PT1734996E - Métodos e composição para tratamento e prevenção de doenças associadas a integrina αvβ5 - Google Patents

Description

ΕΡ 1 734 996/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Métodos e composição para tratamento e prevenção de doenças associadas a integrina ανβ5"

ANTECEDENTES DO INVENTO 0 edema pulmonar ("EP") afecta milhões de pessoas a cada ano, causando morbilidade e mortalidade substanciais. Em pacientes com EP, os alvéolos ficam inundados a partir dos capilares pulmonares o que compromete a transferência de oxigénio para a circulação sistémica (Hall, et al. in Current Therapy in Respiratory Medicine (R. Cherniack, Ed., 1986), págs. 222-227). Esta sequência de eventos resulta em hipoxemia, hipercapnia, e morte se não forem tomadas quaisquer medidas correctivas.

Qualquer condição ou agente que interrompe a homeostasia de fluido nos pulmões pode resultar em EP, que pode ser genericamente dividido em EP cardiogénico e não cardiogénico (ver, e.g., Kakouros e Kakouros, Hellenic J. Cardiol. 44:385-391 (2003). Por exemplo, a Lesão Pulmonar Aguda/Sindrome de Dificuldade Respiratória do Adulto (aguda) ou "SRDA", que se pode desenvolver como resultado de uma lesão do pulmão devida a, e.g., pneumonia, choque séptico, trauma, aspiração de vómito ou inalação química, está muitas vezes associada a EP não cardiogénico. O EP não cardiogénico é caracterizado por uma alteração na permeabilidade vascular do tecido do pulmão que conduz a um aumento nos níveis de fluido nos pulmões. O EP cardiogénico é muitas vezes causado por insuficiência cardíaca esquerda e pode ser uma complicação de um ataque cardíaco, válvulas cardíacas (válvulas mitral ou aórtica) estreitas ou com fugas, ou quaisquer doenças do coração que resultam em enfraquecimento e/ou rigidez do músculo cardíaco (cardiomiopatia). O coração em insuficiência transmite a sua pressão aumentada às veias do pulmão. À medida que a pressão nas veias do pulmão aumenta, o fluido é forçado para os espaços aéreos (alvéolos). Este fluido torna-se então uma barreira para as trocas normais de oxigénio, resultando em faltas de ar. O EP cardiogénico é caracterizado por pressão hidrostática capilar aumentada o que conduz a um aumento nos níveis de fluido nos pulmões. 2 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ Ο ΕΡ é causado por, e.g., permeabilidade capilar alterada; infecção; toxinas inaladas ou em circulação; substâncias vasoactivas (e.g., histamina, quininas); coagulação intravascular disseminada; reacções imunológicas; pneumonia associada a radiação; uremia; quase-afogamento; inalação de fumos; e sindrome de dificuldade respiratória aguda; insuficiência ventricular esquerda; estenose mitral; endocardite bacteriana; fibrose venosa pulmonar; estenose congénita da origem das veias pulmonares; doença veno-oclusiva pulmonar; sobreperfusão de fluidos; hipoalbuminemia (e.g., de enteropatia renal, hepática, nutricional ou de perda de proteína); alta altitude; overdoses de drogas, trauma do SNC, hemorragia subaracnóide, embolismo pulmonar, doença parenquimal pulmonar, eclampsia, anestesia e operações de bypass cardiopulmonar.

Os sintomas de EP podem incluir, por exemplo, falta de ar, respiração rápida e/ou ofegante, taquicardia, hipertensão, aperto no peito, extremidades frias com ou sem cianose associada, tosse com expectoração espumosa ou rósea, uso extensivo de músculos acessórios da respiração, estertores húmidos com ou sem pieira, e suas combinações. Exames para diagnosticar EP incluem análises ao sangue tais como hemograma completo (CBC), ureia no sangue (BUN), creatinina, e proteínas séricas. Análises à urina, gasometria de sangue arterial (GSA), raios X ao tórax e electrocardiogramas (ECG) são todos utilizados para auxiliar o médico no estreitamento do diagnóstico até ao EP. 0 tratamento de EP cardiogénico envolve tipicamente a colocação do paciente em oxigénio a 100%, morfina para aliviar a ansiedade e proporcionar alguns efeitos benéficos cardíacos, furosemida para diurese, vasodilatadores para reduzir o trabalho contra o qual o miocárdio deve bombear, e fármacos inotrópicos, tais como doputamina para aumentar a contractilidade cardíaca. Outras medidas que têm sido utilizadas são torniquetes rotativos em três dos quatro membros e redução do volume de sangue em 500 ml

Infelizmente, não está disponível qualquer tratamento específico ou satisfatoriamente eficaz para o EP. Assim, 3 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ existe uma necessidade na especialidade para terapias de EP eficazes e especificas. 0 presente invento aborda este e outros problemas.

BREVE SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento proporciona anticorpos e composições para tratamento ou prevenção de edema pulmonar ou lesão aguda do pulmão. 0 presente invento proporciona um anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como Depósito ATCC N.° PTA-5817. 0 invento proporciona também um anticorpo que se liga especificamente a integrina ανβ5 e é uma forma humanizada do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como Depósito ATCC N.° PTA-5817. 0 invento proporciona também um anticorpo humanizado que se liga especificamente a integrina ανβ5 e compreende as CDRs de cadeia pesada e leve de um anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como Depósito ATCC N.° PTA-5817. 0 invento proporciona também composições farmacêuticas compreendendo estes anticorpos e um excipiente farmaceuticamente aceitável. 0 invento proporciona também estes anticorpos para utilização no tratamento ou prevenção de edema pulmonar. 0 invento proporciona adicionalmente estes anticorpos para utilização no tratamento ou prevenção de lesão aguda do pulmão. Os anticorpos podem ser utilizados com um segundo agente terapêutico para tratamento de edema pulmonar ou lesão aguda do pulmão. 0 segundo agente terapêutico pode ser seleccionado entre o grupo consistindo de: um inibidor do percurso de ΤΘΕβ, Proteína C activada, um esteróide, GM-CSF, um inibidor de plaquetas, um agente diurético, um agente broncodilatador, um anticorpo que se liga a integrina ανβ5, um anticorpo que se liga a β5, um segundo antagonista de integrina ανβ5, um antagonista de integrina ανβ6, um agonista β2 ou um tensioactivo. Os anticorpos podem ser administrados intravenosamente, intranasalmente ou intrabronquialmente. 0 sujeito tratado é um sujeito mamífero, e.g. um primata tal 4 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ como um humano, um macaco ou um chimpanzé; um canídeo; ou um felino. 0 invento proporciona também a utilização dos anticorpos do invento para o fabrico de um medicamento para tratamento de edema pulmonar. 0 invento proporciona adicionalmente a utilização dos anticorpos para o fabrico de um medicamento para tratamento de lesão aguda do pulmão. 0 invento proporciona também kits para tratamento ou prevenção de EP. Os kits compreendem os anticorpos descritos acima e um segundo agente terapêutico para tratamento ou prevenção de EP. 0 segundo agente terapêutico pode ser seleccionado entre o grupo consistindo de: um inibidor do percurso de ΤΘΕβ, Proteína C activada, um esteróide, GM-CSF, um inibidor de plaquetas, um agente diurético, um agente broncodilatador, um anticorpo que se liga a integrina ανβ5, um anticorpo que se liga a β5, um segundo antagonista de integrina ανβ5, um antagonista de integrina ανβ6, um agonista β2 ou um tensioactivo. 0 invento proporciona também um hibridoma depositado como o Depósito ATCC N.° PTA-5817.

Estas e outras concretizações do invento são adicionalmente ilustradas pela descrição detalhada que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 ilustra resultados de experiências in vivo que demonstram que ratinhos β5~7~ são protegidos de EP induzido por lesão do pulmão. A Figura 2 ilustra resultados de experiências in vivo que demonstram que um anticorpo que se liga especificamente a β5 (i.e., ALULA) reduz a gravidade de EP induzido por isquemia-reperfusão. A Figura 3 ilustra resultados de experiências in vivo que demonstram que um anticorpo que se liga especificamente a β5 (i.e., ALULA) reduz a gravidade de EP induzido por lesão 5 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ do pulmão de ventilação de volume corrente (TV, tidal volume) elevado. A Figura 4 ilustra resultados de experiências in vitro que demonstram que um anticorpo que se liga especificamente a β5 (i.e., ALULA) bloqueia a adesão de células expressando integrina ανβ5 a placas revestidas com uma gama de concentrações do ligando de integrina ανβ5, vitronectina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Introdução 0 presente invento é baseado em parte na constatação surpreendente de que o tratamento de animais com agentes que se ligam a integrinas ανβ5 reduz os sintomas de EP. Mais particularmente, o bloqueio da ligação de ligandos a integrina ανβ5 pode reduzir a gravidade de EP. Os inventores demonstraram que um anticorpo que se liga a integrina ανβ5 bloqueia a ligação de vitronectina, um ligando de integrina ανβ5, a integrina ανβ5. Os inventores demonstraram ainda que a administração de um anticorpo que se liga a integrina ανβ5 reduz a gravidade de EP. Por conseguinte, o invento refere-se ao tratamento ou prevenção de EP num sujeito por administração de uma quantidade eficaz deste anticorpo que se liga a integrina ανβ5. 0 anticorpo revelado é designado "ALULA". 0 invento proporciona também composições farmacêuticas compreendendo estes anticorpos. Como descrito em maior detalhe nos Exemplos abaixo, o ALULA liga-se a integrina ανβ5 e a administração de ALULA a um sujeito mamífero reduz a gravidade de EP no sujeito.

Definições

Um "antagonista de ανβ5" é qualquer agente que compete com um ligando de ανβ5 por locais de ligação de ligando disponíveis em integrinas ανβ5. Os antagonistas de ανβ5 incluem agentes que se ligam especificamente a ανβ5, β5, bem como um agente que se liga a ανβ5 ou β5 e pelo menos a uma outra integrina tal como, e.g., ανβ3 ou ανβ6. 6 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ

Uma integrina ανβ5 é um membro de uma família de moléculas de adesão que compreendem heterodímeros α/β associados não covalentemente que medeiam, inter alia, interacções célula-célula, interacções célula-matriz extracelular, e interacções célula-patogénio. A ανβ5 é a única integrina que contém a subunidade β5. A ανβ5 reconhece a sequência peptídica RGD e liga-se a vitronectina (ver, e.g., Hynes, Cell 69:11-25 (1992)) e tem sido implicada em múltiplas perturbações incluindo AVC, enfarte do miocárdio, cancro (i.e., angiogénese), e doença de neovascularização ocular (ver, e.g., Friedlander et ai., Science 270 (5241):1500-2 (1995); Friedlander et al., PNAS USA 93 (18):9764-9 (1996); Elicieri et al., J. Cell Biol. 157(10:149-159 (2002); Heba et al., J. Vasc. Res. 38(3):288-300 (2001); Soeki et al., Cardiology 93(3):168-74 (2000); e Li et al., Am. J. Physiol. 270(5 Pt 2):H1803-11 (1996)). αν e β5 foram ambas sequenciadas e caracterizadas (ver, e.g., Hynes, 1992 supra, e Patente dos E.U.A. N.° 5527679, respectivamente).

Uma "dose terapêutica" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" de um antagonista de integrina ανβ5 é uma quantidade do antagonista que previne, alivia, diminui ou reduz a gravidade de sintomas de doenças associadas a integrina ανβ5 incluindo, e.g., AVC, enfarte do miocárdio, cancro (i.e., angiogénese), doença de neovascularização ocular e EP (e.g., acumulação de fluido nos pulmões, pressão hidrostática capilar pulmonar aumentada ou falta de ar) num paciente.

[0001] 0 termo "anticorpo" refere-se a um polipéptido codificado por um gene de imunoglobulina ou seus fragmentos funcionais que se liga especificamente e reconhece um antigénio. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes da região constante capa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, bem como a miríade de genes da região variável de imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas como capa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. 7 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ

Uma unidade estrutural exemplar de imunoglobulina (anticorpo) compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipéptido, cada par possuindo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos principalmente responsável pelo reconhecimento de antigénio. Assim, os termos "cadeia pesada variável", "VH" ou "VH" referem-se à região variável de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo um Fv, scFv, dsFv ou Fab; enquanto os termos "cadeia leve variável", "VL" ou "VL" se referem à região variável de uma cadeia leve de imunoglobulina, incluindo um Fv, scFv, dsFv ou Fab.

Exemplos de fragmentos funcionais de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, moléculas de anticorpo completo, fragmentos de anticorpo, tais como Fv, Fv de cadeia simples (scFv), regiões determinantes de complementaridade (CDRs), VL (região variável de cadeia leve), VH (região variável de cadeia pesada), Fab, F(ab)2' e qualquer combinação daqueles ou qualquer outra porção funcional de um péptido de imunoglobulina capaz de se ligar a um antigénio alvo (ver, e.g., Fundamental Immunology (Paul ed., 4.a ed. 2001). Conforme será reconhecido por um pessoa competente na especialidade, vários fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por uma variedade de métodos, por exemplo, digestão de um anticorpo intacto com uma enzima, tal como pepsina; ou síntese de novo. Fragmentos de anticorpo são muitas vezes sintetizados de novo quer quimicamente quer utilizando metodologia de ADN recombinante. Assim, o termo anticorpo, como aqui utilizado, inclui fragmentos de anticorpo quer produzidos pela modificação de anticorpos inteiros, quer aqueles sintetizados de novo utilizando metodologias de ADN recombinante (e.g., Fv de cadeia simples), quer aqueles identificados utilizando bibliotecas de exibição de fago (ver, e.g., McCafferty et al., (1990) Nature 348:552). O termo "anticorpo" inclui também moléculas bivalentes ou biespecíficas, diacorpos, triacorpos e tetracorpos. Moléculas bivalentes e biespecíficas são descritas em, e.g., Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547, Pack e Pluckthun (1992) Biochemistry 31:1579, Hollinger et al. (1993), PNAS. USA 90:6444, Gruber 8 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ et al. (1994) J. Immunol. :5368, Zhu et al. (1997) Protein Sei. 6:781, Hu et al. (1996) Câncer Res. 56:3055, Adams et al. (1993) Câncer Res. 53:4026, e McCartney, et al. (1995) Protein Eng. 8:301.

[0002] Um anticorpo "humanizado" é um anticorpo que mantém a reactividade de um anticorpo não humano sendo ao mesmo tempo menos imunogénico em humanos. Isto pode ser conseguido, por exemplo, mantendo as regiões CDR não humanas e substituindo as restantes partes do anticorpo pelas suas correspondentes de humano. Ver, e.g., Morrison et al., PNAS USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994). "Fv de cadeia simples (scFv)" ou "anticorpos de cadeia simples" referem-se a uma proteina onde as regiões VH e VL de um anticorpo scFv compreendem uma cadeia simples que é dobrada para criar um local de ligação de antigénio similar ao encontrado em anticorpos de duas cadeias. Métodos de preparação de anticorpos scFv foram descritos em e.g., Ward et al., Exp. Hematol. (5):660-4 (1993); e Vaughan et al., Nat. Biotechnol. 14(3):309-14 (1996). Anticorpos Fv de cadeia simples (scFv) incluem opcionalmente um ligador de péptido de não mais do que 50 aminoácidos, geralmente não mais do que 40 aminoácidos, preferivelmente não mais do que 30 aminoácidos, e muito preferivelmente não mais do que 20 aminoácidos de comprimento. Em algumas concretizações, o ligador de péptido é um concatâmero da sequência Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, e.g., 2, 3, 4, 5 ou 6 destas sequências. Contudo, é de notar que podem ser efectuadas algumas substituições de aminoácidos dentro do ligador. Por exemplo, uma valina pode ser utilizada em substituição de uma glicina. Ligadores de péptido adicionais e sua utilização são bem conhecidos na especialidade. Ver, e.g., Huston et al., Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 8:5879 (1988); Bird et al., Science 242:4236 (1988); Glockshuber et al., Biochemistry 29:1362 (1990); Patente dos E.U.A. N.° 4946778, Patente dos E.U.A. N.° 5132405 e Stemmer et al., Biotechniques 14:256-265 (1993). 9 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ A frase "liga-se especificamente (ou selectivamente) a um anticorpo", quando se refere a uma proteína ou péptido, refere-se a uma reacção de ligação que é determinadora da presença da proteína na presença de uma população heterogénea de proteínas e agentes biológicos. Assim, sob condições de imunoensaio designadas, os anticorpos especificados ligam-se a uma proteína particular (e.g., integrina ανβ5, β5, ou suas porções) e não se ligam numa quantidade significativa a outras proteínas presentes na amostra. A ligação específica a um anticorpo sob tais condições pode requerer um anticorpo que é seleccionado quanto à sua especificidade por uma proteína particular. Por exemplo, anticorpos criados contra uma integrina ανβ5 ou um polipéptido β5 podem ser seleccionados para obter anticorpos especificamente imunorreactivos com essa proteína e não com outras proteínas, excepto para variantes polimórficas, e.g., proteínas pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% idênticas a uma sequência de interesse. Pode-se utilizar uma variedade de formatos de imunoensaio para seleccionar anticorpos especificamente imunorreactivos com uma proteína particular. Por exemplo, imunoensaios ELISA de fase sólida, Western blots ou imuno-histoquímica são utilizados como rotina para seleccionar anticorpos monoclonais especificamente imunorreactivos com uma proteína. Ver, Harlow e Lane Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, NY (1988) para uma descrição de formatos e condições de imunoensaio que podem ser utilizados para determinar uma imunorreactividade específica. Tipicamente, uma reacção específica ou selectiva terá pelo menos duas vezes o sinal ou ruído de fundo e mais tipicamente mais de 10 a 100 vezes o sinal ou ruído de fundo.

Um agente que "especificamente compete" pela ligação reduz a ligação específica de um anticorpo a um polipéptido. Considera-se que um primeiro anticorpo inibe competitivamente a ligação de um segundo anticorpo, se a ligação do segundo anticorpo ao antigénio é reduzida por pelo menos 30%, usualmente pelo menos cerca de 40%, 50%, 60% ou 75%, e frequentemente pelo menos cerca de 90%, na presença do primeiro anticorpo utilizando qualquer dos ensaios de ligação competitivos conhecidos na especialidade (ver, e.g., Harlow e Lane, supra). 10 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ

Os termos "polipéptido," "péptido" e "proteína" são aqui utilizados intermutavelmente para referir um polímero de resíduos aminoácido. Os termos aplicam-se aos polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos aminoácido são um mimético químico artificial de um aminoácido correspondente de ocorrência natural, bem como a polímeros de aminoácidos de ocorrência natural e a polímeros de aminoácidos não de ocorrência natural. Como aqui utilizados, os termos abrangem cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, incluindo proteínas a todo o comprimento (i.e., antigénios), onde os resíduos aminoácido estão ligados por ligações peptídicas covalentes. O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, bem como a análogos de aminoácido e a miméticos de aminoácido que funcionam de um modo similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são depois modificados, e.g., hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato e O-fosfo-serina. Análogos de aminoácido refere-se a compostos que possuem a mesma estrutura química básica que a de um aminoácido de ocorrência natural, i.e., um carbono a que está ligado a um hidrogénio, um grupo carboxilo, um grupo amino e um grupo R, e.g., homo-serina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina-metilsulfónio. Estes análogos têm grupos R modificados (e.g., norleucina) ou cadeias principais peptídicas modificadas, mas mantêm a mesma estrutura química básica que a de um aminoácido de ocorrência natural. "Miméticos de aminoácido" refere-se a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam de um modo similar a um aminoácido de ocorrência natural.

Os aminoácidos podem aqui ser referidos quer pelos seus símbolos de três letras habitualmente conhecidos quer pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura de Bioquímica da IUPAC-IUB. Do mesmo modo, os nucleótidos podem ser referidos pelos seus códigos de uma única letra habitualmente aceites. 11 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ

Como aqui utilizados, os termos "ácido nucleico" e "polinucleótido" são utilizados intermutavelmente. A utilização do termo "polinucleótido" inclui oligonucleótidos (i.e., polinucleótidos curtos). Este termo refere-se também a desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos e variantes de ocorrência natural, e podem também referir-se a ácido nucleicos sintéticos e/ou não de ocorrência natural (i.e., compreendendo análogos de ácido nucleico ou resíduos modificados da cadeia principal ou de elementos de ligação), tais como, por exemplo e sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quiral, 2-0-metil-ribonucleótidos, péptido-ácidos nucleicos (PNAs) , e outros. A não ser que indicado de outro modo, uma sequência de ácido nucleico particular abrange também implicitamente suas variantes modificadas conservativamente (e.g., substituições de codões degenerados) e sequências complementares bem como a sequência indicada explicitamente. Especificamente, substituições de codões degenerados podem ser conseguidas gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais codões seleccionados (ou de todos) está substituída por resíduos de base mista e/ou de desoxi-inosina (ver, e.g., Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991);

Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Cassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994) ) .

Inibição de <χνβ5 O presente invento refere-se ao tratamento ou prevenção de EP ou de lesão aguda do pulmão por inibição da ligação de ligandos a integrina ανβ5. Utilizam-se anticorpos que se ligam especificamente à subunidade β5 de integrina ανβ5. A doença é EP (incluindo, e.g., EP cardiogénico e não cardiogénico). Em algumas concretizações, o tratamento de EP também trata ou previne perturbações subsequentes, e.g., fibrose pulmonar.

Anticorpos

De acordo com o presente invento, anticorpos que se ligam especificamente a integrina ανβ5, e em particular à subunidade β5 da integrina ανβ5, são utilizados para tratar 12 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ ou prevenir ΕΡ ou lesão aguda do pulmão. Anticorpos adequados incluem anticorpos humanizados e fragmentos de anticorpo (i.e., Fv, Fab, (Fab')2 ou scFv).

No invento, o anticorpo monoclonal ALULA (Depósito ATCC N.° PTA-5817, efectuado em 13 de Fevereiro de 2004, na ATCC, 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209), que se liga à subunidade β5 da integrina ανβ5, é utilizado para tratar ou prevenir EP ou lesão aguda do pulmão. Sem querer estar limitado pela teoria, é postulado que o ALULA actua por bloqueio das alterações mediadas por integrina ανβ5 na permeabilidade vascular nos pulmões. Em algumas concretizações, utilizam-se ALULA humanizado ou fragmentos de ALULA para tratar EP.

Anticorpos monoclonais são obtidos por várias técnicas familiares dos peritos na especialidade. Resumidamente, células de baço a partir de um animal imunizado com um antigénio desejado são imortalizadas, habitualmente por fusão com uma célula de mieloma (ver, por exemplo, Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976)). Métodos de imortalização alternativos incluem transformação com vírus Epstein-Barr, oncogenes ou retrovírus, ou outros métodos bem conhecidos na especialidade. As colónias resultantes de células imortalizadas individuais são rastreadas quanto à produção de anticorpos da especificidade e afinidade desejadas pelo antigénio, e o rendimento dos anticorpos monoclonais produzidos por estas células pode ser melhorado por várias técnicas, incluindo injecção na cavidade peritoneal de um hospedeiro vertebrado. Alternativamente, podem-se isolar sequências de ADN que codificam um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento de ligação por rastreio de uma biblioteca de ADN a partir de células B de humano de acordo com o protocolo geral descrito por Huse et ai., Science 246: 1275-1281 (1989) .

Os anticorpos monoclonais são colhidos e titulados contra o imunogénio num imunoensaio, por exemplo, um imunoensaio de fase sólida com o imunogénio imobilizado sobre um suporte sólido. Os anticorpos monoclonais ligar-se-ão usualmente com uma Kd de pelo menos cerca de 0,1 mM, mais usualmente pelo menos cerca de 1 μΜ, preferivelmente pelo 13 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ menos cerca de 0,1 μΜ ou melhor, e muito preferivelmente, 0. 01 μΜ ou melhor.

Num caso exemplar, um animal, tal como um coelho ou ratinho, é imunizado com polipéptido ανβ5 ou com uma construção de ácido nucleico codificando um tal polipéptido. Os anticorpos produzidos como resultado da imunização podem ser isolados utilizando métodos padrão.

As imunoglobulinas, incluindo seus fragmentos de ligação e outros derivados, do presente invento podem ser produzidas prontamente por uma variedade de técnicas de ADN recombinante, incluindo por expressão em células transfectadas (e.g., células eucarióticas imortalizadas, tais como células de mieloma ou hibridoma) ou em ratinhos, ratos, coelhos ou outros vertebrados capazes de produzirem anticorpos por métodos bem conhecidos. Células de origem adequadas para as sequências de ADN e células hospedeiras para expressão e secreção de imunoglobulina podem ser obtidas de várias fontes, tais como a American Type Culture Collection (Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, Fifth edition (1985) Rockville, Md).

Em algumas concretizações, o anticorpo é um anticorpo humanizado, i.e., um anticorpo que retém a reactividade de um anticorpo não humano sendo ao mesmo tempo menos imunogénico em humanos. Isto pode ser conseguido, por exemplo, mantendo as regiões CDR não humanas e substituindo as partes restantes do anticorpo pelas suas correspondentes humanas. Ver, e.g., Morrison et al. , PNAS USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison e 01, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al.,

Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994). Técnicas para humanização de anticorpos são bem conhecidas na especialidade e são descritas em e.g., Patentes dos E.U.A. N.os 4816567, 5530101, 5859205, 5585089, 5693761, 5693762, 5777085, 6180370, 6210671 e 6329511; WO 87/02671; Pedido de

Patente EP 0173494; Jones et al. (1986) Nature 321:522; e Verhoyen et al. (1988) Science 239:1534. Anticorpos humanizados são adicionalmente descritos em, e.g., Winter e Milstein (1991) Nature 349:293. Por exemplo, polinucleótidos compreendendo uma primeira sequência codificando regiões de 14 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ estrutura (framework) de imunoglobulina humanizada e uma segunda sequência codificando as regiões determinantes de complementaridade de imunoglobulina desejadas podem ser produzidos sinteticamente ou por combinação de segmentos apropriados de ADNc e de ADN genómico. Sequências de ADN da região constante de humano podem ser isoladas de acordo com procedimentos bem conhecidos a partir de uma variedade de células de humano. As CDRs para produção das imunoglobulinas do presente invento serão obtidas similarmente a partir de anticorpos ALULA monoclonais.

Em alguns casos, a transferência de uma CDR para uma estrutura de humano conduz a uma perda de especificidade para o anticorpo humanizado. Nestes casos, pode-se introduzir uma mutação reversa (back mutation) nas regiões de estrutura da porção humana do anticorpo. Métodos para realizar mutações reversas são bem conhecidos na especialidade na especialidade e são descritos em, e.g., Co et al., PNAS USA 88;2269-2273 (1991) e WO 90/07861.

Em algumas concretizações, os anticorpos são fragmentos de anticorpo tais como Fab, F(ab')2, Fv ou scFv. Os fragmentos de anticorpo podem ser gerados utilizando quaisquer meios conhecidos na especialidade incluindo, digestão química (e.g., papaína ou pepsina) e métodos recombinantes. Métodos para isolamento e preparação de ácidos nucleicos recombinantes são conhecidos dos peritos na especialidade (ver, Sambrook et al., Molecular Clonlng. A Laboratory Manual (2.a ed. 1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Blology (1995)). Os anticorpos podem ser expressos numa variedade de células hospedeiras, incluindo E. coli, outros hospedeiros bacterianos, levedura e várias outras células eucarióticas superiores, tais como as linhas de células COS, CHO e HeLa e linhas de células de mieloma.

Tratamento terapêutico

Como descrito acima, o invento proporciona também composições compreendendo os anticorpos do invento. As composições do invento podem ser proporcionadas para tratar ou prevenir EP ou lesão aguda do pulmão. 15 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ

Numa concretização, as composições do invento (composições compreendendo ALULA, ALULA humanizado ou fragmentos de ALULA) podem ser proporcionadas para tratar ou prevenir EP em sujeitos com EP ou em risco de desenvolver EP. Por exemplo, um sujeito que foi submetido a exposição a um inalante tóxico será provavelmente tratado após uma tal exposição, enquanto um paciente em risco de EP pode ser tratado profilacticamente e/ou terapeuticamente. Exemplos de pacientes em risco de EP incluem pacientes com aspiração aguda, pacientes exibindo sintomas de sepsia bacteriana, pacientes cujas culturas sanguíneas são positivas em relação a bactérias gram-positivas ou gram-negativas, pacientes com pancreatite ou pacientes em choque hemorrágico.

As composições do invento podem ser administradas numa base regular (e.g., diariamente) durante um período de tempo (e.g., 2, 3, 4, 5, 6 dias ou 1-3 semanas ou mais).

As composições do invento podem ser administradas directamente ao sujeito mamífero para bloquear a ligação de ανβ5 utilizando qualquer via conhecida na especialidade, incluindo e.g., por injecção (e.g., intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular ou intradérmica) , inalação, aplicação transdérmica, administração rectal ou administração oral.

As composições farmacêuticas do invento compreendem um transportador farmaceuticamente aceitável. Transportadores farmaceuticamente aceitáveis são determinados em parte pela composição particular que está a ser administrada, bem como pelo método particular utilizado para administrar a composição. Por conseguinte, existe uma ampla variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas do presente invento (ver, e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences, 17.a ed., 1989).

As composições do invento, sozinhas ou em combinação com outros componentes adequados, podem ser produzidas em formulações de aerossol (i.e., podem ser "nebulizadas") para serem administradas via inalação. As formulações de aerossol 16 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ podem ser colocadas em propulsores aceitáveis pressurizados, tais como diclorodifluorometano, propano, azoto, e outros.

Formulações adequadas para administração incluem soluções aquosas e não aquosas, soluções estéreis isotónicas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotónica, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes. Na prática deste invento, as composições podem ser administradas, por exemplo, oralmente, nasalmente, topicamente, intravenosamente, intraperitonealmente ou intratecalmente. As formulações de compostos podem ser apresentadas em recipientes fechados de dose unitária ou multidose, tais como ampolas e frascos para injectáveis. Podem-se preparar soluções e suspensões a partir de pós estéreis, grânulos e comprimidos do tipo anteriormente descrito. Os moduladores podem também ser administrados como parte de um alimento preparado ou fármaco.

Formulações adequadas para administração oral podem compreender: (a) soluções liquidas, tais como uma quantidade eficaz do ácido nucleico empacotado suspenso em diluentes, tais como água, solução salina ou PEG 400; (b) cápsulas, saquetas ou comprimidos, cada um contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente activo, como liquidos, sólidos, grânulos ou gelatina; (c) suspensões num liquido apropriado; e (d) emulsões adequadas. As formas de comprimido podem incluir um ou mais de lactose, sacarose, manitol, sorbitol, fosfatos de cálcio, amido de milho, amido de batata, celulose microcristalina, gelatina, dióxido de silicio coloidal, talco, estearato de magnésio, ácido esteárico e outros excipientes, corantes, cargas, ligantes, diluentes, agentes tamponantes, agentes hidratantes, conservantes, agentes aromatizantes, pigmentos, agentes desintegrantes e transportadores farmaceuticamente compatíveis. Formas de pastilha podem compreender o ingrediente activo num aroma, e.g., sacarose, bem como pastilhas compreendendo o ingrediente activo numa base inerte, tal como gelatina e glicerina ou emulsões de sacarose e goma-arábica, geles, e outros, contendo, para além do ingrediente activo, transportadores conhecidos na especialidade. 17 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ

No contexto do presente invento, a dose administrada a um paciente deverá ser suficiente para efectuar uma resposta benéfica no sujeito ao longo do tempo, e.g., uma redução na pressão hidrostática capilar pulmonar, uma redução em fluido nos pulmões, uma redução na taxa de acumulação de fluido nos pulmões, ou uma sua combinação. 0 nivel de dose óptima para qualquer paciente dependerá de uma variedade de factores incluindo a eficácia do modulador especifico utilizado, a idade, peso corporal, actividade física e dieta do paciente, de uma possível combinação com outros fármacos, e da gravidade da EP. 0 tamanho da dose será também determinado pela existência, natureza e extensão de quaisquer efeitos secundários adversos que acompanham a administração de um composto ou vector particular num sujeito particular.

Na determinação da quantidade eficaz de anticorpos do invento a administrar, um médico pode avaliar os níveis dos anticorpos em circulação no plasma. Em geral, o equivalente de dose é de cerca de 1 ng/kg a 10 mg/kg para um sujeito típico.

Para administração, os anticorpos podem ser administrados a uma taxa determinada pela LD50, e pelos efeitos secundários a várias concentrações, conforme aplicáveis à massa e ao estado de saúde geral do sujeito. A administração pode ser realizada através de uma única dose ou de doses divididas.

Terapia de combinação

Em algumas concretizações, os anticorpos do invento são administrados em conjunto com um segundo agente terapêutico para tratamento ou prevenção de lesão aguda do pulmão e/ou EP. Por exemplo, ALULA, ALULA humanizado ou fragmentos de ALULA podem ser administrados em conjunto com qualquer dos tratamentos padrão para EP incluindo, e.g., agentes diuréticos, agentes broncodilatadores, narcóticos, oxigénio e aplicação selectiva de torniquete. Adicionalmente, os anticorpos do invento podem ser administrados em conjunto com agentes que visam percursos metabólicos que estão implicados em lesão aguda do pulmão e/ou EP. Por exemplo, os anticorpos 18 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ podem ser administrados em conjunto com inibidores do percurso de TGFp, Proteína C activada, esteróides, GM-CSF, inibidores de plaquetas, agonistas β-2, tensioactivos, anticorpos que se ligam especificamente a integrina ανβ5 ou β5, um segundo antagonista de integrina ανβ5, anticorpos que se ligam especificamente a uma integrina ανβ6, antagonistas de integrina ανβ6, antagonistas de receptor de trombina, agentes anti-trombina, inibidores de quinase rho, e ácidos nucleicos que inibem a expressão de integrina ανβ5 incluindo e.g., os oligonucleótidos antissentido e os siRNA aí descritos. Inibidores do percurso de ΤΰΓβ adequados incluem, e.g., anticorpos de TGF-β (incluindo aqueles que especificamente bloqueiam TGF-βΙ, TGF^2, TGF-33 ou qualquer sua combinação) como descrito em e.g., Ling et al., J. Amer. Soc. Nephrol. 14: 377-388 (2003), McCormick et al., J. Immunol. 163:5693-5699 (1999), e Cordeiro, Curr. Opin. Mol. Ther. 5(2):199-203 (2003); inibidores de receptor de TGF-β tipo II ou inibidores de quinase de receptor de TGF-β tipo I, como descrito em, e.g., DaCosta Bayfield, Mol. Pharmacol. 65(3):744-52 (2004), Laping, Curr. Opin. Pharmacol. 3(2):204-8 (2003), Laping, Mol. Pharmacol. 62(1):58-64 (2002); receptor de TGF-β tipo II solúvel como descrito em, e.g., Pittet, J. Clln. Invest. 107:1537-1544 (2001); Wang et al., Exp. Lung Res. 28(6):405-17 (2002) e Wang, Thorax 54(9):805-12 (1999); péptidos solúveis associados a latência como descrito em, e.g., Zhang, J. Invest. Dermatol. 121(4):713-9 (2003); inibidores de trombospondina I como descrito em, e.g., Crawford et al., Cell 93 : 1159-1170 (1998), Riberiro et al., J. Biol. Chem. 274:13586-13593 (1999), e Schultz-Cherry et al., J. Biol. Chem. 269: 26775-26782 (1994). Agonistas β-2 adequados incluem, e.g., albuterol, bitolterol, formoterol, isoproterenol, levalbuterol, metaproterenol, pirbuterol, salmeterol e terbutalina. Tensioactivos adequados incluem, e.g., exosurf, infasurf, KL-4, pumactant, survanta, venticute e tensioactivo TA, como descrito em Taeusch et al., Acta Pharmacol Sin 23 Supplement: 11-15 (2002). Agentes anti-trombina adequados incluem, e.g., hirudina, Hirulog (Biogen), argatroban (Texas Biotechnology) e efegatran (Lilly) e compostos descritos na Patente dos E.U.A. N.° 6518244. Antagonistas de receptor de trombina adequados são descritos em, e.g., Patentes dos E.U.A. N.os 6544982, 6515023, 6403612, 6399581 e 5446131. Inibidores de quinase rho adequados 19 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ incluem, e.g., Υ-27632 como descrito em e.g., Tasaka et ai., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2005 Mar 18; [Publicado electronicamente antes de impresso], fasudil como descrito em, e.g., Nishikimi et ai., J. Hypertens. 22(9):1787-96 (2004), 1-(5-isoquinolinassulfonil)-homopiperazina (HA-1077), (S)-(+)-2-meti1-1-[(4-metil-5-isoquinolina)sulfonil]-homopiperazina (H-1152P) como descrito em, e.g., Sasaki et al. , Pharmacol Ther. 93 (2-3):225-32 (2002), e inibidores de quinase rho adicionais como descrito em, e.g., patentes dos E.U.A. N.os 6451825 e 6218410 e Publicação da Patente dos E.U.A. N.os 20050014783 e 20030134775.

Adicionalmente, os anticorpos podem ser administrados em combinação com um adenovirus expressando ATPase como descrito em Publicação da Patente dos E.U.A. N.° 20020192186; com um receptor adrenérgico β2 como descrito em Publicação da

Patente dos E.U.A. N.° 20020004042; com antagonistas de νΈΘΕβ como descrito em Patente dos E.U.A. N.° 6284751; com inibidores de peroxidação de lípido como descrito em Patente dos E.U.A. N.0 5231114, e com inibidores de moléculas pequenas para integrinas ανβ6, ανβ5 e ανβ3 como descrito em, e.g., Pedidos de Patente dos E.U.A. Publicados N.os 2000/40019206, 2004/0019037, 2004/0019035, 2004/0018192, 2004/0010023, 2003/0181440, 2003/0171271, 2003/0139398, 2002/0037889, 2002/0077321, 2002/0072500, Patente dos E.U.A. N.° 6683051 e Goodman et al., J. Med. Chem. 45(5):1045-51 (2002) . O ALULA, ALULA humanizado ou fragmentos de ALULA e o segundo agente terapêutico podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente. Por exemplo, o anticorpo pode ser administrado primeiro, seguido pelo segundo agente terapêutico. Alternativamente, o segundo agente terapêutico pode ser administrado primeiro, seguido pelo anticorpo. Em alguns casos, o anticorpo e o segundo agente terapêutico são administrados na mesma formulação. Noutros casos o anticorpo e o segundo agente terapêutico são administrados em formulações diferentes. Quando o anticorpo e o segundo agente terapêutico são administrados em formulações diferentes, a sua administração pode ser simultânea ou sequencial. 20 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ

Para administração, ο anticorpo e segundo agente terapêutico podem ser administrados a uma taxa determinada pela LD5o combinada do anticorpo e do segundo agente terapêutico, e pelos efeitos secundários do anticorpo e do segundo agente terapêutico a várias concentrações, como aplicado à massa e estado de saúde geral do sujeito. Em alguns casos, o anticorpo e o segundo agente terapêutico são, cada um, administrados como uma dose subterapêutica ou como uma dose terapêutica.

Kits 0 presente invento proporciona também kits para tratamento ou prevenção de EP. Os kits compreendem ALULA, ALULA humanizada ou fragmentos de ALULA e um segundo agente terapêutico para tratamento de EP. Segundos agentes terapêuticos adequados são, e.g., um inibidor do percurso de ΤΘΕβ, Proteína C activada, um esteróide, GM-CSF, um inibidor de plaquetas, um agente diurético, um agente broncodilatador, anticorpos que se ligam especificamente a integrina ανβ5 ou β5, um segundo antagonista de integrina ανβ5, anticorpos que se ligam especificamente a uma integrina ανβ6, antagonistas de integrina οτνββ, agonistas β-2 e tensioactivos. Os kits podem também compreender instruções escritas (e.g., um manual) para utilização do kit.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Materiais e métodos

Modelo de EP de lesão do pulmão de isquemia-reperfusão de um único pulmão de roedor: Ratinhos ou ratos submetidos a transplante do pulmão, bypass cardiopulmonar, tromboendoarterectomia pulmonar, ou choque severo. Em seguida a isquemia e reperfusão são induzidas durante trinta minutos e três horas, respectivamente. Para induzir isquemia, é realizada uma toracotomia esquerda por bloqueio do hilo esquerdo (e.g., com fita umbilical) durante 30 minutos. Para induzir reperfusão, os pulmões são reinsuflados com um volume corrente de 12 ml/kg de ar e depois retoma-se a ventilação normal. Os animais são eutanizados após 3 horas e a permeabilidade de cada pulmão é avaliada, e.g., por medição 21 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ da extravasação de albumina marcada para o pulmão, expressa como equivalentes pulmonares extravasculares (EVPE, Extravascular Plasma Equivalents) .

Modelo de EP por lesão do pulmão induzida por ventilador em roedor: Ratinhos ou ratos são ventilados com volume corrente normal (6 ml por kg) ou elevado (20 ml por kg) . Os animais sao injectados com albuminas marcadas com I apos 4 horas e depois colhem-se os pulmões e determinam-se os EVPE.

Medição de equivalentes pulmonares extravasculares (EVPE): Os EVPE foram medidos como descrito em, e.g., Frank et al., J. Blol. Chem., 278 (45): 43939-43950 (2003)). Resumidamente, um marcador vascular (e.g., bI-albumina) é injectado intraperitonealmente em ratos duas horas antes da colheita do pulmão. Colhe-se sangue e removem-se os pulmões. Medem-se os valores de radioactividade no pulmão e no plasma. Mede-se a concentração de hemoglobina no homogeneizado de pulmão e no sangue. A radioactividade intravascular no pulmão é calculada multiplicando a contagem de radioactividade no plasma pelo volume de sangue no pulmão.

Anticorpos: O ALULA foi gerado como descrito abaixo. O W6/32, um anticorpo monoclonal murino W6/32 que se liga especificamente a HLA A, B, e C foi obtido na ATCC. 0 CD-I WT, um anticorpo monoclonal que se liga a CD-I foi obtido na ATCC.

Exemplo 2: Geração de ALULA, um anticorpo monoclonal murino que se liga especificamente a integrina ανβ5

Ratinhos knockout ανβ5 foram imunizados com células expressando um polipéptido compreendendo uma sequência de integrina ανβ5. Anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a integrina ανβ5 foram identificados utilizando métodos conhecidos na especialidade. Mais particularmente, identificou-se o ALULA que se liga especificamente a β5. O ALULA foi depositado na ATCC em 13 de Fevereiro de 2004 e tem o N.° de Acesso ATCC: PTA-5817. 22 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ

Exemplo 3: Ratinhos β5 / não desenvolvem ΕΡ associado a lesão do pulmão

Ratinhos β5_/~ e ratinhos do tipo selvagem foram ventilados como descrito em Exemplo 1 acima para induzir EP associada a lesão do pulmão e determinou-se o EVPE. Em contraste com os ratinhos do tipo selvagem, os ratinhos β5_/“ não desenvolveram EP após ventilação. Estes resultados indicam que ο ανβ5 está envolvido em EP. Os resultados são apresentados na Figura 1.

Exemplo 4: Um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a β5 reduz a severidade de edema pulmonar associado a isguemia-reperfusão

Para determinar o papel de β5 em EP associado a isquemia-reperfusão, administraram-se aos ratos os tratamentos seguintes e efectuaram-se as medições de EVPE: 1. Nenhum tratamento. 2. Injecção intraperitoneal (i.p.) de 4 pg por grama de W6/32. 3. I.p. 4 pg por grama (i.p.) de ALULA. 4. Induziu-se isquemia-reperfusão como descrito no

Exemplo 1 acima 5. Induziu-se isquemia-reperfusão e injectaram-se intraperitonealmente 4 pg por grama de W6/32. 6. Induziu-se isquemia-reperfusão e injectaram-se intraperitonealmente 4 pg por grama de ALULA.

[0003] Nestas experiências, os anticorpos foram injectados antes da indução de isquemia-reperfusão.

Ratos que receberam tratamento com ALULA exibiram EVPE reduzido (i.e., permeabilidade reduzida de células do pulmão) em comparação com ratos de controlo, indicando que um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a β5 pode reduzir a severidade de EP.

Os resultados são apresentados na Figura 2. 23

EP 1 734 996/PT

Exemplo 5: Um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a β5 reduz a severidade de edema pulmonar associado a lesão do pulmão

Para determinar o papel de β5 em EP associado a lesão do pulmão, administraram-se aos ratinhos os tratamentos seguintes e efectuaram-se as medições de EVPE: 1. Volume corrente normal e injecção i.p. de 4 pg por grama de CD-I WT. 2. Volume corrente elevado e injecção i.p. de 4 pg por grama de CD-I WT. 3. Volume corrente normal e injecção i.p. de 4 pg por grama de ALULA. 4. Volume corrente elevado e injecção i.p. de 4 pg por grama de ALULA.

Nestas experiências, os anticorpos foram injectados antes dos tratamentos de volume corrente.

Ratinhos que receberam tratamento com ALULA exibiram EVPE reduzido em comparação com ratinhos de controlo, indicando que um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a β5 pode reduzir a severidade de EP.

Assim, o ALULA é o primeiro anticorpo monoclonal especifico para ανβ5 que mostrou ter actividade de bloqueio in vivo em mamíferos inteiros e é o primeiro que mostrou bloquear a permeabilidade vascular aumentada e o desenvolvimento de inundação alveolar em modelos de lesão aguda do pulmão (i.e., EP).

Os resultados são apresentados na Figura 3.

Exemplo 6: 0 anticorpo ALULA bloqueia a ligação do ligando de integrina ανβ5 vitronectina a células expressando integrina ανβ5 Células SW-480 expressando integrina ανβ5 são postas em contacto com 0 pg/ml, 0,1 pg/ml, 0,3 pg/ml e 1 pg/ml de vitronectina na presença de 0 pg/ml, 0,3 pg/ml, 1 pg/ml e 10 pg/ml de ALULA. Um anticorpo monoclonal (i.e., Y9A2) específico de integrina α9β1 é utilizado como controlo 24 ΕΡ 1 734 996/ΡΤ negativo. 0 ALULA bloqueia a ligação do ligando de integrina ανβ5, vitronectina, às células. Os resultados são apresentados na Figura 4.

Lisboa, 2013-07-11

Claims (16)

1. ΕΡ 1 734 996/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como Depósito ATCC N.° PTA-5817.
2. 2. Anticorpo que se liga especificamente a integrina ανβ5, onde o anticorpo é uma forma humanizada do anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como Depósito ATCC N.° PTA-5817.
3. 3. Anticorpo humanizado que se liga especificamente a integrina ανβ5, compreendendo as regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada e leve de um anticorpo produzido pelo hibridoma depositado como Depósito ATCC N.° PTA-5817.
4. 4. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, onde o anticorpo é seleccionado entre o grupo consistindo de um scFv, um Fab e um (Fab')2·
5. 5. Composição farmacêutica compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável e o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. 6. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para utilização no tratamento ou prevenção de edema pulmonar.
7. 7. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para utilização no tratamento ou prevenção de lesão aguda do pulmão.
8. 8. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para a utilização da reivindicação 6, onde a utilização compreende adicionalmente a administração de um segundo agente terapêutico para tratamento ou prevenção de edema pulmonar.
9. 9. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 for para a utilização da reivindicação 7, onde a utilização compreende adicionalmente a administração de um segundo agente terapêutico para tratamento ou prevenção de lesão aguda do pulmão. ΕΡ 1 734 996/ΡΤ 2/2
10. 10. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para a utilização da reivindicação 8 ou 9, onde o segundo agente terapêutico é seleccionado entre o grupo consistindo de um inibidor do percurso de ΤΘΕβ, Proteína C activada, um esteróide, GM-CSF, um inibidor de plaquetas, um agente diurético, um agente broncodilatador, um anticorpo que se liga a integrina ανβ5, um anticorpo que se liga a β5, um segundo antagonista de integrina ανβ5, um antagonista de integrina ανβ6, um agonista β-2 e um tensioactivo.
11. 11. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para a utilização de qualquer uma das reivindicações 6 a 10, que é administrado intravenosamente, intranasalmente ou intrabronquialmente.
12. 12. Utilização do anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para o fabrico de um medicamento para tratamento de edema pulmonar.
13. 13. Utilização do anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para o fabrico de um medicamento para tratamento de lesão aguda do pulmão.
14. 14. Kit para tratamento ou prevenção de edema pulmonar, compreendendo o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e um segundo agente terapêutico para tratamento ou prevenção de edema pulmonar.
15. 15. Kit da reivindicação 14, onde o segundo agente terapêutico é seleccionado entre o grupo consistindo de um inibidor do percurso de ΤΘΓβ, Proteína C activada, um esteróide, GM-CSF, um inibidor de plaquetas, um agente diurético, um agente broncodilatador, um anticorpo que se liga a integrina ανβ5, um anticorpo que se liga a β5, um segundo antagonista de integrina ανβ5, um antagonista de integrina ανβ6, um agonista β-2 e um tensioactivo.
16. 16. Hibridoma depositado com o Depósito ATCC N.° PTA- 5817. Lisboa, 2013-07-11