PT1991690E - Método para a produção de oligossacáridos sialilados - Google Patents

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ΡΕ1991690 1 DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE OLIGOSSACARIDOS SIALILADOS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método para a síntese in vivo de oligossacáridos sialilados em grande escala, a cultura de um microrganismo num meio de cultura, compreendendo, opcionalmente, um precursor exógeno tal como a lactose, em que o referido microrganismo compreende genes heterólogos codificando para uma CMP-Neu5Ac sintetase, uma sintase de ácido siálico, uma GlcNAc-6-fosfato 2 epimerase e uma sialiltransferase, e em que os genes endógenos que codificam para a aldolase de ácido siálico (NanA) e para ManNAc cinase (NanK) foram eliminadas ou inactivadas. A invenção também se refere a este microrganismo que é capaz de produzir ácido siálico activado internamente.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) é o membro mais comum da família de ácido siálico de açúcares aminados. Neu5Ac é frequentemente encontrado como um açúcar terminal em hidratos de carbono complexos da superfície celular e desempenha um papel importante em muitos processos biológicos, tais como a adesão celular e ligação 2 ΡΕ1991690 de toxinas e vírus (Varki, 1993) . Neu5Ac também é um componente principal da porção de hidrato de carbono de gangliósidos que são notavelmente abundantes nos tecidos do cérebro e estão envolvidos em diversas patologias (Zhang & Kiechle, 2004) .

Em virtude das suas importantes funções biológicas, oligossacáridos contendo ácido siálico têm atraído um interesse considerável e têm sido desenvolvidos muitos métodos para sintetizar estas estruturas para a investigação fundamental e aplicações terapêuticas potenciais. No entanto, a produção em larga escala de oligossacáridos sialilados não foi conseguida até hoje. Sínteses químicas não são práticos devido aos múltiplos passos de protecção e de desprotecção e uma série de esforços tem sido colocada em métodos enzimáticos e biotecnológicas. As sialiltransferases usam CMP-Neu5Ac como os nucleótidos de açúcar activados e o desenvolvimento de processos eficientes para a síntese enzimática de sialil-oligossacáridos tem sido possível através da identificação de genes bacterianos de sialiltransferase que são bem expressos em E. coli e a concepção de vários sistemas enzimáticos que mimetizam a via natural da biossíntese de nucleótidos de açúcar (Gilbert et al., 1998).

Uma melhoria significativa veio depois da utilização de células bacterianas vivas para sialiloligossacáridos (Priem et al., a partir produzir 2002).

Nesta 3 ΡΕ1991690 abordagem, a sialil-lactose foi produzido directamente por células em crescimento de estirpes de Escherichia coli modificadas metabolicamente que sobre-expressam os genes de Neisseria meningitidis para a-2,3-di-sialilo transferase e para a CMP-Neu5Ac-sintetase. As bactérias foram cultivadas a uma elevada densidade celular com glicerol como fonte de carbono e energia, enquanto que se forneceram lactose e Neu5Ac exógenas como precursores para a síntese de sialil-lactose. Durante o crescimento, a lactose e Neu5Ac foram activamente internalizadas por β-galactósido e Neu5Ac permeases de E. coli. Para evitar o catabolismo de lactose e Neu5Ac, foram usadas as estirpes mutantes desprovidas de actividades de β-galactosidase e aldolase Neu5Ac. A lactose e a Neu5Ac acumularam no citoplasma em que Neu5Ac foi então convertida em CMP-Neu5Ac a serem transferidas em lactose para formar sialil-lactose (a nossa patente europeia EP 1194584). Este sistema foi aplicado para a produção da parte de hidrato de carbono de gangliósidos GM2 e GMl expressando adicionalmente os genes de glicosiltransferase apropriados (Antoine et ai., 2003). Oligossacáridos polis-sialilados (açúcares GD3 e GT3) foram também produzidos por este método e com o gene cstll de Campylobacter que codifica para uma a-2,3 - e a-2,8-sialiltransferase bifuncio-nal (o nosso pedido de patente US 60/690,837 e Antoine et ai., 2005). A produção em larga escala de sialiloligossa-cáridos por este método microbiológica requer uma quantidade importante de ácido siálico como precursor. O ácido 4 ΡΕ1991690 siálico pode ser purificado a partir de fontes naturais, tais como o leite e a gema de ovo, mas os rendimentos são baixos e o procedimento não é adequado para a produção em larga escala. 0 ácido siálico é geralmente preparado por síntese enzimática da ácido siálico aldolase, utilizando N-acetilmanosamina (ManNAc) e piruvato como substrato. Para reduzir o custo, ManNAc é geralmente preparada por epimerização química ou enzimática da N-acetilglucosamina que é um substrato mais barato do que ManNAc (Lee et al, 2004; Maru et al., 1998). Apesar destas melhorias o custo do ácido siálico é ainda relativamente elevado e este custo dificulta o desenvolvimento de um sistema económico para a produção de sialiloligossacáridos.

Antoine et al. (Chembiochem, vol. 4, n°5, 9 de Maio de 2003, p406-412) e Priem et al. (Glycobiology, vol. 12, n°4, Out 2002, p235-240) descreve a produção de açúcares sialilados a partir da lactose e Neu5Ac como precursores externos. EP 1484406 descreve a produção de Neu5Ac em E. coli que sobre-expressam GlcNAc-2- epimerase e Neu5Ac sintase.

Hamamoto Tomoki et al. (Biotechnology and Biochemistry Out 2005, vol 69, n°10, p 1944-1950) divulga a síntese enzimática de CMP-Neu5Ac a partir de GlcNAc e CMP usando E. coli compreendendo uma GlcNAc 6-P 2- epimerase heteróloga e uma NeuAc sintase heteróloga em combinação com células de levedura e H. influenza CMP-NeuAc sintetase purificadas. WO 2005/090552 refere-se à produção de 5 ΡΕ1991690 glicoproteínas sialiladas em levedura Ends et al. (Applied Microbiology and Biotechnology, Springer Verlag, Berlim, vol. 53, n°3, Março de 2000, páginas 257-261) descreve a produção de sialiloligossacáridos através da combinação de duas estirpes E. coli.

Além disso, como as estirpes de E. coli Kl e N. meningitidis são capazes de produzir CMP-Neu5Ac, mas são patogénicas e não podem ser utilizadas em processos biotecnológicos, por razões de segurança. A maior parte de outras bactérias, incluindo E. coli K12, não têm a maquinaria enzimática para a biossintese de CMP-Neu5Ac, e é um objectivo da invenção consiste em modificar geneticamente estirpes não patogénicas que seriam capazes de produzir CMP-Neu5Ac a partir de UDP-GlcNAc endógeno.

Em conexão com a presente invenção, desenhámos um novo sistema microbiano para a produção em larga escala de sialiloligossacáridos com custos competitivos, sem a necessidade de uma fonte exógena de ácido siálico. Os microrganismos metabolicamente modificados da invenção são viáveis, não patogénicos e podem ser utilizados em processos de grande escala e cultura industrial. Eles têm vias modificadas optimizadas e deleção de ciclos metabólicos fúteis e eles conduzem à biossintese de CMP-Neu5Ac activada que serve como dador in sito de ácido siálico para formar oligossacáridos sialilados. 6 ΡΕ1991690

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um método para a produção de oligossacáridos sialilados pelo crescimento fermentativo de microrganismos. Em particular, a invenção refere-se a um método de síntese de oligossacáridos gue contêm um ou vários resíduos de ácido siálico, sem gualguer adição exógena de ácido siálico ao meio de cultura, incluindo mas não se limitando a: - porções de oligossacárido dos gangliósidos seleccionados de GM3 (3'sialil lactose, Neu5Aca-3Gaip-4Glc) e oligossacáridos compreendendo o motivo GM3, GD3 Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip-4Glc GT3 (Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip-4Glc); GM2 GalNAcp-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc, GMl Galp-3GalNAcP-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc, GDla Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcP-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc GTla Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcP-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc GD2 GalNAcp-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gaip~4Glc GT2 GalNAcP-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gaip-4Glc GDlb, Gaip-3GalNAcp-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gaip-4Glc GTlb Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcP-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gaip-4Glc GQlb Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip~3GalNAcP-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)-

Galp-4Glc GTlc Gaip~3GalNAcP-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gaip~4Glc GQlc, Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcP-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)-Galp-4Glc 7 ΡΕ1991690 GPlc Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcP-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gaip~4Glc GDla Neu5Aca-3Gaip-3(Neu5Aca-6)GalNAcP-4Gaip-4Glc Fucosil-GMl Fuca-2Gaip-3GalNAcP-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc; todos os quais podem ser estendidos para a produção dos gangliósidos correspondentes fazendo reagir as porções de oligossacáridos com ceramida acima. - Outros açúcares sialilados incluindo: - 6'sialil-lactose (Neu5Aca-6Gaip-4Glc) e oligossacáridos compreendendo 6'sialil-lactose

Hexassacárido SGG (Neu5Aca-3Gaip-3GalNacp-3Gala-4Gaip-4Gal) - Tetrassacárido sialilado (Neu5Aca-3Gaip-4GlcNAcP-4GlcNAc) - Pentassacárido LSTD (Neu5Aca-3Gaip-4GlcNAcP-3Gaip-4Glc)

Num aspecto particular, o processo da invenção baseia-se na assimilação activa de um precursor exógeno, tal como por exemplo um mono-, di- ou tri-sacárido, mais particularmente um precursor exógeno seleccionado de entre a lactose, galactose, p-galactósido, e α-galactósido como globotriose (Gala-4Gaip-4Glc) , enquanto que as células estão em crescimento num substrato de carbono alternativo, tal como glicerol ou glicose. A expressão "precursor exógeno" pretende significar um composto envolvido na via biossintética do oligossacárido de acordo com a invenção, que é internalizado pelas células. 8 ΡΕ1991690

Ele também proporciona microrganismos metabolica-mente modificados que podem especificamente produzir oligossacáridos sialilados acima, sem produtos secundários, tais como GAl, GA2, GA3, GA4, e GA5 e a utilização do gene cstIII isolado a partir de estirpes C. jejuni que expressam estruturas de lipo-oligossacáridos que mimetizam o gangliósido GMl, tal como a estirpe C. jejuni Acesso NCTC No 111168, para a produção especifica de GMl.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a produção de sialil-lactose por uma estirpe metabolicamente modificada de E. coli. A Figura 2 mostra a formação de produtos secundários durante a produção de açúcar GMl por estripes metabolicamente modificadas de E. coli. A Figura 3 mostra a formação de produtos secundários durante a biossintese do açúcar GM2 A Figura 4 mostra a via biossintética de UDP-Gal A Figura 5 mostra a formação de produtos secundários durante a biossintese do açúcar GD2 A Figura 6 mostra a estratégia para a produção de um GTl usando sialil-transferase 9 ΡΕ1991690 A Figura 7 mostra a via metabolicamente modificada para a produção do açúcar LSTD (Neu5Aca-3Gaip-4GlcNAcP-3p-4Gal) a partir de lactose exógena A Figura 8 mostra a via metabolicamente modificada para a produção do hexassacárido SGG (Neu5Aca-3Gaip-3GalNacP-3Gala-4Gaip-4Gal) de globotriose exógena. A Figura 9 mostra a via metabolicamente modificada para a produção do tetrassacárido sialilado (Neu5Aca-3Galp-4GlcNAcp-4GlcNAc). A Figura 10 é uma análise por TLC da fracção intracelular e extracelular de cultura de alta densidade celular da estirpe DC7 com uma alimentação continua de lactose. Pista 1: solução padrão (2 mg.mL"1 cada) de lactose, lacto-N-neotetraose (LNnT), lacto-N-neo-hexaose (LNnH). Pistas 2, 3, 4, 5, 6 e 7: fracções intracelulares recolhidas 0, 7, 23, 31, 47 e 54 horas após a adição de lactose. Pistas 8, 9, 10, 11, 12 e 13: fracções extracelulares retiradas 0, 7, 23, 31, 47 e 54 horas após a adição de lactose.

Verificou-se anteriormente que a sialil-lactose (2) migra como o tetrassacárido LNnT. A Figura 11 mostra a produção de sialil-lactose, em cultura de alta densidade celular da estirpe DC7 com uma alimentação continua de lactose. (A) quantidade acumulada de lactose, (□) sialil-lactose intracelular, () sialil-lactose extracelular, (-) crescimento bacteriano. 10 ΡΕ1991690 A Figura 12 é uma análise por TLC de oligossa-cáridos produzidos pela cultura de alta densidade celular da estirpe NF03 contendo os plasmídeos pUC18-cstII e pBBR3-SS. A concentração inicial de lactose foi de 3 g.L"1. Pista 1: solução padrão (2 mg.mL"1 cada) de lactose lacto-N-neotetraose (LNnT), lacto-17-neo-hexaose (LNnH). Pistas 2 e 3: fracções intracelulares recolhidas 7 e 24 horas após a adição de lactose. Pistas 4 e 5: fracções extracelulares recolhidas 7 e 24 horas após a adição de lactose. A Figura 13 é uma análise por TLC de oligossacáridos produzidos pela cultura de alta densidade celular da estirpe CD 15 (pBS-cgtAII-nst, pBBR3-SS-wbpP, PSU-cgtB). A concentração inicial de lactose foi de 5 g.L" 1. Pista 1: solução-padrão (2 mg.mL"1 cada) de lactose lacto-N-neotetraose (LNnT) , lacto-AÍ-neo-hexaose (LNnH) . Pistas 2,3,4,5: fracções intracelulares recolhidas 7, 20, 30 e 44 horas após a adição de lactose. Pistas 6,7,8,9: fracções extracelulares recolhidas 7, 20,30 e 44 horas após a adição de lactose . A sialil-lactose (1) e o açúcar GMl (3) migram como LNnT e LNnH respectivamente. A Figura 14 é uma análise de TLC de oligossacáridos produzidos pela cultura de alta densidade celular da estirpe DC21 (pBS-cgtAII-nst, pBBR3-SS-gne, pSU-cgtB) . A concentração inicial de lactose foi de 5 g.L 1. Pistas 1 e 10: solução-padrão (2 mg.mL"1 cada) de lactose lacto-N-neotetraose (LNnT), lacto-W-neo-hexaose (LNnH). 11 ΡΕ1991690

Pistas 2,3,4,5: fracções intracelulares recolhidas 5, 20, 28 e 44 horas após a adição de lactose.

Pistas 6,7,8,9: fracções extracelulares recolhidas 5, 20,28 e 44 horas após a adição de lactose . A sialil-lactose (1) e o açúcar GM1 (3) migram como LNnT e LNnH respectivamente. A Figura 15 é uma análise por TLC de oligossa-cáridos produzidos pela cultura de alta densidade celular da estirpe DC22. (pBS-cstIII-cgtAII, pBBR3-SS-gne, pSU-CGTB) A concentração inicial de lactose foi de 5 g.L"1. Pistas 1 e 10: solução-padrão (2 mg.mL"1 cada) de lactose lacto-N-neotetraose (LNnT), lacto-N-neo-hexaose (LNnH). Pistas 2,3,4,5: fracções intracelulares retiradas 7, 20,30 e 44 horas após a adição de lactose. Pistas 6,7,8,9: fracções extracelulares recolhidas 7, 20, 30 e 44 horas após a adição de lactose. A sialil-lactose (1) e o açúcar GMl (3) migram como LNnT e LNnH respectivamente. A Figura 16 é uma análise por TLC de oligos-sacáridos produzidos pela cultura de alta densidade celular da estirpe ZWT (ZLKA, pBS-nst, pBBR3-SS-gne, pWKS-cgtAII). A concentração inicial de lactose foi de 5 g.L"1. Pistas 1: solução-padrão (2 mg.mL"1 cada) de lactose, lacto-N-neo-tetraose (LNnT) lacto-N-neo-hexaose (LNnH). Pistas 2,3,4,: fracções intracelulares recolhidas 0, 7 e 22 horas após a adição de lactose. Pistas 5, 6, 7: fracções extracelulares recolhidas 0, 7, e 22 horas após a adição de lactose. A Figura 17 é uma análise por TLC de oligos- 12 ΡΕ1991690 sacáridos produzidos pela cultura de alta densidade celular da estirpe ZWU2 (ZWU, pBS-nst, pBBR3-SS-gne, pWKS-cgtAII). A concentração inicial de lactose foi de 5 g.L 1. Pista 1: solução-padrão (2 mg.mL-1 cada) de lactose, lacto-N-neote-traose (LNnT) lacto-N-neo-hexaose (LNnH) . Pistas 2,3,4 e 5: fracções intracelulares recolhidas 0,7, 22 e 30 horas após a adição de lactose. Pistas 6, 7, 8 e 9: fracções extra-celulares retiradas 0, 7, 22 e 30 horas após a adição de lactose. A Figura 18 mostra um espectro de massa ESI” de uma fracção do composto (2) purificado a partir da fracção intracelular da estirpe de controlo ZWT (A) e da estirpe ZWU2 mutante em galU (B) Pico a m/z 835 corresponde ao açúcar GM2 e o pico a m/z 794 corresponde ao análogo galactosilado (açúcar GA2). A Figura 19 é uma análise por TLC das fracções obtidas após a separação da fracção intracelular de uma cultura de um litro da estirpe ZWUl. A separação foi realizada em Dowex 1 (forma HC03) usando um gradiente de 0-1 M de NaHC03. O volume de cada tubo foi de 10 mL. Os rendimentos das fracções A, B, C e D foram 0,5 g, 0,85, 0,6 e 1,2 g, respectivamente. A Figura 20 é uma análise por TLC de oligos- sacáridos produzidos pela cultura de alta densidade celular da estirpe NF17 (ZLKA, pBS-cgtA-cstII, pSU-cgtB, pBBR-SS-gne) . A concentração inicial de lactose foi de 5 g.L-1. 13 ΡΕ1991690

Pistas 1 e 10: solução padrão (2 mg.mlã1 cada) de lactose, lacto-W-neotetraose (LNnT) lacto-N-neo-hexaose (LNnH) . Pistas 2, 3, 4, e 5: fracções intracelulares recolhidas 7, 22, 30 e 46 horas após a adição de lactose. Pistas 6, 7, 8, e 9: fracções extracelulares recolhidas 7, 22, 30 e 46 horas após a adição de lactose.

DIVULGAÇÃO DA ORIGEM DO MATERIAL GENÉTICO

Tabela 1. Genes, plasmídeos e estripes de Escherichia coli usadas na presente invenção

Descrição Referência ou fonte Genes nst a-2,3-Sialiltransferase de N. meníngitidis L3 estirpe MC58 U60660 neuA CMP-Neu5Ac sintetase de C. Jejuni estirpe ATCC 43438 AF400048 neuB Ácido siálico sintase de C. jejuni estirpe ATCC 43438 AF400048 neuC GldNAc-6-fosfato 2 epimerase de C. jejuni estirpe ATCC 43438 AF400048 cgtA B-4 GalNAc transferase de C. jejuni 0: 19 estirpe OH4384 AF130984 wbpP UDP-GlcNAc C4 epimerase de P. aeruginosa AF035937 gne (Cj1131c) UDP-GlcNAc C4 epimerase de C. jejuni 0.2 estirpe NCTC 11168 AL139077 CStIII (Cjll40) a-2,3-Sialiltransferase de C. jejuni 0:2 estirpe NCTC 11168 AL139077 cgtAII B-4 GalNAc transferase de C. jejuni 0:36 estirpe ATCC 43456 AF401528 cgtB Cj1139c) B-3 Gal transferase de C. jejuni 0:2 estirpe NCTC 11168 AL139077 cstll a-2,3 a-2,8-Sialiltransferase de C. jejuni estirpe ATCC43438 AF400048 ΡΕ1991690 14 (continuação)

Genes nodC W-acetilglucosaroiniltransferase de Azorhizobim caulinodans AAB51164 IgtB βΐ, 4-galactosiltransferase de Neisseria rreningitidis AAC44085 chiA quitinase de Bacillus circulans AAA81528 Plasmídeos pWKS130 Vector de clonagem, Kmr, promotor Plac, baixo número de cópias, replicão pSClOl (Wang & Kushner, 1991) pSU27-18 Promotor CríP^ de vectores de clonagem derivados de pACYC184 (Martinez et al, 1988) pBAD33 Promotor CrTÚP^ de vectores de clonagem derivados de pACYC184 Guzman et al 1995 pBS-nst Derivado de pBluescript II SK com nst (anteriormente denominado NST-01) (Pnem et al, 2002) pBBRlMCS-3 Vector de clonagem, Tcr, prorotor P^, baixo núrrero de cópias, (Kbvach et al., 1995) pBBR3-SS Derivado de pBBRlMSS-3 ccm neuABC presente invenção pBBfô-SS- wbpP Derivado de pBBRlM3S-3 ccm neuABC e wbpP presente invenção pBBR3-SS-gne Derivado de pBBRlMDS-3 ccm neuABC e gne presente invenção pCJC-cstlI Derivado de pCJC18 ccm cstll presente invenção pBS-cgtAII- nst Derivado de pBluescript II SK com cgtA e nst presente invenção pBS-cgtA- cstll Derivado de pBluescript II KS com cgtA, cstll presente invenção pSU18-cgtB Derivado de pSU27 18 ccm cgtB presente invenção pBS-cstlII- cgtAII Derivado de pBluescript II KS ccm, cstIII and cgtAII presente invenção pWKS-cgtAII Derivado de pWKS130 ccm CgtAII, presente invenção pBAD33- cgtAII Derivado de pBAD33 com cgtAII, presente invenção pWKS-lgtB- chiA Derivado de pWKS130 com nst e a quitinase chiA (Dumon et al., 2005) ΡΕ1991690 (continuação)

Plasmídeos pBS-nst-nodC Derivado de pBluescript II SK com nodC e nst de A. caulinodans presente invenção pBS-cstlI- cgtB Derivado de pBluescript II KS com cstll e cgtB presente invenção Estirpes DC DH1 lacZ lacA (Dumon et al., 2005) GIK DHl lacZ lacA galK (Dumon et al., 2005) ZIKA DC AnanKETA presente invenção AZL DC nanA presente invenção AZK DC AnanK nanA presente invenção ZWU ZIKA galU presente invenção GIKA GIK AnanKETA presente invenção zw ZIKA melA wcaJ presente invenção DC6 DC (pBS-nst, pBBR3-SS) presente invenção AWl AZL (pBS-nst, pBBR3-SS) presente invenção DC7 ZIKA (pBS-nst, pBBR3-SS) presente invenção DC7 ZIKA (pBS-nst, pBBR3-SS) presente invenção DCO ZIKA (pBS-nst) presente invenção AZK1 AZK (pBS-nst, pBBR3-SS) presente invenção NF3 ZIKA (pUC-cstII, pBBR3-SS) presente invenção DC15 ZIKA (pDS-cgtAII-nst, pBBR3-SS-v*pP, pSU-cgtB) presente invenção DC21 ZIKA (pBS-cgtAII-nst, pBBR3-SS-gne, pSU-cgtB) presente invenção DC22 ZIKA (pBS-cstIII-cgtAII, pBBR3-SS-gne, pSU-cgtB) presente invenção ZWT ZIKA (pBS-nst, pBBR-SS-gne, pWKS-cgtAII) presente invenção ZWU2 ZWU (pBS-nst, pBBR-SS-gne, pWKS-cgtAII) presente invenção NF08 ZIKA (pUC18-cstII, pBBR3-SS-gne, pWKS-cgtAII) presente invenção NF09 ZIKA (pUC18-cstII, pBBR3-SS-gne, pEAD33-cgtAII) presente invenção ZWU1 ZWU (pUCl8-cstII, pBBR3-SS-qne, pEAD33-cgtAII) presente invenção NF17 ZIKA (pBS-cgtA-cstII, pSU-cgtB, pBBR-SS-gne) presente invenção 16 ΡΕ1991690 (continuação)

Estirpes GLK7 GLKA. (pBS-nst, pEBR3-SS) presente invenção SN4 ZLKA (pBS-nst-nodC, pBBR3-SS, pWKS-lgtB-chiA) presente invenção NF21 ZLKA (pBS-cstII-cgtB, pBBR3-SS-gne, pBAD33-cgtAII) presente invenção

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Numa primeira forma de realização, a invenção refere-se a um método para a produção de oligossacáridos compreendendo pelo menos um residuo de ácido siálico, aqui referidos oligossacáridos sialilados, compreendendo o método o passo que consiste na cultura de um microrganismo num meio de cultura, compreendendo, opcionalmente, um precursor exógeno, em que o referido microrganismo é capaz de produzir ácido siálico activado internamente e compreende genes heterólogos que codificam para uma CMP-Neu5Ac sintetase, uma ácido siálico sintase, uma GlcNAc-6-fosfato-2 epimerase e uma sialiltransferase, e em que os genes endógenos que codificam para a ácido siálico aldolase (NanA) e para a ManNAc cinase (NanK) foram deletados ou inactivados.

No método acima, e dependendo do ponto final, o gene da sialiltransferase heterólogo pode ser seleccionado a partir de a-2,3-sialiltransferase, por exemplo, codificada por nst, a-2,3 a-2,8-sialiltransferase (cstll), e a-2,3-sialiltransferase (cstIII) ou a-2,6-sialiltransferase. A CMP-Neu5Ac sintetase heteróloga pode ser neuA, a ácido siálico sintase heteróloga pode ser neuB, e a GlcNAc-6- 17 ΡΕ1991690 fosfato-2 epimerase heteróloga pode ser neuC. Os genes neuA, neuB, e neuC podem ser isolados a partir de estirpes bacterianas que contêm a estrutura sialilada no seu envelope de célula, tais como a estirpe C. jejuni com o No. de acesso ATCC 43438.

Os genes nanT, nanA, nanK e nanE são parte do mesmo operao, que é regulado pela proteína de ligação ao ADN NanR e induzido por Neu5Ac (Kalivoda et al.r 2003). Assim, os microrganismos da invenção também pode ser nanKEAT-. A produção de Neu5Ac como intermediário durante a síntese de CMP-Neu5Ac por uma estirpe geneticamente modificada que sobre-expressa os genes neuBCA pode, assim, induzir a via do catabolismo do ácido siálico e criar dois ciclos fúteis, que irão a reduzir a capacidade da biossín-tese de CMP-Neu5Ac das bactérias. Um primeiro ciclo fútil pode resultar da actividade combinada da ácido siálico sintase NeuB com a ácido siálico aldolase NanN. Um segundo ciclo fútil pode resultar da acção combinada da UDP-GlcNAc 2 epimerase NeuC com as quatro enzimas NanK NanE NagA GimM e GimU que catalisam a formação de UDP-GlcNAc a partir de ManNAc. De acordo com o método aqui proposto, a degradação de Neu5Ac e ManNAc é impedida. Isto pode ser vantajosamente feito perturbando os genes nanA e nanK nas estirpes que serão utilizados para a produção de sialiloligossacáridos. Numa realização específica, os genes nanT, nanA, nanK e nanE são deletados ou inactivados. Isto pode ser praticado por exemplo através da remoção da totalidade do operão. 18 ΡΕ1991690

Numa forma de realização preferida, o microorga-nismo acima codifica para uma proteína que facilita a absorção de lactose e carece de enzimas que metabolizam a lactose. Por exemplo, em E. coli, a célula é de preferência LacY+ (β-galactósido permease), LacZ- (β-galactosidase), e opcionalmente MelA-(α-galactosidase).

Numa outra forma de realização preferida, o meio compreende um precursor exógeno que é seleccionado, por exemplo, a partir de lactose, galactose, β-galactósido, e α-galactósido, tais como globotriose (Gala-4Ga^-4Glc). A invenção também se refere ao microorganismo de cima e a um meio de cultura de células que compreende o microorganismo acima e um precursor exógeno seleccionado de entre a lactose, a galactose, β-galactósido e, a-galactósido, tais como globotriose (Gala-4Ga^-4Glc).

DEFINIÇÕES 0 termo "ácido siálico" refere-se a qualquer membro de uma família de açúcares carboxilados de nove carbonos. 0 membro mais comum da família de ácido siálico é o ácido N-acetil-neuramínico (2-ceto-5-acetamido-3, 5-dide-soxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-l-ónico (frequentemente abreviado como Neu5Ac, Neu5Ac ou NANA). Um segundo membro da família é o ácido N-glicolil-neuramínico (Neu5Gc ou NeuGc), no qual o grupo N-acetilo de Neu5Ac é hidro-xilado. Um terceiro membro da família de ácido siálico é o 19 ΡΕ1991690 ácido 2-ceto-3-desoxi-nonulosónico (KDN) (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et ai, J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)). Também estão incluídos ácidos siálicos 9-substituídos, tais como a 9-0-Ci-C6 acil-Neu5Ac como 9-0-lactil-Neu5Ac ou 9-O-acetil-Neu5Ac, 9-desoxi-9-fluoro-Neu5Ac e 9-azido-9-desoxi-Neu5Ac. Para revisão da família de ácido siálico, ver, por exemplo, Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemis-try, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, Nova Iorque (1992)). A síntese e utilização de compostos de ácido siálico num procedimento de sialilação é divulgada no pedido de patente internacional WO 92/16640, publicada em 01 de Outubro de 1992. O termo " sialiltransferase CstII bifuncional de Campylobacter jejuni" refere-se a uma sialiltransferase que apresenta ambas as actividades a-2,3 e a-2,8-sialiltrans-ferase. Nalgumas formas de realização, é utilizada a sialiltransferase CstII com o No. de acesso ATCC 43438.

Um "substrato aceitador" ou um "sacárido aceitador" para uma glicosiltransf erase é uma porção de oligossacárido que pode actuar como um aceitador para uma glicosiltransferase específica. Quando o substrato aceitador é posto em contacto com a correspondente glicosil-transferase e substrato dador de açúcar, e outros componentes da mistura de reacção necessários, e a mistura de reacção é incubada durante um período de tempo suficiente, a glicosiltransferase transfere os resíduos de 20 ΡΕ1991690 açúcar do substrato dador de açúcar para o substrato aceitador. Por exemplo, um substrato aceitador para as sialiltransferases utilizado nos métodos da invenção é lactose Gaipi,4-Glc.

Um "substrato doador" para glicosiltransferases é um açúcar de nucleótido activado. Tais açúcares activados geralmente consistem em derivados uridina, guanosina, citidina monofosfato dos açúcares (UMP, GMP e CMP, respectivamente) ou derivados de difosfato dos açúcares (UDP, PIB e CDP, respectivamente) , em que o monofosfato ou difosfato de nucleósido serve como um grupo de saida. Por exemplo, um substrato dador para sialiltransferases utilizado nos métodos da invenção é o CMP-Neu5Ac.

Um "meio de cultura" refere-se a qualquer meio liquido, semi-sólido ou sólido que pode ser usado para sustentar o crescimento de um microrganismo utilizado nos métodos da invenção. Nalgumas formas de realização, o microorganismo é uma bactéria, por exemplo, E. coli. Meios para crescimento de microrganismos são conhecidos, ver, por exemplo, Sambrook et al. e Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocolo, uma publicação conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1998 Suplemento) (Ausubel). Os meios podem ser meios ricos, por exemplo, "Luria broth" ou "terrific broth", ou meios sintéticos ou semi-sintéticos, por exemplo, meio M9. Nalgumas formas de realização preferidas, o meio de crescimento compreende o ácido siálico e a lactose. 21 ΡΕ1991690 "Escala comercial" refere-se a uma escala de produção na ordem dos gramas de um produto sacárido sialilado numa única reacção. Em realizações preferidas, a escala comercial refere-se a produção de escala superior ao cerca de 50, 75, 80, 90 ou 100, 125, 150, 175, ou 200 gramas. 0 termo "operativamente ligado" refere-se à ligação funcional entre uma sequência de ácido nucleico de controlo de expressão (tal como um promotor, sequência de sinal, ou conjunto de locais de ligação a factor de transcrição) e uma segunda sequência de ácido nucleico, em que a sequência de controlo da expressão afecta a transcrição e/ou a tradução do ácido nucleico correspondente à segunda sequência.

Um "polinucleótido heterólogo" ou um "gene hete-rólogo", tal como aqui utilizado, é um originário de uma fonte externa à célula hospedeira particular, ou, se da mesma fonte, é modificada relativamente à sua forma original. Assim, um gene da sialiltransferase heterólogo numa célula inclui um gene que é endógeno relativamente à célula hospedeira particular, mas que foi modificado. A modificação da sequência heteróloga pode ocorrer, por exemplo, tratando o ADN com uma enzima de restrição para gerar um fragmento de ADN que é capaz de ser operativamente ligado a um promotor. Técnicas como mutagénese dirigida são também úteis para a modificação de uma sequência heteróloga. 22 ΡΕ1991690

Um "cassete de expressão recombinante" ou simplesmente uma "cassete de expressão" é uma construção de ácido nucleico, gerada de forma recombinante ou sinteticamente, com elementos de ácidos nucleicos que são capazes de afectar a expressão de um gene estrutural em hospedeiros compatíveis com tais sequências. As cassetes de expressão incluem pelo menos promotores e opcionalmente, sinais de terminação da transcrição. Tipicamente, a cassete de expressão recombinante inclui um ácido nucleico a ser transcrito (por exemplo, um ácido nucleico que codifica para um polipéptido desejado), e um promotor. Factores adicionais necessários ou úteis para realizar a expressão também podem ser usados. Sinais de terminação da transcrição, potenciadores e outras sequências de ácidos nucleicos que influenciam a expressão de genes, podem também ser incluídos numa cassete de expressão. Quando mais do que uma proteína heteróloga é expressa num microrganismo, os genes que codificam para as proteínas podem ser expressos numa única cassete de expressão ou em várias cassetes de expressão que são compatíveis e que podem ser mantidas na mesma célula. Tal como aqui utilizado, cassete de expressão também engloba construções de ácidos nucleicos que são inseridos no cromossoma do microrganismo hospedeiro. Os peritos na técnica estão conscientes de que a inserção de um ácido nucleico num cromossoma pode ocorrer, por exemplo, por recombinação homóloga. Uma cassete de expressão pode ser construída para a produção de mais do que uma proteína. As proteínas podem ser reguladas por uma única sequência de 23 ΡΕ1991690 promotor, como por exemplo, um operão. Ou múltiplas proteínas podem ser codificadas por ácidos nucleicos com promotores individuais e sítios de ligação de ribossomas. 0 termo "isolado" refere-se a material gue é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que interferem com a actividade da molécula biológica. Para células, sacáridos, ácidos nucleicos e polipéptidos da invenção, o termo "isolado" refere-se a material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham o material como encontrado no seu estado nativo. Tipicamente, sacáridos, oligossacáridos, proteínas ou ácidos nucleicos isolados da invenção são pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% ou 85% puros, geralmente pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% puros, conforme medido pela intensidade da banda de um gel corado com prata ou outro método para determinar a pureza. A pureza ou homogeneidade pode ser indicada por um número de meios bem conhecidos na técnica, tais como electroforese em gel de poliacrilamida de uma proteína ou amostra de ácido nucleico, seguida de visualização por coloração. Para certos fins será necessária uma elevada resolução e serão utilizados HPLC ou meios semelhantes para purificação. Para oligossacáridos, como por exemplo, produtos sialilados, a pureza pode ser determinada utilizando, por exemplo, cromatografia em camada fina, HPLC ou espectroscopia de massa.

Os termos "idêntico" ou percentagem de "identi- 24 ΡΕ1991690 dade", no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou de polipéptidos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são a mesma ou têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleótidos que são o mesmos, quando comparados e alinhados para correspondência máxima, tais como medidos utilizando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências ou por inspecção visual. A frase "substancialmente idênticos" no contexto de dois ácidos nucleicos ou polipéptidos, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que têm pelo menos 60%, preferencialmente 80% ou 85%, mais de preferência, pelo menos, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de resíduos de nucleótidos ou de aminoácidos, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, medida utilizando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências ou por inspecção visual. Preferivelmente, a identidade substancial existe ao longo de uma região das sequências que tenha pelo menos cerca de 50 resíduos de comprimento, mais preferencialmente ao longo de uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, e mais preferivelmente as sequências são substancialmente idênticas ao longo de pelo menos cerca de 150 resíduos. Numa forma de realização mais preferida, as sequências são substancialmente idênticas ao longo de todo o comprimento das regiões codifi-cantes.

Para comparação de sequências, tipicamente uma ΡΕ1991690 sequência actua como sequência de referência, relativamente à qual as sequências de teste são comparadas. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências, as sequências em teste e de referência são introduzidas num computador, são designadas coordenadas de subsequência, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo de sequência são designados. 0 algoritmo de comparação de sequências calcula então a percentagem de identidade de sequência para a(s) sequência(s) em teste relativamente à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados. 0 alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de

Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pela busca de método similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Nat' 1. Acad. Sei. USA 85: 2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspecção visual (ver geralmente, Current Protocols in Molécula Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, uma publicação conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1995

Suplemento) (Ausubel)).

Exemplos de algoritmos que são adequados para ΡΕ1991690 determinar a percentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e Altschuel et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. Software para a realização de análises de BLAST está publicamente disponível através do National Centrer for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiramente identificar pares de sequência de elevada pontuação (HSPs), identificando palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que correspondem ou satisfazem alguma pontuação limiar T com valor positivo quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento numa sequência da base de dados. T é referida como o limite da pontuação de palavras de vizinhança (Altschul et al, supra). Estes acertos iniciais de palavras de vizinhança funcionam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSP mais longas que as contenham. Os acertos de palavras são então estendidos em ambas as direcções ao longo de cada sequência, tão longe quanto a pontuação de alinhamento cumulativo pode ser aumentada. As pontuações acumuladas são calculadas usando, para sequências de nucleótidos, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos com correspondência; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos desalinhados; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão da palavra em cada direcção é interrompida quando: a pontuação cumulativa de alinhamento cai pela quantidade X relativamente ao seu valor máximo atingido; a pontuação 27 ΡΕ1991690 cumulativa vai para zero ou abaixo de zero, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou a extremidade de qualquer sequência é atingida. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. 0 programa BLASTN (para sequências de nucleótidos) utiliza por defeito um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as cadeias. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza por defeito um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915 (1989)).

Além de calcular a percentagem de identidade de sequência, o algoritmo BLAST realiza também uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Natl Acad. Sei USA 90: 5873-5787 (1993)). Uma medida da similaridade fornecida mais pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleótidos ou de aminoácidos que ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado semelhante a uma sequência de referência se a probabilidade da menor soma numa comparação entre o ácido nucleico teste com o ácido nucleico de referência é menor do que cerca de 0,1, mais preferencialmente inferior a cerca de 0,01, e preferivelmente menos do que cerca 0,001. 28 ΡΕ1991690 "Variações conservativamente modificadas" de uma sequência polinucleotídica particular, refere-se àqueles polinucleótidos que codificam para sequências de aminoáci-dos idênticas ou essencialmente idênticas, ou quando o polinucleótido não codifica para uma sequência de amino-ácidos, a sequências essencialmente idênticas. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica para qualquer dado polipéptido. Por exemplo, os codões CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, e AGG codificam todos para o aminoácido arginina. Assim, em cada posição em que uma arginina é especificada por um codão, o codão pode ser alterado para qualquer dos codões correspondentes descritos sem alterar o polipéptido codificado. Tais variações de ácidos nucleicos são "substituições silenciosas" ou "variações silenciosas", que são uma espécie de "variações conservativamente modificadas". Cada sequência de polinucleótido aqui descrita que codifica para um polipeptídeo também descreve cada possível variação silenciosa, excepto quando indicado de outro modo. Assim, as substituições silenciosas são uma característica implícita de qualquer sequência de ácido nucleico que codifica para um aminoácido. Um perito reconhecerá que cada codão num ácido nucleico (excepto AUG, que é normalmente o único codão para a metionina) pode ser modificado para originar uma molécula funcionalmente idêntica através de técnicas convencionais. Nalgumas formas de realização, as sequências de nucleótidos que codificam para as enzimas são de preferência optimizadas para a expressão num particular 29 ΡΕ1991690

Do mesmo modo, "substituições de aminoácidos conservativas", em um ou poucos aminoácidos numa sequência de aminoácidos são substituídos por diferentes aminoácidos com propriedades altamente semelhantes também são facilmente identificadas como sendo altamente semelhantes a uma sequência de aminoácidos particular, ou a uma determinada sequência de ácido nucleico que codifica para um aminoácido. Substituições, deleções ou adições individuais que alteram, adicionam ou excluem um único aminoácido, ou uma pequena percentagem de aminoácidos (normalmente menos de 5%, mais tipicamente menos de 1%) , numa sequência codificada são "variações conservativamente modificadas" onde as alterações resultam na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente semelhante. Tabelas de substituições conservadoras que fornecem aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Creighton (1984) Proteins, WH Freeman and Company.

SIALILTRANSFERASES BIFUNCIONAIS

Como observado acima, sialiltransferases bifun-cionais são utilizadas nos métodos da invenção. Ácidos nucleicos que codificam para tais enzimas têm sido isolados a partir de C. jejuni e são divulgados nas Patentes U.S. Nos 6699705 e 6503744 e WO/02074942. Exemplos de estirpes de C. jejuni que podem ser utilizadas como fontes de sialiltransferases bifuncionais incluem OH4384 (as sequências de ácidos nucleicos encontram-se em GenBank acessos 30 ΡΕ1991690 ΑΧ934425 e AR271700), OH4382, 0:10 (as sequências de ácidos nucleicos encontram-se em GenBank acessos AR271701 (SEQ ID No 1), AX934427 (SEQ ID No 2), 0:23, e 0:41 (as sequências de ácidos nucleicos encontram-se em GenBank acessos AR271702 (SEQ ID No 3) e AX934429 (SEQ ID No: 4)). Deve ser entendido que variações conservativamente modificadas como acima definidas de SEQ ID No: 1, 2, 3 e 4 podem ser aqui aplicadas.

CÉLULAS HOSPEDEIRAS

As células recombinantes da invenção são geralmente preparadas criando ou obtendo de outra forma um polinucleótido que codifica para a ou as enzimas particulares de interesse, colocando o polinucleótido numa cassete de expressão sob o controlo de um promotor e de outros sinais de controlo apropriados, e introduzindo a expressão cassete numa célula. Mais do que uma das enzimas podem ser expressas nas mesmas células hospedeiras utilizando uma variedade de métodos. Por exemplo, um único vector extra-cromossómico pode incluir várias cassetes de expressão, ou mais que um vector extracromossómico compatível pode ser usado para manter uma cassete de expressão numa célula hospedeira. As cassetes de expressão também pode ser inseridas num cromossoma da célula hospedeira, através de métodos conhecidos pelos peritos na técnica. Os peritos reconhecerão que também se podem usar combinações de cassetes de expressão em vectores extracromossómicos e de cassetes de expressão inseridas num cromossoma da célula 31 ΡΕ1991690 hospedeira. Outra modificação da célula hospedeira, descrita em detalhe abaixo, pode ser realizada para aumentar a produção do oligossacárido desejado. Por exemplo, o microrganismo pode ser LacY+ permitindo o transporte activo de lactose. As células hospedeiras não precisam de ser NanT+ uma vez que o ácido sialilico activado é produzido internamente com o método de acordo com a invenção.

As células recombinantes da invenção são geralmente microorganismos, tais como, por exemplo, células de levedura, células bacterianas ou células de fungos. Exemplos de células adequadas incluem, por exemplo, Azotobacter sp. (por exemplo, A. vinelandii) , Pseudomonas sp., Rhizobium sp., Erwinia sp., Bacillus sp., Streptomyces sp., Escherichia sp. (por exemplo, E. coli), e Klebsiella sp., entre muitos outros. As células podem ser de qualquer de vários géneros, incluindo Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae) , Candida (por exemplo, C. utilis, C. parapsilosis, C. krusei, C. versatilis, C. lipolytica, C. zeylanoides, C. guilliermondii, C. albicans e C. humicola), Pichia (por exemplo, P. farinosa e P. ohmeri), Torulopsis (por exemplo, T. candida, T. sphaerica, T. xylinus, T. famata e T. versatilis) , Debaryomyces (por exemplo, D. subglobosus, D. cantarellii, D. globosus, D. hansenii, e D. japonicus), Zygosaccharomyces (eg, 2. rouxii e 2. bailii), Kluyveromyces (por exemplo, K. marxianus), Hansenula (por exemplo, H. anómala e H. jadinii) , e Brettanomyces (por exemplo, B. lambicus e B. anomalus). ΡΕ1991690

Os promotores para utilização em E. coli incluem os promotores T7, trp, ou lambda. Um local de ligação de ribossoma e de preferência, um sinal de terminação da transcrição, também são fornecidos. Para a expressão de proteínas heterólogas em células que não E. coli, um promotor que funciona na espécie procariótica particular é necessária. Tais promotores podem ser obtidos a partir de genes que foram clonados da espécie, ou podem ser utilizados promotores heterólogos. Por exemplo, o promotor trp-lac híbrido funciona em Bacillus para além de E. coli. Os métodos de transformação de procariotas que não E. coli são bem conhecidos. Por exemplo, métodos de transformação de espécies de Bacillus e promotores que podem ser utilizados para expressar as proteínas são ensinados na Patente U.S. No. 6255076 e na Patente U.S. No. 6770475.

Em levedura, os promotores convenientes incluem GALl-10 (Johnson e Davies (1984) Mol. Cell. Biol. 4: 1440-1448) ADH2 (Russell et al. (1983) J. Biol. Chem. 258: 2674-2682), PH05 (EMBO J. (1982) 6: 675-680) e AMF (Herskowitz e Oshima (1982) em The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (eds. Strathern, Jones, e Broach) Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, Nova Iorque, pp 181-209). Outro promotor adequado para utilização em leveduras é o promotor híbrido ADH2/GAPDH, tal como descrito em Cousens et al., Gene 61: 265-275 (1987). Para fungos filamentosos, tais como, por exemplo, estirpes dos fungos Aspergillus (McKnight et al., Patente U.S. No. 4935349), exemplos de promotores úteis incluem aqueles derivados a partir de 33 ΡΕ1991690 genes glicolíticos de Aspergillus nidulans, tais como o promotor ADH3 (McKnight et al., EMBO J. 4: 20 93 2099 (1985)) e o promotor tpiA. Um exemplo de um terminador adequado é o terminador ADH3 (McKnight et al.) .

Nalgumas concretizações, os polinucleótidos são colocados sob o controlo de um promotor indutivel, que é um promotor que dirige a expressão de um gene em que o nível de expressão é alterável por factores ambientais ou de desenvolvimento, tais como, por exemplo, temperatura, pH, condições anaeróbias ou aeróbias, luz, factores de transcrição e produtos químicos. Tais promotores são aqui referidos como promotores "indutíveis", que permitem o controlo do momento da expressão da glicosiltransferase ou da enzima envolvida na síntese de nucleótido de açúcar. Para E. coli e outras células hospedeiras bacterianas, os promotores indutíveis são conhecidos pelos peritos na técnica. Estes incluem, por exemplo, o promotor lac. Um promotor indutivel particularmente preferido para a expressão em procariotas é um promotor duplo, que inclui um componente promotor tac ligado a um componente promotor obtido a partir de um gene ou genes que codificam para enzimas envolvidas no metabolismo da galactose (por exemplo, um promotor de um gene da UDP galactose 4-epimerase (galE)). São também conhecidos pelos peritos na técnica promotores indutíveis para outros organismos. Estes incluem, por exemplo, o promotor de arabinose, o promotor 34 ΡΕ1991690 de lacZ, o promotor de metalotioneína, e o promotor de choque térmico, bem como muitos outros. A construção das construções polinucleotídicas geralmente requer a utilização de vectores capazes de se replicarem em bactérias. Estão comercialmente disponíveis imensos kits para a purificação de plasmídeos a partir de bactérias. Para o seu uso adequado, seguem-se as instruções do fabricante (ver, por exemplo, EasyPrepJ, FlexiPrepJ, ambos da Pharmacia Biotech; StrataCleanJ, da Stratagene e, QIAexpress Expression System, Qiagen). Os plasmídeos isolados e purificados podem então ser ainda mais manipulados para produzir outros plasmídeos, e utilizados para transfectar células. A clonagem em Streptomyces ou Bacillus também é possível. São muitas vezes incorporados nos vectores de expressão marcadores de selecção utilizados para construir as células da invenção. Estes genes podem codificar para um produto de gene, tal como uma proteína, necessária para a sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras transformadas crescidas num meio de cultura selectivo. As células hospedeiras não transformadas com o vector contendo o gene de selecção não irão sobreviver no meio de cultura. Os genes de selecção típicos codificam para proteínas que conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, tais como a ampicilina, a neomicina, a canamicina, o cloram-fenicol ou a tetraciclina. Alternativamente, os marcadores seleccionáveis podem codificar para proteínas que comple- 35 ΡΕ1991690 mentam deficiências auxotróficas ou fornecem nutrientes críticos não disponíveis dos meios complexos, por exemplo, o gene que codifica a D-alanina racemase para Bacilos. Frequentemente, o vector terá um marcador de selecção que é funcional em, por exemplo, E. coli, ou noutras células, em que o vector é replicado antes de ser introduzido na célula alvo. Diversos marcadores seleccionáveis são conhecidos dos peritos na arte e são descritos, por exemplo, em Sambrook et al., supra. Um marcador de selecção preferido para utilização em células bacterianas é um marcador de resistência à canamicina (Vieira e Messing, Gene 19: 259 (1982)) . A utilização de selecção com canamicina é vantajosa em relação, por exemplo, à selecção de ampicilina porque a ampicilina é rapidamente degradada por β-lactamase em meio de cultura, removendo assim a pressão selectiva e permitindo que a cultura se torne dominada por células que não contenham o vector. A construção de vectores adequados contendo um ou mais dos componentes acima listados emprega técnicas de ligação convencionais como descrito nas referências citadas acima. Os plasmídeos isolados ou os fragmentos de ADN são clivados, adaptados e re-ligados na forma desejada para gerar os plasmídeos necessários. Para confirmar as sequências correctas nos plasmídeos construídos, os plasmídeos podem ser analisados por meio de técnicas convencionais, tais como a digestão por endonuclease de restrição e/ou sequenciação de acordo com os métodos conhecidos. Técnicas de clonagem molecular para atingir 36 ΡΕ1991690 estes fins são conhecidos na técnica. Uma ampla variedade de métodos de clonagem e de amplificação in vitro adequados para a construção de ácidos nucleicos recombinantes são bem conhecidos pelos peritos na técnica.

Uma variedade de vectores comuns adequados para a construção de células recombinantes da invenção são bem conhecidos na técnica. Para a clonagem em bactérias, vectores comuns incluem vectores derivados de pBR322, tais como pBLUESCRIPT™, e derivados de fagos λ. Em levedura, vectores incluem plasmideos de integração em levedura (por exemplo, YIp5) e plasmideos de replicação em levedura (os plasmideos da série YRp) e pGPD-2.

Os métodos para introduzir vectores de expressão numa célula hospedeira escolhida não são particularmente críticos, e estes métodos são conhecidos pelos peritos na técnica. Por exemplo, os vectores de expressão podem ser introduzidos nas células procarióticas, incluindo E. coli, por transformação com cloreto de cálcio, e em células eucarióticas por meio de tratamento com fosfato de cálcio ou electroporação. Outros métodos de transformação também são adequados.

REALIZAÇÕES PREFERIDAS

Produção de 3' sialil lactose. A produção de 3' sialil lactose pode ser 37 ΡΕ1991690 efectuada numa estirpe metabolicamente modificada acima definida que expressa um gene que codifica para uma enzima que compreende uma actividade de a-2,3 sialiltransferase, tal como uma a-2,3 sialiltransferase ou uma a-2,3 e a-2,8-sialiltransferase bifuncional que utilizam a lactose como aceitador. Conforme indicado, esta estirpe é desprovida de ácido siálico aldolase, ManNAc cinase e actividade de β-galactosidase e expressa os genes heterólogos que codificam para a CMP-Neu5Ac-sintetase, uma ácido siálico sintase e uma GlcNAc-6-fosfato 2 epimerase. Para a produção em larga escala de sialil-lactose, esta estirpe pode ser cultivada a uma densidade celular elevada no substrato barato tal como glucose ou glicerol e alimentados com lactose que será internalizada pela permease de lactose e sialilada pela sialiltransferase recombinante usando o CMP-Neu5Ac gerado endogenamente a partir de UDP-GlcNAc, como mostrado na figura 1.

Produção de 6'sialil-lactose

Aqui, o gene da sialiltransferase é um gene que codifica para a a-2,6 sialiltransferase tal como o gene de Photobacterium damsela (Yamamoto et al, 1998), que resulta na produção de 6'sialil-lactose (Neu5Aca-6Gaip~4Glc).

Produção de açúcar GD3 e GT3 GD3 (Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip~4GlcCer) é um gan-gliósido menor encontrado na maioria dos tecidos normais em 38 ΡΕ1991690 vertebrados superiores incluindo humanos. Verificou-se que o nivel de GD3 aumenta durante algumas situações patológicas, tais como cancros (glioma, melanoma) e têm um papel importante na angiogénese tumoral, Zeng, et al. Câncer Res., 60: 6670 (2000). Assim, a produção de GD3 em elevada escala e economicamente viável é de particular interesse. Para atingir este ponto final, o gene heterólogo de sialiltransferase referenciado acima é escolhido a partir de um gene que codifica para uma a-2,3 e a-2,8 sialiltransferase bifuncional, por exemplo, tais como o gene cstll de Campylobacter jejuni (Gilbert et al., 2002 e depositada sob o número de acesso ATCC 43438) e resulta na produção de açúcar GD3 e GT3. O polipéptido sialiltrans-ferase bifuncional catalisa a transferência de uma porção sialilo de uma molécula de ácido siálico produzida internamente para a Neu5Aca-3Gaip-4Glc (GM3) para formar Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip-4Glc. Esta reacção pode ser ainda prolongada para produzir GT3 que é o precursor de gangliósidos da série C, que são os principais constituintes no cérebro de peixes adultos e são encontrados em abundância em cérebros fetais de vertebrados superiores (Letinic, et al. Neuro-science, 86, 1 (1998)). Eles também são encontrados em diversos tipos de tumores neuroectodérmicos e existe, portanto, potencialmente grande interesse em ter fácil acesso ao oligossacárido GT3. Para este fim, o método aqui compreende ainda a cultura do microorganismo de tal modo que o polipéptido sialiltransferase bifuncional de Campylobacter jejuni que catalisa a transferência de uma porção sialilo de uma de uma molécula de ácido siálico 39 ΡΕ1991690 activada produzida internamente para o Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip-4Glc (GD3) para formar Neu5Ac5a-8Neu5Aca-8Neu5Aca-3Galp-4Glc (GT3).

Produção de açúcar GMl

Tal como ilustrado na figura 2, o sistema para a produção de sialil-lactose apresentado acima (ver também a figura 1) pode ser estendido para a produção da porção de hidrato de carbono do gangliósido GMl por expressão dos genes adicionais para uma β-l,4GalNActransferase e para uma β-l,3-galactosiltransferase. Aqui, o microorganismo da invenção é tal como apresentado na figura 1 e compreende ainda sequências heterólogas que codificam para β-1,4GalNActransferase bem como β-l,3-galactosiltransferase. Nesta forma de realização, a β-l,4GalNActransferase transfere um resíduo UDP-GalNac para sialil-lactose (GM3) para formar GM2 e a β-l,3-galactosiltransferase transfere um resíduo galactosilo para GM2 de modo a formar GMl. Estripes podem não ser capazes de produzir naturalmente UDP-GalNAc tais como estripes de E. coli K12. Neste caso, a estirpe da invenção pode ser complementada por um gene que codifica uma UDP-GlcNAc 4-epimerase, tal como, por exemplo, o gene wbpP de P. aeruginosa (Creuzenet et ai, 2000) e o gene de gne de C. jejuni (Bernatchez et ai, 2005). O açúcar GMl tem uma galactose terminal não redutora e esta estrutura pode ser utilizada como aceitador pela a-2,3 sialiltransferase para produzir o açúcar GDla. O açúcar GDla tem a mesma estrutura de dissacárido terminal não 40 ΡΕ1991690 redutor de sialil-lactose e pode ser utilizado como aceitador pela β-l,4GalNActransferase para formar um intermediário heptassacárido que pode ser galactosilado no octassacárido representado como GAl (Gaip-3GalNAcp-4(Neu5Aca-3)Gaip-3GalNAcP-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc) na figura 2 . A formação do GDla e dos seus derivados maiores reduzem o rendimento de produção do açúcar GMl e é uma forma de realização particular da invenção, para reduzir ou abolir a formação destes produtos secundários. Para este fim, descobrimos uma a-2,3 sialiltransferase que não é capaz de utilizar o açúcar GMl como aceitador. A estirpe C. jejuni NCTC 111168 expressa estruturas de lipo-oligossacá-rido que mimetizam o gangliósido GMl (Linton et al, 2000) . Esta estrutura de núcleo externo de lipo-oligossacárido foi referida por Linton et al (2000) como o núcleo exterior "VI". C. jejuni NCTC 111168 contém um gene chamado cstIII que codifica para uma proteína que apresenta uma identidade de sequência de 53% com sialiltransferase (CstII) a partir de outras estirpes de C. jejuni que expressam um mimético de GDla (Gilbert et al, 2002). A actividade de sialiltransferase de proteína CstIII permite vantajosamente a produção do açúcar GMl como o único produto oligossacárido. Assim, numa forma de realização preferida, a invenção contempla o método acima para a produção específica de GMl, em que a sialiltransferase heteróloga é uma a-2,3 sialiltransferase codificada pelo gene cstIII isolado a partir de estirpes C. jejuni que expressam estruturas lipo-oligossacárido que 41 ΡΕ1991690 imitam o gangliósido GMl, tais como a estirpe C. jejuni NCTC No Acesso 111168.

Produção de açúcar GM2 0 sistema para a produção de sialil-lactose, tal como descrito acima pode ser estendido para a produção da parte de hidrato de carbono do gangliósido GM2 por expressar os genes adicionais para uma β-l,4-GalNActrans-ferase e para UDP-GlcNAc 4-epimerase. Foi previamente relatado que a CgtA β-l,4-GalNActransferase de C. jejuni apresenta uma actividade secundária de β- 1,4 galactosil-transferase que resultou na produção do análogo de açúcar GM2 designado como GA2 na figura 3 (Antoine et al., 2003). O açúcar GA2 contém uma galactose terminal e não redutora e descobrimos que esta galactose pode servir como aceitador para a sialiltransferase para produzir um tetrassacárido disialilado (GA5, figura 3), que por sua vez pode ser convertido no pentassacárido GA4 ou GA3 (figura 3) pela CgtAII β-l,4-GalNActransferase muito activa. A formação de produtos secundários GA2, GA3, GA4 e GA5 reduz o rendimento da produção de açúcar GM2 e torna a sua purificação mais difícil. Está assim, dentro do âmbito da invenção para suprimir a formação destes produtos secundários. A actividade secundária de β-l,4 galacotsil-transferase pode ser vantajosamente suprimida usando um mutante incapaz de produzir UDP-Gal. Tal como ilustrado na figura 4, um tal mutante pode ser obtido através da ruptura 42 ΡΕ1991690 de um dos três seguintes genes: o gene galE que codifica para a UDP-glucose epimerase, o gene galU que codifica para a UDP-Glc pirofosforilase, e o gene pgm que codifica para a fosfoglucomutase. Assim, a invenção é dirigida para um método tal como acima definido para a produção de oligos-sacáridos sialilados, que é estendido para a produção da parte de hidrato de carbono do gangliósido GalNAcp-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc (GM2), em que o microrganismo compreende ainda sequências heterólogas que codificam para uma β-1,4-GalNActransferase, tal como o gene CgtAII de C. jejuni 0:36 estirpe ATCC No. de Acesso 43456, e uma UDP-GlcNAc 4 epimerase e em que o microorganismo tem, pelo menos, um dos três seguintes genes eliminados ou inactivados para interromper a produção endógena de UDP-Gal: o gene galE que codifica para a UDP-glucose epimerase, o gene que galU que codifica para pirof osforilase UDP-Glc, e o gene pgm que codifica para a fosfoglucomutase, evitando essa perturbação a produção de produtos secundários tais como GA2, GA3, GA4 e GA5.

Produção de açúcar GD2 0 sistema para a produção de açúcar GD3 pode ser estendido para a produção da porção de hidrato de carbono do gangliósido GD2 através da expressão dos genes heterólogos adicionais que codificam para uma UDP-GlcNAc 4 epimerase e uma β-l,4-GalNActransferase que utilizam o GD3 açúcar como aceitador, tal como a proteína CgtAII de C. jejuni 0:36 estirpe ATCC número de acesso 43456. 43 ΡΕ1991690

Neste sistema, tanto a sialiltransferase CstII como a CgtAII GalNAc transferase competem para a utilização de sialil-lactose como aceitador (figura 5). Para favorecer a produção de açúcar GD2, reduzimos a expressão de cgtAII na primeira fase da cultura (para permitir a conversão da sialil-lactose essencialmente no açúcar GD3) e em seguida aumentar a expressão de cgtAII numa segunda fase para converter GD3 em GD2. Isto pode ser feito colocando o gene cgtAII sob o controlo de um promotor que é regulado de forma independente por promotores que controlam os outros genes. A actividade secundária de β-l,4-galactosil-transferase da proteína CgtAII pode resultar na produção de análogos galactosilados tais como os compostos GA2 GA5 e GA6 representados na figura 5. Embora esses oligossacáridos possam ser de interesse, também está dentro do âmbito da invenção evitar a formação destes produtos secundários usando uma estirpe mutante incapaz de produzir UDP-Gal como descrito acima para a produção de GM2 para conduzir a uma produção específica de GD2.

Produção de GDlb, GTlc, GTlb, GQlb, GQlc e açúcares GPlc A produção de açúcar GDlb (Gaip-3GalNAcP-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-3)Gaip-4Glc) e açúcar GTlc (Gaip-3GalNAcP~4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gaip-4Glc) pode ser conseguida utilizando a mesma combinação de genes que no sistema de produção do açúcar GD2 descrito acima e, adicionalmente, pela expressão de um gene de β-3 Gal 44 ΡΕ1991690 transferase. Aqui, o microrganismo compreende ainda sequências heterólogas que codificam para UDP-GlcNAc 4-epimerase, uma β-l,4-GalNActransferase que utiliza o açúcar GD3 e GT3 como aceitador, tal como a proteína CgtAII de C. jejuni 0:36 estirpe ATCC No Acesso 43456 e uma β-1,3-galactosiltransferase, tal como o gene cgtB da estirpe C. jejuni 0:2 NCTC No Acesso 11168. 0 sistema para a produção de GDlb e GTlc pode ser estendido para a produção de GTlb, GQlc, GQlb e GPlc pela expressão de um gene que codifica para uma sialiltransferase que é capaz de utilizar GDlb e GTlc como aceitador.

Produção de açúcares GDla e GTla A estratégia para a produção de açúcar GTla é ilustrada na figura 6, e baseia-se na co-expressão do gene cstll para a sialiltransferase bifuncional com o gene cgtA, que codificam para uma β-1,46ηΐΝΑο transferase que não usa açúcar GD3 como aceitador, sendo os produtos finais açúcares GD3, GDla e açúcares GTla. Aqui, a invenção refere-se a um método de acordo como descrito acima para a produção de oligossacáridos sialilados que é aplicado para produzir especificamente Neu5Acα-3Galβ-3GalNAcβ-4 (Neu5Aca-3)Ga^-4Glc (GDla) e Νευ5Αοα-8Ν6υ5Αοα-36η1β-36ηΐΝΑοβ-4(Neu5Aca-3)Ga^-4Glc(GTla), em que o microorganismo compreende sequências heterólogas que codificam para uma a-2,3 a-2,8-sialiltransferase bifuncional, tal como o gene ΡΕ1991690 cstll da estirpe C. jejuni No Acesso ATCC 43438, de uma β-1,4-GalNAc transferase, tal como o gene cgtAII da estirpe C. jejuni 0:36 ATCC com o No de Acesso 43456, que não usa o açúcar GD3 como aceitador e uma β-3 Gal transferase, tal como o gene cgtB da estirpe C. jejuni 0:2 No. Acesso NCTC 11168.

Produção de LSTD (sialil-LNnT) e oligossacáridos X sialil-Lewis Já foi descrito que o tetrassacárido LNnT (Ga^-4GlcNAc β-363ΐβ-461ο) pode ser produzido a partir de lactose exógena pela estirpe metabolicamente modificada que expressa o gene lgtA e IgtB que codifica para a β-1,3 GlcNAc transferase e β-1,4 Galactosiltransferase respecti-vamente (Priem et al., 2002). O sistema acima para a produção de oligossacáridos sialilados pode ser estendido para a produção do pentassacárido LSTD (Neu5Ac a-3Ga^-461οΝΑοβ-363ΐβ-46ΐσ) através da expressão do gene de adicional nst e neuBCA numa estirpe nanK-, nanA- -, como ilustrado na figura 7 . 0 sistema para a síntese de LSTd pode ser combinado com o sistema de fucosilação que já descrevemos para a produção do oligossacárido X de Lewis (Dumon et al., 2004) para produzir oligossacáridos que

transportam o motivo X sialil-Lewis (Neu5Aca-3Ga^-4(Fuca-3)61οΝ3θβ-) na sua extremidade não redutora. A este respeito, o microrganismo compreende ainda uma sequência heteróloga que codifica para uma <x-l, 3-fucosil-transfe-rase, tal como o Helicobacter pylori futA (por exemplo SEQ 46 ΡΕ1991690 ID No 18 - a partir de Helicobacter pylori No de Acesso ATCC 26695) e futB (por exemplo SEQ ID No 19 - a partir de Helicobacter pylori com o No de Acesso ATCC 26695).

Produção do hexassacárido sialosil galactosil globósido (SGG)

Verificou-se que o sialosil galactosil globósido (Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcp-3Gala-4Gaip-4Gal) era o receptor de ligação preferencial para Escherichia coli uropatogénicas (Stapleton et al. , 1998) e poderia, potencialmente, ser utilizado como um agente anti-infeccioso. A produção do hexassacárido SGG a partir da globotriose foi recentemente descrita utilizando ácido siálico adicionado exogenamente (produção eficiente de açúcares globósidos utilizando microrganismos metabolicamente modificados no nosso pedido de Patente US 60/711, 406). A produção do hexassacárido SGG foi realizada por uma estripe nanA-melA que expressa (i) o gene IgtD de Haemophilus influenzae (estirpe rd) que codificava tanto uma GalNAc transferase como actividades de galactosiltransferase, (ii) a nst sialiltransferase (a-2,3-sialiltransferase, tal como, por exemplo, a partir de N. meningitidis, como a estirpe MC58: GenBank número de acesso U60660 - ID SEQ No 5, protein_id = AAC44541.1 - ID SEQ No 6) , que catalisa a transferência de uma porção de sialilo de uma molécula de ácido siálico activado para uma globopentaose para formar o hexassacárido sialosil galactosil globósido (SGG) , (iii) o gene para neuA CMP Neu5Ac-sintase e (iv) o gene wbpP para UDP-GlcNAc-epimerase. 47 ΡΕ1991690

Este sistema foi modificado para funcionar sem a adição de ácido siálico utilizando uma estirpe nanK-nanA-melA e por, adicionalmente, expressar os genes neuABC como ilustrado na figura 8.

Nalgumas formas de realização, os microorganismos são manipulados para melhorar o transporte de um aceitador de sacárido para a célula. Aqui, onde a lactose ou a globotriose é o sacárido aceitador, células de E. coli que expressam ou sobre-expressam a permease LacY podem ser usadas.

Assim, a invenção abrange o método acima, em que o microorganismo é cultivado num meio com globotriose e é LacY+, MelA~, nanT+, nanA~, nanK e compreende lgtD heterólogos, genes de a-2,3-sialiltransferase e UGP-GlcNAc C4 epimerase, bem como os genes neuABC.

Também se descreve aqui um método de acoplamento, em que um primeiro microrganismo é utilizado para preparar globósidos. Como mencionado acima, o meio de cultura pode incluir lactose ou globotriose mas não há necessidade de fornecer o ácido siálico na configuração aqui, uma vez que é produzido internamente. Quando se utiliza a globotriose, também se contempla aqui um conjunto de dois microrganismos separados, o referido primeiro microorganismo cultivado num meio com a lactose e sendo LacY+, LacZ-, MelA- e que compreende um gene lgtC heterólogo para produzir globotrio- 48 ΡΕ1991690 se (a enzima a-l,4-Gal transferase pode ser codificada, por exemplo, pelos genes LgtC de N. meningitidis, N. gonorrhoeae ou Haemophilus influenzae, ou mais particularmente pelo gene LgtC de Neisseria meningititis Ll (126E) número de acesso GenBank U65788 - SEQ ID No 7, protein_id AAB48385 - SEQ ID No 8); sendo o segundo microorganismo cultivado num meio com globotriose e sendo LacY+, MelA-, nanT+, nanA-, nanK- e compreendendo genes IgtD, wbpP e nst heterólogos bem como os genes neuABC. 0 gene IgtD codifica para uma β-3 GalNAc transferase para catalisar a transferência de uma porção galactose de UDP-Gal para globote-traose para formar globopentaose (actividade de β-3 Gal transferase) . Por exemplo, pode ser utilizado o gene IgtD de Haemophilus influenzae HI1578, número de acesso GenBank U32832 - SEQ ID No 9, protein_id = AAC23227 - SEQ ID N 10.

Produção de sialilgalactose

Foi recentemente mostrado que o mutante galK sem actividade de galactocinase pode utilizar galactose exógena como aceitador para a síntese de oligossacáridos com uma galactose redutora terminal (Dumon et al, 2005) . O método para a produção de oligossacáridos sialilados como descrito acima pode ser vantajosamente utilizado para produzir o dissacárido sialil-galactose (Neu5Acct-3Gal) por um microorganismo galK-, nanA- e nanK- (ou nanKEAT-) que expressam o gene para a sialiltransferase e os genes neuBCA cultivado num meio com galactose. ΡΕ1991690

Produção de oligossacáridos sialilados com uma galactose redutora terminal 0 método para a síntese de siali-galactose pode ser adaptado para a produção de análogos de toda a estrutura sialilada mencionada acima. A utilização de galactose como aceitante, em lugar de lactose resulta na formação de análogos que não possuem o resíduo terminal de glucose.

Produção de oligossacáridos sialilados com uma lactose ou galactose terminal transportando funções químicas latentes A ampla especificidade da permease de açúcar pode ser utilizada para internalizar derivados de lactose ou galactose que transportam funções químicas latentes para produzir oligossacáridos conjugáveis. Esta estratégia tem sido aplicada com sucesso para a síntese das porções de oligossacárido dos gangliósidos GM2 e GM3 com uma aglicona alilo ou propargilo (Forte et al, 2005) . A função alcino torna possível uma adição azido sob condições aquosas e a função alceno pode ser ou convertida num aldeído a ser ligado a proteínas por aminação redutiva, ou ser trans formado num grupo amino versátil pela adição de cisteamina. Outra função química, tais como azida ou um grupo amina, também pode ser usada. Todos estes derivados da lactose ou galactose pode ser vantajosamente utilizados para produzir análogos conjugáveis de toda a estrutura sialilada mencionada acima. 50 ΡΕ1991690

Produção de oligossacáridos sialilados com estrutura quito-oligossacárido na sua extremidade redutora

Verificou-se que as estirpes de E. coli que sobre-expressam o gene de Azorhizobium caulinodans nodC de quitina-oligossacárido sintase foram produziam mais do que 2 g.L-1 de quitinapentaose quando elas foram cultivadas a elevada densidade celular (Samain et al., 1997) . Uma vez produzida no citoplasma, a quitinapentaose pode servir como receptor de glicosiltransferases que reconhecem um resíduo GlcNAc não redutor terminal. Esta estratégia foi utilizada para a síntese do hexassacárido Gaip-4[GlcNAcP-4]4GlcNAc por uma estirpe de E. coli que co-expressa o gene nodC de Azorhizobium caulinodans e o gene lgtB de Neisseria meningitidis para β-l, 4-galactosiltransferase (Bettler et al., 1999). O motivo N-acetil-lactosamina terminal deste hexassacárido é um aceitador da sialiltransferase. O heptassacárido sialilado Neu5Aca-3Gaip-4[GlcNAcP-4] 4GlcNAc pode assim ser vantajosamente produzido em estirpes nanK, nanA mutantes de co-expressam nodC, lgtB, nst e neuBCA. Uma estratégia desenvolvida recentemente para reduzir este tamanho é de hidrolisar enzimaticamente a quitinapentaose por uma quitinase nas bactérias vivas assim que é produzida por NodC (Cottaz & Samain, 2005) . Nós descobrimos que é possível no âmbito do método da invenção evitar a formação de um iniciador grande dimensão da quitinapentaose, o que aumenta consideravelmente o peso molecular das estruturas alvo, utilizando, por exemplo, o gene da quitinase do Bacillus circulans. 51 ΡΕ1991690

Tal como ilustrado na figura 9, o método da invenção permite a formação do tetrassacárido sialilado Neu5Aca-3Gaip-4GlcNAcp-4GlcNAc por estirpes nanK-, nanA-que co-expressam nodC, chiA, lgtB, nst e neuBCA. Assim, a invenção refere-se ao método cima; ou, alternativamente, a um método em que nenhum exógeno é adicionado ao meio de cultura; para a produção de oligossacáridos sialilados com estrutura de quito-oligossacárido na sua extremidade redutora, tal como o heptassacárido sialilado Neu5Aca-3Gaip-4 [GlcNAcP-4] 4G1cNAc, em que a sialil-transferase é uma a-2,3-sialiltransferase, como o gene nst de Neisseria, e o microrganismo compreende ainda uma quitina oligossa-cárido sintase, tais como o gene nodC de Azorhizobium caulinodans e um gene p-1,4-galactosiltransferase tal como o gene lgtB da Neisseria meningitidis. Pode ser estendido para a produção de tetrassacárido sialilado Neu5Aca-3Galp-4GlcNAcp-4GlcNAc, em que o microrganismo compreende ainda uma sequência heteróloga que codifica para uma quitinase, tal como o gene chiA.

Ainda noutro aspecto, a invenção refere-se ao microrganismo como definido acima, bem como a um meio de cultura celular que compreende um precursor exógeno seleccionado de entre lactose, galactose, p-galactósido e, α-galactósido como globotriose (Gala-4Gaip-4Glc) e o referido microrganismo.

Exemplo 1: construção de mutantes nanA, nanKA e nanKETA

Todos os mutantes foram construídos a partir de 52 ΡΕ1991690 estripe DC (Dumon et al., 2005), que era um derivado da estirpe DHl com as mutações lacZ e lacA. Uma vez que todos os derivados da estirpe DHl são mutante recA, foram transformadas com o plasmideo de baixo número de cópias pEXT22 (Dykxhoorn et al., 1996) transportando um gene funcional recA e uma resistência à canamicina para recuperar um fenótipo transiente RecA+ para o processo de inactivação do gene que envolveu recombinação de ADN. Uma vez que o gene tenha sido inactivado, o plasmideo foi curado pelo crescimento da célula sem a canamicina e rastreio do fenótipo RecA”. A estirpe AZL foi construída a partir da estirpe DC por inactivação de nanA usando o plasmideo suicida pMAK705 (Hamilton et al, 1989) como anteriormente descrito (Priem et al., 2002).

Para construir a estirpe ZLKA a partir da estirpe DC, os genes nanKETA foram inactivados através da remoção de um segmento de 3,339 kb no ADN cromossómico utilizando o processo anteriormente descrito de um só passo que emprega iniciadores de PCR para proporcionar a homologia com a sequência alvo (Datsenko e Wanner, 2000) . A sequência do iniciador a montante era 5'GCAATTATTGATTCGGCGGATGGTTTGCCGA-TGGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTT C (SEQ ID No: 11) e a sequência do iniciador a jusante era 5'CTCGTCACCCTGCCCGGCGCGCGTGAAAATA-GTTTTCGCATATGAATATCCTCCTT AG. ((SEQ DD N 12). O mesmo procedimento foi utilizado para inactivar o gene nanK na estirpe AZL para obter a estirpe AZK excepto 53 ΡΕ1991690 que o tamanho do fragmento deletado era 0,537 kb e que a sequência do iniciador a montante era 5' CACTGGCGATTGATATC-GGCGGTACTAAACTTGCCGCCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID No 13).

Exemplo 2: Clonagem de genes neuBCA

Um fragmento de ADN 2,995 contendo a sequência dos genes neuBCA foi amplificado por PCR utilizando o ADN genómico de Campylobacter jejuni estirpe ATCC 43438, como molde. Um local Kpnl foi adicionado ao iniciador esquerdo: 5'GGTACCTAAGGAGGAAAATAAATGAAAGAAATAAAAATACAA (SEQ ID No 14) e um local Xhol foi adicionado ao iniciador direito 5'CTCGAGTTAAGTCTCTAATCGATTGTTTTCCAATG (SEQ ID No 15). O fragmento amplificado foi primeiro clonado no vector pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) e, em seguida, sub-clonado nos locais Kpnl e Xhol do vector pBBRl-MCS3 para formar pBBR3-SS.

Exemplo 3: Produção de slalll-lactose por estirpes de E. coli metabolicamente modificadas A produção de sialil-lactose foi investigada com diferentes estirpes mutantes que continham o gene nst de N. meningitidis para a-2,3 sialiltransferase e o plasmídeo pBBR3-SS que continha os genes neuC, neuB e neuA de C. jejuni que codifica para a N-acetilglucosamina-6-fosfato-epimerase, ácido siálico sintetase e CMP-Neu5Ac-sintetase, respectivamente. A produção de sialil-lactose foi estimada pela quantificação colorimétrica de ácido siálico tanto na 54 ΡΕ1991690 fracção intracelular como na fracção extracelular (Tabela 2) . Os resultados mostraram que o mutante nanA AWl e a estirpe DC6, que não continha qualquer mutação no operão de ácido siálico, produziram uma baixa quantidade de sialil-lactose, com um rendimento de produção semelhantes. Os dois mutantes AZKl e DC7 que continham as mutações nanK e nanA tanto produziam ambos quatro vezes maiores quantidades de sialil-lactose. Não se detectou qualquer ácido siálico na cultura de controlo de DC7 incubada sem lactose, indicando que o nivel elevado de ácido siálico total correspondeu à formação de sialil-lactose. A melhoria da produção de sialil-lactose, também foi confirmado por análise por TLC, que mostrou que a banda correspondente a sialil-lactose foi muito mais intensa nos extractos de DC7 e AZKl do que nos extractos de DC6 e AWl.

Tabela 2. Quantificação colorimétrica do ácido siálico em fracções intracelulares e extracelulares de culturas de células de elevada densidade de estirpes qeneticamente modificadas para a produção de sialil-lactose

Estirpe mutação genes heterólogos expressos aceitador Concentração de Neu5Ac (g.L 5 intracelular extracelular DC nenhum lactose 0 0 DC6 neuBCA nst lactose 0,94 0,43 Ml nanA neuBCA nst lactose 1,13 0,27 DC7 nanKEtTA neuBCA nst lactose 2,32 3,25 DC7 nanKETA neuBCA nst nenhum 0,11 0 DOO nanKETA neuBCA lactose 0 0 AZKl nahKnanA neuBCA nst lactose 2,16 2,93 55 ΡΕ1991690 0 ácido siálico total foi quantificado pelo método da difenilamina (Werner & Odin, 1952). As culturas foram incubadas 30 horas após a adição de lactose fornecida a uma concentração de 7,5 g/L, com excepção para a cultura de controlo de DC7 sem lactose.

Exemplo 4: Produção em larga escala de sialil-lactose com alimentação contínua de lactose

Este rendimento de produção foi aumentado através do alargamento do tempo de cultura para 71 horas. A lactose foi adicionada a uma concentração de 2 g.L’1 no inicio das fases de fed-batch. Primeiro foi adicionada continuamente com uma taxa de alimentação de 0,52 g.L’1.]!’1 durante 5 horas na fase com uma elevada taxa de alimentação de glicerol. A taxa alimentação de lactose foi então reduzido para 0,3 g.L’1.]!’1 até ao fim da cultura na segunda fase com uma baixa taxa de alimentação de glicerol. A análise por TLC mostrou que a sialil-lactose (composto 2, Figura 10) foi produzida continuamente, até ao final da cultura, e que a produção de sialil-lactose não era limitada pelo fornecimento de lactose (composto 1) , que pôde sempre ser detectada em pequenas quantidades ao longo da cultura na fracção intracelular.

A quantificação colorimétrica de ácido siálico indicou que sialil-lactose acumulou principalmente na fracção intracelular na primeira parte da cultura. A 56 ΡΕ1991690 concentração intracelular de sialil-lactose, em seguida estabilizou a cerca de 10 g.L-1 e a sialil-lactose, que foi produzida adicionalmente, e foi em seguida secretada no meio extracelular onde acumulou a uma concentração final de 15,5 g.L-1 (Figura 11).

Exemplo 5: Purificação de sialil-lactose

Purificou-se sialil-lactose a partir de um litro de cultura DC7 obtida como descrito no exemplo 4. No final da cultura, a fracção extracelular foi separada das células por centrifugação. O pH da fracção extracelular foi reduzido para 3,00 por adição de uma resina fortemente permutadora de catiões (Amberlite IR120 forma H+) . Isto resultou na precipitação de proteínas, que foram removidas por centrifugação. O pH do sobrenadante clarificado foi então ajustado para 6,0 por meio da adição de um permutador aniónica fraco (Dowex 66 forma de base livre) e metade do sobrenadante foi, em seguida, carregado sobre uma coluna de Dowex 1 (forma HC03) (5 x 20 cm) . Reteve-se sialil-lactose pela resina Dowex 1 e, após lavagem com água destilada, foi eluída com um gradiente contínuo de 0-500 mM de NaHC03. O mesmo procedimento foi repetido com a outra metade do sobrenadante. As fracções eluídas contendo sialil-lactose foram reunidas e o NaHC03 foi removido por um tratamento com Amberlite IR120 (forma H+) até pH 3,0. O pH foi ajustado a 6,0 com NaOH e a sialil-lactose foi liofilizada.

Para a purificação da fracção intracelular, as 57 ΡΕ1991690 células foram permeabilizadas por aquecimento (100°C, 45 min) e ressuspendidas no mesmo volume do meio de cultura inicial. Os oligossacáridos difundem-se livremente no exterior das células e foram recuperados no sobrenadante após centrifugação. A purificação de sialil-lactose foi então levada a cabo utilizando o mesmo protocolo que para a fracção extracelular. A partir de um litro de cultura da estirpe DC7, o rendimento de sialil-lactose purificado foi de 9 gramas da fracção extracelular e 6 gramas da fracção intracelular. A identificação do produto purificado como sialil-lactose foi confirmada por análise de espectrometria de massa.

Exemplo 6: Produção de açúcares GD3 e GT3 A produção dos açúcares GD3 e GT3 a partir de lactose exógena e Neu5Ac foi previamente descrita utilizando a estirpe metabolicamente modificada que expressa o gene cstll de Campylobacter jejuni para a a-2,3 e a-2,8-sialiltransferase bifuncional (Antoine et al., 2005). Aqui investigámos a produção destes dois oligossacáridos sem fornecimento exógeno de ácido siálico utilizando o sistema descrito no exemplo 3. A estirpe NF3 produtora de GD3 foi um mutante nanKEAT que co-expressa cstll e neuBCA (Tabela I) . A estirpe NF3 foi cultivada em elevada densidade celular na presença de 3 g.L"1 de lactose. A análise por TLC (Figura 12) mostrou que a lactose foi completamente convertida nos três compostos que se presumiam ser os açúcares GM3 (1) GD3 (2) e GT3 (3) . 58 ΡΕ1991690 A fracção intracelular da cultura da estirpe NF03 foi purificada por cromatografia de troca iónica em Dowex 1 como descrito no exemplo 4 e três fracções de oligossacáridos que contêm os açúcares GM3, GD3, e GT3 respectivamente foram separadas. Os rendimentos das três fracções de açúcar foram de 0,16 g, 0,75 g e 1,26 g, respectivamente. A identificação foi confirmada por análise por espectrometria de massa das fracções purificadas.

Exemplo 7: Produção de açúcar GMl usando as sialiltrans-ferases de N. meningitidis e a UDP-GlcNAc C4 epimerase de P. aeruginosa. A produção de açúcar GMl a partir de lactose exógena e Neu5Ac foi descrita anteriormente utilizando uma estirpe metabolicamente modificada que expressa: (i) o gene nst de N. meningitidis para a-2,3-Sialyltranferase; (ii) o gene cgtA de C. jejuni 0:19 estirpe OH4384, que codifica para uma p-l,4-GalNAc transferase; (iii) o gene cgtB de Campylobacter jejuni NCTC 11168, que codifica para β-1,4-galactosiltransferase, (iv) o gene wbpP de P. aeruginosa, que codifica para uma UDP-GlcNAc C4 epimerase (Antoine et al., 2003). As primeiras tentativas para produzir açúcar GMl, sem a adição exógena de ácido siálico através da co-expressão de cgtA, cgtB e nst com neuBCA indicou que o passo limitante foi a conversão de sialil-lactose em açúcar GM2 pela CgtA GalNAc transferase. Verificou-se que as GalNAc transferases existem em versões diferentes 59 ΡΕ1991690 dependendo das estirpes de Campylobacter. Reportou-se que a versão cgtA clonada a partir da estirpe OH4384 tinha uma actividade especifica largamente inferior do que aquela das versões da estirpe ATCC 4356 ou NTCC 11168 (Gilbert et al.r 2002; Varki, 1993) . O gene cgtAII foi assim clonado por PCR a partir do ADN genómico da estirpe ATCC 4356 e sub-clonado com o gene nst num plasmídeo pBluescript, obtendo-se o plasmideo pBS-cgtAII-nst (Tabela I). O gene wbpP foi clonado a partir do plasmideo pBBRwbpP (Antoine et al.r 2003) a jusante do gene neuBCA em pBBR3-SS, obtendo-se a pBBR-SS-wbpP. Clonou-se cgtB a partir do plasmideo pACT3cgtAB (Antoine et al., 2003) no plasmideo pSU27-18, obtendo-se pSUl8-CGTB. A estirpe DC foi construída transformando a estirpe mutante nanKEA de ZLKA com os três plasmideos pBS-cgtAII-nst, pBBR-SS-wbpP e pSUl8-cgtB (tabela 1) .

Como mostrado na Figura 13, a estirpe DC15 não acumula o açúcar GM3 (1), indicando que o CgtAII da estirpe ATCC 4356 foi consideravelmente mais activa do que CgtA a partir de estirpe OH4384. No final da cultura, os principais produtos foram um composto (5) , que migrou mais lentamente do que o açúcar GML e um composto (2') que migrou como o açúcar GM2. Após purificação em Dowex 1, a análise por espectrometria de massa indicou que o composto (2') foi um análogo do açúcar GM2, que tem um resíduo Gal em vez de GalNAc e que foi ainda designado como açúcar GA2 (Tabela 3). A estrutura foi: Gaip-4(Neu5Aca-3)Galp4Glc. O espectro de massa do composto (5) sugeriu que era um 60 ΡΕ1991690 octassacárido disialilado formado pela transferência de dois resíduos de açúcar (um HexNAc e um Hex) no açúcar GDla. Uma vez que sendo estes dois açúcares mais provavelmente adicionados por CgtAII e CgtB, a estrutura do composto (5) , o qual foi posteriormente designado como açúcar GAl, é provavelmente: Gaip-3GalNAcP-4Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcP~4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc (Tabela 3).

Tabela 3 Estrutura de análogos de açúcar gangliósido formados como produtos secundários durante a síntese de açúcar gangliósido em razão da actividade de p-1,4 Galactosiltransferase da p-1,4-GalNActransferase de CgtA.

Estrutura nome no texto Gaip-3GalNAcP~4(Neu5Aca-3)Gaip-3GalNAcp- GAl 4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc Gaip-4(Neu5Aca-3)Gaip4Glc GA2 GalNAcP-4(Neu5Aca-3)Gaip-4(Neu5Aca-3)Gaip4Glc GA3 Gaip-4(Neu5Aca-3)Gaip~4(Neu5Aca-3)Gaip4Glc GA4 Neu5Aca-3Gaip-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc GA5 Gaip-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-3)Gaip4Glc GA 6

Exemplo 8: Produção de açúcar GMl usando a sialiltrans-ferase de N. meningitidis e a UDP-Gal C4 (GNE) epimerase de Campylobacter. O açúcar GA2 foi produzido por cultura de DC15 porque a CgtAII é extremamente activa e pode usar UDP-Gal como um doador de açúcar em vez de UDP-GalNAc em caso de 61 ΡΕ1991690 escassez de UDP-GalNAc. Uma vez que esta carência pode ser devida a uma actividade insuficiente da UDP-GlcNAc C4 epimerase codificada por wbpP, a utilização da epimerase codificada pelo gene gne de C. jejuni foi investigada. Mostrou-se recentemente que este gene era mais activo do que WbpP (Bernatchez et al., 2005). O gene gne foi clonado por PCR a partir do ADN genómico da estirpe C. jejuni NCTC 111168 e subclonado no plasmídeo pBBR-SS jusante dos genes neuBCA. O plasmídeo pBBR-SS-gne resultante foi usado para construir a estirpe DC21 que era semelhante à estirpe DC 15, excepto que expressava o gene gne em vez de wbpP. (Tabela 1).

Como mostrado na Figura 14, a expressão adicional de gne quase totalmente aboliu a acumulação de açúcar isoGM2 e os dois produtos principais foram o açúcar GMl (3) e o açúcar GAl (5) . O GMl acumulou-se transitoriamente; a sua concentração intracelular atingiu um máximo de 28 horas após a adição de lactose e depois diminuiu, devido à formação do composto (5).

Exemplo 9: Produção do açúcar GMl usando a sialiltrans-ferase CstIII de C. jejuni O gene cstIII foi clonado por PCR utilizando ADN genómico de C. jejuni 0:2 estirpe NCTC 11168, como um molde. O gene cstIII foi então sub-clonado no plasmídeo pBluescript a montante de cgtAII. O plasmídeo resultante pBS-cstIII-cgtAII foi utilizado para construir a estirpe 62 ΡΕ1991690 DC22 que também expressa cgtB e os genes neuBCA para a biossíntese de CMP-Neu5Ac. A análise por TLC (Figura 15) mostrou que o açúcar GMl (3) era quase o único oligossacárido encontrado na fracção intracelular da estirpe DC22 no final da cultura. Sialil-lactose (D e o açúcar GM2 (2) praticamente não foram detectados como intermediários. Após purificação em Dowexl como descrito no exemplo 5, o rendimento de açúcar GMl foi de 6 g a partir de um litro de cultura.

Exemplo 10: Produção do açúcar GM2 A produção do açúcar GM2 foi investigada com a estirpe ZWT que era semelhante à estirpe produtora de GMl DC21 excepto que não expressava o gene cgtB. Como mostrado na figura 16, a lactose foi muito rapidamente convertida pela estirpe ZWT em compostos (2) que migraram como GM2.

Surpreendentemente um composto (3) que migrou mais lenta mente que GM2 também foi produzido.

Os compostos (2) e (3) foram purificados a partir da fracção intracelular de cultura da estirpe ZWT por cromatografia em Dowexl. A análise por espectrometria de massa indicou que o composto purificado (2) constituída por uma mistura de açúcar GM2 e de um análogo do açúcar GA2. 0 espectro de massa ESI- da fracção B mostrou dois picos em m/z 1310 e 1269. 0 pico a m/z 1310 63 ΡΕ1991690 provavelmente corresponde aos iões quase-moleculares [(M+Na-H)-H]~ derivados do hexassacárido GalNAcP-4(NeuõAca-3)Gaip-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc que foi ainda designado como açúcar GA3 (Tabela 3). 0 segundo pico a m/z 1269 corresponde aos iões de quase-moleculares [(M+Na-H)-H]~ derivados da estrutura Gaip-4(Neu5Aca-3)Gaip-4(NeuõAca-3)Gaip-4Glc (chamado açúcar GA4). A formação do açúcar GA3 e GA4 é explicada tal como ilustrado na figura 11 por uma actividade colateral da Nst sialiltransferase que parece ser capaz de sialilar a extremidade não redutora Gal do açúcar GA2. 0 pentassacárido di-sialilado resultante (açúcar GA6) pode servir como aceitador para o CgtAII ser convertido em qualquer um dos açúcares GA3 ou GA4.

Exemplo 11: Construção de mutantes galU

Para construir o mutante galU, um fragmento de ADN de 1,88 kb contendo a sequência galU foi amplificado por PCR usando o ADN genómico de E. coli Kl2 como molde e os dois iniciadores seguintes: 5'CAATGCCAAATATGGGGAAC (SEQ ID No 16) e 5'GCGGCCGCGTCTTTTCTGGCTAA (SEQ ID No 17) 0 fragmento amplificado foi clonado no vector pCR4blunt-T0P0 (Invitrogen) e um fragmento de 0,244 kb localizado entre os dois locais Ndel presentes na sequência galU foi excisado por digestão com Ndel. O gene truncado galU foi subclonado nos locais Sail e Notl do vector pK03. 64 ΡΕ1991690 A inactivação de galU foi realizada na estirpe ZLKA de acordo com o protocolo de substituição de genes pK03 (Link et al., 1997), obtendo-se a estirpe hospedeira ZWU.

Exemplo 12: Produção de açúcar GM2 por mutantes galU A estirpe ZWU2 foi semelhante à estirpe ZWT utilizada para a produção do açúcar GM2 no exemplo 10, excepto que a estirpe ZWU galU foi usada como estirpe hospedeira em vez da estirpe ZLKA (Tabela 1) Como mostrado na Figura 17, não foram detectados mais produtos laterais (3) no final da cultura de ZWU2. Além disso a análise por espectrometria de massa mostrou que o composto (2) era apenas composta por açúcar GM2 e que o análogo de açúcar GA2, que estava presente no composto (2) purificado da cultura de ZWT, pôde ser detectado (figura 18).

Exemplo 13: Produção de açúcar GD2.

Uma primeira tentativa para produzir o açúcar GD2 foi realizada com a estirpe NF08, que foi construída através da transformação da estirpe hospedeira ZLKA com os três plasmídeos pUC18-cstII, pBBR3-SS-gne, pWKS-cgtAII (Tabela 1). A caracterização de oligossacáridos produzidos pela estirpe NF08 mostrou que os principais produtos foram o açúcar GM2 e o seu análogo de açúcar GA2 galactosilado.

Uma pequena quantidade de açúcar GD2 também foi formada mas foi purificada como uma mistura com os análogos galactosilados GA5 e GA6 (figura 5). 65 ΡΕ1991690 0 gene cgtAII foi sub-clonado no plasmídeo pBAD 33 sob o controlo do promotor de arabinose (Para) · Por este meio a expressão cgtAII pode ser regulada de forma independente a partir de outros genes que estavam sob o controlo do promotor Piac. A estirpe NF09 contendo o plasmideo pWKS-cgtAII em vez de pBAD33-cgtAII foi cultivada sem arabinose durante as primeiras 24 horas que se seguiram à adição de lactose (3 g.L"1) . A arabinose foi então adicionada e a estirpe foi cultivada por um período adicional de 24 horas. Esta estratégia resultou efectivamente na diminuição da produção do açúcar GM2 com um aumento concomitante no rendimento de açúcar GD2. No entanto, os análogos galactosilados GA5 ou GA6 foram ainda produzidos em quantidade significativa. Para evitar a formação destes análogos, que são muito difíceis de separar de GD2, a produção de GD2 foi investigada na estirpe mutante galU ZWUl. A estirpe ZWUl era semelhante à da estirpe NF09, excepto que a estirpe galU ZWU foi usada como estirpe hospedeira em vez da estirpe ZLKA (Tabela 1) . A arabinose foi adicionada depois de 25 horas de cultura para aumentar a expressão de cgtAII depois que quase toda a sialil-lactose ter desaparecido. A purificação da fracção intracelular em Dowexl conduzido para a separação de quatro fracções (Figura 19). A análise por espectrometria de massa indicou que a fracção A foi composta por açúcar GM2 e que a fracção B consistia no açúcar GD2. A Fracção C contida 66 ΡΕ1991690 principalmente GD3 e a Fracção D continha açúcares GT2. Não se detectaram quaisquer análogos de galactosilação e o açúcar GD2 foi obtido como o produto principal.

Exemplo 14: Produção de GDlb e GTl

Os dois genes cstll e cgtB foram clonados no mesmo plasmídeo pBluescript (pBS-cstII-cgtB). A estirpe NF21 foi construída pela transformação da estirpe hospedeira ZLKA com plasmídeo PBS-cstII-cgtB e os dois plasmídeos pBBR-SS-gne e pBAD33-cgtAII. A estirpe NF21 foi cultivada a alta densidade celular como descrito para a estirpe NF09 no exemplo 13 em condições que favoreceram a formação de GD2. Oligossacáridos produzidos a partir de uma cultura de um litro de estirpe NF21 foram purificados primeiro em Dowexl (HC03) resina e três fracções (A, B, e C) foram eluídas com um gradiente de NaHCCh (0-1 M) . A análise por espectrometria de massa indicou que a fracção A (490 mg) continha açúcar GDI, a fracção B (870 mg) continha uma mistura de açúcar GDI com GA5 ou análogo GA6, e que a Fracção C (960 mg) continha açúcar GTl e açúcares GDI e GTl foram purificados a partir da Fracção A e C por meio de cromatografia de exclusão molecular numa coluna Toyopearl HW40S usando NaHC03 a lOOmM como eluente. Como mostrado na Tabela 4, a análise de *Η RMN mostra que os desvios químicos de protões na extremidade H-l da galactose de ambos GDI e GTl eram muito próximos do valor 67 ΡΕ1991690 do H-l da galactose terminal de um açúcar GMl em que a galactose terminal não é substituída. Pelo contrário, o sinal de H-l da galactose terminal de GDla e GTla tem um desvio de 4,62 ppm devido à sua substituição com um ácido siálico. Estes resultados indicam claramente que os açúcares GDI e GTl produzidos pela estirpe NF21 tinha a estrutura de GDlb e GTlc.

Tabela 4 Desvio químico de protões RMN de açúcares gangliósidos a 343°K

Estirpe Açúcar Galactose Terminal Galactose Interna GalNAc Glucose purificado H-l H-3 H-l H-3 H-l α H-l β H-l DC22 GMla 4,57 3,84 4,56 4,17 4,83 5,25 4,68 NF17 GDla 4,62 4,11 4,54 4,17 4,83 5,25 4,68 NF17 GTla 4,62 nd 4,53 nd 4,83 5,25 4,68 NF21 GDlb 4,55 nd 4,53 nd 4,83 5,25 4,68 NF21 GTlc 4,55 3,81 4,52 4,17 4,83 5,25 4,68

Exemplo 15: Produção do açúcar GTla

Os dois genes cstll e cgtA foram clonados no mesmo plasmídeo pBluescript para ser co-expresso com os genes cgtB e neuABC numa estirpe hospedeira mutante nanKEAT ZLKA (Tabela 1). 0 gene cstll foi clonado a jusante de cgtA para ter uma expressão máxima de cgtA e uma expressão menor de cstll, de modo a minimizar a formação de GD3. Como mostrado na figura 20, a análise por TLC da cultura NF17 indicou que os compostos que migram como a sialil-lactose 68 ΡΕ1991690 (1) e o açúcar GMl (3) foram produzidos transitoriamente. Uma pequena quantidade do composto (2) que migrou como GD3 foi recuperada no final da cultura, mas os principais produtos finais foram compostos (4) e (5) que migraram mais lentamente do que GMl. A análise por espectrometria de massa de compostos purificados indicou que os compostos (4) e (5) têm um peso molecular correspondente a GDla e a GTla respectivamente.

Exemplo 16: Produção de sialilgalactose A estirpe GLKA foi construído pela deleção dos genes nanKEAT no cromossoma da estirpe mutante GalK GLK (Dumon et al.r 2005). A estirpe GLK7 foi obtida transformando a estirpe GLKA com o plasmídeo pBS-nst e pBBR3-SS (Tabela 1). O crescimento da estirpe GLK7 estirpe de elevada densidade celular na presença de 3 g-L-1 de galactose resultou na formação de um dissacárido, que foi identificado como sialilgalactose por análise de espectrometria de massa. O rendimento de produção sialilgalactose foi estimado em 6 g.L"1 por quantificação colorimétrica do ácido siálico total.

Exemplo 17: Produção do tetrassacárido Neu5Aca-3Galp-4 G1οΝΑοβ—4 G1cNAc O plasmídeo pBS-nst-nodC foi construído por clonagem do gene nodC de A. caulinodans do plasmídeo pBS- 69 ΡΕ1991690 nodC (Cottaz & Samain, 2005) nos locais EcoRV Kpnl de pBS-nst. A estirpe SN4 foi obtida pela transformação da estirpe ZLKA com os três plasmideos PBS-NST-nodC, pBBR3-SS, pWKS-lgtB-chiA (Tabela 1) . O cultivo da estirpe SN4 de elevada densidade celular resultou na produção de um oligossacárido principal que foi identificado como Neu5Aca-3Gaip-4GlcNAcP-4GlcNAc por análise de espectrometria de massa.

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) SAMAIN, Eric <120> Método para a produção de oligossacáridos sialilados <130> D24149 <150> 60/780,350 <151> 2006-03-09 <160> 19 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 876

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> Glicosiltransferases de Campylobacter, número de acesso NCBI AR271701 <4 0 0> 1 60 120 ISO 240 300 360 420 480 340 soo S6D 720 760 64 0 atgaaa*&ag fctâttsktge iggasafcggà c<5a*gt*taa sagasattga ctaceaaatg amtgatgí: atttagatgc aatcaatttt atmgaaga çaaataetat ctfcggt 35Í&5 3. atfceaaagc agt&i&fctac a&tcctggtc acaacactac actttaaaag âtttaatasc* aaôteaagââ tatgagaeeg aaçtaattat gtgfctefcaafc t&K&acrcaag cteatcfcaga aa<3tg«a*afc U-tglraaaaa ctttttacga ttattttccfc gatgctcatt tgggafcatga mttttaaa c*actta«a« a*ma«tge uat&u*aai. kfctcacg»»* tttatet:©** tcfeaagastt «b*t«saggag -tietafca.tgtg · ftgcagfcas^ atagccckag gatacaaaga áafcfctatetfc .tetgg&atfcg atttttsS-sâ aaatgggtea tq-Statgctt ttgataccaa aca&ga&aat cctttaaaac fçfgctcítga ttttaaaaat gafccgcicac ««tatatogg «cakagtaaa **fc®c*g*6« taaaagcttt agaafcttcta .gaaaaaacci: a«aaaataaa actatattgc ttatgtccta acagtettct ageaaatttc. at-agaactag cgccaaattfc aaettcaaat tttatc&tac aagaà&aa&a taactacact aaagatataq t*atacctte iagtgagget tatggaaaat ttfe^aaaaaa tattaattfck aaaaaaak.aa aaafctaaaga aaaEatttat tiioaagttga taaaag&tct actaagattâ oe^agtgata taaagcãtts tfctcaaagga aaafcaa <210> 2 <211> 876

<212> ADN <213> Campylobacter jejuni <220> <223> Alfa-2,3/alfa 2,8-sialiltransferase sialiltransferase II de Campylobacter, número de acesso NCBI AX934427 <400> 2 &tgaa«aaag Ktsfctattgc tggaaatgg» ccaagttta» aagaaa&tga ttattcaagg ¢0 et»«caa«tg amtgatgt amagetgo «atesam*· àttttgaega tasatactat 120

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<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

NCBI <223> Glicosiltransferases de Campylobacter, número de acesso AR271702 <400> 3 atgaaaaaag ttattattge tggaaatggà ccaagtttaa «açaaattga ttaitcaaga 60

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<212> ADN <213> Campylobacter jejuni <22 0>

NCBI <223> Glicotransferases de Campylobacter, número de acesso AX934 42 9 <400> 4 atgaaaaaag ttatfcattgc fcggaaafcgga ccaagfctfcaa a-agàaattga ttattcaaga 64> ctaecaaatg afctttgatgt afe«.tagatg& a*tc*«fcfcfcfc atttfcgaaga taaatactafc 120

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<211> 1116 <212> ADN <213> Neisseria meningitidis <220> <223> nst alfa-2,3-sialiltransferase, número de acesso GenBanK U60660 <400> 5 atgggct"ga aaseggc»«g ttfcg&eogtg- fctgtgEtxga ttgfcttttfcg tatcgggate 60 ttttâtacgt £tgà£Cg§$t ââátcs^gg gsaaggâãtL? eggtltecbt' $et$diag$ag 120

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<212> PRT <213> Neisseria meningitidis <22 0> <223> Alfa-2,3-sialiltransferase, Protein id AAC44541.1 <400> 6

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<212> ADN <213> Haemophilus influenzae <220> <223> gene lgtD, GenBank sob o número de acesso U32832 81 ΡΕ1991690 <400> 9 atgq««âatt gfcee&ttsçt: Atcggttatt gtttgtgefcfc etaacgceg® gcaatatata 60 gatg&aegca tttcarccet s:«ttaateag sestatgacss atetsgaaat tatagtsate · 120 satgaeggtt «ase*g*S:fct. g&ctttgtet sactrégaag asatatctsa *otag*ç*as · 100 aggaEâaaaa ttsicirgtaa taaatatast ttagggrtca tasattcttt· gsatataggc 240 «tfcggttgte tttç&ggtââ atattttgcs agaatggâbg stg.a£gatát. égfítaaãcçs 3ΰΰ bcgtggattg agaaa*t»gt fcacstafcctg gaga&a.aatg atoatactac agcaatggge 360 testaett«g aqatt&fctgt açaaaasgaa egtggaatta tcggttctca atatas&act 420 ggsgatatst ggaaaaatee attgetacat eatgatattt gtgaagetat gçmtctae. 488 aafceegatac staaeaaçae catgatfcatg agagcaaaeg' tatatagaga gcataaatta 540 atetttiata «agattaies gtatgeagaa"gattstaagt tttggtcaga ggttagtagg €00 «ttggttgtt tagetaatfca teetgsages ttagtaaaat atagactaea tgqaaaceaa '€60 eeatcatcag tfctataafcca tqagcaaaat gagacagcte* aaaagstaaa gagggaaaat 728 accttaats* gataggfcafca gatat&aaag taattastag tgtgfccgfcfcg 180 ct»gaa»fcat atcatgegga taaaagfcaat aaagtgttga · aaagtatact ttatgsgatg· «40 taftatgagefc tagataaat# taetataact tcactettae aetttattaa atatcatett 000 gaattatttg atttaaagca «aatttaaag attataaaaa agttcaeaag aasaataaat 960 gttatatttt ag 012 <210> 10 <211> 323

<212> PRT <213> Haemophilus influenzae <22 0> <223> lgtD, protein id AAC23227 <4 0 0> 10

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Lisboa, 11 de abril de 2104

Claims (8)

1. ΡΕ1991690 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a produção de oligossacáridos compreendendo pelo menos um resíduo de ácido siálico, aqui referidos oligossacáridos sialilados, que compreende o passo de cultura de um microrganismo num meio de cultura, compreendendo opcionalmente, um precursor exógeno, em que o referido microrganismo compreende genes heterólogos que codificam para uma CMP-Neu5Ac-sintetase, uma ácido siálico sintase, uma GlcNAc-6-fosfato 2 epimerase e uma sialil-transferase, e em que os genes endógenos que codificam para a ácido siálico aldolase (NanA) e para ManNAc cinase (NanK) foram deletados ou inactivados, sendo esse microrganismo capaz de produzir ácido siálico activado internamente. 2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o gene heterólogo sialiltransferase é seleccionado de a-2,3-sialiltransferase, a-2,3- e a-2,8-sialiltransferase (cstll), e a-2,6-sialiltransferase. 3. 0 método de acordo com uma das reivindicações 1 a 2, em que o gene da CMP-Neu5Ac sintetase heterólogo é neuA, o gene ácido siálico sintase heterólogo é neuB, e o gene da GlcNAc-6-fosfato-2-epimerase heterólogo é neuC. 4. 0 método de acordo com a reivindicação 3, em que os genes neuA, neuB, e o neuC são isolados de estirpes 2 ΡΕ1991690 de bactérias que contém a estrutura sialilada no seu envelope celular, tais como C. jejuni estirpe ATCC No. de Acesso 43438.
2. 5. O método de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, em que os genes nanT, nanA, nanK e nanE são deletados ou inactivados. 6. 0 método de acordo com uma das reivindi cações 1 a 5, em que o referido microorganismo codifica ainda para uma proteína que facilita a assimilação de lactose e carece de enzimas que metabolizam a lactose. 7. 0 método de acordo com uma das reivindi cações 1 a 6, em que o referido microrganismo é uma estirpe de E. coli que é LacY+, LacZ, e opcionalmente MelA-. 8. 0 método de acordo com uma das reivindi cações 1 a 7, em que o precursor exógeno é seleccionado de lactose, galactose, β-galactósido e, α-galactósido, tal como globotriose (Gal a-4Gaip-4Glc).
3. 9. Um microrganismo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
4. 10. Um meio de cultura celular que compreende lactose como precursor e o microrganismo de acordo com a reivindicação 9. 3 ΡΕ1991690 11. 0 método de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, para a produção de 3'sialil-lactose ou 6'sialil-lactose, em que o microrganismo pode ser cultivado a elevada densidade celular num substrato de carbono, tal como glucose ou glicerol, e alimentada com lactose que é internalizada pela a lactose permease e sialilado pela referida sialiltransferase recombinante usando o CMP-Neu5Ac gerado endogenamente de UDP-GlcNAc. 12. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para a produção de GD3, em que o gene de sialiltransferase heterólogo é bifuncional a-2,3 e a-2,8 sialiltransferase, tal como o gene cstll de Campylobacter jejuni depositada sob o número de acesso ATCC 43438, que catalisa a transferência de uma porção sialilo de uma molécula de ácido siálico activado produzida internamente para o Neu5Aca-3Gaip-4Glc (GM3) para formar Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip-4Glc (GD3). 13. 0 método de acordo com a reivindicação 12, que é estendido para a produção de GT3, em que o microrganismo é ainda cultivado de tal modo que a sialiltransferase bifuncional catalisa a transferência de uma porção sialilo de uma molécula de ácido siálico activada produzida internamente para o Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip-4Glc (GD3) para formar Neu5Ac5a-8Neu5Aca-8Neu5Aca-3Galp-4Glc (GT3). 14. 0 método de acordo com a reivindicação 11 4 ΡΕ1991690 que é estendido para a produção da porção de hidrato de carbono do gangliósido Gaip-3GalNAcP~4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc (GMl), em que o microrganismo compreende ainda sequências heterólogas que codificam para p-1,4GalNActransferase e P~ 1,3-galactosiltransferase, em que a p-1,4GalNActransferase transfere um resíduo UDP-GalNac para a sialil-lactose (GM3) para formar GalNAcP-4(Neu5Aca-3)Gaip~4Glc (GM2) e 1 p-1,3-galactosiltransferase transfere um resíduo galactosilo para GM2 para formar GMLl. 15. 0 método de acordo com a reivindicação 14, em que o microrganismo compreende ainda uma sequência heteróloga que codifica para uma UDP-GlcNAc 4 epimerase, tal como o gene wbpP de P. aeruginosa ou o gene gne de C. jejuni. 16. 0 método de acordo com a reivindicação 11, que é estendido para a produção de Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcP-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc (GDla) e Gaip-3GalNAcP-4(Neu5Aca-3)Galp-3GalNAcp-4(Neu5Aca-3)Galp-4Glc (GAl). 17. 0 método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, para a produção específica de GMl, em que a sialil-transferase heteróloga é uma a-2,3 sialiltransferase codificada pelo gene cstIII isolado de C. jejuni que expressam estruturas de lipo-oligossacárido que mimetizam o gangliósido GMl , tais como C. jejuni a estirpe NCTC No Acesso 111168. 5 ΡΕ1991690 18. 0 método de acordo com a reivindicação 11, que é estendido para a produção da porção de hidrato de carbono do gangliósido GalNAcP-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc (GM2), em que o microrganismo compreende ainda sequências heteró-logas que codificam para uma β-l,4-GalNActransferase, tal como o gene CgtAII de C. jejuni 0:36 estirpe ATCC No Acesso 43456, e uma UDP-GlcNAc 4 epimerase, e em que o microrganismo tem, pelo menos, um dos três seguintes genes deletado ou inactivado para interromper a produção endógena de UDP-Gal: o gene galE que codifica para a UDP-glucose epimerase, o gene galU que codifica para a UDP-Glc pirof osforilase, e o gene pgm que codifica para a fosfoglucomutase. 19. 0 método de acordo com a reivindicação 11, que é estendido para a produção da porção de hidrato de carbono do gangliósido GD2 GalNAcP-4Gaip-4GlcNeu5Aca-8Neu5Aca3 em que o microrganismo compreende ainda sequências heterólogas que codificam para a UDP-GlcNAc 4-epimerase e uma β-l,4-GalNActransferase que utiliza o açúcar GD3 como aceitador, tal como a proteína CgtAII de C. jejuni 0: 36 estirpe ATCC No de Acesso 43456. 20. 0 método de acordo com a reivindicação 19, que é estendido para a produção de produção de açúcar GDlb (Gaip-3GalNAcp-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-3)Gaip-4Glc) e açúcar GTlc (Gaip-3GalNAcP-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gaip-4Glc) em que o microrganismo compreende ainda uma sequência heteróloga que codifica para um gene de uma β-3 Gal 6 ΡΕ1991690 transferase, tal como o gene cgtB de C. jejuni 0:2 estirpe NCTC No Acesso 11168. 21. 0 método de acordo com a reivindicação 20, que é estendido para a produção de produção de GTlb (Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcP-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gaip-4Glc), GQlc (Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcP-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)-Gaip-4Glc), GQlb (Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcP-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gaip-4Glc) e GPlc (Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcP~4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gaip~4Glc) em que o microrganismo compreende ainda uma sequência heteróloga que codifica para um gene que codifica uma sialiltransferase utilizando GDlb e GTlc como aceitador. 22. 0 método de acordo com a reivindicação 19, em que o microrganismo tem, pelo menos, um dos três seguintes genes eliminados ou inactivados para interromper a produção endógena de UDP-Gal: o gene galE que codifica para a UDP-glucose epimerase, o gene galU que codifica a UDP-Glc pirofosforilase, e o gene de pgm. 23. 0 método de acordo com a reivindicação 11, que é estendido para a produção da porção de hidrato de carbono do gangliósido de GTlb: Hsiú Aqíú Ori^SfolNÀGHfelMCte NsuMcsnS NTe%5Aeo3 em que o microrganismo compreende ainda sequências hete- 7 ΡΕ1991690 rólogas que codificam para a UDP-GlcNAc 4 epimerase, um β-1,4-GalNActransferase que utiliza o açúcar GD3 como acei- tador, tal como a proteína CgtAII de C. jejuni 0:36 No Acesso ATCC 43456 e uma β-l,3-galactosiltransferase, tal como o gene de C. jejuni cgtB 0:2 estirpe No Acesso NCTC 11168. 24. 0 método de acordo com uma das reivindicações 1 a 8 para a produção de Neu5Aca-3Galp-3GalNAcP-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc (GDla) e Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcP~4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc (GTla) , em que o microorga-nismo compreende sequências heterólogas que codificam para uma a-2,3 a-2,8-sialiltransferase bifuncional, tal como o gene cstll da estirpe C. jejuni No Acesso ATCC 43438, uma p-l,4GalNAc transferase, tal como o gene cgtAII de C. jejuni 0:36 estirpe No Acesso ATCC 43456, que não usa açúcar GD3 como aceitador e uma β-l,3-galactosiltrans-ferase, tal como o gene cgtB de C. jejuni 0:2 estirpe No Acesso NCTC 111168. 25. 0 método de acordo com uma das reivindicações 1 a 8 para produzir o pentassacárido LSTD (Neu5Aca-3Gaip-4GlcNAcP-3Gaip-4Glc), em que a sialil transferase é uma a-2,3-sialil transferase, tal como o gene nst, e em que em que o microrganismo compreende ainda os genes lgtA e lgtB heterólogos p-l,3-GlcNAc transferase e p-l,4-galac-tosiltransferase, respectivamente. 26. 0 método de acordo com a reivindicação 23 8 ΡΕ1991690 para a produção de oligossacáridos X de sialil-Lewis oligossacáridos, em que o microrganismo compreende ainda uma sequência heteróloga que codifica para uma a-1,3-fucosil-transferase, tal como H. pylori futA (SED ID No 18) OU futB (SED ID No 19). 27. 0 método de acordo com uma das reivindicações 1-8 para a produção de sialosil galactosil globósido (Neu5Aca-3Gaip-3GalNAcP-3Gala-4Gaip-4Gal) , em que o micro-organismo é cultivado num meio com globotriose e é LacY+, MelA-, nanT+, nanA-, nanK- e compreende lgtD heterólogo, tal como o gene lgtD de Haemophilus influenzae HI1578, número de acesso GenBank U32832, os genes para a-2,3-sialiltransferase e UGP-GlcNAc epimerase C4, bem como os genes neuABC. 28. 0 método de acordo com uma das reivindicações 1 a 8 para a produção de sialilgalactose (NeuõAca-3Gal) e oligossacáridos sialilados com uma galactose redutora terminal, em que o microrganismo é galK-, nanA- e nanK- (ou nanKEAT-) e expressa o gene da sialiltransferase e os genes neuBCA e é cultivado num meio com galactose. 29. 0 método de acordo com a reivindicação 1 para a produção de oligossacáridos sialilados com estrutura de quito-oligossacárido na sua extremidade redutora, tal como o heptassacárido sialilado Neu5AcP~3Gaip-4[GlcNAcP4] -4GlcNAc, em que a sialiltransferase é uma a-2,3-sialil-transferase, como o gene nst de Neisseria e o microrganismo 9 ΡΕ1991690 compreende ainda uma quitina oligossacárido sintetase, tais como o gene nodC de Azorhizobium caulinodans e um gene de β-l, 4-galactosiltransferase tais como o gene lgtB de Neisseria meningitidis.
5. 30. O método de acordo com a reivindicação 29 para a produção do tetrassacárido sialilado Neu5Aca-3Gaip-4GlcNAcP-4GlcNAc, em que o microrganismo compreende ainda uma sequência heteróloga que codifica para uma quitinase, tal como o gene chiA.
6. 31. O método de acordo com a reivindicação 29 ou 30, em que nenhum precursor exógeno é adicionado ao meio de cultura.
7. 32. O método de acordo com uma das reivindicações 11 a 31, em que os microorganismos crescem em glicerol ou glucose como substrato de carbono.
8. 33. Um microrganismo tal como definido numa das reivindicações 12, 14, 15, 17 e 18-30. Lisboa, 11 de abril de 2104