PT1988913E - Formulação líquida de g-csf - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "FORMULAÇÃO LÍQUIDA DE G-CSF" A presente invenção refere-se a formulações líquidas de G-CSF estáveis em armazenamento e ao processo para a sua preparação. A invenção refere-se, em particular, a formulações líquidas que contêm G-CSF como substância activa, acetato como substância tampão, polissorbato 20 ou polissorbato 80 como tensioactivo e opcionalmente excipientes farmaceuticamente aceitáveis, em que as formulações apresentam um valor de pH na qama de 4,1 a 4,3. 0 G-CSF (factor estimulador de colónias de granulócitos) é um factor de crescimento de ocorrência natural que pertence à família das citocinas no sentido lato e, aqui, ao grupo dos factores estimuladores de colónias. 0 G-CSF desempenha um papel importante na hematopoese e fomenta a proliferação e diferenciação de células precursoras hematopoéticas e a activação de neutrófilos. Com base nestas propriedades, o G-CSF tem aplicação em diversos domínios médicos, tal como, p. ex., a reconstituição de populações normais de células sanguíneas após quimioterapia ou irradiação ou para a estimulação da resposta imunitária face a agentes patogénicos infecciosos. 0 G-CSF é assim empregue na medicina clínica, principalmente, no combate de tumores e, em particular, para o tratamento da neutropenia como consequência de quimioterapia e utilizado ainda em transplantes de medula óssea e no tratamento de doenças infecciosas. 1 A preparação recombinante de G-CSF foi descrita pela primeira vez na literatura de patentes em 1987, no documento WO-A-87/01132. 0 primeiro preparado de G-CSF comercial, à base de G-CSF recombinante, foi aprovado na Alemanha em 1991 e é preparado e comercializado sob a marca registada Neupogen® pela firma Amgen. 0 produto Neupogen® (seringa pré-cheia) consiste, segundo o catálogo de produtos farmacêuticos ROTE LISTE 2005, nos seguintes componentes: G-CSF numa concentração de 600 pg/mL ou 960 pg/mL, acetato de sódio, sorbitol, polissorbato 80 e água.

No estado da técnica, diversos documentos de patente também se ocupam com preparações farmacêuticas de G-CSF. No documento EP-A-0373679 descreve-se formulações de G-CSF nas quais a proteína é estabilizada pela presença de um ácido, um valor acídico de pH e uma condutibilidade baixa da formulação. O documento DE-A-3723781 refere-se, de um modo geral, à utilização de G-CSF em combinação com um tensioactivo farmaceuticamente aceitável, sacárido, proteína ou um composto de elevado peso molecular farmaceuticamente aceitável.

No documento WO-A-94/14465 descreve-se a utilização de maltose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, rafinose, sacarose e outros açúcares para a estabilização preparações contendo G-CSF.

No documento WO-A-94/14466 são reveladas preparações de G-CSF que contêm uma quantidade de tensioactivo que é menor que a quantidade em G-CSF empregue e uma substância tampão. 2 0 documento WO-A-93/03744 descreve formulações contendo G-CSF que contêm um conservante que é um clorobutanol, álcool benzílico ou benzalcónio. 0 documento EP-A-0988861 revela formulações contendo G-CSF que contêm HEPES, TES ou tricina como substância tampão. 0 documento WO-A1-2005/042024 revela preparações farmacêuticas de G-CSF com um valor de pH acima de 4,0 que contêm um ácido e são livres de agentes tensioactivos. É objectivo da presente invenção preparar uma preparação de G-CSF que pode ser armazenada na forma liquida por períodos de tempo mais longos e que não requer substâncias aditivas estabilizadoras, tal como HSA, aminoácidos ou conservantes. Deste modo, deve disponibilizar-se uma formulação líquida de G-CSF estável em armazenamento que evita, se possível, qualquer risco quanto à aceitabilidade da formulação.

Este objectivo é solucionado, de acordo com a invenção, através do objecto da reivindicação 1. Formas de realização preferidas estão definidas nas reivindicações dependentes.

Verificou-se que as composições líquidas de G-CSF, que contêm acetato como substância tampão e polissorbato 20 e/ou polissorbato 80 como tensioactivo e apresentam um valor de pH entre 4,1 e 4,4, se podem armazenar de forma estável, na forma líquida, por períodos de tempo mais longos, mesmo na ausência de HSA, aminoácidos ou estabilizantes poliméricos; sem que hajam perdas significativas da estabilidade. 3 A invenção refere-se, deste modo, a uma formulação líquida aquosa de G-CSF estável em armazenamento que compreende, a par de G-CSF recombinante humano como substância activa, acetato como tampão e polissorbato 20 (monolaurato de polioxietilenossorbitano, também designado por Tween 20) ou polissorbato 80 (monooleato de polioxietilenossorbitano, também designado por Tween 80), ou uma mistura destes, como tensioactivo e apresenta um valor de pH entre 4,1 e 4,3.

Numa forma de realização preferida, o tensioactivo é um polissorbato 20.

Verificou-se também, contudo, que outros ésteres alquílicos de polioxietilenossorbitano são igualmente adequados para o emprego como detergente nas formulações da presente invenção. O tensioactivo está habitualmente contido numa concentração na gama de 0,0005% (p/v) a 0,05% (p/v), de um modo preferido, na gama de 0,001% (p/v) a 0,01%, de um modo particularmente preferido, na gama de 0,002% (p/v) a 0,008% e, de um modo muito preferido, na gama de 0,004% (p/v) a 0,006% (p/v), relativamente ao volume total da solução. As formulações de acordo com a invenção contêm, em regra, o tensioactivo polissorbato 20 e/ou 80 numa concentração de 0,004% (p/v), 0,005% (p/v) ou 0,006% (p/v). A concentração da substância tampão acetato é seleccionada vantajosamente de modo a que, para o valor de pH na gama de 4,1 a 4,3 de acordo com a invenção, sejam alcançadas tanto a acção estabilizadora do pH, como também uma suficiente capacidade tampão, mas a concentração de iões, e consequentemente a condutibilidade, seja mantida simultaneamente tão reduzida 4 quanto possível, de modo a evitar a formação de agregados. 0 acetato está contido, habitualmente, numa concentração na gama de 0,5 a 150 mmole/L, de um modo preferido, na gama de 1 a 100 mmole/L, de um modo particularmente preferido, na gama de 2a 50 mmole/L e, de um modo muito preferido, entre 5 e 20 mmole/L. Em regra, a concentração do acetato é 10 mmole/L. A substância tampão acetato pode ser empregue tanto na forma de ácido livre, como também na forma de sal. Como sais emprega-se, em particular, os sais fisiologicamente aceitáveis, por exemplo, sais alcalinos ou de amónio, de um modo preferido, o sal de sódio. O valor de pH da formulação situa-se na gama entre 4,1 e 4,3, de um modo preferido, entre 4,2 e 4,3, igualmente de um modo particularmente preferido, entre 4,25 e 4,3 e, de um modo muito preferido, em aproximadamente 4,25 ou aproximadamente 4,3.

Se desejado, o valor de pH da composição também pode ser ainda ajustado, com auxílio de outros ácidos ou bases, ao pH à gama de 4,1 a 4,3, de 4,2 a 4,3, de 4,25 a 4,3 ou de aproximadamente 4,25 ou aproximadamente 4,3. São ácidos adequados, por exemplo, o ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido cítrico e hidrogenofosfato de sódio ou de potássio. São bases adequadas, por exemplo, hidróxidos alcalinos ou alcalino-terrosos, carbonatos alcalinos, acetatos alcalinos, citratos de metais alcalinos e hidrogenofosfatos de dialcalinos, por exemplo, hidróxido de sódio, acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato de sódio, hidrogenofosfato dissódico e dipotássico, bem como amónia. 5 0 pH é ajustado, de um modo preferido, com NaOH. Numa forma de realização, a formulação de acordo com a invenção contém, por conseguinte, além disso, iões de sódio como consequência do ajuste do valor de pH com NaOH.

Numa forma de realização, a formulação contém, além disso, um poliol como substância aditiva farmaceuticamente aceitável, em particular, um álcool de açúcar que é, de um modo particularmente preferido, manitol ou sorbitol.

Estas substâncias aditivas adequam-se particularmente bem como isotonizantes de modo a tornar as composições, de acordo com a invenção, isotónicas com o sangue do doente. A concentração do poliol é habitualmente até 10,0% (p/v), relativamente ao volume total da composição. A concentração é, de um modo preferido, até 8,0% (p/v), de um modo particularmente preferido, até 6,0% (p/v). De um modo particularmente preferido está contido sorbitol ou manitol numa concentração de 5,0% (p/v). A concentração em G-CSF orienta-se pela concentração de substância activa respectivamente desejada na seringa pré-cheia, na qual a formulação liquida de acordo com a invenção é armazenada e por fim aplicada. O produto comercial Neupogen® (ROTE LISTE 2005, n° 51038) pode ser obtido, por exemplo, nas seguintes concentrações: 300 pg/0,5 mL; 480 pg/0,5 mL e 300 pg/1,0 mL. Neste caso, 10 pg de proteína correspondem a aproximadamente 1,0 milhões de unidades internacionais (UI). No caso do produto comercial Granocyte (ROTE LISTE n° 51036) a actividade do G-CSF é algo mais elevada, aqui, 10 pg de proteína correspondem a uma actividade de 1,28 milhões de UI. 6

As concentrações típicas de G-CSF, no âmbito da presente invenção, situam-se entre 0,01 a 3,0 mg/mL, de um modo preferido, entre 0,1 e 2,5 mg/mL, de um modo particularmente preferido, na gama entre 0,5 e 2,0 mg/mL e, de um modo muito preferido, entre 0,6 e 1,5 mg/mL. As concentrações 0,6 mg/mL e 0,96 mg/mL representam formas de realização preferidas. Neste caso, a eficácia do G-CSF empregue é, em regra, aproximadamente 1,0 ± 0,6 x 108 unidades/mg.

Em soluções de partida com concentrações mais elevadas, frequentemente designadas por solução de stock, a concentração em substância activa também pode ser mais elevada, em certas circunstâncias de 5 mg/mL e mais elevada.

As composições de acordo com a invenção podem conter outros estabilizantes e/ou excipientes e aditivos, em particular fisiologicamente aceitáveis. Por exemplo, outros tensioactivos, isotonizantes, agentes redutores, antioxidantes, complexantes, cossolventes, diluentes e agentes caotrópicos.

Todavia, é preferido que a formulação não contenha quaisquer estabilizantes poliméricos. Deve prescindir-se assim, p. ex., de polialquilenoglicóis, tal como polietilenoglicol, amido hidroxietílico, dextranas, ciclodextrinas, mas também de proteínas, tais como HSA e outras proteínas plásmicas ou gelatina.

Como solvente utiliza-se, de um modo preferido, água pura para fins de injecção. Contudo, também podem ser empregues outros solventes adequados e habituais para preparações farmacêuticas. Prescinde-se, contudo, de um modo preferido, de 7 solventes, tais como glicerol, polietilenoglicol e propilenoglicol.

Prescinde-se igualmente do emprego de substâncias tampão, tais como tartarato, succinato, HEPES, TES e tricina.

Prescinde-se também, tanto quanto possível, de estabilizadores de aminoácidos.

Ao todo, é preferido reduzir, tanto quanto possível, o número dos diversos excipientes na formulação.

Correspondentemente, evita-se também, tanto quanto possível, outros açúcares como manitol e sorbitol, e também as substâncias tampão contidas na formulação são, de um modo preferido, exclusivamente acetato.

Os componentes da formulação podem ser adquiridos nas fontes habituais, p. ex., na firma Sigma ou na firma Merck. 0 G-CSF recombinante pode ser preparado e purificado segundo protocolos do estado da técnica. 0 G-CSF é um G-CSF biologicamente activo que tem a capacidade de fomentar a diferenciação e proliferação de células precursoras hematopoéticas e de efectuar a activação de células maduras do sistema hematopoético. A formulação de G-CSF adequa-se, deste modo, para o tratamento de indicações nas quais a administração de G-CSF é vantajosa. Subentende-se que o termo "G-CSF humano biologicamente activo" inclui também mutantes e modificações de G-CSF, cuja sequência de aminoácidos está alterada face à sequência selvagem, mas que apresentam uma actividade biológica semelhante à do G-CSF do tipo selvagem, tal como, p. ex., as descritas nos documentos WO 01/87925 e EP 0456200. São também G-CSF, no sentido da presente invenção, os conjugados de G-CSF nos quais a proteína está presente na forma conjugada, p. ex., com polímeros tal como, por exemplo, polialquilenoglicóis, em particular com polietilenoglicol como o, assim denominado, G-CSF PEGilado ou PEG-G-CSF, ou amidos hidroxialquílicos, em particular com amido hidroxietílico. O G-CSF pode estar glicosilado ou não. Enquanto a proteína recombinante preparada em E. coli não apresenta quaisquer estruturas de hidratos de carbono e é expressa com um resíduo de metionina N-terminal, o G-CSF preparado em células eucarióticas, tal como, por exemplo, células CHO, está em regra glicosilado. A formulação líquida contendo G-CSF é, de um modo preferido, Met-G-CSF humano, preparado em células de E. coli. Podem ser obtidos comercialmente diversos sistemas de expressão para a expressão em células de E. coli. São adequados, por exemplo, a expressão de G-CSF humano sob o controlo de um promotor indutível, por exemplo, de um promotor indutível com IPTG, ver p. ex. Sambrook and Russel, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3a edição 2001, Coldspring Harbour Laboratory Press, Coldspring Harbour, NY, capítulo 15, ou protocolos correntes do fabricante, p. ex. da Promega ou Stratagene. A fermentação das células hospedeiras pode realizar-se igualmente segundo protocolos padrão, tal como estão descritos na literatura de patentes e científica, tal como a subsequente purificação, incluindo a colheita dos, assim denominados, corpos de inclusão que contêm G-CSF sobreeexpresso em E. coli, a lise destes corpos de inclusão, a solubilização, renaturação e purificação por cromatografia, para os quais existem protocolos adequados tanto na literatura de patentes como também em obras 9 de referência da química de proteínas, bem como em manuais de laboratório.

No documento EP-A-0719860 descreve-se o isolamento e purificação de G-CSF, incluindo a solubilização e renaturação. Nos documentos EP-A-0512097, EP-A-0364926, EP-A-0219874 e documento WO 01/87925 foram descritas técnicas gerais para a solubilização e renaturação de proteínas desnaturadas e podem ser inferidas, além disso, da literatura científica e de obras de referência. A proteína renaturada é subsequentemente purificada por meio de métodos cromatográficos, isto é, é separada de outras proteínas e outras impurezas que estão contidas após a solubilização e renaturação. O documento WO 87/01132 Al, já mencionado acima, ocupa-se também, entre outros, da purificação por cromatografia, em que se descreve, pela primeira vez, a preparação de G-CSF em células hospedeiras de E. coli. No documento WO 87/01132 Al, no exemplo 7, executa-se uma cromatografia de troca catiónica utilizando-se uma coluna de CM-celulose no âmbito da purificação do G-CSF recombinante.

No documento EP 0719860 Al, o G-CSF é purificado a seguir à solubilização e oxidação por meio de Dowex para a remoção do agente de solubilização, seguidos de uma cromatografia de troca aniónica e uma cromatografia de troca catiónica. No documento EP 0719860 Al utiliza-se também uma CM-Sepharose para a cromatografia de troca catiónica. 10

No documento WO 03/051922 AI descreve-se um processo de purificação para G-CSF, no qual se realiza uma cromatografia de afinidade a metais, melhor dizendo, uma cromatografia em metal imobilizado (cromatografia de afinidade com metal imobilizado, IMAC) . No documento WO 03/051922, pode ter lugar uma cromatografia de troca catiónica e/ou uma filtração em gel a seguir à cromatografia de afinidade a metais.

No documento WO 01/04154 AI descreve-se um processo para a purificação de G-CSF, no qual se realizam, em primeiro lugar, uma cromatografia de interacção hidrofóbica e, em seguida, uma cromatografia em hidroxiapatita. A seguir à cromatografia em hidroxiapatita realiza-se uma cromatografia de troca catiónica. A pureza do G-CSF que é formulada na formulação de acordo com a invenção deverá perfazer, pelo menos, 95%, de um modo preferido, pelo menos, 97% e de um modo particularmente preferido, pelo menos 99% e, de um modo muito preferido, mais de 99%. A pureza pode ser testada por meio de análises de HPLC. São aqui adequadas as análises por rp-SEC e por IEX. O especialista pode retirar informações quanto aos materiais e protocolos adequados para a execução da rp-HPLC ou da SEC-HPLC das informações dos produtos de fornecedores, tal como a Vydac (http://www.vydac.com) ou a TOSOH Bioscience (http://www.tosohbiosep. de) . Em regra, emprega-se o G-CSF nas preparações de acordo com a invenção preparação, numa pureza superior a 99%, de um modo preferido superior a 99,5%. A eficácia do G-CSF empregue não deverá perfazer, tanto quanto possível, menos de 50000 UI/pg, é particularmente adequado um G-CSF com uma actividade de, pelo menos, 11 aproximadamente 80000 UI/pg, o mais adequado é um G-CSF com uma actividade de aproximadamente 100000 UI/yg ou superior. A determinação do rendimento em Met-G-CSF está também descrita em Herman et al. (1996) Pharm. Biotechnol. 9: 303-328. A fracção exacta em Met-G-CSF é averiguada, neste caso, por integração da área do pico e cálculo com base no coeficiente de extinção.

Após a purificação, o G-CSF pode ser analisado relativamente à sua quantidade e à sua actividade. Pode realizar-se uma análise qualitativa por via de uma análise de SDS-PAGE e com uma subsequente coloração com azul brilhante de Coomassie ou de uma rp-HPLC. Pode utilizar-se um preparado de G-CSF obtenível comercialmente como padrão para as análises. Pode realizar-se adicionalmente um mapa de péptidos ou uma espectroscopia de massa. A actividade do G-CSF purificado pode ser determinada com diversos processos de teste biológicos, tal como estes estão descritos, por exemplo, em Shirafuji et al. (1989) Exp. Hematol. 17(2): 116-119; Oh-Eda et al. (1990) J.

Biol. Chem. 265 (20): 11432-11435; Stute et al. (1992) Blood 79 (11): 2849-2854 e Oshima et al. (2000) Biochem. Biophys. Res.

Commun. 267 (3): 924-927.

Todas as cromatografias são, de resto, executadas segundo as recomendações e protocolos dos fornecedores das matrizes ou das colunas (p. ex., relativamente ao caudal, ao volume de coluna empregue para a lavagem ou para a eluição, aos diâmetros e alturas da colunas etc.). A actividade biológica do G-CSF recombinante obtido pode ser determinada através de um bioensaio e comparada com a de um 12

Para ο G-CSF padrão, obtenível comercialmente (Neupogen®) . efeito, pode-se utilizar a linha celular de murganho NFS-60 que reage ao G-CSF. Para o efeito, cultiva-se esta linha celular em meio RPMI 1640 (firma Bachem, Heidelberg), que contém 1,5 g/L de bicarbonato de sódio, 4,5 g/L de glicose, Hepes 10 mM e piruvato de sódio 1,0 mM e foi suplementado com glutamina 2 mM, 10% de FCS, 2-mercaptoetanol 0,05 mM e 60 ng/mL de G-CSF.

Para o teste de actividade, lavam-se as células duas vezes com meio sem G-CSF, inoculam-se em placas de 96 poços numa concentração de 2 x 104 células por poço e incubam-se durante três dias a 37 °C e 4,5% de CO2 com diversas concentrações do G-CSF purificado e do padrão. Estas são depois coradas com o reagente XTT e a absorção medida a 450 nm num aparelho de leitura de placas de microtitulação. Deseja-se que as células que foram tratadas com o G-CSF obtido, cresçam tão bem como as células que foram tratadas com o padrão (p. ex., o produto comercial Neupogen®) , dado que se pode pressupor então uma mesma actividade biológica das duas amostras de G-CSF. A preparação da formulação realiza-se igualmente segundo métodos habituais do estado da técnica.

Habitualmente dissolve-se, em primeiro lugar, os componentes tampão e de tensioactivo, e eventualmente outras excipientes farmaceuticamente aceitáveis, em quantidades adequadas no solvente aquoso, usualmente água esterilizada. O valor de pH é ajustado, caso seja necessário, com solução de acetato ou com outros ácidos ou bases, tal como os mencionados acima a titulo de exemplo. Após um passo de esterilização habitual, por exemplo filtração através um filtro de esterilização, junta-se G-CSF na concentração desejada. É também 13 possível, sem inconvenientes, colocar previamente G-CSF numa solução aquosa e ajustar subsequentemente o pH ao valor desejado com acetato e ou ácidos ou bases adequados, de um modo preferido, NaOH. A formulação pronta é por fim transferida para um recipiente adequado, no qual é armazenada até à aplicação. Os recipientes são, em particular, seringas pré-cheias, frascos para injectáveis ou ampolas.

As composições de acordo com a invenção podem ser empregues nas mais variadas formas de aplicação. As formulações de acordo com a invenção adequam-se, por exemplo, como soluções para injecção ou para infusão, em particular para a administração intravenosa, intramuscular ou subcutânea. As composições também podem ser, contudo, utilizadas para a preparação de outras formas de aplicação, por exemplo de transferossomas, lipossomas ou hidrogéis. A formulação líquida de acordo com a invenção oferece não apenas as vantagens de prescindir de compostos potencialmente imunogénicos, e de conter, ao todo, um número tão reduzido quanto possível de ingredientes, como também não exige qualquer liof ilização, em qualquer fase da preparação. Por este meio, poupam-se, por um lado, os custos associados a uma liofilização e, por outro, evitam-se os riscos de problemas mecânicos, p. ex., quando não é possível reconstituir o liofilizado de modo completo ou suficiente.

Pelo termo "estável em armazenamento" entende-se, no âmbito da presente invenção, que o teor em moléculas de G-CSF activo perfaz ainda 80% ou mais da concentração de partida após três 14 meses de armazenamento da formulação líquida G-CSF a 25 °C. 0 teor residual em actividade da G-CSF após três meses de armazenamento a 25 °C perfaz ainda, de um modo preferido, pelo menos, 85%, de um modo mais preferido, pelo menos, 90% e de um modo muito preferido, pelo menos, 95% da actividade de partida. A actividade do G-CSF pode ser determinada por meio de testes de actividade habituais, tal como estes já estão descritos no estado da técnica para o G-CSF.

Pelo termo "formulação liquida" entende-se, no âmbito da presente invenção, que a formulação de G-CSF, em conjunto com as outras substâncias contidas na formulação, não é liofilizada em qualquer fase do processo de preparação, portanto nem antes nem durante ou após a mistura das substâncias, e a formulação é destinada à aplicação intravenosa ou subcutânea como solução para injecção ou para infusão.

Numa forma de realização preferida, a formulação não contém quaisquer ingredientes adicionais a par da substância activa G-CSF, de um tensioactivo seleccionado de polissorbato 20, polissorbato 80 ou de uma mistura destes, de acetato, de sorbitol, de iões de sódio e de água e apresenta um valor de pH entre 4,2 e 4,3, em particular entre 4,25 e 4,3. É particularmente preferido o emprego de polissorbato 20 como único tensioactivo na formulação. 15

Exemplos

Os seguintes exemplos devem explicar a invenção sem limitar a mesma.

Prepararam-se composições contendo G-CSF dissolvendo a substância tampão, acetato, na forma do sal de sódio, em conjunto com polissorbato 20 ou polissorbato 80 e sorbitol em água destilada e esterilizada e ajustando subsequentemente o valor de pH com NaOH ao valor de pH desejado entre 4,2 e 4,3. Adicionou-se G-CSF recombinante humano não glicosilado (Filgrastim, Met-G-CSF) na concentração desejada. A preparação e transferência da formulação para seringas pré-cheias realizou-se, de um modo preferido, sob atmosfera de gás azoto.

As formulações concretas das composições preparadas de acordo com a invenção e os seus valores de pH estão indicados nas tabelas seguintes. No emprego de polissorbato 80 no lugar de polissorbato 20, os resultados mostraram ser comparáveis. O mesmo é válido para a utilização de manitol em vez de sorbitol.

Componente Formul.1 Formul. 2 Formul. 3 Formul. 4 Formul. 5 Formul. 6 G-CSF mg/mL 0,6 0,6 0,6 0,96 0,96 0,96 Sorbitol, % p/v 5, 0 5, 0 5, 0 5,0 5, 0 5, 0 Tampão acetato mM 10 10 10 10 10 10 Polissorbato 20%, p/v 0,004 0,004 0,004 0,004 0,004 0,004 NaOH 0,1 N* q. s. q. s. q. s . q.s. q.s. q.s. Água 1, 0 mL ad 1,0 mL ad 1,0 mL ad 1,0 mL ad 1,0 mL ad 1,0 mL pH 4,2 4,25 4,3 4,2 4,25 4,3 * para ajustar o valor de pH 16

Armazenaram-se as formulações de acordo com a invenção em conjunto com formulações correspondentes com um valor de pH de 4,0, que representam o estado da técnica e serviram como formulação de comparação, a diversas temperatura ao longo de diversos períodos de tempo.

Alguns dados das análises de estabilidade a longo prazo estão representados nas figuras anexas (concentração de G-CSF de respectivamente 0,6 mg/mL). A figura 1 mostra análises por SEC e a figura 2 análises por IEX, até 6 meses de armazenamento respectivamente a 30 °C ou 40 °C.

Ao todo, as formulações de acordo com a invenção mostraram resultados comparáveis com a formulação de comparação que se diferenciou das formulações de acordo com a invenção testadas somente por um valor de pH mais ácido, nomeadamente pH 4,0.

Lisboa, 8 de Julho de 2009 17

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Formulação líquida de G-CSF, contendo G-CSF como substância activa, acetato como tampão, polissorbato 20 e/ou polissorbato 80 como tensioactivo e, opcionalmente, excipientes farmaceuticamente aceitáveis, em que a formulação apresenta um valor de pH na gama de 4,1 a 4,3.
2. 2. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 1, com um valor de pH na gama de 4,2 a 4,3.
3. 3. Formulação de acordo com a reivindicação 1 ou 2, com um valor de pH de 4,25.
4. 4. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a concentração do tampão acetato é entre 2 e 5 0 mmo1e/L.
5. 5. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a concentração do tampão acetato é 10 mmole/L.
6. 6. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a formulação contém sorbitol e/ou manitol como excipiente farmaceuticamente aceitável.
7. 7. Formulação de acordo com a reivindicação 6, em que a formulação contém sorbitol.
8. 8. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a formulação não contém um conservante. 1
9. 9. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a formulação nao contém aminoácidos.
10. 10. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a formulação nao contém agentes estabilizantes poliméricos.
11. 11. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o pH foi ajustado com NaOH
12. • 12 . Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores contendo iões de sódio.
13. 13. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, contendo G-CSF, polissorbato 20 e/ou polissorbato 80, sorbitol, acetato e sódio e nenhuns outros ingredientes.
14. 14. Formulação de acordo com as reivindicações 1 até 12, em que o tensioactivo é exclusivamente polissorbato 20.
15. 15. Processo para a preparação de uma formulação liquida de G-CSF de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo a mistura da proteína G-CSF com uma solução compreendendo acetato como tampão, polissorbato 20 e/ou polissorbato 80 como tensioactivo e, opcionalmente, excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Lisboa, 8 de Julho de 2009 2