CN102027371A - Parp相互作用分子的鉴定方法和parp蛋白的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于鉴定PARP相互作用化合物或用于纯化或鉴定PARP蛋白的固定化合物和方法。

Description

PARP相互作用分子的鉴定方法和PARP蛋白的纯化方法
本发明涉及固定化合物(immobilization compound)和用于鉴定PARP相互作用分子的方法和用于纯化PARP蛋白的方法。另外，本发明涉及例如用于治疗癌症、代谢性疾病或自体免疫/炎症性障碍的包含所述相互作用分子的药物组合物，和涉及癌症的诊断方法。
聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)组成真核细胞中存在的细胞信号传导酶的家族，所述酶催化DNA-结合蛋白的聚(ADP-核糖基化)。PARPS还已知为聚(ADP-核糖)合成酶或聚(ADP-核糖)转移酶(pART)。这些酶在对DNA损伤的速发型细胞应答方面起重要作用。对由电离辐射、氧化应激和DNA-结合抗肿瘤药诱导的DNA损伤的应答，PARP将ADP-核糖单元添加到靶蛋白的天冬氨酸和谷氨酸残基的羧酸酯基上。该聚(ADP-核糖基化)为通过附着ADP-核糖单元的复杂支链聚合物上触发受体蛋白失活的翻译后修饰(Schreiber等，2006.Nature Reviews CellBiology 7，517-528)。
ADP核糖基化为一种翻译后蛋白修饰，该修饰中ADP-核糖部分从NAD转移到靶蛋白的特定氨基酸侧链上(Schreiber等，2006.NatureReviews Cell Biology 7，517-528)。
PARP1为PARP家族中首个被表征的成员，并且是最熟知的成员。由ADPRT基因编码的该蛋白是高度保守的染色质结合酶，所述酶结合带切口的DNA并且介导针对DNA损伤的保护。对重大DNA损伤的应答，PARP1被过度激活，并且诱导细胞NAD+和ATP的耗尽，导致细胞功能障碍或细胞死亡。PARP1的过度激活涉及几种疾病的发病机理，所述疾病包括中风、心肌梗塞、糖尿病、神经退行性疾病和炎症疾病。
已经提出使用小分子抑制剂靶向PARP作为用于癌症治疗的有前景的方法(Haince等，2005.Trends Mol Med.11(10)：456-63)。在文献中已经报道了几种PARP抑制剂。然而，第一代的PARP抑制剂对于PARP家族的各种成员是非选择性的，存在对选择性抑制剂的需要。另外，还需要用于PARP抑制剂的选择性剖析(profiling)的新方法。
PARP抑制剂的鉴定和表征的一个前提条件是提供合适的检测方法，优选是使用靶蛋白生理形式的检测方法。本领域中，为了解决该问题已经提出几种策略。
为了对来自小牛胸腺的PARP蛋白进行纯化，描述了两步亲和纯化策略(D’Amours等，1997.Analytical Biochemistry 249，106-108)。第一步由DNA-纤维素色谱组成，第二步由3-氨基苯甲酰胺亲和色谱组成。3-氨基苯甲酰胺是一种PARP抑制剂，与所述酶的C-末端催化结构域相互作用。
常规而言，可以在基于溶液的检测中使用合适的底物使用经纯化的酶或重组酶测定PARP酶活性(Dantzer等，2006.Methods inEnzymology 409，493-510)。这种类型的检测可用于鉴定PARP抑制剂，还可用于通过测试针对PARP家族的所有成员的抑制剂而评估抑制剂选择性。
综上所述，需要为PARP相互作用化合物的鉴定和选择性剖析以及为PARP蛋白的纯化提供有效工具和方法。
发明内容
本发明尤其涉及式(I)的固定化合物或其盐，
其中：
R1a、R1b、R2独立地选自由H和C1-4烷基组成的组，其中C1-4烷基可选地被一个或多个相同或不同的卤素取代；
R3是H；卤素；CN；C(O)OR4；OR4；C(O)R4；C(O)N(R4R4a)；S(O)2N(R4R4a)；S(O)N(R4R4a)；S(O)2R4；S(O)R4；SR4；N(R4R4a)；NO2；OC(O)R4；N(R4)C(O)R4a；N(R4)S(O)2R4a；N(R4)S(O)R4a；N(R4)C(O)N(R4aR4b)；N(R4)C(O)OR4a；OC(O)N(R4R4a)；C1-6烷基；C2-6链烯基；或C2-6炔基，其中C1-6烷基；C2-6链烯基；和C2-6炔基可选地被一个或多个相同或不同的R5取代；
R4、R4a、R4b独立地选自由H；C1-6烷基；C2-6链烯基；和C2-6炔基组成的组，其中C1-6烷基；C2-6链烯基；和C2-6炔基可选地被一个或多个相同或不同的R5取代；
R5是卤素；CN；OR6；SR6；N(R6R6a)；或NO2；
R6、R6a独立地选自由H和C1-4烷基组成的组，其中C1-4烷基可选地被一个或多个相同或不同的卤素取代；
m是0；1；或2；
n是0；1；或2。
在变量或取代基能够选自不同变量的组或所述变量或取代基出现超过一次的情况下，各变量可以相同或不同。
在本发明的意义内如下使用术语：
“烷基”是指直链或支链饱和烃链。烷基碳的各氢可以被取代基取代。
“链烯基”是指含有至少一个C-C双键的直链或支链烃链。链烯基碳的各氢可以被取代基取代。
“炔基”是指包含至少一个C-C三键的直链或支链烃链。炔基碳的各氢可以被取代基取代。
“C1-4烷基”是指具有1-4个碳原子的烷基链，例如如果存在的话位于分子末端的甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基，或当分子的两部分通过烷基连接时例如-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-C(CH2)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-CH(CH3)2-。C1-4烷基碳的各氢可以被取代基取代。
“C1-6烷基”是指具有1-6个碳原子的烷基链，例如如果存在的话位于分子末端的C1-4烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基，或当分子的两部分通过烷基连接时例如-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-C(CH2)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-CH(CH3)2-。C1-6烷基碳的各氢可以被取代基取代。
“C2-6链烯基”是指具有2-6个碳原子的链烯基链，例如如果存在的话位于分子末端的甲基、-CH＝CH2，-CH＝CH-CH3，-CH2-CH＝CH2，-CH＝CH-CH2-CH3，-CH＝CH-CH＝CH2，或当分子的两部分通过链烯基连接时例如-CH＝CH-。C2-6链烯基碳的各氢可以被取代基取代。
“C2-6炔基”是指具有2-6个碳原子的炔基链，例如如果存在的话位于分子末端的-C≡CH，-CH2-C≡CH，CH2-CH2-C≡CH，CH2-C≡C-CH3，或当分子的两部分通过炔基连接时例如-C≡C-。C2-6炔基碳的各氢可以被取代基取代。
“卤素”是指氟、氯、溴或碘。通常优选的是卤素为氟或氯。
由于在制备如下所述的固定产物方面的优选用途，已经将本发明要求保护的固定化合物命名为“固定化合物”。然而，其它可能的用途，例如作为检测中的可溶性竞争者或作为标记探针，也明确地包括在本发明内。
在根据式(I)的化合物包含一个或多个酸性或碱性基团的情况下，本发明还包括其相应的盐。因此，根据本发明包含酸性基团的式(I)的固定化合物可以以例如碱金属盐、碱土金属盐或以其铵盐的形式使用。此类盐的更准确实例包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或与氨或诸如乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸等有机胺形成的盐。根据本发明，含有一个或多个碱性基团(即能够被质子化的基团)的式(I)的固定化合物，可以以与无机酸或有机酸形成其加成盐的形式存在和利用。合适的酸的实例包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、草酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、丁二酸、庚二酸、富马酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯基丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、异烟酸、柠檬酸、己二酸以及本领域技术人员已知的其它酸。如果式(I)的固定化合物在分子中同时含有酸性基团和碱性基团，除了上述盐形式之外，本发明还包括内盐或甜菜碱(betaines)(两性离子(zwitterions))。根据式(I)的各盐可以通过本领域技术人员已知的常规方法获得，例如通过将其与在溶剂或分散液中的有机或无机酸或碱接触，或通过与其它盐进行阴离子交换或阳离子交换。
本发明还包括本发明固定化合物的所有溶剂化物。
从实施例中可以看出，落入式(I)范围内的固定化合物显示与PARP蛋白结合，这使得它们在用于鉴定PARP相互作用化合物的检测方面成为有用的工具。
式(I)的优选固定化合物是其中含有的一个或多个残基具有以下给出的含义的那些固定化合物，这些固定化合物具有所有本发明主题的优选取代基定义的组合。关于式(I)的所有优选固定化合物，本发明还包括所有的互变异构形式和立体异构形式以及其任何比例的混合物。
在本发明的优选实施方式中，下述取代基独立地具有以下含义。因此，这些取代基的一个或多个可以具有以下给出的优选或更优选含义。
优选的是，R1a、R1b独立地选自由H、CH3和C2H5组成的组。在更优选的实施方式中，R1a、R1b至少之一是H。在还更优选的实施方式中R1a、R1b是H。
优选的是，R2是H；CH3；或C2H5。在更优选的实施方式中R2是CH3或C2H5，特别是C2H5。
优选的是，R3是卤素，特别是氯；或可选的被R5取代的C1-6炔基，
优选R5是OR6。
优选R6是H；或CH3。
还更优选R3是氯；或C≡C-C(CH3)2OH。
优选的是，m是1。优选的是，n是1。优选的是，n+m是2。
本发明式(I)的优选固定化合物选自由以下组成的组：
或二者的混合物，优选是以氢卤化物(hydrohalogenide)或羧酸盐，特别是作为盐酸盐或甲酸盐。
本发明的固定化合物可以通过本领域公知的方法制备。合成的示例性类似途径描述于图1。
本发明还涉及固定产物的制备方法，其中至少一种本发明的固定化合物固定于固相载体上。根据本发明方法能够获得的此类固定产物可例如用于鉴定PARP相互作用化合物的本发明的方法或用于诊断癌症的诊断方法。
根据本发明的方法，至少一种本发明的固定化合物固定在固相载体上。本发明全文中，术语“固相载体”涉及能够将小分子配体固定在其表面的每种不溶性载体。
根据本发明，术语“至少一种固定化合物”是指相同类型的至少一个固定化合物固定在固相载体上或一种或多种不同的固定化合物(它们中每一种可以是单数或复数个)固定在固相载体上。优选的是，将一种或两种不同的固定化合物固定在固相载体上，更优选的是本发明式(I)的优选固定化合物选自由以下组成的组中：
所述固相载体可以选自由琼脂糖、改性琼脂糖、琼脂糖珠(例如NHS-激活的琼脂糖)、胶乳、纤维素和铁磁性颗粒或亚铁磁性颗粒组成的组。
在固相载体是包括各种实体的材料的情况下，例如在固相载体包括几种珠或颗粒的情况下，本发明设想如果固定不同的固定化合物在每一单个实体上，例如在每一珠或颗粒上，固定一种或多种不同的固定化合物。因此，在使用两种固定化合物的情况下，本发明设想在每一单独实体上固定一种或多种不同的固定化合物。如果不采取在一个实体上仅固定一种不同的固定化合物的措施，非常可能在在每一单独实体上会存在所有不同的固定化合物。
本发明的固定化合物可以与固相载体共价或非共价地偶联。非共价结合包括经由与链亲和素基质结合的生物素亲和配体进行的结合。
优选的是，固定化合物与固相载体共价偶联。
用于将化合物固定在固相载体上的方法是本领域已知的，并且在实施例1中进一步例示。
通常，偶联前，所述基质可以包含诸如NHS、碳二亚胺等活性基团以使得能够与固定化合物进行偶联反应。所述固定化合物可以通过直接偶联(例如使用诸如氨基-、巯基-、羧基-、羟基、醛基-和酮基等官能团)和通过间接偶联(例如经由生物素，共价连接到本发明的固定产物的生物素和将生物素非共价结合至与固相载体直接结合的链亲和素)而偶联至固相载体。
与固相载体材料的键合可以包括可切割连接子和不可切割连接子。切割可以通过酶促切割或用合适的化学方法进行处理而实现。
因此，根据本发明的优选实施方式，所述固定产物由将本发明的至少一种固定化合物直接共价连接到固相载体而产生，或由将本发明的至少一种固定化合物通过连接子介导的连接到固相载体而产生。
所述连接子可以是C1-10亚烃基，该亚烃基可选地被选自由S、O、NH、C(O)O、C(O)和C(O)NH组成的组中的一种或多种原子或官能团打断，并且其中该连接子可选地被独立地选自由卤素、OH、NH2、C(O)H、C(O)NH2、SO3H、NO2和CN组成的组中的一种或多种取代基取代。
术语“C1-10亚烃基”是指具有1-10个碳原子的亚烃基链，例如亚甲基、亚乙基、-CH＝CH-，-C≡C-、正亚丙基等，其中碳原子的各氢可以被取代基取代。
术语“打断”是指一个或多个原子或官能团***到亚烃基链的两个碳原子之间或位于所述链的末端。
优选的是，所述固定经由上述式(I)中饱和环的环氮原子发生。更优选的是，所述氮原子是胺官能团的部分，以使得所述固定经由形成本发明的固定化合物或其混合物的酰胺键(amidbond)以及可选地固相载体的激活羧酸官能团发生。在固定步骤期间可能需要公知的保护基团技术。
本发明还涉及能够通过本发明方法获得的固定产物。
因此，通过本发明方法能够获得的固定产物为固定在固相载体上的固定化合物。以下将该固定产物称为本发明的固定产物，并可用于本发明的方法。
在优选的实施方式中，可以对本发明的固定化合物或固定产物进一步进行标记。
“标记”是指各物质直接或间接地被提供诸如放射性同位素、荧光标志、化学发光标志、肽或特异结合分子等检测信号的分子标记。特异结合分子包括诸如生物素和链亲和素、地高辛和抗地高辛等配对。所述标记可以直接或间接提供可检测的信号。所述标志还可以是能够用于酶片段互补检测(例如β-半乳糖苷酶片段互补；Zaman等，2006.Assay Drug Dev.Technol.4(4)：411-420)的肽。经标记的化合物不仅可用于成像技术，还可用于体外和体内检测，以用于例如在包含此类经标记化合物的PARP检测中通过抑制经标记化合物的结合来鉴定PARP相互作用化合物。
放射同位素通常用于检测各种生物分子的生物应用，并已经证明可用于在结合检测中。已经设计了几种实例的探针来导入3H(还写为氚T)，原因在于3H可以取代探针中的氢而不改变其结构。“同位素”或“放射性-标记的”化合物是其中一种或多个原子被原子质量或质量数与通常在自然中发现(例如天然存在)的原子的原子质量或质量数不同的原子替换或取代的本发明的化合物。可以导入本发明化合物中的合适的放射性核素包括但不限于2H(还写作氘D)、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、18F、35S、36Cl、82Br、75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I和131I。
荧光标志(例如荧光素、罗丹明、丹酰、NBD(硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑))、BODIPY(二吡咯亚甲基硼二氟化物)和花青(Cy)-染料)的选择指南和将上述荧光标志连接到小分子配体通常是本领域已知的。描述了用于高通量筛选(HTS)酶的检测中荧光探针(荧光团)的应用(Zaman等，2003.Comb.Chem.High Throughput Screen 6(4)：313-320)。荧光探针结合到靶蛋白后荧光性质的改变可以通过对例如荧光偏振、荧光共振能量转移或荧光寿命进行测定而确定。另外，可以使用ALPHAScreen技术，该技术中在680nm时供体珠的激发产生单线态氧，该单线态氧会扩散到经受化学发光反应的受体珠(Glickman等，2002.J.Biomol.Screen.7(1)：3-10)。
如上所讨论，本发明固定产物的一种可能应用是在鉴定PARP的情况下。因此，本发明还涉及此类方法和用途。
因此在本发明方法的第一方面，本发明涉及PARP相互作用化合物的鉴定方法，所述方法包括以下步骤：
a).提供包含PARP的蛋白制剂，
b).使所述蛋白制剂与本发明的固定产物在允许形成PARP和所述固定产物的复合物的条件下接触，
c).将所述复合物与给定的化合物一起温育，和
d).确定所述化合物是否能够从所述固定产物分离PARP。
在本发明方法的第二方面，本发明涉及PARP相互作用化合物的鉴定方法，所述方法包括以下步骤：
a).提供包含PARP的蛋白制剂，
b).使所述蛋白制剂与本发明的固定产物在允许形成PARP和所述固定产物的复合物的条件下接触，和
c).检测步骤b)中形成的复合物。
在本发明方法的第三方面，本发明涉及PARP相互作用化合物的鉴定方法，所述方法包括以下步骤：
a).提供两等份的包含PARP的蛋白制剂，
b).使一等份蛋白制剂与本发明的固定产物在允许形成PARP和所述固定产物的复合物的条件下接触，
c).使另一等份蛋白制剂与所述固定产物以及与给定化合物在允许形成所述复合物的条件下接触，和
d).确定步骤b)和c)中形成的所述复合物的量。
在本发明方法的第四方面，本发明涉及PARP相互作用化合物的鉴定方法，所述方法由以下步骤组成：
a)提供各自包括至少一个包含PARP的细胞的两等份试样，
b)将一等份试样与给定化合物温育，
c)收获各等份试样的细胞，
d)对所述细胞进行裂解从而获得蛋白制剂，
e)使所述蛋白制剂与本发明的固定产物在允许形成PARP和所述固定产物的复合物的条件下接触，和
f)确定步骤e)的各等份试样中形成的复合物的量。
根据本发明，术语“PARP”表示PARP家族(例如PARP1、PARP2、PARP3、PARP4(VPARP)、PARP5a(端锚聚合酶(tankyrase)1)、PARP5b(端锚聚合酶2)、PARP5c(端锚聚合酶3)、PARP6、PARP7(TiPARP)、PARP8、PARP9(Bal)、PARP10、PARP11、PARP12、PARP13、PARP14、PARP15、PARP16)的一个或多个，特别是所有成员(Ame等，2004.Bioessays26(8)：882-93)。然而，整个本发明中，优选PARP是指PARP1，PARP10，PARP14，PARP15或PARP16，特别是其人类同工型。整个本发明中，术语“同工型”也包括PARP家族成员。
根据本发明，术语“PARP”涉及该家族的人类和其它蛋白。该表述特别包括其功能活性衍生物或其功能活性片段或其同源物或由在低严谨条件下与编码所述蛋白的核酸杂交的核酸编码的变体。优选的是，这些低严谨条件包括在包括35％甲酰胺、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.02％PVP、0.02％BSA，100ug/ml变性鲑精DNA和10％(wt/vol)右旋糖酐硫酸酯的缓冲液中在40℃下杂交18-20小时，在由2X SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mM EDTA和0.1％SDS组成的缓冲液中在55℃下洗涤1-5小时，并在由2X SSC、25mMTris-HCl(pH 7.4)5mM EDTA和0.1％SDS组成的缓冲液中在60℃下洗涤1.5小时。
在本发明情况下鉴定出的化合物可以是PARP(参见上文)的一种、一些或所有同工型的配体。
在本发明的某些方面，首先提供了包含PARP的蛋白制剂。本发明的方法可以以任何蛋白制剂作为起始材料进行，只要所述PARP在所述制剂中是可溶的。实例包括几种蛋白的液体混合物、细胞裂解物、不包含原始细胞中存在的所有蛋白的部分细胞裂解物或几种细胞裂解物的组合。术语“蛋白制剂”还包括溶解的纯化蛋白。
目的蛋白制剂中PARP蛋白的存在可以在用特异性针对PARP的抗体作为探针的Western印迹上进行检测。在PARP是特定同工型(例如PARP1)的情况下，所述同工型的存在可以通过同工型-特异性抗体来确定。此类抗体是本领域已知的(Cheong等，2003.Clin.Cancer.Res.9(13)：5018-27；Ame等，1999.J.Biol.Chem.274(25)：17860-17868)。作为选择，质谱(MS)也可用于检测PARP，特别是PARP的同工型(参见下文)。
细胞裂解物或部分细胞裂解物可通过首先分离细胞器(例如细胞核、线粒体、核糖体、高尔基体等)然后制备源自这些细胞器的蛋白制剂而获得。分离细胞器的方法是本领域已知的。另外，已经描述了细胞裂解物的制备方法(Dantzer等，2006.Methods in Enzymology 409，493-510)。
另外，蛋白制剂可以通过对细胞提取物进行分级分离，由此富集诸如细胞质蛋白或膜蛋白等特定类型的蛋白而制备。
此外可以使用来自体液(例如血液、脑脊髓液、腹膜液和尿)的蛋白制剂。
例如可以使用源自诸如线虫(C.elegans)等模型生物体的规定发育阶段或成体阶段的全胚胎裂解物。另外，诸如从小鼠切下的心脏等全器官可以是蛋白制剂的来源。可以对这些器官进行体外灌注以获得蛋白制剂。
此外，所述蛋白制剂可以是包含重组生产的PARP的制剂。原核细胞和真核细胞中重组蛋白的生产方法已广泛地建立(Ame等，1999.J.Biol.Chem.274(25)：17860-17868)。
在本发明方法的优选实施方式中，蛋白制剂的提供包括收获至少一个包含PARP的细胞和对所述细胞进行裂解的步骤。
用于该目的的合适细胞例如是表达PARP家族的成员的那些细胞或组织。
因此，在优选的实施方式中，从外周血分离的细胞代表合适的生物材料。从外周血(PBLs)获得的人类淋巴细胞和淋巴细胞亚群的制备和培养方法是众所周知的(W.E Biddison，第2.2章“Preparation andculture of human lymphocytes”in Current Protocols in CellBiology，1998，John Wiley&Sons，Inc.)。例如，密度梯度离心是从其它血细胞群体(例如红细胞和粒细胞)分离淋巴细胞的方法。人类淋巴细胞亚群可以经由可以被单克隆抗体识别的其特异细胞表面受体而分离。物理分离法包括将这些抗体试剂偶联到允许对被这些抗体结合(阳性选择)的细胞进行富集的磁珠。可以对分离的淋巴细胞进行进一步培养并通过添加细胞因子进行刺激，从而引发受体-介导的信号传导和随后STAT蛋白的磷酸化(Schindler等，2007.282(28)：20059-20063)。
作为起始人类细胞的备选方案，可以使用培养的细胞系(例如MOLT-4细胞，Jurkat或Ramos细胞)。
在优选的实施方式中，所述细胞可以是细胞培养***的部分，并且从细胞培养***中收获细胞的方法是本领域已知的(上文的文献)。
细胞的选择主要取决于PARP的表达，因为必须确保所述蛋白主要存在于所选择的细胞中。为了确定给定细胞是否是用于本发明方法的合适起始***，例如Western印迹、基于PCR的核酸检测方法、Northern印迹和DNA微阵列方法(“DNA芯片”)等方法可能是合适的，从而确定给定的目的蛋白是否存在于所述细胞中。
细胞的选择还受研究目的影响。如果给定药物的体内功效需要进行分析，那么可以选择其中出现所期望治疗效果的细胞或组织(例如B-细胞)。相反，为了说明介导不想要副作用的蛋白靶，可以分析其中观察到副作用的细胞或组织(例如心肌细胞、血管平滑肌或上皮细胞)。
此外，本发明应该设想包含PARP的细胞可以从生物体，例如通过活组织检查获得。相应的方法是本领域已知的。例如，活组织检查是用于获得少量组织的诊断方法，该组织然后可以用显微镜检查或用生化方法进行检查。活组织检查不仅对疾病的诊断、分离和分阶段是重要的，而且对于评价和监视药物治疗也是重要的。
本发明还设想通过收获至少一种细胞，同时地进行裂解。然而，同样优选的是首先收获细胞，然后分别进行裂解。
裂解细胞的方法是本领域已知的。不同细胞类型和组织的裂解可以通过匀化器(例如Potter-匀化器)、超声粉碎机、酶促裂解、洗涤剂(例如NP-40，Triton X-100，CHAPS，SDS)、渗透压冲击、重复冷冻和解冻或这些方法的组合而实现。
根据本发明方法，使包含PARP的蛋白制剂与所述固定产物在允许形成PARP和本发明的固定产物的复合物的条件下接触。
在本发明中，术语“PARP和固定产物的复合物”表示其中固定产物例如通过共价结合或最优选通过非共价结合与PARP相互作用的复合物。
技术人员会知道可以应用哪一种条件以使得能够形成所述复合物。
在本发明的情况下，术语“允许形成复合物的条件”包括有可能进行此类形成，优选此类结合的所有条件。这包括可以将固相载体置于固相上并将裂解物倒在其上。在另一优选实施方式中，还包括固相载体为微粒的形式，并且与细胞裂解物混合。
在非共价结合的情况下，固定产物和PARP之间的结合为例如经由盐桥、氢键、疏水性相互作用或其组合。
在优选实施方式中，所述复合物的形成步骤在基本上生理条件下进行。细胞内蛋白的物理状态描述于Petty，1998(Howard R.Petty，Chapter 1，Unit 1.5 in：Juan S.Bonifacino，Mary Dasso，JoeB.Harford，Jennifer Lippincott-Schwartz，and Kenneth M.Yamada(eds.)Current Protocols in Cell Biology Copyright
Figure BPA00001256077200141
2003 JohnWiley&Sons，Inc.All rights reserved.DOI：10.1002/0471143030.cb0101s000nline Posting Date：May，2001Print Publication Date：October，1998)。
在基本上生理条件下接触的优点在于固定产物、包含PARP的细胞制剂和可选的化合物之间的相互作用尽可能地反映天然条件。“基本上生理条件”特别是在原始、未处理的样品材料中存在的那些条件。它们包括生理蛋白浓度、pH、盐浓度、缓冲容量和涉及蛋白的翻译后修饰。术语“基本上生理条件”不需要与样品源自的来源活生物体相同的条件，但需要基本上类似细胞的条件或与细胞条件接近的条件。当然，本领域技术人员会意识到由于实验设置可出现某些障碍，从而最后导致较不类似的细胞条件。例如，当从活生物体取样和对样品进行加工时细胞壁或细胞膜的最后所需破坏可能需要与生物体中发现的生理条件不相同的条件。实施本发明方法的生理条件的合适改变对本领域技术人员而言是明显的，并且包括在本文所用术语“基本上生理条件”之内。总之，应该理解术语“基本上生理条件”涉及与例如天然细胞中发现的生理条件接近的条件、但不需要这些条件相同。
例如“基本上生理条件”可以包括50-200mM NaCl或KCl，pH6.5-8.5，20-37℃和0.001-10mM二价阳离子(例如Mg++，Ca++，)；更优选为约150m NaCl或KCl，pH 7.2-7.6，5mM二价阳离子，并经常包括0.01-1.0％的非特异性蛋白(例如BSA)。非离子洗涤剂(Tween，NP-40，Triton-X100)可以通常以约0.001-2％、通常0.05-0.2％(体积/体积)存在。作为通常的指南，以下缓冲水性条件可以是适用的：10-250mM NaCl，5-50mM Tris HCl，pH5-8，具有可选添加的二价阳离子和/或金属螯合剂和/或非离子洗涤剂。
优选的是，“基本上生理条件”是指pH为6.5-7.5，优选为7.0-7.5，和/或缓冲液浓度为10-50mM，优选为25-50mM，和/或单价盐(例如Na或K)的浓度为120-170mM，优选为150mM。二价盐(例如Mg或Ca)可以进一步以1-5mM，优选1-2mM的浓度存在，其中更优选所述缓冲液选自由Tris-HCl或HEPES组成的组。
技术人员会意识到本发明的各步骤之间，洗涤步骤可能是需要的。此类洗涤是本领域技术人员知识中的一部分。洗涤用于从固相载体除去细胞裂解物中的未结合成分。通过添加低浓度的洗涤剂或通过对洗涤缓冲液中的盐浓度进行适度调整可以减少非特异性(例如简单的离子性)结合相互作用。
根据本发明的鉴定方法，读出***为检测或确定PARP(本发明的第一方面)，检测PARP和固定产物的复合物(本发明的第二方面)，或确定PARP和固定产物的复合物的量(本发明的第二方面、第三方面和第四方面)。
在根据本发明第一方面的方法中，分离的PARP量的检测或确定优选指示所述化合物能够从固定产物分离PARP的事实。该能力表示各化合物与PARP相互作用，优选与PARP结合，这表示其治疗潜力。
在根据本发明第二方面的方法的一种实施方式中，检测本发明方法期间形成的复合物。形成此类复合物的事实优选指示所述化合物不完全地抑制复合物的形成。另一方面，如果不形成复合物，所述化合物可能是PARP的强相互作用因子，这表示其治疗潜力。
根据本发明第二方面、第三方面和第四方面的方法，确定所述方法期间形成的复合物的量。通常，在各化合物存在下形成的复合物越少，各化合物与PARP的相互作用越强，这表示其治疗潜力。
根据本发明的第二方面形成的复合物的检测可以通过使用针对PARP的标记抗体和合适的读出***而进行。
根据本发明第二方面的优选实施方式，通过确定其量来检测PARP和固定产物的复合物。
在本发明第二方面、第三方面和第四方面方法的过程中，优选将PARP从固定产物分离从而确定所述复合物的量。
根据本发明，分离意味着破坏固定化合物和PARP之间相互作用的每一作用。在优选实施方式中这包括从固定化合物洗脱PARP。
洗脱可以通过使用以下详细所述的非特异性试剂(离子强度、pH值、洗涤剂)而实现。另外，可以测试目的化合物是否能够从固定化合物特异性洗脱PARP。此类PARP相互作用化合物进一步描述于以下部分。
用于破坏相互作用的此类非特异性方法大体上是本领域已知的，并且取决于配体酶相互作用的性质。大体上，离子强度、pH值、温度的变化或与洗涤剂进行温育是从经固定的配体分离靶酶的合适方法。洗脱缓冲液的应用可以通过pH值的极值(高pH或低pH；例如通过使用pH2-3的0.1M柠檬酸盐降低pH)、离子强度的变化(例如使用NaI、KI、MgCl2或KCl的高盐浓度)、破坏疏水性相互作用的极性减少剂(例如二恶烷或乙二醇)或变性剂(离液盐或诸如十二烷基硫酸钠SDS等洗涤剂)分离结合伴侣。
在某些情况下，优选固相载体必须从所释放材料分离。用于此的各方法取决于固相载体的性质并且是本领域已知的。如果载体材料包含于柱内，所释放材料可以作为柱流过物质(column flowthrough)而收集。在载体材料与裂解组分混合的情况下(所谓的批次方法(batchprocedure))，诸如温和的离心等另外的分离步骤可能是必须的，并且所释放材料可以作为上清液而收集。作为选择可以使用磁珠作为固相载体，以使得可以通过使用磁性装置从样品消除所述珠。
在根据本发明第一方面方法的步骤d)中，可以确定PARP是否已经从本发明的固定产物分离。这可以包括检测PARP或确定PARP的量。
因此，至少在本发明所有鉴定方法的优选实施方式中，使用用于检测分离的PARP的方法或用于确定其量的方法。此类方法是本领域已知的，并且包括诸如蛋白测序(例如Edmann降解)、通过质谱法进行分析或使用针对PARP的抗体的免疫检测法等物理-化学方法。
整个本发明中，如果使用抗体来检测PARP或来确定其量(例如经由ELISA)，技术人员会理解如果要检测PARP的特定同工型或如果要确定PARP的特定同工型的量，可以使用同工型-特异性抗体。如上指出，此类抗体是本领域已知的。此外，技术人员会知道用于生产其的方法。
例如，可以使用针对PARP2且不与其它PARP家族成员交叉作用的抗体来特异性检测PARP2(Ame等，1999.J.Biol.Chem.274(25)：17860-17868)。
作为选择，如实施例2中所述，可以通过质谱法来检测PARP的几种同工型。
优选的是，通过质谱法或免疫检测法来检测PARP或确定PARP的量。
使用质谱分析(质谱法)鉴定蛋白是本领域已知的(Shevchenko等，1996.Analytical Chemistry 68：850-858)并且进一步描述于实施例部分。
优选的是，以定量方式例如通过使用iTRAQ技术(针对相对和绝对定量的同量异位(isoberic)标志)或cICAT(可切割同位素-编码亲和标记)(Wu等，2006.J.Proteome Res.5，651-658)来进行质谱分析。
根据本发明的进一步优选实施方式，通过鉴定PARP的蛋白典型肽(proteotypic peptide)进行通过质谱法(MS)的表征。该想法是用蛋白酶消化PARP并通过MS确定所得的肽。结果，对于相同来源蛋白的肽，肽频率有很大程度的差异，将“典型地”有助于鉴定该蛋白的最高频率观察到的肽命名为“蛋白典型肽”。因此，本发明中所使用的蛋白典型肽为独特地鉴定特定蛋白或蛋白同工型的实验上可良好观察到的肽。
根据优选实施方式，通过将在实施本发明方法过程中获得的蛋白典型肽与已知的蛋白典型肽进行比较来进行所述表征。因此，当使用通过用于鉴定MS中蛋白的蛋白酶消化而制备的片段时，通常对于给定的酶观察到相同的蛋白典型肽，并且可以将对于给定样品获得的蛋白典型肽与对于给定类型的酶而言已知的蛋白典型肽进行比较，由此鉴定样品中存在的酶。
作为质谱分析的备选方案，可以通过使用针对PARP(或针对PARP的同工型，参见上文)的特异性抗体来检测洗脱的PARP(包括共同洗脱的结合伴侣或支架蛋白)或来确定其量。
此外，在另一优选实施方式中，一旦通过质谱分析已经建立了共同洗脱结合伴侣的身份，可以使用针对该蛋白的特异性抗体来检测各结合伴侣。
合适的基于抗体的检测包括但不限于Western印迹、ELISA检测、三明治ELISA检测和抗体阵列或其组合。所述检测的建立是本领域已知的(第11章，Immunology，第11-1-11-30页：Short Protocols inMolecular Biology.第四版，由F.M.Ausubel等编辑，Wiley，NewYork，1999)。
这些检测不仅可以以对目的PARP相互作用蛋白(例如PARP复合物的催化亚基或调节亚基)进行检测和定量的方式进行构建，还可以分析诸如磷酸化、泛素修饰化或聚(ADP)核糖基化等翻译后修饰模式的方式进行构建(Affar等，1999.Biochimica et Biophysica Acta 1428，137-146)。
另外，本发明的鉴定方法包括使用测试其作为PARP相互作用化合物的能力的化合物。
大体上，根据本发明，此类化合物可以是能够例如通过抑制PARP与本发明固定产物的结合而与PARP相互作用的每一分子。优选的是，所述化合物对PARP具有作用，例如刺激作用或抑制作用。
优选的是，所述化合物选自由合成或天然存在的化学化合物或有机合成药，更优选小分子有机药，或天然小分子化合物组成的组。优选的是，从包含此类化合物的文库鉴定所述化合物。然后，在本发明的过程中，对此类文库进行筛选。
此类小分子优选不是蛋白或核酸。优选的是，小分子显示的分子量小于1000Da，更优选低于750Da，最优选小于500Da。
根据本发明的“文库”涉及(许多)不同的化学实体的(主要是大的)集合，所述化学实体以能够对不同的个体实体进行快速功能分析(筛选)和同时为形成文库的个体实体提供快速鉴定的分选方式提供。实例是在包含化学化合物的表面上的试管或孔或斑点的集合，其中可以将所述化合物加入到以高通量方式进行的与一种或多种规定的潜在相互作用伴侣的反应中。鉴定出两种伴侣的所期望“阳性”相互作用后，由于文库构建可以对各化合物进行快速鉴定。合成来源和天然来源的文库可以购买或由技术人员设计。
文库构建的实例是本领域已知的，其中使用对于组合文库的设计而言为生物上经验证的起点的天然产物，因为它们具有经证明的生物相关性的记录。天然产物在药物化学和化学生物学中的该特定作用可以用关于通过结构生物学和生物信息学获得的蛋白的结构域结构的新观点来解释。为了满足结构域家族内各结合袋的特定要求，需要通过化学变化对天然产物结构进行优化。据称固相化学是用于该优化方法的有效工具。过去具有各种结构和“药物-样”性质的小分子的集合通过以下几种手段获得：通过之前的内部先导优化成果的档案，通过从化合物卖主购买和通过在公司合并后分开的集合的合并。虽然高通量/组合化学描述为新领先一代的方法中的重要组成，用于合成的文库设计的选择和随后文库成员的设计发展到新水平的挑战和重要性。针对多种生物目的对多种小分子化合物文库设计进行筛选的潜在益处为发现新的先导结构提供了实质上的机遇。
在本发明第二方面和第三方面的优选实施方式中，首先将包含PARP的蛋白制剂与化合物一起温育，然后与固定产物一起温育。然而，所述化合物和本发明固定产物以及包含PARP的蛋白制剂的同时温育(共温育)同样也是优选的(竞争性结合检测)。
在首先与所述化合物进行温育的情况下，优选首先将PARP与所述化合物在4℃-37℃，更优选4℃-25℃，最优选4℃的温度下一起温育10-60分钟，更优选温育30-45分钟。优选的是以1nM-100μM，优选10nM-10μM的浓度使用化合物。第二步，与固定配体接触，优选在4℃下进行10-60分钟。
在同时温育的情况下，优选首先将PARP与所述化合物和本发明的固定产物在4℃-37℃，更优选4℃-25℃，最优选4℃的温度下一起同时温育30-120分钟，更优选温育60-120分钟。优选的是以1nM-100μM，优选10nM-10μM的浓度使用化合物。
此外，本发明第二方面的步骤a)-c)可以使用几种蛋白制剂进行以测试不同的化合物。该实施方式在中(medium)或高通量筛选(参见下文)的情况下特别令人感兴趣。
在根据第三方面或第四方面的本发明方法的优选实施方式中，将在步骤c)中形成的复合物的量与步骤b)中形成的量进行比较。
在根据第三方面或第四方面的本发明方法的优选实施方式中，在步骤c)中形成的复合物的量相对于步骤b)中形成的复合物的量减少表示PARP是所述化合物的靶。这来自于本发明该方法的步骤c)中，所述化合物与配体就与PARP进行结合发生竞争。如果在与所述化合物一起温育的等份试样中存在的PARP较少，这意味着优选的是所述化合物与抑制剂就与酶进行相互作用而发生竞争，因此，是所述蛋白的直接靶，反之亦然。
优选的是，本发明的鉴定方法作为中或高通量筛选进行。
根据本发明鉴定出的相互作用化合物可以通过确定其对PARP是否具有作用，例如对PARP的酶促活性是否具有作用来进一步表征(Dantzer等，2006.Methods in Enzymology 409，493-510)。
简言之，PARP酶活性(自体聚-ADP-核糖基化)可以例如通过在合适的缓冲液中将纯化PARP与DNA酶I处理的DNA和[32P]-NAD于室温下进行温育来测定。该反应通过添加三氯乙酸(TCA)而终止，然后通过玻璃微纤维进行过滤，由此反应产物聚ADP-核糖保留在过滤器中。对所述过滤器进行洗涤、干燥，并用液体闪烁计数器测定放射活性的量(Dantzer等，2006.Methods in Enzymology 409，493-510)。
可以对根据本发明鉴定出的化合物进一步进行优化(先导优化)。由于在这些先导代文库中编码的结构-活性关系(SAR)信息，对此类化合物进行的该随后优化通常是加速的。由于用于跟踪合成的高通量化学(HTC)法的容易适用性，先导优化通常是有利的。
本发明还涉及药物组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
a)鉴定如上所述的PARP相互作用化合物，和
b)将所述相互作用化合物配制到药物组合物中。
因此，本发明提供了药物组合物的制备方法，所述药物组合物可以以有效量施用至受试对象。在优选方面，对治疗剂(the therapeutic)进行充分地纯化。要治疗的受试对象优选是动物，所述动物包括但不限于诸如牛、猪、马、鸡、猫、狗等动物，并优选是哺乳动物，最优选是人类。在具体实施方式中，非人类哺乳动物是受试对象。
根据本发明鉴定出的化合物可用于预防或治疗其中PARP起作用的疾病(例如用于癌症的PARP1抑制剂)。因此，本发明还涉及通过本发明方法鉴定出的化合物在制备用于治疗一种或多种上述疾病的药物中的用途。此外，本发明涉及包括所述化合物的药物组合物。
通常，本发明的药物组合物包括治疗有效量的治疗剂和药学上可接受的载体。在具体实施方式中，术语“药学上可接受”是指由联邦或国家政府的管理机构批准或在美国药典或其它公认的药典中列出用于动物，更具体而言，用于人类。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂。此类药学上的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的液体，包括但不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当口服施用药物组合物时水是优选的载体。当静脉内地施用药物组合物时盐水和水性右旋糖是优选的载体。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液优选用作用于可注射液的液体载体。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇(propylene，glycol，)、水、乙醇等。如果需要，所述组合物还可以包含少量的增湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采取的形式为溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末剂、缓释制剂等。所述组合物可以用常规的粘合剂和诸如甘油三酸酯等载体配制成栓剂。口服剂型可以包括诸如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等标准载体。合适的药物载体的实例描述于由E.W.Martin编著的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″。此类组合物会包含治疗有效量的治疗剂(优选为纯化形式)、以及合适量的载体，从而提供适正确施用至患者的形式。所述制剂应该适合于施用方式。
在优选实施方式中，根据例行方法将所述组合物配制成适合对人类静脉内施用的药物组合物。通常而言，静脉内施用的组合物为在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。需要的话，所述组合物还可以包括增溶剂和诸如利多卡因等局部麻醉剂，以在注射位置缓解疼痛。通常而言，所述成分可以单独供应，或以单位剂型的形式混合在一起，例如作为在诸如并标出活性剂的量的安瓿或小袋(sachette)等密封容器内的干燥冻干粉末或无水浓缩物。当通过输注施用所述组合物时，可以将其用含有无菌药物级的水或盐水的输注瓶进行配送。当通过注射施用所述组合物时，可以提供以安瓿计的注射用无菌水或盐水从而在施用之前可以使所述成分混合。
本发明的治疗剂可以配制成中性形式或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离羧基形成的盐，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐；与游离氨基形成的盐，例如衍生自异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组胺、普鲁卡因等的盐；以及衍生自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁等的盐。
在治疗特定疾病或状况中有效的本发明治疗剂的量会取决于疾病或状况的性质，并且可以通过标准的临床技术确定。另外，可以可选地使用体外检测来帮助鉴定最佳的剂量范围。制剂中要使用的精确剂量也取决于施用途径、疾病或障碍的严重性，并且应该根据从业者和各患者情况来决定。然而，静脉内施用的合适剂量范围通常为约20-500微克活性化合物每千克体重。鼻内施用的合适剂量范围通常为约0.01pg/kg体重～1mg/kg体重。可以从源自体外或动物模型测试***的剂量-相应曲线推断有效剂量。通常，栓剂可以包含0.5％-10％重量的活性成分，口服制剂优选包含10％-95％的活性成分。
各种递送***是已知的，并且可以用于施用本发明的治疗剂，例如封装在脂质体、微粒和微胶囊中：使用能够表达治疗剂的重组细胞、使用受体-介导的胞吞作用；构建治疗性核酸作为逆转录病毒或其它载体的部分等。导入方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述化合物可以通过任何常规途径，例如通过输注、通过弹丸注射、通过经由上皮或粘膜与皮肤内衬(例如口腔、直肠和消化道黏膜等)施用，并且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。另外，可以期望通过任何合适的途径(包括心室内和鞘内注射)将本发明的药物组合物导入到中枢神经***，心室内注射可以受例如附着到诸如Ommaya库等库(reservoir)的心室内导管促进，。还可以例如借助于吸入器或喷雾器以及具有喷雾剂(aerosolizing agent)的制剂来应用肺施用。
在具体实施方式中，可以期望将本发明的药物组合物局部施用到需要治疗的区域。这可以通过例如但不旨在限制的手术期间的局部输注、例如与手术后创伤敷料结合的局部施用、通过注射、借助于导管、借助于栓剂、或借助于植入物来实现，所述植入物为多孔、非多孔或凝胶状材料，包括膜，例如唾液腺膜，或纤维。在一种实施方式中，可以在恶性肿瘤或瘤或前瘤组织的位点(或旧址(former site))处通过直接注射进行施用。
本发明还涉及PARP的纯化方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含PARP的蛋白制剂，
b)使所述蛋白制剂与本发明的固定产物在允许形成PARP和固定产物的复合物的条件下接触，和
c)从所述固定产物分离PARP。
如上所述，已经令人惊奇地发现，本发明的化合物以及进而本发明的固定产物是识别PARP蛋白的配体。这能够使得PARP蛋白的纯化方法有效。
关于PARP、包含PARP的蛋白制剂、用于与本发明固定产物接触的条件、本发明的固定产物、PARP和本发明的固定产物的复合物、从本发明的固定产物分离PARP和检测PARP或确定其量，用于本发明鉴定方法的如上定义的实施方式也适用于本发明的纯化方法。
在优选实施方式中，纯化方法还包括纯化PARP的特定同工型的步骤。
优选的是，使用如上解释的同工型特异性抗体进行所述纯化。
在优选实施方式中，本发明的纯化方法在步骤c)之后包括鉴定能够与PARP结合的蛋白。当在基本上生理条件下进行蛋白复合物的形成时，这特别令人感兴趣，原因在于然后可以保持所述酶的天然条件，该天然条件包括结合伴侣的存在、酶亚基或翻译后修饰，然后这些可以在质谱(MS)的帮助下进行鉴定。
因此，在优选实施方式中，本发明的纯化方法还在步骤c)之后包括确定PARP是否被进一步翻译后修饰，例如通过泛素修饰或通过聚(ADP)-核糖基化。
可以如上所述确定结合蛋白或翻译后修饰以用于检测PARP或确定PARP的量。优选的是，所述方法包括如上所述的免疫检测方法的质谱分析。
本发明还涉及确定样品中PARP的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供预期包含PARP的蛋白制剂，
b)使所述蛋白制剂与本发明的固定产物在允许形成PARP和固定产物的复合物的条件下接触，和
c)检测PARP是否与所述固定产物形成复合物。
在本发明的优选实施方式中，通过从所述固定产物分离PARP和进一步鉴定PARP而进行步骤c)中的所述检测。
可以通过如上所述的质谱或免疫检测法进行所述鉴定。
关于PARP、包含PARP的蛋白制剂、用于与本发明固定产物接触的条件、本发明的固定产物、本发明的PARP和固定产物的复合物、从本发明的固定产物分离PARP和检测PARP或确定其量，用于本发明鉴定方法的如上定义的实施方式也适用于本发明的纯化方法。
本发明还涉及本发明的化合物或固定产物在鉴定PARP相互作用化合物和在纯化PARP蛋白中的用途。如上定义的实施方式还适用于本发明的用途。
本发明还涉及包括本发明化合物或固定产物的试剂盒。此类试剂盒对于执行本发明的方法是特别有用的。所述试剂盒的其它成分可以是用于检测PARP蛋白的抗体，例如对PARP1具有特异性的抗体和针对PARP蛋白的磷酸化位点的抗体。此类抗体及其用途是本领域已知的，并且它们可以商业上获得(Cheong等，2003.Clin.Cancer.Res.9(13)：5018-27；Ame等，1999.J.Biol.Chem.274(25)：17860-17868)。另外，所述试剂盒可以包含针对聚-ADP-核糖的抗体(Affar等，1999.Biochimica et Biophysica Acta 1428，137-146；Kawamitsu等，1984.Biochemistry 23(16)：3771-3777)。此外，所述试剂盒可以包含其它助剂成分，例如缓冲液，用于检测抗体的装置、阳性对照等。此类成分是本领域已知的。
通过附图和实施例进一步描述本发明，不认为其限制本申请权利要求赋予的保护范围。在以下实施例使用术语“亲和基质”的情况下，该术语是指本申请中定义的固定产物。
附图说明
图1：用于合成4-(2-(4-氨基-1，2，5-恶二唑-3-基)-1-乙基-7-(哌啶-4-基甲氧基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-基)-2-甲基丁-3-炔-2-醇(XIII)和4-(4-氯-1-乙基-7-(哌啶-4-基甲氧基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-1，2，5-恶二唑-3-胺(XIV)的反应方案。如实施例1所述合成所述化合物。步骤a)Br2，H2O，室温(rt)然后50℃；b)POCl3，NN-二乙苯胺，0℃然后回流；c)乙胺，室温；d)HCl浓缩(conc)，SnCl2，回流；e)氰基乙酸，EDC，DCM，N-甲基吗啉，室温；f)乙酸，100℃；g)NaNO2，室温；h)羟胺，Et3N，二恶烷，回流；i)异丙基氯化镁，B(OMe)3，H2O2，-78℃；j)叔丁基4-(溴甲基)哌啶-1-羧酸酯，CsCO3，DMF，40℃；k)2-甲基-3-丁炔-2-醇，四(三苯基膦)钯；(0)，Zn，NaI，DBU，DMSO，80℃；1)4N HCl的二恶烷溶液，MeOH。
图2：4-(2-(4-氨基-1，2，5-恶二唑-3-基)-1-乙基-7-(哌啶-4-基甲氧基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-基)-2-甲基-3-丁炔-2-醇(XIII)的结构
图3：4-(4-氯-1-乙基-7-(哌啶-4-基甲氧基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-1，2，5-恶二唑-3-胺(XIV)的结构。
图4：使用固定化合物XIII的药物牵出实验。
显示用考马斯亮蓝染色后的蛋白凝胶。使用包含50mg蛋白的Jurkat和Ramos细胞裂解物的1∶1混合物，如实施例2中所述进行牵出实验。用SDS样品缓冲液对与亲和基质结合的蛋白进行洗脱，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。将所指出的区域切下作为凝胶切片，将蛋白用胰蛋白酶处理，并通过质谱法进行分析。
图5：使用固定化合物XIV的药物牵出实验。
显示用考马斯亮蓝染色后的蛋白凝胶。使用包含50mg蛋白的Jurkat和Ramos细胞裂解物的1∶1混合物，如实施例2中所述进行牵出实验。用SDS样品缓冲液对与亲和基质结合的蛋白进行洗脱，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。将所指出的区域切下作为凝胶切片，将蛋白用胰蛋白酶处理，并通过质谱法进行分析。
图6：人类PARP1(IPI00449049.5)的氨基酸序列。使用固定化合物XIII进行药物牵出实验后通过质谱法鉴定出的肽以粗体显示并加下划线。
图7：人类PARP10(IPI00064457.3)的氨基酸序列。使用固定化合物XIII进行药物牵出实验后通过质谱法鉴定出的肽以粗体显示并加下划线。
图8：人类PARP14(IPI00291215.5)的氨基酸序列。使用固定化合物XIII进行药物牵出实验后通过质谱法鉴定出的肽为粗体并加有下划线。
图9：人类PARP15(IPI00166182.3)的氨基酸序列。使用固定化合物XIII进行药物牵出实验后通过质谱法鉴定出的肽为粗体并加有下划线。
图10：人类PARP16(IPI00297151.3)的氨基酸序列。使用固定化合物XIII进行药物牵出实验后通过质谱法鉴定出的肽为粗体并加有下划线。
实施例
实施例1固定化合物和固定产物(亲和基质)的制备
该实施例描述化合物的合成和使其固定在固相载体上的方法，产生在以下实施例中使用的固定产物(亲和基质)，以用于捕获来自细胞裂解物的PARP蛋白。化合物的合成描述于合成方案1(图1)。
3-溴-5-硝基吡啶-4-醇(II)的合成
在室温下向4-羟基-3-硝基吡啶(I)(7.0g，50mmol)在水(50ml)中的悬浮液逐滴添加溴化物(3.23ml，63mmol)。将所得混合物搅拌1小时然后在50℃下加热2小时。冷却至室温并且另外搅拌1小时后，对产物进行过滤，用冷水洗涤并在真空下干燥3天，从而产生作为白色固体的期望产物(8.35g，76％)。LCMS Rt＝0.45mn，无显著的MS痕迹(no significant MS trace)。
3-溴-4-氯-5-硝基吡啶(III)的合成
向在冰中冷却的磷酰氯(50ml)中缓慢添加3-溴-5-硝基吡啶-4-醇(6.57g，30mmol)。在0℃下将所得的悬浮液搅拌，并逐滴添加N，N-二乙苯胺(4.77ml，30mmol)。在室温下对所得混合物进行加热，然后回流2小时。在真空下浓缩所得黑色溶液，并将残留物倒在冰上。用醚(200ml)提取所述混合物。有机层用水洗涤2次，用盐水洗涤，并在MgSO4上干燥。过滤后，除去溶剂，从而产生作为褐色油的期望化合物，当进一步干燥后所述油固化(6.46g，85％)，LCMS Rt＝3.18mn，无显著的MS痕迹。
3-溴-N-乙基-5-硝基吡啶-4-胺(IV)的合成
向3-溴-4-氯-5-硝基吡啶(6.45g，25.4mmol)的THF溶液(19ml)缓慢地添加乙胺水溶液(70％溶液，101mmol，13ml)。在室温下对所述溶液搅拌3小时，然后倒在水中。用乙酸乙酯提取所得溶液2次。用盐水对有机层进行洗涤，然后在MgSO4上干燥。除去溶剂。通过快速色谱(乙酸乙酯-己烷1∶9-3∶7)对粗产物进行纯化，从而产生作为褐色油的期望化合物(5.45g，92％)LCMS Rt＝2.82mn[M+H]+＝246-248。
5-溴-2-氯-N4-乙基吡啶-3，4-二胺(V)的合成
将3-溴-N-乙基-5-硝基吡啶-4-胺(4.68g，19mmol)溶解于浓盐酸(47ml)中并在85℃下加热。在一部分添加氯化锡(10.8g，57mmol)。在回流下对反应物加热1小时，然后冷却至室温过夜。滤出米白色(offwhite)固体，然后悬浮于冰水(90ml)中。通过添加12N氢氧化钠将pH调整到12。用乙酸乙酯(2x120ml)提取所得溶液。用盐水对有机层进行洗涤，然后在MgSO4上干燥。除去溶剂，从而产生作为黄色油的期望化合物(3.98g，83％)LCMS Rt＝3.07mn[M+H]+＝249.9-251.9。
N-(5-溴-2-氯-4-(乙基氨基)吡啶-3-基)-2-氰基乙酰胺(VI)的合成
向5-溴-2-氯-N4-乙基吡啶-3，4-二胺(3.98g，15.9mmol)的二氯甲烷溶液(40ml)添加EDC(4.57g，23.8mmol)、氰基乙酸(2.02g，23.8mmol)和N-甲基吗啉(6.98ml，63.5mmol)。在室温下搅拌反应物4小时。在真空下除去溶剂。向浆料添加150ml的温乙酸乙酯(40℃)。用2x125ml温水(40℃)、盐水(200ml)对有机层进行洗涤，然后在MgSO4上干燥。部分除去溶剂，从而获得过滤的浆料。用2x20ml冷水对白色固体进行洗涤，并在40℃下于真空炉中干燥，从而产生期望产物(3.66g，72％)LCMS Rt＝2.31mn，[M+H]+＝316.9-318.9。
2-(7-溴-4-氯-1-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)乙腈(VII)的合成
向N-(5-溴-2-氯-4-(乙基氨基)吡啶-3-基)-2-氰基乙酰胺(3.15g，9.9mmol)中添加冰醋酸(35ml)。在回流下将悬浮液搅拌3小时。将所得溶液冷却至室温，从而产生原位用于下一步骤的期望产物。LCMS Rt＝2.93mn[M+H]+＝298.8-300.8。
7-溴-4-氯-1-乙基-N-羟基-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-碳酰亚氨基氰(carbimidoyl cyanide)(VIII)的合成
向2-(7-溴-4-氯-1-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)乙腈的溶液缓慢地添加NaNO2(1.7g，24.8mmol)。然后在室温下将反应物搅拌过夜。对所得固体进行过滤，用水洗涤，并且在40℃下在真空炉中进行干燥，从而产生期望化合物(3.16g，97％，来自VI)。LCMS Rt＝3.58mn[M+H]+＝327.8-329.8。
4-(7-溴-4-氯-1-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-1，2，5-恶二唑-3-胺(IX)的合成
向7-溴-4-氯-1-乙基-N-羟基-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-碳酰亚氨基氰(carbimidoyl cyanide)(3.12g，9.5mmol)的二恶烷(30ml)溶液和三乙胺(5.72ml，41mmol)的搅拌混合物添加羟胺溶液(50％的水溶液，1.5ml)。在回流下将反应物搅拌6小时。然后将反应物冷却至室温。对混合物进行过滤，并且使滤液蒸发，从而产生黄色固体。使所述固定悬浮于甲醇(12ml)中，加热并在65℃下加热30分钟，然后过滤，从而产生作为黄色固体的期望产物(1.82g，56％)LCMS Rt＝4.15mn[M+H]+＝343-347。
2-(4-氨基-1，2，5-恶二唑-3-基)-4-氯-1-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-醇(X)的合成
在-78℃下向4-(7-溴-4-氯-1-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-1，2，5-恶二唑-3-胺(1.82g，5.3mmol)在四氢呋喃(46ml)中的悬浮液缓慢地添加异丙基氯化镁(2M在THF中，8.5ml，16.9mmol)。添加期间使温度保持在-70℃之下。在-78℃下搅拌10分钟后，添加硼酸三甲酯(2.12ml，18.5mmol)，然后在-78℃下搅拌反应物1小时。使混合物升温至室温，并搅拌过夜。在0℃下冷却反应物。一起添加过氧化氢(50％水溶液，5.46ml)和氢氧化钠3N(3.64ml)，保持反应温度在40℃之下。在室温下剧烈搅拌所得反应物2小时。在真空下除去有机溶剂(剩下水)，通过添加1N盐酸使所得悬浮液酸化至pH＝1。在室温下搅拌反应30分钟。添加45ml乙酸乙酯，并在室温下搅拌反应物另外1小时。对混合物进行过滤(2crops)。用9ml水，9ml乙酸乙酯，9ml甲苯和9ml乙酸乙酯洗涤固体。在40℃下于真空炉中干燥后，获得作为黄色固体的期望化合物(1.31m，89％)。LCMS Rt＝3.26mn，[M+H]+＝281-283。
叔丁基4-((2-(4-氨基-1，2，5-恶二唑-3-基)-4-氯-1-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-基氧)甲基)哌啶-1-羧酸酯(XI)的合成
向在二甲基甲酰胺(15ml)中的2-(4-氨基-1，2，5-恶二唑-3-基)-4-氯-1-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-醇(0.5g，1.78mmol)添加碳酸铯(1.45g，4.45mmol)，然后添加叔丁基4-(溴甲基)哌啶-1-羧酸酯(0.545g，1.96mmol)。在40℃下将反应物搅拌20小时。然后反应物在乙酸乙酯和水之间分配。将水层用乙酸乙酯提取2次。将合并的有机层用盐水洗涤，然后在MgSO4上干燥。除去溶剂，从而产生黄色固体，将该黄色固体用己烷/乙酸乙酯磨碎从而在过滤后产生期望化合物(0.497g，58％)。LCMS Rt＝4.97mn，唯一可获得的级分。
叔丁基4-((2-(4-氨基-1，2，5-恶二唑-3-基)-1-乙基-4-(3-羟基-3-甲基丁-1-炔基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-基氧)甲基)哌啶-1-羧酸酯(XII)的合成
在微波管中，将叔-丁基4-((2-(4-氨基-1，2，5-恶二唑-3-基)-4-氯-1-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-基氧)甲基)哌啶-1-羧酸酯(47mg，01mmol)、锌粉(0.002g，0.0033mmol)、碘化钠(0.005g，0.003mmol)、DBU(0.023ml，0.15mmol)、三乙胺(0.017ml，0.125mmol)，2-甲基-3-丁炔-2-醇(0.023ml，0.24mmol)，四(三苯基膦)钯(0)(10重量％，0.005g)和DMSO(0.6ml)相混合。将溶液脱气，然后将试管密封，并在80℃下以微波对反应物加热2.5小时。将反应物用乙酸乙酯稀释，用水洗涤。将水层用乙酸乙酯提取2次。将合并的有机层用水、盐水洗涤，然后在MgSO4上干燥。除去溶剂，从而产生粗产物，对粗产物通过制备HPLC行纯化，从而产生期望化合物(0.012g，23％)LCMS Rt＝4.43mn，唯一可获得的级分。
4-(2-(4-氨基-1，2，5-恶二唑-3-基)-1-乙基-7-(哌啶-4-基甲氧基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-基)-2-甲基丁-3-炔-2-醇盐酸盐(XIII)的合成
将叔丁基4-((2-(4-氨基-1，2，5-恶二唑-3-基)-1-乙基-4-(3-羟基-3-甲基丁-1-炔基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-基氧)甲基)哌啶-1-羧酸酯(12mg，0.023mmol)溶解于甲醇(3ml)。添加在二恶烷中的HCl 4N(2ml)，并且在室温下搅拌反应物2小时。在真空下除去溶剂。将所得固体在甲醇中磨碎(1.5ml)、过滤，用冷甲醇(0.5ml)冲洗，从而产生作为白色固体的期望化合物(9.7mg，92％)。LCMS Rt＝2.18mn.唯一可获得的级分。1H NMR(d6-DMSO，400MHz)δ＝8.96(s，br，2H)，8.23(s，1H)，7.05(s，br，2H)，4.83(q，2H)，4.28(d，2H)，3.35(m，2H)，2.96(m，2H)，2.21(s，b r，1H)，1.97(d，2H)，1.68(m，2H)，1.56(s，6H)，1.47(t，3H)。
4-(4-氯-1-乙基-7-(哌啶-4-基甲氧基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-基)-1，2，5-恶二唑-3-胺甲酸盐(XIV)的合成
向叔丁基4-((2-(4-氨基-1，2，5-恶二唑-3-基)-4-氯-1-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-7-基氧)甲基)哌啶-1-羧酸酯(0.045g，0.094mmol)在甲醇(4ml)中的溶液添加在二恶烷(2ml)中的HCl 4N，并且在室温下搅拌反应物3小时。除去溶剂，并且用甲醇(2.5ml)磨碎残留物。对残留物进行过滤然后通过制备HPLC进行纯化，从而产生作为白色粉末的期望产物(0.0185g，46％)。LCMS Rt＝2.28mn。唯一可获得的级分。.1H NMR(d6-DMSO，400MHz)δ＝8.40(s，1H)，8.01(s，1H)，6.96(s，2H)，4.84(q，2H)，4.19(d，2H)，3.24(m，2H)，2.79(m，2H)，2.12(s，br，1H)，1.89(m，2H)，1.6-1.3(m+t，5H)。
表1：缩写
  Br2   溴
  H2O   水
  POCl3   磷酰氯
  HCl   盐酸
  SnCl2   氯化锡
  EDC   1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐
  DCM   二氯甲烷
  NaNO2   亚硝酸钠
  Et3N   三乙胺
  B(OMe)3   三甲氧基硼酸酯
  H2O2   过氧化氢
  CsCO3   碳酸铯
  DMF   二甲基甲酰胺
  THF   四氢呋喃
  Zn   锌
  NaI   碘化钠
  DBU   1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
  DMSO   二甲亚砜
  MeOH   甲醇
  MgSO4   硫酸镁
  LCMS   液相色谱
  Rt   保留时间
  NMR   核磁共振
  MHz   兆赫
  s   单重态
  d   双重态
  t   三重态
  q   四重态
  m   多重态
  H   氢
  br   宽
  MW   分子量
  V   电压
  amu   原子质量单位
  ml   毫升
  min   分钟
  mmol   毫摩尔
  g   克
  API   原子压力电离(Atomic pressure ionisation)
  ES   电喷射
NMR、LCMS和制备HPLC条件
·所有反应在惰性气氛下进行。
·在Bruker dpx400上获得NMR光谱。
·LCMS分析样品在Agilent HP1100-LC/MSD VL***上使用以下条件运行：
柱：Phenomenex Gemini C18 30x3mm 3μm
溶剂：A＝水+0.1％甲酸；B＝乙腈+0.1％甲酸
流速：1.2ml/min
温度：40℃
表2：梯度条件
  时间(分钟)   ％A   ％B
  0.00   95.0   5.0
  6.00   5.0   95.0
  7.50   5.0   95.0
  7.60   95.0   5.0
  8.00   95.0   5.0
波长：
254nm(对照，400nm)
210nm(对照，360nm)
质谱条件：
以正离子模式收集质谱数据，使用118V～400V的破碎电压(fragmentor ramp)(分别针对MW＝118.09至MW＝922.01)，扫描150～700amu的质量。使制备的样品在Waters-ZQ制备***上使用以下条件运行：
柱：Phenomenex Gemin  C18 100x21.20mm 5μm
溶剂：A＝水+0.1％甲酸；B＝(95％乙腈：5％水)+0.1％甲酸
流速：20ml/min
温度：室温
梯度条件：梯度条件取决于各化合物的保留时间而变化
波长：PDA从190-600nm检测
质谱条件：
使用API和ES模式，从150-700amu以正离子和负离子模式收集质谱数据。
在珠上固定(固定产物；亲和基质)
将NHS-激活琼脂糖凝胶4 Fast Flow(Amersham Biosciences，17-0906-01)用无水DMSO(二甲亚砜，Fluka，41648，H20＜＝0.005％)平衡。将1ml固定珠置于15ml Falcon管，添加化合物母液(如图4所示两种异构体的混合物；通常100mM在DMF或DMSO中)(终浓度0.2-2μmol/ml珠)以及15μl三乙胺(Sigma，T-0886，99％纯)。在直立圆筒振动器(end-over-end shaker)(Roto Shake Genie，Scientific Industries Inc.)上在黑暗中于室温下对珠温育16-20小时。通过HPLC确定偶联效率。通过与氨基乙醇一起在室温下在直立圆筒振动器上温育过夜来封闭未反应的NHS-基团。将珠用10ml DMSO洗涤，并在-20℃下贮存于异丙醇中。这些珠用作实施例2和3中的亲和基质。如上所述通过与氨基乙醇一起温育封闭NHS-基团来产生对照珠(无固定的配体)。
实施例2使用固定化合物的PARP蛋白的药物牵出
该实施例证明固定的化合物(参见图2和3)在从混合的Jurkat和Ramos细胞裂解物中捕获和鉴定PARP蛋白中的用途。为此目的，使Jurkat和Ramos细胞裂解物的混合物与实施例1中所述的固定产物(亲和基质)接触。通过质谱(MS)分析鉴定与固定的化合物结合的蛋白。进一步的实验策略可在WO2006/134056中发现。
为了通过质谱分析鉴定蛋白，将被亲和基质捕获的蛋白在SDS样品缓冲液中洗脱，随后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离(图4和5)。将合适的凝胶带切下，进行使用胰蛋白酶的凝胶内蛋白水解消化，并且通过LC-MS/MS质谱进行分析。通过质谱法鉴定PARP蛋白衍生肽在表4中得到证明，并且PARP蛋白序列的肽序列范围示于图6-10。
1.细胞培养
Jurkat细胞(ATCC号TIB-152)和Ramos细胞(ATCC号CRL-1596)获自外部供应商(CIL SA，Mons，Belgium)，或在1升转瓶(IntegraBiosciences，#182101)于补充有10％胎牛血清(Invitrogen，#10270-106)的RPMI 1640培养基(Invitrogen，#21875-034)的悬浮液中以0.2x106～1.0x106细胞/ml的密度生长。通过离心收获细胞，用1xPBS缓冲液(Invitrogen，#14190-094)洗涤1次，将细胞球团冷冻于液氮中并随后贮存在-80℃下。
2.细胞裂解物的制备
将细胞在Potter S匀化器中在以下裂解缓冲液中匀质化：50mMTris-HCl，0.8％NP40，5％甘油，150mM NaCl，1.5mM MgCl2，25mMNaF，1mM钒酸钠，1mM DTT，pH 7.5。每25ml缓冲液添加一个完整的不含EDTA的片剂(蛋白酶抑制剂鸡尾酒，Roche Diagnostics，1873580)。使用机械化的POTTER S将材料匀浆20次，转移到50mlfalcon管，在冰上温育30分钟，并在4℃下以20,000xg旋转10分钟(10,000rpm，在Sorvall SLA600中，预冷)。将上清液转移到超速离心(UZ)-聚碳酸酯管(Beckmann，355654)，并在4℃下以160.000xg旋转1小时(42.000rpm，在Ti50.2中，预冷)。将上清液再次转移到新的50ml falcon管，通过Bradford检测(BioRad)确定蛋白浓度，并且制备每等分试样包含50mg蛋白的样品。将样品立即用于实验或在液氮中冷冻，并且在-80℃下贮存。该步骤适用于Ramos和Jurkat细胞裂解物的制备。
3.药物牵出实验
将具有固定配体的琼脂糖凝胶珠(100μl珠每牵出实验)在裂解缓冲液中平衡，并在4℃下与包含50mg蛋白的细胞裂解物一起在直立圆筒振动器(Roto Shake Genie，Scientific Industries Inc.)上一起温育2小时。收集珠，将其转移到Mobicol-柱(MoBiTech 10055)并用10ml包含0.4％NP40洗涤剂的裂解缓冲液洗涤，然后用5ml具有0.2％洗涤剂的裂解缓冲液洗涤。为了洗脱结合蛋白，添加60μl2xSDS样品缓冲液，在50℃下对所述柱加热30分钟，并将洗脱物通过离心转移到微量离心管。然后用108mM碘乙酰胺将蛋白烷基化。随后用过SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分离蛋白。
4.通过质谱法进行的蛋白鉴定
4.1在质谱分析之前进行的蛋白消化
基本上按照Shevchenko等，1996，Anal.Chem.68：850-858所述将凝胶分离的蛋白在凝胶内还原和消化。简言之，使用干净的解剖刀将凝胶-分离的蛋白从所述凝胶切下，在黑暗中于室温下使用10mMDTT(在5mM碳酸氢铵中，54℃，45分钟)还原。用猪胰蛋白酶(Promega)以在5mM碳酸氢铵中12.5ng/μl的蛋白酶浓度在凝胶内消化还原的蛋白。使消化在37℃下进行4小时，随后使用5μl 5％甲酸终止反应。
4.2在通过质谱法分析之前进行的样品制备
用20μl 1％TFA对凝胶塞(Gel plugs)提取2次，并收集酸化的消化上清液。将样品在真空离心机中干燥，并再悬浮于10μl 0.1％甲酸中。
4.3.质谱数据获得
将肽样品注入纳米LC***(CapLC，Watersor Ultimate，Dionex)，该***与四极杆TOF(QTOF2，QTOF Ultima，QTOF Micro，Micromass)或离子陷阱(LCQ Deca XP)质谱仪连接。使用水性有机溶剂的梯度液在所述LC***上分离肽(参见以下)。溶剂A是在0.5％甲酸中的5％乙腈，溶剂B是在0.5％甲酸中的70％乙腈。
表3：在质谱仪内对从LC***洗脱的肽进行部分测序。
  时间(分钟)   ％溶剂A   ％溶剂B
  0   95   5
  5.33   92   8
  35   50   50
  时间(分钟)   ％溶剂A   ％溶剂B
  36   20   80
  40   20   80
  41   95   5
  50   95   5
4.4.蛋白鉴定
在LC-MS/MS实验中产生的肽质量和碎片数据用于询问fasta格式的蛋白和核苷酸序列数据库，该数据库由NCBI(用于NCBInr，dbEST和人类以及小鼠基因组)和European Bioinformatics Institute(EBI，用于人类、小鼠、黄果蝇(D.melanogaster)和线虫(C.elegans)蛋白组数据库)维护和定期更新。通过使用软件工具Mascot将测定的肽质量和碎片数据与从数据库中的登记计算出的相同数据关联来鉴定蛋白(Matrix Science；Perkins等，1999.Probability-basedprotein identification by searching sequence databases usingmass spectrometry data.Electrophoresis 20，3551-3567)。检索标准取决于对于分析使用哪一种质谱而变化。通过国际蛋白索引(IPI)定义序列标志符(Kersey等，2004.Proteomics 4(7)：1985-1988)。
表4：在使用固定化合物XIII和XIV的药物牵出实验中通过质谱鉴定PARP蛋白
  PARP蛋白   化合物XIII   化合物XIV
  PARP1   +   +
  PARP10   +   +
  PARP14   +   +
  PARP15   +   -
  PARP16   +   +
Figure IPA00001256076700011
Figure IPA00001256076700021
Figure IPA00001256076700031
Figure IPA00001256076700051
Figure IPA00001256076700061
Figure IPA00001256076700091
Figure IPA00001256076700101
Figure IPA00001256076700111
Figure IPA00001256076700121
Figure IPA00001256076700141
Figure IPA00001256076700161
Figure IPA00001256076700171
Figure IPA00001256076700181
Figure IPA00001256076700191
Figure IPA00001256076700201
Figure IPA00001256076700211
Figure IPA00001256076700221
Figure IPA00001256076700231
Figure IPA00001256076700251

Claims (17)

1.一种式(I)的固定化合物，或其盐，
Figure FPA00001256077100011
其中
R1a、R1b、R2独立地选自由H和C1-4烷基组成的组，其中C1-4烷基可选地被一个或多个相同或不同的卤素取代；
R3是H；卤素；CN；C(O)OR4；OR4；C(O)R4；C(O)N(R4R4a)；S(O)2N(R4R4a)；S(O)N(R4R4a)；S(O)2R4；S(O)R4；SR4；N(R4R4a)；NO2；OC(O)R4；N(R4)C(O)R4a；N(R4)S(O)2R4a；N(R4)S(O)R4a；N(R4)C(O)N(R4aR4b)；N(R4)C(O)OR4a；OC(O)N(R4R4a)；C1-6烷基；C2-6链烯基；或C2-6炔基，其中C1-6烷基；C2-6链烯基；和C2-6炔基可选地被一个或多个相同或不同的R5取代；
R4、R4a、R4b独立地选自由H；C1-6烷基；C2-6链烯基；和C2-6炔基组成的组，其中C1-6烷基；C2-6链烯基；和C2-6炔基可选地被一个或多个相同或不同的R5取代；
R5是卤素；CN；OR6；SR6；N(R6R6a)；或NO2；
R6、R6a独立地选自由H和C1-4烷基组成的组，其中C1-4烷基可选地被一个或多个相同或不同的卤素取代；
m是0；1；或2；
n是0；1；或2。
2.如权利要求1所述的固定化合物，所述固定化合物选自由以下组成的组：
Figure FPA00001256077100021
3.固定产物的制备方法，其中将至少一种如权利要求1或2任一项所述的固定化合物固定在固相载体上，特别是其中所述固相载体选自由琼脂糖、改性琼脂糖、琼脂糖珠(例如NHS-激活的琼脂糖)、胶乳、纤维素和铁磁性颗粒或亚铁磁性颗粒组成的组。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述固定产物由将所述固定化合物直接共价连接到固相载体而产生，或由将所述固定化合物通过连接子介导的共价连接到固相载体而产生，特别是其中所述连接子是C1-10亚烃基，该亚烷基可选地被选自由S、O、NH、C(O)O、C(O)和C(O)NH组成的组中的一种或多种原子或官能团打断，并且其中该连接子可选地被独立地选自由卤素、OH、NH2、C(O)H、C(O)NH2、SO3H、NO2和CN组成的组中的一种或多种取代基取代，特别是其中所述固定经由权利要求1的式(I)中的饱和环的环氮原子发生。
5.一种固定产物，该固定产物能够通过权利要求3或4任一项所述的方法获得。
6.PARP相互作用化合物的鉴定方法，所述方法包括以下步骤：
a).提供包含PARP的蛋白制剂，
b).使所述蛋白制剂与权利要求5所述的固定产物以及与给定化合物在允许形成PARP和固定产物的复合物的条件下接触，和
c).检测步骤b)中形成的复合物。
7.PARP相互作用化合物的鉴定方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供两等份的包含PARP的蛋白制剂，
b)使一等份蛋白制剂与权利要求5所述的固定产物在允许形成PARP和固定产物的复合物的条件下接触，和
c)使另一等份蛋白制剂与所述固定产物以及与给定化合物在允许形成所述复合物的条件下接触，和
d)确定步骤b)和c)中形成的复合物的量。
8.PARP相互作用化合物的鉴定方法，所述方法包括以下步骤：
g)提供各自包括至少一个包含PARP的细胞的两等份试样，
h)将一等份试样与给定化合物温育，
i)收获各等份试样的细胞，
j)对所述细胞进行裂解从而获得蛋白制剂，
k)使所述蛋白制剂与权利要求5所述的固定产物在允许形成PARP和固定产物的复合物的条件下接触，和
l)确定步骤e)的各等份试样中形成的复合物的量。
9.如权利要求7或8任一项所述的方法，其中在与所述化合物一起温育的等份试样中形成的复合物的量相对于不与所述化合物一起温育的等份试样减少表示PARP是所述化合物的靶。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中通过从所述固定产物中分离PARP，并且随后检测分离的PARP或随后确定分离的PARP的量，来确定所述复合物的量，特别是其中通过质谱法或免疫检测法，优选使用针对PARP的抗体的免疫检测法来检测PARP或确定PARP的量。
11.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中所述给定化合物选自由合成化合物或有机合成药，更优选小分子有机药，和天然小分子化合物组成的组。
12.如权利要求7-11中任一项所述的方法，其中所述给定化合物是PARP抑制剂。
13.纯化PARP的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含PARP的蛋白制剂，
b)使所述蛋白制剂与权利要求5所述的固定产物在允许形成PARP和固定产物的复合物的条件下接触，和
c)从所述固定产物分离PARP。
14.如权利要求7-13中任一项所述的方法，其中蛋白制剂的提供包括收获至少一个包含PARP的细胞和对所述细胞进行裂解的步骤。
15.如权利要求7-14中任一项所述的方法，其中形成所述复合物的步骤在基本上生理条件下进行。
16.用于确定样品中PARP的存在的方法，所述方法由以下步骤组成：
a)提供预期包含PARP的蛋白制剂，
b)使所述蛋白制剂与权利要求5所述的固定产物在允许形成PARP和固定产物的复合物的条件下接触，和
c)检测PARP是否与所述固定产物形成复合物。
17.如权利要求1或2任一项所述的固定化合物或如权利要求5所述的固定产物在鉴定PARP相互作用化合物或在纯化PARP中的用途。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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