PT1968632E - Vacina da gripe melhorada - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "VACINA DA GRIPE MELHORADA"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se genericamente a vacinas da gripe para utilização humana e veterinária. Em particular, a presente invenção proporciona uma vacina capaz de induzir protecção de longo prazo e de estirpe cruzada compreendendo uma pluralidade de proteínas quiméricas compreendendo os seguintes epitopos de péptidos do vírus da gripe: um epitopo de célula B e

CTL (Ml 2-12; SEQ ID N°:25 ou 26); um epitopo de célula B (HÁ 91-108; SEQ ID N°:48); um epitopo Th (HA 307-319; SEQ ID N°:57); dois epitopos CTL (NP 335-350; SEQ ID N°:67, e

NP 380-393; SEQ ID N°:68); e mais um epitopo de célula B (HÁ 354-372; SEQ ID N°:80).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Gripe A gripe é uma doença provocada por vírus de três subtipos principais, Gripe A, B e C, que são classificados de acordo com os seus determinantes antigénicos. O virião da gripe consiste num genoma de ARN de cadeia simples intimamente associado com uma nucleoproteína (NP) e envolvido por um envelope de lipoproteína revestido por uma proteína da matriz (Ml) e 1 contendo dois antigénios principais de glicoproteína de superfície, hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) . As glicoproteínas HA e NA são mais susceptíveis a alteração; por exemplo, existem 16 classes imunitárias de HA e 9 diferentes classes NA gue proporcionam a base para os diferentes subtipos do vírus da gripe como H1N1 ou H3N2. 0 vírus da gripe A possui uma glicoproteína transmembranar adicional, M2, que é altamente conservada entre os diferentes subtipos HN. 0 gene M2 gene codifica uma proteína possuindo 96-97-aminoácidos que é expressa como um tetrâmero à superfície do virião. É composto por cerca de 24 aminoácidos extracelulares, cerca de 19 aminoácidos transmembranares e cerca de 54 resíduos citoplásmicos (Lamb et al., 1985) .

Os vírus da gripe A e B são a causa mais comum de gripe no homem. A gripe tem um enorme impacto na saúde pública com graves implicações económicas, para além dos problemas devastadores para a saúde, incluindo morbidez e mesmo mortalidade. A infecção pode ser suave, moderada ou grave, variando desde assintomática até uma infecção respiratória ligeira do tracto superior e traqueobronquite, até uma pneumonia virai grave, ocasionalmente letal.

Os vírus da gripe possuem duas características imunológicas importantes que apresentam um desafio à preparação de vacinas. A primeira refere-se a alterações genéticas que ocorrem nas glicoproteínas de superfície periodicamente, referidas como "deriva antigénica". Esta alteração antigénica produz vírus que iludem a resistência induzida pelas vacinas existentes. A segunda característica de grande preocupação em saúde pública é que os vírus da gripe, em particular o vírus da gripe A podem 2 trocar material genético e fundir. Este processo, conhecido como "desvio antigénico", resulta em novas estirpes diferentes de ambos os vírus parentais, gue podem ser estirpes pandémicas letais. A gripe das aves é um vírus da gripe A gue cruzou a barreira da espécie de aves para mamíferos, incluindo humanos.

Gripe das Aves A maior parte das estirpes da gripe das aves (AI) são classificadas como gripe das aves de baixa patogenicidade (LPAI) e provocam poucos sinais clínicos em aves infectadas. Em contraste, as estirpes de gripe das aves de elevada patogenicidade (HPAI) provocam uma doença grave e extremamente contagiosa e morte entre as aves infectadas.

Os humanos não são normalmente afectados pela gripe das aves, todavia, as epidemias de gripe das aves altamente patogénica (HPAI), recentemente observada em aves de capoeira na Ásia, aumentou as oportunidades para a exposição humana e infecção. Foram relatados vários casos no passado e durante as actuais epidemias na Ásia. Os recentes surtos altamente patogénicos foram provocados pelos vírus da gripe A dos subtipos H5 e H7. Dos 15 subtipos do vírus da gripe das aves, ο H5N1 é de particular preocupação uma vez gue muta rapidamente e possui uma propensão documentada para adquirir genes dos vírus que infectam outras espécies animais. A sua capacidade para provocar doença em humanos está agora bem documentada. As aves que sobrevivem à infecção excretam o vírus durante, pelo menos, 10 dias, oralmente e nas fezes, facilitando desse modo ainda mais a 3 disseminação em mercados de aves vivas e através de aves migratórias. A epidemia de HPAI provocada por H5N1, que começou em meados de Dezembro de 2003 em certos países Asiáticos, disseminou-se e colocou uma preocupação na saúde pública. A disseminação da infecção nas aves aumentou as oportunidades para a infecção directa em humanos. Se mais humanos se tornam infectados ao longo do tempo, também aumenta a probabilidade dos humanos, se forem infectados concorrentemente com estirpes da gripe humana e aviária, poderem servir como o hospedeiro para a emergência de um novo subtipo com genes suficientes da gripe humana para serem facilmente transmitidos de pessoa para pessoa. Um tal evento marcaria o início de uma gripe pandémica. A disseminação da AI entre as aves ocorre principalmente por contacto directo entre aves saudáveis e aves infectadas, e através de contacto indirecto com equipamento e materiais contaminados. O vírus é excretado através das fezes das aves infectadas e através de secreções do nariz, boca e olhos.

0 contacto com material fecal infectado é o modo mais comum de transmissão ave-para-ave. Os patos selvagens introduzem frequentemente vírus de baixa patogenicidade em bandos domésticos criados em quintas ou em voo aberto através de contaminação fecal. Num aviário de aves de capoeira, a transferência do vírus da HPAI entre aves também pode ocorrer através de secreções por via aérea. A disseminação da gripe aviária entre instalações de aves de capoeira quase sempre segue o movimento de pessoas e equipamento contaminado. A 4 transferência de ovos é também um meio potencial da transmissão de AI.

Antigénios do Vírus da Gripe e Produção de Vacinas A imunização em relação ao vírus da gripe é limitada pela variação antigénica do vírus e pela restrição da infecção às membranas da mucosa respiratória. As vacinas da gripe presentemente disponíveis são baseadas no vírus total inactivo ou em determinantes antigénicos, das proteínas de superfície. HA é um imunogénio forte e é o antigénio mais significativo na definição da especificidade serológica das diferentes estirpes de vírus. A molécula de HA (75-80 kD) compreende uma pluralidade de determinantes antigénicos, vários dos quais estão nas regiões que sofrem alterações de sequência em diferentes estirpes (determinantes específicos para a estirpe) e outras em regiões que são conservadas em muitas moléculas de HA (determinantes comuns). Devido a estas alterações, as vacinas da gripe precisam de ser modificadas, pelo menos, periodicamente.

Muitos antigénios da gripe e vacinas preparadas a partir destes, são conhecidos na técnica. A Patente US 4474757 divulga uma vacina contra infecções com o vírus da gripe consistindo num péptido sintético que corresponde a um fragmento antigénico de HA ligado a um veículo macromolecular adequado, tal como polímeros de aminoácidos ou toxóide do tétano. 5 A publicação de PCT Internacional WO93/20846 atribuída a alguns dos inventores da presente invenção divulga uma vacina recombinante sintética contra uma pluralidade de diferentes estirpes de vírus da gripe compreendendo, pelo menos, uma proteína recombinante compreendendo a sequência de aminoácidos da flagelina e, pelo menos, uma sequência de aminoácidos de um epitopo do vírus da gripe HA ou NP, ou um agregado da referida proteína quimérica. Após esta abordagem, verificou-se que uma vacina antigripe recombinante sintética, com base em três epitopos, foi altamente eficiente em murganhos. As vacinas exemplificadas incluíram quimeras de flagelina compreendendo o epitopo HA 91-108, um epitopo de célula B a partir de HA que é conservado em todas as estirpes de H3 e induz anticorpos neutralizantes antigripe, juntamente com um ou ambos os epitopos de auxiliar T ou CTL NP (NP 55-69 e NP 147-158, respectivamente), que induz respostas imunitárias restringidas por MHC. Uma vacina compreendendo uma combinação das três quimeras, acima mencionadas, foi considerada como produzindo a melhor protecção à infecção virai. A publicação do pedido de PCT WO 00/32228 atribuída a alguns dos inventores da presente invenção divulga uma vacina da gripe à base do péptido humano sintético compreendendo, pelo menos, quatro epitopos de vírus da gripe, sendo os epitopos do vírus da gripe reactivos com células humanas, compreendendo os referidos epitopos: (i) um epitopo de hemaglutinina de célula B (HA); (ii) um epitopo de hemaglutinina de auxiliar T (HA) ou nucleoproteína (NP) que se pode ligar a muitas moléculas de HL A; e (iii) pelo menos dois epitopos de linfócitos citotóxicos (CTL), 6 nucleoproteína (NP) ou proteína matriz (M) que são restritos às moléculas de HLA mais prevalentes em diferentes populações de humanos, em particular grupos étnicos ou raciais específicos. Os epitopos de péptidos da gripe podem ser expressos como recombinantes de Salmonella flagellin. Essa vacina requer a preparação trabalhosa de, pelo menos, quatro polipéptidos quiméricos. A publicação do Pedido PCT W02004/080403 e Publicação do Pedido de Patente US US2004/0223976 proporciona uma vacina contra doença provocada pela infecção com o vírus da gripe, e métodos de vacinação. Cada vacina compreende uma pluralidade de péptidos derivados das proteínas M2 e/ou HA do vírus da gripe conjugados quimicamente com uma proteína veículo. A conjugação é entre um terminal do péptido e um sítio reactivo da proteína veículo, em que a proteína veículo é seleccionada de um complexo proteico da membrana externa de Neisseria meningitidis, toxóide do tétano, antigénio de superfície da hepatite B ou antigénio do núcleo, hemocianina do caramujo, proteína da cápside de rotavírus, e a proteína LI de bovino ou o VLP de papilomavírus humano. Essa divulgação requer uma pluralidade de epitopos do péptido M2 ou HA ligados covalentemente à superfície externa de uma proteína veículo e não sugere nem descreve uma vacina compreendendo um polipéptido quimérico. A Publicação do Pedido de PCT WO99/07839 refere-se a antigénios da gripe para utilização em vacinas, em que as vacinas são compreendidas por um produto de fusão de, pelo menos, a parte extracelular de M2 e um veículo de apresentação. 0 fragmento M2 foi fundido ao terminal amino da proteína veículo de modo a reter um terminal N livre do domínio M2 e, deste modo, 7 mimetizar a estrutura de tipo selvagem da proteína M2 . Além disso, essa invenção é exemplificada por meio de uma proteína de fusão M2 em que a porção extracelular intacta do fragmento M2 é fundida com o terminal N da proteína do núcleo do vírus da hepatite B, de modo a mimetizar a estrutura de tipo selvagem da proteína M2, em partículas virais e em células infectadas, em que o terminal N livre se estende para o ambiente extracelular. Esse pedido não descreve nem sugere um epitopo M2 isolado que é constrangido conformacionalmente. A publicação do Pedido de Patente Internacional N° WO 99/07839 divulga uma porção extracelular imunogénica de uma proteína de membrana M2 de um vírus da gripe A fundida com um veículo de apresentação, que pode ser seleccionada do terminal amino da proteína do núcleo do vírus da Hepatite B humana, terceiro fragmento d da proteína do complemento (C3d), fragmento C da toxina do tétano C ou partículas Ty de leveduras. Outros veículos de apresentação não peptídicos são mencionados, no entanto essa invenção é exemplificada apenas através de produtos de fusão genética.

Slepushkin et ai. (1995) descreve a protecção de murganhos para a exposição à gripe A através de vacinação com uma proteína M2 recombinante expressa em baculovírus e administrada com adjuvante de Freund. A Publicação do Pedido de PCT N° WO 98/23735 divulga uma vacina da gripe para induzir uma resposta imunitária citolítica mediada por célula contra um antigénio num mamífero compreendendo um produto de fusão de um antigénio da gripe e uma proteína de stresse ou proteína de choque térmico como veículo. 0 antigénio da gripe é seleccionado de hemaglutinina, nucleoproteína, neuraminidase, Ml, M2, PB1, PB2, PA e uma sua combinação. Não é descrita nem sugerida uma vacina que combine um epitopo de M com um epitopo de HA.

Zou, et ai. (2005) divulgam o péptido extracelular M2 6-13 e sugerem que essa sequência possa ser útil na preparação de uma vacina da gripe. Liu, et al. (2005) divulgam epitopos específicos para o hospedeiro nas sequências extracelulares de M2, que podem ser úteis para a preparação de uma vacina da gripe bivalente. Os epitopos relevantes incluem a sequência M2 10-20 comum à gripe humana, aviária e suína. A Publicação do Pedido de PCT N° WO 94/26903 refere-se a péptidos da proteína da matriz da gripe humana capazes de se ligarem a moléculas de Classe I de MHC humana. Essa invenção proporciona epitopos de péptido candidatos, capazes de se ligarem à ranhura das moléculas de classe I de MHC identificadas utilizando a linha celular 174.CEM T2 (T2) deficiente no processamento do antigénio. Não é divulgada nem sugerida uma vacina compreendendo uma combinação do epitopo de M com um epitopo do péptido HA.

Levi R. et al. ("Synthetic recombinant influenza vaccine induces efficient long-term immunity and cross-strain protection", Vaccine, Butterworth Scientific. Guildford, GB, Vol. 14, N° 1, Janeiro de 1996, p. 85-92) divulgam uma vacina da gripe à base de péptido sintético compreendendo uma mistura de três epitopos seleccionados de um epitopo HA de célula B, um epitopo de auxiliar T NP e um epitopo de CTL. Levi et al. não mencionam epitopos da matriz ou gripe B. 9

Chen Z. et al. ("Enhanced protection against a lethal influenza virus challenge by immunization with both hemagglutinin- and neuraminidase-expressing DNAs", Vaccine Butterworth Scientific. Guildford, GB, Vol. 17, N° 7-8, Fevereiro de 1999, p. 653-659) descrevem vacinas de ADN que codificam as proteínas HA, NA e Ml de tamanho total. Não são especificados péptidos mais curtos. 0 documento WO 02/00885 A2 refere-se a partículas do tipo vírus da gripe compreendendo as proteínas HA, NA, Ml e M2. O referido pedido não divulga quaisquer péptidos curtos.

Jeon S.H. et al. ("Intranasal immunization with synthetic recombinant vaccine containing multiple epitopes of influenza virus", Vaccine, Butterworth Scientific. Guildford, GB, Vol. 20, N° 21-22, Junho de 2002, p. 2772-2780) refere-se à imunização intranasal com uma vacina da gripe recombinante sintética contendo múltiplos epitopos do vírus da gripe. Jeon et al. não divulgam epitopos Ml e epitopos da gripe de tipo B.

Ben-Yedidia et al. ("Towards an epitope-based human vaccine for influenza", Human Vaccines, Vol. 1, N° 3, Maio de 2005, páginas 95-101) é um artigo de revisão sobre vacinas para a gripe baseadas em péptidos humanos. Não são aí mencionados epitopos da proteína da matriz.

Seria muito vantajoso possuir uma vacina da gripe que pudesse ser administrada uma vez e conferir protecção durante vários anos, ou mesmo uma vida inteira, proporcionando protecção cruzada contra novas estirpes de vírus. 10

Permanece uma necessidade ainda não satisfeita para uma vacina útil na indução de uma resposta imunitária para uma vasta gama de subtipos da gripe que permita a protecção a longo termo em várias espécies, que seja rentável e possa ser produzida rapidamente, possa ser administrada numa pluralidade de formas e seja útil para imunização animal e humana.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma vacina da gripe que induz protecção a longo termo e em vários subtipos contra infecção com vírus da gripe A e da gripe B, incluindo os serotipos da gripe das aves. Uma resposta imunitária inesperadamente robusta contra o vírus da gripe A ou B é induzida por uma vacina compreendendo proteínas quiméricas que compreendem, pelo menos, um epitopo do péptido da proteína da matriz da gripe A (M) e, pelo menos, um epitopo do péptido da hemaglutinina (HA) da gripe A ou B. Uma vacina compreendendo uma combinação de um epitopo de M e um epitopo de HA ultrapassa as desvantagens de vacinas conhecidas incluindo a necessidade para incluir epitopos que são restritos a moléculas de HLA associados com diferentes populações raciais ou étnicas. A vacina da presente invenção induz uma eficácia que cruza todas as raças e populações Asiáticas e Africanas reagem tão bem como as

Caucasianas.

Além disso, uma resposta imunitária surpreendentemente eficaz para o vírus da gripe A ou B é induzida por uma vacina compreendendo uma proteína quimérica compreendendo um epitopo do 11 péptido M2 e uma sequência de aminoácidos de flagelina, em que o epitopo do péptido M2 está incorporado na sequência polipeptídica da flagelina. Esta descoberta é inesperada à luz das proteínas de fusão e conjugados de M2 até agora conhecidos que compreende, pelo menos, a região extracelular inteira de M2 e mimetiza a conformação do domínio extracelular inteiro da proteína M2.

Num aspecto, a presente invenção proporciona uma vacina para imunização de um indivíduo compreendendo uma pluralidade de proteínas quiméricas compreendendo os epitopos do péptido do vírus da gripe:

Ml 2-12 (SEQ ID N°:25 ou 26); HA 91-108 (SEQ ID N°:48); HA 307-319 (SEQ ID N°:57); NP 335-350 (SEQ ID N°:67); NP 380-393 (SEQ ID N°:68); e HA 354-372 (SEQ ID N°:80).

De acordo com uma forma de realização, a vacina compreende ainda um adjuvante ou um excipiente.

De acordo com outra forma de realização, a vacina é formulada para administração através de uma modalidade seleccionada a partir do grupo consistindo em distribuição intraperitoneal, subcutânea, intranasal, intramuscular, oral, tópica e transdérmica.

De acordo com outro aspecto, a vacina destina-se à utilização num método para induzir uma resposta imunitária e 12 conferir protecção contra o vírus da gripe num indivíduo. De um modo preferido, a resposta imunitária é induzida contra a gripe das aves, gripe tipo A, gripe tipo B ou uma sua combinação.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, a vacina é utilizada para a preparação de um agente farmacêutico para induzir uma resposta imunitária e conferir protecção contra o vírus da gripe num indivíduo.

Em algumas formas de realização, a vacina protege contra a gripe A, incluindo a gripe das aves. Noutras formas de realização, a vacina compreende um epitopo da gripe B e induz protecção contra a gripe B. Noutra forma de realização, a vacina compreende epitopos do péptido que induz protecção contra ambos os vírus da gripe A e da gripe B.

Vias de administração da vacina incluem, mas não estão limitadas a distribuição intraperitoneal, subcutânea, intranasal, intramuscular, oral, tópica e transdérmica. Vias de administração preferidas incluem a administração oral, intranasal (IN) e intramuscular (IM) . Numa forma de realização, a vacina é formulada para administração intranasal. Noutra forma de realização, a vacina é formulada para administração intramuscular.

Deve ser entendido explicitamente que as composições conhecidas não devem ser excluídas da presente invenção.

Outras formas de realização e o âmbito total da aplicabilidade da presente invenção serão óbvios a partir da descrição detalhada aqui apresentada abaixo. Todavia, deve ser 13 entendido que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indiquem as formas de realização preferidas da invenção, são apresentados apenas a título ilustrativo, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e âmbito da invenção serão óbvias para os especialistas na técnica a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 apresenta um gráfico que apresenta a secreção do interferão gama (IFNy) a partir de linfócitos incubados com o respectivo péptido após a segunda e terceira imunização de murganhos transgénicos (TG) HHD/HLA A2.

As Figuras 2A-2C apresentam a lise de células alvo por NK (células Assassinas Naturais) derivadas de murganhos imunizados com epitopos individuais ou em combinação após a segunda (2A) e terceira imunização (2B). Mesmo após a segunda imunização, as células NK dos murganhos imunizados com a combinação de 6 epitopos (hexa-vacinal) foram capazes de lisar as células alvo mais eficientemente do que as células dos murganhos vacinados com os flagelos nativos (2C). A lise específica foi determinada a diferentes proporções de E:T.

As Figuras 3A e 3B apresentam os resultados da imunização de murganhos C57B1/6 com Hexa-vacina2, consistindo em flagelos recombinantes compreendendo os epitopos dos péptidos HA 91-108, HA 354-372, HA 307-319, NP 335-350, NP 380-393 e M2 1-18. O soro foi testado após 3 imunizações e foi determinada a 14 especificidade do anticorpo (Ab ou Ig) contra o vírus da gripe H3N2 total (3A) e contra o péptido específico M2 1-18 (3B). A Figura 4 apresenta a ligação dos epitopos do péptido a HLA-A2 em células T2: Foi apresentada uma ligação elevada e dependente da dose pelo péptido Ml 3-11. Outros péptidos testados, NP 336-344, NP 380-388 e HA 307-319, também apresentaram capacidade de ligação, que não era dependente da dose.

As Figuras 5A-5C apresentam protecção de anticorpo induzida pelos epitopos do péptido recombinante. Uma subida significativa no título do anticorpo (Ab), específico para cada epitopo foi obtida com os epitopos Ml 2-12, NP 335-350 e HA 91-108 em murganhos imunizados com o epitopo único relevante. A Figura 6 apresenta a resposta à dose imunitária humoral obtida após a vacinação dos murganhos com Hexa-vacinal. A Figura 7 apresenta a resposta imunitária humoral aos flagelos após administração intranasal e intramuscular da Hexa-vacinal. A Figura 8 apresenta os resultados da titulação dos vírus. Após três vacinações com Hexa-vacinal, os murganhos foram infectados com uma dose sub-letal do vírus da gripe estirpe H3N2 (A/Texas/1/77). Os pulmões dos murganhos foram removidos 5 dias mais tarde para titulação da carga virai. A titulação foi realizada em ovos fertilizados. 15 A Figura 9 apresenta o título de IgE na experiência de dosagem e na experiência para avaliação da resposta celular. A Figura 10 apresenta a concentração de IgE (ng/mL) em soros de murganhos transgénicos HHD imunizados intranasalmente (IN) com flagelos recombinantes que expressam os epitopos da gripe. A Figura 11 apresenta as vezes do aumento do título de IgG para 3 estirpes da gripe diferentes em soros de coelhos NZW imunizados intranasalmente três vezes com flagelos recombinantes que expressam seis epitopos da gripe (Hexa-vacina2). A Figura 12 apresenta resultados farmacocinéticos. A concentração máxima no soro de Hexa-vacinal foi observada após 15 minutos (Tmax) . Metade (1¾) da quantidade de exposição total foi obtida dentro de um período de 30 minutos após a dosagem. Não foi detectada proteína após 12 horas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é baseada na descoberta inesperada que uma vacina compreendendo, pelo menos, um epitopo do péptido M e, pelo menos, um epitopo do péptido HA é capaz de induzir uma imunidade protectora para a gripe a longo termo e para várias estirpes.

Definições

Por conveniência, certos termos empregues na especificação, exemplos e reivindicações são aqui descritos. 16 "apresentação de antigénio" significa a uma célula em associação histocompatabilidade de I) de animais ou com a A expressão expressão do antigénio na superfície de com moléculas do complexo principal de classe I ou classe II (MHC-I ou MHC-I HLA-I e HLA-II de humanos. 0 termo "imunogenicidade" ou "imunogénico" refere-se à capacidade de uma substância para induzir ou induzir uma resposta imunitária. A imunogenicidade é medida, por exemplo, através da determinação da presença de anticorpos específicos para a substância. A presença de anticorpos é detectada através de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, utilizando um ensaio de ELISA.

Os epitopos da gripe podem ser classificados como de tipo célula B, de tipo célula T ou de tipo ambas as células B e células T, dependendo do tipo de resposta imunitária que eles induzem. A definição de epitopo de péptido de células B ou células T não é inequívoca; por exemplo, um epitopo do péptido pode induzir a produção de anticorpos mas ao mesmo tempo esse epitopo pode possuir uma sequência que permite a ligação à molécula de HLA humana, tornando-a acessível a CTL e, desse modo, uma classificação dual de células B e células T para esse epitopo particular. "CTL", "células assassinas T" ou "células T citotóxicas" é um grupo de células T diferenciadas que reconhece e lisa células alvo contendo um antigénio estranho específico que funciona na defesa contra a infecção virai e células cancerosas. "Célula Auxiliar T" ou "Th" é qualquer uma das células T que, quando estimuladas por um antigénio específico 17 liberta citocinas que promovem a activaçao e a função das células B e células assassinas T. A expressão "flagelina recombinante" refere-se a um polipéptido de flagelina compreendendo um epitopo de péptido incorporado na sua sequência. Uma flagelina recombinante é distinta de uma proteína de fusão clássica em que o péptido ou proteína a ser expresso numa proteína de fusão é fundida com uma proteína veículo no seu terminal N ou C, deixando o outro terminal livre e conformacionalmente não reprimido. "Sequência de aminoácidos", como aqui utilizado, refere-se a uma sequência de oligopéptido, péptido, polipéptido ou proteína e seu fragmento, e a moléculas que ocorrem naturalmente ou sintéticas. "Gripe das aves" ou "AI" refere-se ao vírus da gripe aviária que infecta aves, incluindo aves domésticas e selvagens. Os vírus da gripe aviária conhecidos pertencem aos subtipos de vírus H5, H7 e H9. 0 vírus da gripe aviária pode pertencer ao tipo de baixa patogenicidade (LPAI) ou de elevada patogenicidade (HPAI) e pode sofrer ou não um desvio antigénico. Foi demonstrado que certas estirpes de gripe das aves, incluindo H5N1, H7N3, H7N7 e H9N2, infectam mamíferos, incluindo humanos.

Epitopos de Péptido Úteis na Preparação de uma Vacina

Os epitopos de péptido derivados das proteínas da gripe são úteis na preparação da composição da presente invenção. Uma composição divulgada inclui, pelo menos, um epitopo de péptido 18 derivado das proteínas da gripe A Ml ou M2 em combinação com um epitopo do péptido HA da gripe A ou gripe B. Deve ser salientado que os epitopos de péptido aqui listados são proporcionados apenas para efeitos de exemplo. As proteínas do vírus da gripe variam entre isolados, proporcionando desse modo múltiplas sequências variantes para cada proteína da gripe. A proteína da matriz Ml é um componente estrutural principal das partículas do vírus da gripe e forma uma camada interior do envelope lípido derivado da célula. No virião e nas células infectadas nos estádios tardios da replicação do vírus, a proteína Ml associa-se às ribonucleoproteínas virais (vRNP), que são compostas por moléculas de ARN virai, múltiplas cópias do NP e as três subunidades da polimerase virai sustendo as extremidades dos ARN virais. 0 domínio N-terminal de Ml refere-se aos aminoácidos 1 a cerca do aminoácido 20 da proteína Ml. A proteína da matriz M2 é um canal de iões de hidrogénio que resulta na dissociação da matriz e do complexo de nucleoproteína nos vacúolos. Esta canal de iões liberta o genoma permitindo que o ARN virai entre no núcleo da célula infectada e inicie a replicação virai. As substâncias terapêuticas contra a gripe, tais como amantadina e rimantadina actuam no bloqueio da actividade de M2. A Gripe B possui uma proteína equivalente conhecida como NB; embora não exista semelhança de sequência elas são ambas proteínas de transmembrana e podem partilhar uma função semelhante. O domínio extracelular da proteína M2 que é uma proteína de transmembrana do vírus da gripe A, é quase invariável em todas as estirpes da gripe A. O domínio N-terminal 19 de M2 refere-se a uma sequência de aminoácidos N-terminal para o domínio da transmembrana. A Tabela 1 proporciona uma lista exemplificativa dos epitopos de péptido de Ml e M2 que podem ser seleccionados para a preparação de proteínas quiméricas.

Tabela 1. Epitopos de péptido Ml e M2

Tipo de epitopo* Posição do Epitopo Sequência de aminoácidos Sequência de nucleótidos NCBI N° M2 6-9 EVET (SEQ ID N°:1) GAAGTGGAAACC (SEQ ID N°:81) ABJ15715.1 Th M2 1-15 MSLLTEVETHTRNGW (SEQ ID N°:2) ATGAGCCTGCTGACC GAAGTGGAAACCCAC ACCAGGAATGGGTGG (SEQ ID N°:82) M2 10-18 PIRNEWGCR (SEQ ID N°: 3) CCGATTCGTAACGAA TGGGGTTGTCGT (SEQ ID N°:83) ABD59 8 8 4 M2 8-15 ETPIRNEWGC (SEQ ID N°:4) GAAACCCCGATTCGT AACGAATGGGGTTGT CGT (SEQ ID N°:84) ABD59 8 8 4 M2 10-20 PIRNEWGCRCN (SEQ ID N°:5) GAAACCCCGATTCGT AACGAATGGGGTTGT CGTGGTTGTCGT (SEQ ID N°:85) ABD59 8 8 4 CTL M2 3-11 LLTEVETPI (SEQ ID N°:6) CTGCTGACCGAAGTGG AAACCCCGATT (SEQ ID N°:86) ABD59 8 8 4 CTL M2 2-10 SLLTEVETP (SEQ ID N°:7) AGCCTGCTGACCGAAG TGGAAACCCCG (SEQ ID N°:87) ABD59 8 8 4 20 (continuação)

Tipo de epitopo* Posição do Epitopo Sequência de aminoácidos Sequência de nucleótidos NCBI N° CTL M2 2-11 SLLTEVETPI (SEQ ID N°: 8) AGCCTGCTGACCGAAG TGGAAACCCCGATT (SEQ ID N°:88) ABD59884 CTL M2 4-11 LTEVETPLT (SEQ ID N°:9) CTGACCG AAGTGG AAA CCCCGCTGACC (SEQ ID N°:89) ABD59884 Th M2 1-15 MSLLTEVETPIRNEW (SEQ ID N°:10) ATGAGCCTGCTGACCG AAGTGGAAACCCCGAT TCGCAACGAATGG (SEQ ID N°:90) ABD59884 Th M2 1-18 MSLLTEVETPIRNE WGCR (SEQ ID N°:11) ATGAGCCTGCTGACCG AAG T G G AAAC C C C G AT TCGCAACGAATGGGGC TGCCGC (SEQ ID N°:91) ABD59884 Th M2 1-15 MSLLTEVETLTKNGW (SEQ ID N°:12) ATGAGCCTGCTGACCG AAG T G G AAAC C C T G AC CAAAAACGGCTGG MSLLTEVETLTRNGW (SEQ ID N°:92) AAK49250 Th M2 1-15 MSLLTEVETLTRNGW (SEQ ID N°:13) ATGAGCCTGCTGACCG AAG T G G AAAC C C T G AC CCGCAACGGCTGG (SEQ ID N°:93) ABI 85097 CTL M2 4-12 LTEVETPIR (SEQ ID N°: 14) CTGACCG AAGTGG AAA CCCCGATTCGC (SEQ ID N°:94) ABD59884 CTL M2 4-13 LTEVETPIRN (SEQ ID N°: 15) CTGACCGAAGTGGAAA CCCCGATTCGCAAC (SEQ ID N°:95) ABD59884 CTL M2 6-14 EVETPIRNE (SEQ ID N°: 16) G AAG T G G AAAC C C C G A TTCGCAACGAA (SEQ ID N°:96) ABD59884 21 (continuação)

Tipo de epitopo* Posição do Epitopo Sequência de aminoácidos Sequência de nucleótidos NCBI N° CTL M2 6-15 EVETPIRNEW (SEQ ID N°: 17) GAAGTGGAAACCCCGA TTCGCAACGAATGG (SEQ ID N°: 97) ABD59884 CTL M2 4-14 LTEVETPIRNE (SEQ ID N°:18) CTGACCGAAGTGGAAA CCCCGATTCGCAACGA A (SEQ ID N°:98) ABD59884 Th M2 4-18 LTEVETPIRNEWGCR (SEQ ID N°:19) CTGACCGAAGTGGAAA CCCCGATTCGCAACGA ATGGGGCTGCCGC (SEQ ID N°:99) ABD59884 Células B M2 6-13 EVETPIRN (SEQ ID N°:20) GAAG T G GAAAC C CCGATTCGTAAC (SEQ ID N°:100) ABD59900 Células B M2 1-18 MSLLTEVETPTRNE WECR (SEQ ID N°:21) ATGAGCCTGCTGACCG AAGTGGAAACCCCGAC CCGCAACGAATGGGAA TGCCGC (SEQ ID N°:101) BAD89348 Células B M2 2-24 SLLTEVETPTRNEW ECRCS DSSD (SEQ ID N°: 22) AGCCTGCTGACCGAAG TGGAAACCCCGACCCG CAACGAATGGGAATGC CGCTGCAGCGATAGCA GCGAT (SEQ ID N°:102) BAD89348 Células B M2 2-24 SLLTEVETPIRNEW GCRCN DSSD (SEQ ID N°: 23) AGCCTGCTGACCGAAG TGGAAACCCCGATTCG CAACGAATGGGGCTGC CGCTGCAACGATAGCA GCGAT (SEQ ID N°:103) ABD59884 Células B M2 7-15 VETPIRNEW (SEQ ID N°: 24) GTGGAAACCCCGATT CGTAACGAATGG (SEQ ID N°:104) ABD59884 22 (continuação)

Tipo de epitopo* Posição do Epitopo Sequência de aminoácidos Sequência de nucleótidos NCBI N° Células B Ml 2-12 SLLTEVETYVL (SEQ ID N°:25) AGCCTGCTGACCGAAG TGGAAACCTATGTGCTT (SEQ ID N°:105) AAO52904 CTL Ml 2-12 SLLTEVETYVP (SEQ ID N°:26) AGCCTGCTGACCGAAG TGGAAACCTATGTGCC G(SEQ ID N°:106) AAO33507 CTL Ml 3-11 LLTEVETYV (SEQ ID N°: 27) CTGCTGACCGAAGTGG AAACCTATGTG (SEQ ID N°: 107) AAO33507 CTL Ml 13-21 SIVPSGPL (SEQ ID N°:28) AGCATTGTGCCGAGCG GCCCGCTG (SEQ ID N°: 108) ABD59901 CTL Ml 17-31 SGPLKAEIAQRLEDV (SEQ ID N°: 29) AGCGGCCCGCTGAAAG CGGAAATTGCGCAGCG CCTGGAAGATGTG (SEQ ID N°: 109) ABD59901 CTL Ml 18-29 GPLKAEIAQRLE (SEQ ID N°:30) GGCCCGCTGAAAGCGG AAATTGCGCAGCGCCT GGAA (SEQ ID N°: 110) ABD59901 CTL Ml 27-35 RLEDVFAGK (SEQ ID N°: 31) CGCCTGGAAGATGTGT TTGCGGGCAAA (SEQ ID N°: 111) ABD59901 CTL Ml 41-51 ALMEWLKTRPI (SEQ ID N°:32) GCGCTGATGGAATGGC TGAAAACCGCCCG (SEQ ID N°: 112) ABD59901 CTL M150-59 PILSPLTKGI (SEQ ID N°: 33) CCGATTCTGAGCCCGC TGACCAAAGGCATT (SEQ ID N°: 113) ABD59901 CTL Ml 51-59 ILSPLTKGI (SEQ ID N°:34) ATTCTGAGCCCGCTGA CCAAAGGCATT (SEQ ID N°: 114) ABD59901 23 (continuação)

Tipo de epitopo* Posição do Epitopo Sequência de aminoácidos Sequência de nucleótidos NCBI N° CTL Ml 55-73 LTKGILGFVFTLTV PSERG (SEQ ID N°: 35) CTGACCAAAGGCATTC TGGGCTTTGTGTTTAC CCTGACCGTCCGAGC GAACGCGGC (SEQ ID N°: 115) ABD59901 CTL Ml 56 — 68 TKGILGFVFTLTV (SEQ ID N°:36) ACCAAAGGCATTCTGG GCTTTGTGTTTACCCT GACCGTG (SEQ ID N°: 116) ABD59901 CTL Ml 57-68 KGILGFVFTLTV (SEQ ID N°:37) AAAGGCATTCTGGGCT TTGTGTTTACCCTGAC CGTG (SEQ ID N°: 117) ABD59901 CTL Ml 58—66 GILGFVFTL (SEQ ID N°: 38) GGCATTCTGGGCTTTG TGTTTACCCTG (SEQ ID N°: 118) ABD59901 CTL Ml 6 0 — 6 8 LGFVFTLTV (SEQ ID N°: 39) CTGGGCTTTGTGTTTA CCCTGACCGTG (SEQ ID N°: 119) ABD59901 CTL Ml 59-67 ILGFVFTLT (SEQID NO:40) ATTCTGGGCTTTGTGT TTACCCTGACC (SEQ ID N°: 120) ABD59901 CTL Ml 128-135 ASCMGLIY (SEQ ID N°:41) GCGAGCTGCATGGGCC TGATTTAT (SEQ ID N°: 121) ABD59901 CTL Ml 134-142 RMGAVTTEV (SEQ ID N°: 42) CGCATGGGCGCGGTGA CCACCGAAGTG (SEQ ID N°: 122) ABD59901 CTL Ml 145-155 GLVCATCEQIA (SEQ ID N°:43) GGCCTGGTGTGCGCGA CCTGCGAACAGATTGC (SEQ ID N°: 123) ABD59901 CTL Ml 164-172 QMVATTNPL (SEQ ID N°: 44) CAGATGGTGGCGACCA CCAACCCGCTG (SEQ ID N°: 124) ABD59901 24 (continuação)

Tipo de epitopo* Posição do Epitopo Sequência de aminoácidos Sequência de nucleótidos NCBI N° CTL Ml 164-173 QMVATTNPLI (SEQ ID N°: 45) CAGATGGTGGCGACCA CCAACCCGCTGATT (SEQ ID N°: 125) ABD59901 CTL Ml 178-187 RMVLASTTAK (SEQ ID N°: 46) CGCATGGTGCTGGCGA GCACCACCGCGAAA (SEQ ID N°: 126) ABD59901 CTL Ml 232-240 DLLENLQTY (SEQ ID N°: 47) GAT C TGC TGGAAAAC CTGCAGACCTAT (SEQ ID N°: 127) ABD59901

Nucleoproteína (NP) é um dos grupos de antigénios específicos, que distinguem entre os vírus da gripe A, B e C. Em contraste, para HA, NP é altamente conservada, sendo 94% conservada em todos os vírus da gripe A. 0 anticorpo especifico para o vírus da gripe A NP não tem actividade neutralizadora do vírus, mas o NP é um alvo importante para os linfócitos T citotóxicos (CTL) que possuem reacção cruzada com todos os tipos de vírus A (Townsend, 1984). Os CTL reconhecem péptidos sintéticos curtos que correspondem a regiões lineares da molécula da gripe NP. A hemaglutinina (HA) é um trímero de glicoproteína incorporado no envelope da gripe. É responsável pela ligação e penetração do vírus na célula hospedeira. Os anticorpos contra a HA neutralizam a infecciosidade virai. As variações antigénicas desta molécula são responsáveis pelos surtos frequentes da gripe e pelo fraco controlo de infecção por imunização (Ada e Jones, 1986) . 25 A polimerase de ARN do vírus da gripe é um heterocomplexo composto por três proteínas da polimerase (P) PB1, PB2 e PA-presentes numa proporção de 1:1:1. 0 seu papel na virulência da gripe não foi totalmente elucidado. Exemplos não limitados de epitopos de péptido de HA, NP e PB podem ser aqui encontrados na tabela 2 abaixo.

Tabela 2: Epitopos do péptido HA, NP e PB

Tipo de epitopo* Posição do Epitopo Sequência de aminoácidos Sequência de nucleótidos Acesso de NCBI Células B HA 91-108 SKAYSNCYPYDVPD YASL (SEQ ID N°:48) AGCAAAGCTTACAGC AAC TGTTACCCTTAT GATGTGCCGGATTAT GCCTCCCTT (SEQ ID N°:128) AAM82562 Células B HA 91-108 SKAFSNCYPYDVPD YASL (SEQ ID N°:49) AGCAAAGCGTTTAGCAAC TGCTATCCGTATGATGTG CCGGATTATGCGAGCCTG (SEQ ID N°:129) CAC 81017 Células B HA 107-124 STAYSNCYPYDVPD YASL (SEQ ID N°:50) AGCACCGCGTATAGCAAC TGCTATCCGTATGATGTG CCGGATTATGCGAGCCTG (SEQ ID N°:130) ABD59854(de A/TW/3286/0 3 (H3N2) Células B HA166-175 (estirpe HA 150-159 A/PR/8) WLTEKEGSYP (SEQ ID N°:51) TGGCTGACGGAGAAG GAGGGCTCATACCCA (SEQ ID N°:131) ABD77675 Th HA 306-324 GVKLESMGIYQ (SEQ ID N°:53) CCCAAGTATGTTAAGCAA AACAC TC TGAAGT TGGCA ACAGGGATGCGGAATGTA CCAGAGAAACAAACTAGA GGC (SEQ ID N°:132) AAL62329 26 (continuação)

Tipo de epitopo* Posição do Epitopo Sequência de aminoácidos Sequência de nucleótidos Acesso de NCBI CTL HA 521-531 GVKLESMGIYQ (SEQ ID N°:53) GGCGTGAAACTGGAAAGC ATGGGCATTTATCAG (SEQ ID N°:133) ABJ09518 CTL HA 518-528 EISGVKLESMG (SEQ ID N°:54) GAAATTTCCGGCGTGAAA CTGGAAAGCATGGGC (SEQ ID N°:134) ABJ09518 CTL HA 458-467 NVKNLYEKVK (SEQ ID N°: 55) AAC G T G AAAAAC C T G T AT GAAAAAGTAAA (SEQ ID N°:135) ABD77675 Th HA 128-145 KVKILPKDRWTQHT TTGG (SEQ ID N°:56) AAAGTGAAAATTCTGCCG AAAGATCGCTGGACCCAG CATACCACCACCGGCGGC (SEQ ID N°:136) AA046269 Th HA307-319(HA 306-318) PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID N°:57) CCCAAGTATGTTAAGCAA AAC AC TC T GAAGT TGGCA ACA (SEQ ID N°:137 AAL62329 Th NP 91-99 KTGGPIYRR (SEQ ID N°: 58) AAAACTGGAGGACCT ATATACAGGAGAGG (SEQ ID N°:138) BAA9 9 4 0 0 CTL NP 44-52 CTELKLSDY (SEQ ID N°: 59) T G C AC C G AAC T G AAAC T G AGCGATTAT (SEQ ID N°:139) BAA9 9 4 0 0 CTL NP 82-95 HPSAGKDPKKTGGP (SEQ ID N°:60) CATCCGAGCGCGGGCAAA GATCCGAAAAAAACCGGC GGCCCG (SEQ ID N°:140 BAA9 9 4 0 0 CTL NP 82-94 HPSAGKDPKKTGG (SEQ ID N°:61) CATCCGAGCGCGGGCAAA GATCCGAAAAAAACCGGC GGC (SEQ ID N°:141 BAA9 9 4 0 0 27 (continuação)

Tipo de epitopo* Posição do Epitopo Sequência de aminoácidos Sequência de nucleótidos Acesso de NCBI Th NP 206-229 FWRGENGRKTRSAY ERMCNILKGK (SEQ ID N°:62) TTTTGGCGCGGCGAAAAC GGCCGCAAAACCCGCAGC GCGTATGAACGCATGTGC AAC AT TC TGAAAGGCAAA (SEQ ID N°:142) ABD59868 CTL NP 265-273 ILRGSVAHK (SEQ ID N°: 63) ATTCTGCGCGGCAGCGTG GCGCATAAA (SEQ ID N°:143) BAA9 9 4 0 0 CTL NP 305-313 KLLQNSQVY (SEQ ID N°: 64) AAAC TGC TGCAGAACAGC CAGGTGTAT (SEQ ID N°:144) ABD59868 CTL NP 335-349 SAAFEDLRVLSFIRG (SEQ ID N°:65 AGCGCGGCGTTTGAAGAT CTGCGCGTGCTGAGCTTT ATTCGCGGC (SEQ ID N°:145) ABD35694 CTL NP 335-350 SAAFEDLRVSSFIRGT (SEQ ID N°:66) AGCGCGGCGTTTGAAGAT CTGCGCGTGAGCAGCTTT ATTCGCGGCACC (SEQ ID N°:146) ABK34765 CTL NP 335-350 SAAFEDLRVLSFIRGY (SEQ ID N°:67) AGCGCGGCGTTTGAAGAT CTGCGCGTGCTGAGCTTT ATTCGCGGCTAT (SEQ ID N°:147) ABD35694 CTL NP 380-393 ELRSRYWAIRTRSG (SEQ ID N°:68) GAACTGCGCAGCCGCTAT TGGGCGATTCGCACCCGC AGCGGC (SEQ ID N°:148) ABK34765 CTL NP 380-388 ELRSRYWAI (SEQ ID N°: 69) GAACTGCGCAGCCGCTAT TGGGCGATT (SEQ ID N°:149) ABK34765 CTL NP 383-391 SRYWAIRTR (SEQ ID N°: 70) AGCCGCTATTGGGCGATT CGCACCCGC (SEQ ID N°:150) BAA9 9 4 0 0 28 (continuação) Tipo de epitopo* Posição do Epitopo Sequência de aminoácidos Sequência de nucleótidos Acesso de NCBI CTL NP 384-394 YWAIRTRSGG (SEQ ID N°:71) TATTGGGCGATTCGCACC CGCAGCGGCGGC (SEQ ID N°:151) BAA9 9 4 0 0 CTL NP 382-390 SRYWAIRTR (SEQ ID N°: 72) AGCCGCTATTGGGCGATT CGCACCCGC (SEQ ID N°:152) BAA9 9 4 0 0 CTL NP 418-426 LPFDKPTIM (SEQ ID N°: 73) CTGCCGTTTGATAAACCG ACCATTATG (SEQ ID N°:153) BAA9 9 4 0 0 CTL PB1 591-599 VSDGGPNLY (SEQ ID N°: 74) GTGAGCGATGGCGGCCCG AACCTGTAT (SEQ ID N°:154) ABK34974 CTL PB1 571-579 RRSFELKKL (SEQ ID N°: 75) CGCCGCAGCTTTGAACTG AAAAAACTG (SEQ ID N°:155) ABK34974 CTL PB2 368-376 RRATAILRK (SEQ ID N°: 76) CGCCGCGCGACCGCGATT CTGCGCAAA (SEQ ID N°:156) ABK34762 epitopo de de epitopos

Em alguns exemplos, a vacina compreende um péptido derivado da gripe B. Exemplos não limitantes de péptido da gripe B são apresentados na Tabela 3. 29

Tabela 3: epitopos de péptido da gripe B

Tipo de epitopo* Posição do Epitopo Sequência de aminoácidos Sequência de nucleótidos Acesso de NCBI CTL NP 30-38 (flu B) RPIIRPATL (SEQ ID N°: 77) CGCCCGATTATTCGCCC GGCGACCCTG (SEQ ID N°:157) ABF21293 CTL NP 263-271 (flu B) ADRGLLRDI (SEQ ID N°:78) GCAGATAGAGGGC TA T T GAGAGACAT C (SEQ ID N°:158) ABF21293 Th HA 308-320 (flu B) PYYTGEHAKAIGN (SEQ ID N°:79) CCGTATTATACCGGCGA ACATGCGAAAGCGATTG GCAAC (SEQ ID N°:159) ABI 84095 B HA 354-372 (flu B) PAKLLKERGFFGAI AGFLE (SEQ ID N°:80) CCGGCGAAACTGCTGAA AGAACGCGGCTTTTTTG GCGCGATTGCGGGCTTT CTGGAA (SEQ ID N°:160) ABI 83926 * Cada péptido pode pertencer a um ou mais tipos de epitopo. Por exemplo, um péptido que induz uma resposta de células B pode também induzir uma resposta de células T (Th e/ou CTL). Ácidos Nucleicos São também divulgadas moléculas de ácidos nucleicos que codificam um vector, tal como um vector de expressão compreendendo os epitopos da gripe e uma célula hospedeira compreendendo um vector que compreende um epitopo da gripe útil na preparação de uma vacina sintética da invenção.

Uma sequência de ácido nucleico isolada que codifica um péptido pode ser obtida a partir da sua fonte natural, por 30 exemplo, como uma porção de um gene. Também pode ser produzida uma molécula de ácido nucleico utilizando a tecnologia do ADN recombinante (e. g., amplificação através da reacção em cadeia pela polimerase (PCR), clonagem) ou síntese química. Sequências de ácidos nucleicos incluem sequências de ácidos nucleicos naturais e seus homólogos, compreendendo, mas não limitadas a, variantes alélicas naturais e sequências de ácidos nucleicos modificadas em que os nucleótidos foram inseridos, eliminados, substituídos, e/ou invertidos de modo a que essas modificações não interfiram substancialmente com a capacidade a molécula de ácido nucleico para codificar uma flagelina funcional.

Uma sequência de polinucleótidos ou oligonucleótidos pode ser deduzida a partir do código genético de uma proteína, todavia, a redundância do código deve ser tida em conta e as sequências de ácidos nucleicos também incluem sequências, que são redundantes como resultado do código genético, cujas sequências podem ser rapidamente determinadas pelos especialistas na técnica.

Os termos "ácido nucleico" e "polinucleótido", como aqui utilizado referem-se a um oligonucleótido, polinucleótido ou nucleótido e seus fragmentos ou porções, e a ADN ou ARN de origem genómica ou sintética que podem ser de cadeia simples ou dupla, e representam a cadeia de sentido ou anti-sentido. 0 termo deve também ser entendido como incluindo, como equivalentes, análogos de ARN ou de ADN produzidos a partir de análogos de nucleótidos e, como aplicável à forma de realização a ser descrita. 31 0 termo "oligonucleótido" refere-se a uma sequência de ácido nucleico de, pelo menos, cerca de 6 nucleótidos a cerca de 60 nucleótidos, de um modo preferido, cerca de 15 a 30 nucleótidos e, de um modo mais preferido, cerca de 20 a 25 nucleótidos, que pode ser utilizada na amplificação por PCR ou um ensaio de hibridação ou um "microarray". Como aqui utilizado, oligonucleótido é substancialmente equivalente aos termos "amplímeros", "iniciadores", "oligómeros" e "sondas", como é normalmente definido na técnica. Os oligonucleótidos codificam os epitopos específicos do péptido úteis na preparação da vacina da presente invenção são proporcionados nas tabelas 1-3 acima.

Como aqui utilizado, condições de restringência elevada são aquelas que são tolerantes até desde cerca de 5% a cerca de 25% de divergência de sequências, de um modo preferido até cerca de 5% a cerca de 15%. Sem limitação, exemplos de condições altamente restringentes (-10 °C abaixo da Tm calculada do híbrido) utilizam uma solução de lavagem de 0,1 X SSC (citrato salino convencional) e 0,5% de SDS à Ti (temperatura de incubação) apropriada, abaixo da Tm calculada do híbrido. A restringência final das condições é principalmente devida às condições de lavagem, particularmente se as condições de hibridação utilizadas são aquelas que permitem que se formem híbridos menos estáveis para forma juntamente com híbridos estáveis. As condições de lavagem a restringência superior

removem então os híbridos menos estáveis. Uma condição de hibridação comum que pode ser utilizada com as condições de lavagem altamente restringentes a moderadamente restringentes descritas acima é a hibridação numa solução de 6 X SSC (ou 6 X SSPE) , 5 X reagente de Denhardt, 0,5% de SDS, 100 mg/mL 32 de ADN de esperma de salmão fragmentado, desnaturada a um Ti apropriada, (ver geralmente Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Press (1989) para condições de restringência elevadas adequadas).

As condições de restringência são uma função da temperatura utilizada na experiência de hibridação e nas lavagens, a molaridade dos catiões monovalentes na solução de hibridação e na(s) solução(ões) de lavagem e a percentagem de formamida na solução de hibridação. Em geral, a sensibilidade por hibridação com uma sonda é afectada pela quantidade e actividade especifica da sonda, a quantidade do ácido nucleico alvo, a detectabilidade do marcador, a taxa de hibridação e a duração da hibridação. A taxa de hibridação é maximizada a uma Ti de cerca de 20 "C -25 °C abaixo da Tm para híbridos ADN: ADN e cerca de 10 °C -15 °C abaixo da Tm para híbridos ADN : ARN. É também maximizado por uma força iónica de cerca de 1,5 M Na+. A taxa é directamente proporcional ao comprimento do duplex e inversamente proporcional ao grau de desemparelhamento. A especificidade na hibridação, todavia, é uma função da diferença na estabilidade entre o híbrido desejado e os híbridos de "fundo". A estabilidade do híbrido é uma função do comprimento do duplex, da composição de bases, força iónica, desemparelhamento e agentes desestabilizadores (se os houver). A Tm de um híbrido perfeito pode ser estimada para híbridos ADN:ADN utilizando a equação de Meinkoth et al (1984). 33

Moléculas Quiméricas ou Recombinantes

Uma "proteína quimérica", "polipéptido quimérico" ou "proteína recombinante" são utilizados indistintamente e referem-se a um epitopo de péptido da gripe ligado operacionalmente a um polipéptido diferente do polipéptido a partir do qual o epitopo de péptido foi derivado. Os epitopos de péptido da presente invenção podem ser preparados através da expressão num vector de expressão como uma proteína quimérica. Os métodos para produzir uma proteína quimérica ou recombinante compreendendo um epitopo de péptido da gripe são conhecidos dos especialistas na técnica. Uma sequência de ácido nucleico que codifica um epitopo de péptido da gripe pode ser inserida num vector de expressão para a preparação de uma construção de polinucleótidos para propagação e expressão nas células hospedeiras.

Num exemplo não limitante, o polipéptido quimérico divulgado inclui quimeras de um epitopo de péptido da gripe com um dos seguintes polipéptidos: Flagelina, Toxina da cólera, Toxina do tétano, Ovalbumina, Proteína de choque térmico da tuberculose, Toxóide da Difteria, Proteína G do vírus do sincício respiratório, Proteína da Membrana Externa de Neisseria meningitides, nucleoproteína (N) do vírus da estomatite vesicular, glicoproteína (G) do vírus da estomatite vesicular, Proteína Rica em Glutamato do Antigénio de Plasmodium falciparum, Proteína 3 da Superfície do Merozoito ou Proteína do envelope de vírus (E). A expressão "vector de expressão" e "vector de expressão recombinante", como aqui utilizado refere-se a uma molécula de 34 ADN, por exemplo, um plasmídeo, flagelina ou vírus, contendo sequências de ácidos nucleicos desejadas e apropriadas necessárias para a expressão dos epitopos de péptido recombinantes para expressão numa célula hospedeira particular. Como aqui utilizado "ligado operacionalmente" refere-se a uma ligação funcional de pelo menos duas sequências. Ligado operacionalmente inclui ligações entre um promotor e uma segunda sequência, por exemplo, um ácido nucleico da presente invenção, em que a sequência do promotor inicia e medeia a transcrição da sequência de ADN que corresponde à segunda sequência.

As regiões reguladoras necessárias para a transcrição do epitopo do péptido podem ser proporcionadas pelo vector de expressão. A natureza precisa das regiões reguladoras necessárias para a expressão genética pode variar entre vectores e células hospedeiras. Geralmente, é necessário um promotor que seja capaz de ligar a polimerase de ARN e promover a transcrição de uma sequência de ácido nucleico associada operacionalmente. As regiões reguladoras podem incluir as sequências 5' não codificantes envolvidas com a iniciação de transcrição e tradução, tal como a caixa TATA, sequência de nivelamento, sequência CAAT e semelhantes. A região não codificante 3' para a sequência codificante pode conter sequências reguladoras de terminação transcricional, tais como terminadores e sítios de poliadenilação. Também pode ser proporcionado um códão de iniciação de tradução (ATG).

De forma a clonar as sequências de ácidos nucleicos no sítio de clonagem de um vector, ligantes ou adaptadores que proporcionam os sítios de restrição compatíveis apropriados durante a síntese dos ácidos nucleicos. Para exemplo, pode ser 35 introduzido um sitio de enzima de restrição desejado num fragmento de ADN através de amplificação do ADN através da utilização de PCR com iniciadores contendo o sitio de enzima de restrição desejado.

Uma construção de expressão compreendendo uma sequência de epitopo de péptido associada operacionalmente com regiões reguladoras pode ser introduzida directamente nas células hospedeiras apropriadas para expressão e produção dos epitopos de péptido per se ou como proteínas de fusão recombinantes. Os vectores de expressão que podem ser utilizados incluem, mas são estão limitados a plasmídeos, cosmídeos, fagos, fagemídeos, flagelina ou vírus modificado. Tipicamente, esses vectores de expressão compreendem uma origem de replicação funcional para propagação do vector numa célula hospedeira apropriada, um ou mais sítios de endonuclease de restrição para inserção da sequência genética desejada e um ou mais maçadores de selecção. A construção de polinucleótidos recombinante compreendendo o vector de expressão e um epitopo de péptido deve ser então transferido para uma célula hospedeira bacteriana na qual pode replicar e ser expressa. Isto pode ser realizado através de métodos conhecidos na técnica. 0 vector de expressão é utilizado com uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica compatível que pode ser derivada de bactérias, leveduras, insectos, mamíferos e humanos.

Um vector de expressão particularmente preferido é um vector de flagelina. Um exemplo não limitante de um vector de expressão de flagelina é divulgado no documento US 6130082 aqui incorporado por referência. Outros vectores de expressão que 36 incluem um gene de flagelos, por exemplo, um gene fliC de Salmonella são também adequados. As células hospedeiras que expressam a flagelina recombinante podem ser formuladas como vacinas vivas.

Uma alternativa para produzir os epitopos de péptido através de técnicas recombinantes é a síntese de péptidos através da utilização de um sintetizador de péptidos. A síntese de péptidos convencional ou outros protocolos sintéticos bem conhecidos na técnica podem ser utilizados.

Formulação de Vacina A vacina pode ser formulada para administração num de muitos modos diferentes. De acordo com uma forma de realização da invenção, a vacina é administrada intranasalmente. A composição intranasal pode ser formulada, por exemplo, na forma líquida como gotas para o nariz, spray ou adequado para inalação, como pó, como creme ou como emulsão. A composição pode conter uma pluralidade de aditivos, tais como adjuvantes, excipientes, estabilizadores, tampões ou conservantes. Para uma aplicação directa, a composição de vacina é, de um modo preferido, fornecida num recipiente apropriado para distribuição da flagelina recombinante na forma de gotas para o nariz ou um aerossol. Em certas formas de realização preferidas, a vacina é formulada para distribuição na mucosa, em particular distribuição nasal (Arnon, 2001; Ben-Yedidia, 1999).

Noutra forma de realização da invenção, a administração é oral e a vacina pode ser apresentada, por exemplo, na forma de 37 um comprimido ou encerrada numa cápsula de gelatina ou uma microcápsula.

Ainda noutra forma de realização, a vacina é formulada para administração parentérica. Em algumas formas de realização, a vacina é formulada para inoculação em massa, por exemplo para utilização com um injector de jacto ou um cartucho de utilização única. A formulação destas modalidades é do conhecimento geral dos especialistas na técnica. 0 lipossoma proporciona outro sistema de distribuição para a distribuição e apresentação de antigénios. Os lipossomas são vesículas de bicamada compostas por fosfolípidos e outros esteróis que rodeiam um centro tipicamente aquoso em que os antigénios ou outros produtos podem ser encapsulados. A estrutura de lipossoma é altamente versátil com muitos tipos variando em tamanhos de nanómetro até micrómetro, desde cerca de 25 nm a cerca de 500 pm. Observou-se que os lipossomas são eficazes na distribuição de agentes terapêuticos a superfícies dérmicas e da mucosa. Os lipossomas podem ser ainda modificados para uma distribuição dirigida através de, por exemplo, incorporação de anticorpos específicos para a membrana de superfície ou alterados para bactérias encapsuladas, vírus ou parasitas. O tempo de sobrevivência médio da estrutura de lipossoma intacto pode ser prolongado com a inclusão de certos polímeros, por exemplo, polietilenoglicol, permitindo a libertação prolongada in vivo. 38

As micropartículas e nanopartículas empregam pequenas esferas biodegradáveis que actuam como depósitos para distribuição da vacina. A principal vantagem que as microesferas de polímero possuem em relação a outros adjuvantes que realizam depósito é que elas são extremamente seguras e foram aprovadas pela "Food and Drug Administration" nos U.S., para utilização em medicina humana como suturas adequadas e para utilização como um sistema de distribuição de fármacos biodegradável (Langer, 1990) . As taxas de hidrólise de copolímero estão muito bem caracterizadas, o que por sua vez permite o fabrico de micropartículas com libertação de antigénio sustida durante períodos de tempo prolongados (0'Hagen, et ai., 1993). A administração parentérica de micropartículas induz imunidade de longa duração, especialmente se incorporam características de libertação prolongada. A taxa de libertação pode ser modulada pela mistura de polímeros e pelos seus pesos moleculares relativos, que irão hidrolisar durante períodos de tempo variáveis. Sem desejar estar limitado pela teoria, a formulação de partículas de tamanhos diferentes (1 pm a 200 pm) também pode contribuir para respostas imunológicas de longa duração uma vez que as partículas grandes devem ser quebradas em partículas mais pequenas antes de estarem disponíveis para a incorporação por macrófagos. Deste modo, pode ser desenvolvida uma vacina de injecção única através da integração de vários tamanhos de partícula, prolongando, desse modo, a apresentação de antigénio e beneficiando grandemente os produtores de pecuária.

Em algumas aplicações pode ser incluído um adjuvante ou excipiente na formulação de vacina. A escolha do adjuvante será 39 determinada, em parte pelo modo de administração da vacina. Por exemplo, a vacinação não injectada irá conduzir à melhoria de uma conformidade global e custos globais inferiores. Um modo preferido de administração é a administração intranasal. Exemplos não limitantes de adjuvantes intranasais incluem pó de quitosano, microesferas de PLA e PLG, QS-21, nanopartícuias de fosfato de cálcio (CAP) e mCTA/LTB (toxina da cólera mutante E112K com subunidade pentamérica B de enterotoxina lábil aquecia).

Utilização Terapêutica da Vacina

As vacinas da invenção destinam-se a utilização em humanos e em animais incluindo pecuária, aves de capoeira e animais domésticos, para a prevenção ou atenuação da doença da gripe A e B.

Os exemplos seguintes são apresentados de modo a ilustrar mais completamente algumas formas de realização da invenção. Eles não devem, de modo algum, ser interpretados, todavia, como limitantes do vasto âmbito da invenção. Um especialista na técnica pode rapidamente inventar muitas variações e modificações dos princípios aqui divulgados sem se separar do âmbito da invenção.

EXEMPLOS ABREVIATURAS: Ab: Anticorpos; CTL: Linfócitos T Citotóxicos; EID: dose que infecta o ovo; HA: Hemaglutinina; HAU: Unidade de 40

Hemaglutinação; NP: Nucleoproteína; PMBC: Células mononucleares do sangue periférico; Th: Auxiliar T; IN ou i.n.: intranasal; IP: intraperitoneal; IM ou i.m.: intramuscular; NK: células Assassinas Naturais; razão E:T: razão efector alvo. EXEMPLO 1. Síntese de péptidos e flagelina recombinante

Os epitopos podem ser expressos como flagelos recombinantes, em gue cada flagelo compreende um ou mais epitopos do péptido. Alternativamente, os epitopos do péptido podem ser expressos num vector de expressão como uma proteína de fusão multimérica compreendendo dois ou mais epitopos do péptido.

As flagelinas recombinantes são sintetizadas através de métodos de biologia molecular conhecidos na técnica. Em resumo: foi preparado um vector de expressão de flagelos compreendendo um marcador antibiótico. Os oligonucleótidos sintetizados foram inseridos no sítio EcoRV do plasmídeo e transfectados para células E. coli competentes. As colónias gue contêm o plasmídeo recombinante foram seleccionadas por rastreio com sonda com um oligonucleótido marcado radioactivamente. Os plasmídeos das colónias positivas foram purificadas e a orientação da inserção foi determinada utilizando análise de restrição. Os plasmídeos desejados foram utilizados para transformar células competentes de Salmonella typhimurium LB5000 (um negativo restritivo, modificação proficiente não flagelado) e foram então transferidas para uma estirpe de vacina viva negativa de flagelina (um mutante Aro A) de Salmonella dublin SL5928 por transdução utilizando o fago P22HT105/1 int. As S. dublin transformadas foram seleccionadas para a resistência a 41 canamicina, motilidade sob a luz do microscópio e crescimento em placas de LB agar semi-sólido, suplementado com Oxoid nutrient broth n° 2. Os clones seleccionados foram cultivados de um dia para o outro em 2 litros de meio e a flagelina foi purificada por clivagem acidica. 0 produto resultante é um agregado da flagelina e pode ser utilizado como tal para uma vacina. A flagelina recombinante não se pretende para ser limitada pela escolha da sequência de flagelina. Em algumas das formas de flagelina possuindo o número de acesso X03395 do gene Hl-d de Salmonella muenchen de flagelina de fase-l-d (ATCC 8388). EXEMPLO 2: Resposta dos murganhos quiméricos ao vírus da gripe inactivado

As quimeras humano murganho são utilizadas para avaliar a resposta imunogénica induzida pela vacina da presente invenção. De modo a estabelecer a adequabilidade da quimera de radiação humana/murganho para avaliação da vacina à base de péptido, foi avaliada a sua resposta imunitária para o virus da gripe inactivo purificado. Os murganhos foram imunizados i. p. com 50 pg dos virus no dia do transplante de PBMC, seguidos por uma exposição virai subletal com a estirpe da gripe A/Texas/1/77, 14 dias após imunização. A vacinação da quimera humano/murganho com a vacina de vírus mortos totais, sem qualquer adjuvante, induziram a produção de anticorpos específicos - o título de anticorpo no soro foi significativamente superior (2,4 vezes) na quimera imunizada como comparado com o grupo de controlo. Além disso, esta vacinação reduziu marcadamente a infecção virai subsequente. O título vírus no pulmão após exposição foi 42 significativamente inferior (por 2,7 ordens de magnitude) nas quimeras imunizadas como comparado com o grupo de controlo.

Esta experiência demonstra a adequabilidade da quimera de radiação humana/murganho para a avaliação da resposta antigripe após imunização. EXEMPLO 3. Análise de FACS de murganhos imunizados para avaliar o enxerto de PBMC humanos na quimera humano/BALBc. 0 sucesso da enxertia de células humanas nas quimeras humano/murganho demonstrado numa experiência preliminar mostrou que a maioria dos linfócitos no peritoneu (50-80%) e nos pulmões de murganhos (30-60%) foram de origem humana. Para a avaliação de enxertias com células humanas na quimera humana/murganho, a presença de células humanas nos murganhos enxertados foi analisado por FACS. EXEMPLO 4. Eliminação do vírus a partir dos pulmões após exposição subletal A infecção com gripe é uma doença respiratória; deste modo, uma resposta imunitária local induzida por uma administração intranasal da vacina pode ser mais eficiente do que a administração parentérica. O esquema de imunização foi modificado de modo a adaptá-lo para imunização intranasal.

Murganhos (6-8 por grupo em 7 experiências repetidas) são imunizados intranasalmente (i. n.) 10-12 dias após transplante 43 de PBMC, como descrito nos Métodos. Dez dias mais tarde, estes são expostos i. n. com 1CT4 HAU em 50 pL de fluido alantóico da estirpe A/Texas/1/77 viva ou outra estirpe do vírus da gripe. Cinco dias mais tarde, estes foram sacrificados e os seus pulmões foram removidos para titulação de vírus. A produção de anticorpo humano nestes murganhos é avaliada em ambos os soros (antes da exposição) e nos pulmões (após exposição).

Ainda para a experiência de exposição a infecção subletal, a capacidade da vacina para protecção da quimera humana/murganho de uma dose de vírus da gripe letal é examinada. EXEMPLO 5. Protecção da infecção com diferentes estirpes de gripe

Um dos principais problemas com vacinas da gripe presentemente disponíveis é que estas são eficazes apenas contra as estirpes incluídas na vacina. Deste modo, é interessante examinar a capacidade da flagelina recombinante compreendendo epitopos da gripe para proteger murganhos de diferentes subtipos de gripe. O péptido epitopo M, que é expresso na flagelina, pode ser conservado em todos os subtipos de gripe H3, enquanto os epitopos de células T são de regiões da hemaglutinina e nucleoproteína altamente conservadas também em outros subtipos. Em outros exemplos o péptido epitopo M é conservado em todas as amostras H9 ou H5. No primeiro passo, é mostrado que os anticorpos de coelho contra estes epitopos podem de facto reconhecer e reagir em ELISA com diferentes estirpes de gripe incluindo A/Texas/1/77, A/Aichi/68, A/PR/8/34 e A/Japanese/57. Para testar ainda o potencial destes epitopos para conferir 44 protecção cruzada em humanos, a quimera de radiação humana/murganho (8 murganhos por grupo) foi imunizada i. n. com a flagelina recombinante. A sua resistência à exposição a diferentes estirpes de gripes foi detectada 7 dias mais tarde e comparada com murganhos não transplantados que são imunizados com a mesma mistura de flagelos. As estirpes de gripe utilizadas para a infecção foram: A/Texas/1/77 (H3N2), A/Japanese/57 (H2N2) e A/PR/8/34 (H1N1). Outras estirpes são também testadas.

EXEMPLO 6: Ensaio de resposta CTL

Após imunização com a vacina da presente invenção, os baços dos animais são removidos e incubados com o péptido que representa o epitopo relevante (por exemplo NP 335-350 ou M2 1-18) por mais 5 dias. As células alvo singeneicas deficientes em TAP (com a mesma tipagem de HLA A2.1, por exemplo: células RMA) são incubadas com o mesmo péptido e com S35-Metionina numa placa separada. Os esplenócitos activados são incubados com a célula alvo e depois do reconhecimento do péptido, irão atacar e libertar metionina. As elevadas contagens de radioactividade indicam um elevado nivel de células CTL activas. 45 EXEMPLO 7: Anticorpo no Soro e ensaios de neutralização de anticorpo

Murganhos, cobaias ou coelhos são imunizados com a mistura de flagelina recombinante, 14 dias pós-imunização, amostras de sangue são recolhidas e o soro é separado. Estes soros podem ser empregues para detecção da especificidade dos anticorpos, por exemplo, por ELISA ou transferência de western, adicionalmente, é possível determinar o seu tipo, i.e. IgGl, ou IgG2a ou IgG2c etc. Em homogenatos de pulmão a IgA pode ser detectada, indicativa de uma resposta imunitária da mucosa.

Ensaio de Neutralização: as células MDCK são infectadas pelo vírus da gripe como determinado por contagem de placas ou por MTT (separação por coloração de viabilidade), após incubação do vírus com soro de animais imunizados; os anticorpos ligam-se ao vírus e evitam a infecção das células MDCK. Um número reduzido de placas ou viabilidade aumentada das células indica a especificidade dos anticorpos e a sua capacidade para evitar/reduzir a infecção. EXEMPLO 8: Imunogenicidade de epitopos individuais

Os murganhos transgénicos HHD/HLA A2 foram imunizados com flagelos que expressam cada epitopo (Fla-91, Fla-335, Fla-380, Fla-Ml 2-12) ou com uma mistura de 6 epitopos (Hexavacinal: Fla-91, Fla-335, Fla-380, Fla-Ml 2-12, Fla-354 e Fla-307). Fla-91 refere-se ao flagelo compreendendo o epitopo HA 91-108; Fla-335 refere-se ao flagelo compreendendo o epitopo NP 335-350; Fla-380 refere-se ao flagelo compreendendo o epitopo NP 380-393; 46

Fla-Ml 2-12 refere-se ao flagelo que expressa o epitopo Ml 2-12; Fla-354 refere-se ao flagelo que expressa o epitopo HA 354-372 (gripe B) ; Fla-307 refere-se ao flagelo que expressa o epitopo HA 307-319.

As células foram incubadas com o respectivo péptido e as células de murganhos imunizados com Hexa-vacina foram incubados com os 4 péptidos HA91, NP335, NP380, Ml 2-12. As sequências de péptido epitopo, identificadores de sequências e dados de homologia entre estirpes podem ser encontrados na tabela 4 a seguir.

Tabela 4: Lista de epitopos de péptido de Hexa vacinai

Tipo de epitopo Sequência do epitopo Homologia em estirpes da Gripe Th HA307-319PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID N°: 57) H3N2 CTL NP 335-350 SAAFEDLRVLSFIRGY (SEQ ID N°:67) H1N2, H2N2, H3N2, H9N2. CTL NP 380-393 ELRSRYWAIRTRSG (SEQ ID N°:68) H1N1, H1N2, H2N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N9, H6N1, H6N2, H6N9, H7N7, H9N2, H9N2, H11N1, H11N8, H11N9, H14N5. Células B HA91-108 SKAYSNCYPYDVPDYASL (SEQ ID N°:48) H3N2 Células B e CTL Ml 2-12 SLLTEVETYVP (SEQ ID N°:26) H1N1, H3N2, H4N6, H5N1, H5N2, H5N3, H6N1, H7N3, H9N2, 47 (continuação)

Tipo de Sequência do epitopo Homologia em estirpes da Gripe epitopo Células B HA 354-372 B/HongKong/330/2001; (Gripe B) PAKLLKERGFFGAIAGFLE B/Beijing/1/87; B/ (SEQ ID N°:80) Singapore/222/79; B/Oregon/5/80; B/ Shangdong/7/97; B/Memphis/13/03; B/Los Angeles/1/02; B/Nebraska/1/01; B/Hong Kong/548/2000; B/Hong Kong/156/99; b/ Vienna/1/99; B/Lee/40 e outros

Imunogenicidade no Modelo de "Murganho HHD Transgénico"

Os epitopos de CTL foram seleccionados pela sua ligação a moléculas HLA-A2. De modo a estudar respostas restritas a HLA, os murganhos nulos para a microglobulina D b-/- β2 (β2 m) , transgénicos para uma HLA-A2.1/D b-/- recombinante. A microglobulina de cadeia única β2 (HHD murganhos) foi empregue. Estes murganhos combinam a transgénese de HLA clássica com a destruição selectiva de H-2 de murino e apresentam apenas respostas restritas a HLA-A2.1. estes murganhos servem como um modelo animal para pesquisa de sistemas envolvendo imunidade celular, tais como cancro, questões de autoimunidade e de vacinação. A resposta celular que contribui para a eliminação do vírus envolve mecanismos mediados por citocinas. 0 envolvimento de citocinas na resposta imunitária montada pela vacina 48

recombinante foi estudado no modelo de murganhos HHD transgénicos.

Neste estudo, os flagelos gue expressam vários péptidos epitopos em PBS, emulsificado em adjuvante de Freund, foram administrados subcutaneamente três vezes. 0 grupo de controlo foi administrado com PBS emulsificado em adjuvante de Freund.

Ensaios celulares: os esplenócitos destes murganhos foram incubados na presença dos péptidos sintéticos correspondentes ao epitopo acima. A secreção de IFN-γ pelas células em resposta à estimulação com os péptidos foi monitorizada por ELISA. A Figura 1 apresenta a secreção de IFN gama como medido a partir de linfócitos incubados com o respectivo péptido após a segunda e terceira imunização.

Os linfócitos activados segregaram IFN-γ em resposta a incubação com os péptidos correspondentes. 0 grupo imunizado com Hexa-vacinal, contendo a mistura de 6 flagelos recombinantes, foi incubado com uma mistura dos 4 epitopos celulares testados separadamente. Após a terceira imunização, a secreção de IFN-γ a partir destas células é significativamente elevada (níveis de IFN segregados por células incubadas com meio, foram inferiores ao nível do ensaio de detecção de 2 pg/mL). A IFN gama segregada a partir de linfócitos não activados (controlos negativos cultivados em meio sem péptido) foi <0,004 ng/mL. A lise por NK (células Assassinas Naturais) contribui para a resposta anti-viral. É conhecido que as células infectadas por vírus são mais sensíveis à lise do que as células não 49 infectadas. É especulado que o reconhecimento de células alvo por células NK é mais ‘ especifico' do que o previamente pensado. Foi demonstrada uma semelhança no motivo do péptido entre os ligantes A2 de HLA e os ligantes HLA-G (expressa em células NK).

Deste modo, além do mecanismo não especifico da activação NK, péptidos específicos de HLA-A2 podem induzir outro aumento específico da actividade de NK (lise).

Os ensaios citotóxicos de linfócitos T (CTL): murganhos HHD/HLA A2.1 foram imunizados com Hexa-vacinal em PBS. A lise directa de células alvo por linfócitos CD8+ não foi demonstrada, contudo, foi obtida uma lise de células Yac-1 marcadas que são sensíveis a lise por NK. A lise por NK foi verificada após a segunda imunização e foi depois aumentada após a terceira imunização. Deve ser notado que os níveis da linha de base da activação de NK em murganhos naíves são aproximadamente nulos.

As Figuras 2A-2C apresentam a lise de células alvo por NK derivadas de murganhos vacinados foi seguido após a segunda e terceira imunização. A percentagem de lise de alvos YAC-1 por células NK após a segunda e terceira imunizações é apresentada. Os linfócitos do baço de murganhos imunizados foram sensibilizados com os péptidos incluídos no flagelo recombinante durante 5 dias e depois incubadas com células YAC-1 marcadas com 35S-Met. A lise específica foi determinada em diferentes proporções E:T. Os dados (% de lise por células NK de cada grupo) são apresentados como vezes de activação em comparação com a lise do grupo imunizado com o flagelo nativo. Após a segunda imunização, as células NK dos murganhos imunizados com a combinação de 6 epitopos (Hexa-vacinal) foram capazes de lisar 50 as células alvo mais eficientemente do que as células de murganhos vacinados com o flagelo nativo. As Figuras 2A e 2B mostram a lise de células NK de péptidos epitopos recombinantes individuais ou uma combinação de três epitopos recombinantes (Fla-NP335, Fla-NP380, Fla-Ml 2-12).

Após três imunizações, as células de murganhos imunizados com 2-12 Ml mostraram um aumento significativo na sua capacidade de destruir células alvo. 0 péptido epitopo 2-12 de Ml é, deste modo, um péptido epitopo útil na preparação da vacina da presente invenção.

As Figuras 3A e 3B mostram os resultados da imunização de murganhos C57B1/6 com a Hexa-vacinal, consistindo em flagelo com 6 epitopos da gripe (HA 91-108, HA 354-372, HA 307-319, NP 335-350, NP 380-393 e M2 1-18): 3 imunizações e foi vírus da gripe H3N2 específico M2 1-18 O soro foi removido após um esquema de determinada a especificidade de Ab contra o completo (Figura 3A) e contra o péptido (Figura 3B). A ligação de epitopos e estabilização de HLA-A2 em humanos T2 (deficientes para transportadores TAP e deste modo expressa quantidades baixas e instáveis de moléculas HLA-A2.1. Após a ligação de péptidos, os níveis estáveis e elevados de HLA-A2 são expressos na superfície celular). As células T2 foram incubadas com várias concentrações de péptidos em meio isento de soro de um dia para o outro e coradas com anticorpos monoclonais específicos. A estabilização de moléculas HLA-A2 foi detectada por citometria de Fluxo. 51 A Figura 4 mostra a ligação de péptidos a HLA-A2 em células T2: a ligação elevada e dependente da dose foi apresentada pelo péptido Ml 3-11. Outros péptidos testados, NP 336-344, NP 380-388 e HA 307-319, apresentaram alguma capacidade de ligação baixa, que não foi dependente da dose. O NP 380-393 é conhecido como especifico para a molécula para B8 de HLA e não se espera que se liguem a A2 de HLA. O péptido HA 91-108 que é maior do que a fenda HLA, apresentaram uma capacidade de ligação apenas à maior concentração (100 μΜ), provavelmente devido ao motivo HLA no seu lado N-terminal. A ligação mínima e não dependente da dose foi demonstrada em concentrações mais pequenas.

Além das respostas celulares, os soros de murganhos após a terceira imunização foram comparados com soros pré-imunitários para anticorpos específicos para os epitopos:

As Figuras 5A-5C mostram que os epitopos do péptido recombinante estimulam a protecção por anticorpo. Um aumento significativo no título de Ab, específico para o epitopo foi obtido com epitopos NP 335-350 (5A), Ml 2-12 (5B) e HA 91-108 (5C) em murganhos imunizados com o único epitopo relevante (200 mg/murganho, IM) .

Conclusões

Os resultados deste estudo indicam que a imunização com a flagelina recombinante contendo epitopos específicos de células T resultou no reconhecimento específico e resposta tipo TH1 52 celular, como apresentado pela secreção de IFN-y por linfócitos dos murganhos vacinados em resposta a estimulação in vitro com os respectivos péptidos sintéticos. Além disso, a ligação especifica dos epitopos investigados a células alvo que expressam A2 de HLA assim como a lise especifica destas células portadoras do epitopo por células NK indica a resposta celular ao Hexa-vacinal nos murganhos HHD transgénicos. EXEMPLO 9: Estudo de Optimizaçao de Dose

Este estudo foi concebido para selecionar a dose óptima do epitopo com base na anti-vacina da gripe Hexa-vacina, que é a menor dose eficaz que confere resposta imunitária suficiente como medido por vários testes imunológicos. Efectuando este estudo com Hexa-vacina foi avaliada a eficácia da vacina por avaliação da resposta humoral e titulação de virus nos pulmões após um esquema de 3 imunizações e infecção.

Concepção do Estudo

Os murganhos HHD/HLA A2.1 foram imunizados 3 vezes IN e IM com 240, 80, 24 ou 8 pg de Hexa-vacinal, consistindo em epitopos da gripe no flagelo bacteriano em PBS (ver Tabela 5 para grupos e identificação). 0 sangue foi recolhido para avaliação da resposta humoral induzida nos murganhos vacinados. Os murganhos foram infectados com virus da gripe H3N2 e titulação virai nos seus pulmões servidos como uma correlação para a eficácia.

Tabela 5: Grupos de estudo e Identificações 53

Grupo N° Tratamento Via A 8 pg IN B 2 4 pg IN C 8 0 pg IN D 2 40 pg IN E flagelo (Controlo) 2 40 pg IN F 8 pg IM G 2 4 pg IM H 8 0 pg IM I 2 40 pg IM J Flagella (Controlo) 2 40 pg IM

Resposta Humoral Imunitária

As doses em escala de Hexa-vacinal contendo 8-240 pg de todos os epitopos combinados induziram uma resposta humoral especifica para o vírus H3N2. A resposta nos grupos imunizados com a maior dose foi significativamente maior do que a linha de base. A alteração do título entre os soros pré-imunitários e soros imunizados é apresentada na Figura 6, que corresponde aos grupos na Tabela 5. Um aumento significativo para além do nível pré-imunitário (p<0,05) e para além dos grupos de controlo E e J que foram imunizados com flagelo nativo (IN ou IM respectivamente em termos de reconhecimento específico do vírus da gripe H3N2 é observado nos grupos Del que foram imunizados com 240 pg de Hexa-vacinal IN ou IM, respectivamente. 54

Resposta humoral: reconhecimento específico do flagelo A resposta humoral é também direccionada para o veículo flagelo. 0 título de anticorpo no soro é demonstrado na Figura 7. A Figura 7 mostra a resposta humoral ao flagelo após administração IN ou IM de Hexa-vacinal. Nos grupos imunizados IN (barras à esquerda); existiu uma resposta a dose em escala em que a maior produção de Ab foi verificada quando a maior dose (IN 240 pg) foi dada. Nos grupos com administração IM (as barras à direita) foi observada uma resposta elevada de modo semelhante em todas as doses que variam de 8 pg-240 pg/murganho. Por ambas as vias, a resposta ao flagelo nativo é muito maior; isto pode resultar em alterações estruturais provocadas pela adição de epitopos estranhos que podem influenciar a sua imunogenicidade.

Titulaçao de vírus

Após um esquema de 3 vacinações, os murganhos foram infectados com uma dose da estirpe de vírus da gripe H3N2 sub-letal (A/Texas/1/77) . Os pulmões dos murganhos foram removidos 5 dias mais tarde para a titulação de carga virai nestes. A titulação foi efectuada em ovos fertilizados (figura 8). A carga virai nos grupos imunizados com Hexa-vacinal (240 pg) é comparável em ambas as vias IM e IN e é significativamente inferior (p<0,05) à do título nos grupos de controlo. Isto mostra que a Hexa-vacinal é eficaz e proporciona protecção contra infecção virai. 55

Conclusões

Os_anticorpos_contra_o_vírus_(H3N2) : foram significativamente superiores no grupo imunizado com as maiores doses de IM e IN, mas não nos grupos imunizados com doses inferiores, apresentado um resposta à dose em escala.

Eliminação de vírus: um título de vírus inferior foi encontrado nos grupos imunizados IN e IM, enguanto títulos de vírus superiores foram detectados em animais imunizados com doses inferiores.

Estes dados indicam que existe uma correlação entre dose e resposta, em que apenas as maiores doses levam a protecção significativa. Não foram notados perda de peso significativa, anormalidades de comportamento ou sinais de alergia (aumento de IgE) como descrito a seguir; EXEMPLO 10: Resposta de IgE após Imunização

Para a avaliação de potencial resposta alérgica ao nosso produto, os níveis de IgE foram medidos em todas as principais experiências conduzidas em murganhos após imunização com diferentes combinações de epitopos ou com flagelo nativo. Nos vários estudos, os murganhos foram imunizados IN ou IM com o flagelo recombinante, o IgE total nos soros foi medido por um kit de detecção de IgE de murino comercial. 56

Baixos títulos de <20 ng/mL foram encontrados em animais imunizados semelhantes ao nível normal em murganhos não imunizados. A Figura 9 apresenta a concentração de IgE (ng/mL) na experiência de dosagem e na experiência para avaliar a resposta celular. Em ambas, os títulos de IgE no dia 0 e após a terceira imunização foram semelhantes.

Os murganhos foram imunizados IN ou IM com Hexa-vacinall em dosas crescentes, de 8 pg-240 pg/murganho. O soro destes murganhos foi testado para o IgE total. A Figura 10 representa a concentração de IgE no soro de murganhos HHD transgénicos (TG) imunizados IN com o flagelo recombinante que expressa epitopos da gripe.

Conclusões

Nas amostras de soro de murganhos imunizados com o flagelo recombinante, foram detectados níveis baixos de IgE. O intervalo normal para o IgE no plasma é estabelecido entre 19 e 200 ng/mL utilizando animais do tipo selvagem). Os títulos obtidos em animais imunizados não excederam 20 ng/mL e deste modo, a Hexa-vacina não induz respostas alérgicas. 57 EXEMPLO 11: Avaliação de Hexa-vacina2 em Coelhos

Neste estudo os coelhos foram administrados IN e IM com o produto de vacina num ambiente controlado numa gaiola de animais certificada como Especificamente Isenta de Patogénicos (SPF). Após um esquema de 3 vacinações, as amostras de sangue foram removidas e as amostras do sítio de administração e os órgãos principais foram removidos e submetidos a análise histopatológica.

Os grupos de estudo consistiram em 3 imunizações em comparação com Hexa-vacina2 (6 epitopos: HA91-108, HA307-319, HÁ 354-372, NP 335-350, NP 380-393, Ml 2-12) com PBS: via IN: Hexa-vacina2 100 pg e 50 pg/50 RL/coelho.

Via IM: Hexa-vacina2 600 pg e 300 pg/500 pL/coelho

Nem mortalidade nem morbidez foram observadas em qualquer dos grupos. Resultados da histopatologia (2 semanas pós-imunização) apresentaram:

Intranasal: Sem toxicidade nos órgãos examinados.

Intramuscular: Sem toxicidade nos órgãos examinados. Um animal apresentou um infiltrado histolítico focal, mínimo no sítio da injecção.

Conclusões

Segurança: Verificou-se que a Hexa-vacina2 era segura e tolerável em coelhos. Resposta humoral: o título Ab específico 58 contra diferentes estirpes de gripe foi registado em alguns dos coelhos. Deve ser notado que distintas respostas foram verificadas entre os coelhos individualmente. A Figura 10 descreve o aumento em vezes no titulo de anticorpo em comparação com o titulo pré-imunitário nos coelhos que responderam. Os coelhos que não responderam foram excluídos.

Figura 11: vezes do titulo de IgG contra 3 diferentes estirpes de gripe no soro de coelhos NZW imunizados IN 3 vezes com flagelo recombinante que expressa 6 epitopos da gripe. EXEMPLO 12: Farmacocinética

Os estudos farmacocinéticos revelaram que o pico de vacina no soro foi obtido aos 15 minutos e eliminado em 12 horas. Num estudo paralelo com a vacina formulada com adjuvante (Alúm), o pico da concentração no soro foi atingido após 30 minutos e a vacina foi eliminada do soro após 24 horas (dados não apresentados) . Além disso, os valores de Cmax, Tmax e AUC foram calculados como descrito a seguir.

Concepção do estudo O estudo consistiu em 10 grupos de 3 machos e 3 fêmeas por grupo que foram administrados com uma dose única de 50 pg de flagelo recombinante/animal. Os animais foram sangrados em 10 pontos de tempo pré-determinados aos 5, 10, 30 minutos e 1, 2, 4, 8, 12, 24 horas. 59

Análise Farmacocinética

Os cálculos das características farmacocinéticas foram baseados no tempo de amostragem de sangue actual [h] (relativamente ao correspondente tempo de administração do Tratamento) arredondado a dois dígitos decimais e tempos de pré-dose negativos marcados para zero. A amostra antes da administração foi utilizada para cálculo das características.

Para o cálculo dos parâmetros farmacocinéticos, foram aplicadas as seguintes regras:

Os valores de concentração de flagelina no soro em pontos de tempo no intervalo entre o tempo zero e a primeira concentração quantificável foram considerados como zero. A avaliação da biodisponibilidade relativa foi efectuada para os parâmetros do alvo primário AUC e Cmax.

Os valores do log transformado dos parâmetros do alvo primário foram submetidos a um modelo de análise de variância (ANOVA) com os efeitos: sequência, indivíduos sem sequência, período e tratamento. 0 efeito da sequência foi testado utilizando o quadrado da média de indivíduos dentro da sequência da ANOVA como um termo de erro. Todos os outros efeitos foram testados contra o erro residual (quadrado da média do erro) da ANOVA. Com base na ANOVA foram i calculados os intervalos de confiança de 90% para o tratamento individual de teste*100/referência [%].

As proporções do tratamento individual de teste*100/referência [%] foram dadas para os parâmetros alvo 60 primários. Para as tabelas de frequência de Tmax foram preparadas por tratamento à base de tempo nominal dos valores de Tmax. A Figura 12 apresenta a concentração de proteína no soro. A concentração máxima no soro 3,925 ng/mL (Cmax) de Hexa-vacina foi observada após 15 minutos (Tmax) . Metade (T1/2) da quantidade de exposição total foi obtida em 30 minutos pós-dosagem. A área sob a curva de concentração no soro-tempo 15,027 ng/mL indica a exposição total do corpo ao longo do tempo à Hexa-vacina. Não puderam ser detectados vestígios de proteína após 12 h.

Conclusões

Uma curva de concentração típica foi obtida no final do estudo farmacocinético com aumento do declive da curva entre 5 a 15 minutos e declive moderado até 12 horas. O nível máximo de concentração (Cmax = 3,925 ng/mL) foi observado após 15 minutos. Não puderam ser detectados vestígios de proteína no soro após 12 horas pós-dosagem. A vacina com base em flagelina será totalmente eliminada do soro em 12 horas.

Segurança do Epitopo

Os epitopos conservados seleccionados utilizados na Hexa-vacina compreendem epitopos que são restritos às moléculas HLA mais prevalentes em humanos. Os epitopos seleccionados estão restritos à estrutura virai e não são partilhados por qualquer proteína humana, deste modo é pouco provável que induzam uma reacção autoimunitária. 61

REFERENCIAS

Ada GL e Jones PD, "The immune response to influenza infection", Curr. Topics Microbio. Immunol.1986; 128:1.

Arnon R, Tarrab-Hazdai R, Ben-Yedidia T. Peptide-based synthetic recombinant vacinnes with anti-viral efficacy. Biologicals. 2001; 29(3-4):237-42.

Ben-Yedidia T, Marcus H, Reisner Y, Arnon R. Intranasal administration of peptide vacinne protects human/mouse radiation chimera from influenza infection. Int Immunol. 1999; 11(7):1043-51.

Gianfrani C, Oseroff C, Sidney J, Chesnut R, Sette A. Human memory CTL response specific for influenza A virus is broad and multispecific. Hum Immunol. 2000; 61:438-452.

Ibrahim GF, Fleet GH, Lyons MJ, Walker RA. Method for the isolation of highly purified Salmonella flagellins. J Clin Microbiol. 1985; (6):1040-4.

Jeon SH, Ben-Yedidia T, Arnon R. Intranasal imunization with synthetic recombinant vaccine containing multiple epitopes of influenza virus. Vaccine. 2002; 20(21-22):2772-80.

Lamb R A, Zebedee S L, Richardson C D. Influenza virus M2 protein is an integral membrane protein expressed on the infected-cell surface. Cell. 1985; 40:627-633. 62

Langer R. New methods of drug delivery. Science. 1990; 249 (4976) :1527-33 .

Liu W, Zou P, Ding J, Lu Y, Chen YH. Sequence comparison between the extracellular domain of M2 protein human and avian influenza A vírus provides new Information for bivalent influenza vaccine design. Microbes Infect. 2005; 7(2):171-7.

Meinkoth J, Wahl G. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports. Anal Biochem. 1984;138(2):267-84. 0'Hagan DT, Jeffery H, Davis SS. Long-term antibody responses in mice following subcutaneous imunization with ovalbumin entrapped in biodegradable microparticles. Vaccine. 1993; 11(9):965-9.

Shapira M, Jolivet M, Arnon R. A synthetic vaccine against influenza with built-in adjuvanticity. Int J Immunopharmacol. 1985; 7:719-723 .

Slepushkin VA, Katz JM, Black RA, Gamble WC, Rota PA, Cox NJ. Protection of mice against influenza A virus challenge by vaccination with baculovirus-expressed M2 protein. Vaccine. 1995; 13(15):1399-402.

Townsend AR, Skehel JJ. The influenza A virus nucleoprotein gene Controls the induction of both subtype specific and cross-reactive cytotoxic T cells. J Exp Med. 1984; 160(2):552-63.

Zou P, Liu W, Chen YH: The epitope recognized by a monoclonal antibody in influenza A virus M2 protein is 63 immunogenic and confers immune protection. Int Immunopharmacol. 2005; 5(4):631-5.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS at the Weizmann ARNON, Ruth <110> YedaResearch and Develoment Co. Ltd.

Institute of Science BEN-YEDIDIA, Tamar

<120> VACINA DA GRIPE MELHORADA

<130> BNDVX/001 PCT

<140> PCT/IL2006/ <141> 2006-12-06 <150> 60/742574 <151> 2005-12-06 <150> 60/742530 <151> 2005-12-06 <16 0> 162 <17 0> Patentln versão <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> GRIPE 3 64 <4 Ο 0> 1

Glu vai Glu Thr 1

<210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> GRIPE <400> 2

Met ser Leu Leu Thr Glu vai Glu Thr His Thr Arg Asn Gly Trp 15 10 15

<210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 3

Pro lie Arg Asn Glu Trp Gly cys Arg 1 5

<210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> GRIPE <400> 4

Glu Thr Pro lie Arg Asn Glu Trp Gly Cys 15 10 65 <210> 5

<211> 11 <212> PRT <213> GRIPE <4Ο0> 5 pró lie Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn 15 10

<210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 6

Leu Leu Thr Glu vai Glu Thr Pro lie 1 5

<210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 7

Ser Leu Leu Thr Glu vai Glu Thr Pro 1 5 66

<210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> GRIPE <400> 8

Ser Leu Leu Thr Glu vai Glu Thr Pro lie 15 10

<210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 9

Leu Thr Glu Vai Glu Thr Pro Leu Thr 1 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> GRIPE <400> 10

Met Ser Leu Leu Thr Glu Vai Glu Thr Pro ile Arg Asn Glu Trp 15 10 15

<210> 11 <211> 18 <212> PRT 67 <213> GRIPE <400> 11

Met Ser Leu Leu Thr Glu Vai Glu Thr Pro Ile Arg Asri Glu Trp Gly 15 10 15

Cys Arg <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> GRIPE <40 0> 12

Met Ser Leu Leu Thr Glu Vai Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gly Trp 15 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> GRIPE <400> 13

Met Ser Leu Leu Thr Glu vai Glu Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp 15 10 15 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE 68 <400> 14

Leu Thr Glu Vai Glu Thr Pro Ile Arg 1 5 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> GRIPE <400> 15

Leu Thr Glu Vai Glu Thr Pro ile Arg Asn 15 10 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 16

Glu val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu <210> 17 <211> 10

<212> PRT <213> GRIPE 69 <4 Ο 0> 17

Glu Vai Glu Thr Pro ile Arg Asn Glu Trp 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> GRIPE <400> 18 1 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> GRIPE <400> 19

Leu Thr Glu Vai Glu Thr Pro lie Arg Asn Glu

Arg 15

Leu Thr Glu Vai Glu Thr Pro lie Arg Asn Glu Trp Gly Cys 15 10 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> GRIPE <40 0> 20 Glu val Glu Thr Pro Ile Arg Asn 1 5 70 <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> GRIPE <400> 21

Met Ser Leu Leu Thr Glu vai Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu 1 5 10

Cys Arg <210> 22 <211> 23 <212> PRT <213> GRIPE <40 0> 22

Ser Leu Leu Thr Glu vai Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Glu Cys 1 5 10 15

Arg Cys Ser Asp ser ser Asp

20 <210> 23 <211> 23 <212> PRT <213> GRIPE 71 <4Ο0> 23 ser Leu Leu Thr Glu vai Glu Thr Pro ile Arg Asn Glu Trp Gly cys 15 10 15

Arg cys Asn Asp ser Ser Asp 20 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 24 vai Glu Thr pro ile Arg Asn Glu Trp 1 5 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> GRIPE <400> 25 ser Leu Leu Thr Glu vai Glu Thr Tyr vai Leu 1 5 10

<210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> GRIPE 72 <4Ο0> 26

Ser Leu Leu Thr Glu vai Glu Thr Tyr vai Pro 1 5 10 <210> 27 <211> 9

<212> PRT <213> GRIPE <400> 27

Leu Leu Thr Glu vai Glu Thr Tyr Vai 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> GRIPE <40 0> 28

Ser lie Vai Pro Ser Gly Pro Leu 1 5 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> GRIPE <40 0> 29

Ser Gly pro Leu Lys Ala Glu lie Ala Gin Arg Leu Glu Asp Vai 15 10 15 73 <210> 30

<211> 12 <212> PRT <213> GRIPE <400> 30

Gly Pro Leu Lys Ala Glu ile Ala Gin Arg Leu Glu 1 5 10 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <40 0> 31

Arg Leu Glu Asp vai Phe Ala Gly Lys <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> GRIPE <400> 32

Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr Arg Pro ile 1 5 10 74

<210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> GRIPE <400> 33 Ργο ilé Leu ser Pro Leu Thr Lys Gly lie 15 10

<210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 34

He Leu ser Pro Leu Thr Lys Gly He

<210> 35 <211> 19 <212> PRT <213> GRIPE <400> 35

Leu Thr Lys Gly ile Leu Gly Phe vai Phe Thr Leu Thr vai pro Ser 1 5 10 15

Glu Arg Gly 75 <210> 36

<211> 13 <212> PRT <213> GRIPE <400> 36

Thr Lys Gly ile Leu Gly Phe vai Phe Thr Leu Thr vai 15 10

<210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> GRIPE <400> 37

Lys Gly lie Leu Gly Phe Vai Phe Thr Leu Thr vai 15 10

<210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 38

Gly xle Leu Gly Phe vai Phe Thr Leu 1 5 <210> 39 <211> 9 76

<212> PRT <213> GRIPE <400> 39

Leu Gly Phe vai Phe Thr Leu Thr vai 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 40

Ile Leu Gly Phe Vai Phe Thr Leu Thr 1 5 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> GRIPE <40 0> 41

Ala Ser Cys Met Gly Leu lie Tyr

<210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE 77 <400> 42

Arg Met Gly Ala vai Thr Thr Glu vai 1 5 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> GRIPE <40 0> 43

Gly Leu Vai Cys Ala Thr Cys Glu Gin lie Ala 1 5 10 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 44

Gin Met vai Ala Thr Thr Asn Pro Leu 1 5

<210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> GRIPE 78 <4Ο0> 45 1 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> GRIPE <40 0> 46

Gin Met vai Ala Thr Thr Asn pro Leu ile

Arg Met vai Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys 15 10 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 47

Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gin Thr Tyr 1 5

<210> 48 <211> 18 <212> PRT <213> GRIPE 79 <400> 48 ser Lys *1, Tyr ser Asn cys ryr Pr. ** val Pro Asp Ala

Ser Leu <210> 49 <211> 18 <212> PRT <213> gripe <40 0> 49 ser Lys Ala phe ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp vai Pro Asp Tyr Ala 1 5 lv

Ser Leu <210> 50 <211> 18 <212> PRT <213> GRIPE <400> 50

Ser Thr Ala Tyr Ser Asn cys Tyr Pro Tyr Asp vai Pro Asp Jyr Ala 15 10 15

Ser Leu

<210> 51 <211> 10 <212> PRT 80 <213> GRIPE <400> 51

Trp Leu Thr Glu Lys Glu Gly Ser Tyr Pro 1 5 10 <210> 52 <211> 19 <212> PRT <213> GRIPE <40 0> 52

Pro Lys Tyr Vai Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg 1 5 10 '15

Asn Val Pro <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> GRIPE <400> 53

Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly lie Tyr Gin 15 10

<210> 54 <211> 11 <212> PRT 81 <213> GRIPE <400> 54

Glu ile Ser Gly Val Lys Leu Glu ser Met Gly 15 10 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> GRIPE <400> 55

Asn val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Vai Lys 1 5 10 <210> 56 <211> 18 <212> PRT <213> GRIPE <400> 56

Lys Val Lys lie Leu Pro Lys Asp Arg Trp Thr Gin His Thr Thr Thr 15 10 15

Gly Gly

<210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> GRIPE 82 <400> 57 pró Lys Tyr vai Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 15 10 <210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> GRIPE <400> 58 pro Lys Tyr vai Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <40 0> 59

Cys Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr

<210> 60 <211> 14 <212> PRT <213> GRIPE 83 < 4 Ο Ο > 60

His ργο ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro 15 10 <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> GRIPE <40 0> 61

His pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly 1 $ 10 <210> 62 <211> 24 <212> PRT <213> GRIPE <40 0> 62

Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg ser Ala Tyr Glu Arg 15 10 15

Met Cys Asn lie Leu Lys Gly Lys 20

<210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE 84 <4 Ο Ο> 63 1 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 64 lie Leu Arg Gly Ser Vai Ala His Lys 1 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> GRIPE <40 0> 65

Lys Leu Leu Gin Asn Ser Gin Vai Tyr

Arg Gly 15

Ser Ala Ala Phe Glu Asp Leu Arg Vai Leu ser Phe Ile 15 10

<210> 6 6 <211> 16 <212> PRT <213> GRIPE 85 <4 Ο Ο> 66

Ser Ala Ala Phe slu Asp Leu Arg vai ser ser Phe Ile Arg Glv Thr 15 10 15 <210> 67 <211> 16 <212> PRT <213> GRIPE <400> 67

Ser Ala Ala Phe Glu Asp Leu Arg vai Leu ser Phe ile Arg Gly Tyr 15 10 15 <210> 68 <211> 14 <212> PRT <213> GRIPE <400> 68

Glu Leu Arg ser Arg Tyr Trp Ala lie Arg rhr Arg Ser Gly 1 5 10 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 69

Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala ile 1 5 86 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 70

Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> GRIPE <400> 71

Tyr Trp Ala ile Arg Thr Arg ser Gly Gly 1 5 10 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 72

Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg 87

<210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 73

Leu pro Phe Asp Lys ρρο Thr lie Met

<210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 74 val sei" Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr

<210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 75

Arg Arg ser phe Glu Leu Lys Lys Leu 1 5 <210> 76 <211> 9 88 <212> PRT < 213> GRIPE <4Ο0> 76

Arg Arg Ala Thr Ala lie Leu Arg Lys 1 5

<210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> GRIPE <400> 77

Arg Pro Ile Ile Arg Pro Ala Thr Leu 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> <213> GRIPE <400> 78

Ala Asp Arg Gly Leu Leu Arg Asp Ile

<210> 79 <211> 13 <212> PRT

<213> GRIPE 89 <400> 79

Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala L.ys Ala lie Gly Asn 1 5 10 <210> 80 <211> 19 <212> PRT <213> GRIPE <400> 80

Pro Ala tys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala lie Ala Gly 1 5 10 15

Phe Leu Glu <210> 81 <211> 12 <212> ADN <213> GRIPE <400> 81 gaagtggaaa cc 12 <210> 82 <211> 45 <212> ADN <213> GRIPE <400> 82 atgagcctgc tgaccgaagt ggaaacccac accaggaatg ggtgg 45 90 <210> 83 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 83 ccgattcgta acgaatgggg ttgtcgt 27 <210> 84 <211> 33 <212> ADN <213> GRIPE <400> 84 gaaaccccga ttcgtaacga atggggttgt cgt 33 <210> 85 <211> 42 <212> ADN <213> GRIPE <400> 85 gaaaccccga ttcgtaacga atggggttgt cgtggttgtc gt 42 91 <210> 86 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 86 ctgctgaccg aagtggaaac cccgatt 27 <210> 87 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 87 agcctgctga ccgaagtgga aaccccg 27 <210> 88 <211> 30 <212> ADN <213> GRIPE <400> 88 agcctgctga ccgaagtgga aaccccgatt 30

<210> 89 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE 92 <4Ο0> 89 ctgaccgaag tggaaacccc gctgacc

<210> 90 <211> 44 <212> ADN <213> GRIPE <400> 90 tgagcctgct gaccgaagtg gaaaccccga ttcgcaacga atgg 44

<210> 91 <211> 54 <212> ADN <213> GRIPE <400> 91 atgagcctgc tgaccgaagt ggaaaccccg attcgcaacg aatggggctg ccgc 54

<210> 92 <211> 45 <212> ADN <213> GRIPE <400> 92 atgagcctgc tgaccgaagt ggaaaccctg accaaaaacg gctgg 45 93 <210> 93 <211> 45 <212> ADN <213> GRIPE <400> 93 atgagcctgc tgaccgaagt ggaaaccctg acccgcaacg gctgg 45 <210> 94 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <40 0> 94 ctgaccgaag tggaaacccc gattcgc 27 <210> 95 <211> 30 <212> ADN <213> GRIPE <40 0> 95 ctgaccgaag tggaaacccc gattcgcaac 30

<210> 96 <211> 27 <212> ADN 94 <213> GRIPE <4 Ο Ο> 9 6 gaagtggaaa ccccgattcg caacgaa 27 <210> 97 <211> 30 <212> ADN <213> GRIPE <400> 97 gaagtggaaa ccccgattcg caacgaat 30 <210> 98 <211> 33 <212> ADN <213> GRIPE <400> 98 ctgaccgaag tggaaacccc gattcgcaac gaa 33 <210> 99 <211> 45 <212> ADN <213> GRIPE <400> 99 ctgaccgaag tggaaacccc gattcgcaac gaatggggct gccgc 45 95 <210> 100 <211> 24 <212> ADN <213> GRIPE <400> 100 gaagtggaaa ccccgattcg taac 24

<210> 101 <211> 54 <212> ADN <213> GRIPE <400> 101 atgagcctgc tgaccgaagt ggaaaccccg acccgcaacg aatgggaatg ccgc 54 <210> 102 <211> 69 <212> ADN <213> GRIPE <400> 102 agcctgetga ccgaagtgga aaccccgacc cgcaacgaat gggaatgccg ctgcagcgat 60 agcagcgat 60 96 <210> 103 <211> 69 <212> ADN <213> GRIPE <400> 103 agcctgctga ccgaagtgga aaccccgatt cgcaaegaat ggggctgccg ctgcaacgat 60 agcagcgat 69 <210> 104 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 104 gtggaaaccc cgattcgtaa cgaatgg 27 <210> 105 <211> 33 <212> ADN <213> GRIPE <400> 105 agcctgctga ccgaagtgga aacctatgtg ctt 33

<210> 106 <211> 33 <212> ADN 97 <213> GRIPE <400> 106 agcctgctga ccgaagtgga aacctatgtg ccg 33 <210> 107 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 107 ctgctgaccg aagtggaaac ctatgtg 27 <210> 108 <211> 24 <212> ADN <213> GRIPE <400> 108 agcattgtgc cgagcggccc gctg 24 <210> 109 <211> 45 <212> ADN <213> GRIPE <400> 109 agcggcccgc tgaaagcgga aattgcgcag cgcctggaag atgtg 45 98 <210> 110 <211> 36 <212> ADN <213> GRIPE <400> 110 ggcccgctga aagcggaaat tgcgcagcgc ctggaa 36 <210> 111 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 111 cgcctggaag atgtgtttgc gggcaaa 27 <210> 112 <211> 30 <212> ADN <213> GRIPE <400> 112 gcgctgatgg aatggctgaa aacccgcccg 30 <210> 113 <211> 30 99

<212> ADN <213> GRIPE <4 Ο 0> 113 ccgattctga gcccgctgac caaaggcatt 30 <210> 114 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 114 attctgagcc cgctgaccaa aggcatt 27 <210> 115 <211> 57 <212> ADN <213> GRIPE <400> 115 ctgaccaaag gcattctggg ctttgtgttt accctgaccg tgccgagcga acgcggc 57

<210> 116 <211> 39 <212> ADN <213> GRIPE 100 <4 Ο 0> 116 accaaaggca ttctgggctt tgtgtttacc ctgaccgtg 39 <210> 117 <211> 36 <212> ADN <213> GRIPE <400> 117 aaaggcattc tgggctttgt gtttaccctg accgtg 36 <210> 118 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 118 ggcattctgg gctttgtgtt taccctg 27 <210> 119 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 119 ctgggctttg tgtttaccct gaccgtg 27 101 <210> 120 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 120 attctgggct ttgtgtttac cctgacc 27 <210> 121 <211> 24 <212> ADN <213> GRIPE <400> 121 gcgagctgca tgggcctgat ttat 24 <210> 122 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 122 cgcatgggcg cggtgaccac cgaagtg 27

<210> 123 <211> 33 <212> ADN <213> GRIPE 102 <400> 123 ggcctggtgt gcgcgacctg cgaacagatt gcg 33 <210> 124 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 124 cagatggtgg cgaccaccaa cccgctg 27 <210> 125 <211> 30 <212> ADN <213> GRIPE <400> 125 cagatggtgg cgaccaccaa cccgctgatt 30 <210> 126 <211> 30 <212> ADN <213> GRIPE <400> 126 cgcatggtgc tggcgagcac caccgcgaaa 30 103 <210> 127 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 127 gatctgctgg aaaacctgca gacctat 27 <210> 128 <211> 54 <212> ADN <213> GRIPE <400> 128 agcaaagctt acagcaactg ttacccttat gatgtgccgg attatgcctc cctt 54 <210> 129 <211> 54 <212> ADN <213> GRIPE <400> 129 agcaaagcgt ttagcaactg ctatccgtat gatgtgccgg attatgcgag cctg 54

<210> 130 <211> 54 <212> ADN 104 <213> GRIPE <400> 130 agcaccgcgt atagcaactg ctatccgtat gatgtgccgg attatgcgag cctg 54 <210> 131 <211> 30 <212> ADN <213> GRIPE <400> 131 tggctgacgg agaaggaggg ctcataccca 30 <210> 132 <211> 75 <212> ADN <213> GRIPE <400> 132 cccaagtatg ttaagcaaaa cactctgaag ttggcaacag ggatgcggaa tgtaccagag 60 aaacaaacta gaggc 75

<210> 133 <211> 33 <212> ADN <213> GRIPE 105 <4 Ο 0> 133 ggcgtgaaac tggaaagcat gggcatttat cag 33 <210> 134 <211> 33 <212> ADN <213> GRIPE <400> 134 gaaatttccg gcgtgaaact ggaaagcatg ggc 33 <210> 135 <211> 30 <212> ADN <213> GRIPE <400> 135 aacgtgaaaa acctgtatga aaaagtgaaa 30 <210> 136 <211> 54 <212> ADN <213> GRIPE <400> 136 aaagtgaaaa ttctgccgaa agatcgctgg acccagcata ccaccaccgg cggc 54 106 <210> 137 <211> 39 <212> ADN <213> GRIPE <400> 137 ccgaaatatg tgaaacagaa caccctgaaa ctggcgacc 39 <210> 138 <211> 39 <212> ADN <213> GRIPE <400> 138 ccgaaatatg tgaaacagaa caccctgaaa ctggcgacc 39 <210> 139 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 139 tgcaccgaac tgaaactgag cgattat 27

<210> 140 <211> 42 <212> ADN <213> GRIPE 107 <4 Ο 0> 140 catccgagcg cgggcaaaga tccgaaaaaa accggcggcc cg 42 <210> 141 <211> 39 <212> ADN <213> GRIPE <400> 141 catccgagcg cgggcaaaga tccgaaaaaa accggcggc 39 <210> 142 <211> 72 <212> ADN <213> GRIPE <400> 142 ttttggcgcg gcgaaaacgg ccgcaaaacc cgcagcgcgt atgaacgcat gtgcaacatt 60 ctgaaaggca aa 72 <210> 143 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 143 attctgcgcg gcagcgtggc gcataaa 27 108 <210> 144 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 144 aaactgctgc agaacagcca ggtgtat 27 <210> 145 <211> 45 <212> ADN <213> GRIPE <400> 145 agcgcggcgt ttgaagatct gcgcgtgctg agctttattc gcggc 45 <210> 146 <211> 48 <212> ADN <213> GRIPE <40 0> 146 agcgcggcgt ttgaagatct gcgcgtgagc agctttattc gcggcacc 48 109 <210> 147 <211> 48 <212> ADN <213> GRIPE <400> 147 agcgcggcgt ttgaagatct gcgcgtgctg agctttattc gcggctat 48 <210> 148 <211> 42 <212> ADN <213> GRIPE <400> 148 gaactgcgca gccgctattg ggcgattcgc acccgcagcg gc 42 <210> 149 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 149 gaactgcgca gccgctattg ggcgatt 27

<210> 150 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE 110 <400> 150 agccgctatt gggcgattcg cacccgc 27 <210> 151 <211> 30 <212> ADN <213> GRIPE <400> 151 tattgggcga ttcgcacccg cagcggcggc 30 <210> 152 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 152 agccgctatt gggcgattcg cacccgc 27 <210> 153 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 153 ctgccgtttg ataaaccgac cattatg 27 111 <210> 154 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 154

Gtgagcgatg gcggcccgaa cctgtat 27 <210> 155 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 155 cgccgcagct ttgaactgaa aaaactg 27 <210> 156 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 156 cgccgcgcga ccgcgattct gcgcaaa 27

<210> 157 <211> 27 <212> ADN 112 <213> GRIPE <400> 157 cgcccgatta ttcgcccggc gaccctg 27 <210> 158 <211> 27 <212> ADN <213> GRIPE <400> 158 gcagatagag ggctattgag agacatc 27 <210> 159 <211> 39 <212> ADN <213> GRIPE <400> 159 ccgtattata ccggcgaaca tgcgaaagcg attggcaac 39 <210> 160 <211> 57 <212> ADN <213> GRIPE <400> 160 ccggcgaaac tgctgaaaga acgcggcttt tttggcgcga ttgcgggctt tctggaa 57 113

<210> 161 <211> 509 <212> PRT <213> salmonella muenchen < 4 0 0 > 161

Lys Glu Lys ile Met Ala Gin vai ile Asn Thr Asn ser Leu Ser Leu 1 5 10 15

Leu Thr Gin Asn Asn Leu Asn Lys ser Gin ser Ala Leu Gly Thr Ala 20 25 30 IIe Glu Arg Leu ser ser Gly Leu Arg lie Asn ser Ala Lys Asp Asp B5 40 45

Ala Ala Gly Gin Ala lie Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn He Lys Gly 50 55 60

Leu Thr Gin Ala Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly ile Serlle Ala Gin 65 70 75 80

Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu lie Asn Asn Asn Leu Gin Arg vai 85 90 95

Arg Glu Leu Ala vai Gin ser Ala Asn Gly Thr Asn ser Gin Ser Asp 100 105 HO

Leu Asp ser lie Gin Ala Glu He Thr Gin Arg Leu Asn Glu lie Asp 115 120 125

Arg vai Ser Gly Gin Thr Gin Phe Asn Gly vai Lys vai Leu Ala Gin 130 135 I40

Asp Asn Thr Leu Thr Ile Gin Vai Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr ile 145 150 155 160

114

Leu Asn val Gin Asp Ala Tyr Thr Pro Lys Glu Thr Ala val Thr Val 180 185 190 Asp Lys Thr Thr Tyr Lys Asn Gly Thr Asp Thr ile Thr Ala Gin ser 195 200 205 Asn Thr Asp ile Gin Thr Ala Ile Gly Gly Gly Ala Thr Gly val Thr 210 215 220 Gly 225 Ala Asp ile Lys Phe 230 Lys Asp Gly Gin 35 Tyr Leu Asp val Lys 240 Gly Gly Ala Ser Ala Gly val Tyr Lys Ala Thr Tyr Asp Glu Thr Thr 245 250 255 Lys Lys val Asn lie Asp Thr Thr ASp Lys Thr Pro Leu Ala Thr Ala 260 265 270 Glu Ala Thr Ala ile Arg Gly Thr Ala Thr ile Thr His Asn Gin ile 275 280 285 Ala Glu Val Thr Lys Glu Gly val Asp Thr Thr Thr Val Ala Ala Gin 290 295 300 Leu Ala Ala Ala Gly Val Thr Gly Ala Asp Lys Asp Asn Thr Ser Leu 305 310 315 320 Vai Lys Leu ser Phe Glu Asp Lys Asn Gly Lys val Ile Asp Gly Gly 325 330 335 Tyr Ala val Lys Met Gly Asp ASp Phe Tyr Ala Ala Thr Tyr ASp Glu 340 345 350 Lys Gin val Gin Leu Leu Leu Asn Asn His Tyr Thr Asp Gly Ala Gly 355 360 365 vai Leu Gin Thr Gly Ala Val Lys Phe Gly Gly Ala Asn Gly Lys Ser 370 375 380 Glu Val val Thr Ala Thr val Gly Lys Thr Tyr Leu Ala Ser Asp Leu 385 390 395 400 ASp Lys His Asn Phe Arg Thr Gly Gly Glu Leu Lys Glu val Asn Thr 405 410 415 ASP Lys Thr Glu Asn Pro Leu Gin Lys lie Asp Ala Ala Leu Ala Gin 420 425 430 115 val Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gin Asn Arg Phe Asn 435 440 445 Ser Ala lie Thr Asn Leu Gly Asn Thr val Asn Asn Leu Ser Ser Ala 450 455 460 Arg Ser Arg ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met 465 470 475 480 ser Arg Ala Gin Ile Leu Gin Gin Ala Gly Thr ser val Leu Ala Gin 485 490 495 Ala Asn Gin Val Pro Gin Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg 500 505

<210> 162 <211> 1530 <212> ADN <213> salmonella muenchen <40 0> 162 aaggaaaaga tcatggcaca agtcattaat acaaacagcc tgtcgctgtt gacccagaat aacctgaaca aatcccagtc cgctctgggc accgctatcg agcgtctgtc ttccggtctg cgtatcaaca gcgcgaaaga cgatgcggcá ggtcaggcga ttgctaaccg tttcaccgcg aacatcaaag gtctgactca ggcttcccgt aacgctaacg acggtatctc cattgcgcag accactgaag gcgcgctgaa cgaaatcaac aacaacctgc agcgtgtgcg tgaactggcg gttcagtctg ctaacggtac taactcccag tctgaccttg actctatcca ggctgaaatc acccagcgtc tgaacgaaat cgaccgtgta tccggtcaga ctcagttcaa cggcgtgaaa gtcctggcgc aggacaacac cctgaccatc caggttggtg ccaacgacgg tgaaactatt gatattgatt taaaagaaat tagctctaaa acactgggac ttgataagct taatgtccag gatgcctaca ccccgaaaga aactgctgta accgttgata aaactaccta taaaaatggt acagatacta ttacagccca gagcaatact gatatccaaa ctgcaattgg cggtggtgca acgggggtta ctggggctga tatcaaattt aaagatggtc aatactattt agatgttaaa ggcggtgctt ctgctggtgt ttataaagcc acttatgatg aaactacaaa gaaagttaat 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 116 attgatacga ctgataaaac tccgttagca actgcggaag ctacagctat tcggggaacg 840 gccactataa cccacaacca aattgctgaa gtaacaaaag agggtgttga tacgacçaca 900 gttgcggctc. aacttgctgc tgcaggggtt actggtgccg ataaggacaa tactagcctt 960 gtaaaactat cgtttgagga taaaaacggt aaggttattg atggtggcta tgcagtgaaa 1020 atgggcgacg atttctatgc cgctacatat gatgagaaac aggtacaatt actgctaaac 1080 aaccactata cagatggtgc tggcgtgctc caaactggag ctgtgaaatt tggtggcgca 1140 aatggtaaat ctgaagttgt tactgctacc gtaggtaaaa cttacttagc aagcgacctt 1200 gacaaacata acttcagaac aggcggtgag cttaaagagg ttaatacaga taagactgaa 1260 aacccactgc agaaaattga tgctgccttg gcacaggttg atacacttcg ttctgacctg 1320 ggtgcggtac agaaccgttt caactccgct atcaccaacc tgggcaatac cgtaaataac 1380 ctgtcttctg cccgtagccg tatcgaagat tccgactacg cgaccgaagt ctccaacatg 1440 tctcgcgcgc agattctgca gcaggccggt acctccgttc tggcgcaggc taaccaggtt 1500 ccgcaaaacg tcctctcttt actgcgttaa 1530

Lisboa, 9 de Julho de 2012 117

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Vacina compreendendo os epitopos de péptidos do vírus da gripe: Ml 2-12 (SEQ ID N° : 25 ou 26) ; HA 91- -108 (SEQ ID N° : 48) ; HA 3 0 7-319 (SEQ ID N°:57); NP 335- -350 (SEQ ID N° : 6 7) ; NP 380-393 (SEQ ID d) oo o HA 354- -372 (SEQ ID N°:80) .
2. 2. Vacina de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda um adjuvante ou um excipiente.
3. 3. Vacina de acordo com a reivindicação 1, formulada para administração através de uma modalidade seleccionada do grupo consistindo em distribuição intraperitoneal, subcutânea, intranasal, intramuscular, oral, tópica e transdérmica.
4. 4. Vacina de acordo com qualquer das reivindicações anteriores para utilização num método para induzir uma resposta imunitária e conferir protecção contra o vírus da gripe num indivíduo.
5. 5. Vacina de acordo com reivindicação 4, em que a resposta imunitária é induzida contra a gripe aviária, gripe tipo A, gripe tipo B ou uma sua combinação.
6. 6. Utilização de uma vacina de acordo com qualquer das reivindicações 1-5 para a preparação de um agente 1 farmacêutico para induzir uma resposta conferir protecção contra o vírus da gripe num Lisboa, 9 de Julho de 2012 imunitária indivíduo.