PT1844164E - Método para detectar agentes patogénicos utilizando sondas molecular beacon - Google Patents
Método para detectar agentes patogénicos utilizando sondas molecular beacon Download PDFInfo
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Description
1
DESCRIÇÃO
"MÉTODO PARA DETECTAR AGENTES PATOGÉNICOS UTILIZANDO SONDAS MOLECULAR BEACONS"
Esta invenção refere-se a meios de diagnóstico específicos para organismos associados a doenças sexualmente transmissíveis, e mais particularmente à detecção de genotipos do papilomavírus humano (HPV), principalmente genotipos do papilomavírus humano genital.
Papilomavírus humano e sua importância
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), o cancro cervical é a segunda causa de morte por cancro mais comum nas mulheres. A presença de infecção por HPV tem sido implicada em mais de 99% dos cancros cervicais a nível mundial. Conforme estimado, mais de 500.000 mulheres, a nível mudial, desenvolvem cancro cervical todos os anos e mais de 273.000 destes casos são fatais. Mesmo com programas de rastreio através do esfregaço de Papanicolau, o número de morte de mulheres com cancro cervical é, todos os anos, significativo. A infecção por HPV é, a nível mundial, a doença sexualmente transmissível (DST) mais frequente, e mais de 60% das mulheres sexualmente activas são infectadas pelo HPV no tracto genital uma vez na vida. Independentemente do estado da infecção por HPV, menos de 1 em 10000 mulheres irá desenvolver cancro cervical invasivo. O facto da maioria das mulheres infectadas por HPV não desenvolver anomalias citológicas ou cancro salienta a importância dos 2 factores de modulação do desenvolvimento de doença cervical para cancro em mulheres infectadas por HPV. Estes factores podem incluir o genotipo HPV e variante molecular, a carga virai HPV, persistência de infecção por HPV, co-infecção ou outros agentes DST, o estado imunitário do hospedeiro e factores ambientais tais como o hábito tabágico.
Os papilomavírus são pequenos vírus de ADN que infectam as células epiteliais de um mamífero, causando lesões epitelais proliferativas, as quais podem ser benignas, por exemplo, fibropapilomas (verrugas) ou malignas. Todos os papilomavírus são semelhantes considerando que o tamanho do genoma, organização, grelha de leitura aberta e funções das proteínas são partilhados. Muitas, mas não todas, as regiões do genoma são conservadas entre os vários papilomavírus.
Devido à estreita associação existente entre o ciclo de vida do papilomavírus e o estado de diferenciação da célula hospedeira, os detalhes do ciclo de vida do papilomavírus ainda não se encontram completamente elucidados. Sabe-se que os papilomavírus infectam as células hospedeiras epiteliais basais, onde os genomas virais se estabelecem e sao mantidos como epissomas de baixo número de cópias que se replicam em coordenação com a replicação da célula hospedeira. À medida que as células infectadas se diferenciam em queratinócitos, o ADN virai é amplificado, os genes de expressão tardia são induzidos seguindo-se a replicação vegetativa do papilomavírus.
Os papilomavírus infectam uma grande variedade de animais, incluindo os seres humanos. Os papilomavírus humanos (HPV) (incluindo a família Papilomaviridae, Alfa-, Beta-, Gama-, Delta-, Mupapilomavírus e géneros 3
Papillomaviridae não classificados) são causas comuns de doenças sexualmente transmissíveis. Têm sido identificados vários tipos de HPV por meio de dados de sequenciação de ADN e foram totalmente sequenciados, até à data, 96 genotipos de HPV. A genotipagem de HPV tem como base sequências de ADN dos genes Ll, E6 e E7. Uma diferença de 10% na sequência, relativamente a cadeias previamente estabelecidas, é suficiente para definir um novo tipo de vírus. A heterogeneidade do grupo do papilomavírus humano é descrita em geral em deVilliers, 1989, J. Virology 63: 4898-4903. Os genomas dos inúmeros tipos de HPV foram sequenciados e/ou caracterizados.
Os HPVs são actualmente vírus de ADN oncogénicos, cujo genoma é organizado em três regiões: As regiões do gene de expressão precoce (EI a E7), a região do gene de expressão tardia (Ll e L2) e a região reguladora superior (Upper Regulatory Region - URR) ou região de controlo longo (long control region - LCR). A URR possui locais de ligação para muitos repressores e activadores de transcrição, sugerindo que a mesma pode desempenhar um papel na determinação da variedade de hospedeiros para tipos específicos de HPV. O EI e E2, no entanto, codificam proteínas que são vitais para a replicação do ADN extra-cromossómico e para a conclusão do ciclo de vida virai. Ο E2 codifica duas proteínas: uma, que inibe a transcrição da região de expressão precoce e a outra, que aumenta a transcrição da região de expressão precoce. Uma marca do carcinoma cervical associado ao HPV é a perda de expressão das proteínas virais E2. Foi descrita, recentemente, uma nova proteína E2, que consiste no produto da pequena grelha de 4 leitura aberta E8 com a parte da proteína E2. Esta proteína tem capacidade para reprimir tanto a replicação virai como a transcrição virai e, por conseguinte, acredita-se que a mesma tenha um papel importante na latência virai. A proteína E4 é expressa nas fases tardias da infecção quando se constroem os viriões, sendo que se lhe desconhece características de transformação; no entanto, considera-se que esta proteína desempenha um papel importante na maturação e replicação do vírus. A proteína E4 induz igualmente o colapso da rede de citoqueratina citoplasmática nos queratinócitos humanos, uma situação que pode ajudar à libertação de viriões da célula infectada. A grelha de leitura aberta (ORF) E5, no entanto, é frequentemente eliminada nas células do carcinoma cervical, indicando que a mesma pode não ser essencial na manutenção da transformação maligna da célula hospedeira. Quando presente, a E5 interage com várias proteínas transmembranares como os receptores do factor de crescimento epidérmico, factor p de crescimento derivado das plaquetas e factor estimulante de colónias. Num estudo, no qual se utilizaram 16 células infectadas com HPV, descobriu-se que a proteína E5 possuía uma actividade de transformação fraca.
Na carcinogénese, a ORF E6 e E7 são consideradas como tendo os papéis mais importantes. Estas duas unidades codificam oncoproteínas que permitem a replicação do vírus e a imortalização e transformação da célula hospedeira do ADN do HPV.
As unidades de região precoce, LI e L2 codificam proteínas do capsídeo virai durante as fases tardias da construção dos viriões. A proteína codificada pela LI é 5 altamente conservada entre as diferentes espécies do papilomavírus. A proteína menor do capsídeo codificado pela L2 possui mais variantes de sequências do que o da proteína Li . 0 HPV pode infectar as células epiteliais basais da pele ou alinhamentos de tecido interiores e são, por conseguinte, categorizados ou como tipo cutâneos ou mucosa (anogenital). 0 ADN do HPV é, normalmente, extra-cromossómico ou episomal em lesões precursoras cervicais benignas. No entanto, em muitas células do cancro cervical, assim como nos linhas celulares do cancro cervical e queratinócitos humanos transformados pelo HPV in vitro, o ADN do HPV é integrado no genoma hospedeiro.
Os tecidos cancerígenos podem conter simultaneamente ADNs integrados e epissomais, embora a integração pareça ocorrer com maior frequência no cancro cervical associado ao HPV 18 do que no cancro cervical associado ao HPV 16. 0 HPV 16 integrado está presente em algumas lesões pré-malignas, mas nem sempre está presente nos carcinomas. Durante a integração do ADN do HPV, o genoma virai quebra normalmente na região E1/E2. Esta quebra causa normalmente a perda das regiões El e E2. Sabe-se que a perda de E2, que codifica proteínas incluindo a proteína que inibe a transcrição das regiões E6 e E7, resulta na expressão descontrolada e aumentada das proteínas oncogénicas E6 e E7. Observou-se, no entanto, que a expressão aumentada de E6 e E7 leva à transformação maligna das células hospedeiras e à formação de tumores. A integração virai do HPV no ADN genómico hospedeiro encontra-se associada ao desenvolvimento do estado policlonal para estado monoclonal 6 na neoplasia intra-epitelial cervical (NIC), e estes acontecimentos têm um papel fundamental no desenvolvimento da neoplasia cervical de baixo grau para neoplasia de alto grau.
Os modelos de desequilíbrio do número de cópias do ADN (NIC) são caracterí st icas de um grau de lesão intra-epitelial escamosa (SIL) cervical, estado de papilomavírus humano (HPV) e recorrência pós operatória. Enquanto foram observadas várias NICs em frequências semelhantes em HG-SIL (SIL de alto grau) assim como em LG-SIL (SIL de baixo grau), outras, incluindo ganho na lq, 3q e 16q, foram frequentemente encontradas em HG-SIL mas não em LG-SIL. Verificaram-se significativamente mais CNIs por caso em HG-SILs, apresentando perda do gene E2 do HPV 16 e em HG SILs, que reocorreram subsequentemente. Os dados apresentam-se consistentes com a aquisição sequencial de CNIs no desenvolvimento de SIL da cervical. A frequência mais alta de NIC associada à perda do gene E2 in vitro suporta os sinais de que a integração de alto risco de HPV está associada a uma instabilidade genómica.
Com base nos dados epidemiológicos, clínicos e moleculares existentes, um subgrupo de HPVs são inequivocamente os agentes etiológicos para cancros cervicais e seus precursores. Foram detectados HPVs em aproximadamente 90% de adenocarcinomas cervicais e carcinomas de células escamosas. A maioria das infecções por HPV são eliminadas espontaneamente, mas foram descobertas infecções persistentes com o ADN do HPV em metástases provenientes de tumores cervicais. No entanto, tipos conhecidos de HPV de alto risco (ou oncogénicos) são um factor de risco significativo para o cancro cervical e 7 são cada vez mais reconhecidos pelo papel que desempenham em outros tipos de cancro. Virtualmente, todos os cancros cervicais (99%) contêm genes de HPVs de alto risco, mais comummente os tipos 16, 18, 31 e 45. Outros tipos de alto risco incluem os tipos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 e 73. HPVs 31, 33, 35, 51 e 52 são muitas vezes referidos como "riscos intermédios", considerando que são mais comuns em lesões displásicas moderadas ou graves do que em carcinomas. Entre as cadeias de alto risco, o HPV 16 e o HPV 18 são os mais estreitamente associados ao carcinoma cervical. Descobriu-se o ADN do HPV 16 em mais de 50% de carcinomas de células escamosas, enquanto o ADN de HPV 18 foi descoberto em mais de 50% de adenocarcinomas. Contudo, a grande maioria de HPVs anogenitais possuem potencial oncogénico. A interacção de HPVs com as células hospedeiras tem duas consequências biológicas principais: a) Todos os HPVs anogenitais induzem lesões escamosas de baixo grau, as quais são a correlação morfológica de uma infecção produtiva e os fenotipos de imortalização exercidos pela expressão normal e E6 e E7. A imortalização é uma estratégia inerente de pailomavirus para mobilizar recursos para a replicação de ADN e para produzir uma nova descendência. b) Raramente, os HPVs induzem um fenotipo epitelial proliferativo reconhecido como uma lesão de alto grau e esse é o próximo precursor cito-histológico do carcinoma cervical invasivo, o qual poderá envolver um expressão descontrolada de E6 e E7.
Até à data, as doenças clinicas, associadas a infecções por HPV e o campo potencial de aplicações para detecção de 8 HPV e métodos de tipagem incluem o condiloma acuminado, líquen escleroso, hiperplasia das células escamosas, neoplasia vulvar intra-epitelial, carcinoma de células escamosas, neoplasia intraepitelial cervical, carcinoma do colo do útero, adenocarcinoma do colo do útero, neoplasia intraepitelial anal, neoplasia intraepitelial peniana, adenocarcinoma da laringe, papilomatose respiratória recorrente e epidermodisplasias verruciformes. Factos recentes sugerem que o HPV poderá também ter um determinado papel no desenvolvimento do cancro da próstata nos homens.
Lesões precursoras do cancro cervical (lesões intraepiteliais) ou anomalias citológicas são testadas utilizando a coloração de Papanicolau, conhecido como esfregaço de Papanicolau, denominação proveniente do nome do seu descobridor George Papanicolau. A técnica envolve colocar o material colhido da raspagem do colo do útero numa lamela de vidro e colorir as células obtidas do tracto anogenital com hematoxilina, um corante nuclear. 0 esfregaço de Papanicolau, no entanto, possui uma falta de repetibilidade e não é suficientemente previsível para evitar neoplasias induzidas por HPV iminentes. Demonstrou-se que 25% das doentes com carcinoma in situ avançado podem apresentar um esfregaço de Papanicolau normal uns anos antes do diagnóstico ou da última citologia negativa e que, numa reavaliação, tenha sido uniformemente positiva em casos de cancro do colo do útero. Um problema cada vez mais prevalente é a ocorrência de cancro invasivo nos 3 anos posteriores a um esfregaço de Papanicolau negativo. A variação actual aceitável de falsos negativos (isto é, mulheres que têm displasia de acordo com um determinado painel de patologistas que analisam biopsias de tecidos em 9 vez de amostras de secreções vaginais, mas que não lhes é diagnosticada tal doença durante um exame de rotina) é de aproximadamente 5-10%, mas estudos recentes sugerem que a variação actual pode ser bastante mais elevada. Além disso, em aproximadamente 7-8% dos casos, o esfregaço de Papanicolau revela células escamosas atípicas de importância indeterminada (ASCUS). Em outros 20-30% de casos, o esfregaço de Papanicolau pode ser insuficiente em termos de interpretação devido à presença de células inflamatórias. No caso do colo do útero, as verrugas planas (visualizadas por colposcopia) são suspeitas de lesões pré-malignas. Tem sido bem descrito o progresso histopatológico de verrugas planas para carcinoma in situ e cancro cervical.
As lesões intraepiteliais são acontecimentos precoces comuns entre as mulheres com infecção incidente por HPV e o intervalo entre a infecção incidente por HPV 16 ou HPV 18 e o grau de NIC 2-3 confirmado por meio de biopsia parece ser relativamente curto. No entanto, estudos têm demonstrado que a infecção com tipos de HPV de alto risco é, normalmente, transitória. A persistência de infecção por HPV aumenta substancialmente o risco de progressão para lesões intraepiteliais de alto grau e doença invasiva. A progressão da doença é variável e é associada à perda ou persistência de HPV. Números significativos de lesões displásicas regridem espontaneamente, outras não chegam a progredir enquanto poucas se desenvolvem rapidamente.
Como consequência do papel preferencial de genotipos de alto risco no cancro cervical e devido ao tipo de modelos diferentes, consequenciais e característicos para outras condições patológicas, tanto a identificação como a tipagem 10 do HPV são consideradas de extrema importância. Para além disso, os tipos diferentes de HPV de alto risco apresentam riscos diferentes para os indivíduos afectados. Por exemplo, o HPV 16 e o HPV 18 têm sido mais consistentemente identificados em níveis mais elevados de displasia cervical e carcinoma comparativamente a outros tipos de HPV. O HPV 16 é igualmente mais prevalente nos casos de carcinoma escamoso e o HPV 18 é mais prevalente em casos de adenocarcinomas.
Diagnósticos HPV
Desde 1980, têm sido clonados alguns genomas virais e utilizados como sondas de tipo específico no diagnóstico do HPV. Têm sido utilizadas técnicas de hibridação por meio de filtragem para detectar o ADN do HPV em raspagens do colo do útero colhidas em paralelo com amostras de citologia de rotina. Têm sido utilizadas sondas do ADN do HPV em diferentes ensaios baseados em hibridações diferentes tais como o ensaio de Southern e híbrido Dot/Southern para detectar o ADN do HPV em amostras de tecido clinicamente derivadas. Além disso, demonstrou-se igualmente o ADN de biopsia purificado e hibridações in situ em amostras de tecido preservado, isto é, localização directa na célula intacta das sequências complementares das sondas de ácido nucleico.
Foi descrito um método para detectar tipos de ADN do HPV que utiliza um procedimento de transferência reversa (reverse blotting). O procedimento envolvia a formação de uma membrana à qual se ligava ADN genómico de quatro tipos diferentes de HPV e posteriormente a hibridação de ADN 11 marcado a partir de uma amostra biológica para a ligação do ADN à membrana.
Foram desenvolvidos inúmeros métodos para detectar tipos de papilomavirus humano utilizando reacções especificas do tipo, detectando um tipo de HPV de cada vez. A reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) foi utilizada para amplificar e detectar a presença de ADN de HPV 16 e HPV 18, em particular, para detectar HPV 16 em biópsias orais e do colo do útero. Foi descrita uma mistura de iniciadores para a amplificação especifica por PCR de sequências HPV nos tipos la, 5, 6a, 8, 11, 16, 18, e 33. As Patentes N°s. US 4 683 195 e US 4 683 202, apresentam a PCR e a utilização de PCR para detectar a presença ou ausência de sequência de ácido nucleico numa amostra. A patente N° . US 5 447 839 apresenta um método para detectar e tipar o HPV. Neste método, as sequências do ADN do HPV em uma amostra são amplificadas por PCR utilizando iniciadores de consenso, os quais amplificam o tipo de HPV oncogénico com o tipo de HPV não oncogénico. Deste modo, a presença de HPV na amostra é indicada pela formação de produtos de amplificação. O HPV é posteriormente tipado utilizando sondas de ADN de tipo especifico, as quais hibridam com a região amplificada de ADN. As sondas de hibridação especificas de tipo apresentadas na presente patente têm capacidade de identificar e distinguir entre cinco tipos de HPV oncogénicos conhecidos, nomeadamente HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18 e HPV 33.
Concebeu-se uma série de métodos para detectar tipos de alto risco de HPV. Muitos destes métodos dependem da detecção de sequências únicas no genoma do HPV. Por exemplo, na técnica, foram reportadas as sondas de ADN ou 12 ARN, complementares a uma fracção dos genes de uma determinada estirpe de HPV de alto risco, sendo úteis no rastreio da presença de uma determinada estirpe de HPV de alto risco em amostras de doentes (Patente N°. US 4 849 332. A Patente N° US 5 705 627 apresenta a utilização de PCR para amplificar e detectar o ADN do HPV utilizando iniciadores de consenso degenerados ou mistos, seguidos de tipagem utilizando uma mistura de sondas de ADN de genotipo especifico. Outros exemplos de utilização de iniciadores de consenso podem ser encontrados na Patente N°. US 5 364 758, e Kleter, B. et al. Am. J. of Pathology, vol. 153, No. 6, 1731-39 (1998)
Existe um método comercial disponível, o gual se baseia na hibridação e amplificação de sinal. (Hybrid Capture II, Digene Corp.) No entanto, este método tem problemas de especificidade devido à homologia de alta sequência de alguma parte dos genomas do HPV.
Os métodos baseados na amplificação consistem numa parte responsável pela sensibilidade (amplificação), a qual é separada daquelas partes responsáveis pela especificidade (detecção por hibridação). Estas técnicas diferem na secção do genoma amplificado, no número de iniciadores e nas técnicas de detecção. Os métodos de amplificação utilizados com maior frequência são GP5+- GP6+ (iniciador geral - GP), MY9-MY11, PGMY, SPF, L1C e as reacções PCR de tipo específico. As técnicas de detecção utilizadas com maior frequência são hibridação específica da sequência, polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (RFPL) e teste de linha da sonda (LiPA). Por vezes, embora raramente, o método de sequência ou outros métodos são aplicados. As características analíticas das amplificações 13 variam em uma ampla variedade e são caracterizadas pelo número de genotipos, os quais podem ser amplificados, pela sensibilidade analítica, especificidade da amplificação/detecção dos genotipos e também pelas diferenças de sensibilidade entre os genotipos. HPV pelo método de PCR em tempo real A carga virai do papilomavírus humano 16 (HPV-16) poderia ser um biomarcador previsível da presença de lesões cervicais de alto grau. Têm sido desenvolvidos alguns ensaios de PCR em tempo real para avaliar com precisão a carga virai do HPV-16 (HPV- 16 Ll, HPV-16 E6, e HPV-16 E6 PG). Os métodos ensinam-nos a desenvolver a detecção do HPV em tempo real, mas apenas a detectar um genotipo de cada vez . A identificação do ADN do HPV em doentes com papilomatose respiratória recorrente juvenil foi realizada utilizando SYBR ® Green PCR em tempo real. 0 método é utilizado para detectar múltiplos genotipos de papilomavírus humanos em uma reacção de PCR em tempo real. No entanto, o método de amplificação é diferente do descrito na presente invenção. 0 amplicão produzido é superior (aproximadamente 450 bp) ao que é aceite para uma sonda com base em um método de amplificação na técnica. O comprimento preferido é 150 bp ou menos. O método de detecção é especifico e incapaz de diferenciar os genotipos de modo fiável, os quais necessitam de uma tipagem virai subsequente utilizando o PCR em tempo real com iniciadores de tipo específico para os tipos de HPV 6, 11, 16, 18, 31 e 33. Este método detecta igualmente os tipos de papilomavírus humano em isolados, mas apenas um genotipo de cada vez. 14
Da mesma forma, outros usaram um método em que uma reacção num tubo único foi utilizada para detectar genotipos de papilomavírus humano de uma forma geral. No entanto, a detecção especifica de grupos não foi descrita.
Foi utilizado outro método para detectar o ADN do papilomavirus humano em parceiros sexuais utilizando uma abordagem de duas fases para avaliar tanto os genotipos como os dados de carga virai 0 método utiliza a reacção em cadeia de polimerase GP5+/6+ (PCR), seguida da análise de blot em linha reversa. Este método foi utilizado para a detecção de 45 tipos de HPV em amostras de raspagem cervicais e penianas. As cargas virais foram subsequentemente determinadas em amostras de raspagem positivas para os tipos de HPV 16, 18, 31 e 33 por meio de testes LightCycler baseados em PCR em tempo real. 0 PCR GP5+/GP6+ gera um amplicão de 150 bp de comprimento, permitindo a aplicação de métodos baseados em sondas em tempo real. No entanto, o método pode não detectar múltiplos genotipos ou grupos em uma reacção.
Foi imaginado um método para detecção homogénea e quantificação em tempo real de amplificação de ácidos nucleicos utilizando digestão com enzimas de restrição. Neste sistema homogéneo, a detecção é mediada por um susbtrato que contém um relator e uma fracção quencher no seu terminal 5' separada por uma pequena secção de ADN que codifica uma sequência de reconhecimento de enzimas de restrição. Na forma em cadeia simples, o sinal do relator fluorescente é extinguido devido à transferência de energia de ressonância por fluorescência (fluorescence resonance energy transfer - FRET). No entanto, à medida que o iniciador se incorpora no amplicão de cadeia dupla, uma 15 enzima de restrição presente na reacção cliva o ADN que liga o relator e o extintor, permitindo a fluorescência sem restrição do relator. Este sistema foi testado, utilizando um iniciador especifico para o gene E6 do papilomavirus humano (HPV) 16 combinado com o marcador de transferência de energia clivável e utilizado para amplificar o ADN do HPV 16 positivo. 0 método não pode ser utilizado para a detecção de múltiplos genotipos ou grupos.
Foi também descrito um sistema baseado no PCR em tempo real para quantificação simultânea de tipos de papilomavirus humano associados ao cancro cervical de alto risco. Foi desenvolvido um teste de PCR em tempo real para a detecção e quantificação de HPV 16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -52, -58 e -67. 0 teste baseia-se em três PCRs paralelos em tempo real a partir de cada amostra de doente: (i) reacção 1 detecta e quantifica HPV 16, -31, -18, e -45 (HPV18 e -45 foram detectados e quantificados conjuntamente utilizando uma sonda) com três fluoroforos diferentes; (ii) reacção 2 detecta e quantifica HPV33, -35, -39, -52, -58, e -67 (HPV33, -52, -58, e -67 foram detectados e quantificados conjuntamente) , uma vez mais em três fluoroforos diferentes e foram apenas utilizadas três sondas diferentes; e (iii) reacção 3 detecta e quantifica a quantidade um gene humano de cópia única (HMBS, Homo sapiens hidroximetilbilano sintase; GenBank n°. acesso M95623. 1). A reacção 1 inclui um total de sete iniciadores PCR e três sondas, a reacção 2 inclui um total de sete iniciadores PCR e três sondas e a reacção 3 inclui dois iniciadores PCR e uma única sonda. 0 método aplica sondas TaqMan hidrolisavéis para PCR em tempo real. Foi descrita a utilização de apenas três sondas em uma reacção, detectando 16 um máximo de 6 genotipos na mesma reacção. 0 método não pode ser utilizado como ensinamento geral para conceber reacções que detectam múltiplos genotipos de HPV, uma vez que as identidades de sequência entre genotipos são limitadas. A extensão da reacção é restrita ao se utilizarem identidades de sequência entre genotipos.
Foi previamente desenvolvido um método para detecção e quantificação do papilomavirus humano oncogénico (HPV), utilizando-se o teste de exonuclease 5' fluorescente. 0 método é baseado na amplificação de um fragmento de 180 bp da parte 3' da grelha de leitura aberta EI num PCR simples com sondas de tipo especifico para os tipos HPV 16, 18, 31, 33 e 35. As sondas podem ser utilizadas separadamente ou em combinações de até três sondas por ensaio. O método foi limitado a três sondas por ensaio.
Foi igualmente descrita uma estratégia para detecção e genotipagem do papilomavirus com SybrGreen e reacção em cadeia de polimerase de farol molecular. 0 teste realiza a detecção geral de HPV por meio de SybrGreen reportando amplicões do ADN do HPV e por genotipagem dos sete tipos de HPV prevalentes (HPV-6, -11, -16, -18, -31, -33, -45) por meio de PCR do farol molecular em tempo real. O método de duas fases utiliza três sondas molecular beacon marcadas de forma diferente numa reacção PCR.
Foi igualmente descrito outro método: Foi utilizado um iniciador fluorescente self-probing de HPV degenerado, conhecido como Scorpion e uma mistura de Scorpions em conjunto com um iniciador de cauda geral.
Ao se utilizar um iniciador de cauda, foi possível introduzir um local de consenso que permite que um único 17
Scorpion reconheça amplicões de HPV muito diferentes. Este é um procedimento de duas fases que pode teoricamente
detectar mais de 40 tipos diferentes de HPV. Foram utilizados :, neste estudo, 10 iniciadores de tipagem Scorpion (HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 56) . A sequência do iniciador de cada Scorpion é especifica do tipo encontra-se localizada na mesma posição de sequência da do GP6+ iniciador de Jacobs e tal. 0 método explica um método de detecção geral para detectar a presença de HPV e um método de detecção de tipo especifico utilizado para tipar amostras positivas. Mas este não resolve o problema do rastreio com sondas múltiplas, o que leva à utilização de sonda de reactividade cruzada. De facto, o método evita utilizar sondas múltiplas em uma reacção.
Os métodos de detecção de HPV com base em PCR em tempo real que utilizam os testes LightCycler™ and TaqMan™ em tempo real têm sido comparados aos imunoensaios GP5+/6+ PCR/enzima (EIA) para avaliar a carga do papilomavírus humano em amostras de raspagem cervical. Ambos os testes de PCR em tempo real determinaram, da mesma forma, a carga de HPV 16 em amostras de raspagem, mas verificou-se pouca concordância entre estes testes e o GP5+/6+ PCR/EIA, sugerindo que o último método não é o adequado para quantificar o ADN do HPV. As cargas do ADN do HPV6/11 e HPV16/18 foram igualmente determinadas por meio de PCR quantitativo fluorgénico em tempo real detectando dos dois tipos de gene HPV de cada vez. Métodos de concepção de iniciador de consenso
Iniciadores e sondas que são utilizados para detectar apenas uma molécula de ácido nucleico do papilomavírus humano, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que 18 codifica uma porção da Ll, pode ser concebida utilizando, por exemplo, um programa de computador tal como OLIGO (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, Colo.) ou Primer3. As caracteristicas apropriadas destes oligonucleótidos são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Existe uma vasta literatura sobre os princípios gerais do desenho do iniciador de PCR, o qual deu lugar a uma série de aplicações de software, principalmente Primer3 e outras extensões. Foi igualmente desenvolvida uma formulação de programação dinâmica rápida para testar iniciadores relativamente à compatibilidade por pares. A aplicação de PCR multiplex tem vindo a aumentar na última década, exigindo protocolos de selecção de iniciador mais sofisticados. Os algoritmos diferentes podem favorecer objectivos ou podem ser concebidos para determinadas plataformas de tecnologia. De modo geral, o problema de identificação de pares de iniciadores para maximizar o nível multiplex de um único teste foi provado como estando completo em termos de NP. Foi apresentado um algoritmo de aproximação que elimina uma complementaridade da base 3' ao mesmo tempo que lida com as limitações da dimensão do produto. 0 método da presente invenção está relacionado com o problema de concepção de testes PCR multiplex, principalmente a concepção de iniciadores de consenso. A abordagem geral desta questão consiste em conceber os iniciadores de consenso para amplificar inúmeros alvos com menos pares de iniciadores do que o número de alvos. Mais ainda, o desenho consideraria ainda as regras de desenho de testes de PCR multiplex, exemplificadas por um herpesvírus de consenso. 19
Foi desenvolvida uma abordagem particular para identificar sequências de genes com relações distantes, baseadas em iniciadores oligonucleótidos hibridos degenerados por consenso (CODEHOPs). Pequenas regiões de proteínas, com níveis altos de conservação, podem ser representadas como blocos de sequências de proteínas de multiplicação alinhadas. Os CODEHOPs derivam destes blocos de sequência conservados e são utilizados no PCR para amplificar a região entre os mesmos. Um iniciador de PCR CODEHOP consiste de um grupo de iniciadores, cada um contendo uma sequência diferente na região principal degenerada 3' , onde cada iniciador faculta uma das possíveis combinações de codão que codificam um motivo de 3-4 aminoácidos conservados alvo de dentro do bloco de sequência. Para além disso, cada iniciador do grupo possui uma região clamp 5' de consenso derivada do nucleótido mais provável em cada posição que codifica os aminoácidos que flanqueiam o motivo alvo. A amplificação é iniciada por emparelhamento e extensão de iniciadores no grupo com a maior similaridade no núcleo 3' degenerado relativamente ao modelo alvo. 0 emparelhamento é estabilizado pelo clamp 5' de consenso, o qual corresponde parcialmente ao modelo alvo. Assim que o iniciador é incorporado, este torna-se o modelo para os ciclos de amplificação subsequentes. Uma vez que todos os iniciadores são idênticos na região clamp 5' de consenso, todos eles emparelharão com elevado rigor durante os ciclos subsequentes de amplificação. Este método tem também sido utilizado no campo da virologia. A abordagem é diferente da abordagem do método da presente invenção, em que são utilizados os blocos de sequência específica para se obter uma amplificação eficaz das 20 respectivas sequências. O programa CODEHOP considera os iniciadores, para efeitos de amplificação, alvos desconhecidos e trabalha com alinhamentos de sequência de proteínas em vez de sequências de ADN.
Existem inúmeros métodos que lidam com o planeamento de iniciadores de consenso/degenerados, mas utilizam normalmente algoritmos diferentes para basicamente resolver o mesmo problema: para identificar o grupo de iniciadores que melhor se adequa em termos de amplificação eficaz das sequências alvo em questão. A colaboração entre iniciadores não é tida em consideração:
Outra abordagem é o programa PriFi (http://cgi-www.daimi.au.dk/csi-chili/PriFi/main) Este programa concebe pares de iniciadores úteis para a amplificação de PCR de ADN genómico em espécies, em que a informação da sequência anterior não se encontra disponível. O programa funciona com um alinhamento de sequências de ADN de espécies filogeneticamente relacionadas e emite uma lista de pares de iniciadores degenerados que preenchem uma série de critérios, de modo a que os iniciadores tenham uma alta probabilidade de amplificar sequências ortólogas em outras espécies filogeneticamente relacionadas. No entanto, o programa não utilize o conceito de colaboração entre iniciadores. 0 programa Amplicon para conceber iniciadores PCR em grupos alinhados de sequências de ADN é um método semelhante. A aplicação mais importante para o Amplicon é o desenho de grupos de iniciadores PCR "específicos de grupo" que amplificam uma região de ADN a partir de um grupo taxonómico, mas não amplificam regiões ortólogas de outros 21 grupos taxonómicos. Uma vez mais, a colaboração entre iniciadores não é tida em consideração. 0 desenho dos iniciadores de reacção de amplificação para detecção por marcação de inúmeros alvos de amplificação relacionados não possui regras directas na literatura. No entanto, é normalmente aceite que as interacções imprevisíveis entre iniciadores e a concorrência para recursos de amplificação diminuem a sensibilidade da reacção e mais iniciadores significam uma probabilidade maior de erros de iniciação, produzindo produtos específicos que competem ainda pelos recursos. 0 papel potencial do teste de HPV no rastreio do carcinoma cervical é altamente dependente da infra-estrutura existente. Em situações clínicas, nas quais se aplica um programa baseado numa citologia bem organizada e eficaz, a questão é saber até que ponto o teste do HPV adiciona ao programa existente e questões custo-eficácia, controlo de qualidade e valor acrescentado à prática actual visível. Por contraste, para situações em que o rastreio é inexistente ou ineficaz devido à fraca qualidade da citologia ou limitações inerentes devido a uma taxa elevada de esfregaços inflamatórios, as questões mais básicas da sensibilidade, especificidade e simplicidade de procedimentos de teste tornam-se fundamentais. A tecnologia de PCR em tempo real oferece características que preenchem e até excedem os requisitos em ambos os cenários acima descritos. Um estudo recente determinou a quantidade do ADN do HPV para alguns do tipos mais frequentes de HPV de alto-risco, como determinantes de progresso de neoplasias cervicais (CIS). A variável do número de cópias por célula não difere entre os tipos de 22 HPV, mas a taxa de probabilidade de CIS no percentil com maior carga virai é substancialmente maior para o HPV 16 (OU = 36,9; 95% Cl = 8,9-153,2) do que para o HPV 31 (OU = 3,2; 95% Cl = 1,1-9,1) ou HPV 18/45 (OU = 2,6; 95% Cl = 1,0-6,4). Por conseguinte, a carga virai do HPV pode ser previsível em termos de risco futuro de CIS cervical numa fase em que o esfregaço é negativo para anomalias escamosas. As tecnologias em tempo real oferecem condições para se determinar a carga virai de modo mais exacto comparativamente aos métodos de detecção de HPV existentes. A tecnologia em tempo real oferece inúmeras vantagens sobre os métodos existentes. No entanto, não foram desenvolvidos métodos de amplificação e detecção que possam detectar mais do que três tipos de papilomavírus humanos em uma reacção. Não foi, igualmente, desenvolvido qualquer método para clinicamente detectar grupos importantes de vírus, por exemplo, papilomavírus humano de baixo risco ou alto risco em grupos em uma reacção.
Um teste com uma auto-amostragem de HPV precisa poderia ter grandes implicações. Um teste destes abre a possibilidade de avaliar as mulheres, as quais, de uma ou outra maneira, não desejam ou são incapazes de se submeter a um exame pélvico. Nas zonas subdesenvolvidas, este teste poderia oferecer uma vantagem sobre a prática actual. Em áreas, em que se efectuam rastreios organizados, as auto-amostragens oferecem uma abordagem adicional para se conseguir alcançar as mulheres que se recusam a fazer um rastreio convencional e podem igualmente desempenhar um papel na vigilância ou monitorização após tratamento de mulheres com HPV positivo e citologias negativas, as quais 23 precisam de se submeter a testes de acompanhamento a curtos intervalos de tempo. A abordagem de auto-amostragem com capacidades de testes quase-doente poderia melhorar a qualidade e a acessibilidade dos programas de rastreio.
Um teste de HPV, orientado para um mercado de rastreio não só convencional como também primário, deveria satisfazer todas estas necessidades. A tecnologia de PCR em tempo real é especialmente adequada para abordar tecnologicamente estes requisitos. A simplicidade inerente da tecnologia ajuda a reduzir as barreiras infra-estruturais e é também mais acessível relativamente a outras tecnologias. Por outro lado, as tecnologias de PCR em tempo real poderiam reforçar a sensibilidade analítica e, melhor ainda, a especificidade da detecção de HPV, facultando uma base mais sólida do melhoramento das contrapartes clínicas destes parâmetros. 0 controlo interno acrescenta capacidades de controlo de qualidade ao sistema.
Na aplicação quase-doente da detecção de HPV, as tecnologias em tempo real são as opções mais viáveis. 0 teste de quase-doente seria a próxima fronteira no rastreio primário e as tecnologias em tempo real estão já a captar uma atenção significativa nesta área, no caso de outros agentes patogénicos e poderão ser um valor acrescentado na prática. A maior sensibilidade do PCR em tempo real comparada com outros métodos, assim como os melhoramentos das características facultados pelo PCR em tempo real, incluindo contenção de amostragem e detecção em tempo real do produto amplificado indicam a viabilidade da implementação dessa tecnologia para o diagnóstico de rotina 24 de infecções por papilomavírus humano no laboratório clínico.
Tsourkas et al. (Briefings in functional genomics and proteomics, Vol. I., No. 4, 372-384 2003) descrevem a utilização de sondas molecular beacon na detecção e identificação de agentes patogénicos. As sondas molecular beacon descritas incluem tipicamente braços de quatros a seis pares de bases.
No primeiro aspecto, a presente invenção apresenta um método para detectar a presença de, pelo menos, um agente patogénico que inclui o contacto com um ácido nucleico obtido a partir de uma amostra com um conjunto que inclui, pelo menos quatro sondas, em que cada uma das sondas referidas inclui uma sequência complementar da sequência de um agente patogénico flanqueado por quatro ou cinco pares de bases complementares, em que as referidas bases formam uma estrutura em braço ou haste na ausência de hibridação para um ácido nucleico de um agente patogénico, em que a referida sonda é marcada com um primeiro marcador interactivo e um segundo marcador interactivo, de modo a que a hibridação da referida sonda para um ácido nucleico de um agente patogénico cause uma mudança no sinal detectado.
Tal como presentemente utilizado, "ácido nucleico" designa ADN e ARN nas suas diversas formas tais como mARN e hnARN. O ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla.
Tal como presentemente utilizado, um "agente patogénico" significa um agente biológico que interrompe a fisiologia normal de um animal e que causa ou que está associado a uma doença. O agente patogénico pode ser um 25 agente causador, isto é, infecção de um doente com o agente patogénico produz a doença isoladamente ou na presença de um ou mais co-factores.
Preferencialmente, o agente patogénico é um organismo associado a uma doença sexualmente transmissível. Tal como aqui utilizado, o termo "organismo associado a uma doença sexualmente transmissível" refere-se a um organismo que se encontra presente em doentes que sofrem de doença sexualmente transmissível. Exemplos de organismos associados a doença sexualmente transmissível incluem Clamidia tracomatis, que é associada a clamidia, Neisseria gonorreia, que é associada a gonorreia, vírus do herpes simples (HSV) que é associado ao herpes genital, pappilomavírus humano que é associado a verrugas genitais e Treponema pálido que é associado à sífilis. 0 organismo é preferencialmente um vírus, mais preferencialmente um papilomavírus humano (HPV). 0 método é preferencialmente utilizado para detectar a presença de um ou mais genotipos HPV.
Embora o método da presente invenção se refira à detecção de um agente patogénico, este método pode ser utilizado para detectar a presença ou ausência de qualquer organismo, principalmente organismos que contêm mais do que uma sub-espécie ou organismos relacionados. Tal como presentemente utilizado, "organismos relacionados" designam organismos que pertencem à mesma classe, género ou espécie e que possuem um nível elevado de similaridade, preferencialmente, pelo menos 80% de identidade, mais preferencialmente 90%. Os organismos relacionados são preferencialmente vírus, mais preferencialmente papilomavírus humanos. 26
Cada uma das sondas tem preferencialmente a estrutura geral 3' - braço -F- sequência complementar de HPV - F'- braço - 5' F e F' são sequências de ligações opcionais que ligam as sequências complementares aos pares de bases flanqueadoras, braço e braço', "braço e braço'" são as sequências formadas pelos pares de bases complementares que formam uma estrutura em haste de hélice dupla na solução. Estas sequências são preferencialmente palindrómicas. Existem preferencialmente 4 bases em cada extremidade da sonda. As bases que constituem o braço ou haste incluem preferencialmente pares C-G e ainda preferencialmente 1, 2, 3, 4 ou 5 pares C-G. 0 braço tem, preferencialmente a sequência CGCG.
Foi determinado, pelas nossas experiências, que os as sondas molecular beacon com braços de quatro pares de bases não interagem uns com uns outros causando um sinal de amplificação falso imprevisível com o tempo, na ausência de ADN alvo detectável, o qual parece depender da variação on-off da estrutura do braço. Ocasionalmente, as sondas molecular beacon de braço de cinco pares de bases precisam ser utilizadas para efeitos de optimização de reacção. As sondas molecular beacon com braços mais compridos em detecção singleplex e multiplex exerceram sinais de amplificação falsos e não controláveis. As sondas molecular beacon de braços mais pequenos têm normalmente temperaturas de fusão demasiado baixas para serem úteis à reacção de amplificação em tempo real. 27 0 termo "marcador interactivo", tal como presentemente utilizado, designa um marcador de um par de marcadores, o qual colabora com o outro do par dos marcadores. Esta colaboração ocorre quando os marcadores estão em estreita proximidade, tal como quando as sondas possuem uma estrutura semi-circular com ansa e haste. Quando a sonda híbrida para um ácido nucleico complementar, a colaboração entre os marcadores é diminuída ou removida totalmente à medida que a distância entre estes aumenta. Os marcadores são ligados às sondas em cada extremidade da sonda, preferencialmente na extremidade da sonda ou adjacente às bases complementares que formam a estrutura semicircular. 0 local em que os marcadores se ligam é irrelevante, considerando que pode ser detectado uma mudança no sinal quando a sonda muda de uma conformação para outra, isto é, semicircular para aberta. A mudança no sinal pode ser um aumento no sinal quando a sonda se encontra na posição aberta, isto é, quando híbrida com uma sequência de ácido nucleico, por exemplo, quando um marcador interactivo absorve o sinal do segundo marcador interactivo. Em alternativa, a mudança no sinal pode ser uma redução no sinal quando a sonda se encontra na posição de aberta, quando híbrida com uma sequência de ácido nucleico complementar, por exemplo, quando o primeiro marcador interactivo faz com que um sinal seja emitido a partir do segundo marcador interactivo.
Em uma forma de realização preferida, os marcadores interactivos são um dador FRET e um aceitador FRET correspondente.
Tecnologia FRET (consulte, por exemplo, patente norte-americana nos. 4, 996, 143, 5, 565, 322, 5, 849, 489 e 6, 162, 603) 28 é baseada no facto de que quando um dador e uma fracção fluorescente aceitadora correspondente se encontram posicionados dentro de uma determinada distância um do outro, ocorre uma transferência de energia entre as duas fracções fluorescentes que pode ser visualizada ou detectada de outra forma e/ou quantificada. Tal como presentemente utilizado, o formato da tecnologia FRET utiliza tecnologia das sondas molecular beacons para detectar a presença ou ausência de um papilomavírus humano. A tecnologia das sondas molecular beacons utiliza uma sonda de hibridação marcada com uma fracção dadora fluorescente e uma fracção aceitadora fluorescente. Os marcadores fluorescentes são normalmente marcados em cada extremidade da sonda. A tecnologia das sondas molecular beacons utiliza uma sonda oligonucleótida com sequências que permitem a formação de uma estrutura secundária (por exemplo, em gancho). Como resultado da formação de estrutura secundária dentro da sonda, ambas as fracções fluorescentes ficam em proximidade espacial quando a sonda se encontra na solução. Após hibridação para os ácidos nucleicos alvo (isto é, o ácido nucleico para o genotipo de HPV), a estrutura secundária da sonda é interrompida e as fracções fluorescentes ficam separadas uma da outra de modo a que após excitação com luz de uma onda de comprimento adequada, a emissão da primeira fracção fluorescente seja diferente da detectada na ausência de um ácido nucleico de um genotipo de HPV.
Tal como presentemente utilizado, no que respeita ao dador e fracções aceitadoras fluorescentes correspondentes, "correspondentes" refere-se a uma fracção aceitadora fluorescente com um espectro de emissão que se sobrepõe ao 29 espectro de excitação de uma fracção dadora fluorescente. 0 comprimento máximo da onda da emissão do espectro da fracção do aceitador fluorescente deverá ser preferencialmente, pelo menos 100 nm maior do que comprimento máximo da onda do espectro de excitação da fracção dadora fluorescente. Mais ainda, a transferência de energia não radioactiva eficaz pode ser produzida entre os mesmos.
As fracções dadoras e aceitadoras fluorescentes são normalmente escolhidas por (a) transferência de energia de alta eficácia de Forster; (b) um grande desvio final de Stokes (>100 nm) ; (c) desvio da emissão o mais possível na zona vermelha do espectro visível (>600 nm) ; e (d) desvio da emissão para um comprimento de onda maior do que a emissão de água fluorescente de Raman produzido por excitação no comprimento de onda do dador de excitação. Por exemplo, uma fracção dadora fluorescente pode ser escolhida considerando que possui a sua excitação máxima perto de uma linha laser (por exemplo, Hélio-Cádmio 442 nm ou Árgon 448 nm) , um coeficiente de extinção elevado, um rendimento quântico elevado e uma boa sobreposição da sua emissão fluorescente com o espectro de excitação da fracção aceitadora fluorescente correspondente. Uma fracção aceitadora fluorescente correspondente pode ser escolhida considerando que possui um coeficiente de extinção alto, um nível quântico alto, uma boa sobreposição da sua excitação com a emissão da fracção dadora fluorescente e emissão na parte vermelha do espectro visível (>600 nm)
Fracções dadoras fluorescentes representativas que podem ser utilizadas com várias fracções aceitadoras fluorescentes na tecnologia FRET incluem fluoresceína, 30
Amarelo Lucifer, B-ficoeritrina, isotiocianato de 9-acridina , Amarelo Lucifer VS, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2, 2'-disulfónico, 7-dietilamino-3-(4 '-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina, sucinimidil 1-pireno butirato, derivados de ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatostilbene-2,2'-disulfónico, opcionalmente pirenos substituídos, antracenos, naftalenos, acridinas, estilbenos, indóis, benzindóis, oxazóis, benzoxazóis, tiazóis, benzotiazóis, 4-amino-7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazóis, cianinas, carbocianinas, carbostirilos, porfirinas, salicilatos, antranilatos, azulenos, perilenes, piridinas, quinolinas, cumarinas, poliazaindacenos, xantenos, oxazinas, benzoxazinas, carbazinas, fenalenones, benzfenalenones, carbazinas, oxazinas, 4-bora-3a,4a-diaza-s-indacenos, fluoroforesceínas, rodaminas, rodoles, 5-carboxifluoroforesceínas (FAM) , ácidos 5—(2' — aminoetil)aminonaftaleno-l-sulfónicos (EDNS), antranilamidas, quelatos de térbio, vermelho 4 Reactivo, vermelho Texas, corantes ATTO, corantes EVO, corantes DYO, corantes Alexa e corantes BODIPY.
Fracções aceitadoras fluorescentes representativas que dependem da fracção dadora fluorescente utilizada, incluem LC. TM. -RED 640 (LightCycler. TM. -Red 640-N-hidroxisuccinimida éster), LC. TM. -RED 705 (Ligh,tCycler. TM. -Red 705- Phosphoramidite), corantes de cianina tal como CY5 e CY5 5, Lissamina rodamina B cloreto de sulfonilo, isotiocianato de tetrametil rodamina, isotiocianato de rodamina x, isotiocianato de eritrosina, fluoresceína, pentacetato de dietilenetriamina ou outros quelatos de iões de lantanídeo (por exemplo, Európio, ou Térbio). Fracções dadoras ou aceitadoras fluorescentes 31 podem ser obtidas, por exemplo, de Molecular Probes (Junction City, Oreg.) ou Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo. ) .
Preferencialmente, a fracção receptora fluorescente é um quencher. Tal como presentemente utilizado, um quencher é uma fracção, a qual diminui a fluorescência emitida por um marcador fluorescente. Isto inclui inibição total e parcial da emissão da fluorescência. 0 grau de inibição não é importante desde que a mudança na fluorescência possa ser detectada assim que o quencher é removido. A fracção absorvente é preferencialmente seleccionada do grupo que consiste de fenilos, naftilos, antracenilos, benzotiazóis, benzoxazóis, orbenzimidazóis, pirenos, antracenos, naftalenos, acridinas, estilbenos, indóis, benzindóis, oxazóis, benzoxazóis, tiazóis, benzotiazóis, 4-amino-7-nitrobenz-2-oxa-l, 3-diazóis, cianinas, carbocianinas, carbonoestirilos, porfirinos, salicilatos, antranilatos, azulenos, perilenos, piridinas, quinolinas, coumarinas, poliazaindacenos, xantenos, oxazinas, benzoxazinas, carbazinas, fenalenones, benzphenalenones, carbazines, oxazines, 4-bora-3a,4a-diaza-s-indacenos, fluoroforesceinas, rodaminas, rodols, 5-carboxi-fluoroforesceinas (FAM), ácidos 5-(2'-aminoetil) aminonaftaleno-l-sulfónicos (EDANS), antranilamidas, quelatos de térbio, vermelho 4 reactivo, dabcils, nitrotirosinas, verdes malaquite, vermelhos Texas, dinitrobenzenos, corantes ATTO, corantes EVO, corantes DYO, corantes Alexa e corantes BODIPY opcionalmente substituídos. 32 A selecção de pares adequados de dadores e aceitadores ou quenchers FRET encontra-se dentro do conhecimento do indivíduo especialista na matéria.
Normalmente, quando o FRET é detectado numa quantidade estatisticamente diferente da quantidade de FRET em uma amostra, na qual falta a molécula de ácido nucleico do papilomavírus humano, é indicada a presença de uma infecção de papilomavírus no indivíduo. Hibridação da sonda para o ácido nucleico aumenta a distância entre a fracção dadora e receptora, e, deste modo, a interacção do FRET é reduzida. A mudança na emissão do comprimento da onda pode ser um aumento na emissão ou emissão em um comprimento de onda diferente tal como quando se utiliza um quencher. Em alternativa, pode verificar-se uma redução na emissão ou emissão em um comprimento de onda diferente quando se utiliza um aceitador dador não-absorvente. A análise fluorescente pode ser conduzida utilizando, por exemplo, um sistema de microscópio epifluorescente com contagem de fotões (contendo o espelho dicróico e filtros apropriados para efeitos de monitoração de emissão fluorescente na gama particular), um sistema fotomultiplicador com contagem de fotões ou um fluorómetro. A excitação para se iniciar a transferência de energia pode ser conduzida com um laser de iões de árgon, uma lâmpada de arco de mercúrio de alta intensidade (Hg), uma fonte de luz de fibra óptica ou outro tipo de fonte de luz de alta intensidade devidamente filtrada para excitação na gama desejada.
As fracções dadoras e aceitadoras fluorescentes são preferencialmente ligadas à sonda nas sequências de ligação. As fracções dadoras e receptoras fluorescentes 33 podem ser ligadas à sonda oligonucleótida apropriada através de um braço de ligação. 0 comprimento de cada braço de ligação é igualmente importante, uma vez gue os braços de ligação irão afectar a distância entre a fracção dadora fluorescente e a fracção aceitadora fluorescente. Para efeitos da presente invenção, o comprimento de um braço de ligação é a distância em Angstroms (ANG) da base de nucleótidos para a fracção fluorescente. De modo geral, um braço de ligação é de aproximadamente 10 a cerca de 25 ANG. O braço de ligação pode ser do tipo descrito em WO 84/03285. A WO 84/03285 apresenta igualmente métodos para ligar braços de ligação a bases de nucleótidos particulares assim como para ligar fracções fluorescentes a um braço de ligação. A sonda deve ter um nivel suficiente de identidade com o ácido nucleico do agente patogénico ou organismo associado a doença sexualmente transmissível de modo a gue possa hibridar com ácido nucleico de um ou mais agentes patogénicos ou organismos associados a uma doença sexualmente transmissível mediante determinadas condições. Diz-se que um ácido nucleico de cadeia simples hibrida para um outro caso se verificarem formas duplas entre os mesmos. Esta situação ocorre quando um ácido nucleico contém uma sequência que é o inverso ou complemento do outro (esta mesma situação dá lugar à interacção natural entre as cadeias sense e anti sense de ADN no genoma e salienta a configuração da hélice dupla). A complementaridade completa entre regiões de hibridação não é necessária de modo a que se forme um duplex; é apenas necessário que o número de bases par seja suficiente para manter o duplex mediante as condições de hibridação utilizadas. É frequentemente 34 desejável ter um ou mais desemparelhamentos entre a sequência da sonda e a do genoma do agente patogénico. Tal é necessário para evitar a formação de estruturas secundárias indesejadas dentro da sonda. Deste modo, em uma forma de realização preferencial, a sequência única para o agente patogénico dentro da sonda contém, pelo menos, um desemparelhamento com a sequência genómica do agente patogénico. As condições de hibridação adequadas são bem conhecidas pelos especialistas na técnica. Por exemplo, 0,2 x SSC/0,1% SDS a 42°C. (para condições de restringência moderada) e 0,1 x SSC a 68° C. (para condições de restringência elevada). A lavagem pode ser realizada utilizando apenas uma das condições indicadas, ou pode ser utilizada cada uma das condições (por exemplo, lavagem durante 10 - 15 minutos cada pela ordem acima indicada).
Pode ser repetida qualquer uma ou todas as lavagens. As condições ideais irão variar e podem ser determinadas empiricamente pelo especialista na técnica. O grau de identidade entre a sonda e o ácido nucleico do agente patogénico irá variar dependendo da função da sonda. Por exemplo, a sonda pode ser utilizada para identificar a presença de todas as subespécies do agente patogénico, por exemplo, todos os tipos de genotipos de HPV, em que cada caso a sonda terá uma sequência que irá hibridar para uma sequência de uma região de um ácido nucleico o qual é altamente conservado entre todas as subespécies, tais como genotipos de HPV.
Uma sonda pode ser utilizada para detectar a presença de agentes patogénicos, por exemplo, genotipos de HPV, de um determinado grupo de risco, por exemplo, genotipos de alto risco ou baixo risco ou outros. A sequência da sonda 35 irá ser devidamente delineada. Por exemplo, uma sonda pode ser concebida para detectar genotipos de alto risco, os quais podem ligar-se aos tipos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, e 73, mas não ácidos nucleicos de outros genotipos. Estes são designados como "sondas de grupos de risco".
Alternativamente, cada sonda pode ter uma sequência com um alto nivel de semelhança relativamente a uma região variável de um genotipo especifico de modo a que hibride apenas um ácido nucleico desse genotipo. Estas sondas são denominadas "específicos do genotipo". Os membros de sondas específicas do tipo papilomavírus humano podem hibridar dentro de regiões específicas do genotipo, preferencialmente aquelas que incluem SEQ ID Nos: 53 a 103 no ADN amplificado. As sondas específicas do genotipo de HPV incluem preferencialmente uma sequência seleccionada das SEQ ID Nos: 33 a 52 ou SEQ ID. Nos. 105 a 117. Estas sequências formam toda ou parte da sequência única do agente patogénico. O grupo de sondas inclui, pelo menos, quarto sondas, preferencialmente 5, 10, 15 ou 20 sondas diferentes. As sondas são cuidadosamente concebidas de modo a que a sequência contida na "ansa" da estrutura semi-circular, não só híbrida com a sequência desejada no ácido nucleico a ser detectado, como também não forma estruturas secundárias com sequências nas ansas de outras sondas. Deste modo, as sequências para a parte semicircular das sondas não são normalmente apenas uma sequência que é 100% complementar à sequência no genoma a ser detectada. Preferencialmente, as sondas específicas do tipo papilomavírus humano podem hibridar dentro de regiões genotipo específicas definidas, 36 preferencialmente aquelas que incluem SEQ ID Nos: 53 a 103 ou SEQ ID. Nos. 105 a 117. Em uma forma de realização preferencial, cada sonda inclui uma sequência seleccionada das SEQ ID. NOS: 33 a 52 ou SEQ ID. Nos. 105 a 117. Em uma forma de realização particularmente preferencial, o grupo de sondas inclui: 5'TET-CGGCGGGTCATCCTTA I I I I I CCATAAGCCG-Dabcyl-3' 5TET-CGGCGGGACATCCATATTACTCTATCAAAGCCG-Dabcyl-3' 5'TET-CGCGGGTCACCCTTATTACTCTATTACAAAACGCG-Dabcyl-3' 5'TET-CCGGCACCCATATTTCCCCCTTAAACCGG-Dabcyl-3' 5'TET-CCGGACGACCAGCAAACAAGACACCCGG-Dabcyl-3' 5'FAM-CGGCCAATAACAAAATATTAGTTCCTAAAGCCG-Dabcyl-3' 5'FAM-CCGGTATCCTGCTTATTGCCACCCCGG-Dabcyl-3' 5'FAM-CGGCCATACCTAAATCTGACAATCCGCCG-Dabcyl-3' 5'FAM-GCCG TTTTTTAGCGTTAGTAGGATTTTTCGGC-Dabcyl-3' 5'FAM-CGGCAAAACAAGATTCTAATAAAATAGCAGCCG-Dabcyl-3' 5'FAM-CGGCTTAAAGTGGGTATGAATGGTTGGCCG-Dabcyl-3' 5'FAM-CCGGGCTGTTCCTAAGGTATCCGCCGG-Dabcyl-3' 5'FAM-CGGCAGCACGCGTTGAGGTTTTAGCCG-Dabcyl-3' 5'FAM-CCGGAGTTTTAGTTCCCAAGGTGTCCCGG-Dabcyl-3' 5'FAM-CCCGCTGTGACTAAGGACAATACCAAACGGG-Dabcyl-3' 5'FAM-CGGCTTCCATCAAAAGTCCCAATAACGCCG-Dabcyl-3' 5'FAM-CGGCAAAGGTGGTAATGGTAGACAGGGCCG-Dabcyl-3' 5'FAM-CGGCAATCTGGTACCAAAACAAACATCGCCG-Dabcyl-3' 5'FAM-CGGCTTAAGGTTCCTATGTCTGGGGGCCG-Dabcyl-3' and 5' (Texas Red)-TTTTTT-(fluorescein) CGGCTGACATAGATCCCCATAGACAGTTGCCG-Dabcyl-3' A presença de agentes patogénicos de um determinado grupo de risco pode ser detectada de duas formas: Primeiramente, sondas de "grupo de risco" podem ser utilizadas. Preferencialmente, o grupo de sondas contém 37 mais do que um tipo de sonda de grupo de risco, em que cada tipo é diferentemente marcado. Por exemplo, uma sonda de alto risco pode ser distinguida de uma sonda de baixo risco. Por conseguinte, a presença de um agente patogénico, tal como o HPV, pode ser detectada em qualquer destes grupos de risco. Em alternativa, o grupo de sondas pode incluir sondas de especificas do genotipo, em que todas as sondas para genotipos de um determinado grupo de risco, por exemplo, genotipos de alto risco são todos marcados pelo mesmo marcador interactivo. Deste modo, a identidade dos genotipos específicos presentes pode não ser determinada, mas a presença de um genotipo de um determinado grupo pode ser confirmada.
Em uma forma de realização preferencial, o método inclui ainda determinar a temperatura de fusão da molécula de ácido nucleico de cadeia dupla formada por uma das referidas sondas e ácido nucleico complementar obtido da referida amostra. Uma vez que cada sonda possui uma determinada sequência de ácido nucleico, a temperatura de fusão da molécula de ácido nucleico de cadeia dupla formada pelas sondas e pelo ácido nucleico complementar obtido da referida sonda é única para cada sonda. Assim, o agente patogénico específico ou genotipo presente pode ser detectado. Por exemplo, pode ser utilizado um grupo de sondas específicas para um determinado grupo de risco de modo a assegurar se algum dos genotipos desse grupo de encontra presente. A temperatura de fusão pode então ser determinada para identificar quais os genotipos específicos presentes. 0 método para detectar individualmente tipos de HPV pode ser efectuado após o método ter sido realizado para 38 detectar a família humana, género, grupos ou concorrentes de papilomavírus humano com o método para detectar papilomavírus humano.
Se for utilizada mais do que uma sonda, estas podem preferencialmente ser distinguidas umas das outras, isto é, cada sonda emite um sinal detectavelmente diferente quando excitadas a um determinado comprimento de onda. Deste modo, são utilizadas duas sondas. Uma irá emitir a um comprimento de onda quando é hibridada para um ácido nucleico do agente patogénico que pode ser distinguido a partir de ambas as sondas na solução (isto é, não hibridadas no ácido nucleico do agente patogénico tal como o genotipo de HPV) e a outra sonda quando é hibridada para o ácido nucleico do agente patogénico. Tal permite a presença de ambas as sondas hibridadas para o ácido nucleico a ser visualizado ao mesmo tempo. Alternativamente, as duas sondas são marcadas com marcadores interactivos diferentes, por exemplo, dadores FRET, os quais são excitados em diferentes comprimentos de onda. Tal pode ser obtido utilizando combinações diferentes de marcadores interactivos, tais como dadores e aceitadores FRET. A selecção de combinações adequadas de marcadores interactivos é uma rotina para os especialistas na técnica. 0 método detecta preferencialmente a presença de quatro ou mais agentes patogénicos ou genotipos, utilizando quatro ou mais sondas. Preferencialmente, as sondas são ligadas a uma fase sólida de modo a que cada tipo de sonda seja uma localização espacialmente definida a qual é distinguível das localizações das restantes sondas. Tal situação permite que sondas marcadas com o mesmo ou semelhante marcador interactivo, o qual produz um sinal no mesmo ou semelhante comprimento de onda sejam utilizadas, ao mesmo tempo que 39 faculta ainda meios para distinguir o sinal produzido por cada sonda. Alternativamente, as sondas podem ser marcadas de modo a que sinais diferentes sejam produzidos por cada tipo de sonda. 0 especialista na técnica irá compreender que uma variedade de suportes sólidos possíveis seja de uso comum na produção de redes de sondas da presente invenção.
Em uma forma de realização preferida, é facultado um método para construção de uma reacção para se atingir a detecção de inúmeros alvos de detecção relacionados, utilizando, pelo menos, quatro sondas molecular beacon em tempo real numa reacção. 0 método inclui a selecção de locais de ligação à sonda, determinando a sequência de sondas, as quais satisfazem os critérios normalmente aplicados às sondas (por exemplo, verificar as sondas em um programa informático relativamente a complementaridade total, como o Primer3) e adicionar bases, preferencialmente quatro ou cinco bases, à sequência da sonda, em ambas as extremidades, tornando as mesmas complementares e com capacidade para formar troncos de cadeia dupla envolvendo exactamente as duas extremidades dos mesmos oligonucleótidos. Estas estruturas são normalmente chamadas molecular beacons de quatro braços. Além disso, o ponto de fusão da sequência da sonda deverá ser maior do que o ponto de fusão da estrutura braço, quando medido mediante aquecimento equilibrado e variações de arrefecimento. Os molecular beacons com tronco de quarto bases são normalmente vantajosos relativamente a outros comprimentos de tronco que possuem variações on-off menores que os troncos mais compridos e que possuem temperatura de fusão mais alta do que os molecular beacons de tronco menor. 40
Normalmente, os membros das misturas da sonda hibridam para amplificar o produto dentro de uma determinada região específica do tipo. As sondas são normalmente marcadas com uma fracção dadora fluorescente numa extremidade e na outra extremidade são normalmente marcadas com uma fracção receptora ou quencher correspondente. Em algumas concretizações, a fracção dadora fluorescente epode conter um complexo específico de corantes fluorescentes, incluindo as denominadas harvester dyes, para mudar o comprimento de onda da emissão da sonda de modo a providenciar um único sinal fluorescente para detecção. 0 método inclui ainda a detecção da presença, ausência ou mudança na transferência de energia fluorescente por ressonância (FRET) entre a fracção dadora fluorescente e a fracção aceitadora ou quencher fluorescente. A presença de ou mudança na FRET é indicativa da presença de papilomavírus humano na amostra biológica, enquanto que a ausência de FRET é indicativa de ausência de papilomavírus humano na amostra biológica.
Normalmente, o ácido nucleico é hibridado com a sonda e excitado a um comprimento de onda absorvido pela fracção dadora fluorescente. A presença ou ausência da sonda de ligação é detectada ao se visualizar e/ou medir o comprimento de onda emitido pela fracção aceitadora ou quencher fluorescente. Em alternativa, pode também ser detectada ao se quantificar a FRET.
Em uma forma de realização preferencial, o ácido nucleico obtido de uma amostra é amplificado antes de ser colocado em contacto com o referido grupo de sondas. Preferencialmente, a amplificação é realizada utilizando uma reacção em cadeia de polimerase (PCR) . A reacção da amplificação pode ser a PCR (consulte, por exemplo, 41 patentes norte-americanas nos. 4, 683, 195 e 4, 683, 202, e Innis et al, editores, PCR Protocols, (Academic Press, New York, 1989; Sambrook et al, Molecular Cloning, Second Edition, (Cold Spring Harbour
Laboratory, Nova Iorque 1989) ) . A PCR pode ser igualmente utilizada quando o ARN se encontra isolado e convertido, preferencialmente por transcrição reversa, para cADN. Preferencialmente, a PCR é realizada utilizando ADN polimerase Taq, por exemplo, Amplitaq™ (Perkin- Elmer, Norwalk, Conn. ). Polimerase Taq pode igualmente ser obtida de MBI Fermentas Perkin Elmer, Boehringer Mannheim and Beckman Instruments. Uma polimerase de ADN equivalente, preferencialmente termoestável, pode igualmente ser utilizada no método da presente invenção, tal como polimerase Tfl (Thermus flavus) (Gut e tal., Virol. Methods 77(1) : 37-46 (1999)) .
Em alternativa, a reacção da amplificação pode ser RT-PCR (Yajima et al, Clin. Chem, 44(12): 2441 -2445 (1998); Martell et al, J. Clin. Microbiol., 37(2): 327-332 (1999); Gut et al, Virol. Methods 77(1): 37-46 (1999); Predhomme et al, Leukemia, 13(6): 957-964 (1999)), nos quais o ARN é transcrito de modo inverso em cADN, o qual é então sujeito a amplificação de PCR.
Tal como bem conhecido, a PCR envolve a extracção e desnaturação (preferencialmente por meio de calor) de uma amostra de ADN (ou ARN) . É adicionado um excesso molar de iniciadores oligonucleótidos, em conjunto com polimerase, que pode ser termicamente estável e dNTPs para formar a sequência amplificada. Os iniciadores oligonucleótidos são concebidos para hibridar as extremidades opostas da sequência desejada para amplificação. No primeiro ciclo da 42 amplificação, a polimerase replica o ADN para produzir dois "produtos longos", os quais começam com os respectivos iniciadores. 0 ADN total, o qual inclui os dois produtos longos e duas cadeias originais, é depois desnaturado e realiza-se uma nova volta de polimerização. 0 resultado do segundo ciclo é: duas cadeias originais, os dois produtos longos do primeiro ciclo, dois longos produtos novos (produzidos a partir das cadeias originais) e dois "produtos curtos" produzidos a partir dos produtos longos. Estes produtos curtos possuem a sequência da sequência-alvo (sense ou anti sense) com um iniciador em cada extremidade. Para cada volta de amplificação adicional, o número de produtos curtos cresce exponencialmente, sendo que cada ciclo produz dois produtos longos adicionais e um número de produtos curtos igual à soma dos produtos longos e curtos que permanecem na extremidade do ciclo anterior.
Os iniciadores oligonucleótidos podem ser sintetizados mediante um número de abordagens, por exemplo, Ozaki e tal., Nuc. Acids Res. 20: 5205-5214 (1992); Agrawal et al, Nuc. Acids Res. 18: 5419-5423 (1990) ou semelhantes. Convenientemente, as sondas oligonucleótidos são sintetizadas em um sintetizador automatizado de ADN, por exemplo, um sintetizador Applied Biosystems, Inc, Foster City, Califórnia modelo 392 ou 394 ADN/ARN utilizando reacções químicas estandardizadas tais como química fosforamidita (Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48 2223-2311 (1992), US Patentes Nos. 4980460, 4725677, 4415732, 4458066 e 4973679). Químicas alternativas, incluindo grupos de estruturas não naturais tais como fosforotioato e fosforamidato, podem ser igualmente empregues, considerando que a eficácia da hibridação dos oligonucleótidos 43 resultantes não é afectada adversamente. 0 comprimento exacto e sequência dos iniciadores de ADN irão depender do polinucleótido alvo a ser amplificado. Preferencialmente, o comprimento dos iniciadores de ADN varia entre 10 a 60 nucleótidos e mais preferencialmente entre 15 a 30 ou 25 nucleótidos.
Preferencialmente, a produção do ácido nucleico amplificada é monitorada continuamente. Tal como presentemente utilizado, "monitorado continuamente" significa que a quantidade do produto amplificado é avaliado numa base regular. Por exemplo, pode fazer-se uma leitura após o primeiro ciclo de amplificação e posteriormente após cada um, dois ou cinco ciclos. Alternativamente, as avaliações da quantidade de produto amplificado presente podem ser efectuadas após um determinado período de tempo, por exemplo, cada um, dois, cinco ou dez segundos. Esta situação permite que o processo seja monitorado em "tempo real". O especialista na técnica irá compreender que o nível do sinal produzido pelas sondas ligadas irá flutuar à medida que o ciclo passa pelas várias fases de emparelhamento, amplificação e desnaturação.
Os métodos convencionais de PCR em conjunto com a tecnologia FRET podem ser utilizados para praticar os métodos da invenção. Em uma concretização, é utilizado um termociclador rápido tal como o instrumento LIGHTCYCLER™ . É possível encontrar no site da Roche, uma descrição detalhada do Sistema LIGHTCYCLER™ e monitoração de PCR Online e em tempo real. Os seguintes pedidos de patente descrevem a PCR em tempo real tal como utilizada na tecnologia LIGHTCYCLER™. WO 97/46707, WO 97/46714 e WO 97/46712. O instrumento LIGHTCYCLER™ é um termociclador 44 rápido combinado com um fluorimetro de microvolume que utiliza ópticas de alta qualidade. Esta técnica de termociclagem utilize cuvetes de vidro fino como reactores. 0 aquecimento e arrefecimento da câmara de reacção são cntrolados por alternância de ar aquecido e à temperatura ambiente. Devido à massa baixa de ar e à taxa elevada de área de superfície para o volume das cuvetes, podem atingir-se taxas de variação térmica muito rápidas dentro da câmara térmica. 0 instrumento permite que a PCR seja monitorada em tempo real e online. Mais ainda, as cuvetes servem como elemento óptico para recolha de sinal (semelhante aos dispositivos ópticos de fibra de vidro), concentrando o sinal na ponta da cuvete. 0 efeito consiste numa iluminação eficaz e monitoração fluorescente de amostras de microvolume. 0 carrossel com as cuvetes pode ser removido do instrumento. Por conseguinte, as amostras podem ser carregadas fora do instrumento (por exemplo, numa Sala de PCR Limpa). Além disso, esta característica permite a fácil limpeza do carrossel das amostras. 0 lfuorímetro, enquanto parte do aparelho, acomoda a fonte de luz. A luz emitida é filtrada e focada por lentes epi-iluminação no topo da cuvete. A luz fluorescente emitida da amostra é depois focada pela mesma lente, passada através de um espelho dicróico, filtrada apropriadamente e focada nos foto-híbridos de recolha de dados. A unidade óptica no instrumento inclui de preferência três filtros passa-banda (530 nm, 640 nm e 710 nm) , proporcionando uma detecção a seis cores e várias opções de aquisição de fluorescência. A presente invenção, contudo, não está limitada pela configuração de um instrumento disponível comercialmente. As opções de recolha de dados incluem uma vigilância uma 45 vez a cada ciclo, recolha de amostra única totalmente continua para análise da curva de fusão, amostragem continua (em que a frequência de amostragem depende do número da amostra) e/ou medição faseada de todas as amostras segundo um intervalo de temperatura definido. 0 termociclador funciona de preferência com uma estação de trabalho PC e pode utilizar o sistema operativo Windows NT. Os sinais das amostras são obtidos à medida que a máquina posiciona os capilares sequencialmente sobre a unidade óptica. 0 software pode exibir os sinais de fluorescência em tempo-real, imediatamente a seguir a cada medição. 0 tempo de aquisição da fluorescência é de 10 a 100 mseg. Após cada ciclo, pode-se actualizar continuamente uma visualização quantitativa da fluorescência vs, número de ciclos para todas as amostras. Os dados gerados podem ser guardados para posterior análise.
Numa forma de realização preferida, o ácido nucleico é amplificado utilizando pelo menos um iniciador seleccionado de entre as Seq Id No 1 a 32, mais preferencialmente utilizando uma mistura de iniciadores compreendendo as Seq Id No. 1 a 32.
Numa forma de realização preferida, o método utiliza um ADN de controlo interno, natural ou artificial, de preferência detectando o sinal ou emissão FRET a um comprimento de onda distinguível, diferente ou independentemente dos comprimentos de onda de emissão utilizados detectando as alterações de emissão numa localização distinguível espacialmente de sondas ligadas a fases sólidas.
Os métodos anteriormente descritos podem ainda incluir a amplificação preventiva de ácidos nucleicos contaminantes 46 de reacções de amplificação anteriores. A prevenção desta amplificação indesejada pode incluir a realização da fase de amplificação na presença de de uracilo e tratamento da amostra biológica com uracil-ADN glicolase antes de uma primeira fase de amplificação. Além disso, o ciclo pode ser executado numa amostra de controlo separada para confirmar as condições adequadas de amplificação. Uma amostra de controlo pode incluir uma porção da molécula do ácido nucleico do papilomavírus humano. Em alternativa, uma amostra de controlo destas pode ser amplificada utilizando um par de iniciadores de controlo e hibridada utilizando um par de sondas de controlo. Um produto da amplificação de controlo é produzido se o modelo de controlo estiver presente na amostra e as sondas de controlo hibridarem para o produto da amplificação de controlo.
Os métodos da presente invenção são efectuados em ácidos nucleicos obtidos a partir de uma amostra biológica. As amostras biológicas representativas incluem raspagens cervicais, esfregaços ou secções de tecido parafinados, outras raspagens de sítios anatómicos onde se verificam infecções por papilomavírus humano e urina. De preferência, a amostra é seleccionado de entre aspirados brônquicos, urina, líquido obtido por massagem prostática, ejaculado, amostras citológicas, raspagens ou biópsias de sangue e do colo do útero, da vúlva, anus, genitais, pele ou laringe.
No segundo aspecto, a presente invenção apresenta um conjunto de sondas compreendendo pelo menos quatro sondas, compreendendo cada uma das sondas referidas uma sequência complementar da sequência de um agente patogénico flanqueado por quatro pares de bases complementares, em que as referidas bases formam uma estrutura braço na ausência 47 de hibridação para um ácido nucleico de um agente patogénico, em que a referida sonda é marcada com um primeiro marcador interactivo e um segundo marcador interactivo, de modo a que a hibridação da referida sonda para um ácido nucleico de um agente patogénico causa uma mudança no sinal detectado.
As formas de realização preferidas do primeiro aspecto relativamente às sondas aplica-se ao segundo aspecto.
Como anteriormente descrito, as sequências que formam a parte "semicircular" da sonda são seleccionadas de forma a que não só hibridem com a sequência desejada no organismo alvo como também não formem estruturas secundárias com as regiões semicirculares de outras sondas. Deste modo, no terceiro aspecto a presente invenção apresenta uma sequência de ácidos nucleicos que compreende qualquer uma das SEQ ID nos. 33 a 52 ou SEQ ID nos 105-117. As sequências de ácidos nucleicos podem ser utilizadas noutros métodos para detectar a presença de um ou mais genotipos de HPV. Deste modo, a presente invenção proporciona igualmente a utilização de um ácido nucleico da invenção para detectar a presença ou ausência de pelo menos um genotipo de HPV. De preferência, o ácido nucleico é utilizado num método que monitoriza continuamente a amplificação dos ácidos nucleicos obtidos de uma amostra.
Estes métodos incluem a tecnologia TAQMAN™, a utilização de sequências como parte de um scorpion molecular e outros métodos à base de PCR. A tecnologia TAQMAN™ detecta a presença ou ausência de um produto da amplificação e portanto a presença ou ausência do papilomavirus humano. A tecnologia TAQMAN™ utiliza uma sonda de hibridação de cadeia simples, marcada 48 com duas fracções fluorescentes. Quando uma primeira fracção fluorescente é excitada com luz a um comprimento de onda adequado, a energia absorvida é transferida para uma segunda fracção fluorescente, de acordo com os princípios de FRET. A segunda fracção fluorescente é geralmente uma molécula quencher. Durante a fase de emparelhamento da reacção de PCR, a sonda de hibridação marcada liga-se ao ADN alvo e é degradada pela actividade exonulease 5' a 3' da polimerase Taq durante a fase de alongamento seguinte. Em resultado, a fracção fluorescente excitada e a segunda fracção fluorescente tornam-se separadas espacialmente uma da outra. Em consequência, com a excitação da primeira fracção fluorescente na ausência da segunda fracção fluorescente, a emissão de fluorescência da primeira fracção fluorescente encontra-se alterada de forma detectável. Por exemplo, se a segunda fracção fluorescente for um quencher, a emissão de fluorescência da primeira fracção fluorescente aumenta e pode, assim, ser detectada. A título de exemplo, um ABI PRISM™ 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, Calif. ) utiliza tecnologia TAQMAN™ e é adequado para a realização dos métodos de detecção do papilomavírus humano. A informação sobre amplificação PCR e detecção utilizando o sistema ABI PRISM™ 7700 pode ser encontrada no sítio web da Applied Biosystems.
Num sexto aspecto, a presente invenção proporciona um método de identificação de um conjunto mínimo de iniciadores que amplificam sequências de ácidos nucleicos de dois ou mais organismos relacionados, compreendendo: 49 (a) Identificação de sítios de ligação do iniciador que possuem pelo menos 30% de identidade entre os referidos organismos; (b) Concepção de um conjunto de iniciadores capazes de iniciar a amplificação nos sítios iniciadores identificados em (a) , em que cada um dos referidos iniciadores não possuem mais de 3 desemparelhamentos com o sítio de ligação do iniciador em pelo menos um dos organismos referidos e em que cada um dos iniciadores referidos difere de cada um dos iniciadores referidos em 4 ou menos nucleótidos; (c) Determinação do menor número de iniciadores necessários para detectar o maior número possível dos organismos mencionados; (d) Determinação da quantidade relativa de cada iniciador necessária no conjunto iniciador referido para garantir amplificação igual das sequências de ácidos nucleicos de todos os organismos mencionados.
Tal como presentemente utilizado, "organismos relacionados" designam organismos que pertencem à mesma classe, género ou espécie e que possuem um nível elevado de similaridade, preferencialmente, pelo menos 80% de identidade, mais preferencialmente pelo menos 90% de identidade. Os organismos relacionados são preferencialmente vírus, mais preferencialmente papilomavírus humanos. Os iniciadores amplificam de preferência a região LI dos papilomavírus humanos. A percentagem de identidade de duas sequências de ácidos nucleicos é determinada pelo alinhamento das sequências para uma comparaçao óptima (por exemplo, podem ser introduzidos intervalos na primeira sequência para um 50 melhor alinhamento com a sequência), e comparação dos nucleótidos em posições correspondentes. 0 "melhor alinhamento" é um alinhamento de duas sequências que tem como resultado a maior percentaqem de identidade. A percentaqem de identidade é determinada pelo número de nucleótidos idênticos nas sequências em comparação (isto é % de identidade = número de posições idênticas/número total de posições x 100). A determinação da percentaqem de identidade entre duas sequências pode ser consequida utilizando um alqoritmo matemático conhecido dos peritos na especialidade. Um exemplo de um algoritmo matemático para comparação de duas sequências consiste no algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2264-2268, modified as in Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5873-5877. Os programas NBLSAT e XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 incorporaram este algoritmo. As pesquisas de nucleótidos BLAST podem ser executadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleótidos homólogas com moléculas de ácido nucleico da invenção. Para obter alinhamentos intervalados para comparação, pode-se utilizar Gapped-BLAST como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Em alternativa, PSI-Blast podem ser utilizados para executar uma pesquisa repetida que detecta relações distantes entre moléculas (Id.). Quando se utilizam os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-BLAST, podendo-se aplicar os parâmetros pré-definidos dos programas respectivos (por exemplo, XBLAST e NBLAST). Outro exemplo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de 51
Myers e Miller, CABIOS (1989). 0 programa ALIGN (versão 2.0) que faz parte do pacote de software de alinhamento de sequência CGC incorporou um algoritmo desses. Outros algoritmos de análise de sequência conhecidos na técnica incluem ADVANCE e ADAM, como descrito em Torellis e Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10: 3-5; and FASTA described in Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85: 2444-8. Em FASTA, kyup é uma opção de controlo que define a sensibilidade e velocidade da pesquisa. Um conjunto mínimo de iniciadores é um conjunto de iniciadores contendo o número mínimo de iniciadores necessários para amplificar as sequências de ácidos nucleicos de tantos organismos relacionados quanto necessário. O conjunto de iniciadores pode conter opcionalmente um iniciador de correcção que é utilizado para controlar diferenças de iniciação entre os iniciadores num sítio de ligação de iniciador particular. Os iniciadores de correcção não devem ter mais de três desemparelhamentos em relação ao sítio de ligação iniciador, onde está previsto actuarem. A adição de iniciadores de correcção ajuda a produzir um nível de sensibilidade na detecção que tem pelo menos duas ordens de magnitude ou mais para todos os organismos que se pretende detectar, por exemplo todos os papilomavírus humanos.
Tal como presentemente utilizado "desemparelhado" refere-se a quando uma base num iniciador não forma um par de bases de acordo com as regras de emparelhamento Watson-Crick, com uma base correspondente no sítio de ligação iniciador. Forma-se um desemparelhamento onde as duas bases correspondentes não estão conformes com os critérios de Watson-Crick, por exemplo C-T, G-A. Os desemparelhamentos encontram-se preferencialmente dentro da metade do 52 iniciador mais próxima da extremidade 5', mais preferencialmente formando nucleótidos antes da extremidade 5' do iniciador. Cada um dos iniciadores do conjunto de iniciadores difere apenas de cada um dos outros iniciadores do conjunto em quatro ou menos nucleótidos. Assim, se os iniciadores contiverem todos 15 nucleótidos de comprimento, então 11 nucleótidos num iniciador são idênticos a 11 nucleótidos em cada um dos outros iniciadores. De preferência, os nucleótidos idênticos não são idênticos.
Numa forma de realização preferida, é apresentado um método de construção de uma reacção multiplex extremamente complexa de amplificação do papilomavirus. 0 método inclui a selecção de sitios de ligação iniciadores conservados (variabilidade inferior a 70%) a uma proximidade apropriada. Os sitios de ligação iniciadores devem estar localizados com uma distância entre si para garantir a produção de um amplicão do tamanho apropriado. De preferência, é produzido um amplicão de 30-160 nucleótidos de comprimento, mais preferencialmente 40-120, 50-100, 60-90 ou 70-80 nucleótidos de comprimento. Os amplicões entre 130 e 160 nucleótidos de comprimento são particularmente preferidos. Os iniciadores formam parte do amplicão gerado. De preferência, os iniciadores têm de 10-30 nucleótidos de comprimento, mais preferencialmente 12-25, 15-22 ou 18, 19, 20 ou 21 nucleótidos de comprimento. A sequência de um conjunto completo de iniciadores, sempre que os iniciadores satisfizerem os critérios normalmente aplicados para iniciadores (por exemplo, verificação dos iniciadores em comparação com um programa informático com plena complementaridade como Primer3) é depois determinada e é concebido o menor número possível de iniciadores com apenas 53 três desemparelhamentos, de preferência numa extremidade do iniciador, mais preferencialmente a extremidade 5' , em relação a todos os organismos, tal como os tipos de papilomavirus humano, que se pretende amplificar. Adicionalmente, os iniciadores devem ligar-se a um número quase igual de tipos que não tenham mais de três desemparelhamentos. Outras diferenças de amplificação são controladas mediante a alteração da concentração relativa dos iniciadores. A sensibilidade de detecção resultante encontra-se de preferência dentro de pelo menos duas magnitudes para todos os organismos relacionados, tal como os tipos de papilomavirus humanos, que se pretende que sejam detectados.
Este constitui um progresso significativo relativamente às técnicas recentes, em que se obedece à adição sequencial dos iniciadores e a métodos de tentativa e erro. 0 método projectado mantém a competição no mínimo. Existem eficiências de iniciação corrigidas em comparação com todos os alvos, resultando em sensibilidades de amplificação igualmente iguais. Além disso, a probabilidade de erros de iniciação é reduzida ao manter os iniciadores preferencialmente variáveis na respectiva extremidade 5'. A mistura de iniciadores é capaz de amplificar pelo menos uma região LI do tipo de papilomavirus humano, de preferência compreendendo as Seq Id n° 53 a 103. De preferência inclui pelo menos um iniciador directo do grupo Seq Id nos 1 a 16 e pelo menos um iniciador inverso do grupo Seq Id nos 17 a 32.
Num sétimo aspecto, o presente aspecto apresenta um conjunto de iniciadores que podem ser obtidos pelo método do sexto aspecto compreendendo pelo menos um iniciador 54 seleccionado das Seq Id nos 1 a 32. De preferência inclui pelo menos um iniciador directo do grupo Seq Id nos 1 a 16 e pelo menos um iniciador inverso do grupo Seq Id nos 17 a 32. Mais preferencialmente inclui Seq Id nos. 1 a 32.
Num outro aspecto, a presente invenção apresenta um conjunto de detecção de um ou mais agentes patogénicos compreendendo um conjunto de sondas, tal como definido no segundo aspecto. 0 conjunto inclui ainda, de preferência, um conjunto de iniciadores identificados de acordo com o método do sexto aspecto.
Além disso, a invenção apresenta um kit de detecção de um ou mais agentes patogénicos, compreendendo um conjunto de iniciadores identificados de acordo com o método do sexto aspecto.
De preferência, os kits podem ser utilizados para detectar um ou vários organismos associados a uma doença sexualmente transmissível, de preferência genotipos HPV. De preferência, as sondas incluem uma sequência seleccionada das SEQ ID Nos: 17 a 33. 0 conjunto de iniciadores compreende de preferência pelo menos uma sequência seleccionada das Seq Id nos. 1 a 32, mais preferencialmente pelo menos uma seleccionada das Seq Id no 32 a 1 e pelo menos uma seleccionada das Seq Id 17-32. Com maior preferência, a mistura iniciadora compreende os iniciadores da Seq Id nos 1-32.
De preferência, os conjuntos incluem ainda um controlo interno. 0 kit pode ainda incluir um folheto ou folha com instruções de utilização da(s) mistura (s) de iniciadores e par(es) de sondas para detectar a presença ou ausência do papilomavírus humano numa amostra biológica. 55
Os kits podem ainda incluir outros componentes, tal como os reagentes necessários para PCR. Estes reagentes incluem tampões, uma ADN polimerase adequada e dNTPs tal como dATP, dCTP, dGTP e dTTP. Os componentes do kit podem ser apresentados em vários frascos ou outros contentores. Os reagentes podem ser liofilizados para posterior reconstituição, para utilização. Em alternativa, os componentes podem ser apresentados em soluções adequadamente tamponadas, prontas a utilizar. Estas soluções podem conter conservantes adequados.
Excepto quando definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados têm um significado igual ao pressuposto por alguém com formação ordinária na técnica da presente invenção. A presente invenção é ilustrada nos exemplos seguintes, não limitadores. Outras características, objectos e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir das figuras e a descrição detalhada e a partir das reivindicações.
Exemplo 1
Detecção PCR em tempo-real para ADN de HPV de alto risco e baixo risco. 0 volume de reacção total era 20 μΐ, incluindo os seguintes componentes: 2μ1 (~0,2pg) ADN de HPV clonado, 18μ1 de tampão polimerase (concentração final: 90 mM TRIS- HC1 (pH=8,0), 1 mM de DTT, 50 mM de KC1, 7 mM de MgCI 1 2-2 f 1 o de Tween-20 (SIGMA), 1% de Ficoll, 1% de PVP, 250 μΜ de cada dNTP (ATP, CTP, GTP, TTP)(Promega) f 0,28 μΜ de : cada iniciador: SEQ. ID. NO: 1-32, 0,18 μΜ de cada farol molecular SEQ. ID. NO: 33-52 e 7,5 U AmpliTaq Gold DNA polymerase (ROCHE)). A reacção foi efectuada num 56 termociclador PCR LightCycler 2.0 com os seguintes parâmetros:
Fase 1: 10 minutos a 95 °C;
Fase 2: 5 minutos a 55 °C;
Fase 3: Ciclos 1-37: 30 segundos a 95 °C, 60 segundos a 42 °C - modo de detecção simples e 30 segundos a 72 °C; Os genotipos HPV de alto risco foram detectados por sondas molecular beacon Seq Id. No 38-51. Os dados da fluorescência foram recolhidos a 530 nm.
Os genotipos de HPV de baixo risco foram detectados por sondas molecular beacon Seq Id No: 33-37. Os dados fluorescentes foram recolhidos a 560 nm. O controlo interno da reacção foi detectado por sondas molecular beacon Seq Id No: 52. Os dados da fluorescência foram recolhidos a 610 nm.
Os genotipos seguintes foram detectados com êxito: baixo risco (6, 11, 42, 43, 44/55), alto risco (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) e controlo interno.
Exemplo 2
Detecção PCR em tempo-real para ADN de HPV de HPV16, HPV18 e HPV6, HPV11. O volume de reacção total era 20 μΐ, incluindo os seguintes componentes: 2μ1 (~0,2pg) de ADN de HPV clonado, 18 μΐ de tampão polimerase (concentração final: 90 mM TRIS-HC1 (pH=8,0), 1OmM de DTT, 50 mM de KC1, 7 mM de MgCI2, 1% de Tween-20 (SIGMA), 1 % de Ficoll, 1 % de PVP, 250 μΜ de cada dNTP (ATP, CTP, GTP, TTP) (Promega) t 0,28 μΜ de cada iniciador: Seq. Id. No: 1-32, 0,18 μιη de cada molecular beacon Seq. Id. No: 33, 34, 38, 39, 52 e 7,5 U Amplitaq
Gold DNA Polymerase (ROCHE) ) . A reacçao foi efectuada num 57 termociclador PCR LightCycler 2.0 com os seguintes parâmetros:
Fase 1: 10 minutos a 95 °C;
Fase 2: 5 minutos a 55 °C;
Fase 3: Ciclos 1-37: 30 segundos a 95 °C, 60 segundos a 42 °C - modo de detecção simples e 30 segundos a 72 °C; Os genotipos HPV16 e HPV18 foram detectados por sondas molecular beacon Seg Id. No 38-39. Os dados fluorescentes foram recolhidos a 530 nm.
Os genotipos de HPV6 e HPV11 foram detectados por sondas molecular beacon Seq Id No: 33-34. Os dados fluorescentes foram recolhidos a 560 nm. 0 controlo interno da reacção foi detectado por sondas molecular beacon Seq Id No: 52. Os dados fluorescentes foram recolhidos a 610 nm.
Os genotipos seguintes foram detectados com êxito: baixo risco (6, 11), alto risco (16, 18) e controlo interno.
Anexo 1
Iniciadores directos
SEQ. ID . NO: 1 KP-F/1 CGCACCAACATATTTTATT SEQ. ID . NO: 2 KP-F/2 CGCACAAGCATCTATTATTA SEQ. ID . NO: 3 KP-F/3 CGCACAAGCATATTTTATC SEQ. ID. NO: 4 KP-F/4 CGCACCAGTATATTTTATCA SEQ. ID . NO: 5 KP-F/5 CGCACAAGCATTTACTATCA SEQ. ID . NO: 6 KP-F/6 CGCACCAACTACTTTTACC SEQ. ID . NO: 7 KP-F/7 CGTACCAGTATTTTCTACCAC SEQ. ID . NO: 8 KP-F/8 CGCACAGGCATATATTACT SEQ. ID . NO: 9 KP-F/9 CGCACCAACATATATTATCA SEQ. ID . N0 : 1C KP-F/ 10 CGTACCAACCTGTACTATTATG 58
SEQ. ID . NO: 11 KP-F/11 GCACCAACTTATTTTACCAT SEQ. ID . NO: 12 KP-F/12 ACCAACCTCTTTTATTATGG SEQ. ID . NO: 13 KP-F/13 AGCACAAATATATATTATTATGG SEQ. ID . NO: 14 KP-F/14 CGCACCGGATATATTACT SEQ. ID . NO: 15 KP-F/15 CGCACAAATATTTATTATTATGC SEQ. ID . NO: 16 KP-F/16 CGGACGAATGTTTATTACC Iniciado res inversos: SEQ. ID . NO: 17 L1C2 TACCCTAAATACTCTGTATTG SEQ. ID . NO: 18 L1R2TACCCTAAATACCCTATATTG SEQ. ID . NO: 19 RI AATTCTAAAAACTCTGTACTG SEQ. ID . NO: 20 R45 TACTCTAAATACTCTGTATTG SEQ. ID . NO: 21 RI1 TACCTTAAACACTCTATATTG SEQ. ID . NO: 22 RI 6 TATTCTAAATACCCTGTATTG SEQ. ID . NO: 23 R42 AACTCTAAATACTCTGTACTG SEQ. ID . NO: 24 R44 CATCTTAAAAACCCTATATTG SEQ. ID . NO: 25 RO3 AACCCTAAACACCCTGTATTG SEQ. ID . NO: 26 RO4 AACGCGAAAAACCCTATATTG SEQ. ID . NO: 27 RO5 TACCCTAAAGACCCTATACTG SEQ. ID . NO: 28 RO 6 AACTCTAAATACCCTATACTG SEQ. ID . NO: 29 RO7 AACGTGAAATACACGATATTG SEQ. ID . NO: 30 RO 8 CACACGGAACACCCTGTACTG SEQ. ID . NO: 31 R54 CACCCTAAACACCCTATATTG SEQ. ID . NO: 32 R85 AACCCGAAACACTCGATACTG
Sonda
Sequências
SEQ ID NO: 33 HPV6B3: GGGTCATCCTTATTTTTCCATAA SEQ ID NO: 34 HPV11B2: GGGACATCCATATTACTCTATCAAA SEQ ID NO: 35 HPV42B2: GGTCACCCTTATTACTCTATTACAAA 59
SEQ ID NO: 36 HPV43B2: CACCCATATTTCCCCCTTAAA SEQ ID NO: 37 HPV44/55B2: ACGACCAGCAAACAAGACAC SEQ. ID . NO: 38 HPV16B5: CAATAACAAAATATTAGTTCCTAAA SEQ. ID . NO: 39 HPV18B8: TATCCTGCTTATTGCCACC SEQ. ID . NO: 40 HPV31B5: CATACCTAAATCTGACAATCC SEQ. ID . NO: 41 HPV33B7: TTTTTTAGCGTTAGTAGGATTTTT SEQ. ID . NO: 42 HPV35B2: AAAACAAGAT T C T AAT AAAATAGCA SEQ. ID . NO: 43 HPV39B3: TTAAAGTGGGTATGAATGGTTG SEQ. ID . NO: 44 HPV45B3: GCTGTTCCTAAGGTATCCG SEQ. ID . NO: 45 HPV51B2: AGCACGCGTTGAGGTTTTA SEQ. ID . NO: 46 HPV52B2: AGTTTTAGTTCCCAAGGTGTC SEQ. ID . NO: 47 HPV56B2: CTGTGACTAAGGACAATACCAAA SEQ. ID . NO: 48 HPV58B2: TTCCATCAAAAGTCCCAATAAC SEQ. ID . NO: 49 HPV59B2: AAAGGTGGTAATGGTAGACAGG SEQ. ID . NO: 50 HPV66B2: AAT C T GGTAC CAAAACAAACAT C SEQ. ID . NO: 51 HPV68B2: TTAAGGTTCCTATGTCTGGGG SEQ. ID . NO: 52 HPV-ICB2 : T GACATAGATCCCCATAGACAGT T SEQ. ID. NO: 53 >Hpv2a cgga ctaatgtgta ttaccatggt ggcagtteta ggcttctcac tgtgggtcat ccatattact ctataaagaa gagtaaíaat aaggtggctg tgcccaaggt atctgggtac caatatcgtg tatttcacgt g SEQ. ID. NO: 54 >HPV3 cgc accaacattt attattatgc aggcagttct cgcttgctga ccgtgggtca tccttatttt gctatcccca aatcttctaa ttccaagatg gatattccta aggtgtccgc ctttcaatat agagtgttta gggtg SEQ. ID. NO: 55 >HPV6 cgcacca acatatttta tcatgccagc agttctagac ttcttgcagt gggtcatcct tatttttcca taaaacgggc taacaaaact gttgtgccaa aggtgtcagg atatcaatac aggglattta aggtg SEQ. ID. NO: 56 >HPV11 cgcacc aacatatttt atcatgccag cagttctaga ctccttgctg tgggacatcc atattactct atcaaaaaag ttaacaaaac agttgtacca aaggtgtctg gatatcaata tagagtgttt aaggta SEQ. ID. NO: 57 >HPV13 60 cgtac caacatattt tatcatgcta gcagttctag actacttgca gtgggaaatc cttattttcc tattaagaaa caaaacaaaa ctgttgtccc taaggtatct ggttatcagt ttagggtatt taaagtt SEQ. ID. NO: 58 >HPV16 cgcacaa acatatatta tcatgcagga acatccagac tacttgcagt tggacatccc tattttccta ttaaaaaacc taacaataac aaaatattag ttcctaaagt atcaggatta caatacaggg tatttagaat a SEQ. ID. NO: 59 >HPV18 c ccacaagcat attttatcat gctggcagct ctagattatt aactgttggt aatccatatt ttagggttcc tgcaggtggt ggcaataagc aggatattcc taaggtttct gcataccaat atagagtatt tagggtg SEQ. ID. NO: 60 >HPV26 cgcacc ggcatatatt attatgcggg cagctctcgt ttattaacat taggacatcc atatttttcc atacctaaaa ctggccaaaa ggccgaaatt cctaaggtat ctgcctatca gtacagggta tttagagtg SEQ. ID. NO: 61 >HPV27 cggacgaatg tctattacca tggtggcagt tctaggctcc tcactgtcgg ccacccatat tattctataa agaagggtag caataatagg ttggcagtgc ctaaggtgtc cggctaccaa taccgtgtat ttcacgtt SEQ. ID. NO: 62 >HPV28 cgca ccaatattta ttattatgca ggcacttctc ggttgctgac cgtgggtcat ccttattttc ccattcctaa atcatccact aacaaagcag atgtgcccaa agtgtccgcc tttcagtata gggtattccg ggtg SEQ. ID. NO: 63 >HPV29 c gcacaaatat ttattattat gcaggcagtt ctcgcctgct cactgtgggt catccacatt attcaattcc caaatcctct ggtaataagg tagatgtgcc taaggtgtct gcatttcagt acagggtttt ccgtgtg SEQ. ID. NO: 64 >HPV30 cg caccaatata ttttatcatg caggcagctc acgtttgctt gctgttggac atccatatta ttctatttct aaggctggta attccaaaac agatgttccc aaggtgtctg catttcagta tagggtcttt agggtc SEQ. ID. NO: 65 >HPV31 cg aaccaacata tattatcacg caggcagtgc taggctgctt acagtaggcc atccatatta ttccatacct aaatctgaca atcctaaaaa aatagttgta ccaaaggtgt caggattaca atatagggta tttagggtt SEQ. ID. NO: 66 >HPV33 cgcacaagca tttattatta tgctggtagt tccagacttc ttgctgttgg ccatccatat ttttctatta aaatcctac taacgctaaa aaattattgg tacccaaagt atcaggcttg caatataggg tttttagggt c SEQ. ID. NO: 67 >HPV34 61 cg cacaaatata tattattatg caggtagtac acgcttgctg gcagtaggac atccctatta tcctataaag gatactaatg ggaaacgtaa gattgctgta cctaaagttt caggtttgca atacagggta tttagaata SEQ. ID. NO: 68 >HPV35 cgcacaaaca tctactatca tgcaggcagt tctaggctat tagctgtggg tcacccatac tatgctatta aaaaacaaga ttctaataaa atagcagtac ccaaggtalc tggtttgcaa tacagagtat ttagagt SEQ. ID. NO: 69 >HPV39 c gcacaggcat atattattat gctggcagct ctagattatt aacagtagga catccatatt ttaaagtggg tatgaatggt ggtcgcaagc aggacattcc aaaggtgtct gcatatcaat atagggtatt tcgcgtg SEQ. ID. NO: 70 >HPV40 cgcaccag tttatattat catgctggta gtgccaggtt actgactata ggacatccat actttgagtt aaaaaaaccc aatggtgaca tttcagtgcc taaggtttct ggacatcaat acagggtatt tagggta SEQ. ID. NO: 71 >HPV42 cgcacca actactttta ccatgccagc agttctaggc tattggttgt tggtcaccct tattactcta ttacaaaaag gccaaataag acatctatcc ccaaagtgtc tggtttacag tacagagtat ttagagtt SEQ. ID. NO: 72 >HPV43 cgcaccaact tattttatta tgctggcagt tcacgtttgc ttgcagtggg tcacccatat ttccccctta aaaattcctc tggtaaaata actgtaccta aggtttctgg ttatcaatac agagtattta gagtt SEQ. ID. NO: 73 >HPV44 cgc accaacatat attaccatgc tagcagttct agacttcttg ctgtgggcaa cccttatttt gccatacgac cagcaaacaa gacacttgtg cctaaggttt cgggatttca atatagggtt tttaagatg SEQ. ID. NO: 74 >HPV45 cgcaca agcatatttt atcatgcagg cagttcccga ttattaactg taggcaatcc atattttagg gttgtaccta atggtgcagg taataaacag gctgttccta aggtatccgc atatcagtat agggtgttta gagta SEQ. ID. NO: 75 >HPV51 cgc accggcatat attactatgc aggcagttcc agactaataa cattaggaca tccctatttt ccaataccta aaacctcaac gcgtgctgct attcctaaag tatctgcatt tcaatacagg gtatttaggg ta SEQ. ID. NO: 76 >HPV52 c gcacaagcat ctattattat gcaggcagtt ctcgattact aacagtagga catccctatttttctattaa aaacaccagt agtggtaatg gtaaaaaagt tttagttccc aaggtgtctg gcctgcaata cagggtattt agaatt SEQ. ID. NO: 77 >HPV53 62 cgcaccact atattttatc atgctggaag ctctcgcttg cttaccgtgg gacatcctta ttaccccatt tctaaatctg gtaaagcaga catccctaag gtgtctgcat ttcagtatag ggtgtttaga gta SEQ. ID. NO: 78 >HPV54 cgcaca agcatatact atcatgcaag cagctctaga ttattggctg ttggacatcc atattttaaa gtacaaaaaa ccaataataa gcaaagtatt cctaaagtat caggaíatca atatagggtg tttagggtg SEQ. ID. NO: 79 >HPV55 cgc accaacatag tttaccatgc tagcagttct agacttcttg ctgtaggcaa cccttatttt gccatacgac cagcaaacaa gacacttgtg cctaaagttt caggatttca atatagggtt tttaaggtg SEQ. ID. NO: 80 >HPV56 cgcacta gtatatttta tcatgcaggc agttcacgat tgcUgccgt aggacatccc tattactctg tgactaagga caataccaaa acaaacattc ccaaagttag tgcatatcaa tatagggtat ttagggta SEQ. ID. NO: 81>HPV57 cgg acgaatgttt attatcatgg tgggagctct cggctcctca cagtaggcca tccatattat tctataaaaa aaagtggcaa taataaggtg tctgtgccca aggtatcggg ctaccagtac cgtgtgttcc atgtg SEQ. ID. NO: 82 >HPV58 c gcacaagcat ttattattat gctggcagtt ccagactttt ggctgttggc aatccatatt tttccatcaa aagtcccaat aacaataaaa aagtattagt tcccaaggta tcaggcttac agtatagggt ctttagggtg SEQ. ID. NO: 83 >HPV59 cgtaccag tattttctac cacgcaggca gttccagact tcttacagtt ggacatccat annaaagt acctaaaggt ggtaatggta gacaggatgt tcctaaggtg tctgcatatc aatacagagt atttagggtt SEQ. ID. NO: 84 >HPV61 cgcaccaact tattttatta tggtggcagt tcccgtctgc ttactgtagg acatccctat tgtagtttgc agcttgatgg gctgcagggc aagaaaaaca ctatccccaa ggtgtctggc tatcaatata gggtgtttag ggte SEQ. ID. NO: 85 >HPV62 cgcacca acctttttta ttatgggggc agctcccgcc ttcttactgt gggacatcca tattgtactt tacaggttgg ccagggtaaa cgggccacca ttcctaaggt gtctgggtat cagtacaggg tgtttcgtgt SEQ. ID. NO: 86 >HPV66 cgtacca gtatatttta tcatgcaggt agctctaggt tgcttgctgt tggccatect tattactctg tttccaaatc tggtaccaaa acaaacatcc ctaaagttag tgcatatcag tatagagtgt ttagggta SEQ. ID. NO: 87 >HPV67 cgcacaag catttactat tacgctggta gctccagact tttagctgta ggccatcctt acttttccat tcctaatccc tccaacacta aaaaggtgtt agtgcccaag gtgtcaggtt tgcagtatag ggtatttagg gtt 63 SEQ. ID. NO: 88 >HPV68 cgcactggca tgtattacta tgctggtaca tcíaggttat taactgtagg ccatccatat tttaaggttc ctatgtctgg gggccgcaag cagggcattc ctaaggtgtc tgcatatcaatacagagtgt ttagggtt SEQ. ID. NO: 89 >HPV69 cgcac cggatatatt actatgcagg cagctctcga ttattaactt tgggtcatcc ctattttcca attcctaaat ctggttcaac agcagaaatt ectaaagtgt ctgcttacca atatagggtt tttcgtgtt SEQ. ID. NO: 90 >HPV70 cgta caggcatata ttattatgct ggaagctctc gcttattaac agtagggcat ccttatttta aggtacctgt aaatggtggc cgcaagcagg aaatacctaa ggtgtctgca tatcagtata gggtatttag ggta SEQ. ID. NO: 91 >HPV72 cgcacca acctctatta ttatggtggc agttctcgtc tactaactgt aggacatcct tactgtgcca tacctctcaa cggacagggc aaaaaaaaca ccattcctaa ggtttcgggg tatcaataca gggtgtttag agta SEQ. ID. NO: 92 >HPV73 agaaca aatatatatt attatgcagg tagcacacgt ttgttggctg tgggacaccc aíattttcct atcaaggatt ctcaaaaacg taaaaccata gttcctaaag tttcaggttt gcaatacagg gtgtttaggc tt SEQ. ID. NO: 93 >HPV74 cgcacc aacatctttt atcatgctag cagttctaga ctacttgctg taggaaatcc ctatttccct ataaaacagg ttaacaaaac agttgttcct aaagtgtctg gatatcaatt tagggtgttt aaggtg SEQ. ID. NO: 94 >HPV81 cgcacc aacctttttt attatggggg cagttcccgc cttcttactg tagggcatcc atattgtacattaactattg gtacccaagg aaagcgttcc actattccca aggtgtotgg gíatcagtac cgggtgtttc gtgtg SEQ. ID. NO: 95 >HPV82 cgc accggcatat attattatgc aggcagttcc agacttatta ccttaggaca tccatatttt tcaataccca aaaccaatac acgtgctgaa atacctaagg tatctgcctt tcagtatagg gtgtttaggg ta SEQ. ID. NO: 96 >HPV83 cg caccaacctc ttttattacg gtggcagctc cagacttctt accgtaggac atccatatta tcctgtacag gttaatggtc aaggaaaaaa agccactatc cccaaggttt ctggctacca atatagggtg tttcgcatt SEQ. ID. NO: 97 >HPV84 cgcaccaac ttattttatt atggtggtag ttctcgcctg cttactgtgg gacatccata ttattctgtt cctgtgtcta cccctgggca aaacaacaaa aaggccacta tccccaaggt ttctgggtat caatacaggg tgtttagggtc SEQ. ID. NO: 98 >HPV85 64 cgta ccagtacatt ttatcatgct ggcagctcta ggcttctaac cgttggacat ccatactata aagttacctc aaatggaggc cgcaagcaag acattcctaa agtgtctgcc tatcagtatc gagtgtttcg ggtt SEQ. ID. NO: 99 >HPV86 cgtaccaac ctattttatt atggtggtag ttcccgcttg cttactgtgg gccatccata ttatcctgtt actgtttcct ccagccctgg acaaaacaac aaaaaggcca ataítcccaa ggtttcgggg tatcaataca gggtttttag ggtg SEQ. ID. NO:10 O >HPV87 cgcaccaac ttattttatt atggtggcag ttctcgcctg cttactgtgg gtcaccctta ctatccagtt actgttacca cccctggtca gaacaagaaa tccaatattc caaaggtgtc tggctatcag tacagggtgt ttcgggtg SEQ. ID. NO: 101 >HPV89 cgtaccaac ctgtactatt atggaggcag ctcccgcctt attacagttg gccaccctta ttatactgta caggtcaatg gtgctaacaa aaaggccaac atacctaagg tatcagggta tcaatacagg gtatttaggg ta SEQ. ID. NO: 102 >HPV90 agaacaaacata tattattatg caggcagttc ccgactgtta actgttggcc atccttattt tgctatcaaa aagcaatcag gaaaaaaccc tatagtggtt cccaaggtgt ctggatatca atatagggtg tttagggta SEQ. ID. NO: 103 >HPV91 cgcacc aacttatttt accatgctgg cagttcccgt ttactggctg tgggccaccc tttttttcct ataaaaaata attctggtaa agtaattgtt cctaaagttt caggtcacca atatagggtg tttagagtt
SEQ. ID. NO: 104 HPV-IC
CGGACGAATGTTTATTACCAGATAGATAGAGATAGATACCCATATA
CAGATAATGACATAGATCCCCATAGACAGTTTATACAGATCAGTAG
CAGTTTTTATATATGAGATGATGATAGCAATACAGAGTATTTAGGGT
A
SEQ. ID. NO: 105 HPV11B3/2 : AAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTG SEQ. ID. NO: 106 HPV42B1: CAAAAAGGCCAAATAAGACA SEQ. ID. NO: 107 HPV43B6: CCCCCTTAAAAATTCCTCT SEQ. ID. NO: 108 HPV44/55B1 AT AC GAC CAGCAAACAAGAC SEQ. ID. NO: 109 HPV39B4: TATGAATGGTGGTCGCAAG SEQ. ID. NO: 110 HPV52B7: AAAACACCAGTAGTGCTAATG 65 SEQ. ID. NO: 111 HPV56B3: CCAAAACAAACATTCCCAA SEQ. ID. NO: 112 HPV59B3: ATCCATATTTTAAAGTACCTAAAG SEQ. ID. NO: 113 HPV66B1: CAAAT C T GG T AC CAAAACAAA SEQ. ID. NO: 114 HPV-ICB4 : CCCATAGACAGTTTATACAGATCA SEQ. ID. NO: 115 HPV6B6: ATAAAACGGGCTAACAAAA SEQ. ID. NO: 116 HPV26B1: TACCTAAAACTGGCCAAAAG SEQ. ID. NO: 117 HPV35B4: ATTCTAATAAAATAGCAGTACCCAAG LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Genoid Kft Jeney , Csaba Hart, Deborah M Takacs, Tibor <12 0> Método <130> P38434WO <150> US 60/737006 <151> 2005-11-15 <150> GB 0523250 . 9 <151> 2005-11-15 <160> 117 <17 0> Patenteln versão 3. 3 <210> 1 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 1 cgcaccaaca tattttatt 19 <210> 2 <211 >20
<212> ADN 66 <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <4 Ο 0>2 cgcacaagca tctattatta 20 <210> 3 <211> 19 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <4 0 0>3 cgcacaagca tattttatc 19
LISTA DE SEQUÊNCIAS <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <400>4 cgcaccagta tattttatca 20 <210> 5 <211 >20 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <22 3> Iniciador <400>5 cgcacaagca tttactatca 20
<210> 6 <211> 19 <212> ADN 67 <213> Artifici al <22 0> <223> Iniciado r <400>6 cgcaccaacl : acttttacc 19 <210> 7 <211 >21 <212> ADN <213> Artifici al <22 0> <223> Iniciado r <400>7 cgtaccagta i ttttctacca c 21 <210 > 8 <211> 19 <212> ADN <213> Artifici al <22 0> <223> Iniciado r <4 0 0>8 cgcacaggca tatattact 19 <210> 9 <211 >20 <212> ADN <213> Artifici al <22 0> <22 3> Iniciado r < 4 0 0 > 9 1 cgcaccaaca tatattatca 20 <210> 10 <211 >22 68 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <4 0 0> 10 cgtaccaacc tgtactatta tg 22 <210> 11 <211 >20 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <22 3> Iniciador <400> 11 geaccaactt attttaccat 20 <210> 12 <211 >20 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <4 0 0> 12 accaacctct tttattatgg 20 <210> 13 <211 >23 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <400> 13 agcacaaata tatattatta tgg <210> 14 23 69 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <4 0 0> 14 cgcaccggat atattact 18 <210> 15 <211 >23 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <400> 15 cgcacaaata tttattatta tgc 23 <210> 16 <211> 19 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <4 0 0> 16 cgg acg aatg tttattacc 19 <210> 17 <211 >21 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <22 3> Iniciador <400> 17 taccctaaat actctgtatt g 21 <210> 18 <211 >21 70 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <4 0 0> 18 taccctaaat accctatatt g 21 <210> 19 <211 >21 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <4 0 0> 19 aattctaaaa actctgtact g 21 <210> 20 <211 >21 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <22 3> Iniciador <400> 20 tactctaaat actctgtatt g 21 <210> 21 <211 >21 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <400> 21 taccttaaac actctatatt g 21 <210> 22 71 <211 >21 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <4 0 0> 22 tattctaaat accctgtatt g 21 <210> 23 <211 >21 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <22 3> Iniciador <400> 23 aactctaaat actctgtact g 21 <210> 24 <211 >21 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <4 0 0> 24 catcttaaaa accctatatt g 21 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <4 0 0> 25 aaccctaaac accctgtatt g 21 <210> 26 <211 >21 72 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <4 0 0> 26 aacgcgaaaa accctatatt g 21 <210> 27 <211 >21 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <22 3> Iniciador <400> 27 taccctaaag accctatact g 21 <210> 28 <211 >21 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <4 0 0> 28 aactctaaat accctatact g 21 <210> 29 <211 >21 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <4 0 0> 29 aacgtgaaat acacgatatt g 21 <210> 30 73 <211 >21 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <4 0 0> 30 cacacggaac accctgtact g 21 <210> 31 <211 >21 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <22 3> Iniciador <400> 31 caccctaaac accctatatt g 21 <210> 32 <211 >21 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Iniciador <4 0 0> 32 aacccgaaac actcgatact g 21 <210> 33 <211 >23 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Sonda <4 0 0> 33 gggtcatcct tatttttcca taa 23 74 <210> 34 <211 : >25 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sonda <4 0 0> 34 gggacatcca tattactcta tcaaa <210> 35 <211 : >27 <212> ADN <213> Artificial <400> 35 ggtcaccctt attactctat tacaaaa <210> 36 <211 : >21 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <22 3> Sonda <400> 36 cacccatatt tcccccttaa a 21 <210> 37 <211 : >20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sonda <4 0 0> 37 acgaccagca aacaagacac <210> 38 20 75 <211 >25 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Sonda <4 0 0> 38 caataacaaa atattagtte ctaaa 25 <210> 39 <211> 19 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Sonda <4 0 0> 39 tatcctgctt attgccacc 19 <210> 40 <211 >21 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Sonda <400> 40 catacctaaa tctg acaatc c 21 <210> 41 <211 >24 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Sonda <4 0 0> 41 ttttttagcg ttagtaggat tttt 24 76 <210> 42 <211 >25 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sonda <4 0 0> 42 aaaacaagat tctaataaaa tagca <210> 43 <211 >22 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sonda <4 0 0> 43 ttaaagtggg tatgaatggt tg <210> 44 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sonda <4 0 0> 44 gctgttccta aggtatccg 19 <210 > 45 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sonda <4Ο0> 45 77 agcacgcgtt gaggtttta 19 <213> Artificial <22 0> <223> Sonda <4 0 0> 46 agttttagtt cccaaggtgt c 21 <210> 47 <211 >23 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <22 3> Sonda <400> 47 ctgtgactaa ggacaatacc aaa <210> 48 <211 >22 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sonda <4 0 0> 48 ttccatcaaa agtcccaata ac <210> 49 <211 >22 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sonda <4 0 0> 49 aaaggtggta atggtagaca gg <210> 50 78 <211 >23 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Sonda <4 0 0> 50 aatctggtac caaaacaaac ate 23 <210> 51 <211 >21 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Sonda <4 0 0> 51 ttaaggttcc tatgtctggg g 21 <210> 52 <211 >24 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> Sonda <4 0 0> 52 tgacatagat ccccatagac agtt 24 <210> 53 <211> 135 <212> ADN <213> Hpv2a <4 0 0> 53 79 cggactaatg tgtattacca tggtggcagt tctaggcttc tcactgtggg tcatccatat 60 tactctataa agaagagtaa taataaggtg gctgtgccca aggtatctgg gtaccaatat 120 cgtgtatttc acgtg 135 <210> 54 <211> 138 <212> ADN <213> HPV3. <400> 54 cgcaccaaca tttattatta tgcaggcagt tctcgcttgc tgaccgtggg tcatccttat 60 tttgctatcc ccaaatcttc taattccaag atggatattc ctaaggtgtc cgcctttcaa 120 tatagagtgt ttagggtg 138 <210> 55 <211> 132 <212> ADN <213> HPV6 <400> 55 cgcaccaaca tattttatca tgccagcagt tctagacttc ttgcagtggg tcatccttat 60 ttttccataa aacgggctaa caaaactgtt gtgccaaagg tgtcaggata tcaatacagg 120 gtatttaagg tg 132 <213> hpvll <400> 56 cgcaccaaca tattttatca tgccagcagt tctagactcc ttgctgtggg acatccatat 60 tactctatca aaaaagttaa caaaacagtt gtaccaaagg tgtctggata tcaatataga 120 gtgtttaagg ta 132 <210> 57 <211> 132 <212> ADN <213> HPV13 <400> 57 80 80 60 120 132 cgtaccaaca tattttatca tgctagcagt tctagactac ttgcagtggg aaatccttat tttcctatta agaaacaaaa caaaactgtt gtccctaagg tatctggtta tcagtttagg gtatttaaag tt <210> 58 <211> 138 <212> ADN <213> HPV16 <400> 58 cgcacaaaca tatattatca tgcaggaaca tccagactac ttgcagttgg acatccctat 60 tttcctatta aaaaacctaa caataacaaa atattagttc ctaaagtatc aggattacaa 120 tacagggtat ttagaata 138 <210> 59 <211> 138 <212> ADN <213> HPV18 <400> 59 cccacaagca tattttatca tgctggcagc tctagattat taactgttgg taatccatat 60 tttagggttc ctgcaggtgg tggcaataag caggatattc ctaaggtttc tgcataccaa 120 tatagagtat ttagggtg 138 <210> 60 <211> 135 <212> ADN <213> HPV26 <400> 60 cgcaccggca tatattatta tgcgggcagc tctcgtttat taacattagg acatccatat 60 ttttccatac ctaaaactgg ccaaaaggcc gaaattccta aggtatctgc ctatcagtac 120 agggtattta gagtg 135 <210> 61 <211> 138 <212> ADN <213> HPV27 81 <4Ο0> 61 cggacgaatg tctattacca tggtggcagt tctaggctcc tcactgtcgg ccacçcatat 60 tattctataa agaagggtag caataatagg ttggcagtgc ctaaggtgtc cggctaccaa 120 taccgtgtat ttcacgtt 138 <210> 62 <211> 138 <212> ADN <213> HPV28 <400> 62 cgcaccaata tttattatta tgcaggcact tctcggttgc tgaccgtggg tcatccttat 60 tttcccattc ctaaatcatc cactaacaaa gcagatgtgc ccaaagtgtc cgcctttcag 120 tatagggtat tccgggtg 138 <210> 63 <211> 138 <212> ADN <213> HPV29 <400> 63 cgcacaaata tttattatta tgcaggcagt tctcgcctgc tcactgtggg tcatccacat 60 tattcaattc ccaaatcctc tggtaataag gtagatgtgc ctaaggtgtc tgcatttcag 120 tacagggttt tccgtgtg 138 <210> 64 <211> 138 <212> ADN <213> HPV30 cgcaccaata tattttatca tgcaggcagc tcacgtttgc ttgctgttgg acatccatat 60 tattctattt ctaaggctgg taattccaaa acagatgttc ccaaggtgtc tgcatttcag 120 tatagggtct ttagggtc 138
<210> 65 <211> 141 <212> ADN 82 <213> HPV31 <400> 65 60 120 141 cgaaccaaca tatattatca cgcaggcagt gctaggctgc ttacagtagg ccatccatat tattccatac ctaaatctga caatcctaaa aaaatagttg taccaaaggt gtcaggatta caatataggg tatttagggt t <210> 66 <211> 140 <212> ADN <213> HPV33 <400> 66 60 120 140 cgcacaagca tttattatta tgctggtagt tccagacttc ttgctgttgg ccatccatat ttttctatta aaatcctact aacgctaaaa aattattggt acccaaagta tcaggcttgc aatatagggt ttttagggtc <210> 67 <211> 141 <212> ADN <213> HPV34 <400> 67 60 120 141 cgcacaaata tatattatta tgcaggtagt acacgcttgc tggcagtagg acatccctat tatcctataa aggatactaa tgggaaacgt aagattgctg tacctaaagt ttcaggtttg caatacaggg tatttagaat a <210> 68 <211> 137 <212> ADN <213> HPV35 <400> 68 60 120 137 cgcacaaaca tctactatca tgcaggcagt tctaggctat tagctgtggg tcacccatac tatgctatta aaaaacaaga ttctaataaa atagcagtac ccaaggtatc tggtttgcaa tacagagtat ttagagt <210> 69 <211> 138
<212> ADN 83 <213> HPV39 <4 Ο Ο > 6 9 cgcacagçjca tatattatta tgctggcagc tctagattat taacagtagg acatccatat 60 tttaaagtgg gtatgaatgg tggtcgcaag caggacattc caaaggtgtc tgcatatcaa 120 tatagggtat ttcgcgtg 138 <210> 70 <211> 135 <212> ADN <213> HPV40 <400> 70 egcaccagtt tatattatca tgctggtagt gccaggttac tgactatagg acatccatac 60 tttgagttaa aaaaacccaa tggtgacatt tcagtgccta aggtttctgg acatcaatac 120 agggtattta gggta 135 <210> 71 <211> 135 <212> ADN <213> HPV42 <400> 71 cgcaccaact acttttacca tgccagcagt tctaggctat tggttgttgg tcacccttat 60 tactctatta caaaaaggcc aaataagaca tctatcccca aagtgtctgg tttacagtac 120 agagtattta gagtt 135 <210> 72 <211> 135 <212> ADN <213> HPV43 <400> 72 cgcaccaact tattttatta tgctggcagt tcacgtttgc ttgcagtggg tcacccatat 60 ttccccctta aaaattcctc tggtaaaata actgtaccta aggtttctgg ttatcaatac 120 agagtattta gagtt 135 <210> 73 <211> 132 84 <212> ADN <213> HPV44 <400> 73 cgcaccaaca tatattacca tgctagcagt tctagacttc ttgctgtggg caacccttat 60 tttgccatac gaccagcaaa caagacactt gtgcctaagg tttcgggatt tcaatatagg 120 gtttttaaga tg 132 <210> 74 <211> 141 <212> ADN <213> HPV45 <400> 74 cgcacaagca tctattatta tgcaggcagt tctcgattac taacagtagg acatccctat 60 ttttctatta aaaacaccag tagtggtaat ggtaaaaaag ttttagttcc caaggtgtct 120 ggcctgcaat acagggtatt tagaatt 147 <210> 77 <211> 132 <212> ADN <213> HPV53 <400> 77 cgcaccacta tattttatca tgctggaagc tctcgcttgc ttaccgtggg acatccttat 60 taccccattt ctaaatctgg taaagcagac atccctaagg tgtctgcatt tcagtatagg 120 gtgtttagag ta 132 <210> 78 <211> 135 <212> ADN <213> HPV54 <400> 78 cgcacaagca tatactatca tgcaagcagc tctagattat tggctgttgg acatccatat 60 tttaaagtac aaaaaaccaa taataagcaa agtattccta aagtatcagg atatcaatat 120 agggtgttta gggtg 135 <210> 79 85 <211> 132 <212> ADN <213> HPV55 <4Ο0> 79 cgcaccaaca tagtttacca tgctagcagt tctagacttc ttgctgtagg caacccttat 60 tttgccatac gaccagcaaa caagacactt gtgcctaaag tttcaggatt tcaatatagg 120 gtttttaagg tg 132 <210> 80 <211> 135 <212> ADN <213> HPV56 <400> 80 cgcactagta tattttatca tgcaggcagt tcacgattgc ttgccgtagg acatccctat 60 tactctgtga ctaaggacaa taccaaaaca aacattccca aagttagtgc atatcaatat 120 agggtattta gggta 135 <210> 81 <211> 138 <212> ADN <213> HPV57 <400> 81 cggacgaatg tttattatca tggtgggagc tctcggctcc tcacagtagg ccatccatat 60 tattctataa aaaaaagtgg caataataag gtgtctgtgc ccaaggtatc gggctaccag 120 taccgtgtgt tccatgtg 138 <210> 82 <211> 141 <212> ADN <213> HPV58 <400> 82 cgcacaagca tttattatta tgctggcagt tccagacttt tggctgttgg caatccatat 60 ttttccatca aaagtcccaa taacaataaa aaagtattag ttcccaaggt atcaggctta 120 cagtataggg tctttagggt g 141 <210> 83 86 <211> 138 <212> ADN <213> HPV59 <400> 83 cgtaccagta ttttctacca cgcaggcagt tccagacttc ttacagttgg acatccatat 60 tttaaagtac ctaaaggtgg taatggtaga caggatgttc ctaaggtgtc tgcatatcaa 120 tacagagtat ttagggtt 138 <210> 84 <211> 144 <212> ADN <213> HPV61 <400> 84 60 120 144 60 120 cgcaccaact tattttatta tggtggcagt tcccgtctgc ttactgtagg acatccctat tgtagtttgc agcttgatgg gctgcagggc aagaaaaaca ctatccccaa ggtgtctggc tatcaatata gggtgtttag ggta <210> 85 <211> 138 <212> ADN <213> HPV62 <400> 85 cgcaccaacc ttttttatta tgggggcagc tcccgccttc ttactgtggg acatccatat tgtactttac aggttggcca gggtaaacgg gccaccattc ctaaggtgtc tgggtatcag tacagggtgt ttcgtgtg 138 <210> 86 <211> 135 <212> ADN <213> HPV66 <400> 86 87 cgtaccagta tattttatca tgcaggtagc tctaggttgc ttgctgttgg ccatccttat 60 tactctgttt ccaaatctgg taccaaaaca aacatcccta aagttagtgc atatcagtat 120 agagtgttta gggta 135 <210> 87 <211> 141 <212> ADN <213> HPV67 <400> 87 cgcacaagca tttactatta cgctggtagc tccagacttt tagctgtagg ccatccttac 60 ttttccattc ctaatccctc caacactaaa aaggtgttag tgcccaaggt gtcaggtttg 120 cagtataggg tatttagggt t 141 <210> 88 <211> 138 <212> ADN <213> HPV68 <400> 88 cgcactggca tgtattacta tgctggtaca tctaggttat taactgtagg ccatccatat 60 tttaaggttc ctatgtctgg gggccgcaag cagggcattc ctaaggtgtc tgcatatcaa 120 tacagagtgt ttagggtt 138 <210> 89 <211> 134 <212> ADN <213> HPV69 cgcaccggat atattactat gcaggcagct ctcgattatt aactttgggt catccctatt 60 ttccaattcc taaatctggt tcaacagcag aaattcctaa agtgtctgct taccaatata 120 gggtttttcg tgtt 134 <210> 90 <211> 138 <212> ADN <213> HPV70 <400> 90 88 cgtacaggca tatattatta tgctggaagc tctcgcttat taacagtagg gcatccttat 60 tttaaggtac ctgtaaatgg tggccgcaag caggaaatac ctaaggtgtc tgcatatcag 120 tatagggtat ttagggta 138 <210> 91 <211> 141 <212> ADN <213> HPV72 <400> 91 cgcaccaacc tctattatta tggtggcagt tctcgtctac taactgtagg acatccttac 60 tgtgccatac ctctcaacgg acagggcaaa aaaaacacca ttcctaaggt ttcggggtat 120 caatacaggg tgtttagagt a 141 <210> 92 <211> 138 <212> ADN <213> HPV73 <400> 92 âgâacaaatâ tatattatta tgcaggtagc acacgtttgt tggctgtggg acacccatat 60 tttcctatca aggattctca aaaacgtaaa accatagttc ctaaagtttc aggtttgcaa 120 tacagggtgt ttaggctt 138 <210> 93 <211> 132 <212> ADN <213> HPV74 cgcaccaaca tcttttatca tgctagcagt tctagactac ttgctgtagg aaatccctat 60 ttccctataa aacaggttaa caaaacagtt gttcctaaag tgtctggata tcaatttagg 120 gtgtttaagg tg 132 <210> 94 <211> 141 <212> ADN <213> HPV81 89 <400> 94 60 120 141 cgcaccaacc ttttttatta tgggggcagt tcccgccttc ttactgtagg gcatccatat tgtacattaa ctattggtac ccaaggaaag cgttccacta ttcccaaggt gtctgggtat cagtaccggg tgtttcgtgt g <210> 95 <211> 135 <212> ADN <213> HPV82 <400> 95 60 120 135 cgcaccggca tatattatta tgcaggcagt tccagactta ttaccttagg acatccatat ttttcaatac ccaaaaccaa tacacgtgct gaaataccta aggtatctgc ctttcagtat agggtgttta gggta <210> 96 <211> 141 <212> ADN <213> HPV83 <4 0 0> 96 60 120 141 cgcaccaacc tcttttatta cggtggcagc tccagacttc ttaccgtagg acatccatat tatcctgtac aggttaatgg tcaaggaaaa aaagccacta tccccaaggt ttctggctac caatataggg tgtttcgcat t <210> 97 <211> 150 <212> ADN <213> HPV84 60 120 150 cgcaccaact tattttatta tggtggtagt tctcgcctgc ttactgtggg acatccatat tattctgttc ctgtgtctac ccctgggcaa aacaacaaaa aggccactat ccccaaggtt tctgggtatc aatacagggt gtttagggtc <210> 98 <211> 138 <212> ADN <213> HPV85 <400> 98 90 90 60 120 138 cgtaccagta cattttatca tgctggcagc tctaggcttc taaccgttgg acatccatac tataaagtta cctcaaatgg aggccgcaag caagacattc ctaaagtgtc tgcctatcag tatcgagtgt ttcgggtt <210> 99 <211> 153 <212> ADN <213> HPV86 <400> 99 60 120 153 cgtaccaacc tattttatta tggtggtagt tcccgcttgc ttactgtggg ccatccatat tatcctgtta ctgtttcctc cagccctgga caaaacaaca aaaaggccaa tattcccaag gtttcggggt atcaatacag ggtttttagg gtg <210> 100 <211> 147 <212> ADN <213> HPV87 <400> 100 60 120 147 cgcaccaact tattttatta tggtggcagt tctcgcctgc ttactgtggg tcacccttac tatccagtta ctgttaccac ccctggtcag aacaagaaat ccaatattcc aaaggtgtct ggctatcagt acagggtgtt tcgggtg <210> 101 <211> 141 <212> ADN <213> HPV89 60 120 cgtaccaacc tgtactatta tggaggcagc tcccgcctta ttacagttgg ccacccttat tatactgtac aggtcaatgg tgctaacaaa aaggccaaca tacctaaggt atcagggtat caatacaggg tatttagggt a <210> 102 <211 > 141 <212> ADN <213> HPV90 <400> 102 141 91 agaacaaaca tatattatta tgcaggcagt tcccgactgt taactgttgg ccatccttat 60 tttgctatca aaaagcaatc aggaaaaaac cctatagtgg ttcccaaggt gtctggatat 120 caatataggg tgtttagggt a 141 <210> 103 <211 > 135 <212> ADN <213> HPV91 <400> 103 cgcaccaact tattttacca tgctggcagt tcccgtttac tggctgtggg ccaccctttt 60 tttcctataa aaaataattc 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REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista das referências citadas pelo requerente serve apenas para conveniência do leitor. Não faz parte do documento da patente europeia. Apesar da compilação cuidadosa das referências, os erros ou as omissões não podem ser excluídos e o IEP rejeita toda a responsabilidade a este respeito.
Documentos de patente citados na descrição:
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Lisboa, 05/10/2010
Claims (40)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para detectar a presença de, pelo menos, um agente patogénico que inclui colocar em contacto um ácido nucleico obtido a partir de uma amostra com um conjunto que inclui, pelo menos, quatro sondas, em que cada uma das sondas referidas inclui uma sequência complementar de uma sequência de um agente patogénico flanqueado por quatro pares de bases complementares, em que as referidas bases emparelham formando uma estrutura em haste na ausência de hibridação com um ácido nucleico do agente patogénico, em que a referida sonda é marcada com um primeiro marcador interactivo e um segundo marcador interactivo, de modo a que a hibridação da referida sonda com um ácido nucleico do agente patogénico mencionado cause uma mudança no sinal detectado.
2. Método de acordo com o reivindicado na reivindicação 1, em que o primeiro marcador interactivo e o segundo marcador interactivo referido são um dador FRET e um aceitador FRET.
3. Método de acordo com o reivindicado na reivindicação 2, em que o receptor FRET é um quencher.
4. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a referida sequência complementar de uma sequência de um agente patogénico se encontra ligada ao(s) par(es) de bases 2 complementares em ambas as extremidades por sequências de ligação.
5. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que os pares de bases complementares mencionados incluem pares C-G.
6. Método de acordo com o reivindicado na reivindicação 5, em que a sonda mencionada inclui a sequência 3' - CGCG-F- sequência única para o agente patogénico -F'- CGCG -5' em que F' e F' são sequências de ligação opcionais.
7. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a sequência única para o agente patogénico presente na sonda contém, pelo menos, um desemparelhamento com a sequência genómica do patogénio.
8. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que cada uma das sondas mencionadas pode ser distinguida de cada uma das outras sondas mencionadas.
9. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que cada uma das sondas mencionadas é ligada a um suporte sólido num local definido. 3
10. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o grupo de sondas mencionado inclui, pelo menos, 10, pelo menos 15 ou, pelo menos 20 sondas.
11. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o método mencionado inclui ainda determinar a temperatura de fusão da molécula de ácido nucleico de cadeia dupla formada por uma das sondas referidas e ácido nucleico complementar obtido a partir da referida amostra.
12. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o ácido nucleico mencionado obtido a partir de uma amostra é amplificado antes de ser colocado em contacto com o grupo de sondas referido.
13. Método de acordo com o reivindicado na reivindicação 12, em que a amplificação mencionada é conduzida utilizando a reacção em cadeia da polimerase (PCR).
14. Método da reivindicação 12 ou reivindicação 13, em que a produção do ácido nucleico amplificado é monitorizada continuamente.
15. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 12 a 15, em que o referido ácido nucleico amplificado é colocado em contacto com o grupo de sondas mencionado após um ciclo de amplificação. 4
16. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 12 a 15, em que o ácido nucleico amplificado é colocado em contacto com o grupo de sondas referido após cada ciclo de amplificação.
17. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 12 a 16, em que a amplificação mencionada é conduzida na presença do grupo de sondas referido.
18. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 12 a 17, em que o método mencionado inclui ainda a amplificação de um controlo interno.
19. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 12 a 18, em que se evita a amplificação de ácido nucleico contaminante.
20. Método de acordo com o reivindicado na reivindicação 19, em que a amplificação de ácido nucleico contaminante mencionada é evitada ao se efectuar a amplificação na presença de uracilo.
21. Método de acordo com o reivindicado na reivindicação 20 que inclui ainda o tratamento do ácido nucleico mencionado com uracil ADN glicosilase antes da amplificação.
22. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em que a amostra mencionada é seleccionada a partir de aspirados brônquicos, urina, 5 líquido obtido por massagem prostática, ejaculado, amostras citológicas de sangue e do colo do útero, vulvares, genitais, do ânus, da pele ou da laringe, esfregaços ou biopsias.
23. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 22, para detectar um organismo associado a doença sexualmente transmissível.
24. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 para detectar a presença de, pelo menos, um genotipo de HPV.
25. Método de acordo com o reivindicado na reivindicação 24 para detectar genotipos de HPV de alto risco ou baixo risco.
26. Método de acordo com o reivindicado na reivindicação 24 ou reivindicação 25, em que o grupo de sondas mencionado inclui, pelo menos, uma sonda que inclui, pelo menos, uma das sequências seleccionadas das SEQ. ID. Nos. 33 a 52 ou SEQ ID N°s. 105-117.
27. Método de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 24 a 26, em que o ácido nucleico mencionado obtido da referida amostra é amplificado utilizando, pelo menos, um iniciador seleccionado das Seq ID. N°s. 1 a 32.
28. Método de acordo com o reivindicado na reivindicação 27, em que o ácido nucleico obtido a partir da referida 6 amostra é amplificado utilizando uma mistura de iniciadores que inclui Seq ID. N°s. 1 a 32.
29. Um grupo de sondas que inclui, pelo menos, quatro sondas, em que cada uma das sondas inclui uma sequência complementar de uma sequência de um agente patogénico flanqueada por quatro pares de bases complementares, em que as referidas bases emparelham formando uma estrutura em haste na ausência de hibridação com um ácido nucleico de agente patogénico, em que a sonda é marcada por um primeiro marcador interactivo e um segundo marcador interactivo de modo a que a hibridação da referida sonda com um ácido nucleico do referido agente patogénico causa uma mudança no sinal detectado.
30. O grupo de sondas de acordo com o reivindicado na reivindicação 29, em que o primeiro marcador interactivo e o segundo marcador interactivo referido são um dador FRET e um receptor FRET. 31. 0 grupo de sondas de acordo com o reivindicado na reivindicação 30, em que o receptor FRET é um quencher.
32. O grupo de sondas de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 2 9 a 31, em que a referida sequência complementar de uma sequência de um agente patogénico se encontra ligada ao(s) par(es) de bases complementares em ambas as extremidades por sequências de ligação. 7 33. 0 grupo de sondas de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 2 9 a 32, em que os pares de bases complementares mencionados incluem pares C-G. 34. 0 grupo de sondas de acordo com o reivindicado na reivindicação 23, em que cada uma das referidas sondas inclui uma sequência. 3' - CGCG-F- sequência única para o agente patogénico -F' -CGCG -5' em que F' e F' são sequências de ligação opcionais. 35. 0 grupo de sondas de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 2 9 a 34, em que a sequência única para o agente patogénico presente na sonda contém, pelo menos, um desemparelhamento com a sequência genómica do agente patogénico. 36. 0 grupo de sondas de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 29 a 35, em que cada uma das sondas mencionadas pode ser distinguida de cada uma das outras sondas referidas. 37. 0 grupo de sondas de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 29 a 36, em que cada uma das sondas mencionadas é ligada a um suporte sólido num local definido. 38. 0 grupo de sondas de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 2 9 a 37, em que o 8 referido agente patogénico é um organismo associado a doença sexualmente transmissível. 39. 0 grupo de sondas de acordo com o reivindicado na reivindicação 38, em que o organismo mencionado é um vírus. 40 . 0 grupo de sondas de acordo com o reivindicado na reivindicação 39, em que o vírus mencionado é um papilomavírus humano. 41. 0 grupo de sondas de acordo com o reivindicado na reivindicação 40, em que cada uma das referidas sondas inclui uma sequência que é complementar a um genotipo do HPV.
42. O grupo de sondas de acordo com o reivindicado na reivindicação 41, em que cada uma das referidas sondas inclui uma sequência que é complementar a um genotipo do HPV de alto risco.
43. O grupo de sondas de acordo com o reivindicado na reivindicação 41, em que cada uma das referidas sondas inclui uma sequência que é complementar a um genotipo do HPV de baixo risco.
44. O grupo de sondas de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 40 a 43, em que o grupo de sondas referido inclui, pelo menos, uma sonda que inclui uma das sequências seleccionadas de SEQ—ID N°s. 33 a 52 ou SEQ ID N°s. 105-117. 9 45. 0 grupo de sondas da reivindicação 44, em que cada sonda do grupo de sondas referido inclui uma sequência seleccionada de SEQ ID N°s. 33 a 52 ou SEQ ID N°s. 105-117 .
46. O grupo de sondas da reivindicação 44 ou reivindicação 45, em que cada sonda do grupo de sondas referido inclui uma sequência seleccionada de SEQ ID N°s. 33 a 52.
47. Um kit para detectar um ou mais agentes patogénicos que inclui um grupo de sondas tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 29 a 46.
48. Um kit de acordo com o reivindicado na reivindicação 47, em que o agente patogénico referido é um organismo associado a doença sexualmente transmissível.
49. Um kit para detectar um ou mais genotipos de HPV que inclui um grupo de sondas tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 29 a 46.
50. O kit de acordo com o reivindicado em qualquer uma das reivindicações 47 a 49 que inclui ainda um controlo interno.
51. Método da reivindicação 13, incluindo adicionalmente a fase de aquecimento até aproximadamente 55 °C durante cerca de 5 minutos antes da amplificação. Lisboa, 05/10/2010
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