PT1891446E - Processo para a identificação de novos compostos de interacção enzimática - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"PROCESSO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE NOVOS COMPOSTOS DE INTERACÇÃO ENZIMÁTICA" A presente invenção refere-se a métodos para a caracterização de enzimas utilizando ligandos enzimáticos ligados a suportes sólidos. 0 objectivo da identificação de fármacos é o de desenvolver medicamentos eficazes e seguros. De modo a alcançar este objectivo, a investigação farmacêutica visa, de um modo preferido, a identificação de fármacos de moléculas pequenas, dirigidos a alvos de fármacos que são conhecidos por serem causativos para a doença de interesse.

Tradicionalmente, a maioria dos fármacos de moléculas pequenas é dirigida contra proteínas receptoras (receptores de membrana celular, tais como receptores ligados a proteina G (GPCR) ou receptores de hormonas nucleares), canais iónicos e enzimas. Das enzimas, são de interesse particular, e. g., proteases, fosfodiesterases e cinases (Revisão: Drews, 2000, "Descoberta de fármacos: uma perspectiva histórica", Science 287, 1960-1964) .

As proteases são consideradas como alvos de fármacos tratáveis, como demonstrado pela gestão eficaz da SIDA, com inibidores de protease do VIH ou a utilização de inibidores da enzima de conversão de angiotensina para tratar a hipertensão. Para o tratamento do cancro, estão em desenvolvimento inibidores 1 de protease dirigidos contra metaloproteinases e caspases de matriz (Docherty et al., 2003, "Proteases como alvos de fármacos", Biochemical Society Symposia 70, 147-161).

As fosfodiesterases (PDE) compreendem uma família de enzimas que catalisam a hidrólise de cAMP ou cGMP e estão implicadas em diversas doenças. O inibidor de PDE5, sildenafil (Viagra), proporciona um tratamento eficaz para a disfunção eréctil. Actualmente, os inibidores de PDE4 (e. g., cilomast e roflumast) estão em testes clínicos como terapêutica anti-inflamatória. Um importante desafio neste campo é o desenvolvimento de inibidores específicos de isotipos de PDE, de modo a evitar a reactividade cruzada que é responsável por efeitos secundários (Card et al., 2004, "Base estrutural para a actividade de fármacos que inibem fosfodiesterases", Structure 12, 2233-2247) .

As cinases catalisam a fosforilação de proteínas, lípidos, açúcares, nucleósidos e outros metabolitos celulares e desempenham papéis chave em todos os aspectos da fisiologia celular eucariótica. A fosforilação de proteínas é uma modificação pós-traducional comum das proteínas e afecta a estrutura e função das proteínas em numerosos modos.

Uma classe de cinases que se tornou num foco recente da identificação de fármacos compreende as cinases de proteína, porque se mostrou que desempenham papéis importantes na iniciação e progressão de tumores, através da desregulação das vias de transdução de sinal (receptor de EGF no cancro do pulmão; superexpressão de receptor de ErbB2/Her-2 no cancro da 2 mama; proteína de fusão BCR-ABL na leucemia; Revisão: Blume-Jensen e Hunter, 2001, "Sinalização de cinase oncogénica", Nature 411, 355-365) . O complemento de cinases de proteína codificado no genoma humano compreende 518 membros de família (quinoma) que podem ser agrupados em várias subfamílias de acordo com a semelhança de sequência (Revisão: Manning et al., 2002, O Complemento de Cinase de proteína do Genoma Humano, Science 298, 1912-1934). Em qualquer célula ou tecido apenas é expresso um subconjunto do quinoma. As cinases transferem grupos de fosfato de ATP para moléculas de substrato e, desse modo, influenciam a estabilidade, actividade e função dos seus alvos. A cavidade de ligação de ATP das diferentes cinases é estruturalmente semelhante e, por conseguinte, considera-se que é difícil desenvolver inibidores competitivos de ATP selectivos. A família de cinases é uma família enzimática de grandes dimensões (em comparação com outras classes enzimáticas relevantes como alvos de fármacos, e. g., fosfodiesterases), proporcionando múltiplas oportunidades para a descoberta de fármacos mas também desafios únicos (família de grandes dimensões; semelhança estrutural das cavidades de ligação de ATP; elevada concentração de ATP intracelular) (Revisão: Cohen, P., 2002, Cinases de proteína - os principais alvos de fármacos do século vinte e um? Nature Reviews Drug Discovery, volume 1, 309-315).

Outra classe de cinases de interesse são as cinases de lípido. As cinases de lípido catalisam a transferência de grupos de fosfato gama de nucleósidos trifosfatos para substratos lipídicos. 3

As cinases de lípido, tal como os membros da família da fosfoinositídeo 3-cinase (PI3K) , são conhecidas por serem moduladores da resposta celular a factores de crescimento, hormonas e neurotransmissores e estão envolvidas no cancro, diabetes e outras doenças (Fruman et al., 1998 . Fosfoinositídeo cinases. Annual Review Biochemistry 67, 481-507; Cantley, L.C., 2002, Science 296, 1655-1657).

Um pré-requisito para a identificação de compostos que interagem com proteínas, e. g., enzimas, é a provisão de preparações de proteína contendo tantas proteínas quanto possível de uma classe, numa grande pureza. Especialmente, a provisão de muitas proteínas de uma classe (e. g., cinases) é importante, dado que esta possibilita o rastreio de compostos farmacêuticos potencialmente interessantes contra muitos membros da família de proteínas (denominada identificação hit) . Outras utilizações exequíveis dessas preparações de proteína incluem o teste de compostos quimicamente optimizados (optimização lead) , a determinação da selectividade de um determinado composto (definição de perfil de selectividade), assim como a confirmação do modo de acção de um determinado composto.

Na técnica, foram propostas várias estratégias para avaliar esta questão.

Uma abordagem para enriquecer proteínas de ligação de ATP, tais como cinases e outras proteínas de ligação de nucleótido, de extractos celulares, depende de ATP imobilizado como reagente de afinidade, i. e., da utilização de um ligando que se liga a potencialmente todas as enzimas de ligação de ATP. Neste caso, o ATP é imobilizado covalentemente pela ligação do grupo de fosfato gama através de um ligante a uma resina (Graves et al. , 4 2002, Molecular Pharmacology 62, N° 6 1364-1372; documento US 5536822). Esta abordagem foi ainda estendida à ligação de compostos simples de bibliotecas combinatórias de compostos (documento WOOO/63694).

Uma desvantagem do ATP imobilizado é que a afinidade para cinases é bastante baixa, conduzindo a captura ineficiente de cinases ou rápida eluição, devido a elevadas velocidades de subtracção. Outra desvantagem é que as cinases não são preferencialmente capturadas, mas também outras classes de proteínas de ligação de ATP que podem ser expressas a niveis muito superiores na célula. As proteínas de ligação de ATP mais abundantes podem causar captura ineficiente, devido a competição, ou podem conduzir a problemas durante a análise de espectrometria de massa das proteínas ligadas se a profundidade analítica não for suficiente.

Outra abordagem descrita na técnica é a utilização de ligandos específicos para uma enzima individual, nomeadamente inibidores de cinase de elevada afinidade e altamente selectivos ou derivados próximos (e. g., fármacos optimizados) . Estes são utilizados para enriquecer cinases de lisados celulares e o mesmo composto não modificado é utilizado para eluição específica, de modo a identificar o alvo ou alvos de fármacos celulares (Godl et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 100, 15434-15439; documento WO 2004/013633). Esta abordagem é bem sucedida apenas se a relação de afinidade de estrutura (SAR) não for destruída através da modificação química do fármaco, mas falha se a SAR estiver comprometida. Além disso, é difícil identificar alvos mediando efeitos secundários não desejados, devido à SAR do alvo de fármaco correlacionado e o alvo de efeito secundário poderem 5 ser diferentes e esta última SAR nao ser habitualmente conhecida.

Um rastreio intensivo de uma biblioteca de química combinatória de purinas 2,6, 9-trissubstituídas conduziu à identificação de um inibidor de CDK potente e selectivo, denominado purvalanol (Knockaert et al., 2002, Oncogene,

Vol. 21, 6413-6424). Aqui, os extractos de células foram rastreados para proteínas de interacção de purvalanol por cromatografia de afinidade, na presença de compostos imobilizados. É ainda descrita na técnica, a identificação de novas proteínas alvo da via de sinalização de GMP cíclico, pela realização de ensaios de ligação de competição em lisados tecidulares, nos quais o ligando cGMP imobilizado é incubado com extractos celulares na ausência e presença de quantidades em excesso de ligandos livres (Kim e Park, 2003, Journal of Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 36, 299-304).

Outra estratégia é a expressão in vitro de enzimas de uma determinada classe, e. g., cinases. Fabian e colegas (Fabian et al., 2005, Nature Biotechnology 23(3), 329-336; documento WO 03084981) descrevem um método de definição de perfil de cinase que não se baseia na captura das cinases endógenas contidas em lisados celulares mas utiliza cinases apresentadas no bacteriófago T7. As cinases (ou domínios de cinase) utilizadas neste ensaio são proteínas de fusão que estão marcadas, de modo a permitir a expressão, purificação e detecção. No ensaio de ligação de competição, estas cinases marcadas com f ago sao ligadas a um inibidor de cinase imobilizado, tratadas com um composto de teste nao imobilizado e 6 as cinases marcadas ligadas são quantificadas por PCR em tempo real, utilizando o ADN de fago como um molde. Uma desvantagem deste método é que as cinases necessitam de ser clonadas e apenas uma fracção das cinases marcadas com fago está enrolada no estado nativo correcto. Além disso, essas preparações de proteína não reflectem, de modo algum, a situação natural numa célula.

Ainda outra abordagem utiliza sondas dirigidas para sítio activo (denominadas sondas baseadas em actividade) que formam ligações covalentes com enzimas alvo. Este método foi utilizado para definição de perfil de expressão de serinas hidrolases com sondas altamente selectivas (Liu et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sei. 96, 14694-14699, documento WO 01/77668) e posteriormente expandidas a outras famílias enzimáticas pela utilização de sondas mais indiscriminadas, consistindo de bibliotecas de sondas baseadas em actividade não dirigida de ésteres de sulfonato fluorescentes marcados com rodamina e biotina (Adam et al., 2002, Nature Biotechnology 20, 805-809, documentos WO 01/77684, WO 03/047509). Contudo, permanece pouco claro que propriedades estruturais e/ou catalíticas são partilhadas por estas enzimas marcadas com sulfonato. Outra limitação desta abordagem é a dificuldade de distinguir interaeções específicas com enzimas e interaeções não específicas, causadas pela reactividade intrínseca das sondas.

Finalmente, tentou-se enriquecer proteínas fosforiladas em tirosinas por anticorpos específicos de tirosina (Blogoev et al., 2004, Nature Biotechnology 9, 1139-1145). Blogoev e colegas descrevem um método que pode ser utilizado para estudar o efeito de compostos, tal como factor de crescimento epidérmico (EGF), nas vias de transdução de sinal dependentes de 7 fosfotirosina. Após lise das células estimuladas por EGF, as proteínas contendo fosfotirosina são enriquecidas por imunoprecipitação com anticorpos dirigidos conta fosfotirosina. No segundo passo, estas proteínas enriquecidas são analisadas e identificadas por análise de espectrometria de massa. Uma limitação importante desta abordagem é que apenas as proteínas fosforiladas em tirosina podem ser capturadas.

Considerando o anterior, há uma necessidade de métodos melhorados para a caracterização das enzimas de uma determinada classe que são expressas numa célula. Além disso, há uma necessidade de métodos melhorados para a identificação de enzimas sendo parceiros de ligação de um determinado composto. A presente invenção satisfaz estas necessidades. No contexto da presente invenção, foi surpreendentemente verificado que a utilização de, pelo menos, um ligando enzimático de largo espectro, imobilizado num suporte sólido, possibilita o isolamento eficaz de enzimas a partir de uma preparação de proteína, de um modo preferido, um lisado celular. Após este isolamento, podem ser aplicados métodos eficazes para a caracterização da enzima ligada ao ligando enzimático de largo espectro ou para a identificação de interacções de composto-enzima. A enzima é, de um modo preferido, identificada por espectrometria de massa. Por conseguinte, a presente invenção proporciona métodos eficazes para a caracterização de enzimas ou a identificação de parceiros de ligação a um determinado composto.

Num primeiro aspecto, a presente invenção descreve um método para a caracterização de, pelo menos, uma enzima, compreendendo os passos de: a) proporcionar uma preparação de proteína contendo a enzima, de um modo preferido pela recolha de, pelo menos, uma célula contendo a enzima e a lise da célula, b) colocar a preparação de proteína sob condições essencialmente fisiológicas em contacto com, pelo menos, um ligando enzimático de largo espectro, imobilizado num suporte sólido, sob condições permitindo a ligação da enzima ao referido ligando enzimático de largo espectro, c) eluir a enzima e d) caracterizar a enzima eluída por espectrometria de massa.

Num segundo aspecto, a presente invenção proporciona um método para a caracterização de, pelo menos, uma enzima, compreendendo os passos de: a) proporcionar duas alíquotas, cada compreendendo, pelo menos, uma célula contendo a enzima, b) incubar uma alíquota com um determinado composto diferente dos ligandos, c) recolher as células, d) lisar as células, e) colocar os lisados celulares, sob condições essencialmente fisiológicas, em contacto com, pelo menos, dois ligandos enzimáticos de largo espectro diferentes, em que os ligandos estão imobilizados num 9 suporte sólido, sob condições permitindo a ligação da enzima aos referidos ligandos enzimáticos de largo espectro, f) eluir a enzima ou enzimas e g) caracterizar a enzima ou enzimas eluidas por espectrometria de massa quantitativa.

De acordo com um terceiro aspecto da invenção, a invenção proporciona um método para a caracterização de, pelo menos, uma enzima, compreendendo os passos de: a) proporcionar duas aliquotas de uma preparação de proteína contendo a enzima, de um modo preferido pela recolha de, pelo menos, uma célula contendo a enzima e a lise da célula, b) colocar uma alíquota, sob condições essencialmente fisiológicas, em contacto com, pelo menos, dois diferentes ligandos enzimáticos de largo espectro, em que os ligandos estão imobilizados num suporte sólido, sob condições permitindo a ligação da enzima aos referidos ligandos enzimáticos de largo espectro, c) colocar a outra alíquota, sob condições essencialmente fisiológicas, em contacto com, pelo menos, dois ligandos enzimáticos de largo espectro diferentes, em que os ligandos estão imobilizados num suporte sólido, sob condições permitindo a ligação da enzima aos referidos ligandos enzimáticos de largo espectro e com um determinado composto dos ligandos diferente, d) eluir a enzima ou enzimas e e) caracterizar a enzima ou enzimas eluidas por espectrometria de massa quantitativa, 10 em que uma detecção reduzida da enzima na alíquota incubada com o composto indica que a enzima é um alvo directo do composto.

De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, é descrito um método para a caracterização de um complexo de enzima-composto, compreendendo os passos de: a) proporcionar uma preparação de proteína contendo a enzima, de um modo preferido pela recolha de, pelo menos, uma célula contendo a enzima e a lise da célula, b) colocar a preparação de proteína sob condições essencialmente fisiológicas em contacto com, pelo menos, um ligando enzimático de largo espectro, imobilizado num suporte sólido, sob condições permitindo a ligação da enzima ao referido ligando enzimático de largo espectro, c) colocar as enzimas ligadas em contacto com um composto para libertar, pelo menos, uma enzima ligada e d) caracterizar a enzima ou enzimas libertadas por espectrometria de massa ou e) eluir a enzima ou enzimas do ligando e caracterizar a enzima ou enzimas por espectrometria de massa identificando, desse modo, um ou mais parceiros de ligação do composto. 11

As abordagens, como mencionado acima, especialmente o método de acordo com o 4o aspecto, têm as seguintes vantagens: - Não é necessária expressão in vitro das enzimas, mas são utilizadas as enzimas endógenas de lisados celulares. - Surpreendentemente, verificou-se que os ligandos de cinase de larga especificidade capturam cinases muito eficientemente. - Os compostos de teste não necessitam de estar ligados ou imobilizados (método de ensaio isento de marcador). A ligação ou eluição de competição é possível com qualquer composto de interesse (não modificado, não imobilizado). - Não são necessários substratos enzimáticos (como em ensaios enzimáticos bioquímicos). - É possível caracterizar o efeito in vivo do composto numa via de transdução de sinal (ver o 2o aspecto). - É possível a identificação de alvos directos e indirectos.

Ao longo da invenção, o termo "enzima" também inclui cada proteína ou péptido na célula sendo capaz de se ligar a um ligando, tais como transportadores, canais iónicos e proteínas, que interagem com enzimas, tal como proteínas adaptadoras 12 contendo domínios de interacção peptídica (e. g., domínios de SH2, SH3 e PDZ).

Contudo, de um modo preferido, o termo "enzima" é interpretado no seu modo habitual como sendo um biocatalisador numa célula.

Em toda a invenção, a expressão "ligando enzimático de largo espectro" refere-se a um ligando gue é capaz de se ligar a algumas mas não todas as enzimas presentes numa preparação de proteína. A presente invenção refere-se, de um modo preferido, a métodos para a caracterização de enzimas ou à identificação de parceiros de ligação a um determinado composto, em que a enzima ou os parceiros de ligação estão incluídos num lisado celular. Contudo, os métodos da presente invenção também podem ser realizados com qualquer preparação de proteína como um material de partida, desde que a(s) proteína(s) esteja(m) solubilizada (s) na preparação. Os exemplos incluem uma mistura líquida de várias proteínas, um lisado celular parcial que não contém todas as proteínas presentes na célula original ou uma combinação de vários lisados celulares.

Os lisados celulares parciais podem ser obtidos, em primeiro lugar, pelo isolamento de organelos celulares (e. g., núcleo, mitocôndrias, ribossomas, golgi, etc.) e, depois, preparar preparações de proteína derivadas destes organelos. Os métodos para o isolamento de organelos celulares são conhecidos na técnica (Capítulo 4.2, Purificação de Organelos a Partir de Células de Mamíferos, em "Current Protocols in Protein Science", 13

Editores: John. E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield; Wiley, ISBN: 0-471-14098-8).

Além disso, as amostras de proteína podem ser preparadas por fraccionamento de extractos celulares enriquecendo, desse modo, tipos específicos de proteínas, tais como proteínas citoplasmáticas ou membranares (Capítulo 4.3, Fraccionamento Subcelular de Células de Cultura Tecidos, em "Current Protocols in Protein Science", Editores: John. E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield; Wiley, ISBN: 0-471-14098-8).

Além disso, podem ser utilizadas preparações de proteína de fluidos corporais (e. g., sangue, fluido cerebrospinal, fluido peritoneal e urina).

Em toda a invenção, a expressão "suporte sólido" refere-se a cada suporte não dissolvido sendo capaz de imobilizar o referido ligando enzimático de largo espectro na sua superfície. O método da invenção, de acordo com o segundo aspecto, abrange, como passos iniciais, uma provisão de duas alíquotas, cada compreendendo, pelo menos, uma célula contendo a enzima e incubando uma alíquota com um determinado composto. Numa forma de realização preferida, a, pelo menos, uma célula é parte do sistema de cultura celular que está dividido em, pelo menos, duas alíquotas. Uma alíquota de células é, depois, incubada com o composto determinado. Os métodos para a incubação de sistemas de cultura celular com compostos são conhecidos na técnica (Giuliano et al., 2004, "O rastreio de elevado teor com ARNsi optimiza uma abordagem biológica celular à identificação de fármacos: definindo o papel da activação de p53 na resposta 14 celular a fármacos anticancerígenos". Journal of Biomolecular Screening 9(7), 557-568).

Contudo, também está incluído na presente invenção que a, pelo menos, uma célula de cada alíquota é parte de um sistema in vivo, e. g., um sistema de murganho ou um sistema de vertebrado inferiores.

Por exemplo, podem ser utilizados lisados de embrião intactos derivados de estádios em desenvolvimento definidos ou estádios adultos de organismos de modelo, tal como C. elegans. Além disso, órgãos intactos, tal como coração dissecado de murganhos, podem ser a fonte de preparações de proteína. Estes órgãos também podem ser perfundidos in vitro e serem, assim, tratados com o composto de teste ou fármaco de interesse.

Todos os métodos da presente invenção incluem, pelo menos, numa forma de realização preferida, os passos de recolha de, pelo menos, uma célula contendo a enzima e a lise da célula.

Numa forma de realização preferida, a célula é parte de um sistema de cultura celular e os métodos para a recolha de uma célula a partir de um sistema de cultura celular são conhecidos na técnica (literatura supra). A escolha da célula irá depender, principalmente, da classe de enzimas destinadas a serem analisadas, dado que tem que ser garantido que a classe de enzima esteja, principalmente, presente na célula de escolha. De modo a determinar se uma determinada célula é um sistema de partida adequado para os métodos da invenção, métodos como transferência de Western, métodos de detecção do ácidos nucleicos baseados em PCR, métodos 15 de transferência de Northern e de micromatriz de ADN ("chips de ADN"), poderão ser adequados de modo a determinar, se uma determinada classe de enzimas está presente na célula. A escolha da célula também será influenciada pelo objectivo do estudo. Se o alvo in vivo para um determinado fármaco necessitar de ser identificado, então serão seleccionadas as células ou tecidos nos quais ocorre o efeito terapêutico desejado (e. g., tecido de cancro da mama para fármacos anticancerígenos). Em contraste, para a elucidação dos alvos de proteína mediando efeitos secundários não desejados, será analisada a célula ou tecido no qual é observado o efeito secundário (e. g., tecido de cérebro para efeitos secundários no SNC) .

Além disso, na presente invenção, considera-se que a célula contendo a enzima pode ser obtida de um organismo, e. g., por biopsia. Os métodos correspondentes são conhecidos na técnica. Por exemplo, uma biopsia é um processo de diagnóstico utilizado para se obter uma pequena quantidade de tecido que pode ser, depois, examinado microscopicamente ou com métodos bioquímicos. As biopsias são importantes para diagnosticar, classificar e estadiar uma doença, mas também para avaliar e monitorizar o tratamento de fármacos. As biopsias de cancro da mama foram anteriormente realizadas como processos cirúrgicos mas, hoje em dia, são preferidas biopsias de agulha (Oyama et al., 2004,

Breast Câncer 11(4), 339-342).

Os métodos descritos da invenção permitem a definição de perfil das amostras de tecido para a presença de classes enzimáticas. Por exemplo, podem ser identificadas enzimas mutadas causativas para a doença (e. g., mutações pontuais que 16 activam cinases oncogénicas). Além disso, as enzimas mutadas que surgem durante o tratamento e são responsáveis pela resistência ao tratamento podem ser elucidadas (e. g., mutações de receptor de EGF causando resistência a fármacos anticancerigenos). A biopsia de fígado é utilizada, por exemplo, para diagnosticar a causa da doença hepática crónica que resulta num fígado hipertrofiado ou resultados de testes de fígado anormais causados por actividades de enzimas hepáticas elevadas (Rocken et ai., 2001, Liver 21(6), 391-396).

Está abrangido na presente invenção que, pela recolha da, pelo menos, uma célula, a lise é realizada simultaneamente. Contudo, é igualmente preferido que a célula seja, em primeiro lugar, recolhida e, depois, separadamente lisada.

Os métodos para a lise de células são conhecidos na técnica (Karwa e Mitra: Preparação de amostras para a extracção, isolamento e purificação do ácidos Nucleicos; capítulo 8, em "Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry", Wiley 2003, Editor: Somenath Mitra, ISBN de impressão: 0471328456; ISBN electrónico: 0471457817). A lise de diferentes tipos de células e tecidos pode ser alcançada por homogeneizadores (e. g., homogeneizador de Potter), desintegradores ultra-sónicos, lise enzimática, detergentes (e. g., NP-40, Triton X-100, CHAPS, SDS), choque osmótico, congelação e descongelação repetida, ou uma combinação destes métodos.

Além disso, todos os métodos da invenção contêm o passo de colocar a preparação celular ou lisado celular, sob condições essencialmente fisiológicas, em contacto com, pelo menos, dois diferentes ligandos enzimáticos de largo espectro, imobilizados 17 num suporte sólido, sob condições permitindo a ligaçao da enzima aos referidos ligandos enzimáticos de largo espectro. A colocação em contacto, sob condições essencialmente fisiológicas, tem a vantagem de que as interacções entre o ligando, a preparação celular (i. e., a enzima a ser caracterizada) e, opcionalmente, o composto reflecte, tanto quanto possível, as condições naturais. "Condições essencialmente fisiológicas" são, inter alia, as condições que estão presentes no material de amostra original, não processado. Incluem a concentração de proteína fisiológica, pH, concentração de sal, capacidade de tamponização e modificações pós-traducionais das proteínas envolvidas. A expressão "condições essencialmente fisiológicas" não requer condições idênticas às no organismo vivo original, de onde a amostra é derivada, mas condições essencialmente semelhantes às celulares ou condições próximas das condições celulares. 0 especialista na técnica irá, evidentemente, compreender que podem surgir determinados constrangimentos devido à configuração experimental que conduzirão, eventualmente, a condições menos semelhantes às celulares. Por exemplo, a dissociação eventualmente necessária de paredes celulares ou membranas celulares, quando se recolhe e processa uma amostra de um organismo vivo, pode requerer condições que não são idênticas às condições fisiológicas verificadas no organismo. As variações adequadas das condições fisiológicas para a prática dos métodos da invenção serão evidentes para os especialistas na técnica e estão abrangidas pela expressão "condições essencialmente fisiológicas", como aqui utilizado. Em resumo, deve ser compreendido que a expressão "condições essencialmente fisiológicas" se refere a condições próximas das condições fisiológicas como, e. g., verificado em 18 células naturais, mas não requer necessariamente que estas condições sejam idênticas.

De um modo preferido, "condições essencialmente fisiológicas" pode compreender NaCl ou KC1 a 50-200 mM, pH 6,5-8,5, 20-45 °C e catião divalente a 0,001-10 mM (e. g., Mg++, Ca++) ; de um modo mais preferido, cerca de 150 mM de NaCl ou KC1, pH 7,2 a 7,6, catião divalente a 5 mM e, frequentemente, incluem, 0,01-1,0 porcento de proteína não específica (e. g., BSA) . Um detergente não iónico (Tween, NP-40, Triton-X100) pode estar, frequentemente, presente, habitualmente a cerca de 0,001 a 2%, tipicamente 0,05-0,2% (volume/volume). Para orientações gerais, podem ser aplicáveis as seguintes condições aquosas tamponadas: NaCl a 10-250 mM, Tris HC1 a 5-50 mM, pH 5-8, com adição opcional de catião (catiões) divalente(s) e/ou quelantes metálicos e/ou detergentes não iónicos.

De um modo preferido, "condições essencialmente fisiológicas" significa um pH de 6,5 a 7,5, de um modo preferido desde 7,0 a 7,5 e/ou uma concentração de tampão de 10 a 50 mM, de um modo preferido desde 25 a 50 mM e/ou uma concentração de sais monovalentes (e. g., Na ou K) de 120 a 170 mM, de um modo preferido 150 mM. Os sais divalentes (e. g., Mg ou Ca) podem, ainda, estar presentes a uma concentração de 1 a 5 mM, de um modo preferido 1 a 2 mM, em que, de um modo mais preferido, o tampão é seleccionado do grupo consistindo de Tris-HCl ou HEPES.

No contexto da presente invenção, a expressão "sob condições permitindo a ligação da enzima aos referidos ligandos enzimáticos de largo espectro" inclui todas as condições sob as quais essa ligação é possível. Isto inclui a possibilidade de se ter o suporte sólido numa fase imobilizada e verter o lisado 19 sobre a mesma. Noutra forma de realização preferida, também está incluído que o suporte sólido esteja numa forma particulada e misturada com o lisado celular.

Numa forma de realização preferida, a ligação entre ligando e enzima é uma ligação não covalente, reversível, e. g., por meio de pontes de sal, ligações de hidrogénio, interacções hidrófobas ou uma sua combinação.

Além disso, os métodos da invenção incluem o passo de eluição da enzima ou enzimas dos ligandos imobilizados no suporte sólido.

Esses métodos são principalmente conhecidos na técnica e dependem da natureza da interacção ligando-enzima. Principalmente, a alteração da força iónica, o valor de pH, a temperatura ou incubação com detergentes são métodos adequados para dissociar as enzimas alvo do ligando imobilizado. A aplicação de um tampão de eluição pode dissociar parceiros de ligação por extremos de valor de pH (pH elevado ou baixo; e. g., diminuição de pH pela utilização de citrato a 0,1 M, pH 2-3), alteração de força iónica (e. g., elevada concentração de sal utilizando Nal, Kl, MgCl2 ou KC1), agentes de redução de polaridade que dissociam interacções hidrófobas (e. g., dioxano ou etilenoglicol) ou agentes desnaturantes (sais caotrópicos ou detergentes, tais como sódio, SDS; Revisão: Subramanian A., 2002, Cromatografia de imunoafinidade. Mol. Biotechnol. 20(1), 41-47) .

Com estes métodos, bastante não específicos, a maioria ou a totalidade das proteínas ligadas será libertada e, depois, 20 necessita de ser analisada por espectrometria de massa (ou, alternativamente, por detecção com anticorpos, ver abaixo). 0 método de acordo com o 4o aspecto inclui, ainda, o passo de colocação das enzimas ligadas em contacto com um composto para libertar, pelo menos, uma enzima ligada. Esta colocação em contacto também ocorre, de um modo preferido, sob condições essencialmente fisiológicas.

Uma vantagem de utilizar um composto de interesse para eluição, em vez dos reagentes não específicos descritos acima, é que nem todas as proteínas ligadas são libertadas, mas apenas uma subfracção, de um modo preferido, a classe enzimática de interesse. Consequentemente, menos proteínas necessitam de ser identificadas por espectrometria de massa, resultando em análise mais rápida e maior profundidade analítica (sensibilidade) para a classe enzimática de interesse. 0 especialista irá entender que entre os passos individuais dos métodos da invenção, podem ser necessários passos de lavagem. Essa lavagem é parte do conhecimento do especialista na técnica. A lavagem serve para remover componentes não ligados do lisado celular do suporte sólido. As interacções de ligação não específicas (e. g., iónicas simples) podem ser minimizadas pela adição de níveis baixos de detergente ou por ajustamentos moderados das concentrações de sal no tampão de lavagem.

Após a eluição ou colocação em contacto, em alguns casos, o suporte sólido tem, de um modo preferido, que ser separado do material libertado. Os métodos individuais para tal dependem da natureza do suporte sólido e são conhecidos na técnica. Se o material de suporte estiver contido numa coluna, o material 21 libertado pode ser recolhido como eluato de coluna. No caso de o material de suporte estar misturado com os componentes de lisado (denominado processo em descontinuo), pode ser necessário um passo de separação adicional, tal como centrifugação suave, e o material libertado ser recolhido como sobrenadante. Alternativamente, esferas magnéticas podem ser utilizadas como suporte sólido, de modo que as esferas possam ser eliminadas da amostra pela utilização de um dispositivo magnético.

De acordo com a presente invenção, a enzima ou enzimas eluídas, ou parceiros de ligação co-eluidos (ver abaixo), assim como as enzimas libertadas de acordo com o método do quarto aspecto são, de um modo preferido, caracterizados por espectrometria de massa. Alternativamente, também é possível ao longo da invenção realizar esta caracterização com anticorpos específicos, dirigidos contra a respectiva enzima ou parceiro de ligação co-eluídos. A identificação de proteínas com análise espectrométrica de massa (espectrometria de massa) é conhecida na técnica (Shevchenko et al., 1996, Analytical Chemistry 68: 850-858, (Mann et al., 2001, Análise de proteínas e proteomas por espectrometria de massa, Annual Review of Biochemistry 70, 437-473) e é, ainda, ilustrada na secção de exemplos.

Como uma alternativa à análise de espectrometria de massa, a enzima ou enzimas eluídas (incluindo parceiros de ligação co-eluídos, por exemplo subunidades enzimáticas ou proteínas de estrutura), podem ser detectadas pela utilização de anticorpos específicos, dirigidos contra uma proteína de interesse. 22

Além disso, noutra forma de realização preferida, uma vez estabelecida a identidade da enzima ou enzimas eluidas por análise de espectrometria de massa, cada enzima de interesse pode ser detectada com anticorpos específicos, dirigidos contra esta enzima.

Os ensaios baseados em anticorpo adequados incluem mas não estão limitados a transferências de Western, ensaios de ELISA, ensaios de ELISA em sanduíche e matrizes de anticorpo ou uma sua combinação. 0 estabelecimento desses ensaios é conhecido na técnica (Capítulo 11, Imunologia, páginas 11-1 a 11-30 em: Protocols in Molecular Blology. Quarta Edição, Editado por F.M. Ausubel et al., Wiley, Nova Iorque, 1999). Múltiplos ensaios podem ser realizados utilizando vários anticorpos em paralelo, por exemplo dirigidos contra muitos membros de uma família enzimática (Pelch et al., análise de Multi-Transferência de Cinase de proteína Kinetworks. Capítulo 8, páginas 99-112 em: Câncer Cell Signalling. Methods and Protocols. Editor: David M. Terrian. Humana Press, Totowa, EUA, 2002) .

Estes ensaios podem, não apenas ser configurados num modo para detectar e quantificar uma enzima de interesse, mas também para analisar padrões de modificação pós-traducional, tal como fosforilação. Por exemplo, o estado de activação de uma cinase pode ser determinado pela sondagem do seu estatuto de fosforilação com anticorpos anti-fosfotirosina, anti-fosfosserina ou anti-fosfotreonina específicos. É conhecido na técnica como seleccionar e utilizar esses anticorpos anti-fosfo (Zhang et al., 2002. Journal of Biological Chemistry 277, 43648-43658). 23

De acordo com uma forma de realização preferida do método da invenção, de acordo com o 2o aspecto, pela caracterização da enzima determina-se se a administração do composto resulta numa expressão diferencial ou estado de activação da enzima. Por conseguinte, pela administração do composto, a expressão da enzima pode ser alterada ou o estado de activação da enzima pode ser alterado.

Neste contexto, uma alteração na expressão da enzima pode, de um modo preferido, significar que mais ou que menos enzima é produzida na célula.

Pela alteração do estado de activação, significa-se, de um modo preferido, que a enzima é mais activa após administração do composto ou menos activa após a administração do composto.

Também pode significar que a afinidade da enzima para o ligando imobilizado está aumentada ou diminuída (e. g. , alteração do estado de activação de uma cinase através de fosforilação por uma cinase a montante; ou ligação do composto a um sítio regulatório alostérico da enzima e alterando, desse modo, a conformação da cavidade de ligação de ATP de uma enzima de ligação de ATP).

No método de acordo com o Io aspecto, a preparação de proteína é incubada, de um modo preferido, sob condições essencialmente fisiológicas, com um composto, como definido abaixo. Consequentemente, apenas as enzimas que não se ligam ao composto são subsequentemente ligadas ao ligando, eluídas e caracterizadas.

De acordo com uma forma de realização preferida do método de acordo com o 3o aspecto da invenção, no passo c) , antes da incubação com o ligando, a alíquota é colocada, de um modo preferido, sob condições essencialmente fisiológicas, em contacto com o composto. Consequentemente, apenas as enzimas que não se ligam ao composto são subsequentemente ligadas ao ligando, eluídas e caracterizadas.

Numa forma de realização preferida do método da invenção, de acordo com o terceiro aspecto, uma detecção reduzida da enzima na alíquota incubada com o composto indica que a enzima é um alvo directo do composto. Isto resulta do facto de que, no passo c) deste método da invenção, o composto compete com o ligando para a ligação da enzima. Se menos enzima puder ser detectada na alíquota incubada com o composto, isto significa, de um modo preferido, que o composto competiu com o inibidor para a interacção com a enzima e é, por conseguinte, um alvo directo da enzima e vice-versa.

No método de acordo com o quarto aspecto, é preferido que este método seja realizado como um rastreio de média ou alta capacidade. Esses ensaios são conhecidos dos especialistas na técnica (Mallari et ai., 2003, Um ensaio de rastreio de alta capacidade genérico para cinases: cinase de proteína A como um exemplo, Journal of Biomolecular Screeing 8, 198-204; Rodems et ai., 2002, Uma plataforma de ensaio baseada em FRET para rastreio de densidade ultra-elevada de cinases de proteína e fosfatases, Assay and Drug Development Technologies 1 (1PT1), 9-19) .

Essencial aos métodos de acordo com o segundo, terceiro e quarto aspectos da invenção é a provisão de um composto que é suposto interagir com a enzima. Principalmente, de acordo com a presente invenção, esse composto pode ser cada molécula que seja 25 capaz de interagir com a enzima. De um modo preferido, o composto tem um efeito na enzima, e. g., um efeito estimulador ou inibidor.

De um modo preferido, o referido composto é seleccionado do grupo consistindo de compostos químicos ou fármacos sintéticos orgânicos, sintéticos ou de ocorrência natural, de um modo mais preferido moléculas pequenas, fármacos orgânicos ou compostos de moléculas pequenas naturais. De um modo preferido, o referido composto é identificado partindo de uma biblioteca contendo esses compostos. Depois, no decurso da presente invenção, essa biblioteca é rastreada.

Essas moléculas pequenas não são, de um modo preferido, proteínas ou ácidos nucleicos. De um modo preferido, as moléculas pequenas exibem um peso molecular inferior a 5000 Da, mais preferido inferior a 2000 Da, de um modo ainda mais preferido inferior a 1000 Da e, muito preferido, inferior a 500 Da.

Uma "biblioteca", de acordo com a presente invenção, refere-se a uma colecção (maioritariamente grande) de (numerosas) entidades químicas diferentes que são proporcionadas num modo variado que possibilita uma rápida análise funcional (rastreio) das diferentes entidades individuais e, ao mesmo tempo, proporciona para uma rápida identificação das entidades individuais que formam a biblioteca. Os exemplos são colecções de tubos ou poços ou pontos em superfícies que contêm compostos químicos que podem ser adicionados a reacções, com um ou mais parceiros definidos potencialmente interactuantes, num modo de alta capacidade. Após a identificação de uma interacção "positiva" desejada de ambos os parceiros, o respectivo composto 26 pode ser rapidamente identificado devido à construção de biblioteca. As bibliotecas de origens sintéticas e naturais podem ser adquiridas ou concebidas pelo especialista na técnica.

Os exemplos da construção de bibliotecas são proporcionados em, por exemplo, Breinbauer R, Manger M, Scheck M, Waldmann H. Desenvolvimento de bibliotecas de compostos guiadas por produtos naturais. Curr Med Chem. Dezembro de 2002; 9(23):2129-45, em que são descritos produtos naturais que são pontos de partida biologicamente validados para a concepção de bibliotecas combinatórias, dado terem um registo provado de relevância biológica. Este papel especial dos produtos naturais na química medicinal e biologia química pode ser interpretado à luz de novos conhecimentos acerca da arquitectura de domínio de proteínas conquistado pela biologia estrutural e bioinformática. De modo a preencher os requisitos específicos da cavidade de ligação individual numa família de domínios, pode ser necessário optimizar a estrutura de produto natural por variação química. Diz-se que a química de fase sólida se tornou numa ferramenta eficiente para este processo de optimização e os avanços recentes neste campo são destacados neste artigo de revisão. Outras referências relacionadas incluem Edwards PJ, Morrell AI. Síntese de bibliotecas de compostos de fase sólida na concepção e desenvolvimento de fármacos. Curr Opin Drug Discov Devei. Julho de 2002; 5 (4):594-605.,- Merlot C, Domine D, Church DJ. Análise de fragmentos na identificação de moléculas pequenas. Curr Opin Drug Discov Devei. Maio de 2002; 5(3) :391-9. Revisão; Goodnow RA Jr. Práticas correntes na produção de novos lead de moléculas pequenas. J Cell Biochem Suppl. 2001; Supl. 37:13-21; que descreve que os correntes processos de identificação de fármacos em muitas empresas farmacêuticas requerem colecções de grandes dimensões e em expansão de estruturas de lead de elevada 27 qualidade, para utilização em ensaios de rastreio de alta capacidade. As colecções de moléculas pequenas com diversas estruturas e propriedades "semelhantes a fármacos" foram, no passado, adquiridas por vários meios: por arquivo de esforços de optimização lead internos anteriores, por compra a vendedores de compostos e por união de colecções separadas após fusões de empresas. Embora a química de alta capacidade/combinatória seja descrita como sendo um importante componente no processo de produção de novos lead, a selecção de concepções de biblioteca para a síntese a subsequente concepção de membros de biblioteca evoluiu para um novo nível de desafio e importância. Os potenciais benefícios do rastreio de concepções de biblioteca de múltiplos compostos de moléculas pequenas contra múltiplos alvos biológicos oferece uma oportunidade substancial para a identificação de novas estruturas de lead.

Os compostos de teste que podem eluir enzimas alvo dos ligandos imobilizados (4o aspecto da invenção) podem ser testados em ensaios enzimáticos convencionais. No seguinte, serão descritos ensaios exemplificativos que podem ser utilizados para caracterizar posteriormente estes compostos. Não se pretende que a descrição destes ensaios limite o âmbito da presente invenção.

Ensaio de protease

Um ensaio de protease exemplificativo pode ser efectuado pela colocação de uma protease em contacto com um substrato peptídico duplamente marcado com flúor (e. g., EDANS) e cromóforos neutralizadores (e. g., DABCYL), sob condições 28 apropriadas e detecção do aumento da fluorescência após clivagem. 0 substrato contém um dador fluorescente próximo de uma extremidade e um grupo aceitador próximo da outra extremidade. A fluorescência deste tipo de substrato é inicialmente neutralizada através de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) intramolecular entre o dador e aceitador. Quando a protease cliva os substratos, os produtos são libertados da neutralização e a fluorescência do dador torna-se evidente. 0 aumento do sinal de fluorescência é directamente proporcional à quantidade de substrato hidrolisado (Taliani, M. et al. , 1996, Methods 240: 60-7).

Ensaio de fosfodiesterase

Um lisado celular de células de leucócitos humanos (U937) pode ser preparado num tampão adequado e serve como fonte da enzima de PDE. Após 20 minutos de incubação, a 25 °C, com [3H]cAMP como substrato em tampão de incubação (Tris-HCl a 50 mM, pH 7,5, MgC12 a 5 mM), a [3H]Adenosina é quantificada (Cortijo et al., 1993, British Journal of Pharmacology 108, 562-568) .

Ensaio de actividade enzimática in vitro para cinase de proteína

Resumidamente, um substrato peptídico marcado com fluoresceína pode ser incubado com a cinase da tirosina (e. g., Lck) , ATP e um anticorpo anti-fosfotirosina. À medida que a 29 reacção prossegue, o péptido fosforilado liga-se ao anticorpo anti-fosfotirosina, resultando num aumento no sinal de polarização. Os compostos que inibem a cinase resultam num baixo sinal de polarização.

Alternativamente, o ensaio pode ser configurado num formato indirecto modificado. Um fosfopéptido fluorescente é utilizado como um rastreador para formação de complexo com o anticorpo anti-fosfo-tirosina, produzindo um elevado sinal de polarização. Quando o substrato não marcado é fosforilado pela cinase, o produto compete com o péptido fosforilado fluorescente para o anticorpo. 0 péptido fluorescente é, depois, libertado do anticorpo na solução, resultando numa perda de sinal de polarização. Os ensaios directo e indirecto podem ser utilizados para identificar inibidores da actividade de proteína cinase da tirosina (Seethala, 2000, Methods 22, 61-70; Seethala e Menzel, 1997, Anal. Biochem. 253, 210-218; Seethala e Menzel, 1998, Anal. Biochem. 255, 257-262).

Este ensaio de polarização de fluorescência pode ser adaptado para a utilização com proteínas serinas/treoninas cinases, pela substituição do anticorpo antifosfotirosina com um anticorpo anti-fosfosserina ou anti-fosfotreonina (Turek et al., 2001, Anal. Biochem. 299, 45-53, PMID 11726183; Wu et al., 2000, J. Biomol. Screen. 5, 23-30, PMID 10841597) .

Os compostos identificados no método de acordo com o 4o aspecto da presente invenção podem, ainda, ser optimizados (optimização lead). Esta optimização subsequente desses compostos é, frequentemente, acelerada devido à informação da relação de estrutura-actividade (SAR) codificada nestas bibliotecas de produção de lead. A optimização lead é, 30 frequentemente, facilitada devido à fácil aplicabilidade dos métodos de química de alta capacidade (HTC) para seguimento de síntese.

De um modo preferido, a optimização lead é suportada com um método de acordo com o 2o, 3o e 4o aspectos da presente invenção, de um modo mais preferido com um método de acordo com o 4o aspecto. Os resultados destes métodos podem proporcionar orientação aos químicos medicinais ou a outros especialistas na técnica de como optimizar posteriormente compostos com respeito a, e. g., selectividade.

Uma utilização dessa biblioteca é finalmente descrita, por exemplo, em Wakeling AE, Barker AJ, Davies DH, Brown DS, Green LR, Cartlidge SA, Woodburn JR. Inibição específica de receptor cinase da tirosina de factor de crescimento epidérmico por 4-anilinoquinazolinas. Breast Câncer Res Treat. 1996,-38 (1) :67-73. A enzima que pode ser caracterizada de acordo com a presente invenção é, de um modo preferido, seleccionada do grupo consistindo numa cinase, uma fosfatase, uma protease, uma fosfodiesterase, uma hidrogenase, uma desidrogenase, uma ligase, uma isomerase, uma transferase, uma acetilase, uma desacetilase, uma GTPase, uma polimerase, uma nuclease e uma helicase.

De um modo preferido, a proteína é uma cinase e, de um modo mais preferido, uma cinase de proteína. De um modo igualmente preferido, a proteína é uma cinase de lípido.

Como já indicado acima, é essencial para a presente invenção que o ligando seja um ligando de largo espectro que 31 seja capaz de se ligar a diversas, mas não todas as enzimas, de uma determinada classe de enzimas. De um modo preferido, o ligando liga-se a 10 a 50%, de um modo mais preferido a 30 a 50% das enzimas de uma determinada classe de enzimas.

De um modo preferido, o ligando é um inibidor da enzima.

Numa forma de realização mais preferida, a enzima é uma cinase e o ligando é um inibidor de cinase.

De um modo preferido, este inibidor de cinase é seleccionado do grupo consistindo de Bisindolilmaleimido VIII, Purvalanol B, CZC00007324 (PD173955 ligável), CZC00008004.

Ligandos adicionais incluem ligando 91 de indol, ligando 32 de quinazolina e uma Estaurosporina modificada (ver o Exemplo 5 a 7) . A estrutura do ligando 91 de indol (ácido 5-[ 5-Fluoro-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3 Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrole-3-carboxílico (3-amino-propil)-amida) é mostrada na Fig. 3. Este composto é uma molécula estruturalmente semelhante ao inibidor de cinase Sutent (SU11248; Sun et al. , 2003. J. Med.

Chem. 46, 1116-1119) . 0 ligando 91 de indol pode ser covalentemente ligado a um material de suporte sólido adequado por meio do grupo amino primário e ser utilizado para o isolamento de proteínas de ligação. A síntese do ligando 91 de indol é descrita no Exemplo 1. De acordo com a invenção, a expressão "ligando 91 de indol" também inclui compostos compreendendo o núcleo idêntico mas que têm outro ligante, de um modo preferido ligado ao grupo NH não sendo parte das estruturas cíclicas, para ligação ao suporte sólido. Tipicamente, os 32 ligantes têm esqueletos de 8, 9 ou 10 átomos. Os ligantes contêm um grupo carboxi- ou amino-activo.

De acordo com uma forma de realização preferida adicional, a caracterização da enzima é realizada pela caracterização de parceiros de ligação co-eluidos da enzima, subunidades enzimáticas ou modificações pós-traducionais da enzima. A base desta forma de realização preferida é que, devido à utilização de condições essencialmente fisiológicas durante a ligação entre o ligando e a enzima, é, de um modo preferido, possivel preservar o estado natural da enzima que inclui a existência de parceiros de ligação, subunidades enzimáticas ou modificações pós-traducionais. Com o auxilio da espectrometria de massa (MS) é possivel, não apenas identificar a enzima, mas também os parceiros de ligação co-eluidos, subunidades enzimáticas ou referidas modificações pós-traducionais.

De acordo com uma forma de realização preferida adicional da presente invenção, a caracterização por espectrometria de massa (MS) é realizada pela identificação de péptidos proteotipicos da enzima ou do parceiro de ligação da enzima. O conceito de péptidos proteotipicos é descrito em detalhe na secção dos exemplos. A ideia é que a enzima ou parceiro de ligação eluido é digerido com proteases e os péptidos resultantes são determinados por MS. Como resultado, as frequências peptídicas para péptidos da mesma proteína fonte diferem em elevado grau, os péptidos mais frequentemente observados que "tipicamente" contribuem para a identificação desta proteína sendo designados "péptidos proteotipicos". Por conseguinte, um péptido proteotípico, como utilizado na presente invenção, é um péptido experimentalmente bem observável que 33 identifica, de um modo único, uma proteína ou isoforma de proteína específica.

De acordo com uma forma de realização preferida, a caracterização é realizada pela comparação dos péptidos proteotípicos obtidos para a enzima ou o parceiro de ligação com péptidos proteotípicos conhecidos. Dado que, quando se utilizam fragmentos preparados por digestão de protease para a identificação de uma proteína em MS, são habitualmente observados os mesmos péptidos proteotípicos para uma determinada enzima, é possível comparar os péptidos proteotípicos obtidos para uma determinada amostra com os péptidos proteotípicos já conhecidos para enzimas de uma determinada classe de enzimas e, desse modo, identificar a enzima estando presente na amostra. A análise de espectrometria de massa é realizada num modo quantitativo, por exemplo pela utilização da tecnologia iTRAQ (marcadores isobáricos para quantificação relativa e absoluta) ou cICAT (marcadores de afinidade codificados por isótipo cliváveis) (Wu et al., 2006. J. Proteome Res. 5, 651-658).

De acordo com uma forma de realização preferida adicional, o suporte sólido é seleccionado do grupo consistindo de agarose, agarose modificada, esferas de sepharose (e. g., sepharose activada por NHS), látex, celulose e partículas de ferro ou ferromagnéticas. 0 ligando enzimático de largo espectro pode estar ligado ao suporte sólido covalentemente ou não covalentemente. A ligação não covalente inclui a ligação por meio de ligandos de afinidade de biotina a matrizes de estreptavidina. 34

De um modo preferido, o ligando de largo espectro está ligado covalentemente ao suporte sólido.

Antes da ligação, as matrizes podem conter grupos activos, tais como NHS, Carbodiimida, etc., para possibilitar a reacção de ligação com compostos. Os compostos podem ser ligados ao suporte sólido por ligação directa (e. g., utilizando grupos funcionais, tais como grupos amino-, sulfidril-, carboxil-, hidroxil-, aldeído- e cetona) e por ligação indirecta (e. g., por meio de biotina, biotina estando conjugada covalentemente ao composto e ligação não covalente de biotina a estreptavidina que está directamente ligada ao suporte sólido). A ligação ao material de suporte sólido pode envolver ligantes cliváveis e não cliváveis. A clivagem pode ser alcançada por clivagem enzimática ou tratamento com métodos químicos adequados.

As interfaces de ligação preferidas para ligação ao composto de interesse a material de suporte sólido são ligantes com um esqueleto de átomo C. Tipicamente, os ligantes têm esqueletos de 8, 9 ou 10 átomos. Dependendo do composto a ser ligado, os ligantes contêm um grupo carboxi- ou amino-activo.

Uma cobertura mais completa de uma classe enzimática é alcançada pela utilização de combinações de ligandos de largo espectro.

De um modo preferido, são utilizados 2 a 10, mais preferido 2 a 6, de um modo ainda mais preferido 2 a 4 ligandos diferentes. De um modo muito preferido, são utilizados 3 ou 4 ligandos diferentes. 35

Os, pelo menos, dois ou todos os ligandos diferentes estão presentes num suporte sólido.

Prefere-se que o espectro com que cada ligando individual se pode ligar seja diferente, de modo que possa ser alcançada máxima cobertura da classe enzimática.

De um modo preferido, cada ligando liga-se a 10 a 50%, de um modo mais preferido a 30 a 50% das enzimas de uma determinada classe de enzimas.

De acordo com uma forma de realização preferida adicional, pela caracterização da enzima ou do complexo de composto-enzima, a identidade de todos ou vários dos membros de uma classe enzimática na célula é determinada. Tal deve-se ao facto de que, pela incubação do ligando com o lisado celular, potencialmente todas as enzimas sendo capazes de se ligarem ao ligando são isoladas e mais tarde caracterizadas. Dependendo do perfil de expressão das enzimas, o ligando é capaz de se ligar a todos ou alguns dos membros de uma classe enzimática que podem, deste modo, ser identificados. No caso das cinases, os métodos da presente invenção permitem ao especialista identificar e caracterizar o quinoma expresso numa determinada célula. O composto é diferente do ligando. A invenção descreve, ainda, um método para a produção de uma composição farmacêutica, compreendendo os passos de: a) identificar um complexo de enzima-composto de acordo com o método do quarto aspecto da presente invenção e b) formular o composto numa composição farmacêutica. 36

Por conseguinte, a invenção descreve um método para a preparação de composições farmacêuticas que podem ser administradas a um indivíduo numa quantidade eficaz. Num aspecto preferido, o medicamento é substancialmente purificado. 0 indivíduo a ser tratado é, de um modo preferido, um animal incluindo, mas não limitado a animais, tais como vacas, porcos, cavalos, galinhas, gatos, cães, etc., e é, de um modo preferido, um mamífero e, de um modo muito preferido, humano. 0 indivíduo pode ser um mamífero não humano.

Em geral, as composições farmacêuticas compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um medicamento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Numa forma de realização específica, a expressão "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do governo Federal ou Estadual ou listado na Farmacopeia U.S. ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para utilização em animais e, mais particularmente, em humanos. 0 termo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou transportador com o qual o terapêutico é administrado. Esses veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo os de petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, incluindo mas não limitados a óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e semelhantes. Quando a composição farmacêutica é administrada oralmente, a água é um veículo preferido. A solução salina e dextrose aquosa são veículos preferidos quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. As soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol são empregues, de um modo preferido, como veículos líquidos para soluções injectáveis. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glucose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, 37 cloreto de sódio monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e semelhantes. A composição, se desejado, também pode conter quantidades menores de agentes molhantes ou emulsionantes ou agentes de tamponização de pH. Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação prolongada e semelhantes. A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes e veículos tradicionais, tal como triglicéridos. A formulação oral pode incluir veículos padrão, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarinato de sódio, celulose, carbonato de magnésio, etc. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E.W. Martin. Essas composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do terapêutico, de um modo preferido na forma purificada, juntamente com uma quantidade adequada de veículo, de modo a proporcionar a forma para administração conveniente ao doente. A formulação deve adequar-se ao modo de administração. A composição pode ser formulada de acordo com processos de rotina, como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotónico estéril. Onde necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local, tal como a lidocaína, para aliviar a dor no local da injecção. Em geral, os ingredientes são proporcionados separadamente ou misturados entre si na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco, ou concentrado isento de água, num recipiente hermeticamente selado, tais como uma ampola ou saqueta, 38 indicando a quantidade de agente activo. Onde a composição seja para ser administrada por infusão, pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água ou solução salina estéril de grau farmacêutico. Onde a composição seja administrada por injecção, pode ser proporcionada uma ampola de água estéril ou solução salina para injecção, de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração. A terapêutica pode ser formulada como formas neutras ou salinas. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os formados com grupos carboxilo livres, tais como os derivados dos ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., os formados com grupos amina livres, tais como os derivados de isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc., e os derivados de sódio, potássio, amónio, cálcio e hidróxidos férricos, etc. A quantidade do terapêutico que será eficaz no tratamento de um distúrbio ou estado particular dependerá da natureza do distúrbio ou estado e pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. Além disso, podem ser opcionalmente empregues ensaios in vitro para auxiliar a identificar gamas de dosagem óptimas. A dose precisa a ser empregue na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade da doença ou distúrbio e deve ser decidida de acordo com o parecer do médico e das circunstâncias de cada doente. Contudo, as gamas de dosagem adequadas para administração intravenosa são, em geral, cerca de 20-500 microgramas de composto activo por quilograma de peso corporal. As gamas de dosagem adequadas para administração intranasal são, em geral, cerca de 0,01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. Doses eficazes podem ser extrapoladas de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de teste 39 in vitro ou de modelos animais. Em geral, os supositórios podem conter ingrediente activo na gama de 0,5% a 10%, em peso; as formulações orais contêm, de um modo preferido, 10% a 95% de ingrediente activo.

Diversos sistemas de distribuição são conhecidos e podem ser utilizados para administrar um terapêutico, e. g., encapsulação em lipossomas, micropartículas e microcápsulas: utilização de células recombinantes capazes de expressarem o terapêutico, utilização de endocitose mediada por receptor (e. g. , Wu e Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432); construção de um ácido nucleico terapêutico como parte de um vector retroviral ou outro vector, etc. Os métodos de introdução incluem mas não estão limitados a vias intradérmicas, intramusculares, intraperitoneais, intravenosas, subcutâneas, intranasais, epidurais e orais. Os compostos podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo por infusão, por injecção de bólus, por absorção através dos revestimentos epiteliais ou mucocutâneos, (e. g., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) e podem ser administrados juntamente com outros agentes biologicamente activos. A administração pode ser sistémica ou local. Além disso, pode ser desejável introduzir as composições farmacêuticas no sistema nervoso central por qualquer via adequada, incluindo injecção intraventricular e intratecal; a injecção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, conjugado a um reservatório, tal como um reservatório de Ommaya. A administração pulmonar também pode ser empregue, e. g., por utilização de um inalador ou nebulizador e formulação com um agente aerossolizante. 40

Pode ser desejável administrar as composições farmacêuticas da invenção localmente na área a necessitar de tratamento. Esta pode ser alcançada, por exemplo, e não a titulo de limitação, por infusão local durante cirurgia, aplicação tópica, e. g. , em conjunto com um penso após cirurgia, por injecção, por meio de um cateter, por meio de um supositório ou por meio de um implante, o referido implante sendo de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tal como membranas sialásticas, ou fibras. Numa forma de realização, a administração pode ser por injecção directa no local (ou local antigo) de um tumor maligno ou tecido neoplásico ou pré-neoplásico. 0 medicamento pode ser distribuído numa vesícula, em particular um lipossoma (Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., 1989, Em: Liposomes in the Therapy of Infectious

Disease and Câncer, Lopez-Berestein e Fidler, ed., Liss, Nova Iorque, p. 353-365; Lopez-Berestein, ibid., p. 317-327; ver, de uma maneira geral, ibid.). O medicamento pode ser distribuído por meio de um sistema de libertação controlada. Numa forma de realização, pode ser utilizada uma bomba (Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507-516; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574-579). Noutra forma de realização, podem ser utilizados materiais poliméricos (Medicai Applications of Controlled Release, Langer e Wise, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Bali, ed., Wiley, Nova Iorque, 1984; Ranger e Peppas, 1983, Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem. 23:61; Levy et al., 1985, Science 228 : 190-192; During et al., 1989, Ann. Neurol. 41 25:351-356; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:858-863).

Ainda noutra forma de realização, um sistema de libertação controlada pode ser colocado em proximidade do alvo terapêutico, i. e., o cérebro, requerendo, deste modo, apenas uma fracção da dose sistémica (e. g., Goodson, 1984, Em: Medicai Applications of Controlled Release, supra, Vol. 2, p. 115-138). Outros sistemas de libertação controlada são discutidos na revisão de Langer (1990, Science 249:1527-1533). O método pode, ainda, compreender o passo de modulação da afinidade de ligação do composto à enzima. Esta pode ser alcançada por métodos conhecidos dos especialistas na técnica, e. g., por uma modificação quimica de diversos residuos do composto e análise subsequente da afinidade de ligação do composto à enzima. A invenção descreve, ainda, a utilização do, pelo menos, um ligando enzimático de largo espectro imobilizado num suporte sólido, para a caracterização de, pelo menos, uma enzima ou de um complexo de enzima-composto. Em relação a esta utilização, também se aplicam todas as formas de realização, como descrito acima para os métodos da invenção. A invenção é, ainda, ilustrada pelas seguintes figuras e exemplos, as quais não são consideradas como sendo limitativas para o âmbito de protecção conferido pelas reivindicações do presente pedido. 42

Breve descrição das figuras

Figura 1 Fig. la: Fig. lb: Fig. lc: Fig. ld: Figura 2 : Estruturas de ligandos de kinobead. A fonte e vias sintéticas dos ligandos são descritas no Exemplo 1.

Ligando 1 de Kinobead (Bisindolilmaleimido VIII)

Ligando 2 de Kinobead (Purvalanol B)

Ligando 3 de Kinobead (CZC00007324, (7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-lH-[1,6]naftiridin-2-ona))

Ligando 4 de Kinobead (CZC00008004, 2- (4'-aminometil fenilamina)-5-fluoro-pirimidin- 4-il)-fenilamina) : Sinaloquinoma (ver o Exemplo 2).

Esta figura mostra uma comparação de precipitações de Fármaco utilizando kinobeads (circulo da esquerda) e imunoprecipitações convencionais com esferas de anticorpo anti-fosfotirosina (circulo da direita). Na experiência de Kinobeads foi identificado um total de 626 proteínas, destas 100 são cinases. Na experiência de imunoprecipitação (IP) foi identificado um total de 503 proteínas, 12 destas eram cinases. As cinases identificadas com ambas as experiências (cinases comuns) são listadas na área de sobreposição. O resultado mostra que com 43 as kinobeads foram identificadas significativamente mais cinases (100 cinases), em comparação com esferas de anticorpo anti-fosfotirosina (12 cinases).

Figura 3: Estruturas dos ligandos 5, 6 e 7 de kinobeads. As vias sintéticas dos ligandos são descritas no Exemplo 5, 6 e 7.

Fig. 3a: Estrutura do ligando 5 de kinobead (ligando 91 de indol)

Fig. 3b: Estrutura do ligando 6 de kinobead (ligando 32 de quinazolina)

Fig. 3c: Estrutura do ligando 7 de kinobead (Estaurosporina modificada)

Figura 4: Perfil de afinidade de proteína quantitativo (PAP). A figura mostra competição de lisado com composto de teste Bis VIII e detecção de proteínas com análise de transferência de Western. A experiência de precipitação foi realizada como descrito no Exemplo 8, com amostras de lisado celular de Jurkat contendo 10 mg de proteína. 0 lisado de entrada (pista L; 50 pg de proteína) e eluatos de SDS de kinobeads (pistas 1 a 7) foram separados num gel de SDS-poliacrilamida, transferidos para uma membrana e sondados com anticorpos. 44

Fig. 4A: A transferência de Western foi sondada, em primeiro lugar, com um anticorpo dirigido contra GSK3beta. Os anticorpos de detecção secundária marcados com peroxidase foram utilizados para detecção quimioluminescente. Como um controlo de carregamento, uma transferência foi sondada com um anticorpo anti-ITK. Pista L: 50 pg de lisado de Jurkat; pista 1: BisVIII a 6,0 μΜ; pista 2 : BisVIII a 2,0 μΜ; pista 3: BisVIII a 0,67 μΜ; pista 4 : BisVIII a 0,22 μΜ; pista 5: BisVIII a 0,074 μΜ; pista 6 : BisVIII a 0,025 μΜ; pista 7: DMSO a 0,5% (controlo de solvente).

Fig. 4B: Competição dependente de concentração de ligação de GSK3 beta a kinobeads por Bis VIII. As bandas de GSK3 beta na transferência de Western mostrada na Figura 2 A foram quantificadas e representadas graficamente contra a concentração de Bis VIII adicionada ao lisado.

Figura 5: Perfil de afinidade de proteína quantitativo para cinase

Os resultados da experiência de perfil de afinidade quantitativo do exemplo 8 são exibidos para quatro cinases. Os valores de Intensidade Relativa (RI) são representados graficamente contra concentração de composto (Bis VIII). O valor de RI50 representa a concentração de composto à qual a intensidade relativa do sinal de MS para uma determinada cinase é 50%, em comparação com o controlo de DMSO.

Fig. 5A: Curva para Glicogénio Sintase Cinase 3 alfa (GSKa; RI50 = 72, 7 nM) 45

Fig. 5A: Curva para Glicogénio Sintase Cinase 3 beta (GSKb; RI50 = 95 nM) Fig. 5C: Curva para cinase de proteína C alfa (PKCa; RI50 = 12,2 nM) Fig. 5D: Curva para cinase de proteína C beta (PKCb; RI50 = 21,5 nM)

Exemplos

Exemplo 1: Preparação de kinobeads

Este exemplo ilustra a preparação de kinobeads com 4 ligandos diferentes. Estas kinobeads foram utilizadas mais tarde no exemplo 2 e exemplo 3.

Os ligandos de captura de largo espectro foram imobilizados covalentemente num suporte sólido através de ligação covalente, utilizando grupos funcionais adequados (e. g., grupos amino ou carboxilo). Os compostos que não contêm um grupo funcional adequado foram modificados, de modo a introduzir esse grupo. Os métodos químicos necessários são conhecidos na literatura química clínica e ilustrados abaixo. 1. Selecção e síntese de ligandos

Os seguintes quatro ligandos de larga especificidade (ligandos 1 a 4 de Kinobead; Figura 1) foram ligados covalentemente a esferas em reacções separadas, como descrito 46 abaixo e, depois, os quatro tipos de esferas foram misturados e utilizados para as experiências de precipitação de fármaco.

Ligando 1 de Kinobead: Acetato de Bisindolilmaleimido VIII (Fórmula Quimica: C24H22N4O2. CH3COOH; PM 398,5; CAS número 138516-31-1; Alexis Biochemicals, AXXORA Deutschland GmbH, Grunberg; Cat- ALX-270-056).

Ligando C2oH25C1N603; Biochemicals Alemanha). 2 de Kinobead: Purvalanol B (Composição química: PM 441,92; CAS número 212844-54-7; Tocris

Cat- 1581, BIOTREND Chemikalien GmbH Kõln,

Ligando 3 de Kinobead: CZC00007324; (7-(4-Aminometil-fenilamino )-3-(2,6-diclorofenil)-1-metil-lH-[1,6]naftiridin-2-ona). Síntese de ligando 1 de kinobead: 7-(4-Aminometil- fenilamino)-3-(2,6-diclorofenil)-1-metil-lH-[1,6]naftiridin-2-ona

As primeiras sete passos da síntese de CZC00007324 foram realizadas como descrito em Klutchko, S.R. et al., 1998, Journal of Medicinal Chemistry 41, 3276-3292. Os restantes passos foram realizados como descrito abaixo.

Passos 1-7: 6-(2,6-Diclorofenil)-2-metanossulfonil-8-metil-8i7-pirido [2,3-d] pirimidin-7-ona foi sintetizada a partir de éster etílico de 4-cloro-2-metilsulfanil-5- pirimidinocarboxilato, 1998, 41, 3276-3292. seguindo o processo em J. Med. Chem. 47

Passo 8: Éster terc-butílico do ácido {4-[3-(2,6-Dicloro-fenil)-l-metil-2-oxo-l,2-di-hidro-[1,6]naftiridin-7-ilamino] benzil}-carbâmico 6 - (2, β-Diclorofenil) -2-metanossulfonil-8-metil-8fí-pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona (0,100 g, 0,2 mmol) e 3-(N-Boc-metilamino)anilina (0,421 g, 2,0 mmol) foram misturados como sólidos e aquecidos a 140 °C, durante 30 min. A mistura reaccional em bruto foi dissolvida em diclorometano e lavada com HC1 a 2 N (aq) x 2. A camada orgânica foi seca com sulfato de magnésio anidro, filtrada e concentrada. O produto em bruto foi recristalizado a partir de acetato de etilo quente para proporcionar éster terc-butílico do ácido {4-[3-(2,6-Dicloro-fenil)-1-meti1-2-oxo-1,2-di-hidro-[1,6]naftiridin-7-ilamino] benzil}-carbâmico, como um sólido amarelo (0,031 g - 25%) . RMN de (DMSO-cfe) δ 10,18 (s, 1H) ; 8, 83 (s, 1H); 7,76 (d, 2H) ; 7, 58 (d, 2H) ; 7,46 (dd, 1H) ; 7,32 (brt, 1H); 7,23 (d, 2H) O i—1 (d, 2H); 3,66 (s, 3H); 1,40 (s, 9H). LCMS: método A, TR = 5,60 min.

Passo 9: 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)- 1-metil-lH-[1,6]naftiridin-2-ona O éster terc-butílico do ácido {4-[3-(2,6-Dicloro-fenil)-1-meti1-2-oxo-1,2-di-hidro-[1,6]naftiridin-7-ilamino]benzil}-carbâmico (0,026 g, 0,05 mmol) foi dissolvido em metanol (3 mL) e foi adicionado ácido clorídrico (4 N em dioxano, 1,2 mL) . A reacção foi agitada, à temperatura ambiente, durante 1,5 horas, quando o HPLC não mostrou material de partida remanescente. O solvente foi removido in vacuo. 0 resíduo foi dissolvido em água e a solução tornada básica com carbonato de sódio (sat., aq.). 0 precipitado resultante foi recolhido e seco para proporcionar 7-(4-Aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-lH- 48 [ 1,6]naftiridin-2-ona (0,021 g -100%), como um sólido amarelo. RMN de 1H (DMSO-d6) δ 10,20 (brd, 1H) ; 8,83 (d, 1H) ; 7,90 (d, 1H) ; 7,76 (d, 1H) ; 7,72 (d, 1H) ; 7,60 (dd, 2H) ; 7,47 (ddd, 1H) ; 7,33 (d, 1H) ; 7,24 (d, 1H) ; 4,07 (d, 2H) ; 3,66 (s, 3H) . LCMS: método A, TR = 4,44 min, [MH+ = 426] .

Ligando 4 de Kinobead: CZC00008004. 2-(4'-aminometil fenilamina)-5-fluoro-pirimidin-4-il)-fenilamina. Fórmula química Ci7H16N5F. PM 309,34. Este é um análogo de CZC00004919. Síntese de CZC00008004 - (2-(4'-aminometil fenilamina)-5-fluoro-pirimidin-4-il)-fenilamina

Passo 1: 2,4-Dicloro-5-fluoro-pirimidina

Oxicloreto de fósforo (2 mL) foi adicionado a 5-fluorouracilo (1 g, 7, 688 inmol) , seguido de pentacloreto de fósforo (3,28 g, 15,76 inmol) , a mistura foi aquecida e agitada, a 110 °C, durante 5 horas e, depois, deixada arrefecer. O excesso de oxicloreto de fósforo foi lentamente hidrolisado num banho de mistura de gelo/água (10 mL) . A mistura aquosa foi extraída com éter dietílico (3 x 10 mL) . As camadas orgânicas foram combinadas, lavadas com bicarbonato de sódio saturado (10 mL), seguido de cloreto de sódio saturado (10 mL), secas com sulfato de magnésio anidro e, depois, filtradas. 0 solvente foi removido por evaporação a 350 mmHg para deixar um óleo viscoso que cristalizou lentamente, para proporcionar o composto do título (1,22 g - 95%). O composto foi utilizado sem análise posterior no passo seguinte. 49

Passo 2: (2-Cloro-5-fluoro-pirimidin-4-il)-fenilamina A uma solução de 2, 4-Dicloro-5-fluoro-pirimidina (0,550 g, 3,30 mmol) em dimetilformamida (13 mL) foi adicionada anilina (0,301 mL, 3,30 mmol) e IV-etildiisopropilamina (0,602 mL, 3,63 mmol) e a mistura agitada, à temperatura ambiente, durante 18 horas. A mistura foi neutralizada com acetato de etilo (20 mL) e lavada com cloreto de amónio saturado (20 mL) e a camada orgânica removida. A camada aquosa foi lavada com acetato de etilo (20 mL) e as camadas orgânicas combinadas lavadas com água (20 mL) , cloreto de sódio saturado (10 mL) e secas com sulfato de magnésio anidro. O solvente foi removido por evaporação e o sólido resultante submetido a cromatografia de coluna (sílica, acetato de etilo (0 a 20%)/éter de petróleo), para proporcionar o composto do título (0,532 g - 72%). LCMS: método A, TR = 4,67 min, [MH+ = 224] .

Passo 3: éster terc-butílico do ácido [4-(5-Fluoro-4-fenilamino-pirimidin-2-ilamino)-benzil]-carbâmico (2-Cloro-5-fluoro-pirimidin-4-il)-fenilamina (0,087 g, 0,39 mmol) e 4-[iV-Boc aminometil] anilina (0, 087 g, 0,39 mmol) foram misturados entre si. Uma barra de agitação foi adicionada e o frasco colocado num banho de óleo, a 110 °C, durante 20 min. A mistura foi arrefecida, o resíduo dissolvido em 3 mL de Diclorometano/Metanol (99:5) e carregada num cartucho de Cromatografia de Flash e purificada utilizando acetato de etilo (20 a 60%) em éter de petróleo, para proporcionar o composto desejado como um sólido amarelo (0,051 g - 32%) . RMN de (400 MHz, CDCl3-d6) δ 7,85 (d, 1H) ; 7,50 (dd, 2H) ; 7,39 (d, 2H) ; 7,27 (t, 2H); 7,12-7,00 (m, 3H); 6,81 (s, 1H); 6,66 (s, 1H) ; 4,67 (s, 50 1Η), 4,17 (d, 2H) , 1,36 (s, 9H). LCMS: método B, TR = 9,20 min [MH+ = 410] .

Passo 4: (2-(4'-aminometilfenilamina)-5-fluoro-pirimidin-4- il)-fenilamina A uma solução de éster terc-butílico do ácido [4-(5-Fluoro-4-fenilamino-pirimidin-2-ilamino)-benzil]-carbâmico (0,055 g, 0,134 mmol) em metanol (5 mL) HC1 (4 N em dioxano) (2 mL) e a reacção foi agitada, à temperatura ambiente, durante 1 hora. 0 solvente foi removido por evaporação. Foi adicionada água (5 mL) e o pH da solução foi elevado para 8 por adição de bicarbonato de sódio. 0 precipitado resultante foi filtrado e seco, para proporcionar o composto do titulo (0, 035 g - 84%) . RMN de 1E (400 MHz, DMSO-cfe) δ 7,90 (d, 1H) ; 7, 70 (dd, 2H) ; 7, 55 (dd, 2H) ; 7,35 (t, 2H) ; 7,20 (d, 2H); 7, 10 (t, 1H) ; 3,80 (s, 2H) . LCMS: método B, TR = 5, 022 min, [MH+ = 310] .

Todas as reacções foram efectuadas sob atmosfera inerte. Os espectros de RMN foram obtidos num Bruker dpx400. A LCMS foi efectuada num Agilent 1100, utilizando uma coluna zorbax SBC-18, 4,6 mm x 150 mm - 5 μ. O caudal da coluna foi 1 mL/min e os solventes utilizados foram água e acetonitrilo (TFA a 0,1%), com um volume de injecção de 10 pL. Os comprimentos de onda foram 254 e 210 nm. Os métodos são descritos abaixo. 51

Tabela 1: Métodos analíticos

Método Nome do Método de Acesso Fácil Nome do Método de ChemStation Caudal Solvente Tempo de Corrida A 7 mn Analítico positivo ANL_P0S7.M 1 mL/min 0-2,5 min 5-95% de MeCN 7 min 2,5-6 min 95% de MeCN B Ião Analítico positivo ANAL_POS.M 1 mL/min 0-11 min 5-95% de MeCN 15 min 11-13 min 95% de MeCN

Tabela 2: Abreviaturas utilizadas em protocolos de química aq aquoso d dupleto DMSO dimetilsulfóxido g grama HC1 Ácido clorídrico HPLC cromatografia líquida de alta pressão LCMS cromatografia líquida - espectrometria de massa m multipleto min minuto mmol milimole N Normal RMN ressonância magnética nuclear q quarteto 52 (continuação) TR tempo de retenção s singuleto sat saturado t tripleto 2. Imobilização de ligandos contendo grupos amina

Sepharose 4 Fast Flow activada por NHS (Amersham

Biosciences, 17-0906-01) foi equilibrada com DMSO anidro (Dimetilsulfóxido, Fluka, 41648, H20 <= 0,005%). Num tubo Falcon de 15 mL foi colocado 1 mL de esferas estruturadas, foi adicionada solução stock de composto (habitualmente 100 mM em DMF ou DMSO) (concentração final 0,2-2 pmol/mL de esferas), assim como 15 pL de trietilamina (SIGMA, T-0886, 99% pura). As esferas foram incubadas, à temperatura ambiente, na escuridão num misturador de extremidade-a-extremidade (Roto Shake Genie, Scientific Industries Inc.), durante 16 - 20 horas. A eficiência de ligação é determinada por HPLC. Os grupos de NHS que não reagiram foram bloqueados por incubação com aminoetanol, à temperatura ambiente, no agitador de extremidade-a-extremidade, de um dia para o outro. As esferas lavadas foram armazenadas em isopropanol ou imediatamente utilizadas para reacções de ligação. 53 3. Imobilização de ligandos contendo grupos carboxilo

Os compostos foram ligados, sob condição básica, a esferas de NHS-Sepharose reversa (PyBroP chemistry), como delineado abaixo.

Lavagem de esferas

Passo 1: Utilizar 1 mL (volume assentado) de NHS-sepharose/esferas para uma reacção de ligação padrão (Sepharose 4 Fast Flow activada por NHS proporcionada em isopropanol, Amersham Biosciences, 17-0906-01).

Passo 2: Lavar as esferas 3 vezes com 10 mL de DMSO e uma vez com 10 mL de DMSO anidro (Dimetilsulfóxido, Fluka, 41648, H2O <= 0,005%); passos de centrifugação: 1 min, 1200 rpm, temperatura ambiente; descartar sobrenadante no lixo de solventes não halogénicos.

Passo 3: Após o último passo de lavagem ressuspender as esferas num volume de DMSO anidro.

Reversão das esferas de NHS

Este passo é concebido para 1 mL de esferas, ajustar em conformidade para quaisquer outros volumes de esferas. As esferas de NHS têm uma capacidade de 20 pmol/mL. Por conseguinte, esferas reversas a 20% deverão ter uma capacidade de 4 pmol/mL. 54

Preparar uma mistura de razão 4:1 de Aminoetanol e Etilenodiamina, depois, adicionar Trietilamina à mistura. (total de 200 pmol) (10 x capacidade de 1 mL de esferas de NHS) 1: 9,66 pL de Aminoetanol a 16,56 M (2-Aminoetanol,

Aldrich, 11.016-7) (total de 160 pmol) 2: 2,68 pL de Etilenodiamina a 14,92 M (Fluka, 03350) (total de 40 pmol). 3: 15 pL de Trietilamina a 7,2 Μ (TEA) (SIGMA, T-0886, 99% pura) A mistura será fraccionada em duas fases, mas não há problema.

Adicionar a mistura às esferas de NHS lavadas/ressuspensas e incubar 16 horas (de um dia para o outro) , à temperatura ambiente, no agitador de extremidade-a-extremidade.

Ligação de PyProB. Este processo não requer um passo de pré-activação, a activação e ligação ocorrem in situ. 1. Dissolver PyBroP (Hexafluorofosfato de bromo-tris- pirrolidino-fosfónio; fornecedor: NOVABIOCHEM) em

Dimetilformamida isenta de água (DMF), para uma concentração final de 100 mM (46,62 mg/mL), a solução pode ser utilizada durante até um dia. 2. Dissolver 35 pL de Diisopropiletilamina (DIEA) em 1 mL de DMF isenta de água, concentração final de 200 mM. 3. Lavar 1 mL de esferas reversas, 3 vezes com 15 mL de DMSO. Passo de centrifugação: 1 minuto a 1200 rpm, temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante. 4. Lavar as esferas reversas, 3 vezes com 15 mL de DMF isenta de água. Passo de centrifugação de 1 minuto, 55 1200 rpm, temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante. 5. Suspender as esferas de sepharose reversas em 1 mL de DMF isenta de água. 6. Adicionar 100 pL de solução de Diisopropiletilamina (DIEA). 7. Adicionar composto (esferas de Sepharose reversas a 1 pmol/mL; corresponde a 10 pL de composto a 100 mM/ mL de esferas de sepharose reversas) de solução de DMF na quantidade requerida às esferas. 8. Misturar até que uma suspensão homogénea seja obtida. 9. Centrífuga: r 1 minuto, a 1200 rpm, à temperatura ambiente, remover 2 0 pL de sobrenadante e diluir em 30 pL de metanol (MeOH) para o valor de partida, para análise de HPLC. 10 . Adicionar 100 pL de solução de PyBroP à suspensão e misturar novamente. 11. Incubar, de um dia para o outro, no misturador de extremidade-a-extremidade, à temperatura ambiente. 12. Centrifugar 1 minuto, a 1200 rpm, à temperatura ambiente, remover 20 pL de sobrenadante e diluir em 30 pL de metanol (MeOH) para o valor ligado, para análise de HPLC.

Bloqueio das esferas 1. Bloquear as esferas pela adição de 100 pL de NHS-Acetato a 100 mM (ver abaixo como preparar reagente de bloqueio). 2. Incubar, de um dia para o outro, à temperatura ambiente, no agitador de extremidade-a-extremidade. 56

Reagente de bloqueio (ácido acético activado por NHS): 1. Preparar soluções a 200 mM de DCCD e NHS em acetonitrilo (~5 mL de cada). 2. Misturar volumes iguais do NHS e DCCD a 200 mM num frasquinho de vidro claro de 20 mL. 3. Por 1 mL de volume total de mistura de NHS/DCCD, adicionar 11,4 pL do ácido acético a 17,49 M (excesso molar de 2x) (Merck, 1.00063.1000). 4. Misturar exaustivamente. Formar-se-á um precipitado após cerca de 2 minutos (cristais do derivado de ureia). 5. Deixar repousar a reacção, à temperatura ambiente, pelo menos, de um dia para o outro, antes de utilização posterior.

Lavagem de esferas 1. Lavar as esferas, 2 vezes com 14 mL de DMSO (e. g., FLUKA, 34869 ou equivalente), depois, com 2 x 14 mL de isopropanol (Merck, 1.00983.1000, pro-analysis) . Passos de centrífuga: 1 minuto a 1200 rpm, temperatura ambiente. Remove sobrenadante entre lavagens. 2. Ressuspender as esferas com 1 mL de isopropanol, para preparar uma pasta a 50% para armazenamento, a -20 °C, ou utilizar imediatamente para reacções de ligação com lisados celulares. 57

Tabela 3: Abreviaturas utilizadas em protocolos de ligação DCCD Diciclo-hexilcarbodiimida DIEA Diisopropiletilamina DMSO Dimetilsulfóxido DMF Dimetilformamida NHS N-hidroxissuccinimida PyBroP Hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfónio TEA Trietilamina

Exemplo 2: Sinaloquinoma

Este exemplo ilustra o tratamento de células com compostos (ver, de um modo particular, o segundo aspecto da invenção) . As células HeLa foram tratadas com factor de crescimento epidérmico (EGF), um lisado celular foi preparado e analisado utilizando Kinobeads (protocolo experimental na secção 2.1) e espectrometria de massa. A preparação de Kinobeads é descrita no Exemplo 1.

Em paralelo, o lisado celular foi submetido a imunoprecipitação com um anticorpo anti-fosfosfotirosina (protocolo experimental na secção 2.2) e analisado por espectrometria de massa. 0 resultado (Figura 2) mostra que as kinobeads identificam significativamente mais cinases (Tabela 8), em comparação com o processo de imunoprecipitação (Tabela 6). 58 1. Preparação da amostra biológica (lisado celular) 1.1 Cultura celular e tratamento de células

Cultura celular. As células HeLa (American Type Culture Collection N° CCL-2) foram cultivadas em meio MEM (sem L-Arginina e sem L-Glutamina; Promocell C-75280), Soro Bovino Fetal a 10% dialisado (Gibco, 26400-044), aminoácidos não essenciais lOOx a 1% (Cambrex, BE13-114E), Piruvato de sódio a 1 mM (Gibco, 11360-039), L-glutamina a 2 mM (Gibco, 25030-032), L-Arginina 12C ou 13C a 40 mg/L (Arginina 12C - Sigma, A6969) (Arginina 13C - Cambridge Isotope Laboratories Inc., CLM-2265), a 37 °C, C02 a 5%.

Propagação celular. Depois de as células atingirem confluência numa placa de 15 cm, as células foram divididas 1 a 10, para crescimento adicional. As células foram divididas, em primeiro lugar, removendo os meios de sobrenadante, depois, lavando brevemente as células com 15 mL de tampão PBS (Gibco, 14190-094). Após remoção do PBS, as células foram desprendidas da placa pela adição de 2 mL de solução de tripsina-EDTA (Gibco, 25300-054) por placa de 15 cm e incubação da placa, durante 10 minutos, a 37 °C. Após desprendimento das células, foram adicionados 8 mL de meio de crescimento MEM (ver acima) por placa de 15 cm. 1 mL desta solução foi colocado em placas de 15 cm frescas e foram adicionados 24 mL de meios MEM (ver acima) . As placas foram novamente incubadas, a 37 °C, C02 a 5%, até que as células estivessem confluentes (~3 — 4 dias).

Tratamento de EGF das células. Um dia antes do tratamento das células com Factor de Crescimento Epidérmico (EGF), o meio de crescimento celular foi removido por aspiração e foram 59 adicionados 20 mL de meio MEM fresco (ver acima), com a excepção de que o meio foi suplementado com Soro Bovino Fetal (FBS) a 0,1%, em vez de FBS a 10%. As células foram incubadas neste meio de inanição, de um dia para o outro, a 37 °C, C02 a 5%. Após inanição das células, 3 pL de EGF humano recombinante a 1 mg/mL (Biomol, 50349-1) foram adicionados a cada placa de 15 cm (concentração final de EGF = 150 ng/mL de meio). Antes da recolha, as placas foram incubadas, a 37 °C, C02 a 5%, durante 10 minutos.

Recolha de células. As células foram recolhidas pela decantação do meio contendo EGF, lavagem de cada placa de 15 cm, uma vez com 10 mL de tampão PBS gelado e raspagem da placa com um raspador de borracha, de modo a desprender as células. As células foram transferidas para tubos Falcon de 50 mL (Becton Dickinson, 352070) e centrifugadas, durante 10 minutos, a 1500 rpm, num Heraeus Multifuge 3SR. O sobrenadante foi aspirado e o sedimento celular foi ressuspenso em 50 mL de tampão PBS gelado. Após centrifugação e aspiração do sobrenadante, os sedimentos celulares foram rapidamente congelados em azoto liquido e, depois, armazenados a -80 °C. 1.2 Preparação de lisados celulares 0 lisado de células HeLa foi preparado por dissociação mecânica em solução de tampão de lise, sob condições suaves que mantêm a estrutura e função das proteínas. 60

Foram efectuadas os seguintes passos:

Descongelar o tecido rapidamente, à temperatura ambiente, ou 37 °C, depois, transferir o tecido para um frasco de vidro contendo o tampão de lise lx (utilizar um frasquinho suficientemente grande para ser utilizado com o homogeneizador Polytron PT 3100) Lisar o órgão/tecido com pulsos de 4 x 10 s, a 5000-7000 rpm, a 4 °C, na câmara frigorífica Transferir o homogeneizado para tubos falcon de 50 mL pré-arrefeeidos

Incubar o homogeneizado sobre gelo, durante 30 min Centrifugar as células, durante 10 min, a 6000 g, a 4 °C (6000 rpm em Sorvall SLA600, pré-arrefecido) Transferir o sobrenadante para um tubo de policarbonato UZ (Beckmann, 355654)

Centrifugar o sobrenadante, durante 1 h, a 145000 g, a 4 °C (40000 rpm em TÍ50.2, pré-arrefecido)

Guardar o sobrenadante (se possível, remover e descartar a maior parte da camada lipídica), transferir o sobrenadante para um frasco de vidro e armazenar sobre gelo

Determinar a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford (BioRad). As concentrações típicas de proteína são na gama de 5-10 mg/mL.

Preparar alíquotas em tubos Falcon de 15 a 50 mL Congelar as alíquotas em azoto líquido e armazená-las a -80 °C. 61

Preparação de 100 mL de tampão de lise lx com NP40 a 0,8%:

Combinar as seguintes soluções ou reagentes e adicionar água destilada para um volume final de 100 mL: 20 mL de tampão de lise 5x (ver abaixo) , 100 pL de DTT a 1 M, 5 mL de NaF a 0,5 M, 4 mL de NP40 a 20%, 4 comprimidos completos isentos de EDTA (cocktail de inibidor de protease, Roche Diagnostics, 1 873 580), adicionar água destilada para 100 mL.

Tabela 4: Preparação de tampão de lise 5x

Substância: Solução stock Cone. final em tampão de lise 1 x Adicionar para tampão de lise 115 x Tris/HCl, pH 7,5 1 M 50 mM 250 mL Glicerol 87% 5% 288 mL MgCl2 1 M 1,5 mM 7,5 mL NaCl 5 M 150 mM 150 mL Na3V04 100 mM 1 mM 50 mL

Estas soluções foram obtidas dos seguintes fornecedores:

Tris/HCl a 1 M, pH 7,5: Sigma, T-2663; Glicerol a 87%: Merck, n° cat. 04091.2500; MgCl2 a 1 M: Sigma, M-1028; NaCl a 5 M: Sigma, S-5150. 0 tampão de lise concentrado 5x foi filtrado através de um filtro de 0,22 pm e armazenado em aliquotas de 40 mL a -80 °C. 62

Preparação de soluções stock utilizadas neste protocolo:

Preparação de solução stock de Na3V04 a 100 mM:

Dissolver 9,2 g de Na3V04 em 400 mL de água destilada. 1) Ajustar o pH para 10,0 utilizando NaOH a 1 N ou HC1 a 1 N. O pH de partida da solução de ortovanadato de sódio pode variar com o lote. A pH 10,0, a solução será amarela. 2) Ferver a solução até que fique incolor (aproximadamente 10 min). 3) Arrefecer para a temperatura ambiente. 4) Reajustar o pH para 10,0 e repetir os passos 2 e 3 até que solução permaneça incolor e o pH estabilize a 10,0. 5) Ajustar o volume para 500 mL com água destilada. 6) Congelar as alíquotas a -20 °C. As aliquotas podem ser armazenadas durante vários meses.

Preparação de solução stock de NaF a 500 mM:

Dissolver 21,0 g de NaF (Sigma, S7920) em 500 mL de água destilada. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 ym e armazenar a 4 °C. 63

Preparação de solução de NP40 a 20%:

Pesar 40,0 g de NP40 (Sigma, Igepal-CA630, catálogo N° 13021) . Adicionar água destilada até 200 g. Misturar completamente e armazenar a solução à temperatura ambiente.

Preparação de solução de DTT a 1 M:

Dissolver 7,7 g de DTT (Biomol, catálogo N° 04010) em 50 mL de água destilada. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 pm e congelar aliquotas de 400 pL a -20 °C. As alíquotas podem ser armazenadas durante vários meses. 2. Reacções de ligação 2.1 Colocação das "kinobeads" (ligandos de captura imobilizados) em contacto com o lisado celular

As kinobeads (ligandos de captura imobilizados) foram colocadas em contacto com lisado celular preparado a partir de células HeLa, sob condições que permitem a ligação das proteínas no lisado aos ligandos. As condições de ligação eram próximas das fisiológicas, pela escolha de condições tampão adequadas preservando a função das proteínas. Após remoção de proteínas não capturadas através de um processo de lavagem suave, as proteínas ligadas foram colocadas em contacto com um composto de teste que conduziu à eluição das proteínas. 64

2.1.1 Preparação de tampões de DP

Tabela 5: Preparação de tampão de DP 5x

Substância: Solução stock Cone. final em tampão de lise 1 x Adicionar para tampão de lise 115 x Tris/HCl, pH 7,5 1 M 50 mM 25 0 mL Glicerol 87% 5% 28 8 mL MgCl2 1 M 1,5 mM 7, 5 mL NaCl 5 M 150 mM 150 mL Na3V04 100 mM 1 mM 50 mL 0 tampão de DP 5x foi filtrado através de um filtro de 0,22 pm e armazenado em aliquotas de 40 mL a -80 °C. Estas soluções foram obtidas dos seguintes fornecedores: Tris/HCl a 1,0 M, pH 7,5 (Sigma, T-2663), Glicerol a 87% (Merck, catálogo número 04091.2500); MgCl2 a 1,0 M (Sigma, M-1028); NaCl a 5,0 M (Sigma, S-5150) .

Foram preparados os seguintes tampões de DP lx: • Tampão de DP lx (para equilibração de esferas) • Tampão de DP lx/NP40 a 0,4% (para equilibração de esferas e primeiro passo de lavagem de esferas) • Tampão de DP lx/NP40 a 0,2% (para a segundo passo de lavagem de esferas e para eluição de compostos) • Tampão de DP lx/inibidores de protease (para o primeiro passo de diluição de lisado); adicionar um comprimido de inibidor de protease por 25 mL de tampão de lise 65 (comprimido isento de EDTA, cocktail de inibidor de protease, Roche Diagnostics, 1 873 580)

Tampão de DP lx/NP40 a 0,4%/inibidores de protease (para a segundo passo de diluição de lisado)

Exemplo para preparação de tampão de DP lx/NP40 a 0,4% (100 mL):

Combinar as seguintes soluções e reagentes e adicionar água destilada para um volume final de 100 mL: 20 mL de tampão de DP 5x, 5 mL de NaF a 0,5 M, 2 mL de NP40 a 20%, 100 pL de DTT a 1 M e adicionar água destilada até 100 mL. Todos os tampões contêm concentração final de DTT a 1 mM. 2.1.2 Lavagem e equilibração de esfera

As kinobeads (Exemplo 1) foram preparadas para a reacção de ligação pela lavagem com um tampão adequado e equilibração no tampão.

Foram efectuadas os seguintes passos: 1. Utilizar tubos Falcon de 15 mL para todas os passos de lavagem. 2. Utilizar 100 pL de KinoBeads por experiência (volume de esfera depositado): misturar quantidades iguais (25 pL) de cada tipo de esfera ligada com os seguintes 4 ligandos (densidade de ligação de 1 pmol/mL): Bis VIII (CZC00001056), Purvalanol B (CZC00007097) , derivado de PD173955 (CZC00007324) e CZC00008004. 66 3. Lavar as esferas duas vezes com 3 mL de tampão de DP lx e uma vez com 3 mL de tampão de DP lx/NP40 a 0,4%. Durante cado passo de lavagem inverter os tubos 3-5 vezes, centrifugar 2 minutos, a 1200 rpm, a 4 °C, numa centrífuga Heraeus. Os sobrenadantes são sobrenadantes aspirados e descartados.

Após a último passo de lavagem preparar uma pasta 1:1 (volume/volume) com tampão de DP lx/NP40 a 0,4%. 2.1.3 Preparação de lisado celular diluído O lisado celular, como descrito na secção (1.2), foi preparado para a reacção de ligação por diluição num tampão adequado e clarificação através de um passo de centrifugação. Foram efectuadas as seguintes passos: 1. Utilizar um volume de lisado celular correspondendo a 50 mg de proteína por experiência. 2. Descongelar o lisado rapidamente num banho-maria, a 37 °C, depois, manter a amostra sobre gelo. 3. Diluir o lisado no seguinte modo: 1) diluir o lisado com tampão de DP lx/inibidores de protease, para reduzir a concentração de detergente de NP-40 de 0,8% para 0,4%. 2) fazer uma diluição adicional do lisado com tampão de DP lx/NP40 a 0, 4%/inibidores de protease, para se atingir uma concentração de proteína final de 5 mg/mL. 67 4. Transferir o lisado diluído para um tubo de policarbonato UZ (Beckmann, 355654) . 5. Clarificar o lisado diluído através de ultracentrifugação (20 min, 4 °C, 100000 g, rotor TI50.2, ultracentrifuga pré- arrefecida). 6. Guardar o sobrenadante e mantê-lo sobre gelo. 2.1.4 Reacção de ligação e lavagem

As esferas lavadas e equilibradas da secção (2.1.2) foram colocadas em contacto com o lisado celular diluído do passo (2.1.3), de modo a permitir a ligação de proteínas aos ligandos. As proteínas ligadas de um modo não específico foram removidas por lavagem suave, de modo a reduzir a ligação de fundo. 1. Combinar o lisado clarificado diluído com 100 pL de KinoBeads lavadas em tubos Falcon de 15 mL ou 50 mL. 2. Incubar, durante 2 horas, a 4 °C, rotacionar em ROTO SHAKE GENIE (Scientific Industries, Inc.) na câmara frigorífica. 3. Após incubação, centrifugar, durante 3 minutos, a 1200 rpm, numa centrífuga Heraeus ou equivalente, a 4 °C. 4. Remover o sobrenadante cuidadosamente, sem perder as esferas. 5. Transferir as esferas para uma coluna Mobicol, com filtro de 90 pm (MoBiTec, Goettingen, N° cat.: M1002-90). 68 6. Lavar as esferas com 10 mL de tampao de DP lx/NP-40 a 0,4% e 5 mL do tampão de DP lx/NP-40 a 0,2%. 7. Antes de prosseguir com o passo seguinte, deixar o tampão de lavagem correr através da coluna completamente. 8. Colocar a coluna em tubo Eppendorf e centrifugar durante 1 minuto, a 800 rpm, a 4 °C.

Fechar as colunas com a tampa inferior. 2.1.5 Eluição de proteínas 1. Adicionar 60 pL de Tampão de Amostra NuPAGE SDS 2x (Invitrogen, NP0007; antes da utilização, diluir o tampão 4x 1:1 com água destilada). 2. Incubar as amostras durante 30 minutos, a 50 °C. 3. Abrir a tampa inferior da coluna e centrifugar as colunas MobiTec 1 minuto, a 2000 rpm, para separar o eluato das esferas. 4. Adicionar 1/10 de volume de iodoacetamida a 200 mg/mL, incubar durante 30 minutos, à temperatura ambiente, proteger da luz. Esta reacção conduz à alquilação de cisteínas para análise de espectrometria de massa. 5. Antes de carregar as amostras no gel, centrifugar as amostras, durante 5 minutos, a 15000 rpm, de modo a remover precipitados. 69 6. Para separaçao de proteína, aplicar 60 pL de amostra a gel de Bis-Tris a 4-12% de NuPAGE (Invitrogen, NP0335).

Preparação de soluções stock utilizadas neste protocolo

Preparação de uma solução stock de Na3VC>4 a 100 mM: 1) Dissolver 9,2 g de Na3VC>4 em 400 mL de água destilada. 2) Ajustar o pH para 10,0 utilizando NaOH a 1 N ou HC1 a 1 N. O pH de partida da solução de ortovanadato de sódio pode variar com o lote. A pH 10,0, a solução será amarela. 3) Ferver a solução até que fique incolor (aproximadamente 10 min) . 4) Arrefecer para a temperatura ambiente. 5) Reajustar o pH para 10,0 e repetir os passos 2 e 3 até que solução permaneça incolor e o pH estabilize a 10,0. 6) Ajustar o volume para 500 mL com água destilada. 7) Congelar as alíquotas a -20 °C. As alíquotas podem ser armazenadas durante vários meses. 70

Preparaçao de uma solução stock de NaF a 500 mM;

Dissolver 21,0 g de NaF (Sigma, S7920) em 500 mL de água destilada. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 pm e armazenar a 4 °C.

Preparaçao de uma solução de NP40 a 20%:

Pesar 40,0 g de NP40 (Sigma, Igepal-CA630, n° cat. 13021). Adicionar água destilada até 200 g. Misturar completamente e armazenar a solução à temperatura ambiente.

Preparaçao de uma solução de DTT a 1 M:

Dissolver 7, 7 g de DTT (Biomol, número de catálogo 04010) em 50 mL de água destilada. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 pm e congelar alíquotas de 400 pL a -20 °C. As alíquotas podem ser armazenadas durante vários meses.

Preparaçao de uma solução stock de Iodoacetamida (200 mg/mL): 1-6125) em 10 mL de um filtro de °C. As aliquotas

Dissolver 2,0 g de Iodoacetamida (Sigma, de água destilada. Filtrar a solução através 0,22 pm e congelar aliquotas de 400 pL a -20 podem ser armazenadas durante vários meses. 71 2.2 Imunoprecipitação utilizando esferas de anticorpo anti-fosfotirosina 2.2.1 Tampões e esferas de anticorpo Antifosfotirosina

Todos os tampões utilizados na experiência de imunoprecipitação com anticorpos anti-fosfotirosina imobilizados foram idênticos aos utilizados para a experiência de kinobead (ver acima) , com excepção de que não foi adicionado DTT e foram adicionados 50 pL do ácido ocadaico a 1 mM (Biomol, El-181; inibidor de fosfatase), de modo que fosse atingida uma concentração final de 500 nM do ácido ocadaico. As esferas de anticorpo antifosfotirosina (esferas de Agarose com anticorpo anti-fosfotirosina 4G10 recombinante ligado covalentemente) foram obtidas de Biomol (Catálogo número 16-199). 2.2.2 Lavagem e equilibração de esferas anti-fosfotirosina

As esferas anti-fosfotirosina foram preparadas para a reacção de ligação pela lavagem com um tampão adequado e equilibração no tampão. 1. Utilizar tubos Falcon de 15 mL para todos os passos de lavagem. 2. Utilizar 100 pL de esferas anti-fosfotirosina por experiência. 3. Lavar as esferas duas vezes com 3 mL de tampão de DP lx (-DTT) e uma vez com 3 mL de tampão de DP lx/NP40 a 0,4% (-DTT). Durante cado passo de lavagem inverter os tubos 3-5 vezes, centrifugar 2 minutos, a 1200 rpm, a 4 °C, numa centrífuga

Heraeus. Os sobrenadantes são aspirados e descartados. 72

Após o último passo de lavagem preparar uma pasta 1:1 (volume/volume) com tampão de DP lx/NP40 a 0,4% (-DTT). 2.2.3 Preparação de lisado celular diluído O lisado celular foi preparado para a reacção de ligação por diluição num tampão adequado e clarificação através de um passo de centrifugação. 1. Utilizar um volume de lisado celular correspondendo a 50 mg de proteína por experiência. 2. Descongelar o lisado rapidamente num banho-maria, a 37 °C, depois, manter a amostra sobre gelo. 3. Diluir o lisado no seguinte modo:

Primeiro passo de diluição: diluir o lisado com tampão de DP lx/inibidores de protease/ácido ocadaico/sem DTT, para reduzir a concentração de detergente de NP-40 de 0,8% para 0,4%.

Segundo passo de diluição: fazer uma diluição adicional do lisado com tampão de DP lx/NP40 a 0,4%/inibidores de protease/ácido ocadaico/sem DTT, para se atingir uma concentração de proteína final de 5 mg/mL. (Nota: A segundo passo de diluição é apenas requerida se a concentração de proteína do lisado após o primeiro passo de diluição for superior a 5 mg/mL). 4. Transferir o lisado diluído para um tubo de policarbonato UZ (Beckmann, 355654). 73 5. Clarificar o lisado diluído através de ultracentrifugação (20 min, 4 °C, 100000 g, rotor TI50.2, ultracentrífuga pré- arrefecida). 6. Guardar o sobrenadante e mantê-lo sobre gelo. 2.2.4 Reacção de ligação e passos de lavagem

As esferas anti-fosfotirosina lavadas e equilibradas foram colocadas em contacto com o lisado celular diluído da secção 2.2.3, de modo a permitir a ligação das proteínas às esferas anti-fosfotirosina. As proteínas ligadas de um modo não específico foram removidas por lavagem suave, de modo a reduzir a ligação de fundo. 1. Combinar o lisado clarificado diluído com 100 pL de esferas anti-fosfotirosina lavadas num tubo Falcon de 15 mL ou 50 mL. 2. Incubar, durante 4 horas, a 4 °C, rotacionar em ROTO SHAKE GENIE (Scientific Industries, Inc.) na câmara frigorífica. 3. Após incubação, centrifugar, durante 3 minutos, a 1200 rpm, numa centrífuga Heraeus ou equivalente, a 4 °C. 4. Remover o sobrenadante cuidadosamente, sem perder as esferas. 5. Transferir as esferas para uma coluna Mobicol, com filtro de 90 pm (MoBiTec, Goettingen, N° cat.: M1002-90). 6. Lavar as esferas com 10 mL de tampão de DP lx/NP-40 a 0,4%/sem DTT e 5 mL de tampão de DP lx/NP-40 a 0,2%/sem DTT. 74 7. Antes de prosseguir com o passo seguinte, deixar o tampão de lavagem correr através da coluna completamente. 8. Colocar a coluna em tubo Eppendorf e centrifugar durante 1 minuto, a 800 rpm, a 4 °C.

Fechar as colunas com a tampa inferior. 2.2.5 Eluição de proteínas ligadas 1. Adicionar 60 pL de Tampão de Amostra NuPAGE SDS 2x (Invitrogen, NP0007; antes da utilização, diluir o tampão 4x 1:1 com água destilada). 2. Incubar as amostras durante 30 minutos, a 50 °C. 3. Abrir a tampa inferior da coluna e centrifugar as colunas MobiTec 1 minuto, a 2000 rpm, para separar o eluato das esferas. 4. Adicionar 1/10 de volume de iodoacetamida a 200 mg/mL, incubar durante 30 minutos, à temperatura ambiente, proteger da luz. Esta reacção conduz à alquilação de cisteínas para análise de espectrometria de massa. 5. Antes de carregar as amostras no gel, centrifugar as amostras, durante 5 minutos, a 15000 rpm, de modo a remover precipitados. 6. Para separação de proteína, aplicar 60 pL de amostra a gel de Bis-Tris a 4-12% NuPAGE (Invitrogen, NP0335). 75 3. Análise de espectrometria de massa de enzimas eluidas (e. g., cinases)

Descrição de péptidos proteotípicos A digestão tríptica de uma mistura de proteína separada por SDS-PAGE produz, para cada proteína, numerosos fragmentos peptídicos distintos com diferentes propriedades físico-químicas. Estes péptidos diferem em compatibilidade com a plataforma analítica de espectrometria de massa utilizada para identificação de proteína (ID), aqui, espectrometria de massa em tandem de ionização de electrosspray de cromatografia de fase líquida reversa nanocapilar (RP-LC-MS/MS). Como resultado, as frequências peptídicas para péptidos da mesma proteína fonte diferem em elevado grau, os péptidos mais frequentemente observados que "tipicamente" contribuem para a identificação desta proteína sendo designados péptidos "proteotípicos". Deste modo, um "péptido proteotípico", é um péptido experimentalmente bem observável que identifica, de um modo único, uma proteína ou isoforma de proteína específica.

Vantagens dos péptidos proteotípicos A utilização de péptidos proteotípicos para a identificação de proteína permite a rápida e focada identificação e quantificação de múltiplas proteínas alvo conhecidas, pela concentração do processo de identificação de proteína num rastreio para a presença de péptidos de assinatura ricos em informação. 76

Identificação experimental de péptidos proteotipicos

Uma estratégia para produzir uma lista de péptidos proteotipicos é recolher dados de identificação de péptidos empiricamente e pesquisar o conjunto de dados para péptidos geralmente observados que identificam, de um modo único, uma proteína.

Para cada registo de proteína de base de dados de IPI com, pelo menos, 10 identificações inequívocas no conjunto de dados de CZ (ID de multipéptido ou ID de péptido simples manualmente verificado), são calculadas as frequências peptídicas para péptidos contribuintes. São apenas consideradas as melhores correspondências de péptido-para-espectro específicas, de acordo com o motor de pesquisa da base de dados Mascot™ (matriz Science) .

Para definição dos péptidos proteotipicos para uma proteína específica, os péptidos são ordenados por frequência peptidica descendente e uma presença peptidica cumulativa é calculada: Este valor proporciona, para cada péptido, a razão de identificação onde este péptido ou qualquer dos péptidos com uma frequência peptidica superior estava presente. Os péptidos proteotipicos são definidos utilizando uma exclusão para presença cumulativa de 95%, i. e., pelo menos, 95% de eventos de identificação para esta proteína foram baseados em, pelo menos, um péptido proteotípico. 77 3.1 Digestão de proteína e preparação de amostra antes de análise de espectrometria de massa

As proteínas foram concentradas, separadas em géis Novex a 4-12% de NuPAGE® (Invitrogen, Carlsbad, CA) e coradas com azul de Coomassie coloidal. As pistas de gel foram sistematicamente cortadas através de toda a gama de separações em < 48 cortes (bandas e regiões interbanda) e submetidas a digestão tríptica no gel, essencialmente como descrito por Shevchenko et al., 1996, Analytical Chemistry 68: 850-858. Resumidamente, os blocos de gel foram descorados, de um dia para o outro, em NH4HCO3 a 5 mM em EtOH a 50%, digeridos durante 4 horas com tripsina a 12,5 ng/pL em NH4HCO3 a 5 mM. Os péptidos foram extraídos com ácido fórmico a 1%, transferidos para uma segunda placa de 96 poços e secos sob vácuo. Os péptidos secos foram ressuspensos em 10 pL do ácido fórmico a 0,1% em água e 5 pL foram injectados no sistema de LC-MS/MS para identificação de proteína. 3.2 Aquisição de dados de espectrometria de massa

As amostras peptídicas foram injectadas num sistema nano LC (CapLC, Waters ou Ultimate, Dionex) que estava directamente ligado a um espectrómetro de massa de tempo-de-voo quadrupolar (QTOF2, QTOF Ultima, QTOF Micro, Micromass ou QSTAR Pulsar, Sciex) ou barreira iónica (LCQ Deca XP, LTQ, Thermo-Finnigan). Os péptidos foram separados no sistema de LC, utilizando um gradiente de solventes aquosos e orgânicos, com um tempo de gradiente típico compreendido entre 15 e 45 min. 0 solvente A foi acetonitrilo a 5% em ácido fórmico a 0,1% e o solvente B foi acetonitrilo a 70% em ácido fórmico a 0,1%. 78 3.3 Identificação de proteína

Os dados de massa e fragmentação peptídicos gerados nas experiências de LC-MS/MS foram utilizados para pesquisar uma versão desenvolvida internamente do índice de Proteína Internacional (IPI) da base de dados de sequências de proteínas (EBI) . As proteínas foram identificadas pela correlação da massa peptídica medida e os dados de fragmentação com os mesmos dados computados a partir dos registos na base de dados, utilizando a ferramenta de software Mascot (Matrix Science; Perkins et ai., 1999, Electrophoresis 20: 3551-3567). Os critérios de pesquisa variaram, dependendo de que espectrómetro de massa foi utilizado para a análise. 4. Resultados

Os resultados da experiência de Sinaloquinoma são mostrados na Figura 2. Esta figura mostra uma comparação de precipitações de Fármaco utilizando kinobeads (círculo da esquerda) e imunoprecipitações convencionais com esferas de anticorpo anti-fosfotirosina (círculo da direita). Na experiência de Kinobeads foi identificado um total de 626 proteínas, destas, 100 eram cinases. Na experiência de imunoprecipitação (IP) foi identificado um total de 503 proteínas, 12 destas eram cinases. As cinases identificadas com ambas as experiências (cinases comuns) são listadas na área de sobreposição. O resultado mostra que com as kinobeads foram identificadas significativamente mais cinases (100 cinases), em comparação com esferas de anticorpo anti-fosfotirosina (12 cinases). 79

As cinases identificadas para ambas as abordagens experimentais são listadas nas seguintes tabelas. Além disso, as sequências de péptidos proteotípicos para as cinases são listadas em tabelas separadas.

Tabela 6: Cinase identificada após imunoprecipitação (IP). Os nomes de cinase são de acordo com a nomenclatura de cinases humanas (http://kinase.com) e Manning et al., 2002, Science 298, 1912-1934, como especificado em material suplementar).

Identificação de cinase Nome de Cinase Pontuação Número de péptidos identificados Péptido proteotípico experimental disponível e identificado 1 DNAPK 606 20 X 2 TIFlb 202 6 X 3 p3 8a 343 11 X 4 CDK2 196 4 X 5 TYK2 77 3 X 6 LYN 67 2 X 7 EGFR 2463 162 X 8 FAK 1203 51 X 9 ACK 160 6 10 KHS2 65 2 80

Tabela 7: Sequências de péptidos proteotípicos para cinases identificadas após imunoprecipitação (IP, ver a Tabela 6) . Os nomes de cinase são de acordo com a nomenclatura de cinases humanas (http://kinase.com) e Manning et al., 2002, Science 298, 1912-1934, como especificado em material suplementar).

EXPERIÊNCIA NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO IP CDK2 ALFPGDSEIDQLFR IP CDK2 IGEGTYGVVYK IP CDK2 FMDASALTGIPLPLIK IP DNAPK HGDLPDIQIK IP DNAPK LACDVDQVTR IP DNAPK AALSALESFLK IP DNAPK DQNILLGTTYR IP DNAPK FMNAVFFLLPK IP DNAPK VTELALTASDR IP DNAPK LGASLAFNNIYR IP DNAPK LNESTFDTQITK IP DNAPK QLFSSLFSGILK IP DNAPK NILEESLCELVAK IP DNAPK TVSLLDENNVSSYLSK IP DNAPK TVGALQVLGTEAQSSLLK IP EGFR VLGSGAFGTVYK IP EGFR IPLENLQIIR IP EGFR GDSFTHTPPLDPQELDILK IP FAK LGDFGLSR IP FAK FLQEALTMR IP FAK FFEILSPVYR 81 (continuação)

EXPERIÊNCIA NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO IP FAK LLNSDLGELINK IP FAK TLLATVDETIPLLPASTHR IP HER2/ErbB2 VLGSGAFGTVYK IP LYN EEPIYIITEYMAK IP p38a LTDDHVQFLIYQILR IP p38a NYIQSLTQMPK IP p38a LTGTPPAYLINR IP TIFlb IVAERPGTNSTGPAPMAPPR IP TYK2 HGIPLEEVAK IP TYK2 LSDPGVGLGALSR

Tabela 8: Cinases identificadas após precipitação de fármaco com kinobeads. Os nomes de cinase são de acordo com a nomenclatura de cinases humanas (http://kinase.com) e Manning et al., 2002, Science 298, 1912-1934, como especificado em material suplementar).

Identificação de cinase Nome de Cinase Pontuação Número de péptidos identificados Péptido proteotipico experimental disponível e identificado Identificado também em IP (ver a tabela 1) 1 DNAPK 6592 263 X IP 2 FRAP 356 9 X 3 ATM 113 3 X 4 ATR 91 2 X 5 CDC2 309 11 X 82 (continuação)

Identificação de cinase Nome de Cinase Pontuação Número de péptidos identificados Péptido proteotipico experimental disponível e identificado Identificado também em IP (ver a tabela 1) 6 YES 1747 100 X 7 CaMK2d 1003 41 X 8 JNK1 1011 45 X 9 JNK2 317 11 X 10 CaMK2g 811 21 X 11 p3 8a 1145 90 X IP 12 TNKl 81 4 X 13 GSK3B 1408 81 X 14 FYN 1845 115 X 15 SRC 1780 91 X 16 Erk2 1677 200 X 17 CaMK2b 122 3 X 18 JNK3 590 26 X 19 Coai 316 11 X 20 GSK3A 1390 117 X 21 AurA 198 8 X 22 RIPK2 634 19 X 23 CDK2 1172 50 X IP 24 ADCK1 88 4 25 CKla 566 21 X 26 GAK 1995 61 X 27 AAK1 123 3 X 28 CDK9 379 13 X 29 CKld 206 7 X 30 Erkl 566 26 X 31 NEK9 1947 102 X 83 (continuação)

Identificação de cinase Nome de Cinase Pontuação Número de péptidos identificados Péptido proteotipico experimental disponível e identificado Identificado também em IP (ver a tabela 1) 32 TYK2 222 6 X IP 33 AMPKal 93 3 X 34 LYN 1783 67 X IP 35 AurB 287 10 X 36 CKle 314 10 X 37 EGFR 165 3 X IP 38 EphB2 1165 43 X 39 ALK2 299 11 X 40 DDR1 759 28 X 41 TBK1 2042 72 X 42 CSK 1584 102 X 43 TEC 50 2 44 ZAK 499 16 X 45 ALK4 472 9 X 46 ADCK3 309 8 X 47 MAP2K5 795 32 48 EphB4 2237 165 X 49 ARG 2128 69 X 50 FER 2762 130 X 51 RSK2 2100 99 X 52 CK2a2 930 32 X 53 BMPR1A 676 19 X 54 TGFBR1 478 15 X 55 EphA5 114 4 X 56 BRK 107 3 57 FAK 1933 95 X IP 84 (continuação)

Identificação de cinase Nome de Cinase Pontuação Número de péptidos identificados Péptido proteotipico experimental disponível e identificado Identificado também em IP (ver a tabela 1) 58 ILK 209 6 X 59 CDK5 699 27 X 60 DDR2 1073 44 X 61 JAK1 1083 31 62 MYT1 152 5 63 PKCd 53 4 64 RSK3 2227 117 X 65 Weel 550 18 X 66 ACTR2 193 5 67 MAP3K2 383 15 68 ACTR2B 82 2 69 WeelB 550 18 X 70 ABL 1133 35 X 71 MET 503 12 X 72 BRAF 361 7 73 INSR 1807 64 X 74 KHS1 393 12 75 PAK4 448 15 X 76 PKD1 58 2 77 PKD2 58 2 X 78 IGF1R 935 28 X 79 PHKg2 519 16 X 80 CaMKK2 199 5 X 81 MAP2K2 294 6 X 82 TGFbR2 49 2 83 Fused 42 2 85 (continuação)

Identificação de cinase Nome de Cinase Pontuação Número de péptidos identificados Péptido proteotipico experimental disponível e identificado Identificado também em IP (ver a tabela 1) 84 EphA2 2099 90 X 85 ACK 169 4 IP 86 NLK 46 2 87 CDK7 623 20 X 88 CHK2 58 2 X 89 KHS2 60 4 IP 90 MLK3 59 1 X 91 PKCe 53 4 X 92 PKCh 53 4 X 93 PYK2 106 3 X 94 TA02 120 3 95 CKlgl 45 2 X 96 LIMK1 271 6 97 MAP2K1 480 14 98 HRI 52 1 99 SIK 36 1 100 Erk7 67 1 101 NEK2 145 4 102 NEK7 175 5 103 BMPR1B 179 5 X 104 MAP2K3 133 5 105 FGFR2 514 17 86

Tabela 9: Sequências de péptidos proteotípicos para cinases identificadas após precipitações de fármaco com kinobeads (ver a Tabela 8).

EXPERIÊNCIA NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO KinobeadDP AAK1 ADIWALGCLLYK KinobeadDP ABL GQGESDPLDHEPAVSPLLPR KinobeadDP ABL WTAPESLAYNK KinobeadDP ABL VADFGLSR KinobeadDP ABL NGQGWVPSNYITPVNSLEK KinobeadDP ADCK3 DKLEYFEERPFAAASIGQVHLAR KinobeadDP ADCK3 SFTDLYIQIIR KinobeadDP ADCK3 VALLDFGATR KinobeadDP ADCK3 AVLGSSPFLSEANAER KinobeadDP ALK2 WFSDPTLTSLAK KinobeadDP ALK4 TIVLQEIIGK KinobeadDP ALK4 EAEIYQTVMLR KinobeadDP AMPKal IGHYILGDTLGVGTFGK KinobeadDP ARG AAS S S SVVPYLPR KinobeadDP ARG ESESSPGQLSISLR KinobeadDP ARG GAQASSGSPALPR KinobeadDP ARG VLGYNQNGEWSEVR KinobeadDP ARG VPVLISPTLK KinobeadDP ARG WTAPESLAYNTFSIK KinobeadDP ARG VADFGLSR KinobeadDP ARG NGQGWVPSNYITPVNSLEK KinobeadDP ATM LVVNLLQLSK 87 (continuação)

EXPERIÊNCIA NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO KinobeadDP ATR APLNETGEVVNEK KinobeadDP AurA SKQPLPSAPENNPEEELASK KinobeadDP AurA VEFTFPDFVTEGAR KinobeadDP AurB IYLILEYAPR KinobeadDP AurB SNVQPTAAPGQK KinobeadDP BMPR1A FNSDTNEVDVPLNTR KinobeadDP BMPR1A WNSDECLR KinobeadDP BMPR1A YEGSDFQCK KinobeadDP BMPR1A YMAPEVLDESLNK KinobeadDP BMPR1A ETEIYQTVLMR KinobeadDP BMPR1A HENILGFIAADIK KinobeadDP BMPR1A VFFTTEEASWFR KinobeadDP BMPR1A YGEVWMGK KinobeadDP BMPR1B ETEIYQTVLMR KinobeadDP BMPR1B HENILGFIAADIK KinobeadDP BMPR1B VFFTTEEASWFR KinobeadDP BMPR1B YGEVWMGK KinobeadDP CaMK2b LTQYIDGQGRPR KinobeadDP CaMK2b NLINQMLTINPAK KinobeadDP CaMK2b AGAYDFPSPEWDTVTPEAK KinobeadDP CaMK2b DLKPENLLLASK KinobeadDP CaMK2d FYFENALSK KinobeadDP CaMK2d AGAYDFPSPEWDTVTPEAK KinobeadDP CaMK2d DLKPENLLLASK KinobeadDP CaMK2g FYFENLLSK (continuação)

EXPERIÊNCIA NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO KinobeadDP CaMK2g LTQYIDGQGRPR KinobeadDP CaMK2g NLINQMLTINPAK KinobeadDP CaMK2g AGAYDFPSPEWDTVTPEAK KinobeadDP CaMK2g DLKPENLLLASK KinobeadDP CaMKK2 GPIEQVYQEIAILK KinobeadDP CaMKK2 LAYNENDNTYYAMK KinobeadDP CDC2 DLKPQNLLIDDKGTIK KinobeadDP CDC2 NLDENGLDLLSK KinobeadDP CDC2 SPEVLLGSAR KinobeadDP CDC2 IGEGTYGVVYK KinobeadDP CDK2 APEILLGCK KinobeadDP CDK2 FMDASALTGIPLPLIK KinobeadDP CDK2 ALFPGDSEIDQLFR KinobeadDP CDK2 IGEGTYGVVYK KinobeadDP CDK5 IGEGTYGTVFK KinobeadDP CDK5 SFLFQLLK KinobeadDP CDK7 APELLFGAR KinobeadDP CDK7 VPFLPGDSDLDQLTR KinobeadDP CDK9 GSQITQQSTNQSR KinobeadDP CDK9 IGQGTFGEVFK KinobeadDP CKle HPQLLYESK KinobeadDP CKla LFLIDFGLAK KinobeadDP CKld FDDKPDYSYLR KinobeadDP CKld GNLVYIIDFGLAK KinobeadDP CKld TVLLLADQMISR 89 (continuação)

EXPERIÊNCIA NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO KinobeadDP CKle FDDKPDYSYLR KinobeadDP CKle GNLVYIIDFGLAK KinobeadDP CKle TVLLLADQMISR KinobeadDP CKlgl TLFTDLFEK KinobeadDP CK2al GGPNIITLADIVKDPVSR KinobeadDP CK2al QLYQTLTDYDIR KinobeadDP CK2al TPALVFEHVNNTDFK KinobeadDP CK2a2 HLVSPEALDLLDKLLR KinobeadDP CK2a2 LIDWGLAEFYHPAQEYNVR KinobeadDP CK2a2 QLYQILTDFDIR KinobeadDP CK2a2 TPALVFEYINNTDFK KinobeadDP CK2a2 VLGTEELYGYLK KinobeadDP CSK HSNLVQLLGVIVEEK KinobeadDP CSK LLYPPETGLFLVR KinobeadDP CSK VMEGTVAAQDEFYR KinobeadDP DDR1 AQPFGQLTDEQVIENAGEFFR KinobeadDP DDR1 NCLVGENFTIK KinobeadDP DDR1 NLYAGDYYR KinobeadDP DDR1 QVYLSRPPACPQGLYELMLR KinobeadDP DDR1 WMAWECILMGK KinobeadDP DDR1 YLATLNFVHR KinobeadDP DDR2 DVAVEEFPR KinobeadDP DDR2 FMATQIASGMK KinobeadDP DDR2 HEPPNSSSSDVR KinobeadDP DDR2 IFPLRPDYQEPSR 90 (continuação)

EXPERIÊNCIA NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO KinobeadDP DDR2 NLYSGDYYR KinobeadDP DDR2 QTYLPQPAICPDSVYK KinobeadDP DDR2 WMSWESILLGK KinobeadDP DDR2 YLSSLNFVHR KinobeadDP DNAPK AALSALESFLK KinobeadDP DNAPK DQNILLGTTYR KinobeadDP DNAPK FMNAVFFLLPK KinobeadDP DNAPK FVPLLPGNR KinobeadDP DNAPK GLSSLLCNFTK KinobeadDP DNAPK HGDLPDIQIK KinobeadDP DNAPK INQVFHGSCITEGNELTK KinobeadDP DNAPK IPALDLLIK KinobeadDP DNAPK LACDVDQVTR KinobeadDP DNAPK LAGANPAVITCDELLLGHEK KinobeadDP DNAPK LGASLAFNNIYR KinobeadDP DNAPK LGNPIVPLNIR KinobeadDP DNAPK LLEEALLR KinobeadDP DNAPK LNESTFDTQITK KinobeadDP DNAPK LPLISGFYK KinobeadDP DNAPK LPSNTLDR KinobeadDP DNAPK LQETLSAADR KinobeadDP DNAPK MSTSPEAFLALR KinobeadDP DNAPK NILEESLCELVAK KinobeadDP DNAPK NLLIFENLIDLK KinobeadDP DNAPK NLSSNEAISLEEIR 91 (continuação)

EXPERIÊNCIA NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO KinobeadDP DNAPK QITQSALLAEAR KinobeadDP DNAPK QLFSSLFSGILK KinobeadDP DNAPK SLGPPQGEEDSVPR KinobeadDP DNAPK SQGCSEQVLTVLK KinobeadDP DNAPK TVGALQVLGTEAQSSLLK KinobeadDP DNAPK TVSLLDENNVSSYLSK KinobeadDP DNAPK VCLDIIYK KinobeadDP DNAPK VTELALTASDR KinobeadDP DNAPK VVQMLGSLGGQINK KinobeadDP EGFR GDSFTHTPPLDPQELDILK KinobeadDP EphA2 DGEFSVLQLVGMLR KinobeadDP EphA2 FADIVSILDK KinobeadDP EphA2 LPSTSGSEGVPFR KinobeadDP EphA2 NILVNSNLVCK KinobeadDP EphA2 VSDFGLSR KinobeadDP EphA5 WTAPEAIAFR KinobeadDP EphA5 VSDFGLSR KinobeadDP EphB2 AGAIYVFQVR KinobeadDP EphB2 FGQIVNTLDK KinobeadDP EphB2 TFPNWMENPWVK KinobeadDP EphB2 VDTIAADESFSQVDLGGR KinobeadDP EphB2 NILVNSNLVCK KinobeadDP EphB2 VSDFGLSR KinobeadDP EphB4 APSGAVLDYEVK KinobeadDP EphB4 FPQVVSALDK 92 (continuação)

EXPERIÊNCIA NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO KinobeadDP EphB4 LNDGQFTVIQLVGMLR KinobeadDP EphB4 WTAPEAIAFR KinobeadDP EphB4 NILVNSNLVCK KinobeadDP EphB4 VSDFGLSR KinobeadDP Erkl NYLQSLPSK KinobeadDP Erk 1 APEIMLNSK KinobeadDP Erk 1 YIHSANVLHR KinobeadDP Erk 1 ICDFGLAR KinobeadDP Erk2 FRHENIIGINDIIR KinobeadDP Erk2 GQVFDVGPR KinobeadDP Erk2 LKELIFEETAR KinobeadDP Erk2 NYLLSLPHK KinobeadDP Erk2 VADPDHDHTGFLTEYVATR KinobeadDP Erk2 APEIMLNSK KinobeadDP Erk2 YIHSANVLHR KinobeadDP Erk2 ICDFGLAR KinobeadDP FAK FFEILSPVYR KinobeadDP FAK FLQEALTMR KinobeadDP FAK LLNSDLGELINK KinobeadDP FAK TLLATVDETIPLLPASTHR KinobeadDP FAK LGDFGLSR KinobeadDP FER LQDWELR KinobeadDP FER QEDGGVYSSSGLK KinobeadDP FER SGVVLLNPIPK KinobeadDP FER WTAPEALNYGR 93 (continuação)

EXPERIÊNCIA NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO KinobeadDP FR AP GPTPAILESLISINNK KinobeadDP FR AP VLGLLGALDPYK KinobeadDP FYN EVLEQVER KinobeadDP FYN WTAPEAALYGR KinobeadDP FYN LIEDNEYTAR KinobeadDP FYN GSLLDFLK KinobeadDP FYN IADFGLAR KinobeadDP GAK ALVEEEITR KinobeadDP GAK AMLQVNPEER KinobeadDP GAK AVVMTPVPLFSK KinobeadDP GAK IA VMS F P AE G VE S AL K KinobeadDP GAK TPEIIDLYSNFPIGEK KinobeadDP GSK3A VIGNGSFGVVYQAR KinobeadDP GSK3A VTTVVATLGQGPER KinobeadDP GSK3A YFFYSSGEK KinobeadDP GSK3B LLEYTPTAR KinobeadDP GSK3B LYMYQLFR KinobeadDP GSK3B VIGNGSFGVVYQAR KinobeadDP GSK3B YFFYSSGEK KinobeadDP IGF IR AENGPGPGVLVLR KinobeadDP IGF IR HSHALVSLSFLK KinobeadDP IGF IR MYFAFNPK KinobeadDP IGF IR TTINNEYNYR KinobeadDP IF1R VAGLESLGDLFPNLTVIR KinobeadDP IGF IR DlYETDYYR 94 (continuação)

EXPERIÊNCIA NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO KinobeadDP IGF IR IEFLNEASVMK KinobeadDP IGF IR IGDFGMTR KinobeadDP ILK MYAPAWVAPEALQK KinobeadDP INSR DLLGFMLFYK KinobeadDP INSR E L GQG S F GMVYEGNAR KinobeadDP INSR ESLVISGLR KinobeadDP INSR TIDSVTSAQELR KinobeadDP INSR TVNESASLR KinobeadDP INSR WEPYWPPDFR KinobeadDP INSR DlYETDYYR KinobeadDP INSR IEFLNEASVMK KinobeadDP INSR WMAPESLK KinobeadDP INSR IGDFGMTR KinobeadDP JNK1 NIIGLLNVFTPQK KinobeadDP JNK1 APEVILGMGYK KinobeadDP J-NK1 ILDFGLAR KinobeadDP JNK2 NI ISLLNVFTPQK KinobeadDP JNK2 APEVILGMGYK KinobeadDP JNK2 ILDFGLAR KinobeadDP JNK3 NI ISLLNVFTPQK KinobeadDP JNK3 APEVILGMGYK KinobeadDP JNK3 ILDFGLAR KinobeadDP LYN EEPIYIITEYMAK KinobeadDP LYN GSLLDFLK KinobeadDP LYN IADFGLAR 95 (continuação)

EXPERIÊNCIA NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO KinobeadDP MAP2K2 ISELGAGNGGVVTK KinobeadDP MAP2K2 YPIPPPDAK KinobeadDP MET AFFMLDGILSK KinobeadDP MET DLIGFGLQVAK KinobeadDP MLK3 ITVQASPGLDR KinobeadDP NEK9 AGGGAAEQEELHYIPIR KinobeadDP NEK9 LGINLLGGPLGGK KinobeadDP NEK9 LQQENLQIFTQLQK KinobeadDP NEK9 SSTVTEAPIAVVTSR KinobeadDP NEK9 T SEVYVWGGGK KinobeadDP p3 8a LTGTPPAYLINR KinobeadDP p38a NYIQSLTQMPK KinobeadDP p3 8a SLEEFNDVYLVTHLMGADLNNIVK KinobeadDP p3 8a LTDDHVQFLIYQILR KinobeadDP p3 8a ILDFGLAR KinobeadDP PAK4 AALQLVVDPGDPR KinobeadDP PHKg2 LTAEQALQHPFFER KinobeadDP PHKg2 SLLEAVSFLHANNIVHR KinobeadDP PHKg2 VAVWTVLAAGR KinobeadDP PHKg2 LSPEQLEEVR KinobeadDP PYK2 EIITSILLSGR KinobeadDP PYK2 EVGLDLFFPK KinobeadDP PYK2 VLANLAHPPAE KinobeadDP PYK2 LGDFGLSR KinobeadDP RIPK2 CLIELEPVLR 96 (continuação)

EXPERIÊNCIA NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO KinobeadDP RIPK2 SLPAPQDNDFLSR KinobeadDP RIPK2 SPSLNLLQNK KinobeadDP RIPK2 TQNILLDNEFHVK KinobeadDP RSK2 EASAVLFTITK KinobeadDP RSK2 LGMPQFLSPEAQSLLR KinobeadDP RSK2 NQSPVLEPVGR KinobeadDP RSK2 LYLILDFLR KinobeadDP RSK3 APQAPLHSVVQQLHGK KinobeadDP RSK3 EASFVLHTIGK KinobeadDP RSK3 LGMPQFLSTEAQSLLR KinobeadDP RSK3 LYLILDFLR KinobeadDP SRC AANILVGENLVCK KinobeadDP SRC WTAPEAALYGR KinobeadDP SRC LIEDNEYTAR KinobeadDP SRC GSLLDFLK KinobeadDP TBK1 EPLNTIGLIYEK KinobeadDP TBK1 FGSLTMDGGLR KinobeadDP TBK1 IISSNQELIYEGR KinobeadDP TBK1 LFAIEEETTTR KinobeadDP TBK1 TTEENPIFVVSR KinobeadDP TBK1 VIGEDGQSVYK KinobeadDP TGFbRl HDSATDTIDIAPNHR KinobeadDP TGFbRl TIVLQESIGK KinobeadDP TGFbRl TLSQLSQQEGIK KinobeadDP TGFbRl VPNEEDPSLDRPFISEGTTLK 97 (continuação)

EXPERIÊNCIA NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO KinobeadDP TGFBR1 EAEIYQTVMLR KinobeadDP TNK1 MLPEAGSLWLLK KinobeadDP TYK2 LGLAEGTSPFIK KinobeadDP Weel B IPQVLSQEFTELLK KinobeadDP Weel B ISSPQVEEGDSR KinobeadDP YES LLLNPGNQR KinobeadDP YES L P Q LVDMAAQIADGMAYIER KinobeadDP YES SDVWSFGILQTELVTK KinobeadDP YES AANILVGENLVCK KinobeadDP YES EVLEQVER KinobeadDP YES FQIINNTEGDWWEAR KinobeadDP YES WTAPEAALYGR KinobeadDP YES LIEDNEYTAR KinobeadDP YES GSLLDFLK KinobeadDP YES IADFGLAR KinobeadDP ZAK CEIEATLER KinobeadDP ZAK GLEGLQVAWLVVEK KinobeadDP ZAK LTIPSSCPR KinobeadDP ZAK NVVIAADGVLK

Exemplo 3: Ensaio de rastreio utilizando compostos de teste para eluição de proteína

Este exemplo ilustra a eluição competitiva de proteínas ligadas a kinobeads com compostos de teste não modificados (ver, 98 de um modo particular, o quarto aspecto da invenção). As kinobeads (como descrito no exemplo 1) foram colocadas em contacto com lisado de cérebros de murganho, as proteínas ligadas foram eluídas com diversos compostos de teste e as proteínas libertadas foram analisadas por espectrometria de massa. 1. Preparação da amostra biológica (lisado tecidular) 1.1 Preparação de lisados

Um lisado de cérebro de murganho foi preparado por dissociação mecânica em tampão de lise (5 mL de tampão por cérebro de murganho), sob condições suaves que mantêm a estrutura e função das proteínas. Foram realizadas as seguintes passos: • Descongelar o tecido rapidamente, à temperatura ambiente, ou 37 °C, depois, transferir o tecido para um frasco de vidro contendo o tampão de lise lx (utilizar um frasquinho suficientemente grande para ser utilizado com o homogeneizador Polytron PT 3100) • Lisar o órgão/tecido com pulsos de 4x 10 s, a 5000-7000 rpm, a 4 °C, na câmara frigorífica • Transferir o homogeneizado para tubos falcon de 50 mL pré- arrefecidos • Incubar o homogeneizado sobre gelo, durante 30 min

• Centrifugar as células, durante 10 min, a 6000 g, a 4 °C (6000 rpm em Sorvall SLA600, pré-arrefecido) 99

• Transferir o sobrenadante para um tubo de policarbonato UZ (Beckmann, 355654)

• Centrifugar o sobrenadante, durante 1 h, a 145000 g, a 4 °C (40000 rpm em TÍ50.2, pré-arrefecido) • Guardar o sobrenadante (se possível, remover e descartar a maior parte da camada lipídica), transferir o sobrenadante para um frasco de vidro e armazenar sobre gelo • Determinar a concentração de proteína pelo ensaio de

Bradford (BioRad). As concentrações típicas de proteína são na gama de 5-10 mg/mL.

• Preparar alíquotas em tubos Falcon de 1 a 50 mL • Congelar as alíquotas em azoto líquido e armazená-las a - 80 °C. 1.2 Preparação de tampão de lise e solução stock

Preparação de 100 mL de tampão de lise lx com NP40 a 0,8%

Combinar as seguintes soluções ou reagentes e adicionar água destilada para um volume final de 100 mL: 20 mL de tampão de lise 5x (ver abaixo) , 100 pL de DTT a 1 M, 5 mL de NaF a 0,5 M, 4 mL de NP40 a 20%, 4 comprimidos completos isentos de EDTA (cocktail de inibidor de protease, Roche Diagnostics, 1 873 580), adicionar água destilada para 100 mL. 100

Tabela 10: Preparação de tampão de lise 5x

Substância: Solução Cone. final em tampão Adicionar para tampão stock de lise 1 X de lise 115 x Tris/HCl, pH 7,5 1 M 50 mM 250 mL Glicerol 87% 5% 288 mL MgCl2 1 M 1,5 mM 7,5 mL NaCl 5 M 150 mM 150 mL Na3V04 100 mM 1 mM 50 mL

Estas soluções foram obtidas dos seguintes fornecedores:

Tris/HCl a 1 M, pH 7,5: Sigma, T-2663; Glicerol a 87%: Merck, n° cat. 04091.2500; MgCl2 a 1 M: Sigma, M-1028; NaCl a 5 M: Sigma, S-5150. O tampão de lise concentrado 5x foi filtrado através de um filtro de 0,22 pm e armazenado em aliquotas de 40 mL a -80 °C.

Preparação de soluções stock

Preparação de solução stock de Na3V04 a 100 mM:

Dissolver 9,2 g de NasVCg em 400 mL de água destilada.

1) Ajustar o pH para 10,0 utilizando NaOH a 1 N ou HC1 a 1 N. O pH de partida da solução de ortovanadato de sódio pode variar com o lote. A pH 10,0, a solução será amarela. 101 2) Ferver a solução até que fique incolor (aproximadamente 10 min) . 3) Arrefecer para a temperatura ambiente. 4) Reajustar o pH para 10,0 e repetir os passos 2 e 3 até que solução permaneça incolor e o pH estabilize a 10,0. 5) Ajustar o volume para 500 mL com água destilada. 6) Congelar as aliquotas a -20 °C. As aliquotas podem ser armazenadas durante vários meses.

Preparação de solução stock de NaF a 500 mM:

Dissolver 21,0 g de NaF (Sigma, S7920) em 500 mL de água destilada. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 pm e armazenar a 4 °C.

Preparaçao de solução de NP40 a 20%:

Pesar 40,0 g de NP40 (Sigma, Igepal-CA630, catálogo N° 13021). Adicionar água destilada até 200 g. Misturar completamente e armazenar a solução à temperatura ambiente.

Preparação de solução de DTT a 1 M:

Dissolver 7,7 g de DTT (Biomol, catálogo N° 04010) em 50 mL de água destilada. Filtrar a solução através de um filtro de 102 0,22 μιη e congelar alíquotas de 400 pL a -20 °C. As alíquotas podem ser armazenadas durante vários meses. 2. Colocação das kinobeads em contacto com o lisado celular e eluição de proteínas ligadas por compostos de teste

As kinobeads foram colocadas em contacto com lisado de cérebro de murganho, sob condições que permitem a ligação das proteínas no lisado aos ligandos. As condições de ligação eram próximas das fisiológicas, pela escolha de condições tampão adequadas preservando a função das proteínas. Após remoção de proteínas não capturadas através de um processo de lavagem suave, as proteínas ligadas foram colocadas em contacto com um composto de teste para eluição de proteína. 2.1 Preparação de tampões de DP Tabela 11: Preparação de tampão de DP 5x

Substância: Solução stock Cone. final em tampão de llse 1 x Adicionar para tampão de llse 115 x Tris/HCl, pH 7,5 1 M 50 mM 2 50 mL Glicerol 87% 5% 2 88 mL MgCl2 1 M 1,5 mM 7,5 mL NaCl 5 M 150 mM 150 mL Na3V04 10 0 mM 1 mM 50 mL 103 0 tampão de DP 5x é filtrado através de um filtro de 0,22 pm e armazenado em alíquotas de 40 mL a -80 °C. (Nota: O mesmo tampão também é utilizado para a preparação de lisados celulares totais). Estas soluções foram obtidas dos seguintes fornecedores: Tris/HCl a 1,0 M, pH 7,5 (Sigma, T-2663), Glicerol a 87% (Merck, catálogo número 04091.2500); MgCl2 a 1,0 M (Sigma, M-1028); NaCl a 5,0 M (Sigma, S-5150).

Foram preparados os seguintes tampões de DP lx • Tampão de DP lx (para equilibração de esferas) • Tampão de DP lx/NP40 a 0,4% (para equilibração de esferas e primeiro passo de lavagem de esferas) • Tampão de DP lx/NP40 a 0,2% (para a segundo passo de lavagem de esferas e para eluição de compostos) • Tampão de DP lx/inibidores de protease (para o primeiro passo de diluição de lisado); adicionar um comprimido de inibidor de protease por 25 mL de tampão de lise (comprimido isento de EDTA, cocktail de inibidor de protease, Roche Diagnostics, 1 873 580) • Tampão de DP lx/NP40 a 0,4%/inibidores de protease (para a segundo passo de diluição de lisado)

Exemplo para preparação de tampão de DP lx/NP40 a 0,4% (100 mL)

Combinar as seguintes soluções e reagentes e adicionar água destilada para um volume final de 100 mL: 20 mL de tampão de DP 5x, 5 mL de NaF a 0,5 M, 2 mL de NP40 a 20%, 100 pL de DTT a 1 M 104 e adicionar água destilada até 100 mL. Todos os tampões contêm concentração final de DTT a 1 mM. 2.2 Lavagem e eguilibração de Esferas

As kinobeads (Exemplo 1) foram preparadas para a reacção de ligação pela lavagem com um tampão adequado e equilibração no tampão. 1. Utilizar tubos Falcon de 15 mL para todas os passos de lavagem. 2. Utilizar 100 pL de KinoBeads por experiência (volume de esfera assentado) : misturar quantidades iguais (25 pL) de cada tipo de esfera ligada com os seguintes 4 ligandos (densidade de ligação de 1 pmol/mL):

Bis VIII (CZC00001056), Purvalanol B (CZC00007097) , derivado de PD173955 (CZC00007324) e CZC00008004. 3. Lavar as esferas duas vezes com 3 mL de tampão de DP lx e uma vez com 3 mL de tampão de DP lx/NP40 a 0,4%. Durante cado passo de lavagem inverter os tubos 3-5 vezes, centrifugar 2 minutos, a 1200 rpm, a 4 °C, numa centrífuga Heraeus. Os sobrenadantes são sobrenadantes aspirados e descartados.

Após o último passo de lavagem preparar uma pasta 1:1 (volume/volume) com tampão de DP lx/NP40 a 0,4%. 105 2.3 Preparação de lisado celular diluído 0 lisado de cérebro de murganho foi preparado para a reacção de ligação por diluição num tampão adequado e clarificação através de um passo de centrifugação. 1. Utilizar um volume de lisado celular correspondendo a 50 mg de proteína por experiência. 2. Descongelar o lisado rapidamente em banho-maria, a 37 °C, depois, manter a amostra sobre gelo. 3. Diluir o lisado no seguinte modo: 3) diluir o lisado com tampão de DP lx/inibidores de protease, para reduzir a concentração de detergente de NP-40 de 0,8% para 0,4%. 4) fazer uma diluição adicional do lisado com tampão de DP lx/NP40 a 0,4%/inibidores de protease, para se atingir uma concentração de proteína final de 5 mg/mL. (Nota: A segundo passo de diluição é apenas requerida se a concentração de proteína do lisado após o primeiro passo de diluição for superior a 5 mg/mL). 4. Transferir o lisado diluído para um tubo de policarbonato UZ (Beckmann, 355654). 5. Clarificar o lisado diluído através de ultracentrifugação (20 min, 4 °C, 100000 g, rotor TI50.2, ultracentrifuga pré- arrefecida). 106 6. Guardar o sobrenadante e mantê-lo sobre gelo. 2.4 Reacção de ligação e lavagem

As esferas lavadas e equilibradas (secção 2.2) foram colocadas em contacto com o lisado celular diluido (secção 2.3), de modo a permitir a ligação de proteínas aos ligandos. As proteínas ligadas de um modo não específico foram removidas por lavagem suave, de modo a reduzir a ligação de fundo. 1. Combinar o lisado clarificado diluído com 100 pL de KinoBeads lavadas em tubos Falcon de 15 mL ou 50 mL. 2. Incubar, durante 2 horas, a 4 °C, rotacionar em ROTO SHAKE GENIE (Scientific Industries, Inc.) na câmara frigorífica. 3. Após incubação, centrifugar, durante 3 minutos, a 1200 rpm, numa centrífuga Heraeus ou equivalente, a 4 °C. 4. Remover o sobrenadante cuidadosamente, sem perder as esferas. 5. Transferir as esferas para uma coluna Mobicol, com filtro de 90 pm (MoBiTec, Goettingen, N° cat.: M1002-90). 6. Lavar as esferas com 10 mL de tampão de DP lx/NP-40 a 0,4% e 5 mL do tampão de DP lx/NP-40 a 0,2%. 7. Antes de prosseguir com o passo seguinte, deixar o tampão de lavagem correr através da coluna completamente 107 8. Colocar a coluna em tubo Eppendorf e centrifugar durante 1 minuto, a 800 rpm, a 4 °C.

Fechar as colunas com a tampa inferior. 2.5 Eluição de proteínas ligadas com compostos de teste

Foram utilizados diversos compostos de teste (ver a secção 2.7) para libertar proteínas ligadas, seguindo estos passos: 1. Ressuspender as esferas com proteínas ligadas (secção 2.4) em tampão de DP lx/NP-40 a 0,2%, como pasta 1:3 (volume/volume). 2. Transferir 20 pL da pasta 1:3 para colunas MoBiTech (equivalente a 5 pL de esferas). 3. Colocar a coluna num tubo Eppendorf e centrifugá-la durante 15 segundos, a 800 rpm, a 4 °C. Tapar as colunas com a tampa inferior. 4. Adicionar 10 pL de tampão de eluição contendo 1,0 mM do composto de teste (as gamas de concentração de 0,1 a 1,0 mM são adequadas). Como um controlo, utilizar tampão de eluição contendo DMSO a 2% ou DMF a 2%, dependente do solvente utilizado para dissolução do composto de teste.

Fechar a coluna com a tampa superior. 5. Incubar durante 30 minutos, a 4 °C, numa incubadora Eppendorf a 700 rpm. 108 6. Abrir a coluna (primeiro, em cima, depois, em baixo), colocar a coluna de volta no tubo com silicone (SafeSeal Microcentrifuge Tubes, n° cat. 11270, Sorenson BioScience, Inc.) . Para recolher o eluato, centrifugar 2 minutos, a 2000 rpm, em centrífuga de mesa, à temperatura ambiente. O volume típico do eluato é, aproximadamente, 15 pL. 7. Adicionar 5 pL de Tampão de Amostra de NuPAGE SDS 4x (Invitrogen, NP0007), contendo DTT a 100 mM (o DTT tem que ser adicionado imediatamente antes da utilização). 8. Incubar durante 30 minutos, a 50 °C. 9. Adicionar 1/10 de volume de iodoacetamida a 200 mg/mL, incubar durante 30 min, à temperatura ambiente, proteger da luz. Esta reacção conduz à alquilação de cisteínas para a espectrometria de massa. 10. Antes de carregar as amostras no gel, centrifugar as amostras, durante 5 minutos, a 15000 rpm, de modo a remover precipitados. 11. Para separação de proteína, aplicar 10 pL de amostra a gel de Bis-Tris a 4-12% NuPAGE (Invitrogen, NP0335). 2.6 Preparação de soluções stock utilizadas neste protocolo

Preparação de uma solução stock de Na3V04 a 100 mM 1) Dissolver 9,2 g de Na3V04 em 400 mL de água destilada. 109 2) Ajustar o pH para 10,0 utilizando NaOH a 1 N ou HC1 a 1 N. O pH de partida da solução de ortovanadato de sódio pode variar com o lote. A pH 10,0, a solução será amarela. 3) Ferver a solução até que fique incolor (aproximadamente 10 min). 4) Arrefecer para a temperatura ambiente. 5) Reajustar o pH para 10,0 e repetir os passos 2 e 3 até que solução permaneça incolor e o pH estabilize a 10,0. 6) Ajustar o volume para 500 mL com água destilada. 7) Congelar as aliquotas a -20 °C. As alíquotas podem ser armazenadas durante vários meses.

Preparaçao de uma solução stock de NaF a 500 mM

Dissolver 21,0 g de NaF (Sigma, S7920) em 500 mL de água destilada. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 ym e armazenar a 4 °C.

Preparaçao de uma solução de NP40 a 20%

Pesar 40,0 g de NP40 (Sigma, Igepal-CA630, n° cat. 13021). Adicionar água destilada até 200 g. Misturar completamente e armazenar a solução à temperatura ambiente. 110

Preparaçao de uma solução de DTT a 1 M

Dissolver 7, 7 g de DTT (Biomol, número de catálogo 04010) em 50 mL de água destilada. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 pm e congelar aliquotas de 400 pL a -20 °C. As aliquotas podem ser armazenadas durante vários meses.

Preparação de uma solução stock de Iodoacetamida (200 mg/mL)

Dissolver 2, 0 g de Iodoacetamida (Sigma, 1-6125) em 10 mL de água destilada. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 pm e congelar aliquotas de 400 pL a -20 °C. As aliquotas podem ser armazenadas durante vários meses. 2.7 Compostos de teste para eluição

Os compostos de teste listados abaixo foram utilizados para experiências de eluição após diluição, como descrito abaixo.

Preparação de stocks de composto de teste:

Tipicamente, todos os compostos são dissolvidos em DMSO a 100% (Fluka, n° cat. 41647), a uma concentração de 100 mM. Alternativamente, pode ser utilizado DMF a 100% (Fluka, n° cat. 40228) para os compostos que não podem ser dissolvidos em DMSO. Os compostos são armazenados a - 20 °C. 111

Diluição de composto de teste para experiências de eluição;

Preparar stock a 50 mM, pela diluição do stock a 100 mM 1:1 com DMSO a 100%. Para experiências de eluição diluir, ainda, o composto 1:50 com tampão de eluição (= tampão de DP 1 x/NP40 a 0,2%) . CZC1038: Bisindolilmaleimido III (Fornecedor: Alexis

Biochemicals; catálogo número 270-051-M005; Fórmula Química C23H20N4O2; PM 3 8 4, 4). CZC7097: Purvalanol B (Fornecedor: Tocris Biochemicals, catálogo número 1581; composição química C20H25CIN6O3; PM 441,92; CAS número 212844-54-7). CZC00007324 (derivado de PD173955; a síntese é descrita no Exemplo 1. CZC00008004: Este é um análogo de CZC00004919 (a síntese é descrita no Exemplo 1). CZC00007098: SB202190 (Fornecedor: TOCRIS 1264 1A/46297; fórmula química C20H14N3OF; PM 331,34). CZC00009280: Estaurosporina (Fornecedor: SIGMA-ALDRICH: S4400; inibidor de cinase de larga gama; fórmula química C28H26N4O3; PM 466,53). CZC00007449: SP600125 (Fornecedor: Merck Biosciences N° 420119, inibidor de JNK1/2; fórmula química C14H8N2O; PM 220,2). 112 3. Análise de espectrometria de massa de enzimas eluidas (e. g., cinases)

Descrição de péptidos proteotipicos A digestão tríptica de uma mistura de proteína separada por SDS-PAGE gera, para cada proteína, numerosos fragmentos peptídicos distintos com diferentes propriedades físico-químicas. Estes péptidos diferem em compatibilidade com a plataforma analítica de espectrometria de massa utilizada para identificação de proteína (ID), aqui, espectrometria de massa em tandem de ionização de electrosspray de cromatografia de fase líquida reversa nanocapilar (RP-LC-MS/MS). Como resultado, as frequências peptídicas para péptidos da mesma proteína fonte diferem em elevado grau, os péptidos mais frequentemente observados que "tipicamente" contribuem para a identificação desta proteína sendo designados péptidos "proteotipicos". Deste modo, um "péptido proteotípico", é um péptido experimentalmente bem observável que identifica, de um modo único, uma proteína ou isoforma de proteína específica.

Vantagens dos péptidos proteotipicos A utilização de péptidos proteotipicos para a identificação de proteína permite a rápida e focada identificação e quantificação de múltiplas proteínas alvo conhecidas, pela concentração do processo de identificação de proteína num rastreio para a presença de péptidos de assinatura ricos em informação. 113

Identificação experimental de péptidos proteotipicos

Uma estratégia para produzir uma lista de péptidos proteotipicos é recolher dados de identificação de péptidos empiricamente e pesquisar o conjunto de dados para péptidos geralmente observados que identificam, de um modo único, uma proteína.

Para cada registo de proteína de base de dados de IPI com, pelo menos, 10 identificações inequívocas no conjunto de dados de CZ (ID de multipéptido ou ID de péptido simples manualmente verificado), são calculadas as frequências peptídicas para péptidos contribuintes. São apenas consideradas as melhores correspondências de péptido-para-espectro específicas, de acordo com o motor de pesquisa de base de dados Mascot™ (matriz Science) .

Para definição dos péptidos proteotipicos para uma proteína específica, os péptidos são ordenados por frequência peptidica descendente e uma presença peptidica cumulativa é calculada: Este valor proporciona, para cada péptido, a razão de identificação onde este péptido ou qualquer dos péptidos com uma frequência peptidica superior estava presente. Os péptidos proteotipicos são definidos utilizando uma exclusão para presença cumulativa de 95%, i. e., pelo menos, 95% de eventos de identificação para esta proteína foram baseados em, pelo menos, um péptido proteotípico. 114 3.1 Digestão de proteína e preparação de amostra antes da análise de espectrometria de massa

As proteínas foram concentradas, separadas em géis Novex a 4-12% de NuPAGE® (Invitrogen, Carlsbad, CA) e coradas com azul de Coomassie coloidal. As pistas de gel foram sistematicamente cortadas através de toda a gama de separações em < 48 cortes (bandas e regiões interbanda) e submetidas a digestão tríptica no gel, essencialmente como descrito por Shevchenko et al., 1996, Analytical Chemistry 68: 850-858. Resumidamente, os blocos de gel foram descorados, de um dia para o outro, em NH4HCO3 a 5 mM em EtOH a 50%, digeridos durante 4 horas com tripsina a 12,5 ng/pL em NH4HCO3 a 5 mM. Os péptidos foram extraídos com ácido fórmico a 1%, transferidos para uma segunda placa de 96 poços e secos sob vácuo. Os péptidos secos foram ressuspensos em 10 pL do ácido fórmico a 0,1% em água e 5 pL foram injectados no sistema de LC-MS/MS para identificação de proteína. 3.2 Aquisição de dados de espectrometria de massa

As amostras peptídicas foram injectadas num sistema nano LC (CapLC, Waters ou Ultimate, Dionex) que estava directamente ligado a um espectrómetro de massa de tempo-de-voo quadrupolar (QTOF2, QTOF Ultima, QTOF Micro, Micromass ou QSTAR Pulsar, Sciex) ou barreira iónica (LCQ Deca XP, LTQ, Thermo-Finnigan). Os péptidos foram separados no sistema de LC, utilizando um gradiente de solventes aquosos e orgânicos, com um tempo de gradiente típico compreendido entre 15 e 45 min. 0 solvente A foi acetonitrilo a 5% em ácido fórmico a 0,1% e o solvente B foi acetonitrilo a 70% em ácido fórmico a 0,1%. 115 3.3 Identificação de proteína

Os dados de massa e fragmentação peptídicos produzidos nas experiências de LC-MS/MS foram utilizados para pesquisar uma versão desenvolvida internamente do índice de Proteína Internacional (IPI) da base de dados de sequências de proteínas (EBI) . As proteínas foram identificadas pela correlação da massa peptídica medida e os dados de fragmentação com os mesmos dados computados a partir dos registos na base de dados, utilizando a ferramenta de software Mascot (Matrix Science; Perkins et al., 1999, Electrophoresis 20: 3551-3567). Os critérios de pesquisa variaram, dependendo de que espectrómetro de massa foi utilizado para a análise. 4. Resultados O método permite estabelecer um perfil da cinase eluída para qualquer dado composto de teste permitindo, desse modo, avaliar a selectividade do composto de teste. Uma limitação é que apenas as cinases capturadas nas kinobeads durante o primeiro passo podem ser avaliadas, o que poderá representar uma subfracção de todas as cinases contidas no lisado celular. 116

Tabela 12: Cinases libertadas identificadas por análise de espectrometria de massa, após eluição específica com compostos de teste (os números representam pontuação de espectrometria de massa/número de péptidos identificados). Os nomes de cinase são de acordo com a nomenclatura de cinases humanas (http://kinase.com) e Manning et al., 2002, Science 298, 1912-1934, como especificado em material suplementar). Os primeiros quatro compostos na tabela 12 são as versões não imobilizadas dos ligandos 1-4 de kinobead.

Cinase EMSO a 2% CZC1038 CZC7097 CZC7324 CZC8004 CZC1355 CZC7098 CZC7479 CZC9280 SDS AAK1 130/5 562/38 1036/51 582/35 718/35 638/27 198/4 593/32 777/44 240/32 ALK2 65/2 AMPKal 64/2 ARG 59/2 452/28 BRAE^S 70/4 CaMK2a 911/53 978/27 513/11 966/43 288/9 509/11 1027/69 786/74 CaMK2b 834/52 679/16 499/14 685/30 572/19 143/5 1182/72 615/75 CaMK2d 702/17 473/12 328/7 444/11 260/8 822/40 434/36 CaMK2g 550/18 527/27 809/25 379/42 CaMKK2 314/6 465/9 101/3 522/12 93/2 282/10 338/10 CDK5 303/7 831/19 1086/41 462/11 794/27 856/28 166/4 504/11 861/43 604/21 CDKL5 48/1 CKle CRIK 90/5 CSK 492/12 809/19 307/8 365/15 EphA4 1702/37 1233/32 138/3 332/11 727/33 EphAS 330/14 144/3 246/9 EphA7 EphBl 366/10 180/10 EphB2 1334/30 1004/22 149/5 114/4 437/19 Erklps5 418/14 749/48 557/77 386/26 270/13 71/2 239/8 117 (continuação)

Cinase EMSO a 2% CZC1038 CZC7097 CZC7324 CZC8004 CZC1355 CZC7098 CZC7479 CZC9280 SDS Erk2 751/25 754/50 1437/115 1179/235 810/46 1036/82 506/20 641/24 955/50 1023/102 FAK 269/6 322/10 257/8 379/19 160/6 FER 237/6 322/8 388/11 100/2 818/21 275/11 FYN 268/6 279/6 314/6 407/17 GAK 278/7 733/16 90/3 255/6 166/8 GSK3Aps 166/6 1232/60 357/6 154/3 635/27 393/21 406/8 132/4 868/47 585/77 GSK3B 1176/54 1037/30 789/19 881/26 536/14 743/34 345/8 824/59 763/72 JNK1 311/10 448/17 590/48 559/18 540/19 678/28 457/16 389/47 JNK2 287/11 277/7 702/21 662/18 405/12 170/5 429/30 369/20 JNK3 284/7 782/49 642/23 620/37 542/30 578/39 363/10 447/27 LIMKlps 186/4 LYN 134/6 MAP2K1 208/6 78/2 74/2 49/2 90/4 MARK2 49/1 NEK9 61/2 p38a 127/6 295/10 104/7 p38b 60/1 80/2 95/3 PAK5 64/1 PKCa 64/1 PKCg 107/2 53/1 PYK2 159/4 291/7 1909/48 1401/42 1228/58 88/2 422/10 1978/82 809/39 QSK 153/7 RSK1 292/7 1177/32 626/19 312/9 435/11 1634/47 825/45 RSK3 401/11 312/12 721/21 107/6 SRC 544/13 351/9 546/13 419/25 TBK1 48/1 TRKB 207/4 165/4 TRKC YESps 304/7 110/3 480/12 236/13 118

Tabela 13: Cinases libertadas identificadas por análise de espectrometria de massa, após eluição especifica com compostos de teste (pontuação de espectrometria de massa/número de péptidos identificados). Os compostos de teste são seleccionados de uma biblioteca de moléculas pequenas orgânicas (compostos de estrutura de cinase) . Os nomes de cinase são de acordo com a nomenclatura de cinases humanas (http://kinase.com) e Manning et al., 2002, Science 298, 1912-1934, como especificado em material suplementar).

Cinase CZC9413 CZC9414 CZC9459 CZC9482 CZC9493 CZC9494 CZC9489 CZC9488 CZC9484 CZC9490 AAK1 1110/54 1138/69 1288/69 1459175 823/35 777/44 989/48 1032/57 663/36 352/16 ALK2 85/2 80/2 100/2 49/1 106/3 AMPKal ARG BRAFps 96/4 78/2 CaMK2a 909/33 357/8 1294/57 417/25 1023/49 1002/32 1430/69 1307/78 1187/83 71/2 CaMK2b 1128/71 151/5 1315/99 626/18 1077177 806/21 939/67 1251/72 969/65 CaMK2d 736/21 760/42 414/10 752/24 376/9 712/39 720/35 716/24 CaMK2g 970/25 812/32 709/27 741/17 929/26 620/26 CaMKK2 242/8 178/4 287/10 225/7 140/4 187/6 237/6 CDK5 677/33 513/12 525/14 773/20 906/44 580/13 838/38 907/24 951/30 204/5 CDKL5 CKle 80/2 CRIK 50/1 CSK 73/2 66/2 121/2 73/2 EphA4 123/4 EphA5 EphA7 88/2 EphBl EphB2 74/2 247/7 Erklps5 121/4 144/5 282/8 469/15 176/5 333/10 89/3 597/19 513/14 Erk2 913/36 852/37 837/51 676/40 837/44 822/24 896/30 994/51 759/28 119 (continuação)

Cinase CZC9413 CZC9414 CZC9459 CZC9482 CZC9493 CZC9494 CZC9489 CZC9488 CZC9484 CZC9490 EAK 302/8 81/2 193/6 153/6 FER 118/3 154/6 344/9 149/4 FYN 53/1 GRK 234/6 663/20 388/10 63/1 187/5 732/21 161/4 530/14 201/6 GSK3Aps 586/18 891/23 335/7 230/5 201/5 630/14 745/15 1030/55 78/2 GSK3B 663/32 471/23 294/14 143/5 282/8 257/7 343/8 567/29 908/60 JNK1 595/36 553/17 964/34 703/23 JNK2 394/23 469/15 84/3 523/17 562/30 494/33 JNK3 371/10 555/33 610/30 662/44 346/10 164/5 635/37 968/45 789/47 LIMKlps 46/1 LYN MAP2K1 95/4 253/8 93/3 234/8 152/5 105/4 481/12 338/10 48/1 MARK2 NEK9 122/3 46/1 p38a p38b ΕΑΚ5 PKCa PKCg 210/6 145/4 167/5 PYK2 133/3 292/7 430/12 833/21 219/6 47/1 1712/42 1769/51 703/17 51/1 QSK RSK1 445/11 100/3 193/4 207/4 511/12 466/14 1471/38 634/17 BSK3 272/8 94/2 211/5 354/11 437/14 301/10 SRC 135/3 TBK1 TRKB 139/4 111/3 TRKC 97/3 YESps 120

Exemplo 4: Comparação de ligandos co-imobilizados versus ligandos ligados separados 0 objectivo desta experiência foi o de avaliar se uma mistura de esferas contendo um tipo de ligando (ligandos ligados separadamente) produz resultados semelhantes em termos de cinases identificadas, em comparação com ligandos co-imobilizados (ligação simultânea). 0 resultado mostra que há uma vasta sobreposição de cinases identificadas em ambas as experiências, demonstrando que ambas as abordagens são exequíveis.

Dois ligandos foram ligados, individualmente ou simultaneamente, a esferas de Sepharose e, depois, utilizados para experiências de precipitação utilizando lisados de células HeLa (ligando 1: BisVIII; ligando 2: CZC00008004; detalhes como no Exemplo 1: Preparação de kinobeads). A ligação dos compostos individualmente foi realizada como detalhado no Exemplo 1. A ligação simultânea dos dois ligandos também foi realizada como no Exemplo 1, com a excepção de que os compostos foram ligados às mesmas esferas, a uma concentração de 0,5 ymol/mL, em vez das esferas a 1 pmol/mL padrão. O sucesso de ligação dos compostos imobilizados individualmente ou simultaneamente foi controlado por meio de análise de HPLC. As esferas foram lavadas e armazenadas, como descrito no exemplo 1. A preparação de lisados de células HeLa, lavagem de esferas, colocação das esferas em contacto com lisado, lavagem e análise de proteínas libertadas por espectrometria de massa foram realizadas como descrito no Exemplo 2 (Experiência de sinaloquinoma). 121

Tabela 14: Cinases identificadas por análise de espectrometria de massa. Comparação da experiência com dois ligandos ligados simultaneamente (parte esquerda) versus compostos ligados individualmente (esferas mistas; parte direita). Os nomes de cinase são de acordo com a nomenclatura de cinases humanas (http://kinase.com) e Manning et al., 2002, Science 298, 1912-1934, como especificado em material suplementar).

Ligação simultânea (Bis VIII e CZC8004 pré-misturado) Esferas misturadas pós—ligação (Bis VIII e CZC8004) Identificação Cinase Pontuação de MS Ntknero de péptidos tarrbém em pós-mistura Identificação Cinase Pontuação de MS Nunero de péptidos tanrtoém em pré— mistura 1 TBK1 1531 63 X 1 ΊΒΚ1 1365 57 X 2 GSK3B 932 52 X 2 NEK9 1113 36 X 3 AurA 895 40 X 3 TNK1 921 44 X 4 ΊΎΚ2 841 29 X 4 ΊΎΚ2 917 34 X 5 TNK1 771 46 X 5 AurA 910 46 X 6 CDK2 741 34 X 6 GSK3A 814 47 X 7 NEK9 736 22 X 7 CaMK2g 781 38 X 8 GSK3A 707 43 X 8 GSK3B 745 33 X 9 JNK2 654 24 X 9 JAKl 731 27 X 10 JNK1 548 23 X 10 CaMK2d 641 26 X 11 CaMK2g 494 24 X 11 AurB 631 28 X 12 CaMK2d 456 21 X 12 DNAPK 610 24 X 13 AAKl 450 17 X 13 JNK2 578 23 X 14 AurB 424 15 X 14 JNK1 499 21 X 15 JAKl 187 6 X 15 CDK2 485 19 X 16 CDK9 160 6 0 16 FER 423 17 X 17 YES 108 5 X 17 AAKl 368 17 X 18 FER 106 3 X 18 TEC 159 7 0 19 MPSK1 80 3 0 19 BIKE 124 4 0 20 DNAPK 72 4 X 20 YES 108 6 X 21 ULK3 64 1 0 21 ERAP 59 3 0 122

Tabela 15: Cinases e sequências de péptidos proteotípicos identificados na experiência de ligação simultânea

NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO AAKl APEMVNLYSGK AURKB IYLILEYAPR AURKB LPLAQVSAHPWVR AURKB SNVQPTAAPGQK CAMK2D DLKPENLLLASK CAMK2D FTDEYQLFEELGK CAMK2D GAILTTMLATR CAMK2D IPTGQEYAAK CAMK2G LTQYIDGQGRPR CDK2 ALFPGDSEIDQLFR CDK2 FMDASALTGIPLPLIK CDK9 IGQGTFGEVFK CDK9 LLVLDPAQR CDK9 NPATTNQTEFER GSK3A SQEVAYTDIK GSK3A VIGNGSFGVVYQAR GSK3A VTTVVATLGQGPER GSK3A YFFYSSGEK GSK3B DIKPQNLLLDPDTAVLK GSK3B LYMYQLFR GSK3B VIGNGSFGVVYQAR JAK1 LIMEFLPSGSLK JAK1 LSDPGIPITVLSR 123 (continuação)

NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO MAPK8 APEVILGMGYK MAPK9 ILDFGLAR MAPK9 NIISLLNVFTPQK MAPK9 VIEQLGTPSAEFMK NEK9 LGINLLGGPLGGK NEK9 LNPAVTCAGK NEK9 LQQENLQIFTQLQK NEK9 SSTVTEAPIAVVTSR NEK9 VLACGLNEFNK PRKDC INQVFHGSCITEGNELTK PRKDC NELEIPGQYDGR PRKDC QLFSSLFSGILK PRKDC YPEETLSLMTK STK16 APELFSVQSHCVIDER STK16 GTLWNEIER STK6 SKQPLPSAPENNPEEELASK STK6 VEFTFPDFVTEGAR TBK1 IASTLLLYQELMR TBK1 LFAIEEETTTR TBK1 TTEENPIFVVSR TBK1 VIGEDGQSVYK TNK1 AAALSGGLLSDPELQR TNKl VADFGLVRPLGGAR TYK2 LGLAEGTSPFIK TYK2 LSDPGVGLGALSR 124 (continuação)

NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO TYK2 MVVAQQLASALSYLENK TYK2 SLQLVMEYVPLGSLR TYK2 SQAPDGMQSLR ULK3 ASVENLLTEIEILK YES 1 AANILVGENLVCK YES 1 EVLEQVER

Tabela 16: Cinases e sequências de péptidos proteotípicos identificados na experiência de mistura (esferas mistas após ligação)

NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO AAK1 ADIWALGCLLYK AURKB HFTIDDFEIGRPLGK AURKB IYLILEYAPR AURKB LPLAQVSAHPWVR AURKB SNVQPTAAPGQK BMP2K ADIWALGCLLYK BMP2K ITDTIGPTETSIAPR CAMK2D AGAYDFPSPEWDTVTPEAK CAMK2D FTDEYQLFEELGK CAMK2D FYFENALSK CAMK2D GAILTTMLATR CAMK2G AGAYDFPSPEWDTVTPEAK CAMK2G DLKPENLLLASK 125 (continuação)

NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO CAMK2G FTDDYQLFEELGK CAMK2G LTQYIDGQGRPR CAMK2G NLINQMLTINPAK CDK2 ALFPGDSEIDQLFR CDK2 FMDASALTGIPLPLIK FER HSIAGIIR FER THAEDLNSGPLHR FRAP1 GPTPAILESLISINNK GSK3A SQEVAYTDIK GSK3A VIGNGSFGVVYQAR GSK3A VTTVVATLGQGPER GSK3A YFFYSSGEK GSK3B DIKPQNLLLDPDTAVLK GSK3B LLEYTPTAR GSK3B LYMYQLFR GSK3B VIGNGSFGVVYQAR GSK3B YFFYSSGEK JAK1 LIMEFLPSGSLK JAK1 LSDPGIPITVLSR MAPK8 APEVILGMGYK MAPK8 NIIGLLNVFTPQK MAPK9 APEVILGMGYK MAPK9 ILDFGLAR MAPK9 NIISLLNVFTPQK MAPK9 VIEQLGTPSAEFMK 126 (continuação)

NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO NEK9 AGGGAAEQEELHYIPIR NEK9 LNPAVTCAGK NEK9 LQQENLQIFTQLQK NEK9 SSTVTEAPIAVVTSR NEK9 VLACGLNEFNK PRKDC AALSALESFLK PRKDC DFGLLVFVR PRKDC DILPCLDGYLK PRKDC DLLLNTMSQEEK PRKDC DQNILLGTTYR PRKDC FMNAVFFLLPK PRKDC FVPLLPGNR PRKDC GLSSLLCNFTK PRKDC HSSLITPLQAVAQR PRKDC INQVFHGSCITEGNELTK PRKDC LAGANPAVITCDELLLGHEK PRKDC LATTILQHWK PRKDC LSDFNDITNMLLLK PRKDC LYSLALHPNAFK PRKDC NELEIPGQYDGR PRKDC QCLPSLDLSCK PRKDC SDPGLLTNTMDVFVK PRKDC SIGEYDVLR PRKDC SLGPPQGEEDSVPR PRKDC VTELALTASDR 127 (continuação)

NOME DE CINASE PÉPTIDO PROTEOTÍPICO STK6 QWALEDFEIGRPLGK STK6 SKQPLPSAPENNPEEELASK STK6 VEFTFPDFVTEGAR TBK1 IASTLLLYQELMR TBK1 LFAIEEETTTR TBK1 TTEENPIFVVSR TBK1 VIGEDGQSVYK TEC ELGSGLFGVVR TEC GQEYLILEK TEC HAFGSIPEIIEYHK TNK1 AAALSGGLLSDPELQR TNK1 ANLWDAPPAR TNK1 MLPEAGSLWLLK TNK1 VADFGLVRPLGGAR TYK2 AAALSFVSLVDGYFR TYK2 HGIPLEEVAK TYK2 LGLAEGTSPFIK TYK2 LSDPGVGLGALSR TYK2 MVVAQQLASALSYLENK TYK2 SLQLVMEYVPLGSLR TYK2 SQAPDGMQSLR YES1 EVLEQVER 128

Exemplo 5: Síntese de ligando 5 de kinobead (ligando 91 de indol) Síntese de ligando 91 de indol: ácido 5-[5-Fluoro-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrole-3-carboxílico (3-amino-propil)-amida

Passo 1: 5-Fluoro-l,3-di-hidro-indol-2-ona

Uma solução de 5-Fluoroisatina (1 g) em hidrato de Hidrazina (55%, 10 mL) foi aquecida a 110 °C, durante 30 minutos. Depois da suspensão ter entrado em solução, a reacção foi aquecida a 110 °C, durante 4 horas, depois, arrefecida a 0 °C. O precipitado foi filtrado e lavado com água. 0 sólido foi suspenso em água (10 mL) , o pH foi diminuído para pH 2 por adição de HC1 conc. e a solução agitada, à temperatura ambiente, durante 5 horas. O precipitado foi recolhido, o sólido lavado com água (2x15 mL) e seco na estufa a vácuo, a 40 °C (0,26 g, 30%). RMN de 1R (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,2 (s, 1H) ; 6,8- 7,0 (dd, 2H); 6,6 (m, 1H); 3,2 (s, 2H). LCMS: método D, TR = 1,736 min, [MH+ = 152].

Passo 2: Éster terc-butílico do ácido {3-[(5-Formil-2,4-dimetil-lH-pirrole-3-carbonil)-amino]-propil}-carbâmico A uma solução do ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirazol-3-carboxílico (0,300 g, 1,79 mmol), N-(3-Dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (0,516 g, 2,69 mmol), hidrato de 1-Hidroxibenzotriazole (0,364 g, 2,69 mmol), trietilamina (0,502 mL, 3,56 mmol) em dimetilformamida (3 mL) foi adicionado N-Boc-1,3-diaminopropano (0,375 mL, 2,15 mmol). A solução foi 129 agitada, à temperatura ambiente, durante 15 horas. Uma mistura de solução saturada de cloreto de sódio (1,5 mL), água (,5 mL) e bicarbonato de sódio aquoso saturado (1,5 mL) foi adicionada e o pH da solução ajustado para 12 por adição de hidróxido de sódio a 10 N. A solução foi extraída 3 vezes com uma mistura de diclorometano: Metanol (9:1). A camada orgânica foi seca com sulfato de magnésio anidro. O solvente foi removido e o resíduo purificado por cromatografia de flash (Hexano:Acetato de etilo para 100%)), para produzir o composto desejado como um sólido amarelo (0,30 g, 52%) . RMN de ΧΗ (400 MHz, DMSO-d<U δ 11,90 (s, 1H); 9,50 (s, 1H) ; 7,50 (m, 1H) ; 6,90 (m, 1H) ; 3,20 (q, 2H) ; 3.00 (q, 2H) ; 2,30 (s, 3H)); 2,20 (s, 3H)); 1,60 (m, 2H)) ; 1,40 (s, 9H) . LCMS: método D, TR = 2,103 min, [M+Na+ = 346] e [M-Boc+Na+ = 246].

Passo 3: Éster terc-butílico do ácido [3-({5-[5-Fluoro-2-oxo-1,2-di-hidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrole-3-carbonil}-amino)-propil]-carbâmico

Uma solução de éster terc-butílico do ácido {3-[(5-Formil-2, 4-dimetil-lH-pirrole-3-carbonil)-amino]-propil}-carbâmico (0,200 g, 0,62 mmol) e 5-Fluoro-l,3-di-hidro-indol-2-ona (0,011 g, 0,62 mmol), pirrolidina (0,003 mL) em etanol (2 mL) foi aquecida a 78 °C, durante 3 horas. A reacção foi arrefecida para 0 °C e o precipitado resultante filtrado, lavado com etanol frio. O produto foi suspenso em etanol (4 mL) e agitado, a 72 °C, durante 30 minutos. A reacção foi filtrada, o precipitado seco numa estufa a vácuo, a 40 °C, para produzir o composto desejado como um sólido (0,265 g, 94%). RMN de ΤΗ (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,8 (s, 1H) ; 11,00 (s, 1H) ; 7,80 (m, 2H) ; 7,70 (m, 1H) ; 7.0 (m, 1H) ; 6,9 (m, 2H) ; 3,30 (q, 2H) ; 3,10 (q, 2H) ; 2,50 (dd, 130 6Η) 1,60 (m, 2H) ) ; 1,40 (s, 9H) . LCMS: método D, TR = 2,86 min, [M+Na+ = 479] e [M-Boc+Na+ = 379].

Passo 4: (3-amino-propil)-amida do ácido 5-[5-Fluoro-2-oxo- I, 2-di-hidro-indol-(3 Z)-ilidenemetil]-2,4-dimetil-lH-pirrole-3-carboxílico Éster terc-butílico do ácido [3-({5-[5-Fluoro-2-oxo-l,2-di-hidro-indol- (32) -ilidenometil]-2,4-dimetil-lH-pirrole-3-carbonil}-amino)-propil]-carbâmico foi suspenso em metanol. Foram adicionados 2 mL de HC1 (4 N) em dioxano e a reacção agitada, à temperatura ambiente, de um dia para o outro. O solvente foi removido para produzir o composto desejado (0, 098 g, 91%). RMN de (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,8 (s, 1H) ; II, 00 (s, 1H) ; 7, 90-7, 70 (m, 5H) ; 6,9 (m, 2H) ; 3,30 (q, 2H) ; 2,80 (q, 2H) ; 2,50 (dd, 6H) 1,80 (m, 2H) . LCMS: inconclusivo, devido a fluorescência.

Todas as reacções foram efectuadas sob atmosfera inerte. Os espectros de RMN foram obtidos num Bruker dpx400. A LCMS foi efectuada num Agilent 1100, utilizando uma coluna zorbax SBC-18, 4.6 mm x 150 mm - 5 μ ou uma coluna Pequena: ZORBAX® SB-C18, 4.6 x 75 mm, 3,5 microns ("coluna curta") . O caudal da coluna foi 1 mL/min e os solventes utilizados foram água e acetonitrilo (TFA a 0,1%), com um volume de injecção de 10 pL. Os comprimentos de onda foram 254 e 210 nm. Os métodos são descritos abaixo. 131

Tabela 17: Métodos analíticos

Método Nome de Método de Acesso Fácil Nome de Método de ChemStation Caudal Solvente Tempo de Corrida A 7 mn Analítico positivo ANL_POS 7.M 1 mL/min 0-2,5 min 5-95% de MeCN 7 min 2,5-6 min 95% de MeCN B Ião Analítico positivo ANAL_POS.M 1 mL/min 0-11 min 5-95% de MeCN 15 min 11-13 min 95% de MeCN C Injecção de loop, Positivo 1 mL/min 95% de MeCN 1 min D Ião Analítico positivo Coluna curta ANL Positivo 1 mL/mn 0-4,5 min 30-95% de MeCN 5 min E pH Elevado Analítico pH Elevado Analítico 3 mL/min 0 a 8 min 5-95% de MeCN 10 min 8 a 9 min 95% de MeCN

Tabela 18: Abreviaturas utilizadas em protocolos de química aq aquoso D dupleto DMSO dimetilsulfóxido G qrama HC1 Ácido clorídrico HPLC cromatografia líquida de alta pressão LCMS cromatografia líquida - espectrometria de massa 132 (continuação) M multipleto min minuto mmol milimole N Normal RMN ressonância magnética nuclear Q quarteto TR tempo de retenção S singleto sat saturado T tripleto

Exemplo 6: Síntese de ligando 6 de kinobead (ligando 32 de quinazolina) Síntese de ligando 32 de quinazolina: 7-(4-amino)-butiloxi-4-(2-fluoro-4-bromo-fenil)-amino-6-metoxiquinazolina

Passo 1: 7-benziloxi-4-(2-fluoro-4-bromo-fenil)-amino-6- metoxiquinazolina A uma solução de 7-benziloxi-4-cloro-6-metoxiquinazolina (0,250 g, 0,83 mmol) e 4-bromo-2-fluoroanilina (190 mg, 1 mmol) em isopropanol (10 mL) foi adicionado ácido clorídrico (4 M em dioxano, 0,230 mL, 0,92 mmol). A mistura foi agitada, a 90 °C, durante 2 horas. A mistura reaccional foi deixada arrefecer para a temperatura ambiente. O sólido foi removido por filtração, lavado com isopropanol e éter frios e, finalmente, seco, de um dia para o outro, a 50 °C, proporcionando o composto do título 133 (0,297 g - 79%). RMN de TH (400 MHz, CD3OD-d4) δ 8,65 (s, 1H) ; 7, 96 (s, 1H) ; 7,55 (m, 5H); 7,40(t, 3H); 7,30 (s, I H) ; 5,37 (s, 2H); 4,89 (s, 1H); 4,08 (s, 1H). LCMS: método C, [M+ = 454].

Passo 2: 7-hidroxi-4-(2-fluoro-4-bromo-fenil)-amino-6- metoxiquinazolina A 7-benziloxi-4-(2-fluoro-4-bromo-fenil)-amino-6-metoxiquinazolina (297 mg, 0,654 mmol) foi dissolvida em ácido trifluoroacético (5 mL) e a solução foi agitada até refluxo, durante uma hora. A mistura reaccional foi deixada arrefecer para a temperatura ambiente e vertida sobre gelo. O sólido foi removido por filtração e absorvido em metanol. A solução foi tornada básica utilizando amónia aquosa (para pH 11) e reduzida in vacuo. O sólido foi recolhido por filtração, lavado com água e éter frios e, finalmente, seco, de um dia para o outro, sob vácuo, a 50 °C, proporcionando o composto do titulo. (0,165 g - 69%). RMN de 1H (400 MHz, CD3OD-d4) δ 8,55 (s, 1H) ; 7,89 (s, 1H); 7,52(m, 3H); 7,13(s, 1H); 4,08 (s, 3H) . LCMS: método C, [M+ = 364].

Passo 3: 7-(4-amino-ftalimida)-butiloxi-4-(2-fluoro-4-bromo-fenil)-amino-6-metoxiquinazolina A N(-4-bromobutil)-ftalimida (0,355 g, 0,1,187 mmol) foi adicionada numa porção a uma mistura de 7-hidroxi-4-(2-fluoro-4-bromo-fenil)-amino-6-metoxiquinazolina (360 mg, 0,989 mmol) e carbonato de potássio (410 mg, 2,967 mmol) em dimetilformamida (7 mL). A mistura reaccional foi agitada a 60 °C, durante 2 horas e, depois, deixada arrefecer para a temperatura 134 ambiente. Foi adicionada água (10 mL) e o precipitado foi removido por filtração. O sólido foi lavado com água e metanol frios e, finalmente, seco, de um dia para o outro, a 50 °C, sob vácuo, proporcionando o composto do titulo (0,317 mg - 57%). RMN de XH (400 MHz, CD3OD-d4) δ 9,49 (s, 1H) ; 8,29 (s, 1H) ; 7,82 (m, 4H) ; 7,71 (s, 1H) ; 7,61 (m, 1H) ; 7,47 (t, 1H, J = 8,3 Hz); 7,413 (m, 1H); 7,11 (s, 1H); 4,09 (m, 2H); 3,87 (s, 3H); 3,62 (m, 2H); 1,75 (s amplo, 4H). LCMS: método B, TR = 9,20 min, [MH+ = 410].

Passo 4: 7-(4-amino)-butiloxi-4-(2-fluoro-4-bromo-fenil)- amino-6-metoxiquinazolina

Uma suspensão de 7-(4-amino-ftalimida)-butiloxi-4-(2- fluoro-4-bromo-fenil)-amino-6-metoxiquinazolina (150 mg, 0,265 mmol) em dimetilformamida (5 mL) foi tratada com monoidrato de hidrazina. A mistura reaccional foi agitada, à temperatura ambiente, ao longo de 2 dias (a solubilização ocorreu após alguns minutos e o consumo total de material de partida observado) e, depois, reduzida in vacuo. O óleo amarelo espesso foi purificado utilizando o método de "captura e libertação" (cartucho Isolute SCX-2, com método de libertação optimizado) , proporcionando o composto do titulo (63 mg, 51%). RMN de ΧΗ (400 MHz, CDC13- OO LO Ό Ό 1 68 (s, 1Η); 8,48 (t, 1H, J = 8,5 Hz); 7,36 (m, 1H) ; 7,33 (m, ih; 1 ; 7,32 (s amplo, 1H) ; 7,25 (s, 1H) ; 7,00 (s, 1H) ; 4,19 (m, 2Η) ; 4,02 (s, 3Η) ; 2,80 (m, 2H) ; 1,98 (m, 2H) ; 1,67 (m, 2H) ; 1,49 (s amplo, 2H) . HPLC: método D, TR = 3,52 min.

Todas as reacções foram efectuadas sob atmosfera inerte. Os espectros de RMN foram obtidos num Bruker dpx400. A LCMS foi efectuada num Agilent 1100, utilizando uma coluna zorbax SBC-18, 135 4.6 mm χ 150 mm - 5 μ ou uma coluna Pequena: ZORBAX® SB-C18, 4.6 x 75 mm, 3,5 mícrons ("coluna curta"). O caudal da coluna foi 1 mL/min e os solventes utilizados foram água e acetonitrilo (TFA a 0,1%), com um volume de injecção de 10 pL. Os comprimentos de onda foram 254 e 210 nm. Os métodos são descritos abaixo.

Tabela 19: Métodos analíticos

Método Nome de Método de Acesso Fácil Nome de Método de ChemStation Caudal Solvente Tempo de Corrida A 7 mn Analítico positivo ANL_POS 7.M 1 mL/min 0-2,5 min 5-95% de MeCN 7 min 2,5-6 min 95% de MeCN B Ião Analítico positivo ANAL_POS.M 1 mL/min 0-11 min 5-95% de MeCN 15 min 11-13 min 95% de MeCN c Injecção de loop, Positivo 1 mL/min 95% de MeCN 1 min D Ião Analítico positivo Coluna curta ANL Positivo 1 mL/mn 0-4,5 min 30-95% de MeCN 5 min E pH Elevado Analítico pH Elevado Analítico 3 mL/min 0 a 8 min 5-95% de MeCN 10 min 8 a 9 min 95% de MeCN 136

Tabela 20: Abreviaturas utilizadas em protocolos de química aq aquoso D dupleto DMSO dimetilsulfóxido G grama HC1 Ácido clorídrico HPLC cromatografia líquida de alta pressão LCMS cromatografia líquida - espectrometria de massa M multipleto min minuto mmol milimole N Normal RMN ressonância magnética nuclear Q quarteto TR tempo de retenção S singleto sat saturado T tripleto

Exemplo 7: Síntese de ligando 7 de kinobead (Estaurosporina modificada) 0 ligando 7 de kinobead baseado em Estaurosporina foi sintetizado de acordo com o seguinte protocolo. 137

Passo 1: Modificação de Estaurosporina com ácido diglicólico anidrido

Dissolver Estaurosporina (tipicamente, 10 mg, IRIS-Biotech, Alemanha) em 1 mL de DMF isenta de água, adicionar 5 pL de TEA, arrefecer para 0 °C. A partir desta solução, são retirados 5 pL e misturados com 50 pL de ACN, para determinação da quantidade de partida relativa, utilizando um sistema de LC-MS (AGILENT, Alemanha) . Para a análise de LC-MS, 5 pL da mistura reaccional são diluídos em 50 pL de ACN a 100%. Após mistura exaustiva, são aplicados 5 pL à análise de HPLC, utilizando um amostrador automático. A separação é efectuada a um caudal de 450 pL/min, com ácido fórmico a 0,1% em água, como solvente A e ácido fórmico a 0,1% em ACN a 100%, como solvente B, utilizando uma coluna C18 de 3 x 50 mm (ZORBAX-Extended C 18, AGILENT, Alemanha). É utilizado um gradiente de 10% de A para 95% de B em 75 minutos. A absorvência de UV é observada a 254 nm, a massa molecular do composto é determinada em linha por um sistema de MS quadrupolar de fase simples (MSD, AGILENT, Alemanha). Os dados registados são verificados manualmente. Esta primeira análise serve como o padrão para o cálculo dos rendimentos dos produtos de reacção. A área de pico do sinal de UV é fixada em 100% como quantidade de partida, com base na Estaurosporina pura. À solução de Estaurosporina gelada é adicionado um excesso de 10 vezes do ácido diglicólico anidrido (Merck Alemanha) em DMF. A reacção, com rendimento próximo de 100%, é terminada em 10 minutos, verificada por HPLC, pela mistura de 5 pL da mistura reaccional com 50 pL de ACN e analisada por LC-MS, como descrito acima. A massa molecular desloca-se de 467,5 Da (Estaurosporina não modificada) para 545,6 Da (Estaurosporina modificada) para a 138 molécula carregada individualmente. Se a reacção não for completa, outro excesso de dez vezes do ácido diglicólico anidrido é adicionado e a mistura mantida durante outros 30 minutos, à temperatura ambiente. A mistura reaccional é analisada por LC-MS, como descrito acima.

Depois da reacção ser completada, não pode ser detectada Estaurosporina não modificada. São adicionados 5 mL de água à mistura reaccional, em primeiro lugar para neutralizar o ácido anidrido, em segundo lugar para diluir para extracção de fase sólida. Preparar um cartucho de extracção de fase sólida C18 de 500 mg (Phenomenex, Alemanha), por activação com 10 mL de metanol e equilibração com TFA a 0,1% em água. Os solventes são passados através do cartucho, com um caudal de, aproximadamente, 2 a 3 mL/min, pela utilização de uma bomba de vácuo de membrana. A mistura reaccional aquosa é aplicada no cartucho e passada através dele com o mesmo caudal como acima. Depois de a solução ter passado completamente através do cartucho e a estaurosporina modificada estar ligada ao material de C18, é lavada, em primeiro lugar, com ACN a 5%, TFA a 0,1%, depois, com ACN a 10% e, finalmente, com ACN a 20%, todos com TFA a 0,1% em água. A Estaurosporina modificada é, depois, eluida com ACN a 70%, TFA a 0,1% em água, seguido de ACN a 80%, TFA a 0,1% em água. Os eluatos são combinados e secos em vácuo.

Passo 2: Ligaçao da Estaurosporina modificada à diamina ligada à fase sólida utilizando química de PyBroP

Dissolver a Estaurosporina modificada em DMF isenta de água e adicionar a resina de Bis-(aminoetil)etilenoglicol-tritilo pré-dilatada em DMF (TRIS Biotech, Alemanha). A diamina ligada à 139 fase sólida é adicionada em excesso de 2 a 3 vezes. À pasta, adicionar 10 pL de diisopropiletilamina (DIEA, FLUKA, Alemanha) e um excesso de cinco vezes de PyBroP acima da Estaurosporina modificada. A reacção é efectuada durante 16 horas, à temperatura ambiente, sob mistura permanente através de um misturador de extremidade-a-extremidade. Verificar o sobrenadante para Estaurosporina modificada não ligada por HPLC, utilizando o sistema de LC-MS, como descrito acima. Este passo não é quantitativo, apenas é medido o desaparecimento de Estaurosporina modificada não ligada. Depois de a reacção ser completada (já não se pode detectar Estaurosporina modificada não ligada) , a resina é lavada com 10 volumes de DMF isenta de água e duas vezes com 10 volumes de DCM.

Passo 3: Reacçao de clivagem A resina é, depois, ressuspensa em 5 volumes de DCM, arrefecida para 0 °C e 1 mL de TFA é adicionado. A resina amarela clara anterior deverá agora ficar vermelha escura, indicando a reacção. A clivagem é efectuada durante 20 minutos, a 0 °C e 20 minutos, à temperatura ambiente. A solução é recolhida e a resina lavada duas vezes com 10 volumes de DCM. Todos os eluatos são combinados e secos, utilizando um evaporador rotativo. O filme oleoso remanescente é dissolvido em 0,5 mL de DMF e são adicionados 5 mL de água. A Estaurosporina modificada é purificada por extracção de fase sólida, como descrito acima e seca sob vácuo. O rendimento é verificado por HPLC com absorvência de UV, a 254 nm, contra a solução de estaurosporina não modificada original, como descrito acima, em relação à solução da Estaurosporina não modificada após dissolução do produto de reacção em 1 mL de DMF. A partir desta 140 solução, são misturados 5 pL com 50 pL de ACN e 5 pL são analisados por LC-MS. A massa molecular do produto esperado é 727,8 Da. A área de pico a 254 nm está relacionada com a área de pico da Estaurosporina não modificada como 100% analisado, como descrito. A estaurosporina modificada é utilizada para ligação a sepharose activada por NHS, como habitualmente por meio do seu grupo amino. Antes da ligação, 1 mL de esferas é lavado três vezes com 12 mL de DMSO isento de água e, depois, ressuspenso com 1 mL de DMSO isento de água. A esta suspensão, são adicionados 20 pL de TEA e um equivalente de 1 pmole da Estaurosporina modificada em DMF. Directamente após adicionar e misturar bem e centrifugação breve, durante 1 minuto, a 1200 rpm, 20 pL do sobrenadante são retirados e 5 pL são analisados por LC-MS. Após 16 horas, sob mistura continua num misturador rotativo, a suspensão é centrifugada novamente e 20 pL são retirados para determinar a restante Estaurosporina modificada não ligada, por análise de 5 pL por LC-MS, como descrito acima. Habitualmente 100% da Estaurosporina modificada está ligada. Em seguida, as esferas são lavadas três vezes com 12 mL de DMSO, ressuspensas novamente com 1 mL de DMSO e 50 pL de etanolamina (MERCK, Alemanha) são adicionados para bloquear grupos activados por NHS que não reagiram. A reacção é efectuada durante 16 h, sob mistura contínua. Após o bloqueio da reacção, as esferas são lavadas três vezes com 12 mL de isopropanol (MERCK, Alemanha) e armazenadas como uma pasta 1:1, a 4 °C, até à sua utilização. 141

Foram utilizados os seguintes reagentes: DMF: N,N-Dimetilformamida (FLUKA, 40228); TEA: Trietilamina (SIGMA-Aldrich, T0886); ACN: Acetonitrilo para HPLC (Merck, 1.00030); TFA: Ácido trifluoroacético (FLuKA, 09653);

PyBroP: Hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfónio (Novabiochem, 01-62-0017); DCM: Diclorometano (FLUKA, 66749); DMSO: Dimetilsulfóxido (FLUKA, 41648).

Exemplo 8: Ligação de competição em lisado e perfil de afinidade de proteína quantitativo (PAP)

Este exemplo ilustra a ligação de competição em lisados celulares (ver, de um modo particular, o terceiro aspecto da invenção). Um composto de teste, Bisindolilmaleimido VIII (Bis VIII, um inibidor de cinase bem conhecido; Davies et al. , 2000. Especificidade e mecanismo de acção de alguns inibidores de cinase de proteína geralmente utilizados. Biochemical Journal 351(Pt 1): 95-105), foi adicionado a um lisado celular permitindo, desse modo, ao composto de teste ligar-se às proteínas alvo no lisado. Depois, o lisado foi colocado em contacto com a matriz de afinidade de kinobeads, para capturar as proteínas alvo livres remanescentes. As proteínas ligadas à 142 matriz de kinobeads foram, depois, eluidas com tampão contendo detergente, separadas num gel de SDS-poliacriamida e analisadas por imunodetecção (transferências de Western) ou detecção de espectrometria de massa.

Para análise de transferência de Western, as proteínas ligadas à matriz de afinidade foram eluidas da matriz de afinidade e, subsequentemente, separadas por electroforese em gel de SDS-Poliacrilamida e transferidas para uma membrana de transferência. As cinases individuais foram detectadas com anticorpos específicos contra GSK3alfa, GSK3beta e ITK (Figura 4A). 0 resultado mostra que a pré-incubação do lisado celular com Bis VIII impediu a ligação das proteínas alvo GSK3alfa e GSK3beta à matriz de kinobeads, num modo dependente de dose. Concentrações crescentes do inibidor de cinase Bis VIII impediram, de um modo específico, a ligação de GSK3 alfa e GSK3beta às kinobeads mas não a ligação de ITK. Para GSK3beta, o sinal foi quantificado e representado graficamente contra a concentração de Bis VIII adicionada ao lisado celular (Figura 4B) .

Para a detecção quantitativa de proteínas por espectrometria de massa, as proteínas foram eluidas da matriz de afinidade e subsequentemente separadas por electroforese em gel de SDS-Poliacrilamida. As áreas de gel adequadas foram cortadas e submetidas a digestão proteolítica em gel com tripsina. Quatro amostras de digestão tríptica (correspondendo a três concentrações diferentes de Bis VIII no lisado e um controlo de DMSO) foram marcadas com reagentes iTRAQ e as amostras combinadas foram analisadas numa única análise de espectrometria de massa de LC-MS/MS, seguida de quantificação de pico no espectro de MS/MS (Ross et al., 2004. Quantificação de proteína 143 multiplexada em Saccharomyces cerevisiae utilizando reagentes de marcação isobáricos reactivos com amina. Mol. Cell. Proteomics 3(12): 1154-1169). 0 resultado mostra que foram detectados diferentes niveis de proteínas individuais e os valores de intensidade relativa foram calculados (Tabela 21). São mostradas as curvas de ligação para cinases individuais (Figura 5) . Os valores de intensidade relativa 50 (RI50), representando a afinidade de pares de cinase-composto, são semelhantes a valores de IC50 referidos por ensaios enzimáticos de cinase (Davies et al., 2000. Especificidade e mecanismo de acção de alguns inibidores de cinase de proteína geralmente utilizados. Biochemical Journal 351(Pt 1): 95-105). 1. Cultura celular

As células de Jurkat (clone E6-1 da ATCC, número TIB-152) foram cultivadas em 1 litro de frascos Spinner (Integra Biosciences, N° 182101) em suspensão em meio RPMI 1640 (Invitrogen, N° 21875-034), suplementado com Soro Bovino Fetal a 10% (Invitrogen), a uma densidade entre 0,15 x 106 e 1,2 x 106 células/mL e recolhidas por centrifugação. Os sedimentos celulares foram congelados em azoto líquido e subsequentemente armazenados a -80 °C. 2. Preparação de lisados celulares

As células de Jurkat foram homogeneizadas num homogeneizador Potter S em tampão de lise: Tris-HCl a 50 mM, NP40 a 0,8%, glicerol a 5%, NaCl a 150 mM, MgC12 a 1,5 mM, NaF a 25 mM, vanadato de sódio a 1 mM, DTT a 1 mM, pH 7,5. Foi 144 adicionado um comprimido isento de EDTA completo (cocktail de inibidor de protease, Roche Diagnostics, 1 873 580) por 25 mL de tampão. O material foi dissociado 10 vezes utilizando um POTTER S mecanizado, transferido para tubos falcon de 50 mL, incubado durante 30 minutos sobre gelo e concentrado no fundo do tubo, durante 10 minutos, a 20000 g, a 4 °C (10000 rpm num Sorvall SLA600, pré-arrefecido). O sobrenadante foi transferido para um tubo de policarbonato (UZ) de ultracentrifuga (Beckmann, 355654) e centrifugado durante 1 hora, a 100000 g, a 4 °C (33500 rpm em TÍ50.2, pré-arrefecido). O sobrenadante foi novamente transferido para um tubo falcon fresco de 50 mL, a concentração de proteína foi determinada por um ensaio Bradford (BioRad) e foram preparadas amostras contendo 50 mg de proteína por alíquota. As amostras foram imediatamente utilizadas para experiências ou congeladas em azoto líquido e armazenadas congeladas a -80 °C. 3. Pré-incubação de lisado com composto de teste

Alíquotas de lisado de Jurkat (10 mg de proteína) foram incubadas com diferentes concentrações de Bis VIII, durante uma hora, a 4 °C (concentração final de Bis VIII de 0,025 μΜ, 0,074 μΜ, 0,22 μΜ, 0,67 μΜ, 2,0 μΜ e 6,0 μΜ) . Para ο efeito, foram preparadas soluções de Bis VIII em DMSO a 100%, como solvente, que correspondiam a concentração de Bis VIII final desejada de 200 vezes (Bis VIII da Alexis Biochemicals cat. número ALX 270-056). Cinco pL destas soluções foram adicionados a 1 mL de lisado, resultando nas concentrações finais indicadas. Para uma experiência de controlo, foram utilizados 5 pL de DMSO sem Bis VIII. 145 4. Captura de proteína com kinobeads A cada amostra de lisado pré-incubado, 40 pL de kinobeads (ver o exemplo 1) foram adicionados e incubados durante uma hora, a 4 °C. Durante a incubação, os tubos foram rotacionados num agitador de extremidade-a-extremidade (Roto Shake Genie, Scientific Industries Inc.). As esferas foram recolhidas por centrifugação, transferidas para colunas Mobicol (MoBiTech 10055) e lavadas com 10 mL de tampão de DP lx, contendo detergente de NP40 a 0,4%, seguido de uma lavagem com 5 mL de tampão de DP lx com NP40 a 0,2%. Para eluir as proteínas

ligadas, foram adicionados 100 pL de tampão de amostra de SDS 2x, a coluna foi aquecida durante 30 minutos, a 50 °C e o eluato foi transferido para um tubo de microcentrífuga por centrifugação. As proteínas foram, depois, separadas por electroforese de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE). A composição e preparação de tampões são descritas no exemplo 2. 5. Detecção de Proteína por Análise de Transferência de Western

As transferências de Western foram realizadas de acordo com processos padrão e reveladas com o sistema de detecção de transferência de Western de ECL, de acordo com as instruções do fabricante (Amersham Biosciences, N° RPN2106). O sistema de detecção de transferência de Western de ECL da Amersham é um método de emissão de luz, não radioactivo, para a detecção de antigénios específicos, directamente ou indirectamente com anticorpos marcados com Peroxidase de Rábano (HRP). 146 0 anticorpo anti-Glicogénio Sintase cinase 3 beta (GSK3beta) foi utilizado a uma diluição de 1:1000 (ηηίί-63Κ3β policlonal de coelho, Stressgen Bioreagents, Victoria, Canadá, produto número KAP-ST002). Este anticorpo também reconhece GSK3alfa. O anticorpo anti-ITK também foi utilizado a uma diluição de 1:1000 (anticorpo anti-ITK policlonal de coelho, Upstate Lake Placid, N.I., catálogo número 06-546). 6. Detecçao de Proteína por Espectrometria de Massa 6.1 Digestão de proteína antes da análise de espectrometria de massa

As proteínas separadas em gel foram reduzidas, alquiladas e digeridas em gel, essencialmente seguindo o processo descrito por Shevchenko et al., 1996, Anal. Chem. 68:850-858.

Resumidamente, as proteínas separadas em gel foram excisadas do gel utilizando um bisturi limpo, reduzidas utilizando DTT a 10 mM (em bicarbonato de amónio a 5 mM, 54 °C, 45 minutos) e, subsequentemente, alquiladas com iodoacetamida a 55 mM (em bicarbonato de amónio a 5 mM), à temperatura ambiente, no escuro, durante 30 minutos. As proteínas reduzidas e alquiladas foram digeridas em gel com tripsina porcina (Promega), a uma concentração de protease de 10 ng/pL, em hidrogenocarbonato de Trietilamónio a 5 mM (TEAB). A digestão foi deixada prosseguir durante 4 horas, a 37 °C e a reacção foi subsequentemente interrompida utilizando 5 pL do ácido fórmico a 5%. 147 6.2 Preparaçao de amostra antes da análise por espectrometria de massa

Os blocos de gel foram extraídos duas vezes com 20 pL do ácido fórmico a 1%, em água e uma vez com 20 pL do ácido fórmico a 0,1%, acetonitrilo a 60% em água e agregados com sobrenadantes de digestão acidificada. As amostras foram secas num vácuo. 6.3 Marcaçao de iTRAQ de extractos peptídicos

Os extractos peptídicos de amostras tratadas com diferentes concentrações do composto de teste (0,074 pM, 0,22 pM e 0,67 pM de Bis VIII) e o controlo de solvente (DMSO a 0,5%) foram tratados com diferentes isómeros do reagente de marcação isobárico (iTRAQ Reagents Multiplex Kit, parte número 4352135, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) . Os reagentes de iTRAQ são um conjunto de reagentes multiplexados, específicos de amina, de isótopo estável, que podem marcar todos os péptidos em até quatro amostras biológicas diferentes, possibilitando a identificação e quantificação simultâneas dos péptidos. Os reagentes de iTRAQ foram utilizados de acordo com as instruções proporcionadas pelo fabricante.

As amostras foram ressuspensas em 10 pL de solução de TEAB a 50 mM, pH 8,5 e 10 pL de etanol foram adicionados. O reagente de iTRAQ foi dissolvido em 85 pL de etanol e 10 pL de solução de reagente foram adicionados à amostra. A reacção de marcação foi realizada à temperatura ambiente, durante uma hora, num agitador horizontal e interrompida pela adição de 10 pL do ácido fórmico a 10% em água. As quatro amostras marcadas foram, depois, 148 combinadas, secas numa centrífuga a vácuo e ressuspensas em 10 pL do ácido fórmico a 0,1% em água. 6.4 Aquisição de dados espectrométricos de massa

As amostras peptídicas foram injectadas num sistema nano LC (CapLC, Waters ou Ultimate, Dionex) que estava directamente ligado a um espectrómetro de massa de TOF quadrupolar (QTOF2, QTOF Ultima, QTOF Micro, Micromass) ou barreira iónica (LTQ Deca XP). Os péptidos foram separados no sistema de LC, utilizando um gradiente de solventes aquosos e orgânicos (ver abaixo). O solvente A foi acetonitrilo a 5% em ácido fórmico a 0,5% e o solvente B foi acetonitrilo a 70% em ácido fórmico a 0,5%.

Tabela 3: Os péptidos eluindo do sistema de LC foram parcialmente sequenciados no espectrómetro de massa.

Tempo (min) % de solvente A % de solvente B 0 95 5 5, 33 92 8 35 50 50 36 20 80 40 20 80 41 95 5 50 95 5 149 6.5 Identificação de proteína

Os dados de massa e fragmentação peptídicos gerados nas experiências de LC-MS/MS foram utilizados para pesquisar bases de dados de sequências proteicas e nucleotídicas formatadas por fasta, mantidas e actualizadas regularmente no NCBI (para o NCBInr, dbEST e os genomas humanos e de murganho) e Instituto Europeu de Bioinformática (EBI, para as bases de dados de proteoma de humano, murganho, D. melanogaster e C. elegans) . As proteínas foram identificadas pela correlação da massa peptídica medida e os dados de fragmentação com os mesmos dados computados a partir dos registos na base de dados, utilizando a ferramenta de software Mascot (Matrix Science; Perkins et ai., 1999 . Identificação de proteína baseada em probabilidade pela pesquisa de bases de dados de sequências, utilizando dados de espectrometria de massa. Electrophoresis 20, 3551-3567). Os critérios de pesquisa variaram, dependendo de que espectrómetro de massa foi utilizado para a análise. 6.6 Quantificação de proteína A quantificação relativa de proteína foi realizada utilizando áreas de pico de sinais de ião repórter de iTRAQ, essencialmente como descrito por Ross e colegas (Ross et al. , 2004. Quantificação de proteína multiplexada em Saccharomyces cerevisiae utilizando reagentes de marcação isobáricos reactivos com amina. Mol. Cell. Proteomics 3(12): 1154-1169). 150 6.7 Curvas de ligaçao e determinação de valores de RI50

Os valores de intensidade relativa (RI) para as cinases identificadas são mostrados na Tabela 21. 0 composto de teste Bis VIII foi utilizado a três concentrações diferentes no lisado celular e os valores de RI foram normalizados para o controlo de DMSO. Para cinases seleccionadas, os valores de RI foram representados graficamente contra a concentração de Bis VIII e o ajuste de curva foi realizado utilizando o programa Xlfit (ID Busiess Solutions Ltd.), utilizando um modelo de equilíbrio hiperbólico (Figura 5) . 0 valor de RI50 corresponde à concentração do composto de teste (Bis VIII), cuja intensidade relativa do sinal de MS para uma cinase é 50%, em comparação com o controlo de solvente (DMSO).

Tabela 21: Proteínas identificadas por análise de espectrometria de massa O composto de teste Bis VIII foi utilizado a três concentrações diferentes no lisado e os valores de RI resultantes foram normalizados para o controlo de DMSO, o qual foi fixado em 1,0. São listados os valores de intensidade relativa. O Representativo refere-se ao número de acesso de base de dados do índice de Proteína Internacional (IPI, Instituto Europeu de Bioinformática) , uma compilação de sequências de proteína derivadas de várias bases de dados de sequências de elevada qualidade (incluindo GenBank, EMBL, SwissProt, RefSeq, Ensembl). Os nomes de cinase são de acordo com a nomenclatura de cinases humanas (http://kinase.com) e Manning et al., 2002,

Science 298, 1912-1934, como especificado em material suplementar). 151

Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4

Representativo Nome de Agrupamento Nome de Cinase DMSO 0,074 CM 0,02 CM 0,67 CM IPI00298977.4 AAK1 AAK1 1,00 0,82 0,90 0, 75 IPI00329488.4 ABL2 ARG 1,00 0,96 0,97 0,91 IPI00176642.3 AURKB AurB 1,00 0,95 1, 04 0,97 CZBO 0 0 0 0 0 43.1 ABI 1 Abll 1,00 0,81 0,90 1,03 IPI00306217.1 BLK BLK 1,00 0,90 0,96 0,83 IPI00430291.1 CAMK2D CaMK2d 1,00 0,91 0,99 0,88 IPI00169392.3 CAMK2G CaMK2g 1,00 0,83 0,98 0,88 IPI00031681.1 CDK2 CDK2 1,00 0,89 0, 85 0,65 IPI00023530.4 CDK5 CDK5 1,00 0,92 1,02 0,95 IPI00000685.1 CDK7 CDK7 1,00 1,03 1, 04 0,89 IPI00013212.1 CSK CSK 1,00 0,84 0,94 0,89 IPI00183400.8 CSNK1A1 CKla 1,00 0,97 1, 04 1,02 IPI00465058.1 CSNK1G1 CKlgl 1,00 1,01 1,05 0,96 IPI00219012.2 FYN FYN 1,00 0,91 1, 04 0,93 IPI00298949.1 GAK GAK 1,00 0,92 1, 01 0,97 IPI00292228.1 GSK3A GSK3A 1,00 0,50 0,29 0,20 IPI00216190.1 GSK3B GSK3B 1,00 0,54 0,39 0,28 IPI00004566.1 ITK ITK 1,00 0,80 0,94 0,91 IPI00515097.1 LCK LCK 1,00 0,87 1,00 0,94 IPI00003479.1 MAPK1 Erk2 1,00 0,89 1,04 0,98 IPI00002857.1 MAPK14 p3 8a 1,00 0,82 0,95 0,93 IPI00024672.1 MAPK8 JNK1 1,00 0,91 1,02 0,83 IPI00024673.1 MAPK9 JNK2 1,00 0,97 1,08 1, 04 IPI00012069.1 NQOl 1,00 0,84 0,99 0,87 IPI00219129.7 NQ02 1,00 0,87 0,95 0,78 IPI00410287.1 PRKAA1 AMPKal 1,00 0,88 1,00 0,91 IPI00220409.2 PRKABl 1,00 0,91 0,94 0,79 152 (continuação)

Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4

Representativo Nome de Agrupamento Nome de Cinase DMSO 0,074 CM 0,02 CM 0,67 CM IPI00549328.2 PRKAG1 1,00 0,78 0,79 0,68 IPI00385449.3 PRKCA PKCa 1,00 0,25 0,19 0,18 IPI00219628.1 PRKCB1 PKCb 1,00 0,29 0,23 0, 17 IPI00029702.1 PTK2B PYK2 1,00 0,82 0,90 0, 74 IPI00465291.3 SNF1 LK2 QIK 1,00 0,93 1,11 0,98 IPI00479211.2 SRC SRC 1,00 0,93 0,98 0,94 IPI00298940.2 STK6 AurA 1,00 0,90 1,03 0,87 IPI00293613.1 TBK1 TBK1 1,00 1, 05 1, 13 1,14 IPI00411818.3 ULK3 ULK3 1,00 0,95 0,97 1, 15 IPI00025830.1 WEE1 Weel 1,00 1,21 1, 15 1,14 IPI00477734.1 YES1 YES 1,00 0,82 0,92 0,87

Lisboa, 4 de Junho de 2013 153

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para a caracterização de, pelo menos, uma enzima, compreendendo os passos de: a) proporcionar duas alíquotas, cada compreendendo, pelo menos, uma célula contendo a enzima, b) incubar uma aliquota com um determinado composto diferente dos ligandos, c) recolher as células, d) lisar as células, e) colocar os lisados celulares, sob condições essencialmente fisiológicas, em contacto com, pelo menos, dois ligandos enzimáticos de largo espectro diferentes, em que os ligandos estão imobilizados num suporte sólido, sob condições permitindo a ligação da enzima aos referidos ligandos enzimáticos de largo espectro, f) eluir a enzima ou enzimas e g) caracterizar a enzima ou enzimas eluidas por espectrometria de massa quantitativa.
2. 2. Método para a caracterização de, pelo menos, uma enzima, compreendendo os passos de: 1 a) proporcionar duas alíquotas de uma preparaçao de proteína contendo a enzima, b) colocar uma alíquota, sob condições essencialmente fisiológicas, em contacto com, pelo menos, dois ligandos enzimáticos de largo espectro diferentes, em que os ligandos estão imobilizados num suporte sólido, sob condições permitindo a ligação da enzima aos referidos ligandos enzimáticos de largo espectro, c) colocar a outra alíquota, sob condições essencialmente fisiológicas, em contacto com, pelo menos, dois ligandos enzimáticos de largo espectro diferentes, em que os ligandos estão imobilizados num suporte sólido, sob condições permitindo a ligação da enzima aos referidos ligandos enzimáticos de largo espectro e com um determinado composto diferente dos ligandos, d) eluir a enzima ou enzimas e e) caracterizar a enzima ou enzimas eluídas por espectrometria de massa quantitativa, em que uma detecção reduzida da enzima na alíquota incubada com o composto indica que a enzima é um alvo directo do composto.
3. Método da reivindicação 2, em que a provisão de uma preparação de proteína no passo a) inclui os passos de recolha de, pelo menos, uma célula contendo a enzima e a lise da célula. 2
4. 4. Método de qualquer das reivindicações 1 a 3, realizado como um rastreio de alta capacidade.
5. 5. Método de qualquer das reivindicações 1 a 4, em que o referido composto é seleccionado do grupo consistindo de compostos sintéticos, ou fármacos sintéticos orgânicos, de um modo mais preferido fármacos orgânicos de moléculas pequenas e compostos de moléculas pequenas naturais.
6. 6. Método de qualquer das reivindicações 1 a 5, em que a enzima é seleccionada do grupo consistindo de uma cinase, uma fosfatase, uma protease, uma fosfodiesterase, uma hidrogenase, uma desidrogenase, uma ligase, uma isomerase, uma transferase, uma acetilase, uma desacetilase, uma GTPase, uma polimerase, uma nuclease e uma helicase.
7. 7. Método de qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o ligando se liga a 10% a 50%, de um modo preferido 30% a 50%, das enzimas de uma determinada classe de enzimas.
8. 8. Método de qualquer das reivindicações 1 a 7, em que o ligando é um inibidor.
9. 9. Método da reivindicação 8, em que a enzima é uma cinase e o ligando é seleccionado do grupo consistindo de Bisindolilmaleimido VIII, Purvalanol B, CZC00007324 (PD173955 ligável) e CZC00008004.
10. 10. Método de qualquer das reivindicações 1 a 9, em que a caracterização da enzima é realizada pela caracterização de parceiros de ligação co-eluidos da enzima, subunidades enzimáticas ou modificações pós-traducionais da enzima. 3
11. 11. Método de qualquer das reivindicações 1 a 10, em que a caracterização é realizada pela identificação de péptidos proteotípicos da enzima ou do parceiro de ligação da enzima.
12. 12. Método da reivindicação 11, em que a caracterização é realizada pela comparação dos péptidos proteotípicos obtidos para a enzima ou o parceiro de ligação com péptidos proteotípicos conhecidos.
13. 13. Método de qualquer das reivindicações 1 a 12, em que o suporte sólido é seleccionado do grupo consistindo de agarose, agarose modificada, esferas de sepharose (e. g., sepharose activada por NHS), látex, celulose e partículas de ferro ou ferromagnéticas.
14. 14. Método de qualquer das reivindicações 1 a 13, em que os ligandos enzimáticos de largo espectro estão covalentemente ligados ao suporte sólido.
15. 15. Método de qualquer das reivindicações 1 a 14, em que são utilizados 2 a 10 ligandos diferentes, de um modo preferido 2 a 6, de um modo mais preferido 2 a 4.
16. 16. Método de qualquer das reivindicações 1 a 15, em que, pela caracterização da enzima ou complexo de enzima-composto, a identidade de todos ou partes dos membros de uma classe enzimática na célula é determinada.
17. 17. Método de qualquer das reivindicações 1 a 16, em que a ligação entre ligandos e enzima é uma ligação não covalente. 4
18. 18. Método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o ligando de largo espectro é capaz de se ligar a algumas mas não a todas as enzimas presentes na preparação de proteína. Lisboa, 4 de Junho de 2013 5