não formam interacções intermoleculares entre cadeias polipeptídicas individuais distintas.)

As proteínas analisadas por SEC foram: 1. ) Fab-sc-TRAIL(específica para R2)-SNSN (figura 19):

Proteína de fusão compreendendo um domínio Fab fundido em posição N-terminal a uma proteína de fusão de TRAIL em cadeia simples específica para interacção com receptor 2 de TRAIL, glicosilada 2. ) Fab-sc-TRAIL(específica para R2)-SSSS (figura 18)

Proteína de fusão compreendendo um domínio Fab fundido em posição N-terminal a uma proteína de fusão em cadeia simples de TRAIL específica para interacção com o receptor 2 de TRAIL, não glicosilada 3. ) Fab-sc-TRAIL-wt-SNSN (figura 20).:

Proteína de fusão compreendendo um domínio Fab fundido em posição N-terminal a uma TRAIL em cadeia simples, glicosilada A análise por SEC das três construções Fab-sc de TRAIL purificadas revelou um único pico de proteína para todas as proteínas indicando fracções de proteína solúvel definida (>95% de trímero). 0 peso molecular aparente calculado para as proteínas (com base na calibração da coluna) indica fortemente uma associação trimérica dos domínios TNF-SF para as proteínas purificadas. Nenhuma das proteínas analisadas apresentou indicação de agregação (figuras 18, 19, 20).

Comparando "Fab-sc-TRAIL-R2-SNSN" potencialmente glicosilada com "Fab-sc-TRAIL-R2-SSSS" não glicosilada indica uma diferença significativa do peso molecular aparente nativo que é devida a glicosilação de Fab-sc-TRAIL (específica para R2)-SNSN.

Sabe-se que a expressão de membros sc-TNF-SF como proteínas de fusão com fragmento de anticorpo fv facilita a agregação da proteína. O princípio de construção das variantes Fab-sc-TRAIL revelou que não há qualquer agregação das variantes TRAIL expressas e é portanto benéfico relativamente à solubilidade da proteína. 6.3 Glicosilação diferencial de variantes sc-TRAIL-ligante

A glicosilação de proteínas pode ser benéfica para construções recombinantes sc-TNF-SF relativamente à potencial imunogenicidade e estabilidade. De modo a obter glicosilação da construção sc-TRAIL, conceberam-se sequências específicas de ligante que continham possíveis locais de glicosilação ligada a N em posições definidas (consultar figura 21-A). A expressão recombinante e subsequente análise de transferência "western" revelaram que a posição respectiva da asparagina (N) no interior da sequência de ligante é importante para glicosilação subsequente da proteína. Surpreendentemente, a posição de ligante preferencial da asparagina glicosilada foi identificada como a posição "2" tal como descrito na figura 21-A, (G S G S G N G S) . Caso a asparagina esteja localizada noutras posições (e.g. posição "1" [G S G N G S G S] consultar a figura 21-A), a glicosilação da(s) respectiva(s) asparaginas(s) é eliminada. Este aspecto pode ser confirmado por análise de transferência "western" de diferentes variantes sc-TRAIL. Caso ambas as asparaginas do ligante 1 e ligante 2 estejam localizadas na posição "2" pode observar-se um desvio significativo do peso molecular dependente da glicosilação para a variante sc-TRAIL respectiva (figura 22). Pode também confirmar-se um desvio de peso molecular da variante sc-TRAIL-ligante glicosilada por cálculo do peso molecular aparente após análise por SEC (figura 18, 19). 0 Fab-sc-TRAIL(especifico de R2)SSSS não glicosilado tem nitidamente um menor peso molecular (68 kDa) do que Fab-sc-TRAIL (especifico de R2)SNSN glicosilado (87 kDa).

Com base nesta análise, reivindicamos glicosilação diferencial das construções sc-TRAIL por modificação da posição das asparaginas no interior da(s) sequência(s) ligante(s) . A glicosilação protege a sequência ligante relativamente a degradação proteolítica e pode estabilizar a proteína. Além da glicosilação da sequência ligante prevenir potencialmente o reconhecimento da sequência ligante pelo sistema imunitário, reduz potencialmente a imunogenicidade da proteína. Assim, a gl icosilação da sequência do ligante é benéfica relativamente a imunogenicidade e estabilidade proteolítica das construções sc-TRAIL e tem uma influência potencial na semivida da proteína. Pode usar-se a glicosilação específica diferencial do ligante para modificar a imunogenicidade e estabilidade de membros de TNF-SF recombinante. 6.3. Expressão e análise de um sc-TRAIL com sequência do ligante prolongada e resíduos de haste N-terminais (sc-TRAIL-(95-281)-long)

Em WO/2005/103077 descreve-se um polipéptido de fusão TRAIL em cadeia simples, aqui denominado sc-TRAIL-(95-281)-long, em que cada módulo TRAIL compreende os resíduos 95 a 281 de SEQ ID NO:10. Os módulos TRAIL estão ligados por um ligante glicina serina consistindo de pelo menos 12 aminoácidos (GGGSGGGSGGGS). Comparativamente aos módulos TRAIL da presente invenção (compreendendo os resíduos 121-281 de SEQ ID NO:10), estão presentes 25 aminoácidos adicionais incluindo a região de haste em cada um dos módulos TRAIL adjacentes.

De modo a analisar a influência da sequência do ligante nas construções sc-TRIAL, analisou-se sc-TRAIL-(95-281)-long. A expressão, purificação e subsequente análise por SEC revelou que sc-TRAIL-(95-281)-long com o ligante de 12 aa e a sequência de haste adicional é expresso e excretado para o sobrenadante de cultura celular de células HEK293T. No entanto, a análise pode SEC da proteína purificada indica que sc-TRAIL-(95-281)-long apresenta múltiplos picos compreendendo uma grande quantidade de proteína numa forma oligomerizada ou agregada. A agregação de sc-TRAIL-(95-281)-long é um efeito directo das sequências prolongadas do ligante em combinação com os resíduos adicionais da haste N-terminal. Os resultados indicam que o ligante mais longo usado nesta construção leva a propriedades de agregação aumentada na construção. 7. Construção de polipéptidos de fusão em cadeia simples compreendendo um ou mais domínios adicionais 7.1. Montagem de TNF-SF solúvel e fragmentos de anticorpo conhecidos na especialidade

Sabe-se na especialidade que os domínios solúveis de citocina TNF-SF podem ser fundidos a fragmentos de anticorpo de modo o obter trimerização e/ou dimerização de trímeros. Construíram-se proteínas de fusão scFv-TNF-SF em cadeia simples consistindo de um anticorpo em cadeia simples e um domínio solúvel compreendendo um TNF-RBD e a região de haste. Os trímeros correspondentes consistem de três anticorpos em cadeia simples e três domínios solúveis (figura 7).

Além disso, construíram-se proteínas de fusão Fc-TNF-SF, em que cada proteína de fusão compreende um domínio Fc intramolecular N-terminal e um domínio solúvel C-terminal (figura 8) . Consegue-se dimerização dos domínios solúveis por montagem dos dois domínios Fc através de pontes dissulfureto. Os trímeros são obtidos subsequentemente por uma combinação de dois domínios solúveis de uma proteína de fusão Fc-TNF-SF e um domínio solúvel de outra proteína de fusão Fc-TNF-SF. Tal como se pode deduzir da figura 4, a dimerização de trímeros também é mediada pela fusão Fc-TNF-SF N-terminal. Em conclusão, estão presentes três fragmentos de anticorpo Fc por dímero do trímero. No entanto, tais proteínas de fusão formam provavelmente agregados de peso molecular superior, o que representa uma desvantagem importante. 7.2 Proteínas de fusão da invenção compreendendo um ou mais domínios adicionais

As proteínas de fusão da invenção compreendendo um ou mais domínios adicionais podem ser construídas de várias formas. Seguidamente exemplifica-se a construção de proteínas de fusão com domínios adicionais com o anticorpo pertuzumab dirigido contra o antigénio ErbB2 de superfície celular. A seguência de aminoácidos da cadeia pesada apresenta-se em SEQ ID NO: 33: 1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT DYTMDWVRQA PGKGLEWVAD VNPNSGGSIY .

61 NQRFKGRFTL SVDRSKNTLY LOMNSLRAED TAVYYCARNL GPSFYFDYWG QGTLVTVSSA 121 STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGaVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG ·

181 LYSLSSWTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPK SC A sequência de aminoácidos da cadeia leve apresenta-se em SEQ ID NO: 34

1 DiQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVS IGVAWYQQKP GKAPKLUYSASYRYTGVPS

61 RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YYIYPYTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP

121 SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEGDSKD STYSLSSTLT

181 LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC 7.2.1

Numa concretização, o polipéptido de fusão da invenção compreende adicionalmente um fragmento de anticorpo Fab no terminal N ou no terminal C (figura 9A). A fusão de um fragmento de anticorpo Fab ao terminal N do polipéptido de fusão scTNF-SF pode ser conseguida pelas seguintes duas estratégias: (i) Prolonga-se a sequência de cadeia pesada com aminoácidos adicionais da região de dobra de IgGl e funde-se à proteína de fusão TNF-SF em cadeia simples. A região de dobra IgGl compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35: . . . .KSC1DKTHTC2PPÇ3PAPE. . .

Numa concretização preferida, selecciona-se o domínio Fab de modo que a cisteína do terminal C da cadeia pesada (Cl da região de dobra) termina o domínio CHI. Esta cisteína é necessária para formar uma ligação dissulfureto com a cadeia leve. 0 ligante subsequente compreende parte da região de dobra de IgG (e.g. DKTHT ou DKT), no entanto sem cisteínas adicionais da região de dobra. Alternativamente, usa-se um ligante de glicina/serina. Devido à ausência de cisteínas adicionais, obtém-se uma proteína de fusão monomérica compreendendo duas cadeias de polipéptido. 0 ligante tem de preferência um comprimento de 3-15 aminoácidos. Com maior preferência, o ligante é seleccionado do ligante 1-7 tal como apresentado seguidamente. 1. DKTHTG(S)a(G)b; (a=0-5; b=0 ou 1) 2. DKTHTGS(S)a(GS)bG(S)c (a, b =0,1-6; c=0 ou 1) 3. DKTG(S)a(G)b; (a=0-5; b=0 ou 1) 4. DKTG(S)a(GS)bG(S)c (a, b =0,1-6; c=0 ou 1) 5. SSG(S)a(GS)bG(S)c (a, b =0,1-6; c=0 ou 1) 6. SS(GGGS)aG(S)b (a=0, 1-4; b=0 ou 1) 7. GSPGSSSSSS(G)a (a=0 ou

As sequências de aminoácido preferidas com o módulo de cadeia pesada posicionado no terminal N relativamente ao módulo scTNF-SF apresentam-se em SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 49. Para objectivos de produção, estas cadeias de polipéptido são co-expressas com o polipéptido de cadeia leve de Fab (SEQ ID NO: 40) para obter ultimamente os polipéptidos de fusão Fab-scTRAIL. (ii) A sequência de cadeia leve está fundida à proteína de fusão TNF-SF em cadeia simples. A região constante da cadeia leve (e.g. SEQ ID NO: 34) termina com um resíduo de cisteína C-terminal. Este resíduo pode ser ligado em ponte covalente com a cisteína da dobra Cl da cadeia pesada. De preferência, usam-se os ligantes 1-7 tal como apresentados seguidamente para a ligação entre a sequência de cadeia leve e a proteína de fusão TNF-SF. São preferidos os ligantes 5-7 (consultar anteriormente).

De preferência, o último aminoácido no ligante adjacente ao módulo de citocina é Gly ou Ser. Seguidamente apresentam-se as sequências do ligante preferidas:

Adicionalmente, o ligante pode compreender motivos de glicosilação em N (NXS/T, em que X pode ser qualquer aminoácido).

Apresenta-se uma concretização das sequências de aminoácidos com o módulo de cadeia leve posicionado a N-terminal relativamente ao módulo scTNF-SF em SEQ ID NO: 51.

No caso das proteínas de fusão Fab-scTNF-SF, a co-expressão das duas cadeias de polipéptido é necessária para conseguir a montagem correcta do módulo Fab além do módulo scTNF-SF (consultar a figura 9A). Os módulos de cadeia pesada e leve de Pertuzumab (SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34) foram equipados com um péptido de sinalização, sujeitos a tradução reversa e os genes sintéticos resultantes (SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 42) são fundidos geneticamente a montante dos módulos de genes específicos de scTRAILwt ou scTRAILR2 (SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32) . Apresentam-se exemplos das cassetes génicas resultantes em SEQ ID NO: 46, 48 e 50. Após subclonagem para vectores de expressão adequados, usou-se uma selecção dos plasmídeos resultantes para expressão de proteína transitória em células HEK293T. Transfectaram-se plasmídeos TRAIL de cadeia pesada ou TRAIL de cadeia leve, sozinhos ou em combinação com os vectores necessários que codificam a cadeia leve ou pesada do fragmento Fab (figura 26). Surpreendentemente, a combinação de módulos no interior das proteínas de fusão influenciou a estabilidade relativa da proteína scTRAIL durante a expressão baseada em excreção. Caso o módulo da cadeia leve do domínio Fab seja fundido em posição N-terminal relativamente ao domínio scTRAIL (exemplificado em SEQ ID NO: 51), o produto de expressão é estável por si próprio e é excretado, quando expresso separadamente (pistas 1-4, figura 26) . Pode então esperar-se que quando tal polipéptido de fusão é co-expresso com um módulo de cadeia pesada, formar-se-ão as duas principais espécies de proteínas durante um processo de produção potencial: (1) a proteína de fusão Fab-scTRAIL consistindo de duas cadeias de polipéptido e (2) como contaminação uma proteína de fusão cadeia leve-scTRAIL sem um domínio Fab funcional. Assim, prefere-se a fusão do módulo de cadeia pesada em posição N-terminal relativamente ao módulo scTNF-SF para a expressão, de modo a evitar esta desvantagem técnica.

Apresenta-se na figura 28 uma análise funcional de proteínas de fusão recombinantes da invenção scTRAIL compreendendo Fab com o módulo de cadeia pesada fundido em posição N-terminal relativamente ao módulo scTRAIL (Fab-scTRAILR2-SNSN ou Fab-scTRAILwt-SNSN). Como etapa de purificação final, usou-se cromatografia de exclusão de tamanho tal como exemplificado nas figuras 19 e 20.

Pode conseguir-se facilmente uma bioactividade superior comparativamente a ligandos homotriméricos solúveis através do uso de um ligando da superfamília TNF reticulado artificialmente ou ligado a membrana. Assim, o enriquecimento local de construções TRAIL em cadeia simples (scTRAIL) em células que expressam o antigénio Her2 através do fragmento Fab selectivo para Her2 ("Pertuzumab") fundido com estas proteínas scTRAIL deve aumentar a sua bioactividade citotóxica. De igual modo, o bloqueamento dos locais de ligação de Her2 em células por pré-incubação com o fragmento Fab específico para Her2 (Pertuzumab-Fab) deve diminuir apenas a bioactividade citotóxica de proteínas de fusão Fab-scTRAIL. Tal como apresentado na figura 28A, as construções scTRAIL induzem a morte de células HT1080, dado que a viabilidade diminui com o aumento da concentração de proteína. Assim, a pré-incubação de células HT1080 com o fragmento Fab (Pertuzumab-Fab), seguida por co-incubação com as construções Fab-scTRAIL (Fab-scTRAILR2-SNSN ou Fab-scTRAILwt-SNSN) durante a noite, diminuiu a actividade citotóxica das construções Fab-scTRAIL (figura 28B), enquanto Fab apenas não induziu qualquer morte celular.

Pode conseguir-se um efeito técnico aumentado pelo uso de ligandos da superfamília TNF reticulados artificialmente ou ligados a membrana resultando especialmente em bioactividade superior comparativamente a ligando homotrimérico solúvel.

Assim, o enriquecimento local de ligandos ou ligandos em cadeia simples, tal como exemplificado por TRAIL em cadeia simples (scTRAIL), em células ou em células vizinhas deve aumentar a bioactividade destas proteínas de fusão. 0 enriquecimento local (ou direcção ao alvo) destes ligandos em cadeia simples pode ser induzido especificamente, por exemplo por fusão de ligandos em cadeia simples com sequências de aminoácidos que se ligam a qualquer antigénio presente em células, tais como por exemplo células de tumor. Os exemplos de sequências de ligação de antigénio podem ser derivados de anticorpos tais como fragmentos scFv ou Fab. Os exemplos de antigénios expressos em células alvo podem ser receptores tais como da família EGFR ou qualquer outro antigénio para o qual se possa gerar um anticorpo de ligação. Neste contexto, são de especial interesse os antigénios de superfície celular específicos para tumor ou células de cancro. 7.2.2

Noutra concretização, o polipéptido de fusão da invenção compreende adicionalmente um fragmento de anticorpo scFv no terminal N ou no terminal C (figura 9B).

Nesta concretização podem usar-se ligantes 5-7, tal como descritos anteriormente. Adicionalmente os ligantes podem compreender motivos de glicosilação em N.

Um fragmento Fv em cadeia simples-pertuzumab preferido para fusão à proteína de fusão de citocina em cadeia simples pode compreender os aminoácidos Glul-Serll9 de SEQ ID NO: 33 e Asp-Lysl07 ou Thrl09 de SEQ ID NO: 34. Os fragmentos VH e VL podem estar ligados através de um ligante.

Apresenta-se uma concretização de um domínio scFv de pertuzumab na seguinte SEQ ID NO: 36:

1 METDTLLLWV LLLVWFAGNG EVOLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT'DYTMDWVRQA

61 PGKGLEWVAD VNPNSGGSIY NQRFKGRFTL SVDRSKNTLY

LQMNSLRAED TAVYYCARNL

121 GPSFYFDYWG QGTLVTVSSG GGGSGGGGSG GGGSDIQMTQ SPSSLSASVG DRVTiTCKAS

181 QDVSIGVAWY QQKPGKAPKL LIYSASYRYT GVPSRFSGSG SGTDFTLTÍS SLQPEDFATY 241 YCQQYY1YPY TFGQGTKVEI KRT—

Os aminoácidos 1-20 (sublinhados) constituem o péptido de sinalização de excreção N-terminal. 7.2.3

Numa concretização adicional, o polipéptido de fusão da invenção compreende um fragmento de anticorpo Fc adicional N-terminal ou C-terminal (figuras 10 e 11).

De preferência, o domínio de fragmento de anticorpo Fc é derivado de uma cadeia pesada de imunoglobulina G humana, em particular de uma cadeia pesada de imunoglobulina IgGl humana. Numa concretização especialmente preferida, apresenta-se a sequência de aminoácidos do domínio Fc em SEQ ID NO: 37. 1 KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW .

61 YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTiS

121 KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV

181. LDSPGSFFLY SKLTVDKSRW QGGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK

Os aminoácidos Lysl-Glul6 definem a região de dobra.

Para uma fusão no terminal C (figura 11) o domínio Fc compreende de preferência o domínio constante completo (aminoácidos 17-230 de SEQ ID NO: 37) e uma parte da região de dobra ou a região de dobra completa, e.g. a região de dobra completa ou a região de dobra com início no aminoácido Asp4.

Os ligantes preferidos para ligar o fragmento de anticorpo Fc C-terminal (e.g. figura 11) apresentam-se seguidamente:

Ligante 8 scCCD95L/scTRAIL____GG (P/S) a (GS) b (G/S) c KSCDKTHTCPPCPAPE. . . (a=0 ou 1; b=0-8; c=0-8)

Ligante 9 scCD95L/scTRAIL____GG (P/S) a (GSSGS) bGS (G/S) cDKTHTCPPCPAPE. . . (a=0 ou 1; b=0-8; c=0-8)

Ligante 10 scCD95L/scTRAIL____GG (P/S) a (S) b (GS) c (G/S) d DKTHTCPPCPAPE. . . (a=0 ou 1; b=0-8; c=0-8; d=0-8)

Todos os ligantes têm inicio com GlyGly tendo contudo em consideração que o aminoácido C-terminal de TRAIL é uma Gly. Alternativamente, na posição 3 do ligante, está presente Pro ou Ser. O ligante 8 compreende a cisteina Cysl da cadeia pesada.

Deve salientar-se que os ligantes 8-10 são também adequados para a fusão C-terminal de outros polipéptidos, e.g. uma proteína de fusão scTNF-SF adicional.

Detalhadamente, o módulo scTRAILwt (SEQ ID NO: 28), o módulo scTRAIL(específico para R2) (SEQ ID NO: 29) e o módulo scCD95L (SEQ ID NO: 27) são fundidos em posição N-terminal ao domínio Fc de IgGl humana, com início em Asp4 de SEQ ID NO: 37 usando quatro elementos ligantes, tal como apresentado na tabela 2.

Tabela 2: Sequências de ligação do domínio Fc no terminal C ao módulo scTNF-SF. O aminoácido N- terminal do domínio CH2 de IgGl está sublinhado. A glicina N-terminal da sequência ligante apresenta-se entre parêntesis. Para as proteínas TNF-SF com uma glicina como o aminoácido C-terminal (e.g. TRAIL), a glicina N-terminal da sequência de ligação pertence formalmente ao módulo scTNF-SF.

Para purificação e caracterização, colocou-se uma Strep-tag II (sequência de aminoácidos WSHPQFEK) em posição C-terminal relativamente ao domínio Fc. Este marcador de afinidade foi ligado ao domínio CH3 através de um elemento ligante flexível (sequência de aminoácidos SSSSSSA), substituindo o resíduo de lisina C-terminal da sequência CH3. As sequências de aminoácidos das proteínas de fusão scTNF-SF, bem como as relativas aos módulos de proteína descritos, foram traduzidas reversamente e optimizou-se a sua utilização de códão para expressão baseada em células de mamíferos. A síntese génica foi efectuada por ENTELECHON GmbH (Regensburg, Alemanha). As cassetes de expressão para as proteínas de fusão maiores foram montadas por procedimentos de clonagem comuns iniciando com módulos de ADN de tamanho adequado e padrão de enzimas de restrição adequado. Como exemplo, a cassete génica resultante para a proteína de fusão TRAILwt FC01 em cadeia simples (scTRAILwt-FCOl) apresenta-se em SEQ ID NO: 44 e a sequência de proteína codificada apresenta-se em SEQ ID NO: 43. As cassetes génicas que codificam as variantes de ligantes encurtadas (tabela 1) foram geradas por PCR com base em estratégias de subclonagem, iniciando com SEQ ID NO: 44. As cassetes de expressão finais foram libertadas dos vectores de clonagem intermediários e subclonadas para o esqueleto pCDNA4-HisMax, usando os locais únicos Hind-III, Not-I ou Xba-I do plasmídeo. Para a montagem das proteínas de fusão Fab e Fc, introduziu-se um local SgS-I único no esqueleto do vector, substituindo o local Not-I. Todas as cassetes de expressão foram verificadas rotineiramente por sequenciação de ADN. As proteínas foram expressas transitoriamente em células HEK293T e monitorizaram-se os sobrenadantes de cultura celular relativamente à sua actividade pró-apoptótica. Tal como apresentado na figura 27, as proteínas de fusão scTRAIL-Fc da invenção foram capazes de induzir um aumento acentuado na actividade de caspase, confirmando a potência da dimerização baseada em Fc de dois módulos scTRAILwt. Obtiveram-se resultados similares para proteínas de fusão scTRAIL(específicas para R2)-Fc (dados não apresentados).

Caso se funda um fragmento de anticorpo Fc ao terminal N de uma proteína de fusão scTNF-SF (conforme a figura 10) , a sequência de aminoácidos do módulo Fc é de preferência tal como apresentada em SEQ ID NO: 38:

1 METDTLLLWV LLLWVPAGNG DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT 61 CVWDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK - 121 CKVSNKALPA PEKT1SKAK GQPREPGVYT LPPSREÈMTK .

NQVSLTCLVK GFYPSDÍAVE 181 WESNGQPENN YKXTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS ;

241 LSLSPG

Os aminoácidos 1-20 (sublinhados) constituem um péptido de sinalização de excreção N-terminal.

Para ligar o módulo Fc à proteína de fusão ScTNF-SF, usam-se de preferência ligantes Gly/Ser. Todos os ligantes iniciam de preferência com uma serina e terminam de preferência com glicina ou serina. Apresentam-se seguidamente as sequências dos ligantes 11-12 preferidos: 11. ((S)a(GS)bG(S)c (a, b =0,1-6; c=0 ou 1) 12. S(GGGS) aGb (S)c (a, b =0,1-6; c=0 ou 1) 7.3 Dimerização das proteínas de fusão em cadeia simples da invenção 7.3.1 Polipéptidos de fusão em cadeia simples compreendendo um domínio adicional

As proteínas de fusão triméricas da invenção podem ser dimerizadas adicionalmente.

Numa concretização, obter-se-á dimerização caso se ligue directamente o terminal C de uma primeira proteína de fusão ao terminal N de uma segunda proteína de fusão através de uma estrutura ligante tal como aqui definida (figura 12).

Noutra concretização, pode ligar-se uma proteína de fusão da invenção compreendo um fragmento de anticorpo Fab como um domínio adicional através de um ligante tal como aqui definido directamente com uma proteína de fusão adicional da invenção ou indirectamente através de um fragmento de anticorpo scFv fundido a uma proteína de fusão adicional da invenção (figura 13) . Assim, consegue-se dimerização das proteínas de fusão triméricas da invenção.

Noutras concretização, pode obter-se dimerização de trímeros através da montagem de duas proteínas de fusão da invenção compreendendo um fragmento de anticorpo Fab como um domínio adicional (figura 14) . Neste caso, formam-se pontes dissulfureto intermoleculares.

Para a construção de fragmentos Fab N-terminais de dimerização para o domínio scTNF-SF (e.g. figura 14), usam-se de preferência os resíduos de cisteína naturais da região de dobra de IgG (SEQ ID NO: 35).

De preferência, a cisteína C-terminal da sequência de Fab corresponde ao resíduo Cl da região de dobra, que forma uma ligação dissulfureto com a cadeia leve. A segunda cisteína C2 pode ser usada para a ligação covalente de dois módulos Fab. Um terceiro resíduo de cisteína C3 pode ser aberto ou ligado ao C3 da cadeia vizinha. Os ligantes preferidos entre a sequência de cadeia pesada de Fab e o terminal N do domínio scTNF-SF são os ligantes 13-22 tal como apresentados seguidamente. 13. DKTHTÇPGSS(GS)aG(S) b 14. DKTHTCPGSSaG (S) b 15. DKTHTC(GSSGS)aGSG(S)b 16. DKTHTCGSS(GS)aG(S) b 17. DKTHTCGSSaG(S) b 18. DKTHTC (GSSGS)aGS(G)b 19. DKTHTCPPCPGSSGSGSGS(G)b 20. DKTHTCPPCP (GSSGS) aGS (G) b 21. DKTHTÇPPÇPGSS (GS)aGS(G) b 22. DKTHTCPPCPGSSaGS (G) b

Adicionalmente, os ligantes podem ser modificados por incorporação de motivos de glicosilação em N, tal como descrito anteriormente.

Numa concretização adicional, a dimerização das proteínas de fusão da invenção compreendendo um fragmento de anticorpo Fc como um domínio N-terminal e/ou C-terminal adicional pode ser obtida pela formação de pontes dissulfureto intermoleculares entre duas das referidas proteínas de fusão. Nesse caso, apenas está presente um fragmento de anticorpo Fc por dímero de uma proteína de fusão trimérica. Assim, contrariamente às proteínas de fusão de fragmento de anticorpo Fc da especialidade, a formação de agregados de elevado peso molecular não é muito provável. 7.3.2 Polipéptidos de fusão em cadeia simples compreendendo uma pluralidade de dominios adicionais 0 polipéptido de fusão em cadeia simples pode compreender um ou mais domínios adicionais, e.g. um fragmento de anticorpo adicional e/ou um domínio de direcção ao alvo adicional e/ou um domínio de citocina adicional.

Uma proteína de fusão da invenção compreendendo um fragmento de anticorpo Fc como um domínio adicional pode ser ligada a um fragmento de anticorpo Fab ou scFv adicional através do terminal N de um fragmento de anticorpo Fc fundido ao terminal N (figura 15) ou directamente através do seu terminal N através de uma estrutura ligante adicional (figura 16), caso o fragmento de anticorpo Fc esteja ligado à proteína de fusão da invenção através do seu terminal C.

Além de um fragmento de anticorpo adicional ou em vez do fragmento de anticorpo adicional, pode ligar-se uma citocina adicional, de preferência uma interleucina, à proteína de fusão. Assim, é possível obter uma combinação de um scCD95L agonista e de uma molécula de scCD95L antagonista ou alternativamente combinações de scTRAIL (específico para Rl) e scTRAIL (específico para R2).

As referidas proteínas de fusão são especialmente úteis para a indução de apoptose.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Apogenix GmbH <120> Moléculas de TNFSF em cadeia simples <130> scl <140> PCT/EP200 9/ <141> 2009-07-18 <160> 53

<170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 205 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <223> LTA humana <400> 1

Met Thr pro Pro Glu Arg Leu Phe Leu Pro Arg val cys Gly Thr Thr IS 10 15

Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu val Leu Leu Pro Gly Ala 20 25 30

Gin Gly Leu Pro Gly val Gly Leu Thr Pro 5er Ala Ala Gin Thr Ala 35 40 45

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Ala His Leu lie Gly Asp Pro Ser· Lys Gin Asn ser Leu Leu Trp Arg 65 70 75 60

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Leu Tyr Leu Ala His Glu val Gin Leu Phe ser ser Gin Tyr Pro phe 130 13S 140

His val Pro Leu Leu ser ser Gin Lys Met val Tyr pro Gly Leu Gin 145 150 15 S 160

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Gin Gly Asp Gin Leu Ser Thr His Thr Asp Gly lie pro His Leu val 180 185 190

Leu Ser Pro Ser Thr val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu 195 200 205

<210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <223> TNFa humana <400> 2

Met ser Thr Glu Ser Met lie Arg Asp val Glu Leu Ala Glu Glu Ala IS 10 15

Leu pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gin Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe 20 25 30

Leu ser Leu Phe Ser Phe Leu lie val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe 35 40 45 cys Leu Leu His phe Gly val lie Gly pr° Glu Arg Glu Glu Phe pro 50 55 60

Arg Asp Leu Ser Leu lie Ser Pro Leu Ala Gin Ala Val Arg Ser ser 65 70 7 S 80

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Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu 100 105 110

Leu Ala Asn Gly val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu val val Pro Ser 115 120 125

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Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 180 185 190 pro lie Tyr Leu Gly Gly val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 195 200 205

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Gin Val Tyr phe Gly lie ile Ala Leu 225 230

<210> 3 <211> 244 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <223> LTA humana <220> <221> MISC_FEATURE <223> LTB humana <400> 3 Q Gly Gly Arg Leu Gin Gly Arg Met Gly Ala Leu Gly Leu Glu GW * M lO 15 1 5 . riv Ala Thr Ser Leu val Thr Leu

Gly ser Leu Leu Leu Ala Val Ala * 30 20 i I on Ala val Leu Ala Leu val Pro Leu Leu Ala val Pro lie Thr val Le 45 35 40 e1, asp Gin Gl, Gly Leu Val Thr Glu Thr Ala Asp Pro Gly Ala Gin 50 55 n „i_ I ws Leu Pro Glu Glu Glu Pro Glu

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Leu Lys Gly Girt Gly Leu Gly Trp Glu Thr Thr Lys Glu Gin Ala Phe 100 105 AJ·

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Ala Pro Pro Gly Gly Gly Asp Pro Gin Gly Arg Ser val Thr Leu Arg 145 ISO 155 160 ser ser Leu Tyr Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Pr0 Thr Çíf GlU 165 170

Leu Leu Leu Glu Gly Ala Glu Thr vai Thr Pro Vai Leu Asp Pro Ala 180 185 190

Arg Arg Gin Gly Tyr Gly pro Leu Trp Tyr Thr Ser vai Gly Phe Gly 195 200 205

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His Pro Asp Met vai aso Phe Ala Arg Gly Lys Thr Phe Phe Gly Ala 22S 230 235 240 val Met Vai Gly

<210> 4 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <223> 0X40L humana <400> 4

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Leu Lys Lys val Arg Ser val Asn Ser Leu Met val Ala ser Leu Thr 130 135 140

Tyr Lys Asp Lys val Tyr Leu Asn val Thr Thr Asp Asn Thr ser Leu 145 150 I55 160

Asp Asp Phe His val Asn Gly Gly Glu Leu He Leu lie His Gin Asn 165 170 i/5

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<210> S <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <223> CD40L humana <400> 5

Met lie Glu Thr Tyr Asn Gin Ttir ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Giy 15 10 IS

Leu Pro He Ser Met Lys lie Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 lie Thr Gin Met lie Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45

Arg Leu Asp Lys lie Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp phe val 50 55 60 phe Met Lys Thr lie Gin Arg cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu ser 65 70 75 80

Leu Leu Asn cys Glu Glu lie Lys ser Gin Phe Glu Gly Phe Val Lys 7 85 90 95

Asp lie Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn ser Phe Glu 100 105 110

Met Gin Lys Gly Asp Gin Asn Pro Gin lie Ala Ala His val He Ser 115 120 !25

Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr ser Val Leu Gin Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 1^0

Tyr Tyr Thr Met ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin 145 150 155 160

Leu Thr val Lys Arg Gin Gly Leu Tyr Tyr lie Tyr Ala Gin Val Thr . r1l, .Ί„ cnr r,ln Ala Pro Phe lie Ala ser

Phe Cys Ser ash Arg Glu Ala ser ser Gin »'· jão 180 185 . a— Dko rin Ara He Leu Leu Arg Ala

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Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro cys G y 220 210 215 - . , , . fi« Ala ser Val phe Val Asn

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Gly Leu Leu Lys Leu 260 <210> 6

<211> 281 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CD95L humana <4 0 0> 6

Met Gin Gin Pro Phe Asn τyr pro Tyr pro Gl»1 11 e Tr^ As^ 15 10

Ser Ser Ala ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Tlir Va1 Pr° CyS 20 25 30 pro Thr ser val pro Arg Arg pro Gly Gin Arg Arg Pro Pro Pro Pro 35 40 45 pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro pro Pro Pro Pro Leu Pro 50 55 60 pro Leu pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly 65 70 75 80

Leu Cys Leu Leu val Met Phe Phe Met val Leu val Ala Leu Val Gly 85 90 95

Leu Gly Leu Gly Met Phe Gin Leu Phe His Leu Gin Lys Glu Leu Ala 100 105 110

Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gin Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu 115 120, 125

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Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr ser Ala Asp His 9 245 250 255

Leu Tyr val Asn Val ser Glu Leu Ser Leu val Asn Phe Glu Glu ser 260 265 270

Gin Thr phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 280

<210> 7 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> CD27L humana <400> 7

Met Pro Glu Glu Gly ser Gly Cys ser Ar9 Arg ΡΓΟ Τ^Γ 1 5 10 15

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Leu Ala Arq Glv asp Thr Leu cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu

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<210> 8 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <223> CD30L humana <400> 8

Men Asp Pro Gly Leu Gin Gin Ala Leu Asn Gly Met Ala Pro Pro Gly 1 s 10 15

Asp Thr Ala Met his Val pro Ala Gly ser Val Ala ser His Leu Gly 20 25 30

Thr Thr ser Arg ser Tyr Phe Tyr Leu Thr Thr Ala Thr Leu Ala Leu 35 40 45

Cys Leu Val Phe Thr val Ala Thr lie Met val Leu Val val Gin Arg 50 55 60

Thr Asp Ser He Pro Asn Ser Pro asp Asn val pro Leu Lys Gly Gly 65 70 75 80

Asn Cys ser Glu Asp Leu Leu cys lie Leu Lys Arg Ala Pro Phe Lys 85 90 95

Lys Ser Trp Ala Tyr Leu (Jin Val Ala Lys His Leu Asn Lys Thr Lys 100 105 110

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Gly Asn Leu val lie Gin Phe Pro Gly Leu Tyr Phe lie xle cys Gin 130 135 140

Leu Gin Phe Leu val Gin Cys Pro Asn Asn ser Val Asp Leu Lys Leu 145 150 155 160

Glu Leu Leu lie Asn Lys His lie Lys Lys Gin Ala Leu Val Jhr val 165 170 175

Cys Glu Ser Gly Met Gin Thr Lys His Val Tyr Gin Asn Leu Ser Gin 180 185 190

Phe Leu Leu Asp Tyr Leu Gin Val Asn Thr Thr He Ser Val Asn val 195 200 205

Asp Thr Phe Gin Tyr lie Asp Thr ser Thr phe Pro Leu Glu Asn Val 210 215 220

Leu ser lie Phe Leu Tyr Ser Asn Ser Asp 225 230

<210> 9 <211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <223> CD137L humana <400> 9

Met Glu Tyr Ala ser Asp Ala ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro 15 10 15

Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu val 20 25 30

Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala cys Ala val Phe 35 40 45

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Gly Gin Arg Leu Gly val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His

210 215 22U

Ala Trp Gin Leu Thr Gin Gly Ala Thr val Leu Gly Leu Phe Arg val 225 230 235 240

Thr Pro Glu He Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg ser Glu 245 250

<210> 10 <211> 281 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <223> TRAIL humano <400> 10

Met Ala Met Met Glu val Gin Gly cly Pro ser Leu Gly Gin Thr cys 1 5 10 15 val Leu lie val He Phe Thr val Leu Leu Gin Ser Leu Cys val Ala 20 25 30

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Tyr ser Lys Ser Gly lie Ala cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 50 55 60

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Leu Val Arg Glu Arg Gly pro Gin Arg val Ala Ala His lie Thr Gly 115 120 125

Thr Arg Gly Arg ser Asn Thr Leu ser ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu 130 135 140

Lys Ala Leu Gly Arg Lys lie Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg ser Gly 145 ISO 155 160

His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu val He 165 170 175

His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr lie Tyr ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe 180 185 190

Gin Glu Glu lie Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met val Gin 195 200 205

Tyr lie Tyr Lys Tyr Thr ser Tyr pro Asp Pro lie Leu Leu Met Lys 210 215 220 ser Ala Arg Asn ser cys Trp ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr 225 230 235 240

Ser lie Tyr Gin Gly Gly lie Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg lie 245 250 255 phe val Ser val Thr Asn Glu His Leu lie Asp Met Asp His Glu Ala 260 265 270

Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 275 280

<210> 11 <2H> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <223> RANKL humano <400> 11 A«B Tvr Thr uvs Tyr Leu Árg Gly Ser Glu Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr inr y l5 15

Glu mt Gly Gly G!y Pro Gly Ala Pro His slu «1* "· ^ *1» 20 " pro Pro pro Pro Ala Pro His Gin Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met 35 . 40

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Glu Ala Gin Pro Phe Ala His Leu Thr lie Asn Ala Thr Asp lie Pro

Ser Glv Ser His Lys val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly * 180 185 190

Tpd Ala Lys lie ser Asn Met Thr phe ser Asn Gly Lys Leu lie Val P 195 200 205

Asn Gin Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn lie cys Phe Arg His 210 215 220

His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr clu Tyr Leu Gin Leu Met Val 225 230 235 2*°

Tyr val Thr Lys Thr Ser He Lys He Pro Ser ser His Thr Leu Met 7 245 250 255

Lys Gly Gly ser Thr Lys Tyr Trp ser Gly Asn ser Glu Phe His Phe 260 265 270

Tyr ser lie Asπ val Gly Gly phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu 275 280 265 lie Ser lie Glu val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gin Asp 290 295 300

Ala Thr TVr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp lie Asp 305 310 315

<210> 12 <211> 249 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <223> TWEAK humana <4 Ο 0> 12

Met Ala Ala Are Ar, ser Gin Ar„ Ar. Arg Gly Arg Arg Gly clu Pro 1 5

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ser Leu ser Ala Gin du Pro Ala Gin Glu Glu Leu val Ala Glu Glu SO asp Gin asp Pro 5er Glu Leu Asn Pro Gin Thr Glu Glu ser Gin asp 65 70 75

Pro Ala Pro Phe Leu Asn Arg Leu val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro 85 90 95

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Leu Lys Leu Asp Leu Leu val Asp Gl^ val Leu Ala Leu Arg cys Leu

Glu Glu Phe ser Ala Thr Ala Ala ser Ser Leu Gly Pro Gin Leu Arg 195 200 205

Leu Cys Gin Val Ser Gly ueu Leu Ala Leu Arq Pro Gly Ser Ser Leu 210 215 220

Arg lie Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala Pro phe Leu 225 230 235 240

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<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <223> APRIL_ver1 humana <400> 13

Met pro Ala ser Ser Pro Phe Leu Leu Ala ΡΓΟ Lys Gly pro pro Gly 1 5 10 15

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Leu Ser Trp Gly Ala Ala Leu Gly Ala Val Ala cys Ala Met Ala Leu 35 40 45

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Leu Gin Gly Thr Gly Gly Pro ser Gin Asn Gly Glu Gly Tyr Pro Trp

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Asp Asp ser asp val Thr Glu Val Met Trp Gin Pro Ala Leu Arg Arg 130 135 140 gly Arg Gly Leu Gin Ala Gin Gly Tyr Gly Val Apg lie Gin Asp Ala 145 150 155 160 gly val Tyr Leu Leu Tyr ser Gin Val Leu Phe Gin asp val Thr Phe 165 170 175 thr Met Gly Gin val val Ser Arg 6lu Gly Gin Gly Arg Gin Glu Thr 180 185 190

Leu Phe Arg Cys lie Arg Ser Met PrO Ser His Pro ASD Are Ala Tyr 195 200 205

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Leu Ser Val He lie Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu ser Pro 225 230 235 240

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<210> 14 <211> 250 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <223> APRIL-ver2 humana <4 0 0> 14

Met Pro Ala Ser ser Pro Phe Leu Leu Ala Pro Lys Gly pro Pro Gly 15 10 15

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Leu Ser Trp Gly Ala Ala Leu Gly Ala val Ala cys Ala Met Ala Leu 35 40 45

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<210> 15 <211> 285 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> BAFF humana <4 Ο 0> 15

Met Asp asp ser Thr Glu Arg Glu Gin Ser Arg Leu Thr ser Cys Leu 15 10 15

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<210> 16 <211> 240 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> LIGHT humana <4 Ο 0> 16

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Gin Gly Ala Gin Arg Ser Ser Trp Lys Leu Trp Leu phe Cys ser lie 20 25 30

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<210> 19 <211> 391 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <223> EDA-A1 humana <4 0 0> 19

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20 25 BO

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<210> 20 <211> 389 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <223> EDA-A2 humana <400> 20

Met Gly Tyr Pro Glu Vai Glu Arg Arg Glu Leu Leu Pro Ala Ala Ala 1 5 10 15 pro Arg Glu Arg Gly ser Gin Gly cys Gly cys Gly Gly Ala pro Ala

20 25 ÍV

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Gly Gly ser Gly Ser Gly <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> ligante <400> 23

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Gly Gly ser Gly Asn Gly ser Gly 1 5 . <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> ligante <400> 25

Gly Gly Asn Gly ser Gly Sêp Gly 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <2 0 0> <223> ligante <400> 26

Gly Gly Asn Gly Ser Gly 1 5 <210> 27 <211> 472 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> proteína de fusão scCD95L <4Ο0> 27

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Leu Thr Gly Lys ser Asn ser Arg ser Met pro Leu Glu Trp Glu Asp 325 330 335

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Glu Asn Asp Arg lie Phe val ser val Thr Asn Glu Arg Leu Leu Gin 165 170 175

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Gly Arg Ser Asn Thr Leu ser ser pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala 210 215 220

Leu Gly Arg Lys He Asn ser Trp Glu Ser ser Arg ser Gly His Ser 225 230 235 240 phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu val lie His Glu 245 250 255

Lys Gly Phe Tyr Tyr lie Tyr ser Gin Thr cln Phe Lys Phe Arg Glu 260 265 270

Glu lie Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr lie 275 280 285

Tyr Lys Tyr Thr ser Tyr Pro asp Pro lie Leu Leu Met Lys Ser Ala 290 7 295 300

Arg Asn ser cys τρρ ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser lie

305 310 315 32D

Typ Gin Gly Gly xle Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg He Phe val 325 330 335

Ser val Thr Asn Glu Are Leu Leu Gin Met Asp His Glu Ala Ser Phe 340 345 350

Phe Gly Ala Phe Leu val Gly Gly Ser Gly Xaa Gly Xaa Gly Ser Arg 355 360 365 val Ala Ala His He Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu ser 370 375 380

Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys lie Asn Ser 385 390 395 400

Trp Glu Ser Ser Arg ser Gly His ser phe Leu Ser Asn Leu His Leu 405 410 415

Arg Asn Gly Glu Leu Val lie His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr lie Tyr 420 425 430

Ser Gin Thr Gin Phe Lys Phe Arg Glu Glu lie Lys Glu Asn Thr Lys 435 440 445

Asn Asp Lys Gin Met val Gin Tyr He Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro 450 455 460

Asp Pro lie Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys 465 470 475 480

Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr ser lie Tyr Gin Gly Gly lie Phe Glu 485 490 495

Leu Lys Glu Asn Asp Arg He Phe Val Ser val Thr Asn Glu Arg Leu 500 505 510

Leu Gin Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu val Gly 515 520 525

Gly Pro Gly ser ser ser ser Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gin Phe 530 535 540

Glu Lys 545 <210> 30 <211> 1452

<212> ADN <213> Artificial <220> <223> sequência de nucleótidos; proteína de fusão scCD95L <400> 30 aagcttgccg ccaccatgga gactgacacc ctgctgttgt gggtcctact gctttgggtc 60 cctgcaggaa atggatccga attgcgtagc gtcgcacate tgacagggaa gtccaacagc 120

agaagtatgc ccctcgaatg ggaggatacc taxgggattg tgctcctttc aggcgtgaaa ISO tacaagaagg gtgggctcgt catcaatgaa actggatrgt acttcgtcta ttcaaaggtt 240 tactttcgtg gtcaatcttg taataacttg cctctcagcc ataaggtcta tatgcgtaac 300 tccaaatacc cacaagacct cgttatgatg gagggtaaga tgatgagrta ctgcaccaca 360 gggcaaatgt gggccaggag tagrtaccrc ggcgcggtgt ttaacctcac tagcgccgat 420 catrtgtacg ttaatgtcag cgagctgtcc ttggtgaact tcgaggaaag ccaaacattc 480 tvtggcttat acaaactcgg tggcagcggt agtggctccg gaagaagcgt cgcacacttg 540 actggcaaat ctaattcccg ttcaatgcct ctggagtggg aagacactta tggcatcgtc 600 ttgctgtctg gtgtaaagta taagaagggt ggcctggtga ttaacgaaac cggcttgtac 660 ttcgtgtata gcaaagtcta cttcagagga cagagctgcà acaacttgcc tctgtcccat 720 aaagtgtata tgaggaatag taaatatcca caggatccag ttatgatgga agggaagatg 780 atgtcgtatt gtacgaccgg ccagatgtgg gctcgcagca gctatctggg tgccgtattc 840 aaettgactt ctgcggatca cctctatgtg aacgtgtccg aattgtcgct ggtgaatttt 900 gaggagtcac agaccttctt cggactctac aagctgggag gcagtggtag tggtagcgge 960 cgctctgtxg ctcatctgac gggaaagagc aactctagga gtatgecgct ggagtgggag 1020 gacacaracg gtatcgtgct gttatccggc gttaagtaca agaaaggcgg attggtcatc 1080 aacgagactg gactctactt tgtctactcg aaggtgtact ttcgcggcca atcctgcaac 1140 aaccttccac tctctcacaa ggtctacatg aggaactcca agtacccaca ggacttggtg 1200 atgatggagg gcaagatgat gagctactgc actaccggac agatgtggge acgatcctcg 1260 taccttggtg ccgtcttcaa cctgacatca gccgaccatc tgtacgtcaa cgtcagcgaa 1320 ctgcctctgg tcaacttcga ggaaagtcag acgttcttcg gtttgtataa gctcggcggt 1380 cctggctcga gtagcagcag ttcagcttgg agtcacccac agttcgagaa gtaataggeg 1440 cgccgctcta ga 14S2 <210> 31 <212> 1650 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência de nucleótidos: proteína de fusão scTRAILwt <400> 31 aagcttgccg ccaccatgga gactgacacc ctgctgtcgt gggtcctact gctttgggtc 60 cctgcaggaa atggacagag agtggctgct cacatcaccg gaactcgggg taggtctaac 120 accctgtcca gcccgaattc taagaacgag aaggctctgg gcaggaagat caactcttgg 180 gagtccagca gatccggrca tagrttcctg tctaacttgc acctgagaaa cggcgagcrg 240 gtgaiccatg agaagggctt ctactacatc tactctcaga cctacttccg ctttcaggag 300 gagatcaagg agaacaccaa gaacgacaag cagatggtgc agcacatcta caagtacacc 360 agctatccag acccaatcct gctgatgaag rccgctagga actcctgttg gagcaaagac 420 gccgagtatg gcctgtatag catctarcag ggaggcatet tcgagetgaa ggagaacgac 480 aggatcttcg tgagcgtcac taatgagcat ctcatcgaca tggaccatga agcctctttc 540 ttcggcgctt tcttagtggg cggttccgga arcggtartg gragtcgcgt cgcggcacat 600 attactggca cccgagggag aagtaatact ttgtcaagtic ccaatagcaa gaatgagaag 660 gccctgggtc gaaagatcaa tagctgggag tcaagtcggt ctggacacag ctttctcagt 720 aatctccatc tccgaaatgg tgaattggtc atacatgaga aggggttcta ttacatctat 780 agccaaactt actttaggtt ccaagaggag attaaggaga acacgaagaa tgataagcag 840 atggttcaat atatttacaa gtacacttcc tatccagacc cgatcttgct tatgaagtca 900 gcccgtaata gctgttggag taaagatgca gaaracggac tctatagtat ttaccaaggt 960 gggatatttg aactcaagga gaatgatcgc atattcgtat ctgcgacaaa cgaacacttg 1020 attgatatgg accacgaagc ragttrctrc ggagcattcc tggtgggcgg aagcggcarc 1080 ggaaregget cragagtagc cgcccacata accgggacaa ggggacgaag caacacgcta 1140 agttctccta actcaaagaa egagaaagea cttggacgta agateaactc ctgggaàagt 1200 tetegtagtg ggcattcctt cctgtccaac ctccacrtga qaaatgggga gcrtgtgatt 1260 cacgaaaagg gattctacta catctactec cagacatact tccgattcca agaggaaatc 1320 aaggagaata ctaagaaega eaaaeagatg gtccagtaca tatacaagta caccteatac 1380 cccgatccca tactgttgat gaaatctgca aggaactctt gctggtcraa ggacgctgag 1440 targggttgt actcgatcta ccagggcgga atttxcgagt tgaaagagaa cgaccgcata 1500 ttcgtgtcag raaccaacga gcacctgata gatatggacc atgaggeate cttctttggt 1560 gccttcctgg tgggcggtcc tggctcgagt ageageagtt cagcttggag tcacccacag 1620 rtcgagaagt aataggegeg cegcgctagc 1650 <210> 32 <211> 1674 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> sequência de nucleótidos: proteína de fusão scTRAILR2 <4Ο0> 32 aagcttgccg ccaccatgga gactgacacc ctgctgttgt gggtcctact gctttgggtc 60 cctgcaggaa atggatcccc tggaagttct tcaagctcta gcagagtggc tgctcacatc 120 accggaactc ggggtaggtc taacaccctg tccagcccga attccaagaa cgagaaggct 180 ctgggcagga agatcaactc ttgggagtcc agcagatccg gtcatagttt cctgtctaac 240 ttgcacctga gaaacggcga gctggtgatc catgagaagg gcttctacta catctactct 300 cagacccagt tcaagtttcg ggaggagatc aaggagaaca ccaagaacga caagcagatg 360 gtgcagtaca tctacaagta caccagctat ecagacccaa tcctgctgat gaagteeget 420 aggaactcct gttggagcaa agaegeegag tatggcctgt atagcateta teagggagge 480 atettegage tgaaggagaa cgacaggatc ttcgtgagcg tcactaatga gaggctgctc 540 cagatggacc atgaagcctc tttettegge getttettag tgggcggttc eggaareggt 600 artggtagtc gcgtcgcggc acatattact ggcacccgag ggagaagtaa tactttgtca 660 agtcccaata gcaagaatga gaaggccctg ggtcgaaaga tcaatagetg ggagtcaagt 720 cggtctggac acagctttct cagtaatctc catctccgaa atggtgaatt ggtcatacat 780 gagaaggggt tttattacat ctatagccaa actcagttta agttccgaga ggagattaag 840 gagaacacga agaatgataa gcagatggtt caatatattt acaagtacac ttcctatcca 900 gacccgatct tgcttatgaa gtcagcccgt aatagctgtt ggagtaaaga tgcagaatac 960 ggactctata gtatttacca aggtgggata tttgaactca aggagaatga tcgcatattc 1020 gtatctgtga caaacgaacg cttgcttcag atggaccacg aagctagttt etteggagea 1080 ttcctggtgg geggaagegg cartggaarc ggetetagag tagccgccca cataaccggg 1140 acaaggggac gaagcaacac getaagttet cctaactcaa agaaegagaa agcacttgga 1200 egtaagatea actcctggga aagrtctcgt agtgggcatt ccttcctgtc caacctccac 1260 ttgagaaatg gggagcttgt gattcacgaa aagggattct actacateta ctcccagaca 1320 cagttcaaat teegagagga aatcaaggag aatactaaga acgacaaaca gatggtccag 1380 tacatataca agtacacctc ataccccgat cctatactgt tgatgaaatc tgcaaggaac 1440 tcttgctggt etaaggaege tgagtatggg ttgtactcga tctaccaggg cggaattttc 1S00 gagttgaaag agaacgaccg catattcgtg tcagtaacca acgagcgcct gttgcagatg 1560 gaccatgagg catccttctt tggtgccttc ctggtgggcg gtcctggctc gagtageage 1620 agttcagctt ggagtcaccc acagttcgag aagtaatagg cgcgccgcgc tage 1674 <210> 33 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> módulo de cadeia pesada (VHCH1) de Fab pertuzumab <4Ο0> 33

Cl» Vil Sin Le» «ml cl» Ser ely Cly Cly Leu vai Gin Pro Giy Cly

J 5 1U

Ser Leu Arg Leu Ser cys Ala aU Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 2S 30

Thr Met Asp Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys 6ly Leu Glu Trp vai 35 40 45

Ala asp vai Asn Pro Asn ser Gly Gly ser lie Tyr Asn Gin Arg Phe 50 5S 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Vai Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 7S 80

Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr cys 85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu vai Thr vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro ser vai Phe 115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140

Gly cys Leu vai Lys Asp Tyr phe pro Glu Pro vai Thr vai Ser Trp 145 150 155 160

Asn ser Gly Ala Leu Thr ser Gly vai his Thr Phe Pro Ala Vai Leu 165 170 175

Gin ser ser Gly Leu Tyr ser Leu Ser ser vai vai Thr vai pro Ser WO 185 190 ser ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Vai Asn His Lys Pro 195 200 205 ser Asn Thr Lys vai Asp Lys Lys vai Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 <210> 34 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> módulo de cadeia leve (VLCL) de Fab pertuzumab <400> 34

Asp He Gin Met Thr Gin ser pro ser ser Leu ser Ala ser vai Gly 15 10 15

Asp Arg val Thr IIe Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Vai Ser Ile Gly 20 2S 30 val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys pro Gly Lys Ala pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly val Pro Ser Arg Phe ser Gly 50 55 60 ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr rle Ser ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr Tyr lie Tyr pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Ghi Gly Thr Lys val Glu ile Lys Arg Thr val Ala Ala

Pro Ser val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu ivs ser clv

115 120 i2S Υ Y

Thr Ala ser val val Cys Leu Leu Asn Asn phe Tyr ργο Ara Glu Ala 130 135 140 9

Lys val Gin Trp Lys val Asp Asn Ala Leu Gin ser Gly Asn ser cln 145 ' 150 155 i60

Glu Ser val Thr Glu Gin Asp Ser Lys asp Ser Thr Tyr ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

Ιβο 185 J

Ala cys g^u val TV His Gin Gjjj Leu Ser ser Pro val Thr Lys Ser

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 35 <211> 16

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> região de dobra de IGG1 humana <4Ο0> 35

Lys ser Cys Asp Lys Thr His Thr cys pro Pro Cys pro Ala Pro Glu IS 10 15 <210> 36 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> módulo scFv de pertuzumab <4Ο0> 36

Met Glu Thr Asp jhr Leu LeU LeU Trp LeU LeU LeU ΤΓΡ if1 ΡΓ0 .-1 rlv Asn Gly Glu val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val

Ala b,y 20 25 30 pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu ser cys Ala Ala ser Gly Phe Thr

Gin Pro 35* 40 4S

Phe *rhr Asp Tyr Thr Met Asp Trp val Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly 50 55 60

Leu Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn ser Gly Gly Ser He Tjjr

Asn Gin Arg Phe l^s Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg ser Lys

Acn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu asp Thr Ala

Asn inr 105 110 ual Tvr Tyr cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr a V 115 120 125 t™ Glv Gin Gly Thr Leu val Thr val ser ser Gly Gly Gly Gly ser ,ΓΗ !3o X3S 140

Gl^ Gly Gly Gly Ser Gl^ Gly Gly Gly Ser Asç lie Gin Met Thr Gin ser pro ser ser Leu ser Ala ser val Gly Asp Arg val Thr lie Thr er 165 170 175 cys Lys Ala ser Gin Asp val ser lie Gly val Ala Trp rjrr Gin Gin

Lvs Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala ser Tyr Arg 7 195 200 205

Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg phe Ser Gly Ser Gly ser Gly Thr Asp 210 215 220

Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu asd Phe Ala Thr Tyr 225 230 235 240

Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr He Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr 7 7 245 250 255

Lys val Glu lie Lys Arg Thr 260 <210> 37 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> parte Fc de IGGl humana (dobra+CH2+CH3) <400> 37

Lys Ser cys Asp Lys Thr His Thr cys Pro Pro cys pro Ala Pro Glu 15 10 15

Leu Leu Gly Gly Pro ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp ' 20 25 30

Thr Leu Met lie Ser Arg Thr pro Glu val Thr cys val Val val Asp

35 40 4S val ser His Glu Asp Pro gIu Val Lys Phe Asn τγρ Tyr val Asp Gly SO 55 60 val Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 65 70 75 80

Ser Thr Tyr Arg val val ser Va1 Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 85 90 95

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val ser Asn Lys Ala Leu Pro 100 105 110

Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 115 120 125

Pro Gin val Tyr Thr Leu pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 130 135 140

Gin val Ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly Phe Tyr pro Ser Asp lie 145 150 155 160

Ala val Glu Trp Glu ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr ; 165 170 175

Thr Pro Pro Val Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys 180 185 190

Leu Thr Val Asp Lys ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 195 s 200 205 ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys ser Leu 210 215 220

Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 38 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Módulo Fc N-terminal com péptido de sinalização <400> 38

Met Glu Thr ASP Thr Leu Leu Leu Trp val Leu Leu Leu Trp val Pro 1 5 10 15

Ala Gly Asn Gly asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 20 25

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser val Phe Leu Phe pro Pro Lys Pro Lys 35 40 45 ASP Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu val Thr cys val Val val 50 55 60

Asp val Ser His Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp gg 70 75 80

Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr Ljjs Pro Arg Glu Glu Gin Tyr

Asn Ser Thr Tyr Arg val val Ser val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 100 105 no

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys Val ser Asn Lys Ala Leu 115 120 125

Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 130 135 140

Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys IAS 150 15 S 160

Asn Gin val ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro ser Asp lie Ala val Glu Trp Glu ser Asn Gl^ Gin Pro Glu Asn A|n Tyr Lys

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr Ser

195 200 20S

Lvs Leu Thr val Asp Lys ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe ser y 210 215 220 cys ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys ser 225 230 235 240

Leu ser Leu Ser pro Gly 245 <210> 39 <211> 265 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> módulo de cadeia pesada de Fab pertuzumab com péptido de sinalização <400> 39

Met Glu Thr asp Thr Leu Leu Leu Trp val Leu Leu Leu Trp val Pro 1 5 10 15

Ala Gly Asn Gly Glu val Gin Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu val 20 25 á0

Gin pro Gly Gly ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala Ser Gly phe Thr 35 40 45

Phe Thr asp Tyr Thr Met Asp Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 50 55 60

Leu Glu Trp val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser He Tyr 65 70 75 80

Asn Gin Arg phe Lys Gly Arg phe Thr Leu Ser val Asp Arg ser Lys 85 90 95

Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala ιδο 105 no

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr 115 120 125

TrD Gly Gin Gly Thr Leu val- Thr val Ser ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 pro ser val Phe pro Leu Ala Pro ser ser Lys Ser Thr ser Gly Gly 145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu val Lys Asp Tyr phe Pro Glu pro Val 165 170 175

Thr val Ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr ser Gly val His Thr Phe 180 185 190 pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu ser Ser val val 19S 200 205

Thr val Pro Ser ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr TYr lie cys Asn val 210 215 220

Acn his lvs Pro ser Asn Thr Lys val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 epr cvs asp Lys Thr His Gly ser Pro Gly Ser ser Ser ser Ser ser ser <-y* J 24S 250 255

Ala Trp ser His Pro Gin phe Glu Lys 260 265 <210> 40 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> módulo de cadeia leve de Fab pertuzumab com péptido de sinalização <400> 40

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15

Gly ser Thr Gly Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser ser Leu ser y 20 2S 30

Ala Ser Val Gly A$p Arg val Thr ile Thr Cys Lys Ala ser Gin Asp 35 40 45 val Ser lie Gly val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys pro Gly Lys Ala pro 50 55 60

Lys Leu Leu lie Tyr ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly val Pro ser 65 70 75 ' 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr

100 los HO ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys val Glu lie Lys Arg 115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser val Phe lie Phe pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 13S 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala ser val val cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys val Gin Trp Lys val Asp Asn Ala Leu Gin ser 165 170 175

Gly Asn ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin ASP Ser Lys Asd Ser Thr 180 18S 30

Tyr ser Leu ser ser Thr Leu Thr Leu ser Lys Ala asd Tyr elu Lys 195 200

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215

Val Thr Lys ser phe Asn Arg Gly Glu cys Gly ser Pro Gly ser Ser 225 230 235 240

Ser ser Ser Ser Ala Trp Ser h1s Pro Gin Phe Glu Lys 245 250 <210> 41 <211> 823 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Módulo de gene de cadeia pesada de Fab pertuzumab <400> 41 aagcttgccg ccaccatgga gactgacacc ctgctgttgt gggtcctacc gctttgggtc 60 cctgcaggta acggtgaagt gcagctcgtc gaaagcggtg gcggactggt teagcccggt 120 ggrcctctgc ggcrgtcttg tgctgcctcg ggrttcacgt tcactgacta cacaatggac 180 tgggtgcgrc aggctcccgg aaagggattg gagtgggtag ccgacgttaa tccaaactcc 240 ggcgggagca tctacaacca gaggttcaag gggaggtcca ctctgagcgt ggatcgrccc 300 aagaacacgc tgtacctcca gatgaactct ctcagggccg aggacacggc tgtrcaccat 360 tgcgcgagga acctgggtcc ttccttctac ttcgactact ggggacaggg aaccctggtg 420 accgtcagct ccgcttctac caagggtcct agtgtgrtcc ctcttgcrcc cagctctaaa 480 agcacctccg gtggaactgc tgctctgggc tgtctggtta aggaccactt ccccgaaccc 540 gtgaccgrat cttggaacrc cggcgcactr acttctggcg tccacacttt cccagccgtc 600 ttacagtcct ctggcctgta txctttgagc agcgtcgtga ccgtgcctag cagtagtctg 660 ggcacccaga cctacatctg caacgtcaac cacaagccta gcaacaccaa ggttgacaag 720 aaggtcgagc ctaagtcgtg cgacaagacg cacggatccc ccggctcgag ttcaagctct 780 tctgcctggr cacatccaca attcgagaag taataggcgc gcc 823 <210> 42 <211> 787 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Módulo de gene de cadeia leve de Fab pertuzumab <400> 42 aagctrgccg ccaccatgga gaccgataca ctgctcttgt gggtactctt gctgtgggtt 60 ccgggatcta ccggtgaeat ccagatgaca caatctccta gcagtctgag cgcaagtgtt 120

ggagatcgtg tcaccatcac atgcaaggcc agccaggatg tgagcattgg agtcgcctgg ISO tãtcagcaga aacccggcaa ggcacccaag ctgctgatcx actcggccag xtacagatac 240 actggcgtac cttcgaggxx tagtggtagc ggttctggaa ccgatttcac cctcaccatt 300 agctccctcc aacccgagga cttcgccacc tactactgcc ageaatacta catctaccct 360 tacacgttcg gccaaggcac taaggtcgag attaaacgta cggtcgcagc tccttccgta 420 ttcatcttcc cacctagcga cgagcagcta aagxctggaa ctgcgtccgt cgtgtgcctg 480 ctcaacaacx tctaccctcg ggaagcgaag gtccagtgga aagcggacaa cgctctccag 540 xccggcaata gccaggaatc cgtgaccgag caggacagca aggattctac ctactcactg 600 tccagcaccc ttacgctgtc caaggccgac tacgagaagc ataaggtgta cgcttgtgag 660 gtgactcacc aaggxccgtç aagccctgxg accaagagct tcaacagagg cgagtgcgga 720 tcccctggct cgagttcaag ctettctgcc tggtcacatc cacaattcga gaagtaatag 780 gcgcgcc 787 <210> 43 <211> 771 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> proteína de fusão scTRAILwt-FC com péptido de sinalização <4Ο0> 43

Met Glu Thr asp Thr ueu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp val Pro X 5 10

Ala Gly ASP Gly G^n Ar9 val Ala Ala His Ile Thr Tt)r Ar® G^y 20 25 30

Apg ser Asn Thr* Leu ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu 35 40 45

Gly Arg Lys lie Asn ser Trp Glu ser ser Arg ser Gly His Ser Phe 50 55 60

Leu ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val lie His Glu Lys 65 70 75 80

Gly Phe Tyr Tyr lie Tyr Ser Gin Thr Tyr phe Arg Phe Gin Glu Glu 85 90 95 lie Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin wet val Gin Tyr lie Tyr 100 105 110

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Gly Ala Phe Leu vai Gly Gly ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Arg vai 180 185 190

Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu ser Ser 195 200 205

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<223> HC-scTRAILwt-SNSN <4Ο0> 45

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Met Glu Thr Asp. Thr Leu Leu Leu Trp val Leu Leu Leu Trp Val pro 1 5 10 15

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Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr lie Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr 340 345 350

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Trp ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr ser lie Tyr Gin Gly Gly 705 710 715 720 lie Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg lie Phe val Ser val Thr Asn 725 730 735

Glu Arg Leu Leu sin Met Asp H-js Glu Ala ser phe Phe Gly Ala Phe 740 745 750

Leu val Gly Gly pro Gly Ser ser ser Ser Ser Ser Ala Trp Ser His 755 760 765

Pro Gin Phe Glu Lys 770 <210> 48 <211> 2347

<212> ADN <213> Artificial <220> <223> Módulo de gene HC-scTRAILR2-SNSN <400> 48 aagcttgccg ccaccatgga gactgacacc ctgctgttgt gggtcctact gctttgggtrc 60 cctgcaggta acggtgaagt gcagctcgte gaaagcggtg gcggactggt tcagcccggt 120 ggttccctgc ggctgtcttg tgctgcctcg ggtttcacgt tcactgacta cacaatggac 180

Tgggtgcgrc aggctcctgg aaagggattg gagtgggtag ccgacgttaa tccaaactcc 240 ggcgggagca tctacaacca gaggttcaag gggaggttca ctccgagcgt ggatcgctcc 300 aagaacacgc tgracctcca gatgaactct ctcagggccg aggacacggc tgtttactat 360 rgcgcgagga acctgggtcc ttccttctac ttcgaccact ggggacaggg aaccctggtg 420 accgtcagct ccgcttctac caagggtcct agtgtgttcc ctcttgctcc cagctctaaa 480 agcacctccg gtggaactgc tgctctgggc tgtctggtta aggactacrt ccccgaaccc 540 gtgaccgtat cttggaactc cggcgcactt acttctggcg tccacacttt cccagccgtc 600 ttacagtcct ctggcctgta ttctttgagc agcgtcgtga ccgtgcctag cagragtctg 660 ggcacccaga cctacatctg caacgtcaac cacaagccta gcaacaccaa ggttgacaag 720 aaggtcgagc ctaagtcgtg cgacaagacg cacggatccc ctggaagttc ttcaagctct 780 agcagagtgg ctgcteaeat caccggaact cggggtaggt ctaacaccct gtccagcccg 840 aattccaaga acgagaaggc tctgggcagg aagatcaact cttgggagtc cagcagatcc 900 ggtcatagtt tcctgtctaa cttgcacctg agaaacggcg agctggtgat ccatgagaag 960 ggcttctact acatetactc tcagacccag ttcaagtttc gggaggagat caaggagaac 1020 aceaagaacg acaagcagat ggtgcagtac atctacaagt acaccagcta tccagaccca 1080 atcccgctga tgaagtccgc taggaactcc tgttggagca aagacgccga gtatggcctg 1140 tatagcatct atcagggagg catcrtcgag ctgaaggaga acgacaggat cttcgtgagc 1200 gtcactaatg agaggctgct ccagatggac catgaagcct ctttcttcgg cgctttctta 1260 gtgggcggtt ccggaagcgg taatggcagt cgcgtcgcgg cacatattac tggcacccga 1320 gggagaagta atactttgtc aagtcccaat agcaagaatg agaaggccct gggtcgaaag 1380 atcaatagct gggagtcaag tcggtctgga cacagctttc tcagtaatct ccatctccga 1440 aatggtgaat tggtcataca tgagaagggg ttctattaca tctatagcca aactcagttt 1500 aagttccgag aggagattaa ggagaacacg aagaatgata agcagatggt tcaararatt 1560 tacaagtaca cttcctatcc agacccgatc ttgcttatga agtcagcccg taatagctgt 1620 tggagtaaag atgcagaata cggactctat agtatttacc aaggtgggat atttgaactc 1680 aaggagaatg atcgcatatt cgtatctgtg acaaacgaac gcttgctica gatggaccac 1740 gaagciagrc tcttcggagc attcctggtg ggcggaagcg gcagtggaaa cggctctaga 1800 gtagccgccc acataaccgg gacaagggga cgaagcaaca cgctaagttc tcctaactca 1860 aagaacgaga aagcacttgg acgtaagatc aactcctggg aaagttctcg tagtgggcat 1920 tccttcctgt ccaacctcca cttgagaaat ggggagcttg tgattcacga aaagggattc 1980 tactacatct actcccagac acagtrcaaa ttccgagagg aaatcaagga gaatactaag 2040 aacgacaaac agatggtcca gtacatatac aagtacacct cataccccga tcctatactg 2100 ttgatgaaat ctgcaaggaa ctcttgctgg tctaaggacg crgagtatgg gttgtactcg 2160 atctaccagg gcggaatttt cgagttgaaa gagaacgacc gcatartcgt gtcagtaacc 2220 aacgagcgcc tgttgcagat ggaccatgag gcatccttct trggtgcctt cctggtgggc 2280 ggtcctggct cgagtagcag cagttcagct tggagtcacc cacagttcga gaagtaatag 2340 gcgcgcc 2347 <210> 49 <211> 773 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> HC-scTRAILR2-SSSS com péptido de sinalização <400> 49

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15

Ala Gly Asn Gly Glu val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val 20 25 30

Gin Pro Gly Gly ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 35 40 45

Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 50 SS 60

Leu Glu Trp val Ala Asp val Asn Pro Asn ser Gly Gly ser lie Tyr 65 70 75 80

Asn Gin Arg Phe Lys Gly Are Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys 85 90 95

Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 100 105 110

Val Tyr Tyr cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro ser Phe Tyr Phe Asp Tyr 115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr val Ser ser Ala ser Thr Lys Gly 130 135 140

Pro Ser val Phe Pro Leu Ala pro ser ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155

Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe P1*® Glu pro val 165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr ser Gly val His Thr Phe 160 185 190

Pro Ala val Leu Gin ser ser Gly Leu TVr ser Leu Ser Ser val val 195 200 205

Thr val pro ser ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He cys Asn val 210 Z15 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys val Asp Lys Lys val Glu pro Lys 225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Gly ser Pro Gly ser Ser Ser ser ser Ser 245 250 255

Arg val Ala Ala His lie Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu 260 265 270

Ser ser Pro Asn ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys lie Asn 275 7 280 285

Ser Trp Glu Ser Ser Arg ser Gly His Ser Phe Leu ser Asn Leu His 290 295 300

Leu Arg Asn Gly Glu Leu val lie His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr lie 305 310 315 320

Tyr Ser Gin Thr Gin Phe Lys Phe Arg Glu Glu lie Lys Glu Asn Thr 325 330 335

Lys Asn Asp Lys Gin wet val Gin Tyr lie Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr 340 345 350

Pro Asp Pro He Leu Leu Met Lys ser Ala Arg Asn ser cys Trp ser 355 360 355

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Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Tie Phe val Ser val Thr Asn Glu Arg 385 390 395 400

Leu Leu Gin Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala phe Leu val 405 410 415

Gly Gly Ser Gly ser Gly ser Gly Ser Arg val Ala Ala His lie Thr 420 425 430 g1v Thr Arg Gly Arg Ser Asn Ttlr Leu Ser Ser Pro Asn Ser LYS Asn y 435 440 445 riu lvs Ala Leu Gly Arg Lys lie Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg ser 450 «55 460

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Gin Tyr lie Tyr Lys Tyr Thr |er Tyr Pro Asp Pro il| Leu Leu Met

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Gly Ser Arg Val Ala Ala His lie Thr Gly Thr Arg Gly Arg ser Asn 595 600 60S rhr Leu Ser Ser Pro Asn ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys 610 615 620

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Leu val Gly Gly Pro Gly ser ser Ser Ser Ser Ser Ala Trp Ser His 755 760 765 pro Gin Phe Glu Lys 770 <210> 50 <211> 2347 <212> ADN <213> Artificial <22 0>

<223> Módulo de gene HC-scTRAILR2-SSSS <4Ο0> 50 aagcttgccg ccaccatgga gactgacacc ctgctgttgt gggtcctact gctttgggtc 60 cctgcaggta acggtgaagt gcagctegtc gaaagcggtg gcggacrggt ccagcccggt 120 ggttctctgc ggccgicttg tgctgcctcg ggtttcacgt tcactgacta cacaarggac 160 tgggtgcgtc aggctcctgg aaagggattg gagtgggtag ccgacgttaa tccaaactcc 240

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Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu τγρ val Leu Leu Leu Trp val Pro 1 5 K io 15

Gly Ser Thr Gly Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser ser Leu Ser 20 25 30

Ala Ser val Gly Asp Arg val Thr He Thr Cys Lys Ala ser Gin Asp 3S 40 45 val ser lie Gly Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60

Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro ser 65 70 * v 80

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Leu Lys ser Gly Thr Ala Ser val val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 iso 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys val Gin Trp Lys val Asp Asn Ala Leu Gin ser 165 170 175

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Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205

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Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met val Gin Tyr lie Tyr Lys 325 330 335

Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro lie Lfeu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn 340 345 350 ser cys Trp ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser lie Tyr Gin 355 360

Gly Gly He Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg lie phe vai Ser Vai 370 375 380

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Lys Gin Met Vai Gin Tyr lie Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro 7 500 505 510 lie Leu Leu Met Lys ser Ala Arg Asn ser cys Trp Ser Lys Asp Ala 515 S20 525

Glu Tyr Gly Leu Tyr ser lie Tyr Gin Gly Gly lie Phe Glu Leu Lys 530 535 540

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Phe Gly Ala Phe Leu val Gly Gly Pro Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser 740 745 ου

Ala Trp ser His Pro Gin Phe Glu Lys 755 760 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência de ligante <400> 52

Gly Ser Gly ser Gly ser Gly ser 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> sequência de ligante <400> 53

Gly ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser 1 5

Lisboa, 2015-04-20

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Polipéptido de fusão em cadeia simples compreendendo: (i) um primeiro domínio de citocina da família TNF solúvel, (ii) um primeiro ligante peptídico, (iii) um segundo domínio de citocina da família TNF solúvel, (iv) um segundo ligante peptídico e (v) um terceiro domínio de citocina da família TNF solúvel, em que o polipéptido de fusão é substancialmente não agregável, em que o domínio de citocina da família TNF solúvel é seleccionado de domínios TRAIL solúveis.
2. 2. Polipéptido da reivindicação 1, em que o segundo e/ou o terceiro domínio de citocina da família TNF solúvel é um domínio encurtado em N-terminal que compreende opcionalmente mutações da sequência de aminoácidos.
3. 3. Polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1-2 em que pelo menos um dos domínios de citocina da família TNF solúveis, particularmente pelo menos um dos domínios de citocina da família TNF solúveis (iii) e (v) é um domínio TRAIL solúvel com uma sequência N-terminal que inicia entre o aminoácido Glnl20 e Vall22 de TRAIL humano e em que Argl21 pode ser substituída por um aminoácido neutro, e.g. Ser ou Gly.
4. 4. Polipéptido da reivindicação 3, em que pelo menos um dos domínios de citocina da família TNF solúveis, particularmente pelo menos um dos domínios de citocina da família TNF solúveis (iii) e (v) é um domínio TRAIL solúvel com uma sequência N-terminal seleccionada de (a) Argl21 - Vall22 - Alal23 e (b) (Gly/Ser) 121-Vall22-Alal23.
5. 5. Polipéptido das reivindicações 3 ou 4 em que o domínio TRAIL solúvel termina com o aminoácido Gly281 de TRAIL humano e/ou opcionalmente compreende uma mutação nas posições R130, G160, Hl 68, R170, H177, Y189, R191, Q193, E195, N199, K201, Y213, T214, S215, H264, 1266, D267 ou D269 ou em duas ou mais das referidas posições.
6. 6. Polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1-5 em que o primeiro e segundo ligantes peptídicos têm independentemente um comprimento de 3-8 aminoácidos, especificamente um comprimento de 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos e de preferência são ligantes de glicina/serina, compreendendo opcionalmente um resíduo de asparagina que pode ser glicosilado.
7. 7. Polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1-6 que compreende adicionalmente um domínio de péptido de sinalização N-terminal, que pode compreender um local de clivagem de protéase e/ou que compreende adicionalmente um elemento C-terminal que pode compreender e/ou ligar-se a um domínio de reconhecimento/purificação.
8. 8. Polipéptido de qualquer uma das reivindicações 1-7 que compreende adicionalmente um domínio adicional N-terminal e/ou C-terminal, e.g. um anticorpo em cadeia simples ou fragmento de anticorpo, tal como um domínio de fragmento Fab ou Fc.
9. 9. Molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido de fusão de qualquer uma das reivindicações 1-8, de preferência em ligação operacional com uma sequência de controlo de expressão.
10. 10. Célula ou organismo não humano transformado ou transfectado com uma molécula de ácido nucleico da reivindicação 9, em que a célula é e.g. uma célula procariótica ou uma célula eucariótica, de preferência uma célula de mamífero ou com maior preferência uma célula humana.
11. 11. Composição farmacêutica ou de diagnóstico compreendendo, como um agente activo, uma proteína de fusão de qualquer uma das reivindicações 1-8 ou uma molécula de ácido nucleico da reivindicação 9, em particular para uso em terapia, mais particularmente na profilaxia e/ou tratamento de doenças causadas, associadas e/ou acompanhadas por disfunção de citocinas TNF, em particular doenças proliferativas, tais como tumores, e.g. tumores sólidos ou linfáticos; doenças infecciosas; doenças inflamatórias; doenças metabólicas; doenças auto-imunes, e.g. doenças reumatóides e/ou artríticas; doenças degenerativas, e.g. doenças neurodegenerativas tais como esclerose múltipla; doenças associadas a apoptose ou rejeições de transplante.