PT1948235E - Métodos de determinação da eficácia de adalimumab em sujeitos com espondilite anquilosante, utilizando ctx-ii e mmp3 como biomarcadores - Google Patents

Description

ΕΡ 1 948 235/ΡΤ DESCRIÇÃO "Métodos de determinação da eficácia de adalimumab em sujeitos com espondilite anquilosante, utilizando CTX-II e MMP3 como biomarcadores"

ANTECEDENTES DO INVENTO

Os níveis elevados de TNF desempenham um papel importante na inflamação patológica. 0 TNF, também designado por (TNFcx), foi implicado na patofisiologia de uma variedade de doenças e distúrbios humanos, incluindo a sépsis, as infecções, as doenças auto-imunes, a rejeição de transplantes e a doença do enxerto contra o hospedeiro (ver, por exemplo, Moeller et al. (1990) Cytokine 2:162; Patente U.S. n.° 5,231,024 concedida a Moeller et al.; Publicação de patente europeia n.° 260 610 BI por Moeller, A. et al.; Vasilli (1992) Annu. Rev. Immunol. 10:411; Tracey & Cerami (1994)

Annu. Rev. Med. 45:491). A espondilite anquilosante (EA), que foi associada a niveis elevados de TNF (Lange et al. (2000) Eur J Med Res. 5(12):507), é uma doença reumática inflamatória comum que produz rigidez vertebral progressiva e uma restrição da mobilidade. A EA é uma forma de inflamação crónica das articulações da coluna vertebral e sacroiliacas, que pode causar dor e rigidez na coluna vertebral e à volta dela. Com o tempo, a inflamação vertebral crónica (espondilite) pode conduzir a uma cimentação completa (fusão) das vértebras, um processo designado por anquilose, que pode conduzir, pelo seu lado, a uma perda da mobilidade da coluna vertebral.

A EA é muitas vezes diagnosticada utilizando uma combinação de métodos, incluindo a análise dos sintomas, um exame fisico e uma análise por raios X. Os sintomas de um doente com EA poderão incluir dor e rigidez matinal nas áreas da coluna vertebral e do sacro, com ou sem inflamação concomitante em outras articulações, tendões e órgãos. Os sintomas precoces da EA podem, contudo, ser muito enganadores, pois a rigidez e a dor na região lombar podem ser encontradas em muitas outras condições e, em resultado disso, pode decorrer algum tempo até que o diagnóstico de EA 2 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ seja sequer considerado. Além disso, o exame fisico do doente poderá revelar sinais de inflamação e uma amplitude reduzida do movimento das articulações, muitas vezes particularmente evidente na coluna vertebral. A flexibilidade da região lombar e/ou do pescoço poderá estar reduzida. Pistas adicionais para o diagnóstico poderão ser sugeridas por anomalias da coluna vertebral observadas por raios X ou pela presença do marcador genético na análise de sangue, o gene HLA-B27. A EA tem associados danos estruturais, que resultam da degradação e ressorção da cartilagem e do osso da articulação, tendo como consequência a destruição da articulação. Terapeuticamente, é importante considerar tanto os sintomas do doente com EA, como os danos estruturais causados pela destruição das articulações associados à doença. 0 tratamento tradicional da EA tem incluído a administração de anti-inflamatórios não esteróides (ΑΙΝΕ) ao doente para diminuir a dor e a rigidez da coluna vertebral e de outras articulações. Os ΑΙΝΕ utilizados habitualmente incluem a indometacina (Indocin), a tolmetina (Tolectin), o sulindac (Clinoril), o naproxeno (Naprosyn) e o diclofenac (Voltaren). Mais recentemente, foi demonstrado que os agentes biológicos anti-TNF, como o etanercept, o infliximab e o adalimumab, são eficazes na redução dos sintomas associados à EA.

Por exemplo: WALTER P. ET AL.: "Infliximab in ankylosing spondylitis: A prospective Observational inception cohort analysis of efficacy and safety" J RHEUMATOL, vol. 29, 2002, pp. 959-965, XP008097020 descreve um método para determinar a eficácia do infliximab na espondilite anquilosante. MAKSYMOWYCH WALTER P ET AL: "Etanercept exerts beneficiai effects on articular cartilage biomarkers of degradation and turnover in patients with ankylosing spondylitis" JOURNAL OF RHEUMATOLOGY, TORONTO, CA, vol. 32, no. 10, 1 October 2005 (2005-10-01), pp. 1911-1917, 3 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ ΧΡ008097021 ISSN: 0315-162Χ estuda a utilização do etanercept para combater a espondilite anquilosante e explora a sua potencial eficácia. BERNARD VANDOOREN ET AL: "Involvement of Matrix Metalloproteinases and Their Inhibitors in Peripheral Synovitis and Down-Regulation by Tumor Necrosis Factor alpha Blockade in Spondylarhtropathy", ARTHRITIS & RHEUMATISM, vol. 50, no. 9, September 2004 (2004-09), pp. 2942-2953, revela que o infliximab, se administrado a sujeitos com uma espondilartropatia, induz uma regulação negativa das metaloproteinases da matriz.

SUMÁRIO DO INVENTO Não obstante as melhorias no tratamento da EA utilizando agentes biológicos anti-TNF, há a necessidade de testes diagnósticos e prognósticos para ajudar os médicos a diagnosticar os sintomas do doente e a recomendar regimes de tratamento apropriados. Adicionalmente, para melhor avaliar as melhorias no estado da doença do paciente, são necessários testes diagnósticos e prognósticos que proporcionem melhores cuidados médicos para o doente, assim como um custo reduzido do tratamento.

De acordo com uma primeira concretização, o presente invento proporciona assim um método de determinação da eficácia do adalimumab para o tratamento da espondilite anquilosante (EA) num sujeito com EA, em que o referido método compreende a determinação de um nivel de C-telopéptido do colagénio tipo II (CTX-II) pós-tratamento e um nivel de metaloprotease da matriz 3 (MMP3) pós-tratamento em amostra (s) obtida (s) de um sujeito com EA, onde um nivel de CTX-II pós-tratamento inferior na(s) amostra(s) em relação a um nivel de CTX-II padrão conhecido baseado em sujeito(s) com EA e um nivel de MMP3 pós-tratamento inferior na(s) amostra(s) em relação a um nivel de MMP3 padrão conhecido baseado em sujeito(s) com EA indica que o adalimumab é eficaz para o tratamento da EA no sujeito. Na referida primeira concretização do invento, é preferido que o nivel de CTX-II pós-tratamento na(s) amostra(s) obtida(s) do sujeito seja uma 4 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ redução de pelo menos cerca de 9% em relaçao ao nível de CTX-II padrão conhecido baseado em sujeito(s) com EA.

Na referida primeira concretização do invento, é adicionalmente preferido que o nível de MMP3 pós-tratamento na(s) amostra(s) obtida(s) do sujeito seja uma redução de pelo menos cerca de 8% em relação ao nível de MMP3 padrão conhecido baseado em sujeito(s) com EA.

De acordo com uma segunda concretização, o presente invento proporciona um método de determinação da eficácia do adalimumab para o tratamento da espondilite anquilosante (EA) num sujeito com EA, em que o referido método compreende a determinação de um nível de C-telopéptido do colagénio tipo II (CTX-II) pré-tratamento e um nível de metaloprotease da matriz 3 (MMP3) pré-tratamento em amostra(s) obtida(s) do sujeito com EA, onde um nível de CTX-II pós-tratamento inferior em relação ao nível de CTX-II pré-tratamento e um nível de MMP3 pós-tratamento inferior em relação ao nível de MMP3 pré-tratamento indica que o adalimumab é eficaz para o tratamento da EA no sujeito.

De acordo com uma terceira concretização, o presente invento proporciona um método de determinação da eficácia do adalimumab para o tratamento da espondilite anquilosante (EA) num sujeito com EA, em que o referido método compreende a determinação de um nível de C-telopéptido do colagénio tipo II (CTX-II) pós-tratamento e um nível de metaloprotease da matriz 3 (MMP3) pós-tratamento em amostra(s) obtida(s) do sujeito com EA, onde um nível de CTX-II pós-tratamento inferior em relação a um nível de CTX-II pré-tratamento e um nível de MMP3 pós-tratamento inferior em relação a um nível de MMP3 pré-tratamento indica que o adalimumab é eficaz para o tratamento da EA no sujeito.

Nas concretizações acima, é preferido que a determinação do nível de MMP3 seja efectuada por ELISA.

De acordo com uma quarta concretização, o presente invento proporciona um método de determinação da eficácia do adalimumab para o tratamento da espondilite anquilosante (EA) num sujeito com EA, em que o referido método compreende a 5 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ determinação de um nível de C-telopéptido do colagénio tipo II (CTX-II) pós-tratamento em amostra(s) obtida(s) do sujeito com EA, onde uma diminuição do nível de CTX-II de pelo menos 9% em relação a um nível de CTX-II padrão conhecido baseado em sujeito(s) com EA indica que o adalimumab é eficaz para o tratamento da EA no sujeito.

Nas concretizações acima, é preferido que a determinação do nível de CTX-II seja efectuada por ELISA

De acordo com concretizações preferidas do invento, o CTX-II é o CTX-II urinário.

De acordo com concretizações preferidas do invento, a MMP3 é a MMP3 sérica.

Nas concretizações acima, é preferido que o método do invento compreenda adicionalmente uma comparação do nível de proteína C reactiva (PCR) do sujeito com um nível de PCR padrão conhecido associado à EA e a determinação se o nível de PCR do sujeito é superior ao nível de PCR padrão conhecido, em que um nível de PCR inferior em relação ao nível de PCR padrão conhecido indica a eficácia do tratamento. A presente descrição proporciona, assim, biomarcadores que poderão ser utilizados para determinar melhorias no estado global da doença EA dos doentes, particularmente no que diz respeito a danos estruturais associados à EA. Esta descrição descreve pois um método de determinação da eficácia de um inibidor do TNF para diminuir a degradação da cartilagem e/ou a sinovite que estão relacionadas com a EA. A presente descrição inclui assim também um método de identificação de doentes com EA que são candidatos para o tratamento com inibidores do TNF, por exemplo, o adalimumab, com base no seu nível de biomarcadores da degradação da cartilagem e/ou da sinovite.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 ilustra o desenho de estudo do estudo descrito no Exemplo 1. 6 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ A Figura 2 representa um gráfico que indica que os doentes de adalimumab experimentaram reduções significativas dos níveis de CTX-II urinário em relação a doentes de placebo, na semana 12 e na semana 24. A Figura 3 mostra um gráfico que indica que os doentes de adalimumab experimentaram reduções estatisticamente significativas dos níveis de MMP3 em relação a doentes de placebo, às 12 semanas e às 24 semanas. A Figura 4 apresenta um gráfico que indica que os níveis de PCR foram significativamente reduzidos em doentes de adalimumab em comparação com doentes de placebo, na semana 12 e na semana 24.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO I. Definições

Para que o presente invento possa ser mais facilmente entendido, definem-se primeiro alguns termos. 0 termo "biomarcador", como aqui utilizado, refere-se geralmente a uma molécula, isto é, um gene (ou um ácido nucleico que codifica o referido gene), uma proteína, uma estrutura de hidratos de carbono ou um glicolípido, cuja expressão numa amostra derivada de um tecido ou uma célula de mamífero pode ser detectada por métodos padrão da técnica (bem como aqueles aqui descritos) e é preditiva ou indica uma condição do sujeito do qual foi obtida. Quando o biomarcador é uma proteína, a modulação ou alteração da expressão engloba a modulação através de diferentes modificações pós-traducionais. Um biomarcador poderá ser utilizado para diferenciar a actividade de doença, incluindo as melhorias na condição e uma deterioração da condição, com base no nível do biomarcador. Por conseguinte, numa concretização, um biomarcador útil na presente invenção é qualquer molécula cuja expressão é regulada (positiva ou negativamente) num doente com uma condição de doença, por exemplo, uma espondiloartropatia, em comparação com um controlo normal, ou seja, um sujeito não afectado. Numa concretização, conjuntos seleccionados de um, dois, três e mais dos biomarcadores 7 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ deste invento podem ser usados como end-points para diagnósticos ou prognósticos rápidos destinados a determinar a resposta de um doente a uma terapia anti-TNF. 0 termo "biomarcador da degradação do colagénio" refere-se a uma molécula, isto é, um gene (ou um ácido nucleico que codifica o referido gene), uma proteína, uma estrutura de hidratos de carbono ou um glicolípido, que está associada à destruição do colagénio. Um biomarcador da degradação do colagénio é utilizado para diferenciar a actividade de doença, isto é, a destruição do colagénio, num sujeito do qual a amostra ou o tecido é obtido. Numa concretização, o biomarcador da degradação do colagénio é um fragmento de colagénio, por exemplo, um fragmento de colagénio tipo II. 0 biomarcador da degradação do colagénio utilizado no invento é o C-telopéptido do colagénio tipo II (CTX-II). 0 termo "biomarcador da sinovite" refere-se a uma molécula, isto é, um gene (ou um ácido nucleico que codifica o referido gene), uma proteína, uma estrutura de hidratos de carbono ou um glicolípido, que está associada à sinovite ou inflamação da membrana sinovial. Um biomarcador da sinovite poderá ser utilizado para indicar um aumento da renovação, proliferação, degradação, inflamação, destruição, decomposição, remodelação patológica ou degradação da sinóvia ou do colagénio sinovial de um doente. Numa concretização, um biomarcador da sinovite é uma endopeptidase associada à degradação da matriz extracelular (MEC), por exemplo, as metaloproteínases da matriz. 0 biomarcador da sinovite utilizado no invento é a MMP-3. sem 0 termo "nível padrão conhecido" ou "nível de controlo" refere-se a um nível do biomarcador aceite ou predeterminado que é utilizado para comparar o nível do biomarcador derivado de uma amostra de um doente. Numa concretização, o nível padrão conhecido do biomarcador da degradação do colagénio e/ou do biomarcador da sinovite baseia-se num sujeito ou sujeitos com EA e, por conseguinte, representa o estado da doença. Noutra concretização, o nível padrão conhecido do biomarcador indica um estado não afectado, isto é, doença, de um sujeito que não tem EA. 8 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

Quando comparado com o nível padrão conhecido de um determinado biomarcador, um desvio do nível padrão conhecido geralmente indica ou uma melhoria ou uma deterioração do estado da doença. Em alternativa, quando comparado com o nível padrão conhecido de um determinado biomarcador, uma equivalência com o nível padrão conhecido geralmente indica uma confirmação da actividade de doença, uma confirmação de um estado sem doença ou, caso o nível do biomarcador do doente seja obtido após um tratamento terapêutico para a doença, o insucesso de uma terapia para melhorar o estado de doença de um doente.

Tal como aqui utilizado, o termo "expressão", quando utilizado com respeito à detecção da expressão de um biomarcador do presente invento, pode referir-se à detecção da transcrição do gene que codifica uma proteína biomarcadora, à detecção da tradução da proteína biomarcadora e/ou à detecção da proteína biomarcadora que resulta do metabolismo de uma proteína maior, por exemplo, a degradação do colagénio tipo II que origina o fragmento CTX-II. A detecção da expressão de um biomarcador refere-se ao acto de determinar activamente se um biomarcador é expresso ou não. A quantificação da expressão refere-se ao acto de determinar o nível do dado biomarcador, por exemplo, ng/ml. A detecção e/ou quantificação da expressão pode incluir a determinação se a expressão do biomarcador é regulada positivamente em comparação com um nível padrão conhecido, regulada negativamente em comparação com um nível padrão conhecido ou substancialmente inalterada em comparação com um nível padrão conhecido. Por conseguinte, o passo de quantificar e/ou detectar a expressão não requer que a expressão do biomarcador seja efectivamente regulada positiva ou negativamente, podendo em vez disso incluir também a detecção da ausência de expressão do biomarcador ou a detecção de que a expressão do biomarcador não foi alterada ou não é diferente (isto é, detectar a ausência de uma expressão significativa do biomarcador ou a ausência de uma alteração significativa na expressão do biomarcador em comparação com um controlo).

0 termo "nivel" ou "quantidade", como aqui utilizado, refere-se à quantidade mensurável de um biomarcador. A 9 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ quantidade poderá ser (a) uma quantidade absoluta medida em moléculas, moles ou peso por unidade de volume ou células ou (b) uma quantidade relativa, por exemplo, medida por análise densitométrica. Numa concretização preferida, determinam-se os níveis de ARN e/ou proteína do biomarcador. 0 termo "sujeito" ou "doente", como aqui utilizado, refere-se a um animal humano ou não humano. 0 termo "amostra", como aqui utilizado, refere-se a uma recolha de células similares ou de tecido obtida de um sujeito. A fonte da amostra de tecido ou de células poderá ser um tecido sólido, tal como um aspirado ou uma biopsia ou uma amostra de tecido ou de órgão fresca, congelada e/ou preservada; sangue ou quaisquer constituintes do sangue; ou fluidos corporais, como sangue, soro, plasma, urina, saliva, suor ou líquido sinovial. Numa concretização, o biomarcador da sinovite é obtido de uma amostra de soro. Numa concretização, o biomarcador da degradação da cartilagem é obtido de uma amostra de urina. 0 termo "TNFa humano" (aqui abreviado como hTNFa ou simplesmente hTNF), tal como aqui utilizado, pretende designar uma citocina humana que existe como uma forma segregada de 17 kD e uma forma associada à membrana de 26 kD, cuja forma biologicamente activa é constituída por um trímero de moléculas de 17 kD ligadas de modo não covalente. A estrutura do hTNFa está adicionalmente descrita em, por exemplo, Pennica, D., et al. (1984) Nature 312:724-729;

Davis, J.M., et al. (1987) Biochemistry 2_6:1322-1326; e

Jones, E.Y., et al. (1989) Nature 338:225-228. 0 termo TNFa humano pretende incluir o TNFa humano recombinante (rhTNFa), que pode ser preparado por métodos de expressão recombinante padrão ou adquirido comercialmente (R & D Systems, n.° de catálogo 210-TA, Minneapolis, Minnesota). 0 TNFa é também designado por TNF. 0 termo "inibidor do TNFa" inclui agentes que interferem com a actividade do TNFa. 0 termo também inclui cada um dos anticorpos humanos e partes de anticorpos humanos anti-TNFa aqui descritos, assim 10 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ como aqueles descritos na Patente U.S. n.° 6,090,382; 6,258, 562; 6,509, 015, 7, 223,394 e US 2003/0219438 AI. O inibidor do TNFa utilizado no presente invento é um anticorpo anti-TNFa, ou um seu fragmento, incluindo o infliximab (Remicade®, Johnson & Johnson; descrito na Patente U.S. n.° 5,656,272), o CDP571 (um anticorpo monoclonal IgG4 humanizado anti-TNFa), o CDP870 (um fragmento de anticorpo monoclonal humanizado anti-TNFa), um dAb anti-TNF (Peptech), o CNTO 148 (golimumab; Medarex e Centocor, ver WO 02/12502) e o adalimumab (Humira® Laboratórios Abbott, um Ac monoclonal humano anti-TNF, descrito em US 6, 090,382 como D2E7) . Os anticorpos para o TNF adicionais que poderão ser utilizados no presente invento estão descritos na Patente U.S. n.° 6,593,458; 6,498,237; 6,451,983; e 6,448,380. Noutro aspecto da presente descrição, o inibidor do TNFa é uma proteína de fusão para o TNF, por exemplo, etanercept (Enbrel®, Amgen; descrito em WO 91/03553 e WO 09/406476). Noutro aspecto da presente descrição, o inibidor do TNFa é uma proteína de ligação do TNF recombinante (r-TBP-1) (Serono). O termo "anticorpo", tal como aqui utilizado, pretende designar as moléculas de imunoglobulinas constituídas por quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfureto. Cada cadeia pesada é constituída por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é constituída por três domínios: CHI, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é constituída por uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é constituída por um domínio: CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), interpoladas com regiões que são mais conservadas, designadas por regiões framework (FR). Cada região VH e VL é constituída por três CDR e quatro FR, dispostas da extremidade amino-terminal para a extremidade carboxi-terminal pela seguinte ordem: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Os anticorpos do invento estão descritos em maior detalhe na Patente U.S. n.° 6,090,382; 6,258,562; e 6,509,015. 11 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ Ο termo "parte de ligação ao antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "parte do anticorpo"), como aqui utilizado, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que conservam a capacidade de ligação especifica a um antigénio (por exemplo, hTNFa). Foi demonstrado que a função de ligação ao antigénio de um anticorpo pode ser desempenhada por fragmentos de um anticorpo completo. Os exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo "parte de ligação ao antigénio" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F{ab')2f um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfureto na região da dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; um fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546), que consiste num domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por um adaptador sintético, que permite transformá-los numa cadeia proteica única em que as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecido como Fv de cadeia única (scFv); ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sei. USA 8_5: 5879-5883) . Tais anticorpos de cadeia única também se destinam a estar abrangidos pelo termo "parte de ligação ao antigénio" de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia única, como os diabodies, estão também abrangidas. Os diabodies são anticorpos bivalentes e biespecíficos em que os domínios VH e VL são expressos numa cadeia polipeptídica única, mas utilizando um adaptador que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando assim os domínios a emparelhar com domínios complementares de outra cadeia e criando dois locais de ligação ao antigénio (ver, por exemplo, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sei. USA jK): 6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2_: 1121-1123) . As partes dos anticorpos do presente invento estão descritas em maior detalhe na Patente U.S. n.° 6,090,382; 6,258,562; 6, 509, 015. O inibidor do TNFoí utilizado no invento é o adalimumab. 12 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

Os fragmentos de ligação são produzidos por técnicas de ADN recombinante ou por clivagem enzimática ou química das imunoglobulinas intactas. Os fragmentos de ligação incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, cadeias únicas e anticorpos de cadeia única. Com excepção das imunoglobulinas ou anticorpos "biespecíficos" ou "bifuncionais", todos os locais de ligação de uma imunoglobulina ou anticorpo são idênticos. Um "anticorpo biespecífico" ou "bifuncional" é um anticorpo híbrido artificial possuindo dois pares cadeia leve/pesada diferentes e dois locais de ligação diferentes. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos, incluindo a fusão de hibridomas ou a ligação de fragmentos Fab'. Ver, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 7_9:315-321 (1990); Kostelny et al. , J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).

Uma "substituição de aminoácido conservativa", como aqui utilizada, é uma substituição em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido possuindo uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). O termo "anticorpos quiméricos" refere-se a anticorpos em que uma parte de cada uma das sequências de aminoácidos das cadeias leve e pesada é homóloga das sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe particular, enquanto o restante segmento das cadeias é homólogo das sequências correspondentes de outra espécie. Noutro aspecto, o invento apresenta um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio quimérico, em que as regiões variáveis de ambas as cadeias leve e pesada mimetizam as regiões variáveis de 13 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ anticorpos derivados de uma espécie de mamífero, enquanto as partes constantes são homólogas das sequências em anticorpos derivados de outra espécie. Num aspecto preferido do invento, os anticorpos quiméricos são preparados por meio do enxerto de regiões CDR de um anticorpo de ratinho nas regiões framework de um anticorpo humano.

Os "anticorpos humanizados" referem-se a anticorpos que compreendem pelo menos uma cadeia compreendendo resíduos framework da região variável de uma cadeia de um anticorpo humano (designado por imunoglobulina ou anticorpo receptor) e pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo não humano (por exemplo, de ratinho). Além do enxerto das CDR, os anticorpos humanizados normalmente são sujeitos a alterações adicionais de forma a melhorar a sua afinidade e/ou imunogenicidade. 0 termo "anticorpo multivalente" refere-se a um anticorpo compreendendo mais de um local de reconhecimento do antigénio. Por exemplo, um anticorpo "bivalente" tem dois locais de reconhecimento do antigénio, ao passo que um anticorpo "tetravalente" tem quatro locais de reconhecimento do antigénio. Os termos "monoespecífico", "biespecífico", "triespecífico", "tetraspecífico", etc. referem-se ao número de especificidades diferentes do local de reconhecimento do antigénio (em oposição ao número de locais de reconhecimento do antigénio) presentes num anticorpo multivalente. Por exemplo, os locais de reconhecimento do antigénio de um anticorpo "monoespecífico" ligam-se todos ao mesmo epitopo. Um anticorpo "biespecífico" ou de "especificidade dupla" possui pelo menos um local de reconhecimento do antigénio que se liga a um primeiro epitopo e pelo menos um local de reconhecimento do antigénio que se liga a um segundo epitopo que é diferente do primeiro epitopo. Um anticorpo "monoespecífico multivalente" possui múltiplos locais de reconhecimento do antigénio que se ligam todos ao mesmo epitopo. Um anticorpo "biespecífico multivalente" possui múltiplos locais de reconhecimento do antigénio, em que alguns deles se ligam a um primeiro epitopo e alguns deles se ligam a um segundo epitopo que é diferente do primeiro epitopo. 14 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ Ο termo "anticorpo humano", tal como aqui utilizado, pretende incluir os anticorpos que possuem regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas da linha germinal humana. Os anticorpos humanos do invento poderão incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulinas da linha germinal humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou dirigida in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo nas CDR e, em particular, na CDR3. Contudo, o termo "anticorpo humano", como aqui utilizado, não pretende incluir os anticorpos em que sequências CDR derivadas da linha germinal de outra espécie de mamífero, por exemplo, o ratinho, foram enxertadas em sequências framework humanas. 0 termo "anticorpo humano recombinante", como aqui utilizado, destina-se a incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como os anticorpos expressos utilizando um vector de expressão recombinante transfectado numa célula hospedeira (descrito adicionalmente abaixo), os anticorpos isolados a partir de uma biblioteca combinatória e recombinante de anticorpos humanos (descrito adicionalmente abaixo), os anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um ratinho) que é transgénico relativamente a genes de imunoglobulinas humanas (ver, por exemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287) ou os anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva o splicing de sequências de genes de imunoglobulinas humanas noutras sequências de ADN. Tais anticorpos humanos recombinantes possuem regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas da linha germinal humana. Em determinadas concretizações, contudo, tais anticorpos humanos recombinantes são sujeitos a mutagénese in vitro (ou, quando se utiliza um animal transgénico para as sequências de imunoglobulinas humanas, mutagénese somática in vivo) e, deste modo, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas e relacionadas com as sequências VH e VL da linha germinal humana, poderão não existir naturalmente no repertório da linha germinal de anticorpos humanos in vivo. 15 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

Tais anticorpos quiméricos, humanizados, humanos e biespecificos podem ser produzidos por técnicas de ADN recombinante conhecidas na técnica, por exemplo utilizando os métodos descritos na Patente U.S. n.° 5,500,362; EP 0184187; EP 171496; EP 0173494; Publicação internacional PCT n.° WO 86/01533; Patente U.S. n.° 4,816,567; EP 0125023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad Sei. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Câncer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; Shaw et al. (1988) J. Natl. Câncer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Patente U.S. n.° 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; e Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4453-4060, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029-10033 (1989), US 5,530,101; US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; Selick et al., WO 90/07861 e Winter, US 5,225,539.

Um "anticorpo isolado", como aqui utilizado, pretende designar um anticorpo que está substancialmente livre de outros anticorpos possuindo especificidades antigénicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a hTNFa está substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antigénios distintos de hTNFa). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a hTNFa poderá, contudo, possuir uma reactividade cruzada com outros antigénios, como sejam as moléculas TNFa de outras espécies (discutido em maior detalhe abaixo). Além disso, um anticorpo isolado poderá estar substancialmente livre de outro material celular e/ou produtos químicos.

Um "anticorpo neutralizante", como aqui utilizado (ou um "anticorpo que neutralizou a actividade do hTNFa"), pretende designar um anticorpo cuja ligação a hTNFa resulta em inibição da actividade biológica do hTNFa. Esta inibição da actividade biológica do hTNFa pode ser avaliada através da medição de um ou mais indicadores da actividade biológica do hTNFa, como a citotoxicidade induzida por hTNFa (in vitro ou in vivo) , a activação celular induzida por hTNFa e a ligação 16 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ de hTNFa a receptores de hTNFa. Estes indicadores da actividade biológica do hTNFa podem ser avaliados por um ou mais de vários ensaios padrão in vitro ou in vivo conhecidos na técnica (ver Patente U.S. n.° 6,090,382). Preferencialmente, a capacidade de um anticorpo para neutralizar a actividade do hTNFa é determinada por inibição da citotoxicidade induzida por hTNFa de células L929. Como um parâmetro adicional ou alternativo da actividade do hTNFa, é possivel determinar a capacidade de um anticorpo para inibir a expressão de ELAM-1 induzida por hTNFa em células HUVEC, como uma medida da activação celular induzida por hTNFa. 0 termo "ressonância de plasma de superfície", como aqui utilizado, refere-se a um fenómeno óptico que permite a análise de interacções bioespecíficas em tempo real por detecção de alterações nas concentrações de proteína numa matriz de biossensor, por exemplo, utilizando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, Nova Jérsia). Para obter descrições adicionais, ver o Exemplo 1 de Patente U.S. 6,258,562 e Jõnsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19; Jõnsson et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125; e Johnnson et al. (1991) Anal.Biochem. 198:268. 0 termo "K0ff", como aqui utilizado, pretende designar a constante de velocidade para a dissociação de um anticorpo a partir do complexo anticorpo/antigénio. O termo "Kd", como aqui utilizado, pretende designar a constante de dissociação de uma interacção anticorpo-antigénio particular. O termo "IC50", como aqui utilizado, pretende designar a concentração do inibidor necessária para inibir o endpoint biológico de interesse, por exemplo, neutralizar a actividade de citotoxicidade. 0 termo "molécula de ácido nucleico", como aqui utilizado, pretende incluir moléculas de ADN e moléculas de ARN. Uma molécula de ácido nucleico poderá ser de cadeia 17 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ simples ou cadeia dupla, mas preferencialmente é ADN de cadeia dupla. O termo "molécula de ácido nucleico isolada", como aqui utilizado em referência a ácidos nucleicos que codificam anticorpos ou partes de anticorpos (por exemplo, VH, VL, CDR3) que se ligam a hTNFa, pretende designar uma molécula de ácido nucleico em que as sequências nucleotidicas que codificam o anticorpo ou parte do anticorpo estão isentas de outras sequências nucleotidicas que codificam anticorpos ou partes de anticorpos que se ligam a antigénios distintos de hTNFa, em que estas outras sequências poderão flanquear naturalmente o ácido nucleico no ADN genómico humano. Assim, por exemplo, um ácido nucleico isolado do invento que codifica uma região VH de um anticorpo anti-hTNFa não contém outras sequências codificantes de outras regiões VH que se ligam a antigénios distintos de hTNFa. 0 termo "vector", como aqui utilizado, pretende designar uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vector é um "plasmídeo", que se refere a uma volta de ADN de cadeia dupla circular no qual podem ser ligados segmentos de ADN adicionais. Outro tipo de vector é um vector virai, em que segmentos de ADN adicionais podem ser ligados no genoma virai. Determinados vectores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, os vectores bacterianos possuindo uma origem de replicação bacteriana e os vectores epissómicos de mamíferos). Outros vectores (por exemplo, os vectores não epissómicos de mamíferos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira e, deste modo, são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, determinados vectores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão ligados funcionalmente. Tais vectores são aqui designados por "vectores de expressão recombinante" (ou simplesmente "vectores de expressão). Em geral, os vectores de expressão úteis em técnicas de ADN recombinante encontram-se frequentemente na forma de plasmídeos. No presente fascículo, os termos "plasmídeo" e "vector" podem ser utilizados indistintamente, já que o plasmídeo é a forma de vector mais 18 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ usada habitualmente. Contudo, o invento pretende incluir outras formas de vectores de expressão, tais como os vectores virais (por exemplo, retrovirus deficientes ao nível da replicação, adenovírus e vírus adeno-associados), que desempenham funções equivalentes. 0 termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira") , como aqui utilizado, pretende designar uma célula na qual foi introduzido um vector de expressão recombinante. Deve entender-se que tais termos pretendem designar não só a célula em questão particular, mas também a descendência de tal célula. Como determinadas modificações poderão ter lugar em gerações subsequentes devido a mutação ou a influências ambientais, tal descendência poderá, na verdade, não ser idêntica à célula parental, mas estar ainda incluída no âmbito do termo "célula hospedeira" como aqui utilizado. 0 termo "dose", como aqui utilizado, refere-se a uma quantidade de inibidor do TNFa que é administrada a um sujeito. 0 termo "dose múltipla variável" inclui as diferentes doses de um inibidor do TNFa que são administradas a um sujeito para tratamento terapêutico. Os termos "regime de dose múltipla variável" ou "terapia de dose múltipla variável" descrevem um regime de tratamento que se baseia na administração de diferentes quantidades do inibidor do TNFa em vários momentos temporais ao longo do tratamento. Os regimes de dose múltipla variável estão descritos em WO 05/110452. O termo "medicar", como aqui utilizado, refere-se à administração de uma substância (por exemplo, um anticorpo anti-TNFa) para alcançar um objectivo terapêutico (por exemplo, o tratamento da artrite reumatóide).

Os termos "regime posológico bissemanal", "medicação bissemanal" e "administração bissemanal", como aqui utilizados, referem-se ao decurso temporal da administração de uma substância (por exemplo, um anticorpo anti-TNFa) a um sujeito para alcançar um objectivo terapêutico. O regime 19 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ posológico bissemanal não se destina a incluir um regime posológico semanal. Preferencialmente, a substância é administrada a cada 9-19 dias, mais preferencialmente a cada 11-17 dias, ainda mais preferencialmente a cada 13-15 dias, e mais preferencialmente ainda a cada 14 dias. 0 termo "combinação", como na frase "um primeiro agente em combinação com um segundo agente", inclui a co-administração de um primeiro agente e um segundo agente, que poderão, por exemplo, ser dissolvidos ou misturados no mesmo veiculo farmaceuticamente aceitável, ou a administração de um primeiro agente, seguido do segundo agente, ou a administração do segundo agente, seguido do primeiro agente. Por conseguinte, o presente invento inclui métodos de tratamento terapêutico de combinação e composições farmacêuticas de combinação. 0 termo "concomitante", como na frase "tratamento terapêutico concomitante", inclui a administração de um agente na presença de um segundo agente. Um método de tratamento terapêutico concomitante inclui os métodos em que o primeiro, o segundo, o terceiro ou os agentes adicionais são co-administrados. Um método de tratamento terapêutico concomitante também inclui os métodos em que o primeiro ou os agentes adicionais são administrados na presença de um segundo ou de agentes adicionais, em que o segundo ou os agentes adicionais, por exemplo, poderão ter sido previamente administrados. Um método de tratamento terapêutico concomitante poderá ser executado progressivamente por diferentes actores. Por exemplo, um actor poderá administrar a um sujeito um primeiro agente e um segundo actor poderá administrar ao sujeito um segundo agente, e os passos de administração poderão ser executados ao mesmo tempo, ou praticamente ao mesmo tempo, ou em momentos distantes, desde que o primeiro agente (e agentes adicionais) seja após administração na presença do segundo agente (e agentes adicionais). 0 actor e o sujeito poderão ser a mesma entidade (por exemplo, um ser humano). 0 termo "terapia de combinação", como aqui utilizado, refere-se à administração de duas ou mais substâncias terapêuticas, por exemplo, um anticorpo anti-TNFa e outro 20 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ fármaco. 0(s) outro(s) fármaco(s) poderá(ão) ser administrado(s) concomitantemente com, antes ou após a administração de um anticorpo anti-TNFa. 0 termo "kit", como aqui utilizado, refere-se a um produto embalado compreendendo componentes, com o qual administrar o anticorpo contra TNFa do invento para o tratamento de um distúrbio relacionado com o TNFa. 0 kit compreende preferencialmente uma caixa ou recipiente que suporta os respectivos componentes. A caixa ou recipiente tem afixada uma etiqueta ou um protocolo aprovado pela Food and Drug Administration. A caixa ou recipiente suporta os componentes do invento, que estão preferencialmente contidos em recipientes de plástico, polietileno, polipropileno, etileno ou propileno. Os recipientes podem ser tubos com tampa ou frascos. 0 kit também pode incluir instruções para administrar o anticorpo para TNFa do invento. Numa concretização, o kit do invento inclui a formulação compreendendo o anticorpo humano D2E7, conforme descrito em US 8,216,583 e US 2004/00 33228 AI. Vários aspectos do invento estão descritos aqui em maior detalhe. II. Biomarcadores da degradação da cartilagem e da espondilite

Existe a necessidade de estabelecer uma ferramenta de avaliação significativa para a espondilite anquilosante (EA) que permita determinar melhorias, especialmente melhorias estruturais precoces, em doentes com EA submetidos a terapia com um inibidor do TNF. Actualmente, a velocidade de sedimentação dos eritrócitos (ESR) e o nivel de proteína C reactiva (CRP) são os métodos mais amplamente utilizados para avaliar a actividade da EA. Contudo, estes marcadores sozinhos são insuficientes para avaliar a actividade de doença da EA (Ruof & Stucki (1999) J Rheumatol 26:966) . 0 invento tal como definido nas reivindicações anexas disponibiliza biomarcadores que foram identificados como sendo úteis na avaliação da capacidade de uma terapia anti-TNF para prevenir os danos estruturais associados à EA num doente. Além disso, o invento tal como definido nas 21 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ reivindicações anexas disponibiliza um método de determinação da resposta de um doente a melhorias na destruição estrutural das articulações associada à EA. Os métodos aqui descritos identificam alterações na progressão dos danos estruturais num doente, que poderiam não ser facilmente evidentes utilizando meios mais tradicionais, como a radiografia. Os métodos do invento são vantajosos, uma vez que proporcionam um meio para o médico determinar a eficácia de um tratamento anti-TNF num doente sem ter de esperar por resultados clínicos, que poderão demorar períodos de tempo prolongados.

De uma forma geral, o presente invento inclui uma comparação dos níveis de biomarcador de um doente com EA, ou suspeito de ter EA, com um nível padrão conhecido associado à actividade de doença, para determinar se o nível de biomarcador do doente aumentou, diminuiu ou manteve-se igual, em relação ao controlo. Ao determinar a eficácia de um inibidor do TNF para tratar a EA num doente, particularmente no que diz respeito a melhorar os danos estruturais, os níveis do biomarcador poderão ser predeterminados ou, em alternativa, poderão incluir a obtenção de uma amostra do doente e depois a utilização do nível do biomarcador determinado a partir da amostra na avaliação comparativa do presente invento. 0 presente invento identifica determinados biomarcadores associados à destruição estrutural, incluindo a degradação da cartilagem e a sinovite, que poderão ser utilizados para determinar se a terapia anti-TNF eleita é ou não adequada para o tratamento ou se uma terapia diferente, incluindo uma terapia anti-TNF diferente, deve ser considerada. Tais meios preditivos beneficiam a saúde geral do sujeito, pois permitem obter respostas mais rápidas para determinar a terapia apropriada. Os métodos aqui descritos também diminuem o custo global do processo de tratamento, ao eliminarem mais rapidamente as terapias ineficazes.

um método de do TNF para 0 por exemplo, a a medição de e da sinovite. A 0 presente invento disponibiliza determinação da eficácia de um inibidor tratamento de uma espondiloartropatia, espondilite anquilosante, compreendendo biomarcadores da destruição da cartilagem 22 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ eficácia é determinada de acordo com a capacidade do inibidor do TNF para reduzir os biomarcadores que reconhecidamente reflectem a actividade de doença relacionada com a degradação da cartilagem e/ou a sinovite num sujeito.

Num aspecto, o presente invento inclui um método de determinação da eficácia de um inibidor do TNFa, por exemplo, um anticorpo para o TNFa humano ou uma sua parte de ligação ao antigénio, para tratar a espondilite anquilosante (EA), em que um nivel predeterminado de um biomarcador da degradação do colagénio e/ou de um biomarcador da sinovite de um doente com EA após tratamento com o inibidor do TNFa (nivel do biomarcador pós-tratamento) é comparado com um nivel padrão conhecido do biomarcador da degradação do colagénio e/ou do biomarcador da sinovite associado ao estado da doença. Uma vez os dois níveis comparados, determina-se se o nível do biomarcador da degradação do colagénio e/ou do biomarcador da sinovite pós-tratamento é inferior ao nível padrão conhecido, em que um nível inferior do biomarcador da degradação do colagénio e/ou do biomarcador da sinovite do doente após tratamento com o inibidor do TNF relativamente ao nível padrão conhecido indica a eficácia do inibidor do TNFa para o tratamento da EA. Especificamente, de acordo com uma primeira concretização, o presente invento proporciona um método de determinação da eficácia do adalimumab para o tratamento da espondilite anquilosante (EA) num sujeito com EA, em que o referido método compreende a determinação de um nível de C-telopéptido do colagénio tipo II (CTX-II) pós-tratamento e de um nivel de metaloprotease da matriz 3 (MMP3) pós-tratamento em amostra (s) obtida (s) do sujeito com EA, onde um nível de CTX-II pós-tratamento inferior na(s) amostra(s) em relação a um nivel de CTX-II padrão conhecido baseado em sujeito(s) com EA e um nivel de MMP3 pós-tratamento inferior na(s) amostra(s) em relação a um nivel de MMP3 padrão conhecido baseado em sujeito(s) com EA indica que o adalimumab é eficaz para o tratamento da EA no sujeito.

Noutro aspecto, o presente invento disponibiliza um método de determinação da eficácia de um inibidor do TNF, por exemplo, um anticorpo para o TNFa humano ou uma sua parte de ligação ao antigénio, para a espondilite anquilosante (EA) , que compreende a comparação de um nivel pré-tratamento de um 23 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ biomarcador da degradação do colagénio e/ou de um biomarcador da sinovite obtido de um doente com EA com um nível pós-tratamento do biomarcador da degradação do colagénio e/ou do biomarcador da sinovite obtido do referido doente, em que um nível do biomarcador pós-tratamento inferior indica a eficácia do inibidor do TNF para tratar a EA no doente.

Ao reduzir o nível de um biomarcador associado à degradação da cartilagem e/ou à sinovite, um inibidor do TNF pode ser utilizado para reduzir ou prevenir os danos estruturais associados à EA. Especificamente, de acordo com uma segunda concretização, o presente invento proporciona um método de determinação da eficácia do adalimumab para o tratamento da espondilite anquilosante (EA) num sujeito com EA, em que o referido método compreende a determinação de um nível de C-telopéptido do colagénio tipo II (CTX-II) pré-tratamento e de um nível de metaloprotease da matriz 3 (MMP3) pré-tratamento em amostra(s) obtida(s) do sujeito com EA, onde um nível de CTX-II pós-tratamento inferior em relação ao nível de CTX-II pré-tratamento e um nível de MMP3 pós-tratamento inferior em relação ao nível de MMP3 pré-tratamento indica que o adalimumab é eficaz para o tratamento da EA no sujeito. Num aspecto, este invento disponibiliza um método de monitorização da eficácia de um inibidor do TNF, por exemplo um anticorpo para o TNFa humano ou uma sua parte de ligação ao antigénio, para diminuir a progressão dos danos estruturais associados à espondilite anquilosante (EA) num doente, compreendendo a determinação do nível de um biomarcador da degradação do colagénio e/ou de um biomarcador da sinovite num doente e a comparação do nível do biomarcador da degradação do colagénio e/ou de um biomarcador da sinovite com um nível padrão conhecido do biomarcador da degradação do colagénio e/ou de um biomarcador da sinovite associado à EA. Neste caso, uma redução do nível do biomarcador do doente em relação a um nível padrão conhecido indica que o inibidor do TNF é eficaz para diminuir a velocidade de progressão dos danos estruturais associados à EA no doente.

Noutro aspecto, o presente invento disponibiliza um método de previsão da eficácia de um inibidor do TNF, por exemplo um anticorpo para o TNFa humano ou uma sua parte de ligação ao antigénio, para o tratamento da EA num doente, 24 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ compreendendo a comparação de um nível predeterminado de um biomarcador da degradação do colagénio e/ou de um biomarcador da sinovite do doente após tratamento com o anticorpo para o TNFoí humano, ou uma sua parte de ligação ao antigénio, com um nível padrão conhecido do biomarcador da degradação do colagénio e/ou de um biomarcador da sinovite de um doente com EA. Com base nos dois níveis do biomarcador, faz-se uma avaliação relativamente ao facto de o nível do biomarcador da degradação do colagénio e/ou de um marcador da sinovite pós-tratamento do doente ser ou não inferior ao nível padrão conhecido do biomarcador da degradação do colagénio e/ou de um biomarcador da sinovite. Neste caso, um nível inferior do biomarcador da degradação do colagénio e/ou de um biomarcador da sinovite do doente em relação ao nível padrão conhecido indica que o anticorpo para o TNFoí humano, ou uma sua parte de ligação ao antigénio, é previsivelmente eficaz para o tratamento da EA no doente.

Nas situações acima em que se determina que um inibidor do TNF é eficaz na redução dos biomarcadores associados à destruição da cartilagem e/ou à sinovite, o que, pelo seu lado, reflecte uma redução da destruição estrutural, isto é, da destruição das articulações, a continuação do tratamento com o inibidor do TNF poderá ser considerada. Num aspecto do presente invento, poderá considerar-se a administração do mesmo regime posológico ao doente. Em alternativa, poderá considerar-se uma redução da dose do inibidor do TNF que é comprovadamente eficaz para o tratamento da EA no doente. 0 presente invento proporciona um método de utilização de um biomarcador da degradação da cartilagem sozinho ou em combinação com um biomarcador da sinovite, assim como um método de utilização de um biomarcador da sinovite sozinho ou em combinação com um biomarcador da degradação da cartilagem, para determinação da eficácia de um tratamento com um inibidor do TNF para a EA.

Além disso, a análise do biomarcador da degradação do colagénio e/ou da sinovite poderá ser efectuada numa amostra de um doente que ainda não recebeu terapia com um inibidor do TNF. Uma análise dos biomarcadores da degradação do colagénio e da sinovite poderá ser efectuada para determinar se é 25 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ provável que ο doente responda ao tratamento com um anticorpo anti-TNFa, por exemplo, o adalimumab. Níveis comparáveis de um biomarcador da degradação do colagénio e/ou da sinovite de uma amostra de um doente, em relação a um nível padrão conhecido caracterizado como sendo um nível indicativo de EA, poderão indicar que o doente tem EA e, por conseguinte, seria um candidato para o tratamento com um inibidor do TNF. Deste modo, esse doente poderá ser seleccionado para o tratamento com um anticorpo anti-TNFa, por exemplo, o adalimumab, de modo a prevenir os danos estruturais que poderão surgir com a progressão da doença.

Num aspecto do presente invento, o nível de controlo baseia-se no nível de linha de base do biomarcador da degradação da cartilagem e/ou da sinovite do próprio doente, em que o nível de linha de base é determinado antes do tratamento com o inibidor do TNF. Em tal caso, o nível do biomarcador da degradação da cartilagem e/ou da sinovite que é determinado após o tratamento é comparado com o nível de linha de base do doente. Em seguida, determina-se se o inibidor do TNF é ou não eficaz com base no facto de o biomarcador da degradação da cartilagem e/ou da sinovite ter ou não diminuído no doente após o tratamento. Noutro aspecto do presente invento, o nível de linha de base que é utilizado como controlo baseia-se no nível do biomarcador da degradação da cartilagem e/ou da sinovite do próprio doente num dado momento durante o tratamento com o inibidor do TNF, em que o nível de linha de base num dado momento durante o tratamento é comparado com um nível do biomarcador num dado momento posterior enquanto o doente permanece em tratamento.

Num aspecto do presente invento, o nível padrão conhecido baseia-se num nível aceite do biomarcador da degradação da cartilagem e/ou da sinovite associado ao estado de doença, isto é, associado a doente (s) com EA. 0 nível padrão conhecido do nível do biomarcador da degradação da cartilagem e/ou da sinovite poderá basear-se num único doente com EA ou, em alternativa, na média obtida de um grupo de doentes com EA. Por exemplo, o nivel padrão conhecido da MMP-3 sérica para um doente com EA está compreendido entre cerca de 10-200, cerca de 15-180, cerca de 20-140, cerca de 30-120, cerca de 40-100, cerca de 50-80, cerca de 25-57 ou cerca de 26 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ 60-70 ng/ml. Noutro aspecto do presente invento, o nível padrão conhecido do CTX-II urinário para um doente com EA está compreendido entre cerca de 300-1000, cerca de 300-800, cerca de 300-600, cerca de 315-395, cerca de 320-390, cerca de 325-385, cerca de 330-380, cerca de 325-385, cerca de 324-388, cerca de 335-375, cerca de 340-370, cerca de 345-365 ou cerca de 350-360 ng/ml.

Em alternativa, noutro aspecto do presente invento, o nível padrão conhecido poderá basear-se nos níveis do biomarcador da degradação da cartilagem e/ou da sinovite de um sujeito(s) saudável e não afectado. O nível padrão conhecido do nível do biomarcador da degradação da cartilagem e/ou da sinovite poderá basear-se num único sujeito saudável e não afectado ou, em alternativa, numa média de um grupo de sujeitos saudáveis e não afectados. Exemplos de valores normais do CTX-II urinário, isto é, valores de sujeitos saudáveis sem EA, estão descritos em Haima (2005) Osteo Medicai Group Clinicai and Technical Monograph e Mouritzen et ai. (2003) Annals of the Rheumatic Diseases 62:332. Por exemplo, num aspecto do presente invento, o nível padrão conhecido da MMP-3 sérica num sujeito saudável e não afectado está compreendido entre cerca de 13 e 15 ng/ml (ver Chen et al. (2006) Rheumatology 45:414).

Os intervalos intermédios para os níveis de biomarcadores referidos acima, por exemplo, cerca de 323 a cerca de 329 mg/ml de CTX-II urinário, também se destinam a fazer parte deste invento. Adicionalmente, os intervalos de valores utilizando uma combinação de quaisquer uns dos valores referidos acima como limites superiores e/ou inferiores destinam-se a estar incluídos. Além disso, os limites superiores descritos acima não pretendem ser limitativos no que diz respeito a níveis aumentados de MMP-3 e CTX-II em doentes com EA. O nível do biomarcador da degradação da cartilagem e/ou da sinovite é considerado alterado em relação ao controlo, isto é, o nível pré-tratamento do próprio doente ou o nível padrão conhecido, se o nível for superior/tiver aumentado ou for inferior/tiver diminuído em relação ao controlo. Numa concretização, o nível do biomarcador da degradação da 27 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ cartilagem e/ou da sinovite derivado de um doente com EA é considerado superior/aumentado em relação ao nível de controlo se o nível do biomarcador da degradação da cartilagem e/ou da sinovite for superior/tiver aumentado face ao nível de controlo numa quantidade que é maior que o erro padrão do ensaio utilizado para determinar o nível. Numa concretização, o nível do biomarcador da degradação da cartilagem e/ou da sinovite derivado de um doente com EA é considerado inferior/reduzido em relação ao nível de controlo se o nível do biomarcador da degradação da cartilagem e/ou da sinovite for inferior/tiver diminuído face ao nível de controlo numa quantidade que é maior que o erro padrão do ensaio utilizado para determinar o nível. Noutra concretização, o nível do biomarcador da degradação da cartilagem e/ou da sinovite derivado de um doente com a enfermidade pode ser considerado superior/aumentado ou inferior/diminuído em relação ao nível de controlo se a diferença no nível de controlo e no nível do biomarcador da degradação da cartilagem e/ou da sinovite derivado de uma amostra do doente for pelo menos cerca de duas, três, quatro ou cinco vezes maior ou menor que o erro padrão das medições do controlo e da amostra.

Numa concretização, a eficácia do inibidor do TNF é demonstrada quando os níveis de CTX-II para um sujeito com EA diminuem pelo menos cerca de 9% em relação ao nível de linha de base ou ao nível padrão conhecido. Numa concretização, a eficácia do inibidor do TNF é demonstrada quando os níveis de MMP-3 diminuem pelo menos cerca de 8% em relação ao nível de linha de base ou ao nível padrão conhecido para um sujeito com EA. Numa concretização adicional, a eficácia do inibidor do TNF é demonstrada quando os níveis de MMP-3 diminuem pelo menos cerca de 12% em relação ao nível de linha de base ou ao nível padrão conhecido para um sujeito com EA.

Os intervalos intermédios para os níveis de biomarcadores referidos acima, por exemplo, cerca de 8 a cerca de 10%, também se destinam a fazer parte deste invento. Adicionalmente, os intervalos de valores utilizando uma combinação de quaisquer uns dos valores referidos acima como limites superiores e/ou inferiores destinam-se a estar incluídos. Além disso, os limites percentuais superiores 28 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ descritos acima não pretendem ser limitativos no que diz respeito a níveis percentuais reduzidos de MMP-3 e CTX-II em doentes com EA, isto é, as diminuições percentuais maiores também estão contempladas pelo invento. Especificamente, de acordo com uma terceira concretização, o presente invento proporciona um método de determinação da eficácia do adalimumab para o tratamento da espondilite anquilosante (EA) num sujeito com EA, em que o referido método compreende a determinação de um nível de C-telopéptido do colagénio tipo II (CTX-II) pós-tratamento e de um nível de metaloprotease da matriz 3 (MMP3) pós-tratamento em amostra(s) obtida(s) do sujeito com EA, onde um nível de CTX-II pós-tratamento inferior em relação a um nível de CTX-II pré-tratamento e um nível de MMP3 pós-tratamento inferior em relação a um nível de MMP3 pré-tratamento indica que o adalimumab é eficaz para o tratamento da EA no sujeito. Especificamente, de acordo com uma quarta concretização, o presente invento proporciona um método de determinação da eficácia do adalimumab para o tratamento da espondilite anquilosante (EA) num sujeito com EA, em que o referido método compreende a determinação de um nível de C-telopéptido do colagénio tipo II (CTX-II) pós-tratamento em amostra (s) obtida (s) do sujeito com EA, onde uma redução do nível de CTX-II de pelo menos 9% em relação a um nível de CTX-II padrão conhecido baseado em sujeito(s) com EA indica que o adalimumab é eficaz para o tratamento da EA no sujeito.

Biomarcadores da degradação da cartilagem A cartilagem articular é largamente constituída por uma rede fibrilar à base de colagénio tipo II complexada com o proteoglicano agrecano (ver Poole AR, 2003. Rheum Dis Clin North Am 29:803-818 e Eyre (1991) Semin Arthritis Rheum. 21(3 Suppl 2):2-11). Na doença articular, o colagénio tipo II é progressivamente clivado por colagenases. A degradação do colagénio tipo II ocorre de uma forma em que os produtos do processo de degradação distribuem-se por três grupos, de acordo com a localização do epitopo particular na molécula de colagénio (para um artigo de revisão, ver Birmingham et al. (2006) Biomarker Insights 2:61). 29 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

Os diferentes tipos de epitopos, incluindo os neoepitopos e os epitopos dos telopéptidos, podem ser utilizados como indicadores de eventos de degradação associados ao colagénio. 0 colagénio tipo II maduro consiste numa estrutura helicoidal tripla com telopéptidos curtos em ambas as extremidades. Os telopéptidos estão reticulados de modo covalente com outras cadeias de colagénio e servem para ligar as moléculas de colagénio individuais numa rede fibrilar rígida. Quando a matriz extracelular da cartilagem é degradada, geram-se fragmentos de colagénio maduro. Tais fragmentos são encontrados tanto no soro como na urina e podem ser medidos como marcadores do catabolismo da cartilagem. Os telopéptidos incluem o col2CTx e o CTX-II (WO 91/08478; Christgau et al. (2001) Bone 29:209; Matyas et al. (2004) Arthritis Rheum 50:543; e Eyre (1989) "Peptide fragments containing HP and LP cross-links, USP 5702909). A proteólise origina uma perda de epitopos do colagénio tipo II para os fluidos corporais. Por conseguinte, examinando os epitopos do colagénio tipo II nos fluidos corporais, é possível determinar a quantidade de degradação do colagénio (ver Birmingham et al. (2006) Biomarker Insights 2:61 e Christgau et al. (2001) Bone 29:209). A capacidade de monitorizar e de abrandar ou reverter o processo de degradação do colagénio é importante de um ponto de vista clínico, uma vez que a degradação extensa das fibras de colagénio tipo II maduro reticuladas é considerada uma fase crítica, e possivelmente até irreversível, da destruição articular (Billinghurst et al. (1997)). A abordagem aqui descrita utiliza biomarcadores da degradação da cartilagem para determinar a eficácia de um inibidor do TNF para o tratamento da EA, a qual tem uma componente de doença que inclui danos estruturais, isto é, danos articulares. De acordo com as concretizações aqui descritas, o CTX-II, que está localizado quase exclusivamente na cartilagem, é utilizado nos métodos do invento como um biomarcador da decomposição da cartilagem. 30 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

CTX-II

Numa concretização preferida, o biomarcador da degradação do colagénio é o C-telopéptido do colagénio tipo II (CTX-II) . O CTX-II é um fragmento do colagénio que tem origem no colagénio tipo II C-terminal. 0 CTX-II é idêntico ao neoepitopo Col2CTx, encontrado na extremidade C-terminal do fragmento de H de comprimento do colagénio tipo II clivado (para um artigo de revisão, ver Birmingham et al. (2006)). 0 CTX-II é um biomarcador conhecido da degradação da cartilagem. 0 CTX-II foi inicialmente associado à degradação da cartilagem em doentes com osteoartrite no joelho (Garnero et al. (2001) Annals Rheum Dis 60:619), onde a subsequente elevação do CTX-II na urina dos doentes com osteoartrite grave foi determinada (Jung et al. (2004) Pathobiol 71:70). Demonstrou-se também que o CTX-II está correlacionado com o grau de destruição articular (Christgau et al. (2001) Bone 29:209; Garnero & Delmas (2003) Curr Op Rheumat 25:641).

Num aspecto, o presente invento proporciona um método de determinação da eficácia de um inibidor do TNFa para o tratamento da EA num doente, compreendendo a comparação de um nível de CTX-II predeterminado do doente, após tratamento com o inibidor do TNFa, com um nível de CTX-II padrão conhecido associado à EA. Efectua-se depois uma avaliação quanto à relação entre os dois níveis de CTX-II, para determinar se o nível de CTX-II pós-tratamento do doente é ou não inferior ao nível de CTX-II padrão conhecido. Um nível de CTX-II reduzido em relação a um nível padrão conhecido representando o estado de doença da EA indica que o inibidor do TNFa é eficaz para o tratamento da EA no doente. Neste caso, o nível padrão conhecido representaria um nível de CTX-II de um sujeito com actividade de doença EA, isto é, um doente afectado e não tratado.

Especificamente, de acordo com a sua quarta concretização, o presente invento disponibiliza um método de determinação da eficácia do adalimumab para o tratamento da espondilite anquilosante (EA) num sujeito com EA, em que o referido método compreende a determinação de um nível de C-telopéptido do colagénio tipo II (CTX-II) pós-tratamento em 31 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ amostra(s) do sujeito com EA, onde uma diminuição do nível de CTX-II de pelo menos 9% em relação a um nível de CTX-II padrão conhecido baseado em sujeito(s) com EA indica que o adalimumab é eficaz para o tratamento da EA no sujeito.

Noutro aspecto, o invento proporciona um método de determinação da eficácia de um inibidor do TNFa para diminuir os danos estruturais associados à espondilite anquilosante (EA) num doente, compreendendo a comparação de um nível de CTX-II predeterminado do doente com EA, após tratamento com o inibidor do TNFa, com um nível de CTX-II padrão conhecido associado à EA. Efectua-se depois uma avaliação dos dois níveis de CTX-II, para determinar se o nível de CTX-II pós-tratamento do doente é inferior ao nível de CTX-II padrão conhecido. Se o nível de CTX-II do doente for inferior em relação ao nível padrão conhecido, então esse resultado indica que o inibidor do TNFa é eficaz na diminuição dos danos estruturais associados à EA no doente.

Num aspecto, o invento descreve um método de determinação da eficácia de um inibidor do TNFa para o tratamento da EA num doente, compreendendo a comparação de um nível de CTX-II pós-tratamento predeterminado obtido do doente com um nível de CTX-II pré-tratamento predeterminado obtido do doente. Efectua-se depois uma avaliação dos dois níveis de CTX-II para determinar se o nível de CTX-II pós-tratamento é inferior ao nível de CTX-II pré-tratamento, em que um nível de CTX-II pós-tratamento inferior em relação ao nível de CTX-II pré-tratamento indica que o inibidor do TNFa é eficaz para o tratamento da EA no doente.

Biomarcadores da sinovite

Sabe-se hoje que a sinovite (inflamação) ocorre precocemente nas doenças inflamatórias, como a osteoartrite, e está associada à progressão radiológica da doença. 0 processo pelo qual a inflamação, incluindo a inflamação subclínica, pode exacerbar os danos nas articulações envolve provavelmente alterações da função dos condrócitos, uma angiogénese intensificada e/ou um turnover ósseo acelerado (Bonnet & Walsh DA. (2005) Rheumatology 44:7-16). O presente invento utiliza biomarcadores sinoviais para determinar a 32 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ eficácia de um inibidor do TNF para o tratamento da EA. Num aspecto, a MMP-3 sérica, que provavelmente tem origem na articulação inflamada (Kruithof et al. (2005) Arthritis Rheum 52:3898), é utilizada como um biomarcador da sinovite para determinar a eficácia de um inibidor do TNF para o tratamento da EA. MMP-3 A degradação das moléculas da matriz da cartilagem envolve endopeptidases dependentes de zinco, nomeadamente as metaloproteinases da matriz (MMP). As MMP, uma família de endopeptidases dependentes de Zn2+, clivam os constituintes da matriz extracelular (MEC), como os colagénios e os proteoglicanos. As MMP medeiam diferentes processos fisiológicos através da digestão de componentes da matriz extracelular. A MMP3 é uma enzima que degrada a fibronectina, a laminina, os colagénios III, IV, IX e X e os proteoglicanos da cartilagem. Há actualmente pelo menos 20 tipos de MMP humanas, que estão agrupadas de acordo com a respectiva estrutura e substrato específico em: colagenase (MMP-1, 8, 13), estromelisina, gelatinase (MMP-2, 9) e metaloproteinases de ligação à membrana plasmática (ver, por exemplo, Nabeshima K et al. 2002 Pathol Int 52: 255-64).

Num aspecto preferido do presente invento, o biomarcador da sinovite utilizado no invento é a MMP-3. Demonstrou-se que os níveis de MMP-3 sérica estão aumentados nas doenças reumáticas inflamatórias caracterizadas por sinovite das articulações, como a AR, a polimialgia reumática, a artrite psoriática e a artrite cristalina aguda. É aceite que os níveis de MMP-3 sérica reflectem a inflamação sinovial (ver Ribbens et al. (2002) Annals of the Rheumatic Diseases 61:161). Além disso, estudos anteriores correlacionaram as metaloproteinases da matriz (MMP), especificamente a MMP-3 (estromelisina 1), com o valor do índice de Bath de actividade de doença para a espondilite anquilosante em doentes com EA (ver Yang, C. et al. (2004) Arthritis Rheum 51:691-9). 33 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ A sequência de aminoácidos da MMP-3 é conhecida e pode ser encontrada, por exemplo, sob o n.° de acesso do GenBank AAI07491. A sequência de nucleótidos da MMP-3 também é conhecida e pode ser encontrada, por exemplo, sob o n.° de acesso do GenBank NM002422. 0 invento inclui ainda a utilização do biomarcador da degradação da cartilagem, especificamente, o CTX-II, e do biomarcador da sinovite, especificamente, a MMP-3, em que o primeiro é utilizado isoladamente ou em combinação com o segundo, para concretizar os métodos do invento. Além disso, o invento poderá ser utilizado em combinação com a proteína C reactiva, para determinar adicionalmente a eficácia do inibidor do TNF para o tratamento da EA.

Os níveis da proteína C reactiva (PCR) poderão ser utilizados em combinação com um biomarcador da degradação da cartilagem, por exemplo, o CTX-II, e o biomarcador da sinovite, por exemplo, a MMP-3, como um indicador do estado de doença da EA e da eficácia de uma dada terapia anti-TNF. A proteína PCR pertence à família das pentraxinas, assim denominada pois tem cinco subunidades idênticas, codificadas por um único gene no cromossoma 1, que se associam para formar uma estrutura pentamérica estável semelhante a um disco. A PCR é produzida exclusivamente no fígado e é segregada em quantidades acrescidas no espaço de 6 horas de um estímulo inflamatório agudo. Os níveis elevados de PCR proporcionam um índice sensível da inflamação em curso e, deste modo, fornecem um complemento valioso para uma avaliação clínica cuidadosa.

Ensaios para determinação do nível dos biomarcadores 0 nível de um biomarcador da degradação da cartilagem e/ou da sinovite numa amostra pode ser analisado por uma variedade de metodologias conhecidas na técnica. Uma vez a amostra obtida do doente, é possível usar qualquer método adequado conhecido na técnica para a detecção e a quantificação de um biomarcador da degradação da cartilagem ou da sinovite destinado a utilização nos métodos do invento (quer ao nível do ácido nucleico ou, preferencialmente, da proteína). Tais métodos são bem conhecidos na técnica e 34 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ incluem, embora não estejam limitados a estes, as transferências de Western, as transferências de Northern, as transferências de Southern, a imuno-histoquimica, os ensaios ELISA, por exemplo, um ELISA amplificado, os ensaios sanguíneos quantitativos, por exemplo, um ELISA sérico, os ensaios quantitativos baseados em urina, por exemplo, para examinar os niveis de expressão ou de degradação de proteína no caso do CTX-II, a imunoprecipitação, a imunofluorescência, a citometria de fluxo, a imunocitoquímica, as análises de espectrometria de massa, por exemplo, MALDI-TOF e SELDI-TOF, as técnicas de hibridação de ácidos nucleicos, os métodos de transcrição inversa de ácidos nucleicos e os métodos de amplificação de ácidos nucleicos. Exemplos destes ensaios estão descritos em maior pormenor abaixo.

Ensaios baseados em proteína

Os métodos do invento poderão ser executados utilizando ensaios baseados em proteína para determinar o nível do dado biomarcador. Os exemplos de ensaios baseados em proteína incluem as análises imuno-histoquímicas e/ou de Western, os ensaios sanguíneos quantitativos, por exemplo, o ELISA sérico, e os ensaios quantitativos baseados em urina, por exemplo, o ELISA em urina. Numa concretização, um imunoensaio é efectuado para fornecer uma análise quantitativa do dado biomarcador.

As proteínas das amostras do doente podem ser isoladas utilizando técnicas que são bem conhecidas pelos peritos. Os métodos de isolamento de proteínas empregues podem ser, por exemplo, como aqueles descritos em Harlow e Lane (Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). A quantidade do biomarcador da degradação da cartilagem ou da sinovite poderá ser determinada por detecção ou quantificação do polipéptido expresso correspondente. 0 polipéptido pode ser detectado e quantificado por qualquer um de vários meios conhecidos pelos peritos. Estes poderão incluir métodos bioquímicos analíticos, como a electroforese, a electroforese capilar, a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) , a cromatografia de camada fina (TLC), a 35 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ cromatografia de hiperdifusão e similares, ou vários métodos imunológicos, como as reacções de precipitina em gel ou liquido, a imunodifusão (simples ou dupla), a imunoelectroforese, o radioimunoensaio (RIA), os ensaios imunossorventes ligados a enzima (ELISA), os ensaios imunofluorescentes e a transferência de Western.

Numa concretização, o nivel do biomarcador da degradação da cartilagem ou da sinovite poderá ser determinado utilizando um imunoensaio. A utilização de anticorpos dirigidos para os biomarcadores aqui descritos pode ser utilizada para pesquisar amostras biológicas humanas, por exemplo, fluidos, relativamente aos níveis do antigénio biomarcador específico, isto é, os biomarcadores da degradação do colagénio e/ou da sinovite. A título ilustrativo, os fluidos humanos, como o soro sanguíneo ou a urina, podem ser recolhidos de um doente e analisados relativamente a um epitopo específico, quer como antigénio libertado quer ligado à membrana em células presentes no fluido de amostra, utilizando anticorpos anti-biomarcador, em ensaios RIA ou ELISA padrão conhecidos na técnica. Os anticorpos utilizados em tais métodos são preferencialmente anticorpos monoclonais. Numa concretização, a avaliação imunosserológica in vitro de soros recolhidos dos doentes permite uma determinação não invasiva da progressão ou da redução da degeneração da cartilagem, assim como de um aumento ou de uma diminuição da sinovite com base nos níveis serológicos dos biomarcadores correspondentes. Numa concretização, efectua-se um imunoensaio para determinação quantitativa da degradação da cartilagem, medindo o nível de CTX-II na urina humana. Numa concretização, realiza-se um imunoensaio para determinação quantitativa da sinovite, medindo o nível de MMP-3 no soro humano.

Nos imunoensaios, o agente para detectar um polipéptido do biomarcador da degradação da cartilagem ou da sinovite poderá ser um anticorpo capaz de se ligar à proteína do biomarcador da degradação da cartilagem ou da sinovite. Os anticorpos podem ser policlonais ou, mais preferencialmente, monoclonais. Um anticorpo intacto, ou um seu fragmento (por exemplo, Fab ou F(ab')2), pode ser utilizado. 36 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

Numa concretização, os anticorpos dirigidos para CTX-II, incluindo o CTX-II urinário, são utilizados em imunoensaios, por exemplo, ensaios ELISA, para determinar o nivel de CTX-II numa amostra de um doente com EA. Numa concretização, os niveis de CTX-II podem ser medidos em amostras quer de urina quer de soro de um doente. Numa concretização, um anticorpo que poderá ser utilizado nos métodos e composições do invento para a detecção e a quantificação do CTX-II urinário humano é o anticorpo monoclonal F46 (ver Christgau et al. (2001) Bone 29:209) e F4601 (ver Oestergaard et al. (2006) Osteoarthritis Cartilage. 14(7):670).

Numa concretização, os anticorpos dirigidos para MMP-3, incluindo a MMP-3 sérica, são utilizados em imunoensaios, por exemplo, ensaios ELISA, para determinar o nivel de MMP-3 numa amostra de um doente com EA. Numa concretização, a MMP-3 pode ser medida em amostras séricas do doente. Numa concretização, um anticorpo para a detecção e a quantificação da MMP-3 sérica humana é o anticorpo monoclonal 1B4 (Murray GI et al. Gut 43:791-7 (1998)) .

Os ensaios de ligação competitiva poderão ser utilizados para determinar o nível da proteína correspondente ao biomarcador da degradação do colagénio e/ou da sinovite. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um ensaio imunossorvente ligado a enzima em sanduíche (ELISA). O ensaio ELISA pode ser utilizado para detectar a presença do biomarcador da degradação do colagénio e/ou da sinovite numa amostra. O ensaio ELISA é um imunoensaio sensível que utiliza uma enzima ligada a um anticorpo ou um antigénio como marcador para a detecção de uma proteína específica, especialmente um antigénio ou um anticorpo. O ensaio ELISA é um ensaio em que o antigénio ou o anticorpo preso é detectado por uma enzima ligada, que geralmente converte um substrato incolor num produto colorido ou num produto que pode ser detectado. Um dos tipos de ELISA mais comuns é o "ensaio ELISA em sanduíche". Numa concretização, o nível do biomarcador da degradação da cartilagem e/ou da sinovite é determinado utilizando um ensaio ELISA.

Além disso, um perito pode adaptar facilmente os métodos de detecção de proteínas/anticorpos conhecidos para 37 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ utilização na determinação da quantidade de um marcador do presente invento (isto é, CTX-II e/ou MMP-3).

Os métodos de análise do CTX-II como um biomarcador da destruição das articulações são conhecidos na técnica e estão descritos, por exemplo, em Oestergaard et al. (2006) Osteoarthritis Cartilage. 14(7):670 e Mouritzen et al. (2003) Annals of the Rheumatic Diseases 62:332, aqui incorporados através de referência. Estão disponíveis comercialmente ensaios para determinação dos níveis de CTX-II, incluindo, por exemplo, Urine Cartilaps® e Serum Cartilaps® (Nordic Bioscience Diagnostics). O ensaio Urine Cartilaps® tem sido utilizado em estudos clínicos para a avaliação quantitativa da degradação da cartilagem na artrite reumatóide e na osteoartrite. Por exemplo, o ensaio ELISA Urine CartiLaps® baseia-se na ligação competitiva de um anticorpo monoclonal a fragmentos urinários do colagénio tipo II, isto é, CTX-II, ou a péptidos sintéticos biotinilados presos na superfície de placas de microtitulação revestidas com estreptavidina. Inicialmente, os péptidos sintéticos biotinilados são presos na superfície de poços revestidos com estreptavidina da placa de microtitulação. Após lavagem, os padrões, os controlos e as amostras de urina são pipetados para os poços depois da adição de uma solução do anticorpo monoclonal. Os poços são lavados e adiciona-se uma solução de anticorpo (coelho) anti-imunoglobulina de ratinho conjugado com peroxidase aos poços. Após o segundo passo de lavagem, adiciona-se um substrato cromogénico a todos os poços, para-se a reacção colorida com ácido sulfúrico e mede-se a absorvância. Exemplos adicionais de como analisar o CTX-II utilizando ensaios ELISA estão descritos em Christgau (2001 Bone 29:209).

Numa concretização, realiza-se um imunoensaio para determinar o nivel do biomarcador da sinovite MMP-3 no soro humano. Os métodos de análise da MMP-3 como um biomarcador da sinovite são conhecidos na técnica e estão descritos, por exemplo, em Tamarat et al. (2003) PNAS 100: 8555. Além disso, os kits comerciais disponíveis para determinação dos níveis da proteína MMP-3 incluem o sistema Human Matrix Metalloproteinase-3 Biotrak ELISA (Amersham) (ver também Yang et al. (2004) Arthritis and Rheumatism 51:691). Exemplos 38 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ adicionais descrevendo como analisar a proteína MMP-3 estão referidos em Chen et al. (2006) Rheumatology 45:414.

Numa concretização, os anticorpos, ou fragmentos de anticorpos, são utilizados em métodos como a transferência de Western ou em técnicas de imunofluorescência para detectar as proteínas expressas. Em tais casos, geralmente é preferível imobilizar o anticorpo ou as proteínas num suporte sólido. Os suportes adeguados de fase sólida incluem gualguer suporte capaz de ligar um antigénio ou um anticorpo. Os suportes bem conhecidos incluem o vidro, o poliestireno, o polipropileno, o polietileno, o dextrano, o nylon, as amilases, as celuloses naturais e modificadas, as poliacrilamidas, o gabro e a magnetite.

Um perito conhecerá muitos outros suportes adequados para ligar o anticorpo ou o antigénio e será capaz de adaptar esse suporte para utilização no presente invento. Por exemplo, uma proteína isolada a partir de células pode ser corrida em electroforese em gel de poliacrilamida e imobilizada num suporte de fase sólida como a nitrocelulose. O suporte pode depois ser lavado com tampões apropriados, seguido de tratamento com o anticorpo marcado de forma detectável. 0 suporte de fase sólida pode depois ser lavado uma segunda vez com o tampão para remover o anticorpo não ligado. A quantidade de marcador ligado no suporte sólido pode, em seguida, ser detectada por meios convencionais. Os meios de detecção de proteínas utilizando técnicas electroforéticas são bem conhecidos pelos peritos (ver, de uma forma geral, R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.).

Outros métodos padrão que utilizam anticorpos para detectar e quantificar os marcadores da degradação do colagénio e/ou da sinovite incluem, embora não estejam limitados a estes, os radioimunoensaios ("RIA"), os ensaios de receptores, os imunoensaios enzimáticos ("EIA"), os bioensaios citoquímicos, os ensaios de ligandos, os ensaios imunorradiométricos, os fluoroimunoensaios e os ensaios imunossorventes ligados a enzima ("ELISA"). Um método 39 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ adicional inclui, para facilidade de detecção e pela sua natureza quantitativa, o ensaio em sanduíche ou de duplo anticorpo, do qual existem algumas variações, em que todas elas se destinam a estar enqlobadas no presente invento. Estes métodos são bem conhecidos, e os peritos compreenderão que requerem uma quantidade razoável de experimentação para optimizar a interacção entre os anticorpos e os antigénios e a detecção dos antigénios pelos anticorpos. Estas e outras técnicas de imunoensaio poderão ser encontradas em Principies And Practice Of Immunoassay, 2nd Edition, Price and Newman, eds., MacMillan (1997) e em Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Ch. 9 (1988).

Os anticorpos utilizados em imunoensaios conhecidos na técnica e aqui descritos para determinar os níveis de biomarcadores poderão ser marcados com um marcador detectável. 0 termo "marcado", relativamente à sonda ou ao anticorpo, pretende englobar a marcação directa da sonda ou do anticorpo por acoplamento (isto é, ligação física) de uma substância detectável à sonda ou ao anticorpo, assim como a marcação indirecta da sonda ou do anticorpo por reactividade com outro reagente que está marcado directamente. Os exemplos de marcação indirecta incluem a detecção de um anticorpo primário utilizando um anticorpo secundário marcado de forma fluorescente, e a marcação terminal de uma sonda de ADN com biotina de modo a poder ser detectada com estreptavidina marcada de forma fluorescente.

Numa concretização, o anticorpo está marcado, por exemplo, um anticorpo marcado radioactivamente, marcado com um cromóforo, marcado com um fluoróforo ou marcado enzimaticamente. Noutra concretização, um derivado do anticorpo (por exemplo, um anticorpo conjugado com um substrato ou com a proteína ou o ligando de um par proteína-ligando (por exemplo, biotina-estreptavidina)) ou um fragmento do anticorpo (por exemplo, um anticorpo de cadeia única, um domínio hipervariável de um anticorpo isolado, etc.) que se liga especif icamente a uma proteína do biomarcador da degradação da cartilagem ou da sinovite. 40 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

Numa concretização do invento, os métodos proteómicos, por exemplo, a espectrometria de massa, são utilizados para detectar e quantificar o biomarcador da degradação da cartilagem ou da sinovite. Por exemplo, a espectrometria de massa com análise do tempo de voo e ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF) ou a espectrometria de massa com análise do tempo de voo e ionização/dessorção a laser em superfície melhorada (SELDI-TOF MS), que envolvem a aplicação de uma amostra biológica, como o soro, num chip que liga proteínas (Wright, G.L., Jr., et al. (2002) Expert Rev Mol Diagn 2:549; Li, J., et al. (2002) Clin Chem 48:1296; Laronga, C., et al. (2003) Dis Markers 19:229; Petricoin, E.F., et al. (2002) 359:572; Adam, B.L., et al. (2002) Câncer Res 62:3609; Tolson, J., et al. (2004) Lab Invest 84:845; Xiao, Z., et al. (2001) Câncer Res 61:6029), podem ser utilizadas para detectar e quantificar o biomarcador da degradação da cartilagem ou da sinovite. Os métodos de espectrometria de massa estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. n.os 5,622,824, 5,605,798 e 5,547,835.

ARN

Numa concretização, o nível de um ARNm que codifica o referido biomarcador pode ser medido utilizando métodos conhecidos pelos peritos, por exemplo, a análise de Northern. A expressão génica do biomarcador pode ser detectada ao nível do ARN. O ARN poderá ser extraído das células utilizando técnicas de extracção de ARN, incluindo, por exemplo, a utilização da extracção com isotiocianato de guanidina/fenol (RNAzol B; Biogenesis), os kits de preparação de ARN RNeasy (Qiagen) ou PAXgene (PreAnalytix, Suíça). Os formatos de ensaio típicos utilizando a hibridação de ácido ribonucleico incluem os ensaios de run-on nuclear, a reacção de RT-PCR, os ensaios de protecção da ARNase (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), a transferência de Northern e a hibridação in situ. A expressão génica também pode ser detectada pela análise de microarrays como descrito abaixo.

Para a transferência de Northern, as amostras de ARN são primeiro separadas em termos de tamanho por electroforese num gel de agarose em condições desnaturantes. O ARN é depois transferido para uma membrana, reticulado e hibridado com uma 41 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ sonda marcada. É possível utilizar sondas não isotópicas ou sondas radiomarcadas de alta actividade específica, incluindo sondas de ADN geradas via iniciadores aleatórios, por nick translation ou por PCR, sondas de ARN transcritas in vitro e oligonucleótidos. Adicionalmente, é possível utilizar sequências com uma homologia apenas parcial (por exemplo, ADNc de uma espécie diferente ou fragmentos de ADN genómicos que podem conter um exão) como sondas.

Os ensaios de protecção das nucleases (NPA; incluindo os ensaios de protecção da ribonuclease e os ensaios da nuclease Sl) proporcionam um método extremamente sensível para a detecção e a quantificação de ARNm específicos. A base dos NPA é a hibridação em solução de uma sonda anti-senso (radiomarcada ou não isotópica) com uma amostra de ARN. Após a hibridação, a sonda de cadeia simples não hibridada e o ARN são degradados pelas nucleases. Os restantes fragmentos protegidos são separados num gel de acrilamida. Os NPA permitem a detecção simultânea de várias espécies de ARN. A hibridação in situ é uma ferramenta versátil e poderosa para a localização de ARNm específicos em células ou tecidos. A hibridação da sonda tem lugar na célula ou no tecido. Como a estrutura celular é preservada ao longo do procedimento, a hibridação in situ fornece informações sobre a localização do ARNm dentro da amostra de tecido. 0 procedimento inicia-se com a fixação das amostras em formalina tamponada de forma neutra e a inclusão do tecido em parafina. As amostras são depois cortadas em secções finas e montadas em lâminas de microscópio. (Em alternativa, o tecido pode ser seccionado, congelado e pós-fixado em paraformaldeído.) Após uma série de lavagens para remover a parafina e reidratar as secções, efectua-se uma digestão com Proteinase K para aumentar a acessibilidade para a sonda, e uma sonda marcada é depois hibridada com as secções da amostra. As sondas radiomarcadas são visualizadas com filme líquido seco sobre as lâminas, ao passo que as sondas marcadas de forma não isotópica são convenientemente detectadas com reagentes colorimétricos ou fluorescentes. Este último método de detecção é a base da hibridação in situ fluorescente (FISH). 42 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

Os métodos de detecção que podem ser empregues incluem os marcadores radioactivos, os marcadores enzimáticos, os marcadores quimioluminescentes, os marcadores fluorescentes e outros marcadores adequados.

Tipicamente, a reacção de RT-PCR é utilizada para amplificar alvos de ARN. Neste processo, a enzima transcriptase inversa é utilizada para converter o ARN em ADN complementar (ADNc), que pode depois ser amplificado para facilitar a detecção. A reacção de RT-PCR quantitativa relativa envolve a amplificação de um controlo interno em simultâneo com o gene de interesse. 0 controlo interno é utilizado para normalizar as amostras. Uma vez normalizadas, é possivel efectuar comparações directas da abundância relativa de um ARNm especifico através das amostras. Os controlos internos normalmente utilizados incluem, por exemplo, GAPDH, HPRT, actina e a ciclofilina.

Conhecem-se muitos métodos de amplificação de ADN, a maior parte dos quais assenta numa reacção enzimática em cadeia (como uma reacção da polimerase em cadeia, uma reacção da ligase em cadeia ou uma replicação de sequência auto-sustentada) ou na replicação da totalidade ou de parte do vector no qual foi clonado.

Muitos métodos de amplificação do alvo e de sinal (TAS) foram descritos na literatura e revisões gerais destes métodos estão, por exemplo, em Landegren, U. et al., Science 242:229-237 (1988) e em Lewis, R., Genetic Engineering News 10:1, 54-55 (1990). A reacção de PCR é um método de amplificação de ácidos nucleicos comum na técnica e descrito, entre outros, nas Patentes U.S. n.os 4,683,195 e 4,683,202. A reacção de PCR pode ser utilizada para amplificar qualquer ácido nucleico conhecido num contexto de diagnóstico (Mok et al., 1994, Gynaecologic Oncology 52:247-252). A replicação de sequência auto-sustentada (3SR) é uma variação de TAS, que envolve a amplificação isotérmica de um molde de ácido nucleico via ciclos sequenciais de actividades de transcriptase inversa (RT), polimerase e nuclease que são mediados por um cocktail de enzimas e iniciadores oligonucleotidicos apropriados (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:1874). A reacção de amplificação por 43 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

ligação ou ο sistema de amplificação por ligação utiliza a ADN-ligase e quatro oligonucleótidos, dois por cadeia-alvo. Esta técnica é descrita por by Wu, D. Y. & Wallace, R. B., 1989, Genomics 4:560. Na técnica da replicase Qbeta, a replicase de ARN do bacteriófago Qbeta, que replica ARN de cadeia simples, é utilizada para amplificar o ADN-alvo, como descrito por Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197. A reacção de PCR quantitativa (Q-PCR) é uma técnica que permite a determinação de quantidades relativas de transcritos numa amostra.

III. Inibidores do TNF

Este invento descreve um método de determinação da eficácia de um inibidor do TNFa, por exemplo, um anticorpo para o TNFa humano ou uma sua parte de ligação ao antigénio, para tratar a espondilite anquilosante (EA) . O invento também disponibiliza um método de monitorização da eficácia de um inibidor do TNFa, por exemplo, um anticorpo para o TNFa humano ou uma sua parte de ligação ao antigénio, para diminuir a progressão dos danos estruturais associados à espondilite anquilosante (EA) num doente. O invento inclui ainda um método de previsão da eficácia de um inibidor do TNFa, por exemplo, um anticorpo para o TNFa humano ou uma sua parte de ligação ao antigénio, para o tratamento da EA num doente. As composições e os kits relacionados com os métodos aqui descritos também estão contemplados como parte do invento.

Num aspecto, estes métodos incluem a determinação da eficácia de anticorpos humanos isolados, ou suas partes de ligação ao antigénio, que se ligam ao TNFa humano com alta afinidade e uma velocidade de dissociação baixa e possuem uma capacidade neutralizante elevada. De preferência, os anticorpos humanos utilizados no presente invento são anticorpos anti-hTNFa humanos neutralizantes recombinantes. O anticorpo neutralizante recombinante do invento é aqui designado por D2E7, também denominado HUMIRA® e adalimumab (a sequência de aminoácidos da região VL de D2E7 está apresentada na SEQ ID NO: 1; e a sequência de aminoácidos da região VH de D2E7 está apresentada na SEQ ID NO: 2) . As propriedades de D2E7 (adalimumab/HUMIRA®) foram descritas em 44 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

Salfeld et al., Patentes U.S. n.os 6, 090,382, 6,258,562 e 6,509,015.

Os métodos do presente invento também podem ser executados utilizando anticorpos anti-hTNFa murinos humanizados e quiméricos, que foram submetidos a ensaios clínicos para o tratamento da artrite reumatóide (ver, por exemplo, Elliott, M.J., et al. (1994) Lancet 344:1125-1127;

Elliot, M.J., et al. (1994) Lancet 344:1105-1110; Rankin, E.C., et al. (1995) Br. J. Rheumatol. 34:334-342).

Numa concretização, o método do invento inclui a determinação da eficácia de anticorpos e partes de anticorpos D2E7, anticorpos relacionados com D2E7 e partes de anticorpos relacionados com D2E7 e outros anticorpos humanos e partes de anticorpos humanos com propriedades equivalentes a D2E7, como seja uma alta afinidade de ligação para hTNFa com uma cinética de dissociação baixa e uma capacidade neutralizante elevada, para o tratamento da EA. Numa concretização, o invento fornece um tratamento com um anticorpo humano isolado, ou uma sua parte de ligação ao antigénio, que se dissocia do TNFa humano com uma Kd de 1 x 10“8 M ou inferior e uma contante de velocidade Koff de 1 x 10“3 s_1 ou inferior, ambas determinadas por ressonância de plasma de superfície, e neutraliza a citotoxicidade do TNFa humano, num ensaio L929 in vitro padrão, com uma IC5o de 1 x 10“7 M ou inferior. Mais preferencialmente, o anticorpo humano isolado, ou uma sua parte de ligação ao antigénio, dissocia-se do TNFa humano com uma Koff de 5 x 1CT4 s~4 ou inferior ou, ainda mais preferencialmente, com uma KQff de 1 x IO-4 s~4 ou inferior. Mais preferencialmente, o anticorpo humano isolado, ou uma sua parte de ligação ao antigénio, neutraliza a citotoxicidade do TNFa humano, num ensaio L929 in vitro padrão, com uma IC50 de 1 x 1CT8 M ou inferior, ainda mais preferencialmente com uma IC50 de 1 x IO-9 M ou inferior e mais preferencialmente ainda com uma IC50 de 1 x 10_1° M ou inferior. Numa concretização preferida, o anticorpo é um anticorpo recombinante humano isolado ou uma sua parte de ligação ao antigénio. É bem conhecido na técnica que os domínios CDR3 das cadeias leve e pesada dos anticorpos desempenham um papel 45 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ importante na especificidade/afinidade de ligação de um anticorpo para um antigénio. Por conseguinte, noutro aspecto, o invento refere-se a métodos de previsão da resposta de um doente a um tratamento para a EA, em que o tratamento compreende a administração de anticorpos humanos que possuem cinéticas de dissociação baixas para a associação com hTNFa e têm dominios CDR3 das cadeias leve e pesada que estruturalmente são idênticos ou estão relacionados com aqueles de D2E7. A posição 9 do dominio CDR3 de VL de D2E7 pode ser ocupada por Ala ou Thr, sem afectar substancialmente a Koff. Assim, um motivo de consenso para a região CDR3 de VL de D2E7 compreende a sequência de aminoácidos: Q-R-Y-N-R-A-P-Y- (T/A) (SEQ ID NO: 3). Adicionalmente, a posição 12 do dominio CDR3 de VH de D2E7 pode ser ocupada por Tyr ou Asn, sem afectar substancialmente a Koff. Deste modo, um motivo de consenso para a região CDR3 de VH de D2E7 compreende a sequência de aminoácidos: V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID NO: 4). Além disso, conforme demonstrado no Exemplo 2 da Patente U.S. n.° 6,090,382, o dominio CDR3 das cadeias leve e pesada de D2E7 é receptivo à substituição por um único resíduo de alanina (na posição 1, 4, 5, 7 ou 8 do CDR3 de VL ou na posição 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11 do CDR3 de VH) , sem afectar substancialmente a KQff. Ainda adicionalmente, o perito compreenderá que, dada a receptividade dos domínios CDR3 de VL e VH de D2E7 a substituições por alanina, pode ser possível a substituição de outros aminoácidos nos domínios CDR3, ainda com preservação da constante de velocidade de dissociação baixa do anticorpo, em particular substituições com aminoácidos conservativos. Preferencialmente, não são feitas mais de uma a cinco substituições conservativas de aminoácidos nos domínios CDR3 de VL e/ou VH de D2E7. Mais preferencialmente, não são feitas mais de uma a três substituições conservativas de aminoácidos nos domínios CDR3 de VL e/ou VH de D2E7. Adicionalmente, as substituições conservativas de aminoácidos não devem ser feitas em posições de aminoácidos críticas para a ligação a hTNFa. As posições 2 e 5 do domínio CDR3 de VL de D2E7 e as posições 1 e 7 do domínio CDR3 de VH de D2E7 parecem ser críticas para a interacção com hTNFa e, deste modo, as substituições conservativas de aminoácidos não são preferencialmente efectuadas nestas posições (embora uma substituição por alanina na posição 5 do domínio CDR3 de VL de D2E7 seja 46 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ aceitável, como descrito acima) (ver Patente U.S. n.° 6, 090,382) .

Por conseguinte, noutra concretização, o invento proporciona métodos de determinação da eficácia de um tratamento para a EA, compreendendo a administração de um anticorpo humano isolado, ou uma sua parte de ligação ao antigénio. O anticorpo ou uma sua parte de ligação ao antigénio apresenta preferencialmente as seguintes caracteristicas: a) dissocia-se do TNFa humano com uma constante de velocidade K0ff de 1 x 10 3 s 1 ou inferior, conforme determinada por ressonância de plasma de superfície; b) possui um domínio CDR3 de cadeia leve compreendendo a seguência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, ou modificada a partir da SEQ ID NO: 3 por uma única substituição de alanina na posição 1, 4, 5, 7 ou 8 ou por uma a cinco substituições conservativas de aminoácidos nas posições 1, 3, 4, 6, 7, 8 e/ou 9; c) possui um domínio CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, ou modificada a partir da SEQ ID NO: 4 por uma única substituição de alanina na posição 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11 ou por uma a cinco substituições conservativas de aminoácidos nas posições 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 e/ou 12.

Mais preferencialmente, o anticorpo, ou uma sua parte de ligação ao antigénio, dissocia-se do TNFa humano com uma Koff de 5 x 10“4 s~4 ou inferior. Ainda mais preferencialmente, o anticorpo, ou uma sua parte de ligação ao antigénio, dissocia-se do TNFa humano com uma Koff de 1 x IO”4 s”1 ou inferior.

Ainda noutra concretização, o invento proporciona métodos de determinação da eficácia de um tratamento para a EA, compreendendo a administração de um anticorpo humano isolado, ou uma sua parte de ligação ao antigénio. O anticorpo, ou a sua parte de ligação ao antigénio, contém preferencialmente uma região variável de cadeia leve (VL) possuindo um domínio CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, ou modificada a partir da SEQ ID 47 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ ΝΟ: 3 por uma única substituição de alanina na posição 1, 4, 5, 7 ou 8, e uma região variável de cadeia pesada (VH) possuindo um domínio CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, ou modificada a partir da SEQ ID NO: 4 por uma única substituição de alanina na posição 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11. Preferencialmente, a VL contém ainda um domínio CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 (isto é, a CDR2 de VL de D2E7) e a VH contém ainda um domínio CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 (isto é, a CDR2 de VH de D2E7) . Ainda mais preferencialmente, a VL contém ainda um domínio CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (isto é, a CDR1 de VL de D2E7) e a VH contém um domínio CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 (isto é, a CDR1 de VH de D2E7) . As regiões framework para a VL são preferencialmente da família VKI da linha germinal humana, mais preferencialmente do gene Vk A20 da linha germinal humana, ainda mais preferencialmente das sequências framework da VL de D2E7 apresentadas nas Figuras IA e 1B da Patente U.S. n.° 6, 090,382 . As regiões framework para a VH são preferencialmente da família VH3 da linha germinal humana, mais preferencialmente do gene VH DP-31 da linha germinal humana, ainda mais preferencialmente das sequências framework da VH de D2E7 apresentadas nas Figuras 2A e 2B da Patente U.S. n.° 6,090,382.

Por conseguinte, noutra concretização, o invento disponibiliza métodos de determinação da eficácia de um tratamento da EA, em que o tratamento compreende a administração de um anticorpo humano isolado, ou uma sua parte de ligação ao antigénio. O anticorpo ou a sua parte de ligação ao antigénio contém uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (isto é, a VL de D2E7) e uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 (isto é, a VH de D2E7) . Em determinadas concretizações, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada, tal como uma região constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD. Preferencialmente, a região constante de cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada de IgGl ou uma região constante de cadeia pesada de IgG4. Adicionalmente, o anticorpo pode compreender 48 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ uma região constante de cadeia leve, seja ela uma região constante de cadeia leve capa ou uma região constante de cadeia leve lambda. Preferencialmente, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia leve capa. Em alternativa, a parte do anticorpo pode ser, por exemplo, um fragmento Fab ou um fragmento Fv de cadeia única.

Ainda noutras concretizações, o invento disponibiliza métodos de determinação da eficácia de um tratamento para a EA, em que o tratamento compreende a administração de um anticorpo humano isolado, ou de uma sua parte de ligação ao antigénio, contendo domínios CDR3 de VL e VH relacionados com D2E7. Por exemplo, anticorpos, ou suas partes de ligação ao antigénio, com uma região variável de cadeia leve (VL) possuindo um domínio CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 2 6 ou com uma região variável de cadeia pesada (VH) possuindo um domínio CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada entre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 35.

Noutra concretização, o método do presente invento inclui a determinação da eficácia de um tratamento para a EA, em que o tratamento compreende a administração de um inibidor do TNFa, incluindo, embora não limitado a, um anticorpo anti-TNFa, ou um seu fragmento, incluindo o infliximab (Remicade®, Johnson & Johnson; descrito na Patente U.S. n.° 5,656,272), o CDP571 (um anticorpo IgG4 monoclonal humanizado anti-TNFa), o CDP 870 (um fragmento de anticorpo monoclonal humanizado anti-TNFa) , um dAb anti-TNF (Peptech) , o CNTO 148 (golimumab; Medarex e Centocor, ver WO 02/12502) e o adalimumab (Humira® Abbott Laboratories, um anticorpo monoclonal humano anti-TNF, descrito em US 6,090,382 como D2E7 e empregue pelo presente invento). Outros exemplos incluem o etanercept (descrito em WO 91/03553 e em WO 09/406476), um receptor solúvel de TNF de tipo I, um receptor 49 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ solúvel peguilado de TNF de tipo I (PEG TNF-R1) ou o p55TNFRlgG (Lenercept). Noutra concretização, o inibidor do TNFoí é uma proteína de ligação a TNF recombinante (r-TBP-I) (Serono). 0 anticorpo para TNFa utilizado nos métodos e composições da presente descrição e deste invento poderá ser modificado para um tratamento melhorado da EA. Em algumas concretizações, o anticorpo para TNFa, ou seus fragmentos de ligação ao antigénio, é modificado quimicamente para fornecer um efeito desejado. Por exemplo, a peguilação de anticorpos e de fragmentos de anticorpos da presente descrição e do presente invento pode ser efectuada por qualquer uma das reacções de peguilação conhecidas na técnica, como descrito, por exemplo, nas seguintes referências: Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992); EP 0 154 316; e EP 0 401 384.

Preferencialmente, a peguilação é executada via uma reacção de acilação ou uma reacção de alquilação com uma molécula de polietilenoglicol reactiva (ou um polímero solúvel em água reactivo análogo). Um polímero solúvel em água preferido para a peguilação dos anticorpos e fragmentos de anticorpos da presente descrição e do presente invento é o polietilenoglicol (PEG) . Tal como aqui utilizado, o termo "polietilenoglicol" pretende englobar qualquer uma das formas do PEG que têm sido utilizadas para derivatizar outras proteínas, como seja o monoalcoxi(C1-C10)polietilenoglicol ou o monoariloxi(C1-C10)polietilenoglicol.

Os métodos de preparação de anticorpos e fragmentos de anticorpos peguilados da presente descrição e do presente invento compreenderão geralmente as etapas de (a) reacção do anticorpo ou fragmento de anticorpo com polietilenoglicol, por exemplo um éster reactivo ou um derivado aldeídico de PEG, em condições nas quais o anticorpo ou fragmento de anticorpo fica ligado a um ou mais grupos PEG e (b) obtenção dos produtos da reacção. Para um perito na técnica, será evidente seleccionar as condições de reacção óptimas ou as reacções de acilação com base em parâmetros conhecidos e no resultado desejado. 50 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

Os anticorpos e fragmentos de anticorpos peguilados poderão geralmente ser utilizados para tratar a EA, por meio da administração dos anticorpos e fragmentos de anticorpos para TNFa aqui descritos. Geralmente, os anticorpos e fragmentos de anticorpos peguilados têm uma semivida maior em comparação com os anticorpos e fragmentos de anticorpos não peguilados. Os anticorpos e fragmentos de anticorpos peguilados poderão ser utilizados sozinhos, em conjunto ou em combinação com outras composições farmacêuticas.

Ainda noutra concretização da presente descrição e do presente invento, os anticorpos para TNFa ou seus fragmentos podem ser alterados, em que a região constante do anticorpo é modificada para reduzir pelo menos uma função efectora biológica mediada pela região constante, em relação a um anticorpo não modificado. Para modificar um anticorpo da presente descrição e do presente invento de modo a este exibir uma ligação reduzida ao receptor Fc, o segmento da região constante de imunoglobulina do anticorpo pode ser mutado em regiões particulares necessárias para as interacções com o receptor Fc (FcR) (ver, por exemplo, Canfield, S.M. & S.L. Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491; e Lund, J. et al. (1991) J. of Immunol. 147:2657-2662). A redução da capacidade de ligação a FcR do anticorpo também poderá reduzir outras funções efectoras que assentam nas interacções com FcR, tais como a opsonização e a fagocitose e a citotoxicidade celular dependente de antigénio.

Um anticorpo ou parte de anticorpo utilizado nos métodos da presente descrição e do presente invento pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional (por exemplo, outro péptido ou proteína). Por conseguinte, os anticorpos e partes de anticorpos da presente descrição e do presente invento destinam-se a incluir as formas derivatizadas e modificadas de outro modo dos anticorpos anti-hTNFa humanos aqui descritos, incluindo as moléculas de imunoadesão. Por exemplo, um anticorpo ou parte de anticorpo da presente descrição e do presente invento pode ser ligado funcionalmente (por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou outra forma) a uma ou mais entidades moleculares adicionais, tais como outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou um diabody), um 51 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ agente detectável, um agente citotóxico, um agente farmacêutico e/ou uma proteína ou péptido que pode mediar a associação do anticorpo ou parte do anticorpo a outra molécula (por exemplo, uma região central da estreptavidina ou uma marca de poli-histidina).

Um tipo de anticorpo derivatizado é produzido pela reticulação de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, por exemplo, para criar anticorpos biespecíficos). Os agentes de reticulação adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, possuindo dois grupos distintamente reactivos separados por um espaçador apropriado (por exemplo, o éster de m-maleimidobenzoíl-N-hidroxi-succinimida), ou homobifuncionais (por exemplo, o suberato de disuccinimidilo). Estes agentes de ligação estão disponíveis através de Pierce Chemical Company, Rockford, Ilinóis.

Os agentes detectáveis úteis com que um anticorpo ou parte de anticorpo da presente descrição e do presente invento pode ser derivatizado incluem os compostos fluorescentes. Os agentes detectáveis fluorescentes exemplificativos incluem a fluoresceína, o isotiocianato de fluoresceína, a rodamina, o cloreto de 5-dimetilamina-l-naftalenossulfonilo, a ficoeritrina e similares. Um anticorpo também pode ser derivatizado com enzimas detectáveis, tais como a fosfatase alcalina, a peroxidase de rábano, a glucose-oxidase e similares. Quando um anticorpo é derivatizado com uma enzima detectável, ele é detectado por adição de reagentes adicionais que a enzima utiliza para produzir um produto de reacção detectável. Por exemplo, quando o agente detectável peroxidase de rábano está presente, a adição de peróxido de hidrogénio e de diaminobenzidina conduz a um produto de reacção colorido, que é detectável. Um anticorpo também pode ser derivatizado com biotina e detectado através de medição indirecta da ligação a avidina ou estreptavidina.

Um anticorpo, ou parte de anticorpo, utilizado nos métodos ou composições da presente descrição e do presente invento pode ser preparado por expressão recombinante dos genes das cadeias leve e pesada da imunoglobulina numa célula hospedeira. Para expressar um anticorpo de modo recombinante, uma célula hospedeira é transfectada com um ou mais vectores 52 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ de expressão recombinante transportando fragmentos de ADN que codificam as cadeias leve e pesada de imunoglobulina do anticorpo, de modo que as cadeias leve e pesada sejam expressas na célula hospedeira e, de preferência, sejam segregadas para o meio em que as células hospedeiras são cultivadas, meio este a partir do qual os anticorpos são recuperados. Utilizam-se metodologias de ADN recombinante padrão para obter os genes das cadeias leve e pesada do anticorpo, incorporar estes genes em vectores de expressão recombinante e introduzir os vectores em células hospedeiras, como sejam aqueles descritos em Sambrook, Fritsch & Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) e Patente U.S. n.° 4,816,397 de Boss et al.

Para expressar o anticorpo D2E7 ou um anticorpo relacionado com D2E7, obtêm-se primeiro os fragmentos de ADN que codificam as regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. Estes ADN podem ser obtidos por amplificação e modificação das sequências variáveis de cadeia leve e cadeia pesada da linha germinal, utilizando a reacção em cadeia da polimerase (PCR). As sequências de ADN da linha germinal para os genes da região variável das cadeias leves e pesadas humanas são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, a base de dados de sequências da linha germinal humana "Vbase"; ver também Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I.M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; e Cox, J.P.L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line V78 Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836).

Para obter um fragmento de ADN que codifica a região variável de cadeia pesada de D2E7, ou de um anticorpo relacionado com D2E7, um membro da família VH3 de genes VH da linha germinal humana é amplificado por reacção de PCR padrão. Mais preferencialmente, a sequência VH DP-31 da linha 53 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ germinal é amplificada. Para obter um fragmento de ADN que codifica a região variável de cadeia leve de D2E7, ou de um anticorpo relacionado com D2E7, um membro da família VKI de genes VL da linha germinal humana é amplificado por reacção de PCR padrão. Mais preferencialmente, a sequência VL A20 da linha germinal é amplificada. Os iniciadores de PCR adequados para utilização na amplificação das sequências VH DP-31 da linha germinal e VL A20 da linha germinal podem ser desenhados com base nas sequências de nucleótidos descritas nas referências citadas acima, utilizando métodos padrão.

Uma vez obtidos os fragmentos VH e VL da linha germinal, estas sequências podem ser mutadas para codificar as sequências de aminoácidos de D2E7 ou relacionadas com D2E7 aqui descritas. As sequências de aminoácidos codificadas pelas sequências de ADN de VH e VL da linha germinal são inicialmente comparadas com as sequências de aminoácidos de VH e VL de D2E7 ou relacionadas com D2E7 para identificar os resíduos de aminoácidos na sequência de D2E7 ou relacionada com D2E7 que diferem da linha germinal. Em seguida, os nucleótidos apropriados das sequências de ADN da linha germinal são mutados para que a sequência da linha germinal mutada codifique a sequência de aminoácidos de D2E7 ou relacionada com D2E7, utilizando o código genético para determinar que alterações de nucleótidos deverão ser feitas. A mutagénese das sequências da linha germinal é efectuada por métodos convencionais, tais como a mutagénese mediada por PCR (em que os nucleótidos mutados são incorporados nos iniciadores de PCR para que o produto de PCR contenha as mutações) ou mutagénese dirigida.

Após a obtenção dos fragmentos de ADN que codificam os segmentos VH e VL de D2E7 ou relacionados com D2E7 (por amplificação e mutagénese dos genes VH e VL da linha germinal como descrito acima), estes fragmentos de ADN podem ser adicionalmente manipulados por técnicas de ADN recombinante padrão, por exemplo para converter os genes da região variável em genes das cadeias do anticorpo completo, em genes do fragmento Fab ou num gene de scFv. Nestas manipulações, um fragmento de ADN que codifica VL ou VH é ligado de forma funcional a outro fragmento de ADN que codifica outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um 54 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ adaptador flexível. 0 termo "ligado de forma funcional", como utilizado neste contexto, pretende significar que os dois fragmentos de ADN estão unidos de tal forma que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de ADN permanecem in-frame. 0 ADN isolado que codifica a região VH pode ser convertido num gene de cadeia pesada completa por meio da ligação funcional do ADN que codifica VH a outra molécula de ADN que codifica as regiões constantes de cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3). As sequências dos genes das regiões constantes de cadeias pesadas humanas são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat, E.A., et ai. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e os fragmentos de ADN que compreendem estas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR padrão. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas mais preferencialmente é uma região constante de IgGl ou IgG4. Para o gene de cadeia pesada de um fragmento Fab, o ADN que codifica VH pode ser ligado funcionalmente a outra molécula de ADN que codifica apenas a região constante CHI de cadeia pesada. 0 ADN isolado que codifica a região VL pode ser convertido num gene de cadeia leve completa (assim como num gene de cadeia leve de Fab) por meio da ligação funcional do ADN que codifica VL a outra molécula de ADN que codifica a região constante de cadeia leve, CL. As sequências dos genes das regiões constantes de cadeias leves humanas são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) e os fragmentos de ADN que compreendem estas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante capa ou lambda, mas mais preferencialmente é uma região constante capa.

Para criar um gene de scFv, os fragmentos de ADN que codificam VH e VL são ligados funcionalmente a outro fragmento que codifica um elemento de ligação flexível, por 55 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ exemplo, que codifica a sequência de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de forma que as sequências VH e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões VL e VH unidas pelo elemento de ligação flexível (ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242 :423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554).

Para expressar os anticorpos, ou partes de anticorpos, utilizados na presente descrição e no presente invento, os ADN que codificam as cadeias leves e pesadas completas ou parciais, obtidos da forma descrita acima, são inseridos em vectores de expressão, de modo que os genes estejam ligados funcionalmente a sequências de controlo transcricional e traducional. Neste contexto, o termo "ligado funcionalmente" pretende dizer que um gene de um anticorpo é ligado num vector, de forma que as sequências de controlo transcricional e traducional presentes no vector desempenhem a sua função pretendida de regular a transcrição e a tradução do gene do anticorpo. 0 vector de expressão e as sequências de controlo da expressão são seleccionados para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vectores separados ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vector de expressão. Os genes do anticorpo são inseridos no vector de expressão por métodos padrão (por exemplo, a ligação de locais de restrição complementares no fragmento génico do anticorpo e no vector ou a ligação de extremidades lisas caso não estejam presentes locais de restrição). Antes da inserção das sequências da cadeia leve ou pesada de D2E7 ou relacionada com D2E7, o vector de expressão poderá já transportar as sequências da região constante do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem para converter as sequências VH e VL de D2E7 ou relacionadas com D2E7 em genes de anticorpo completo consiste em inseri-las em vectores de expressão que já codificam as regiões constantes de cadeia pesada e a região constante de cadeia leve, respectivamente, de modo que o segmento VH fique ligado funcionalmente ao(s) segmento(s) CH no vector e o segmento VL fique ligado funcionalmente ao segmento CL no vector. Adicionalmente ou em alternativa, o vector de expressão recombinante pode codificar um péptido de sinal que facilita 56 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ a secreção da cadeia do anticorpo a partir de uma célula hospedeira. 0 gene da cadeia do anticorpo pode ser clonado no vector, de forma que o péptido de sinal esteja ligado in-frame com a extremidade amino do gene da cadeia do anticorpo. 0 péptido de sinal pode ser um péptido de sinal de uma imunoglobulina ou um péptido de sinal heterólogo (isto é, um péptido de sinal de uma proteína que não é uma imunoglobulina).

Além dos genes das cadeias do anticorpo, os vectores de expressão recombinante do invento transportam sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes das cadeias do anticorpo numa célula hospedeira. 0 termo "sequência reguladora" pretende incluir os promotores, os amplificadores e outros elementos de controlo da expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou a tradução dos genes das cadeias do anticorpo. Tais sequências reguladoras estão descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Os peritos na técnica compreenderão que a concepção do vector de expressão, incluindo a selecção das sequências reguladoras, poderá depender de factores como a escolha da célula hospedeira a transformar, o nível de expressão da proteína desejada, etc. As sequências reguladoras preferidas para a expressão em células hospedeiras de mamífero incluem elementos virais que controlam níveis elevados de expressão das proteínas em células de mamífero, tais como os promotores e/ou amplificadores derivados de citomegalovírus (CMVj (como o promotor/amplificador CMVj, vírus símio 40 (SV40) (como o promotor/amplificador SV40), adenovírus (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Para uma descrição adicional dos elementos reguladores virais e suas sequências, ver, por exemplo, Patente U.S. n.° 5,168,062 por Stinski, Patente U.S. n.° 4,510,245 por Bell et al. e Patente U.S. n.° 4,968,615 por Schaffner et al.

Além dos genes das cadeias do anticorpo e das sequências reguladoras, os vectores de expressão recombinante utilizados na presente descrição e no presente invento poderão transportar sequências adicionais, tais como as sequências que regulam a replicação do vector nas células hospedeiras 57 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ (por exemplo, as origens de replicação) e os genes de marcas de selecção. 0 gene da marca de selecção facilita a selecção das células hospedeiras nas quais o vector foi introduzido (ver, por exemplo, Patente U.S. n.os 4,399,216, 4,634,665 e 5,179,017, todas por Axel et al.). Por exemplo, tipicamente, o gene da marca de selecção confere resistência a drogas, como G418, higromicina ou metotrexato, a uma célula hospedeira na qual o vector foi introduzido. Os genes de marcas de selecção preferidos incluem o gene da di-hidrofolato-redutase (DHFR) (para usar em células hospedeiras dhfr” com selecção/amplificação com metotrexato) e o gene neo (para selecção com G418).

Para a expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vector(es) de expressão que codifica(m) as cadeias leve e pesada são transfectados numa célula hospedeira por técnicas padrão. As várias formas do termo "transfecção" pretendem englobar uma grande variedade de técnicas habitualmente usadas para a introdução de ADN exógeno numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, a electroporação, a precipitação com fosfato de cálcio, a transfecção com DEAE-dextrano e similares. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos da presente descrição e do presente invento em células hospedeiras quer procarióticas quer eucarióticas, a expressão dos anticorpos em células eucarióticas, e mais preferencialmente em células hospedeiras de mamífero, é a mais preferida, pois é mais provável que estas células eucarióticas, e em particular as células de mamífero, construam e segreguem um anticorpo correctamente enrolado e imunitariamente activo do que as células procarióticas. A expressão procariótica de genes de anticorpos tem sido referida como ineficaz para a produção de altos rendimentos de anticorpo activo (Boss, M.A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

As células hospedeiras de mamífero preferidas para expressar os anticorpos recombinantes da presente descrição e do presente invento incluem as células de ovário de hamster chinês (células CHO) (incluindo as células CHO dhfr-, descritas em Urlaub & Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad Sei. USA 77:4216-4220, utilizadas com uma marca de selecção DHFR, por exemplo, como descrito em R.J. Kaufman & P.A. Sharp 58 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ (1982) Mol. Biol. 159:601-621), as células de mieloma NSO, as células COS e as células SP2. Quando os vectores de expressão recombinante que codificam os genes do anticorpo são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos por cultura das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção do anticorpo para o meio de cultura em que as células hospedeiras são crescidas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura utilizando métodos de purificação de proteínas padrão.

As células hospedeiras também podem ser utilizadas para produzir partes de anticorpos intactos, como os fragmentos Fab ou as moléculas scFv. Entende-se que as variações ao procedimento acima estão no âmbito da presente descrição e do presente invento.

Por exemplo, poderá ser desejável transfectar uma célula hospedeira com o ADN que codifica ou a cadeia leve ou a cadeia pesada (mas não ambas) de um anticorpo deste invento. A tecnologia de ADN recombinante também poderá ser utilizada para remover algum ou todo o ADN que codifica uma ou ambas as cadeias leve e pesada e que não é necessário para a ligação a hTNFa. As moléculas expressas a partir destas moléculas de ADN truncadas também estão englobadas nos anticorpos da presente descrição e do presente invento. Além disso, é possível produzir anticorpos bifuncionais em que uma cadeia pesada e uma cadeia leve constituem um anticorpo do invento e a outra cadeia pesada e cadeia leve são específicas de um antigénio distinto de hTNFa, por reticulação de um anticorpo da presente descrição e do presente invento com um segundo anticorpo através de métodos de reticulação química padrão.

Num sistema preferido para a expressão recombinante de um anticorpo, ou uma sua parte de ligação ao antigénio, da presente descrição ou do presente invento, um vector de expressão recombinante que codifica tanto a cadeia leve do anticorpo como a cadeia pesada do anticorpo é introduzido em células CHO dhfr- por transfecção mediada por fosfato de cálcio. No vector de expressão recombinante, cada um dos genes das cadeias leve e pesada do anticorpo está ligado 59 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ funcionalmente aos elementos reguladores amplificador CMV/promotor AdMLP para impelir niveis elevados de transcrição dos genes. 0 vector de expressão recombinante também transporta um gene DHFR, que permite a selecção das células CHO que foram transfectadas com o vector utilizando a selecção/amplificação com metotrexato. As células hospedeiras transformantes seleccionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias leve e pesada do anticorpo, e o anticorpo intacto é recuperado a partir do meio de cultura. Utilizam-se técnicas de biologia molecular padrão para preparar o vector de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, seleccionar os transformantes, cultivar as células hospedeiras e recuperar o anticorpo a partir do meio de cultura.

Os anticorpos humanos recombinantes da presente descrição e do presente invento, além de D2E7 ou de uma sua parte de ligação ao antigénio, ou dos anticorpos relacionados com D2E7 aqui descritos, podem ser isolados através de rastreio de uma biblioteca combinatória e recombinante de anticorpos, preferencialmente uma biblioteca de apresentação em fago de scFv, criada utilizando os ADNc de VL e VH humanas preparados a partir do ARNm derivado de linfócitos humanos. As metodologias de preparação e rastreio de tais bibliotecas são conhecidas na técnica. Além dos kits disponíveis comercialmente para gerar bibliotecas de apresentação em fago (por exemplo, o Recombinant Phage Antibody System de Pharmacia, n.° de catálogo 27-9400-01; e o kit de apresentação em fago SurfZAP™ de Stratagene, n.° de catálogo 240612), os exemplos de métodos e reagentes particularmente receptivos para utilização na geração e rastreio de bibliotecas de apresentação de anticorpos podem ser encontrados em, por exemplo, Ladner et al., Patente U.S. n.° 5,223,409; Kang et al., Publicação PCT n.° WO 92/18619; Dower et al., Publicação PCT n.° WO 91/17271; Winter et al., Publicação PCT n.° WO 92/20791; Markland et al., Publicação PCT n.° WO 92/15679; Breitling et al., Publicação PCT n.° WO 93/01288; McCafferty et al., Publicação PCT n.° WO 92/01047; Garrard et al., Publicação PCT n.° WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-65; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al. , Nature (1990) 348:552-554; 60 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrarei et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al.

(1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; e Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982.

Numa concretização preferida, para isolar os anticorpos humanos com alta afinidade e uma constante de velocidade de dissociação baixa para hTNFa, utiliza-se primeiro um anticorpo murino anti-hTNFa com alta afinidade e uma constante de velocidade de dissociação baixa para hTNFa (por exemplo, MAK 195, o hibridoma que tem o número de depósito ECACC 87 050801) para seleccionar as sequências de cadeias leves e pesadas humanas com uma actividade de ligação a hTNFa similar, utilizando os métodos de impressão de epitopo descritos em Hoogenboom et al., Publicação PCT n.° WO 93/06213. As bibliotecas de anticorpos utilizadas neste método são preferencialmente bibliotecas de scFv preparadas e rastreadas da forma descrita em McCafferty et al., Publicação PCT n.° WO 92/01047, McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; e Griffiths et al., (1993) EMBO J 12:725-734. As bibliotecas de anticorpos scFv são preferencialmente rastreadas utilizando o TNFa humano recombinante como antigénio.

Uma vez os segmentos VL e VH humanos iniciais seleccionados, efectuam-se experiências de "mistura e combinação", em que diferentes pares dos segmentos VL e VH inicialmente seleccionados são rastreados relativamente à ligação a hTNFa, para seleccionar as combinações do par VL/VH preferidas. Adicionalmente, para melhorar mais a afinidade e/ou reduzir a constante de velocidade de dissociação para a ligação a hTNFa, os segmentos VL e VH do(s) par(es) VL/VH preferido(s) podem ser mutados aleatoriamente, de preferência ao nível da região CDR3 de VH e/ou VL, num processo análogo ao processo de mutação somática in vivo responsável pela maturação da afinidade dos anticorpos durante uma resposta imune natural. Esta maturação da afinidade in vitro pode ser obtida por amplificação das regiões VH e VL utilizando iniciadores de PCR complementares da região CDR3 de VH e da região CDR3 de VL, respectivamente, iniciadores estes que 61 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ foram "enriquecidos" com uma mistura aleatória das quatro bases nucleotídicas em determinadas posições, de modo que os produtos de PCR resultantes codifiquem segmentos VH e VL nos quais foram introduzidas mutações aleatórias nas regiões CDR3 de VH e/ou VL. Estes segmentos VH e VL mutados aleatoriamente podem ser novamente rastreados quanto à ligação a hTNFa, e as sequências que exibem alta afinidade e uma velocidade de dissociação baixa para a ligação a hTNFa podem ser seleccionadas.

Após o rastreio e o isolamento de um anticorpo anti-hTNFa da presente descrição e do presente invento a partir de uma biblioteca recombinante de apresentação de imunoglobulinas, o ácido nucleico que codifica o anticorpo seleccionado pode ser recuperado a partir do conjunto de apresentação (por exemplo, a partir do genoma fágico) e subclonado noutros vectores de expressão por técnicas de ADN recombinante padrão. Se desejado, o ácido nucleico pode ser adicionalmente manipulado para criar outras formas do anticorpo da presente descrição e do presente invento (por exemplo, ligadas ao ácido nucleico que codifica domínios adicionais das imunoglobulinas, tais como regiões constantes adicionais). Para expressar um anticorpo humano recombinante isolado através de rastreio de uma biblioteca combinatória, o ADN que codifica o anticorpo é clonado num vector de expressão recombinante e introduzido em células hospedeiras de mamífero, conforme descrito em maior detalhe acima.

Os métodos de isolamento de anticorpos humanos com alta afinidade e uma constante de velocidade de dissociação baixa para hTNFa também estão descritos na Patente U.S. n.° 6,090,382, 6,258,562 e 6,509,015. IV. Espondiloartropatias O TNFa tem sido implicado na patof isiologia de uma grande variedade de perturbações, incluindo doenças inflamatórias como as espondiloartropatias (ver, por exemplo, Moeller et al. (1990) Cytokine 2:162; Patente U.S. n.° 5,231,024; Publicação de Patente Europeia n.° 260 610). 62 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

Tal como aqui utilizado, o termo "espondiloartropatia" ou "espondiloartropatias" é usado para designar qualquer uma de várias doenças afectando as articulações da coluna vertebral, em que estas doenças partilham caracteristicas clinicas, radiológicas e histológicas comuns. Algumas espondiloartropatias partilham caracteristicas genéticas, isto é, estão associadas ao alelo HLA-B27. Numa concretização, o termo espondiloartropatia é utilizado para designar qualquer uma de várias doenças que afectam as articulações da coluna vertebral, excluindo a espondilite anquilosante, em que tais doenças partilham caracteristicas clinicas, radiológicas e histológicas comuns. Os exemplos de espondiloartropatias incluem a espondilite anquilosante, a artrite/espondilite psoriática, a artrite enteropática, a artrite reactiva ou sindrome de Reiter e as espondiloartropatias indiferenciadas. Os exemplos de modelos animais utilizados para estudar as espondiloartropatias incluem os ratinhos transgénicos ank/ank e os ratos transgénicos HLA-B27 (ver Taurog et al. (1998) The Spondylarthritides. Oxford:Oxford University Press).

Os métodos desta descrição também podem ser utilizados para tratar sujeitos que têm ou estão em risco de desenvolver uma espondiloartropatia. Os exemplos de sujeitos que estão em risco de ter espondiloartropatias incluem os seres humanos que sofrem de artrite. As espondiloartropatias podem estar associadas a outras formas de artrite, incluindo a artrite reumatóide. Numa concretização da presente descrição, os níveis dos biomarcadores da degradação da cartilagem e/ou da sinovite de um doente com uma espondiloartropatia ou em risco de desenvolver uma espondiloartropatia são determinados e utilizados para avaliar se o doente está em risco de desenvolver uma espondiloartropatia. Os exemplos de espondiloartropatias que podem ser tratadas com um anticorpo para TNFa e, por conseguinte, examinadas utilizando os métodos aqui referidos estão descritos abaixo. 1. Espondilite anquilosante (EA) 0 factor de necrose tumoral tem sido implicado na patofisiologia da espondilite anquilosante (EA) (ver Verjans et al. (1991) Arthritis Rheum. 34:486; Verjans et al. (1994) 63 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

Clin Εχρ Immunol. 97:45; Kaijtzel et al. (1999) Hum Immunol. 60:140). A EA é uma condição inflamatória envolvendo a inflamação de uma ou mais vértebras. A EA é uma doença inflamatória crónica que afecta o esqueleto axial e/ou as articulações periféricas, incluindo as articulações entre as vértebras da coluna vertebral e as articulações sacroiliacas e as articulações entre a coluna vertebral e a pélvis. A EA pode eventualmente fazer com que as vertebras afectadas se fundam ou cresçam em conjunto. As espondiloartropatias, incluindo a EA, podem estar associadas a artrite psoriática e/ou a doença inflamatória do intestino (DII), incluindo a colite ulcerosa e a doença de Crohn.

As manifestações precoces da EA podem ser determinadas por testes radiográficos, incluindo exames de tomografia computorizada e de ressonância magnética. As manifestações precoces da EA incluem muitas vezes sacroileite e alterações nas articulações sacroiliacas, conforme indicado pelo esbatimento das margens corticais do osso subcondral, seguidas de erosões e esclerose. A fadiga também tem sido referida como um sintoma comum da EA (Duffy et al. (2002) ACR 66th Annual Scientific Meeting Abstract) . Por conseguinte, os métodos da presente descrição e do presente invento podem ser utilizados para fornecer um tratamento melhorado para a EA, ao proporcionarem um método de determinação da eficácia de um tratamento compreendendo a administração de um inibidor do TNF .

Numa concretização, o método do invento é utilizado para determinar a eficácia da administração de um inibidor do TNF para o tratamento de uma espondiloartropatia, incluindo a EA, associada a DII. A EA é muitas vezes tratada com medicamentos anti-inflamatórios não esteróides (ΑΙΝΕ), como a aspirina ou a indometacina. Assim, os métodos da presente descrição e do presente invento poderão ser utilizados para determinar a eficácia de um tratamento compreendendo um anticorpo para TNFa, administrado em combinação com agentes normalmente utilizados para reduzir a inflamação e a dor geralmente associadas à espondilite anquilosante. 64 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ 2. Artrite psoriática Ο factor de necrose tumoral tem sido implicado na patofisiologia da artrite psoriática (Partsch et al. (1998)

Ann Rheum Dis. 57:691; Ritchlin et al. (1998) J Rheumatol. 25:1544). Tal como aqui referida, a artrite psoriática ou psoriase associada à pele refere-se à artrite inflamatória crónica que está associada à psoriase, a qual é uma condição dermatológica crónica comum que causa manchas vermelhas no corpo. Cerca de 1 em 20 indivíduos com psoriase desenvolverá artrite juntamente com a condição dermatológica, e em cerca de 75% dos casos a psoriase precede a artrite. A artrite psoriática manifesta-se de uma variedade de formas, que vão desde artrite moderada a grave, em que a artrite geralmente afecta os dedos e a coluna vertebral. Quando a coluna vertebral é afectada, os sintomas são similares aos da espondilite anquilosante, descritos acima. Por conseguinte, a eficácia de um anticorpo para o TNFa, ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, para o tratamento da artrite psoriática pode ser determinada utilizando o método e as composições da presente descrição. A artrite psoriática está por vezes associada a artrite mutilante. A artrite mutilante refere-se a uma condição que é caracterizada por uma erosão óssea excessiva, resultando numa deformidade erosiva e disforme que mutila a articulação. Numa concretização, a eficácia de um anticorpo para o TNFa, ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, para o tratamento da artrite mutilante pode ser determinada utilizando o método e as composições da presente descrição. 3. Artrite reactiva/síndrome de Reiter O factor de necrose tumoral tem sido implicado na patofisiologia da artrite reactiva, que é também designada por síndrome de Reiter (Braun et al. (1999) Arthritis Rheum. 42(10):2039). A artrite reactiva refere-se à artrite que complica uma infecção noutro local do corpo, muitas vezes após infecções entéricas ou urogenitais. A artrite reactiva é muitas vezes caracterizada por determinados sintomas clínicos, incluindo inflamação das articulações (artrite), uretrite, conjuntivite e lesões da pele e das membranas 65 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ mucosas. Além disso, a artrite reactiva pode surgir após infecção com uma doença sexualmente transmissível ou infecção disentérica, incluindo clamídea, campylobacter, salmonela ou yersinia. Numa concretização, a eficácia de um anticorpo para o TNFa, ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, para o tratamento da artrite reactiva pode ser determinada utilizando o método e as composições da presente descrição. 4. Espondiloartropatias indiferenciadas

Numa concretização, os anticorpos obtidos utilizando os métodos da presente descrição são utilizados para tratar sujeitos que sofrem de espondiloartropatias indiferenciadas (ver Zeidler et al. (1992) Rheum Dis Clin North Am. 18:187).

Outros termos utilizados para descrever as espondiloartropatias indiferenciadas consistem em oligoartrite seronegativa e oligoartrite indiferenciada. 0 termo espondiloartropatias indiferenciadas, como aqui utilizado, refere-se a uma condição em que o sujeito demonstra apenas alguns dos sintomas associados a uma espondiloartropatia. Esta condição é geralmente observada em adultos jovens que não têm DII, psoríase ou os sintomas clássicos de EA ou síndrome de Reiter. Nalguns casos, as espondiloartropatias indiferenciadas poderão ser uma indicação precoce de EA. Numa concretização, a eficácia de um anticorpo para o TNFa, ou de um seu fragmento de ligação ao antigénio, para o tratamento das espondiloartropatias indiferenciadas pode ser determinada utilizando o método e as composições da presente descrição. V._Composições_farmacêuticas_e_administração farmacêutica A. Composições e administração

Os anticorpos, as partes de anticorpos e outros inibidores do TNFa destinados a utilização nos métodos da presente descrição e do presente invento podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração a um sujeito. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende um anticorpo, parte de anticorpo ou outro inibidor do TNFa da presente descrição e do presente 66 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ invento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal como aqui utilizado, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, materiais de revestimento, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardantes da absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis. Os exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais dos seguintes elementos: água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, bem como suas combinações. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois como o manitol e o sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis poderão compreender ainda quantidades secundárias de substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, conservantes ou tampões, que melhoram o prazo de validade ou a eficácia do anticorpo, parte de anticorpo ou outro inibidor do TNFa.

As composições destinadas a utilização nos métodos da presente descrição e do presente invento poderão estar numa variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas farmacêuticas líquidas, semi-sólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injectáveis e para infusão), dispersões ou suspensões, pastilhas, comprimidos, pós, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo de administração pretendido e da aplicação terapêutica. As composições preferidas típicas encontram-se na forma de soluções injectáveis ou para infusão, por exemplo, composições similares às utilizadas para a imunização passiva de seres humanos com outros anticorpos ou outros inibidores do TNFa. 0 modo de administração preferido é parentérico (por exemplo, intravenoso, subcutâneo, intraperitoneal, intramuscular). Numa concretização preferida, o anticorpo ou outro inibidor do TNFa é administrado por infusão ou injecção intravenosa. Noutra concretização preferida, o anticorpo ou outro inibidor do TNFa é administrado por injecção intramuscular ou subcutânea.

As composições terapêuticas têm tipicamente de ser estéreis e estáveis nas condições de fabrico e armazenamento. As composições podem ser formuladas como uma solução, uma 67 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ microemulsão, uma dispersão, um lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para conter uma alta concentração de fármaco. As soluções injectáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação do composto activo (isto é, o anticorpo, parte de anticorpo ou outro inibidor do TNFa), na quantidade exigida, num solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes referidos acima, conforme necessário, seguida de esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto activo num veiculo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários entre aqueles referidos acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são a secagem sob vácuo e a liofilização, que fornecem um pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma sua solução previamente filtrada em condições estéreis. A fluidez correcta de uma solução pode ser mantida, por exemplo, mediante a utilização de um material de revestimento como a lecitina, mediante a manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de uma dispersão e mediante a utilização de tensioactivos. A absorção prolongada de composições injectáveis pode ser obtida pela inclusão, na composição, de um agente retardante da absorção, por exemplo, sais monoestearato e gelatina.

É igualmente possível incorporar compostos activos suplementares nas composições. Em determinadas concretizações, um anticorpo ou parte de anticorpo destinado a utilização nos métodos da presente descrição e do presente invento é co-formulado e/ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, incluindo um inibidor ou antagonista da EA. Por exemplo, um anticorpo anti-hTNFa ou parte de anticorpo da presente descrição e do presente invento poderá ser co-formulado e/ou co—administrado com um ou mais anticorpos adicionais que se ligam a outros alvos associados a condições relacionadas com o TNFa (por exemplo, anticorpos que se ligam a outras citocinas ou que se ligam a moléculas da superfície celular), uma ou mais citocinas, um receptor solúvel de TNFa (ver, por exemplo, Publicação PCT n.° WO 94/06476) e/ou um ou mais agentes químicos que inibem a produção ou a actividade de hTNFa (como os derivados de ciclohexano-ilideno descritos na Publicação PCT n.° WO 68 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ 93/19751) ou qualquer combinação destes. Além disso, um ou mais anticorpos da presente descrição e do presente invento poderão ser utilizados em combinação com dois ou mais dos agentes terapêuticos anteriores. Tais terapias de combinação poderão utilizar, de forma vantajosa, doses mais baixas dos agentes terapêuticos administrados, evitando assim possíveis efeitos secundários, complicações ou um nível baixo de resposta por parte do doente associados às várias monoterapias.

Num aspecto, esta descrição inclui composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz de um inibidor do TNFa e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que a quantidade eficaz do inibidor do TNFa poderá ser eficaz para tratar a EA. Numa concretização, o anticorpo ou parte de anticorpo destinado a utilização nos métodos do invento é incorporado numa formulação farmacêutica da forma descrita em US 8,216,583 e US 2004/0033228 AI. Esta formulação inclui uma concentração de 50 mg/ml do anticorpo D2E7, em que uma seringa pré-cheia contém 40 mg de anticorpo para injecção subcutânea. Noutra concretização, a formulação da presente descrição e conforme empregue nos métodos deste invento inclui D2E7. e

Os anticorpos, as partes de anticorpos e outros inibidores do TNFa da presente descrição e destinados a utilização nos métodos do presente invento podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, embora para muitas aplicações terapêuticas, a via/modo de administração preferido seja a injecção subcutânea. Noutra concretização, a administração é por injecção ou infusão intravenosa. Como os peritos compreenderão, a via e/ou o modo de administração variará dependendo dos resultados pretendidos. Em determinadas concretizações, o composto activo pode ser preparado juntamente com um transportador que protege o composto contra uma libertação rápida, como seja uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de entrega microencapsulados. É possível utilizar polímeros biocompatíveis e biodegradáveis, por exemplo, polímeros de etileno-acetato de vinilo, polianidridos, poli(ácido glicólico), colagénio, poliortoésteres 69 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ poli(ácido láctico). Muitos métodos para a preparação de tais formulações estão patenteados ou são geralmente conhecidos pelos peritos na técnica. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Robinson, ed., Dekker, Inc., New York, 1978.

Os anticorpos para TNFa utilizados na presente descrição e no presente invento também podem ser administrados na forma de formulações de cristais de proteínas, que incluem uma combinação de cristais de proteínas encapsulados num suporte polimérico para formar partículas revestidas. As partículas revestidas da formulação de cristais de proteínas poderão ter uma morfologia esférica e consistir em microsferas de até 500 micrómetros de diâmetro ou poderão ter alguma outra morfologia e consistir em microparticulados. A concentração reforçada dos cristais de proteínas permite que o anticorpo do invento seja entregue subcutaneamente. Numa concretização, os anticorpos para TNFa da presente descrição e do presente invento são entregues via um sistema de entrega de proteínas, em que uma ou mais composições ou formulações de cristais de proteínas são administradas a um sujeito com uma condição relacionada com TNFa. As composições e os métodos de preparação de formulações estabilizadas de cristais de anticorpo completo ou cristais de fragmento de anticorpo também estão descritos em WO 02/072636.

Num aspecto da presente descrição, uma formulação compreendendo os fragmentos de anticorpo cristalizado descritos em US 8,216,583 e US 2004/0033228 AI é utilizada para tratar a artrite reumatóide.

Em determinadas concretizações, um anticorpo, uma parte de anticorpo ou outro inibidor do TNFa da presente descrição e destinado a utilização nos métodos do presente invento pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou um veículo comestível assimilável. O composto (e outros ingredientes, se desejado) também pode ser confinado numa cápsula de gelatina rígida ou gelatinosa, comprimido em pastilhas ou incorporado directamente na alimentação do sujeito. Para uma administração terapêutica oral, os compostos podem ser incorporados juntamente com excipientes e utilizados na forma de pastilhas ingeríveis, pastilhas 70 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ bocais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias e similares. Para administrar um composto da presente descrição e destinado a utilização nos métodos do presente invento por outro meio que não a administração parentérica, poderá ser necessário revestir o composto, ou co-administrar o composto, com um material para prevenir a sua inactivação.

As composições farmacêuticas da presente descrição poderão incluir uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilacticamente eficaz" de um anticorpo ou parte de anticorpo. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, nas doses e durante os períodos de tempo necessários, para obter o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, da parte de anticorpo ou de outro inibidor do TNFa poderá variar de acordo com factores como o estado da doença, a idade, o sexo e o peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo, parte de anticorpo ou outro inibidor do TNFoí para provocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma quantidade em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo, parte de anticorpo ou outro inibidor do TNFa têm menos peso do que os efeitos benéficos terapêuticos. Uma "quantidade profilacticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, nas doses e durante os períodos de tempo necessários, para obter o resultado profiláctico desejado. Tipicamente, dado que uma dose profiláctica é utilizada nos sujeitos antes da doença ou numa fase mais precoce da mesma, a quantidade profilacticamente eficaz será menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.

Os regimes posológicos poderão ser ajustados para fornecer a resposta óptima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profiláctica). Por exemplo, poderá administrar-se um bolus único, poderão administrar-se várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose poderá ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. Para efeitos de facilidade de administração e uniformidade da dose, é especialmente vantajoso que as composições parentéricas sejam formuladas numa forma farmacêutica unitária. A forma farmacêutica unitária, como aqui utilizada, refere-se a 71 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ unidades fisicamente discretas concebidas como doses unitárias para os sujeitos mamiferos a tratar, em que cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veiculo farmacêutico necessário. As especificações para as formas farmacêuticas unitárias são ditadas e estão directamente dependentes de (a) as caracteristicas únicas do composto activo e do efeito terapêutico ou profiláctico particular a obter e (b) as limitações inerentes à técnica de misturar tal composto activo para o tratamento da sensibilidade nos indivíduos.

Num aspecto, a presente descrição fornece um método unidose para o tratamento de uma condição relacionada com o TNFa, compreendendo a administração a um sujeito devidamente necessitado de uma unidose de um inibidor do TNFa, tal como um anticorpo humano. Num aspecto, o inibidor do TNFa é o anticorpo anti-TNFa D2E7. A unidose do inibidor do TNFa pode ser qualquer quantidade terapêutica ou profilacticamente eficaz. Num aspecto, administra-se a um sujeito uma unidose de 20 mg, 40 mg ou 80 mg de D2E7. A unidose poderá ser administrada por qualquer via, incluindo, por exemplo, a administração subcutânea. Os regimes posológicos bissemanais podem ser usados para tratar condições em que a actividade do TNFa é prejudicial e estão adicionalmente descritos em US 2003/0235581 AI. Os métodos de tratamento ou prevenção de dose múltipla variável podem também ser utilizados para tratar distúrbios em que a actividade do TNFa é prejudicial e estão adicionalmente descritos em WO 05/110452. É de salientar que os valores de dose poderão variar com o tipo e a gravidade da condição que se pretende aliviar. Deve também entender-se que, para cada sujeito particular, os regimes posológicos específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e a avaliação profissional da pessoa que está a administrar ou a supervisionar a administração das composições, e que os intervalos de dose aqui apresentados são apenas exemplificativos. A presente descrição também diz respeito a composições farmacêuticas embaladas ou kits para administração dos 72 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ anticorpos anti-TNF para o tratamento da EA. Num aspecto da presente descrição, o kit compreende um inibidor do TNFa, como um anticorpo, uma segunda composição farmacêutica compreendendo um agente terapêutico adicional e instruções de administração para o tratamento da EA. As instruções poderão descrever como, por exemplo, subcutaneamente, e quando, por exemplo, na semana 0 e na semana 2, as diferentes doses do inibidor do TNFa e/ou do agente terapêutico adicional deverão ser administradas a um sujeito para efeitos de tratamento.

Outro aspecto da presente descrição refere-se a kits contendo uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-TNFa e um veiculo farmaceuticamente aceitável, e uma ou mais composições farmacêuticas, em que cada uma delas compreende um fármaco útil para tratar um distúrbio relacionado com o TNFa e um veiculo farmaceuticamente aceitável. Em alternativa, o kit compreende uma composição farmacêutica única compreendendo um anticorpo anti-TNFa, um ou mais fármacos úteis para tratar um distúrbio relacionado com o TNFa e um veículo farmaceuticamente aceitável. Os kits contêm instruções de administração das composições farmacêuticas para o tratamento de um distúrbio relacionado com o TNFa. Numa concretização, o kit contém instruções relativamente à forma de determinar a eficácia do inibidor do TNF para o tratamento da EA. 0 kit poderá incluir qualquer um dos seguintes componentes para executar os métodos do invento: um agente detectável que reconhece especificamente o CTX-II e/ou o CTX-II e a MMP-3; instruções de utilização; e reagentes para isolar uma amostra do doente.

Em alternativa, a embalagem ou kit pode conter o inibidor do TNFa e pode ser promovido para uso, quer na embalagem quer através de informação anexa, nas utilizações ou tratamento dos distúrbios aqui descritos. Os kits ou compostos farmacêuticos embalados podem ainda incluir um segundo agente (como aqui descrito) embalado ou co-promovido com instruções para utilização do segundo agente com um primeiro agente (como aqui descrito). 73 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ Β. Agentes terapêuticos adicionais A presente descrição refere-se à determinação da eficácia de um inibidor do TNF para o tratamento da EA, sozinho ou em combinação com um agente terapêutico adicional. A combinação de agentes utilizada nos métodos e composições farmacêuticas aqui descritos poderá ter um efeito terapêutico aditivo ou sinérgico na(s) condição(ões) ou doença(s) visadas para tratamento. A combinação de agentes utilizada nos métodos ou composições farmacêuticas aqui descritos também poderá reduzir um efeito prejudicial associado a pelo menos um dos agentes, quando este é administrado sozinho ou sem o(s) outro(s) agente(s) da composição farmacêutica particular. Por exemplo, a toxicidade dos efeitos secundários de um agente poderá ser atenuada por outro agente da composição, permitindo assim uma dose mais elevada, melhorando a aceitação por parte do doente e melhorando o resultado terapêutico. Os efeitos, benefícios e vantagens aditivos ou sinérgicos das composições aplicam-se a classes de agentes terapêuticos, sejam elas classes estruturais ou funcionais, ou aos compostos individuais em si.

Os compostos activos suplementares também podem ser incorporados nas composições. Em determinadas concretizações, um anticorpo ou parte de anticorpo do invento é co-formulado e/ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, que são úteis para tratar um distúrbio relacionado com o TNFa. Por exemplo, um anticorpo anti-hTNFa, uma parte de anticorpo ou outro inibidor do TNFa do invento poderá ser co-formulado e/ou co—administrado com um ou mais anticorpos adicionais que se ligam a outros alvos (por exemplo, anticorpos que se ligam a outras citocinas ou que se ligam a moléculas da superfície celular), uma ou mais citocinas, um receptor solúvel de TNFa (ver, por exemplo, Publicação PCT n.° WO 94/06476) e/ou um ou mais agentes químicos que inibem a produção ou a actividade de hTNFa (como os derivados de ciclohexano-ilideno descritos na Publicação PCT n.° WO 93/19751). Adicionalmente, um ou mais anticorpos ou outros inibidores do TNFa da presente descrição poderão ser utilizados em combinação com dois ou mais dos agentes terapêuticos anteriores. Tais terapias de combinação poderão utilizar, de forma vantajosa, doses mais baixas dos agentes 74 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ terapêuticos administrados, evitando assim possiveis toxicidades ou complicações associados às várias monoterapias.

Os exemplos não limitativos de agentes terapêuticos com que um anticorpo, uma parte de anticorpo ou outro inibidor do TNFa pode ser combinado num método de tratamento e avaliado quanto à eficácia de acordo com os métodos do invento incluem os seguintes elementos: fármaco(s) anti-inflamatórios não esteróides (ΑΙΝΕ); fármaco(s) anti-inflamatórios supressores das citocinas; CDP-571/BAY-10-3356 (anticorpo humanizado anti-TNFa Celltech/Bayer); cA2/infliximab (anticorpo quimérico anti-TNFa; Centocor); 75 kdTNFR-IgG/etanercept

(proteína de fusão IgG-receptor do TNF de 75 kD; Immunex; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A) ; 55 kdTNF-IgG (proteína de fusão IgG-receptr do TNF de 55 kD; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396 (anticorpo primatizado anti-CD4; IDEC/SmithKline; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1995) Vol. 38, S185); DAB 486-IL-2 e/ou DAB 389-IL-2 (proteínas de fusão de IL-2; Seragen; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223); Anti-Tac (anti-IL-2Ra humanizado; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (citocina anti-inflamatória; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; citocina anti-inflamatória IL-10 recombinante; DNAX/Schering); IL-4; agonistas de IL-10 e/ou IL-4 (por exemplo, anticorpos agonistas); IL-1RA (antagonista do receptor IL-1; Synergen/Amgen); anakinra (Kineret®/Amgen) ; TNF-bp/s-TNF (proteína de ligação a TNF solúvel; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement) , S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268, pp. 37-42); R973401 (inibidor da fosfodiesterase tipo IV; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282); MK-966 (inibidor de COX-2; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism 9 (supplement), S81) ; Iloprost (ver, por & Rheumatism (1996) Vol. 39, No , . 9 metotrexato; talidomida (ver r por & Rheumatism (1996) Vol. 39, No , . 9 ver (1996) Vol. 39, No. exemplo, Arthritis (supplement), S82) exemplo, Arthritis (supplement), S282) e drogas relacionadas com a talidomida (por exemplo, Celgen); leflunomida (anti-inflamatório e inibidor de citocinas; ver, por exemplo, Arthritis & 75 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ 75 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ pp. não não não não não

Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S131; Inflammation Research (1996) Vol. 45, pp. 103-107); ácido tranexâmico (inibidor da activação do plasminogénio; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S284); T-614 (inibidor de citocinas; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282); prostaglandina EI (ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282); Tenidap (fármaco anti-inflamatório não esteróide; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S280); Naproxeno (fármaco anti-inflamatório não esteróide; ver, por exemplo, Neuro Report (1996) Vol. 7, 1209-1213); esteróide); esteróide); esteróide); esteróide); esteróide); Rheumatism Azatioprina Vol. 39, No. anti-inflamatório anti-inflamatório anti-inflamatório anti-inflamatório anti-inflamatório

Meloxicam (fármaco Ibuprofeno (fármaco Piroxicam (fármaco Diclofenac (fármaco Indometacina (fármaco (1996; ) Vol. 39, No. (ver, por exemplo, No. 9 (supplement), (ver, por exemplo, No. 9 (supplement),

Sulfassalazina (ver, por exemplo, Arthritis & (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S281); (ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) 9 (supplement), S281); inibidor de ICE (inibidor da enzima conversora da interleucina-1β); inibidor de zap-70 e/ou lck (inibidor da tirosina-cinase zap-70 ou lck) ; inibidor de VEGF e/ou inibidor de VEGF-R (inibidor do factor de crescimento endotelial vascular ou do receptor do factor de crescimento endotelial vascular; inibidores da angiogénese); fármacos anti-inflamatórios corticosteróides (por exemplo, SB203580); inibidores da TNF-convertase; anticorpos anti-IL-12; anticorpos anti-IL-18; interleucina-11 (ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol 9 (supplement), S296); interleucina-13 Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, S308); inibidores da interleucina-17 Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, S120); ouro; penicilamina; cloroquina; hidroxicloroquina; clorambucilo; ciclosporina; ciclofosfamida; irradiação linfóide total; globulina anti-timócitos; anticorpos anti-CD4; toxinas CD5; colagénio e péptidos administrados oralmente; lobenzarit dissódico; agentes reguladores de citocinas (CRA) HP228 e HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); oligodesoxinucleótidos fosforotioato anti-senso ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor do 76 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ complemento 1 (ΤΡΙΟ; Τ Cell Sciences, Inc.); prednisona; orgoteína; glicosaminoglicanos polissulfatados; minociclina; anticorpos anti-IL2R; lípidos marinhos e botânicos (ácidos gordos de peixe e de sementes de plantas; ver, por exemplo, DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777); auranofina; fenilbutazona; ácido meclofenâmico; ácido flufenâmico; globulina imune intravenosa; zileuton; azaribina; ácido micofenólico (RS-61443); tacrolimus (FK-506); sirolimus (rapamicina); amiprilose (terafectina); cladribina (2-clorodesoxiadenosina); metotrexato; agentes antivirais; e agentes moduladores imunes. Qualquer um dos agentes referidos acima pode ser administrado em combinação com o anticorpo para TNFa da presente descrição para tratar um distúrbio relacionado com o TNFa, utilizando o método de tratamento unidose ou de dose múltipla variável.

Numa concretização, a presente descrição inclui um artigo de manufactura ou um método de tratamento para determinar a eficácia de um inibidor do TNF, em combinação com um dos seguintes agentes, para o tratamento de um distúrbio relacionado com o TNFa em que a actividade do TNFa é prejudicial: anticorpo anti-IL12 (ABT 874); anticorpo anti-IL18 (ABT 325); pequena molécula inibidora de LCK; pequena molécula inibidora de COT; anticorpo anti-ILl; pequena molécula inibidora de MK2; anticorpo anti-CD19; pequena molécula inibidora de CXCR3; pequena molécula inibidora de CCR5; pequena molécula inibidora de CCR11; anticorpo anti-E/L-selectina; pequena molécula inibidora de P2X7; pequena molécula inibidora de IRAK-4; pequena molécula agonista do receptor de glucocorticóides; anticorpo anti-receptor C5a; pequena molécula inibidora do receptor C5a; anticorpo anti-CD32; e CD32 como uma proteína terapêutica.

Ainda noutra concretização, a presente descrição inclui um artigo de manufactura ou um método de tratamento para determinar a eficácia de um inibidor do TNF, em combinação com um antibiótico ou um agente anti-infeccioso. Os agentes anti-infecciosos incluem aqueles agentes conhecidos na técnica para tratar infecções virais, fúngicas, parasitárias ou bacterianas. O termo "antibiótico", tal como aqui utilizado, refere-se a uma substância química que inibe o crescimento ou mata os microrganismos. Este termo engloba o 77 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ antibiótico produzido por um microrganismo, assim como os antibióticos sintéticos (por exemplo, análogos) conhecidos na técnica. Os antibióticos incluem, embora não estejam limitados a estes exemplos, a claritromicina (Biaxin®) , a ciprofloxacina (Cipro®) e o metronidazol (Flagyl®) .

Noutra concretização, a presente descrição inclui um artigo de manufactura ou um método de tratamento para determinar a eficácia de um inibidor do TNF, em combinação com um fármaco utilizado para tratar a doença de Crohn ou um distúrbio relacionado com a doença de Crohn. Os exemplos de agentes terapêuticos gue podem ser utilizados para tratar a doença de Crohn incluem mesalamina, prednisona, azatioprina, mercaptopurina, infliximab, budesonida, sulfassalazina, succinato sódico de metilprednisolona, difenoxilato/sulfato de atropina, cloridrato de loperamida, metotrexato, omeprazol, folato, ciprofloxacina/dextrose-água, bitartarato de hidrocodona/apap, cloridrato de tetraciclina, fluocinonida, metronidazol, timerosal/ácido bórico, sulfato de hiosciamina, colestiramina/sacarose, cloridrato de ciprofloxacina, cloridrato de meperidina, cloridrato de midazolam, cloridrato de oxicodona/acetaminofeno, cloridrato de prometazina, fosfato de sódio, sulfametoxazol/trimetoprim, celecoxib, policarbofil, napsilato de propoxifeno, hidrocortisona, multivitaminas, balsalazida dissódica, fosfato de codeina/apap, cloridrato de colesevelam, cianocobalamina, ácido fólico, levofloxacina, natalizumab, metilprednisolona, interferão-gama e sargramostim (GM-CSF). Numa concretização, o metotrexato é administrado para o tratamento da doença de Crohn numa dose de 2,5 mg a 30 mg por semana. O anticorpo para o TNFa poderá ser administrado em combinação com corticosteróides tópicos, análogos da vitamina D, retinóides tópicos ou orais, ou suas combinações, para o tratamento da psoriase. Além disso, o anticorpo para o TNFa poderá ser administrado em combinação com um dos seguintes agentes para o tratamento da psoriase: pequena molécula inibidora de KDR (ABT-123), pequena molécula inibidora de Tie-2, calcipotrieno, propionato de clobetasol, acetonido de triancinolona, propionato de halobetasol, tazaroteno, metotrexato, fluocinonida, dipropionato de betametasona, 78 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ acetonido de fluocinolona, acitretina, champô de alcatrão, valerato de betametasona, furoato de mometasona, cetoconazol, pramoxina/fluocinolona, valerato de hidrocortisona, flurandrenolida, ureia, betametasona, propionato de clobetasol/emoliente, propionato de fluticasona, azitromicina, hidrocortisona, fórmula hidratante, ácido fólico, desonida, alcatrão, diacetato de diflorasona, etanercept, folato, ácido láctico, metoxsaleno, hidrocortisona/subgalato de bismuto/óxido de zinco/ resorcinol, acetato de metilprednisolona, prednisona, protector solar, ácido salicilico, halcinonida, antralina, pivalato de clocortolona, extracto de carvão, alcatrão/ácido salicilico, alcatrão/ácido salicilico/enxofre, desoximetasona, diazepam, emoliente, emoliente pimecrolimus, fluocinonida/emoliente, óleo mineral/óleo de ricino/lactato de sódio, óleo mineral/óleo de amendoim, petróleo/miristato de isopropilo, psoraleno, ácido salicilico, sabão/tribromsalan, timerosal/ácido bórico, celecoxib, infliximab, alefacept, efalizumab, tacrolimus, pimecrolimus, PUVA, UVB e outra fototerapia e sulfassalazina.

Numa concretização, o anticorpo para o TNFa da presente descrição e destinado a utilização nos métodos do presente invento é administrado, utilizando um método de dose múltipla-variável, para o tratamento da EA, em combinação com um dos agentes referidos acima para o tratamento de um distúrbio intestinal. Noutra concretização, os agentes adicionais referidos acima são utilizados em combinação com um anticorpo para o TNFa, no método de tratamento unidose. Ainda noutra concretização, o anticorpo para o TNFa é administrado num regime posológico bissemanal.

Qualquer um dos agentes terapêuticos referidos acima, isoladamente ou em combinação, pode ser administrado a um sujeito que sofre que um distúrbio relacionado com o TNFa em que o TNFa é prejudicial, em combinação com o anticorpo para o TNFa, utilizando um regime de tratamento de dose múltipla variável. Numa concretização, qualquer um dos agentes terapêuticos acima referidos, isoladamente ou em combinação, pode ser administrado a um sujeito que sofre de um distúrbio intestinal, juntamente com um anticorpo para o TNFa, para tratar outro distúrbio relacionado com o TNFa, tal como a 79 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ artrite reumatóide. Deve entender-se que os agentes terapêuticos adicionais podem ser utilizados em terapia de combinação como descrito acima, mas também poderão ser utilizados noutras indicações aqui descritas em que se pretende um efeito benéfico. 0 presente invento é adicionalmente ilustrado pelo exemplo seguinte, que não deve ser interpretado como limitativo de nenhuma forma.

EXEMPLO

Exemplo 1: O adalimumab suprime os biomarcadores da degradação da cartilagem e da sinovite na espondilite anquilosante (EA) activa 0 objectivo do estudo seguinte consistiu em analisar potenciais biomarcadores da destruição óssea e da cartilagem, por exemplo, marcadores da ressorção óssea, marcadores da degradação do colagénio e marcadores da sinovite, num ensaio controlado de adalimumab no tratamento da EA moderada a grave. 0 estudo também procurou analisar o efeito de um inibidor do TNF, isto é, o adalimumab, na correlação de um marcador da ressorção óssea, de um marcador da degradação do colagénio e de um marcador da sinovite com a PCR, um marcador conhecido para a EA, numa população de estudo da EA. Métodos

Os doentes com EA activa que tiveram uma resposta inadequada a pelo menos um ΑΙΝΕ ou um DMARD eram elegíveis para participar neste estudo. 0 desenho do estudo está representado na Figura 1. Os doentes foram aleatorizados para receber placebo ou adalimumab 40 mg subcutaneamente (sc), semana sim, semana não (sssn), durante um período inicial de 24 semanas em dupla ocultação, seguido de um período aberto de 80 semanas. Analisaram-se três biomarcadores na linha de base e após o tratamento com adalimumab ou placebo na semana 12 e na semana 24. Especificamente, analisou-se o marcador da ressorção óssea, N-telopéptidos do colagénio tipo I (NTX) séricos, o biomarcador da degradação do colagénio, C-telopéptidos do colagénio tipo II urinários (CTX-II 80 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ urinário), e ο biomarcador da sinovite, metaloprotease da matriz 3 sérica (MMPS). Assim, os parâmetros de eficácia primários incluíram a avaliação nos critérios do grupo de trabalho ASAS, o índice de Bath de actividade de doença para a espondilite anquilosante (BASDAI) e a PCR. Por ELISA, mediram-se as concentrações de C-telopéptidos do colagénio tipo II urinários (CTX-II urinário), N-telopéptidos do colagénio tipo I séricos (NTX) e MMP3 sérica para cada doente, na linha de base e nas semanas 12 e 24. Determinaram-se as diferenças de concentração em relação à linha de base em cada grupo de tratamento, assim como as correlações entre as alterações destes biomarcadores e outros resultados da EA.

Os critérios de inclusão dos doentes incluíram: doentes com idade ^18 anos; EA activa, definida pelo cumprimento de pelo menos 2 dos 3 critérios seguintes: (1) pontuação BASDAI ^4, (2) pontuação da escala analógica visual (VAS) para a dor lombar total á4 e (3) rigidez matinal ál hora; e resposta inadequada a pelo menos um ΑΙΝΕ.

Os critérios de exclusão dos doentes incluíram: tratamento anti-TNF recebido anteriormente; evidências radiológicas de anquilose total da coluna vertebral (coluna de "bambu"); utilização de DMARD prévio a menos de 4 semanas da linha de base (distinto de metotrexato, sulfassalazina ou hidroxicloroquina); injecção intra-articular de corticosteróides na articulação a menos de 4 semanas da linha de base; e utilização de outros compostos biológicos ou de terapia investigativa a menos de 6 semanas da linha de base.

Resultados

Um total de 82 doentes participou no estudo: 44 doentes de placebo versus 38 doentes de adalimumab. Dos 82 doentes totais, 80 (98%) doentes completaram o período de 24 semanas. Os dois doentes que não completaram o período de 24 semanas eram do grupo de placebo. As características na linha de base foram similares entre os grupos de tratamento. 0 perfil demográfico na linha de base está apresentado na Tabela 1 abaixo. 81 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

Tabela 1. Perfil demográfico na linha de base

Placebo (N=44) Adalimumab 40 mg sssn (N=38) Idade (anos)t 40, 0 41, 9 Raça (% caucasiana) 42 (95,5) 37 (97, 4) Sexo (% masculino) 36 (81,8) 29 (76,3) Peso (kg) t 78,2 76, 1 Duração da EA (anos) t 12, 1 14, 5 PCR (mg/dl) t 2,3 1,8 NTX (nm/bce) t 9, 77 10,5 Concentração de CTX-II urinário (ng/ml) 388,2 324, 8 MMP-3 (ng/ml) t 57, 1 25,3

Entre todos os doentes do estudo, os níveis de PCR correlacionaram-se de forma significativa com os níveis de CTX-II urinário, MMP3 e NTX na linha de base. A correlação entre os níveis de PCR e CTX-II urinário foi superior à correlação entre os níveis de PCR e MMP3 e NTX. As correlações dos biomarcadores e da PCR na linha de base estão apresentadas na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2. Correlações dos biomarcadores e da PCR na linha de base

Todos os doentes na linha de base r=valor de correlação (N, p-value) CTX-II urinário MMP3 NTX PCR 0,71 (8 0;<0,001) 0,45(81;<0,001) 0,37(80;0,001) CTX-II urinário - 0,27(79; 0,015) 0,49(78;<0,001) r=valor de correlação N=doentes

Ocorreram reduções significativas das concentrações de CTX-II urinário e de MMP3 (apresentado abaixo na Tabela 3) nos doentes de adalimumab em relação aos doentes de placebo na semana 12 e na semana 24 (p<0,001), mas não existiram diferenças significativas para NTX. 82 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

Tabela 3. Reduções significativas de CTX-II urinário e MMP3

Biomarcador Visita Alteração no grupo de adalimumab (%) Alteraçao no grupo de placebo (%) CTX-II urinário Semana 12 -76,8 (-9,6) 43, 8 (22,2) Semana 24 -64,7 (3,2) 47, 4 (29, 8) MMP3 Semana 12 -3,9 (-12,3) 12,4 (18,9) Semana 24 -3,2 (-8,6) 12,5 (20,1)

Como ilustrado na Figura 2, os doentes de adalimumab experimentaram reduções significativas dos níveis de CTX-II urinário em relação aos doentes de placebo na semana 12 e na semana 24. Os doentes de adalimumab também experimentaram reduções estatisticamente significativas dos níveis de MMP3 em relação aos doentes de placebo na semana 12 e na semana 24, como representado na Figura 3. Os níveis de PCR foram significativamente reduzidos nos doentes de adalimumab em comparação com os doentes de placebo na semana 12 e na semana 24 (ver Figura 24).

As alterações dos níveis de PCR, CTX-II urinário e MMP-3 da linha de base até à semana 12 correlacionaram-se estatística e significativamente no grupo de adalimumab. Observaram-se correlações significativas entre a PCR na linha de base e 1) o CTX-II urinário (r=0,71); 2) a MMP3 (r=0,45); e 3) o NTX (r=0,37) (p<0,001); e entre o CTX-II urinário e o NTX (r=0,49; p<0,0001). As alterações do CTX-II urinário e da MMP3 na semana 12 correlacionaram-se significativamente com as alterações da PCR (r=0,40 e 0,43; respectivamente) (p<0,005). Além disso, a alteração do CTX-II urinário na semana 12 correlacionou-se significativamente com a alteração da MMP3 (r=0,41; p<0,0001). No grupo de adalimumab, a análise de correlação confirma que a melhoria dos níveis de PCR está associada a uma redução dos níveis de ambos os biomarcadores CTX-II e a MMP-3. As correlações entre a alteração da PCR e dos biomarcadores em relação à linha de base na semana 12 estão apresentadas abaixo na Tabela 2. 83 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

Tabela 4. Correlações entre a alteraçao da PCR e dos biomarcadores em relação à linha de base na semana 12*

Placebo R=valor (N, de correlação p-valuet) CTX-II urinário MMP3 NTX PCR 0,21 (42,-0, 172) 0,34 (44,-0,023) 0,08 (43,-0,629) CTX-II urinário — 0, 45 (42,-0,003) 0,27 (41,-0, 089) Adalimumab CTX-II urinário MMP3 NTX PCR 0,41 (38,-0,010) 0,37 (37,-0, 024) 0,08 (37,-0,620) CTX-II urinário — 0, 15 (37,-0,375) 0,10 (37,-0,540) Em conclusão, nos doentes com EA moderada a grave, o adalimumab suprimiu significativamente os biomarcadores que reflectem a sinovite e a degradação da matriz da cartilagem. 0 adalimumab induziu a supressão dos biomarcadores que reflectem a sinovite (MMP3) e a degradação da matriz da cartilagem (CTX-II urinário), sugerindo que o adalimumab retarda os danos estruturais associados à EA. Além disso, as alterações do CTX-II urinário e da MMP3 correlacionaram-se significativamente com a alteração da PCR. 84 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Maksymowych, Walter P. et al.

ESPONDILITE

<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES DE DIAGNÓSTICO DA ANQUILOSANTE UTILIZANDO BIOMARCADORES

<130> BBI-235PC <140> PCT/US06/42564 <141> 2006-10-31 <150> 60/732444 <151> 2005-11-1 <160> 37 <170> FastSEQ para Windows, versão 4.0

<210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Região variável da cadeia leve de D2E7 <400> 1

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Axg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tvr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Glv Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 BO Glu Asp Vai Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105

<210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial 85 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ <220> <223> Região variável da cadeia pesada de D2E7 <400> 2

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 · 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr cys 85 90 95 Ala Lys Vai Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de D2E7 <221> VARIANTE <222> 9 <223> Xaa = Thr ou Ala <400> 3

Gin Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Xaa 1 5

<210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia pesada de D2E7 <221> VARIANTE <222> 12 <223> Xaa = Tyr ou Asn 86 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ <400> 4

Vai Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Xaa 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR2 da região variável de cadeia leve de D2E7 <400> 5

Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR2 da região variável de cadeia pesada de D2E7 <400> 6

Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Vai Glu 1 Gly 5 10 15 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR1 da região variável de cadeia leve de D2E7 <400> 7

Arg Ala Ser Gin Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial 87 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ <220> <223> CDR1 da região variável de cadeia pesada de D2E7 <400> 8

Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 9

<211> 107 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Região variável de cadeia leve de 2SD4 <400> 9

Asp Xle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Xle Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Xle Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Vai Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr 85 90 95 Ala Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Xle Lys 100 105

<210> 10 <211> 121 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Região variável de cadeia pesada de 2SD4 88 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ <40 0> 10

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala' Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Vai 35 40 45 Ser Ala Xle Thr Trp Asn Ser Gly His Xle Asp Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Ala Vai Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyx Cys 85 90 95 Thr Lys Ala Ser Tyx Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asn Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial < 220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de 2SD4 <400> 11

Gin Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Ala 1 S

<210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de ΕΡ B12 <400> 12

Gin Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala 1 5

<210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de VL10E4 89 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ <400> 13

Gin Lys Tyr Gin Arg Ala Pro Tyr Thr 1 5

<210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de VL100A9 <400> 14

Gin Lys Tyr Ser Ser Ala Pro Tyr Thr 1 5

<210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de VLL100D2 <400> 15

Gin Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Thr 1 5

<210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de VLL0F4 <400> 16

Gin Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr 1 5

<210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial ΕΡ 1 948 235/ΡΤ 90 <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de LOE5 <400> 17

Gin Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Tyr 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de VLLOG7 <400> 18

Gin lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Asn 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de VLLOG9 <400> 19

Gin Lys Tyr Thr Ser Ala Pro Tyr Thr 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de VLLOH1 <400> 20

Gin Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Asn 1 . 5 <210> 21 <211> 9 91 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de VLLOHIO <400> 21

Gin lys Tyr Asn Ser Ala Ala Tyr Ser 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de VL1B7 <400> 22

Gin Gin Tyr Asn Ser Ala Pro Asp Thr 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de VL1C1 <400> 23

Gin Lys Tyr Asn Ser Asp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de VL0.1F4 <400> 24

Gin Lys Tyr Ile Ser Ala Pro Tyr Thr 1 S 92 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ

<210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de VL0.1H8 <400> 25

Gin Lys Tyr Asn Arg Pro Pro Tyr Thr 1 5

<210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia leve de L0E7.A <400> 26

Gin Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala 1 5

<210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia pesada de 2SD4 <400> 27

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asn 15 10

<210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia pesada de VH1B11 93 ΕΡ 1 948 235/ΡΤ <400> 28

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Lys 15 10

<210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia pesada de VH1D8 <400> 29

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Tyr 15 10

<210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia pesada de VH1A11 <400> 30

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asp 1 5 10

<210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia pesada de VH1B12 <400> 31

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Phe Ser Leu Asp Tyr 15 10

<210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial ΕΡ 1 948 235/ΡΤ 94 <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia pesada de VH1E4 <400> 32

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu His Tyr 1 5 10 <210> 33 <211> 12

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia pesada de VH1F6 <400> 33

Ala Ser Phe Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Glu Tyr 1 5 10 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia pesada de 3C-H2 <400> 34

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Glu Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> CDR3 da região variável de cadeia pesada de VH1-D2.N <400> 35

Vai Ser Tyr leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Asn 15 10 <210> 36 <211> 321 95

ΕΡ 1 948 235/ΡΤ <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Região variável da cadeia leve de D2E7 <400> 36 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtagggga cagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca gggcatcaga aattacttag cctggtatca gcaaaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatetatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctacagcct gaagatgttg caacttatta ctgtcaaagg tataaccgtg caccgtatac ttttggccag gggaccaagg tggaaatcaa a

<210> 37 <211> 363 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Região variável da cadeia pesada de D2E7 <400> 37 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ccggcaggtc cctgagactc tcctgtgcgg cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct ccagggaagg gcctggaatg ggtctcagct atcacttgga atagtggtca catagactat gcggactctg tggagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat ctgcaaatga acagtctgag agctgaggat acggccgtat attactgtgc gaaagtctcg taccttagca ccgcgtcctc ccttgactat tggggccaag gtaccctggt caccgtctcg agt 1

Lisboa, 2013-11-19

Claims (11)

1. ΕΡ 1 948 235/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Método de determinação da eficácia do adalimumab para o tratamento da espondilite anquilosante (EA) num sujeito com EA, em que o referido método compreende a determinação de um nível de C-telopéptido do colagénio tipo II (CTX-II) pós-tratamento e um nível de metaloprotease da matriz 3 (MMP3) pós-tratamento em amostra(s) obtida(s) do sujeito com EA, onde um nível de CTX-II pós-tratamento inferior na(s) amostra(s) em relação a um nivel de CTX-II padrão conhecido baseado em sujeito (s) com EA e um nível de MMP3 pós-tratamento inferior na(s) amostra(s) em relação a um nível de MMP3 padrão conhecido baseado em sujeito(s) com EA indica que o adalimumab é eficaz para o tratamento da EA no sujeito.
2. 2. Método de determinação da eficácia do adalimumab para o tratamento da espondilite anquilosante (EA) num sujeito com EA, em que o referido método compreende a determinação de um nível de C-telopéptido do colagénio tipo II (CTX-II) pré-tratamento e um nível de metaloprotease da matriz 3 (MMP3) pré-tratamento em amostra(s) obtida(s) do sujeito com EA, onde um nível de CTX-II pós-tratamento inferior em relação ao nível de CTX-II pré-tratamento e um nível de MMP3 pós-tratamento inferior em relação ao nível de MMP3 pré-tratamento indica que o adalimumab é eficaz para o tratamento da EA no sujeito.
3. 3. Método de determinação da eficácia do adalimumab para o tratamento da espondilite anquilosante (EA) num sujeito com EA, em que o referido método compreende a determinação de um nível de C-telopéptido do colagénio tipo II (CTX-II) pós-tratamento e um nivel de metaloprotease da matriz 3 (MMP3) pós-tratamento em amostra(s) obtida(s) do sujeito com EA, ΕΡ 1 948 235/ΡΤ 2/3 onde um nível de CTX-II pós-tratamento inferior em relação a um nível de CTX-II pré-tratamento e um nível de MMP3 pós- tratamento inferior em relação a um nível de MMP3 pré-tratamento indica que o adalimumab é eficaz para o tratamento da EA no sujeito
4. 4. Método de determinação da eficácia do adalimumab para o tratamento da espondilite anquilosante (EA) num sujeito com EA, em que o referido método compreende a determinação de um nível de C-telopéptido do colagénio tipo II (CTX-II) pós-tratamento em amostra(s) do sujeito com EA, onde uma diminuição do nível de CTX-II de pelo menos 9% em relação a um nível de CTX-II padrão conhecido baseado em sujeito(s) com EA indica que o adalimumab é eficaz para o tratamento da EA no sujeito.
5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o CTX-II é o CTX-II urinário.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o nível de CTX-II pós-tratamento na(s) amostra(s) obtida(s) do sujeito é uma redução de pelo menos cerca de 9% em relação ao nível de CTX-II padrão conhecido baseado em sujeito(s) com EA.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o nível de MMP3 pós-tratamento na(s) amostra(s) obtida(s) do sujeito é uma redução de pelo menos cerca de 8% em relação ao nível de MMP3 padrão conhecido baseado em sujeito(s) com EA.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a MMP3 é a MMP3 sérica.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, compreendendo adicionalmente a comparação do nível de proteína C reactiva (PCR) do sujeito com um nível de PCR padrão conhecido associado à EA, e ΕΡ 1 948 235/ΡΤ 3/3 a determinação se o nível de PCR do sujeito é superior ao nível de PCR padrão conhecido, em que um nível de PCR inferior em relação ao nível de PCR padrão conhecido indica a eficácia do tratamento.
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o nível de MMP3 é determinado por ELISA.
11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o nível de CTX-II é determinado por ELISA. Lisboa, 2013-11-19