CN105392801A - 使用抗αvβ5抗体治疗和预防急性肾损伤 - Google Patents

使用抗αvβ5抗体治疗和预防急性肾损伤 Download PDF

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Abstract

本发明公开了使用特异性结合αvβ5或β5的抗体和抗体片段来治疗或预防急性肾损伤和/或其后遗症的方法。

Description

使用抗αvβ5抗体治疗和预防急性肾损伤
相关申请
本申请要求于2013年3月15日提交的美国临时申请号61/792,681和于2013年11月1日提交的美国临时申请号61/898,811的优先权权益，这二者的内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明总体涉及使用结合αvβ5(αvβ5)整联蛋白的抗体或其抗原结合片段治疗或预防急性肾损伤。
发明背景
急性肾损伤(以前称为急性肾衰竭)是肾的严重炎症和损伤，其有时候导致完全的肾衰竭。急性肾损伤的特征是快速失去肾的***功能，并且通常通过氮代谢的终端产物(脲和肌酸酐)的累积或尿输出的减少或这二者来诊断。这是一些剧烈影响肾的疾病的临床表现。已经患有急性肾损伤的患者具有增加的发展出慢性肾病的风险。
急性肾损伤是住院患者常见的并且危重患者非常常见的症状。在西方世界中，医院获得性急性肾损伤影响了约二百万患者。因此，其造成了严重的问题，使住院治疗过程复杂化，并且意味着住院患者更差的临床结果。
急性肾损伤诊断的升高，部分地是由于群体的老龄化、在医院中暴露于肾毒性药物和感染的增加，以及手术干预的数量的增加。根据肾衰竭的严重程度，死亡率介于7％到高至80％的范围，平均死亡率为约35％。在欧洲、美国和日本，每年约700,000的死亡与该疾病有关。
因此，对可治疗或预防急性肾损伤及其后续的并发症的治疗剂存在巨大的需要。
发明概述
本公开描述了使用特异性结合αvβ5和/或β5的抗体及其抗原结合片段的方法，以及它们在治疗、预防或减轻急性肾损伤的症状或严重程度上的用途。
在一个方面中，本申请公开了用于治疗、预防或减轻有需要的人受试者中急性肾损伤的严重程度或其并发症的方法。所述方法涉及将有效量的特异性结合αvβ5整联蛋白的抗体或其抗原结合片段施用至人受试者。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与αvβ5整联蛋白的β5亚基特异性结合。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是αvβ5拮抗剂。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体竞争。在一些实施方案中，所述抗体与由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体竞争，其中所述抗体的效应功能被降低或消除。在其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段像由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体一样结合相同的表位。在某些实施方案中，所述抗体像由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体一样结合相同的表位，其中所述抗体的效应功能被降低或消除。在其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包含由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3。在其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体的人源化形式。在其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体的人源化形式，其中所述抗体的效应功能被降低或消除。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:3中所列的或具有两个或更少取代(即，2、1或0个取代)的SEQIDNO:3中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:4中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:4中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:21中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:21中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:24中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:24中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:22中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:22中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:25中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:25中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:23中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:23中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:26中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:26中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:27中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:27中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:3中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:3中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:4中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:4中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:21中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:21中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:24中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:24中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:22中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:22中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:25中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:25中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:23中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:23中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:26中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:26中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:27中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:27中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:3中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:4中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:21中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:24中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:22中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:25中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:23中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:26中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:27中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段除了包含以上段落中描述的VHCDR1、2和3外，还包含：VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:6中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段除了包含以上段落中描述的VHCDR1、2和3外，还包含：VLCDR1，其包含SEQIDNO:28中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:28中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:29中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:29中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:30中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:30中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:3中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:3的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:4中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:4的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:5的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:6的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:21中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:21的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:24中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:24的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:5的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:6的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:22中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:22的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:25中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:25的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:5的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:6的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:23中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:23的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:26中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:26的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:27中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:27的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:28中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:28的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:29中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:29中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:30中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:30中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:3中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:3的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:4中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:4的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:5的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:6的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:21中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:21的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:24中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:24的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:5的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:6的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:22中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:22的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:25中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:25的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:5的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:6的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:23中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:23的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:26中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:26的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:27中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:27的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:28中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:28的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:29中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:29中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:30中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:30中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。
在其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:3中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:4中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:21中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:24中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:22中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:25中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:23中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:26中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:27中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:28中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:29中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:30中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。
在一些实施方案中，经静脉内、经皮下或经动脉内施用所述抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述人受试者已经基于急性肾损伤网络(AcuteKidneyInjuryNetwork，AKIN)标准或危险/损伤/衰竭/丧失/ESRD(RIFLE)标准被鉴定为患有急性肾损伤。
在另一个实施方案中，与健康对照受试者相比，所述人受试者已经被鉴定为具有升高的血清肌酸酐、血浆肌酸酐、尿肌酸酐或血脲氮(BUN)水平。
在另一个实施方案中，与健康对照受试者相比，所述人受试者已经被鉴定为具有升高的血清或尿嗜中性粒细胞明胶酶相关的载脂蛋白、血清或尿白细胞介素-18、血清或尿半胱氨酸蛋白酶抑制剂C或尿KIM-1水平。
在一些实施方案中，所述急性肾损伤是缺血性急性肾损伤。在一个实施方案中，所述人受试者已经被鉴定为具有降低的有效动脉容积。在一个实施方案中，所述人受试者已经被鉴定为患有血管内容积减小(例如，由出血、胃肠损失、肾损失、皮肤和粘膜损伤、肾病综合征、硬变或毛细管泄漏所致)。在一个实施方案中，所述人受试者已经被鉴定为具有降低心输出量(例如，由心原性休克、心包疾病、充血性心力衰竭、瓣膜性心脏病、肺病或败血症所致)。在一个实施方案中，所述人受试者已经被鉴定为具有全身性血管扩张(例如，由硬变、过敏或败血症引起)。在一个实施方案中，所述人受试者已经被鉴定为具有肾血管收缩(例如，由早期败血症、肝肾综合征、急性高钙血症、药物或放射性造影剂引起)。
在一些实施方案中，所述急性肾损伤是肾毒性急性肾损伤。在一个实施方案中，所述人受试者已经暴露于肾毒素。例如，所述肾毒素可为选自由以下组成的组的肾毒性药物：抗生素(例如，氨基糖苷)、化疗剂(例如，顺铂)、钙调磷酸酶抑制剂、两性霉素B和放射照相造影剂。在另一例子中，所述肾毒素可为违禁药物或重金属。
在某些实施方案中，所述人受试者已经历创伤性损伤或挤压性损伤。
在某些实施方案中，所述人受试者已经历器官移植手术(例如，肾移植手术或心脏移植手术)。
在某些实施方案中，所述人受试者已经历伴有灌注不足的手术。
在某些实施方案中，所述人受试者已经历心胸手术或血管手术。
在某些实施方案中，所述人受试者服用了干扰膀胱正常排空的药剂(例如，抗胆碱能药)。
在某些实施方案中，所述人受试者患有良性的***肥大或癌症(例如，***癌、卵巢癌或结直肠癌)。
在某些实施方案中，所述人受试者患有肾结石。
在某些实施方案中，所述人受试者患有输尿管堵塞。
在某些实施方案中，所述人受试者已服用引起或导致晶尿症的药物、引起或导致肌红蛋白尿症的药物或者引起或导致膀胱炎的药物。
在一些实施方案中，所述人受试者施用选自由以下组成的组的第二治疗剂：αvβ5整联蛋白抑制剂、αvβ6整联蛋白抑制剂、CXCR4拮抗剂、IL-6抑制剂、IL-1α抑制剂、IL-12抑制剂、MIP-1-α抑制剂、AP214、THR-184、QPI-1002、人碱性磷酸酶、抗凋亡剂、抗坏死剂、消炎剂、抗败血症剂、生长因子、血管扩张剂、自由基清除剂、嗜中性粒细胞明胶酶相关的载脂蛋白、C5a受体拮抗剂和α-黑素细胞刺激性激素。
在另一方面中，本申请公开了一种用于在人受试者中保护肾免受损伤的方法。所述方法涉及将有效量的特异性结合αvβ5整联蛋白的抗体或其抗原结合片段施用至人受试者。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与αvβ5整联蛋白的β5亚基特异性结合。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是αvβ5拮抗剂。在某些实施方案中，所述损伤是针对肾的上皮的。在某些实施方案中，所述损伤是肾小管上皮损伤。在一些实施方案中，所述人受试者已经或将暴露于缺血性损伤或肾毒性损伤。在一些实施方案中，所述人受试者已经暴露于氧化性损伤(例如，由例如反应性氧或氮物质等自由基导致)。
在另一方面中，本申请公开了一种用于治疗患有肾损伤的人受试者的方法。所述方法涉及将有效量的特异性结合αvβ5整联蛋白的抗体或其抗原结合片段施用至人受试者。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与αvβ5整联蛋白的β5亚基特异性结合。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是αvβ5拮抗剂。在某些实施方案中，所述损伤是针对肾的上皮的。在某些实施方案中，所述损伤是肾小管上皮损伤。在一些实施方案中，所述人受试者已经或将暴露于缺血性损伤或肾毒性损伤。在一些实施方案中，所述人受试者已经暴露于氧化性损伤(例如，由例如反应性氧或氮物质等自由基导致)。
在另一个方面中，本申请公开了一种用于提高人受试者中的尿流的方法。所述方法涉及将有效量的特异性结合αvβ5整联蛋白的抗体或其抗原结合片段施用至人受试者。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与αvβ5整联蛋白的β5亚基特异性结合。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是αvβ5拮抗剂。
在另一方面中，本申请公开了一种用于保护人受试者在移植期间免受急性肾损伤的方法。所述方法涉及在所述肾移植之前或同时将有效量的特异性结合αvβ5整联蛋白的抗体或其抗原结合片段施用至人受试者。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与αvβ5整联蛋白的β5亚基特异性结合。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是αvβ5拮抗剂。在某些实施方案中，所述方法还包括在所述肾移植后(例如，0.1小时、0.2小时、0.3小时、0.4小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、168小时或1周、2周、3周或1月)，将一剂或多剂的特异性结合所述αvβ5整联蛋白的抗体或其抗原结合片段施用至所述人受试者。
在以上方面的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体竞争。在一些实施方案中，所述抗体与由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体竞争，其中所述抗体的效应功能被降低或消除。在其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段像由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体一样结合相同的表位。在某些实施方案中，所述抗体像由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体一样结合相同的表位，其中所述抗体的效应功能被降低或消除。在其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包含由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3。在其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体的人源化形式。在其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体的人源化形式，其中所述抗体的效应功能被降低或消除。
在以上方面的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:3中所列的或具有两个或更少取代(即，2个、1个或0个取代)的SEQIDNO:3中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:4中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:4中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:21中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:21中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:24中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:24中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:22中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:22中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:25中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:25中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:23中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:23中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:26中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:26中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:27中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:27中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:3中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:3中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:4中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:4中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:21中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:21中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:24中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:24中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:22中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:22中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:25中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:25中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:23中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:23中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:26中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:26中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:27中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:27中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:3中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:4中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:21中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:24中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:22中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:25中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:23中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:26中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:27中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。
在以上方面的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段除了包含以上段落中描述的VHCDR1、2和3外，还包含：VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:6中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。在某些其它实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段除了包含以上段落中描述的VHCDR1、2和3外，还包含：VLCDR1，其包含SEQIDNO:28中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:28中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:29中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:29中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:30中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:30中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成。
在以上方面的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:3中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:3的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:4中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:4的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:5的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:6的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:21中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:21的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:24中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:24的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:5的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:6的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:22中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:22的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:25中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:25的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:5的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:6的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:23中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:23的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:26中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:26的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:27中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:27的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:28中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:28的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:29中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:29中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:30中所列的或具有两个或更少取代的SEQIDNO:30中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。
在以上方面的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:3中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:3的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:4中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:4的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:5的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:6的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:21中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:21的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:24中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:24的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:5的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:6的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:22中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:22的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:25中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:25的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:5的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:6的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:23中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:23的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:26中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:26的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:27中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:27的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:28中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:28的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:29中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:29中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:30中所列的或具有一个取代的SEQIDNO:30中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。
在以上方面的一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:3中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:4中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:21中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:24中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:22中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:25中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:5中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:6中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:7中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:8中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体，其包含：VHCDR1，其包含SEQIDNO:23中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR2，其包含SEQIDNO:26中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VHCDR3，其包含SEQIDNO:27中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR1，其包含SEQIDNO:28中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；VLCDR2，其包含SEQIDNO:29中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成；以及VLCDR3，其包含SEQIDNO:30中所列的氨基酸序列，或由所述序列组成，其中所述人源化抗体的效应功能被降低或消除。
在一些实施方案中，经静脉内、经皮下或经动脉内施用所述抗体或其抗原结合片段。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语都具有与由本发明所属领域的技术人员所通常理解相同的含义。虽然在实施或测试本发明中可使用与本文描述的方法和材料相似或相同的方法和材料，但是下文描述了示例性的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它文献都通过引用以其整体并入。在相矛盾的情况下，以本申请包括定义为准。这些材料、方法和例子仅仅是举例说明性的，而非意图限制。
本发明的另一些特征、目的和优点将从以下详细描述和权利要求书中变得显而易见。
发明详述
本公开至少部分地基于这样的发现，即，结合αvβ5整联蛋白的抗体可用于治疗急性肾损伤。特别地，在急性肾损伤动物模型中，发现特异性结合αvβ5整联蛋白的抗体降低血清肌酸酐水平，这是肾健康的重要指标，通常用于确定受试者是否患有急性肾损伤，或是否处于发展成急性肾损伤的风险中。因此，本公开描述了通过施用特异性结合αvβ5整联蛋白或该整联蛋白的β5亚基的抗体或其抗原结合片段来治疗或预防急性肾损伤的方法。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是αvβ5拮抗剂(即，其与针对αvβ5整联蛋白上的可用结合位点的αvβ5配体竞争)。
整联蛋白是结合细胞外基质蛋白并且介导细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用以及细胞-病原体相互作用的细胞表面糖蛋白受体。这些受体由非共价缔合的α链和β链构成，其组合以得到具有不同细胞特异性和粘附特异性的多种异二聚体蛋白质。这些蛋白质可与细胞表面配体、跨膜蛋白、可溶蛋白酶、病原体和生长因子相互作用。整联蛋白缺陷后的病理学后遗症以及整联蛋白亚基敲除动物常常的严重表型凸显了这些受体在生物学过程中的重要性。
αvβ5整联蛋白是包含β5亚基的唯一整联蛋白。αvβ5识别RGD肽序列，并且结合玻连蛋白(Hynes,Cell,69:11-25(1992))。αvβ5还可结合纤连蛋白、骨桥蛋白、生腱蛋白c和腺病毒五邻体c基底。αvβ5可通过需要完整的细胞骨架以及细胞收缩的机制来活化TGF-β。αv和β5二者都已经被测序和表征(分别为Hynes,1992，见上文和美国专利No.5,527,679)。
β5
人β5蛋白的氨基酸序列(登记号NP_002204.2)示出如下：
MPRAPAPLYACLLGLCALLPRLAGLNICTSGSATSCEECLLIHPKCAWCSKEDFGSPRSI
TSRCDLRANLVKNGCGGEIESPASSHVLRSLPLSSKGSGSAGWDVIQMTPQEIAVNLRP
GDKTTFQLQVRQVEDYPVDLYYLMDLSLSMKDDLDNIRSLGTKLAEEMRKLTSNFRLGFG
SFVDKDISPFSYTAPRYQTNPCIGYKLFPNCVPSFGFRHLLPLTDRVDSFNEEVRKQRVS
RNRDAPEGGFDAVLQAAVCKEKIGWRKDALHLLVFTTDDVPHIALDGKLGGLVQPHDGQC
HLNEANEYTASNQMDYPSLALLGEKLAENNINLIFAVTKNHYMLYKNFTALIPGTTVEIL
DGDSKNIIQLIINAYNSIRSKVELSVWDQPEDLNLFFTATCQDGVSYPGQRKCEGLKIGD
TASFEVSLEARSCPSRHTEHVFALRPVGFRDSLEVGVTYNCTCGCSVGLEPNSARCNGSG
TYYCGLCECSPGYLGTRCECQDGENQSVYQNLCREAEGKPLCSGRGDCSCNQCSCFESEF
GKIYGPFCECDNFSCARNKGVLCSGGGECHCGECKCHAGYIGDNCNCSTDISTCRGRDGQ
ICSERGHCLCGQCQCTEPGAFGEMCEKCPTCPDACSTKRDCVECLLLHSGKPDNQTCHSL
CRDEVTTWVDTIVKDDQEAVLCFYKTAKDCVMMFTYVELPSGKSNLTVLREPECGNTPNA
MTILLAVVGSILLVGLALLAIWKLLVTIHDRREFAKFQSERSRARYEMASNPLYRKPIST
HTVDFTFNKFNKSYNGTVD(SEQIDNO：1)
鼠科β5蛋白的氨基酸序列(登记号NP_001139356.1)示出如下：
MPRVPATLYACLLGLCALVPRLAGLNICTSGSATSCEECLLIHPKCAWCSKEYFGNPRSI
TSRCDLKANLIRNGCEGEIESPASSTHVLRNLPLSSKGSSATGSDVIQMTPQEIAVSLRP
GEQTTFQLQVRQVEDYPVDLYYLMDLSLSMKDDLENIRSLGTKLAEEMRKLTSNFRLGFG
SFVDKDISPFSYTAPRYQTNPCIGYKLFPPNCVPSFGFRHLLPLTDRVDSFNEEVRKQRVS
RNRDAPEGGFDAVLQAAVCKEKIGWRKDALHLLVFTTDDVPHIALDGKLGGLVQPHDGQC
HLNEANEYTASNQMDYPSLALLGEKLAENNINLIFAVTKNHYMLYKNFTALIPGTTVEIL
HGDSKNIIQLIINAYSSIRAKVELSVWDQPEDLNLFFTATCQDGISYPGQRKCEGLKIGD
TASFEVSVEARSCPGRQAAQSFTLRPVGFRDSLQVEVAYNCTCGCSTGLEPNSARCSGNG
TYTCGLCECDPGYLGTRCECQEGENQSGYQNLCREAEGKPLCSGRGECSCNQCSCFESEF
GRIYGPFCECDSFSCARNKGVLCSGHGECHCGECKCHAGYIGDNCNCSTDVSTCRAKDGQ
ICSDRGRCVCGQCQCTEPGAFGETCEKCPTCPDACSSKRDCVECLLLHQGKPDNQTCHHQ
CKDEVITWVKTIVKDDQEAVLCFYKTAKDCVMMFSYTELPNGRSNLTVLREPECGSAPNA
MTILLAVVGSILLIGMALLAIWKLLVTIHDRREFAKFQSERSRARYEMASNPLYRKPIST
HTVDFAFNKFNKSYNGSVD(SEQIDNO：2)
抗αvβ5抗体
本公开涵盖了特异性结合αvβ5整联蛋白和/或所述整联蛋白的β5亚基的抗体或其抗原结合片段用于治疗或预防急性肾损伤的用途。在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与针对αvβ5整联蛋白上的可用配体结合位点的αvβ5配体竞争。在一些实施方案中，所述抗体是由2004年2月13日以登记号PTA-5817保藏于ATCC的杂交瘤产生的鼠科ALULA抗体的人源化形式。
所述鼠科ALULA抗体的重链可变区(VH)氨基酸序列的氨基酸序列提供如下：
EVQVQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIYPGN
SDTSYNQKFKGKAKLTAVTSPNTAYMELSSLTNEDSAVYYCTTTTYGYDWFAYWG
QGTLVTVSA(SEQIDNO：9)
编码所述鼠科ALULA抗体的VH核酸的核酸序列提供如下：
GAGGTTCAGGTCCAGCAGTCTGGGACTGTGCTGGCAAGGCCTGGGGCTTCAGTG
AAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCAGCTACTGGATGCACTGGG
TAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGCGCTATTTATCCTGGAA
ATAGTGATACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCAAACTGACTGCAG
TCACATCCCCCAACACTGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACAAATGAGGACT
CTGCGGTCTATTACTGTACAACCACTACATATGGTTACGACTGGTTTGCTTACTGG
GGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQIDNO：10)
所述鼠科ALULA抗体的轻链可变区(VL)氨基酸序列的氨基酸序列提供如下：
NIMMTQSPSSLTVSAGEKVTMSCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYW
ASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSSLTFGAGTKLELK
(SEQIDNO：11)
编码所述鼠科ALULAVL核酸序列的核酸序列提供如下：
AACATTATGATGACACAGTCGCCATCATCTCTGACTGTGTCTGCAGGAGAAAAGG
TCACTATGAGCTGTAAGTCCAGTCAAAGTGTTTTATACAGTTCAAATCAGAAGAA
CTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTAC
TGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATGGCTTCACAGGCAGTGGATCTG
GGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTA
TTACTGTCATCAATACCTCTCCTCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAG
CTGAAA(SEQIDNO：12)
ALULA的重链可变区和轻链可变区的互补决定区(CDR)1、2和3的氨基酸序列提供如下。所述CDR基于Kabat编号***。
结构域 SEQ ID NO 序列
VH CDR1 3 SYWMH
VH CDR2 4 AIYPGNSDTSYNQKFKG
VH CDR3 5 TTYGYDWFAY
VL CDR1 6 KSSQSVLYSSNQKNYLA
VL CDR2 7 WASTRES
VL CDR3 8 HQYLSSLT
本申请还公开了可用于本发明的抗体的ALULA的“替代的CDR”。“替代的”CDR是指根据AbYsis的Chothia、增强Chothia/AbMCDR或接触定义的任一个来定义的CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。这些替代的CDR可例如通过使用AbYsis数据库(www.bioinf.org.uk/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)来得到。在下表中，将ALULA的重链可变区和轻链可变区的“替代的”CDR1、2和3氨基酸序列与根据Kabat定义的CDR进行比较。
在某些实施方案中，所述抗αvβ5(或抗β5)抗体或其抗原结合片段是人源化的。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化的ALULA。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQIDNO:9所列的氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，这样的特异性结合αvβ5(或β5亚基)的抗体或抗原结合片段，抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用；抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用；和/或抑制TGF-β活化。在某些实施方案中，抗αvβ5(或抗β5)抗体或其抗原结合片段还包含与SEQIDNO:11所列的氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区二者，所述特异性结合αvβ5(或β5亚基)的抗体或抗原结合片段，抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用；抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用；和/或抑制TGF-β的活化。
在一些实施方案中，所述抗αvβ5(或抗β5)抗体或其抗原结合片段包含ALULA的VH的CDR1(SEQIDNO:3)、CDR2(SEQIDNO:4)和CDR3(SEQIDNO:5)中的一个或多个、两个，或者所有三个。在一些实施方案中，这样的特异性结合αvβ5(或β5亚基)的抗体或抗原结合片段，抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用；抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用；和/或抑制TGF-β活化。在某些实施方案中，所述抗αvβ5(或抗β5)抗体或其抗原结合片段还包含ALULA的VL的CDR1(SEQIDNO:6)、CDR2(SEQIDNO:7)和CDR3(SEQIDNO:8)中的一个或多个、两个，或者所有三个。在一些实施方案中，这样的特异性结合αvβ5(或β5亚基)的抗体或抗原结合片段，抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用；抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用；和/或抑制TGF-β活化。在一个具体实施方案中，所述抗αvβ5(或抗β5)抗体或其抗原结合片段包含ALULA的VH的CDR1(SEQIDNO:3)、CDR2(SEQIDNO:4)、和CDR3(SEQIDNO:5)，以及ALULA的VL的CDR1(SEQIDNO:6)、CDR2(SEQIDNO:7)和CDR3(SEQIDNO:8)。在另一个实施方案中，所述抗αvβ5(或抗β5)抗体或其抗原结合片段包含具有两个或更少取代的ALULA的VHCDR1(SEQIDNO:3)、具有两个或更少取代的ALULA的VHCDR2(SEQIDNO:4)，以及具有两个或更少取代的ALULA的VHCDR3(SEQIDNO:5)。在另一个实施方案中，所述抗αvβ5(或抗β5)抗体或其抗原结合片段包含具有两个或更少取代的ALULA的VLCDR1(SEQIDNO:6)、具有两个或更少取代的ALULA的VLCDR2(SEQIDNO:7)，以及具有两个或更少取代的ALULA的VLCDR3(SEQIDNO:8)。在一些实施方案中，这样的特异性结合αvβ5(或β5亚基)的抗体或抗原结合片段，抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用；抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用；和/或抑制TGF-β活化。
在一些实施方案中，所述抗αvβ5(或抗β5)抗体或其抗原结合片段包含ALULA的VH的替代的CDR1(SEQIDNO:21、22或23)、替代的CDR2(SEQIDNO:24、25或26)和替代的CDR3(SEQIDNO:5或27)中的一个或多个、两个，或者所有三个。在一些实施方案中，这样的特异性结合αvβ5(或β5亚基)的抗体或抗原结合片段，抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用；抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用；和/或抑制TGF-β活化。在某些实施方案中，所述抗αvβ5(或抗β5)抗体或其抗原结合片段还包含ALULA的VL的替代的CDR1(SEQIDNO:6或28)、替代的CDR2(SEQIDNO:7或29)和替代的CDR3(SEQIDNO:8或30)中的一个或多个、两个，或者所有三个。在一些实施方案中，这样的特异性结合αvβ5(或β5亚基)的抗体或抗原结合片段，抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用；抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用；和/或抑制TGF-β活化。在一个实施方案中，所述抗αvβ5(或抗β5)抗体或其抗原结合片段包含ALULA的VH的替代的CDR1(SEQIDNO:21)、替代的CDR2(SEQIDNO:24)、和替代的CDR3(SEQIDNO:5)，以及ALULA的VL的替代的CDR1(SEQIDNO:6)、替代的CDR2(SEQIDNO:7)和替代的CDR3(SEQIDNO:8)。在另一个实施方案中，所述抗αvβ5(或抗β5)抗体或其抗原结合片段包含ALULA的VH的替代的CDR1(SEQIDNO:22)、替代的CDR2(SEQIDNO:25)、和替代的CDR3(SEQIDNO:5)，和/或ALULA的VL的替代的CDR1(SEQIDNO:6)、替代的CDR2(SEQIDNO:7)和替代的CDR3(SEQIDNO:8)。在另一个实施方案中，所述抗αvβ5(或抗β5)抗体或其抗原结合片段包含ALULA的VH的替代的CDR1(SEQIDNO:23)、替代的CDR2(SEQIDNO:26)、和替代的CDR3(SEQIDNO:27)，和/或ALULA的VL的替代的CDR1(SEQIDNO:28)、替代的CDR2(SEQIDNO:29)和替代的CDR3(SEQIDNO:30)。在另一个实施方案中，所述抗αvβ5(或抗β5)抗体或其抗原结合片段包含具有两个或更少取代(例如，2个、1个或没有)的ALULA的VH的替代的CDR1(SEQIDNO:21、22或23)、具有两个或更少取代的ALULA的VH的替代的CDR2(SEQIDNO:24、25或26)，以及具有两个或更少取代的ALULA的VH的替代的CDR3(SEQIDNO:5或27)。在另一个实施方案中，所述抗αvβ5(或抗β5)抗体或其抗原结合片段包含具有两个或更少取代的ALULA的VL的替代的CDR1(SEQIDNO:6或28)、具有两个或更少取代的ALULA的VL的替代的CDR2(SEQIDNO:7或29)，以及具有两个或更少取代的ALULA的VL的替代的CDR3(SEQIDNO:8或30)。在一些实施方案中，这样的特异性结合αvβ5(或β5亚基)的抗体或抗原结合片段，抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用；抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用；和/或抑制TGF-β活化。
本公开还包括特异性结合αvβ5和/或β5的抗体，所述抗体具有ALULA的框架区中的一个、两个、三个或所有四个中的六个或更少(例如，六个、五个、四个、三个或更少、三个、两个或更少、两个或一个)氨基酸取代，和/或重链可变区中的一个、两个或所有三个CDR(或替代的CDR)中的四个或更少(例如，四个、三个或更少、两个或更少或一个)氨基酸取代。本申请还包括这样的抗体，即，其具有ALULA的框架区中的一个、两个、三个或所有四个中的六个或更少(例如，六个、五个、四个、三个或更少、三个、两个或更少、两个或一个)氨基酸取代，和/或轻链可变区中的一个、两个或所有三个CDR(或替代的CDR)中的四个或更少(例如，四个、三个、两个或更少、两个或一个)氨基酸取代。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。在一些实施方案中，这样的特异性结合αvβ5(或β5亚基)的抗体或抗原结合片段，抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用；抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用；和/或抑制TGF-β活化。
本公开还涵盖了与特异性结合αvβ5整联蛋白和/或所述整联蛋白的β5亚基的抗体竞争的任何抗体或其抗原结合片段(例如，ALULA或ALULA的人源化形式)用于治疗或预防急性肾损伤或本文描述的任何其它适应症的用途。
在某些实施方案中，可将VH和/或VL区连接至恒定区(例如，野生型人Fc区或包含一个或多个改变的Fc区)。在某些实施方案中，所述恒定区包含CH1结构域和铰链区。在一些实施方案中，所述恒定区包含CH3结构域。在一些实施方案中，所述抗体具有衍生自人κ序列或λ序列的恒定区。在一个具体实施方案中，所述恒定区包含人亚组κ2序列。所述恒定区可为人Fc区，例如，野生型Fc区，或包含一个或多个氨基酸取代的Fc区。所述恒定区可具有修饰所述抗体的性质的取代(例如，提高或降低以下中的一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数量、效应细胞功能或补体功能)。例如，人IgG1恒定区可在一个或多个残基234和237(基于Kabat编号)中的一个或多个处发生突变。抗体可具有重链的CH2区中的降低或改变效应功能的突变，所述效应功能例如Fc受体结合和补体活化。例如，抗体可具有例如美国专利No.5,624,821和5,648,260中描述的那些突变。抗体还可具有稳定免疫球蛋白的两个重链之间的二硫键的突变，例如，如本领域中公开的IgG4铰链区中的突变(例如，Angal等,Mol.Immunol.,30:105-08(1993))。还参见例如，U.S.2005-0037000。在某些实施方案中，所述抗体具有选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的组的亚型。
在某些实施方案中，可将所述抗体或其抗原结合片段缀合至可用于治疗或预防急性肾损伤或本文描述的任何其它适应症的一种或多种试剂。这些试剂可为例如，microRNA、microRNA模拟物、小干扰RNA、拮抗剂、反义核酸、核酶、小分子化合物和其它化学部分。这样的抗体或抗原结合片段可用于例如将所结合试剂递送至表达αvβ5的感兴趣的细胞或组织。在某些实施方案中，可将所述抗体或其抗原结合片段缀合至需要选择性递送至表达αvβ5的细胞(例如，以降低或预防所缀合的药物的毒性；降低副作用)的药物。
基于改进的效价、对αvβ5更高的亲和力或亲合力和/或比以前已知的αvβ5抗体降低的免疫原性来选择抗体使用。确定效价、亲和力或亲合力以及抗体的免疫原性的方法是在本领域技术人员知识内的。
得到抗αvβ5抗体的方法
许多方法可用于得到抗体，特别是人抗体。一个示例性的方法包括筛选蛋白表达文库，例如，噬菌体或核糖体展示文库。噬菌体展示在例如U.S.5,223,409；Smith,Science228:1315-1317(1985)；WO92/18619；WO91/17271；WO92/20791；WO92/15679；WO93/01288；WO92/01047；WO92/09690；和WO90/02809中有描述。Fab在噬菌体上的展示在例如美国专利No.5,658,727；5,667,988；和5,885,793中有描述。
除了使用展示文库外，还可使用其它方法来得到αvβ5结合抗体。例如，可使用β5蛋白或其肽作为非人动物(例如，啮齿类，例如小鼠、仓鼠或大鼠中)的抗原。此外，可将用编码β5的cDNA转染的细胞注入非人动物中，作为产生有效结合细胞表面αvβ5蛋白的抗体的方法。
在一个实施方案中，所述非人动物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可用人Ig位点工程化在小鼠抗体产生方面有缺陷的小鼠株系。使用杂交瘤技术，可产生并选择衍生自具有期望特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见例如，XENOMOUSETM,Green等,NatureGenetics7:13-21(1994)、U.S.2003-0070185、WO96/34096和WO96/33735。
在另一个实施方案中，从非人动物得到单克隆抗体，然后进行修饰，例如，人源化或去免疫化。Winter描述一种示例性的CDR接枝方法，其可用于制备本文描述的人源化抗体(U.S.5,225,539)。可用非人抗体的至少一部分来置换特定的人抗体的全部或一些CDR。可仅有必要置换结合所需的CDR或这样的CDR的结合决定区，从而实现结合αvβ5的有用的人源化抗体。
人源化抗体可通过用来自人Fv可变区的等价序列置换不直接涉及抗原结合的Fv可变区的序列来生成。以下文献中提供了用于生成人源化抗体一般方法：Morrison,S.L.,Science,229:1202-1207(1985)；Oi等,BioTechniques,4:214(1986)；以及US5,585,089；US5,693,761；US5,693,762；US5,859,205；和US6,407,213。这些方法包括分离、操作和表达编码重链或轻链中的至少一个的全部或部分免疫球蛋白Fv可变区的核酸序列。这样的核酸的来源是本领域技术人员已知的，并且如上文所述，例如，可从产生针对预定靶标的抗体的杂交瘤得到，从种系免疫球蛋白基因或从合成的构建体得到。然后可将编码人源化抗体的重组DNA克隆至合适的表达载体中。
人种系序列例如在以下文献中有公开：Tomlinson,I.A.等,J.Mol.Biol.,227:776-798(1992)；Cook,G.P.等,Immunol.Today,16:237-242(1995)；Chothia,D.等,J.Mol.Bio.227:799-817(1992)；以及Tomlinson等,EMBOJ.,14:4628-4638(1995)。VBASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的全面目录(由Tomlinson,I.A.等MRCCentreforProteinEngineering,Cambridge,UK编辑)。可使用这些序列作为人序列来源，例如，用于框架区和CDR。还个使用共有的人框架区，例如，如美国专利No.6,300,064中描述的。
还可通过WO98/52976和WO00/34317中公开的方法特定删除人T细胞表位或“去免疫化”来修饰非人αvβ5结合抗体。简略而言，可针对结合II型MHC的肽来分析抗体的重链可变区和轻链可变区；这些肽表示潜在的T细胞表位(如在WO98/52976和WO00/34317中定义的)。为了检测潜在的T细胞表位，可应用一种计算机造模方法，称为“肽穿线”，并且此外，可在人II型MHC数据库中搜索VH和VL序列中存在的基序，如在WO98/52976和WO00/34317中描述的。这些基序结合18种主要的II型MHCDR同种异型中的任意种，并从而构成潜在的T细胞表位。可通过取代可变区中的少量氨基酸残基或优选通过单一的氨基酸取代来消除所检测到的潜在的T细胞表位。尽量进行保守取代。常常，但并不是排除性地，可使用人种系抗体序列位置共有的氨基酸。在鉴定去免疫化的变化后，可通过诱变或其它合成方法(例如，从头合成、盒置换等)来构建编码VH和VL的核酸。可将经诱变的可变序列任选地与人恒定区例如人IgG1或κ恒定区融合。
在一些情况下，潜在的T细胞表位将包括已知或预测为对抗体功能重要的残基。例如，潜在的T细胞表位通常偏向于CDR。此外，潜在的T细胞表位可存在于对抗体结构和结合重要的框架残基中。在一些情况下，消除这些潜在表位的变化将需要更详细的审查，例如，通过制备并测试具有和没有该变化的链来进行。在可行的情况下，可通过CDR外的取代来消除与CDR重合的潜在的T细胞表位。在一些情况下，对CDR的改变是唯一选择，并且因此，可测试具有和没有这些取代的变体。在其它情况下，去除潜在的T细胞表位的取代处于框架区内的残基位置，其可能对抗体结合至关重要。在这些情况下，测试具有和没有该取代的变体。因此，在一些情况下，设计了去免疫化重链可变区和轻链可变区的一些变体，并且测试了多个重链/轻链组合以鉴定最优的去免疫化抗体。然后，可通过结合去免疫化范围，特别是，可变区中剩余的潜在的T细胞表位的数量，考虑不同的变体的结合亲和力，来做出最终去免疫化的抗体的选择。可使用去免疫化来修饰任何抗体，例如，包括非人序列的抗体，例如，合成抗体、鼠科抗体、其它非人单克隆抗体或从展示文库分离的抗体。
还可使用其它用于人源化抗体的方法。例如，其它方法可描述抗体的三维结构、三维结构中结合决定区附近的框架位置以及免疫原性的肽序列。参见例如，WO90/07861；美国专利No.5,693,762；5,693,761；5,585,089；5,530,101；和6,407,213；Tempest等(1991)Biotechnology9:266-271。还有一种方法称为“人源化改造”，并且在例如U.S.2005-008625中有描述。
可例如通过制备并表达编码所列的氨基酸序列的基因来制成抗体，例如上文所述的抗体。生成任何所述抗αvβ5抗体的变体(例如，包含氨基酸取代)的方法是本领域公知的。这些方法包括但不限于，通过定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变和盒诱变来制备编码所述抗体或其任何部分(例如，框架区、CDR、恒定区)的制备的DNA分子。定点诱变是本领域公知(参见例如，Carter等,Nucl.AcidsRes.,13:4431-4443(1985)；以及Kunkel等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488(1987))。PCR诱变还适于制造起始多肽的氨基酸序列变体。参见Higuchi,于PCRProtocols,pp.177-183(AcademicPress,1990)；以及Vallette等,Nucl.AcidsRes.17:723-733(1989)。用于制备序列变体的另一种方法是盒诱变，其基于Wells等Gene,34:315-323(1985)描述的技术。
亲和力成熟
在一个实施方案中，修饰本文描述的抗αvβ5抗体或其抗原结合片段，例如通过诱变来进行，以提供经修饰的抗体的集合。然后，评价所述经修饰的抗体以鉴定一种或多种具有改变的功能性质的抗体(例如，改进的结合、提高的稳定性、降低的抗原性或提高的体内稳定性)。在一种实施方式中，使用展示文库技术来选择或筛选所述经修饰的抗体集合。然后从第二文库鉴定亲和力更高的抗体，例如，通过使用更严格或更具竞争性的结合和洗涤条件来进行。还可使用其它筛选技术。
在一些实施方式中，所述诱变靶向已知或很可能处于结合界面的区域。如果，例如，所鉴定的结合蛋白是抗体，则可针对本文描述的重链或轻链的CDR区(或改变CDR区)进行诱变。此外，还可针对CDR附近或傍边的框架区(例如，框架区，特别是CDR(或替代的CDR)连接的10个、5个或3个氨基酸内)进行诱变。在抗体的情况下，还可将诱变限制于一个或一些CDR(或替代的CDR)，例如，以制造逐步的改进。
在一个实施方案中，使用诱变来制造与一个或多个种系序列更相似的抗体。一种示例性的制种方法可包括：鉴定一个或多个与分离的抗体的序列相似(例如，在特定的数据库中最相似)的种系序列。然后，可在分离的抗体中制造突变(氨基酸水平)，进行逐步突变、组合突变或二者。例如，制造包括编码一些或所有种系突变的序列的核酸文库。然后，评价所述经突变的抗体，例如，以鉴定相对于所分离的抗体具有一个或多个额外的种系残基并且仍然可用(例如，具有功能活性)的抗体。在一个实施方案中，尽可能多地将种系残基引入分离的抗体中。
在一个实施方案中，使用诱变来取代CDR(或替代的CDR)区中的一个或多个种系残基，或将一个或多个种系残基***其中。例如，种系CDR(或替代的CDR)残基可来自与将被修饰的可变区相似(例如，最相似)的种系序列。在诱变后，可评价所述抗体的活性(例如，结合或其它功能活性)，以确定所述种系残基被容纳。可在框架区中进行类似的诱变。
可通过不同的方式执行选择种系序列。例如，如果其满足预定的选择性或相似性标准，即可将其选择为种系序列，例如，相对于供体非人抗体至少一定的百分率同一性，例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的同一性。可使用至少2个、3个、5个或10个种系序列来进行该选择。在CDR1和CDR2的情况下，鉴定相似的种系序列可包括选择一个这样的序列。在CDR3的情况下，鉴定相似的种系序列可包括选择一个这样的序列，但是可包括使用两个分别对氨基端部分和羧基端部分有贡献的种系序列。在另一些实施方式中，使用多于一个或两个种系序列，例如，以形成共有序列。
两个序列之间的“序列同一性”的计算按如下进行。为了最优比对目的，将这些序列对齐(例如，可在第一和第二氨基酸序列或核酸序列中引入缺口以进行最优对齐，并且可为了比对的目的忽略非同源序列)。最优对齐被确定为使用GCG软件包中的GAP程序，用Blossum62评分矩阵的最高分，其中缺口罚分12，缺口延伸罚分4，并且移码缺口罚分5。然后，在相应的氨基酸位置或核苷酸位置比较氨基酸残基或核苷酸。当第一序列的一个位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则这两个分子在该位置是同一的。两个序列之间的百分率同一性是这两个序列共享的相同位置的数量的函数。
在其它实施方案中，可将所述抗体修饰成具有改变的糖基化模式(即，从初始的或天然的糖基化模式改变)。如在该上下文中所用，“改变的”意为具有一个或多个碳水化合物部分的缺失，和/或具有添加至初始抗体的一个或多个糖基化位点。将糖基化位点添加至本发明公开的抗体可通过改变氨基酸序列以包含糖基化位点共有序列来实现；这样的技术是本领域公知的。另一种增加抗体上的碳水化合物部分的数量的方法是通过使糖苷与抗体的氨基酸残基进行化学或酶耦合来实现。这些方法在例如WO87/05330以及Aplin和Wriston(1981)CRCCrit.Rev.Biochem.,22:259-306中有描述。去除抗体上存在的任何碳水化合物部分可通过如本领域描述的化学或酶的方式来实现(Hakimuddin等(1987)Arch.Biochem.Biophys.,259:52；Edge等(1981)Anal.Biochem.,118:131；和Thotakura等(1987)Meth.Enzymol.,138:350)。参见例如，关于通过提供挽救(salvage)受体结合表位来延长体内半衰期的修饰的美国专利No.5,869,046。
在一个实施方案中，抗体具有与SEQIDNO：3、4、5、6、7和8的序列不同的CDR序列(例如，ChothiaCDR或KabatCDR)。与本文描述的人源化ALULA抗体的序列不同的CDR序列包括氨基酸变化，例如，如果CDR为5至7个氨基酸长，则为1个、2个、3个或4个氨基酸的取代，如果CDR为10氨基酸或更长，则CDR序列中存在1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个氨基酸取代。所述经取代的氨基酸可具有相似的电荷、疏水性或立体化学特性。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是保守取代。在其它实施方案中，所述氨基酸取代是非保守取代。这样的取代在本领域技术人员的常识内。可筛选包含经取代的CDR的抗体或其抗体片段，以鉴定具有本文描述的特征(例如，特异性地结合β5、抑制αvβ5与玻连蛋白的结合)中的一个或多个的抗体。
与CDR不同，可制造结构框架区(FR)中的更大变化，而不会有害地影响抗体的结合性质。对FR的变化包括但不限于，人源化非人衍生的框架，或工程化对抗原接触或稳定化结合位点重要的某些框架残基，例如，改变恒定区的型或亚型，改变可改变Fc受体结合等效应功能的特定氨基酸残基(Lund等,J.Immun.,147:2657-62(1991)；Morgan等,Immunology,86:319-24(1995))，或改变衍生恒定区的种类。
所述抗αvβ5抗体可为全长抗体的形式，或为抗αvβ5抗体的低分子量形式的形式(例如，生物活性抗体片段或小抗体)，例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、dAb、scFv和sc(Fv)2。本公开涵盖的另一些抗αvβ5抗体包括包含单可变链例如VH或VL的单一结构域抗体(sdAb)或其生物学活性片段。参见例如，Moller等,J.Biol.Chem.,285(49):38348-38361(2010)；Harmsen等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,77(1):13-22(2007)；U.S.2005/0079574和Davies等,(1996)ProteinEng.,9(6):531-7。如完整抗体一样，sdAb能够选择性地结合特定抗原。由于分子量仅为12kDa至15kDa，所以sdAb比常见的抗体小得多，甚至小于Fab片段和单链的可变片段。
本发明提供了包含抗αvβ5抗体或其抗原结合片段与其一种或多种酸性变体的混合物的组合物，例如，其中酸性变体的量小于约80％、70％、60％、60％、50％、40％、30％、30％、20％、10％、5％或1％。本发明还提供了包含具有至少一个脱酰胺基位点的抗αvβ5抗体或其抗原结合片段的组合物，其中所述组合物的pH介于约5.0至约6.5，以使例如，至少约90％的抗αvβ5抗体是没有脱酰胺基的(即，小于约10％的抗体脱酰胺基)。在某些实施方案中，小于约5％、3％、2％或1％的抗体脱酰胺基。所述pH介于5.0至6.0，例如为5.5或6.0。在某些实施方案中，所述组合物的pH为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。
“酸性变体”是感兴趣的多肽的一种变体，其比所述感兴趣的多肽更具酸性(例如，通过阳离子交换色谱来确定)。酸性变体的一个例子是脱酰胺基变体。
多肽分子的“脱酰胺基”变体是其中初始多肽的一个或多个天冬酰胺残基被转化成了天冬氨酸的多肽，即，中性的酰胺侧链被转化成了具有总酸性特性的残基。
在设计包含抗αvβ5抗体或其抗原结合片段的组合物中本文所用术语“混合物”意为，存在期望的抗αvβ5抗体或其抗原结合片段以及其一种或多种酸性变体二者。所述酸性变体可主要包括脱酰胺基化的抗αvβ5抗体，以及少量其它酸性变体。
在某些实施方案中，突变以消除脱氨基的抗体的结合亲和力(KD)、结合速率(KDon)和/或解离速率(KDoff)与野生型抗体相似，例如，具有小于约5倍、2倍、1倍(100％)、50％、30％、20％、10％、5％、3％、2％或1％的差异。
在某些实施方案中，当施用至患有急性肾损伤的人患者或急性肾损伤的动物模型时，抗αvβ5抗体或其抗原结合片段或其低分子量抗体特异性结合β5，抑制αvβ5与玻连蛋白的结合，抑制αvβ5与TGF-β的LAP的结合，抑制TGF-β的活化，抑制TGF-β的信号转导，和/或减轻症状的严重程度(例如，Heyman等,Contrin.Nephrol.,169:286-296(2011)；Heyman等,Exp.Opin.DrugDisc.,4(6):629-641(2009)；Morishita等,Ren.Fail.,33(10):1013-1018(2011)；WeiQ等,Am.J.Physiol.RenalPhysiol.,303(11):F1487-94(2012))。在一个实施方案中，所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段或其低分子量抗体抑制大鼠单侧肾缺血夹闭模型的疾病发展。可根据本领域已知的方法来测量抗αvβ5抗体或其抗原结合片段或其低分子量抗体的这些特征。
抗体片段
可通过蛋白水解消化完整的αvβ5抗体来制备αvβ5结合抗体的抗体片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Facb、和Fv)。例如，可通过用例如木瓜酶、胃蛋白酶或纤溶酶等酶处理完整的抗体来得到抗体片段。木瓜酶消化完整抗体产生F(ab)2或Fab片段；胃蛋白酶消化完整抗体得到F(ab')2或Fab'；并且纤溶酶消化完整抗体得到Facb片段。
作为另一选择，可通过重组的方式来产生抗体片段。例如，可构建编码感兴趣的抗体片段的核酸，将其引入表达载体，并在合适的宿主细胞中表达。参见例如，Co,M.S.等,J.Immunol.,152:2968-2976(1994)；Better,M.和Horwitz,A.H.,MethodsinEnzymology,178:476-496(1989)；Pluckthun,A.和Skerra,A.,MethodsinEnzymology,178:476-496(1989)；Lamoyi,E.,MethodsinEnzymology,121:652-663(1989)；Rousseaux,J.等,MethodsinEnzymology,(1989)121:663-669(1989)；和Bird,R.E.，TIBTECH,9:132-137(1991))。抗体片段可在大肠杆菌中表达，或由大肠杆菌分泌，从而允许容易地产生大量的这些片段。抗体片段可从抗体噬菌体文库分离。作为另一选择，可从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段，并将其化学耦合以形成F(ab)2片段(Carter等,Bio/Technology,10:163-167(1992))。根据另一方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。具有延长的体内半衰期的包含挽救受体结合表位残基的Fab和F(ab')2片段在美国专利No.5,869,046中有描述。
小抗体
抗αvβ5抗体的小抗体包括双抗体、单链(scFv)以及单链的(Fv)2(sc(Fv)2)。
“二抗体”是由通过基因融合构建的二价小抗体(参见例如，Holliger,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:6444-6448(1993)；EP404,097；WO93/11161)。二抗体是由两个多肽链构成二聚体。二抗体的每个多肽链的VL结构域和VH结构域通过接头结合。构成接头的氨基酸残基的数量可为2个至12个残基(例如，3个至10个残基，或者五个或约五个残基)。二抗体中的多肽的接头通常太短，不允许VL与VH彼此结合。因此，同一多肽链中编码的VL和VH不能形成单链的可变区片段，而是与不同的单链的可变区片段形成二聚物。结果，二抗体具有两个抗原结合位点。
scFv是通过用接头连接VH与VL而得到的单链的多肽抗体(参见例如，Huston等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:5879-5883(1988)；和Pluckthun,“ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies”第113卷,EdResenburg和Moore,SpringerVerlag,NewYork，第269-315页,(1994))。VH和VL的连接顺序没有特别限制，并且它们可以以任何顺序来布置。布置的例子包括：[VH]接头[VL]；或[VL]接头[VH]。scFv中的H链V区和L链V区可衍生自本文描述的任何抗αvβ5抗体或其抗原结合片段。
sc(Fv)2是其中两个VH和两个VL由接头连接以形成单链的小抗体(Hudson等,J.Immunol.Methods,(1999)231:177-189(1999))。可例如通过用接头连接scFv来制备sc(Fv)2。本发明的sc(Fv)2包括优选其中两个VH和两个VL以以下顺序布置的抗体：VH、VL、VH和VL([VH]接头[VL]接头[VH]接头[VL])，以单链的多肽的N端为起始；但是所述两个VH和两个VL的顺序不限于上述布置，并且可以以任何顺序对它们进行布置。布置的例子列于如下：
[VL]接头[VH]接头[VH]接头[VL]
[VH]接头[VL]接头[VL]接头[VH]
[VH]接头[VH]接头[VL]接头[VL]
[VL]接头[VL]接头[VH]接头[VH]
[VL]接头[VH]接头[VL]接头[VH]
通常来说，当连接四个抗体可变区时需要三个接头；所述接头可为相同的或不同的。对于连接小抗体的VH区和VL区的接头，没有特别的限制。在一些实施方案中，所述接头是肽接头。可使用包括约3个至25个残基(例如，5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个碱基)例如任何可变的单链的肽来作为接头。这样的肽接头的例子包括：Ser；GlySer；GlyGlySer；SerGlyGly；GlyGlyGlySer(SEQIDNO:13)；SerGlyGlyGly(SEQIDNO:14)；GlyGlyGlyGlySer(SEQIDNO:15)；SerGlyGlyGlyGly(SEQIDNO:16)；GlyGlyGlyGlyGlySer(SEQIDNO:17)；SerGlyGlyGlyGlyGly(SEQIDNO:18)；GlyGlyGlyGlyGlyGlySer(SEQIDNO:19)；SerGlyGlyGlyGlyGlyGly(SEQIDNO:20)；(GlyGlyGlyGlySer(SEQIDNO:15))n，其中n是1或更大的整数；(SerGlyGlyGlyGly(SEQIDNO:16))n，其中n是1或更大的整数。
在某些实施方案中，所述接头是合成的化合物接头(化学交联剂)。市场上可得到的交联剂的例子包括：N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)、二琥珀酰亚胺辛二酸盐(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸盐(BS3)、二硫双(琥珀酰亚胺丙酸盐)(DSP)、二硫双(磺基琥珀酰亚胺丙酸盐)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸盐)(EGS)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺琥珀酸盐)(磺基-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基)乙基砜(BSOCOES)和双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基)乙基砜(磺基-BSOCOES)。
小抗体的VH或VL的氨基酸序列可包含修饰，例如，取代、缺失、增加和/或***。例如，所述修饰可处于抗αvβ5抗体或其抗原结合片段的一个或多个CDR(或替代的CDR)中。在某些实施方案中，所述修饰涉及抗αvβ5小抗体的VH和/或VL结构域的一个或多个CDR(或替代的CDR)和/或框架区中的一个、两个或三个氨基酸取代。可制造这样的取代以改进结合、功能活性和/或降低抗αvβ5小抗体的免疫原性。在某些实施方案中，所述取代是保守氨基酸取代。在其它实施方案中，可删除或添加抗αvβ5抗体或其抗原结合片段的一个、两个或三个CDR(或替代的CDR)的氨基酸，只要当VH与VL缔合时存在αvβ5结合和/或功能活性即可。所述经修饰的小抗体可抑制αvβ5与玻连蛋白结合；抑制αvβ5与TGF-β的LAP结合；和/或抑制TGF-β信号转导。
双特异性抗体
双特异性抗体是具有对至少两种不同表位的特异性的抗体。示例性的双特异性抗体可结合αvβ5蛋白的两个不同表位。另一些这样的抗体可将αvβ5结合位点与针对另一种蛋白质的结合位点蛋白(例如，αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8)进行组合。可将双特异性抗体制备为全长抗体或其低分子量形式(例如，F(ab')2双特异性抗体、sc(Fv)2双特异性抗体、二抗体双特异性抗体)。
全长双特异性抗体的传统产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同的特异性(Millstein等,Nature305:537-539(1983))。在不同的方法中，将具有期望结合特异性的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果期望的话)免疫球蛋白轻链的DNA***各自的表达载体中，并将其共转染至合适的宿主细胞中。这在三种多肽片段的比例调节上提供了更大的灵活性。但是，当以相等比率表达至少两条多肽链导致高产率时，可将两种或三种多肽链的编码序列***至单个的表达载体中。
根据美国专利No.5,731,168中描述的另一种方法，可工程化抗体分子对之间的界面以使从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分率最大化。优选的界面包含至少部分的CH3结构域。在该方法中，用较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)来置换第一抗体分子的界面的一条或多条小氨基酸侧链。通过用大氨基酸侧链置换较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)，在第二抗体分子上创造出与大侧链(多个)相同或相似尺寸的补偿性的“腔”。这提供了提高异二聚物相对于例如同二聚物等其它不需要的终产物的产率的机制。
双特异性抗体包括交联的抗体或“异源缀合的”抗体。例如，在异源缀合中，一个抗体耦合至抗生物素蛋白，其它抗体耦合至生物素。异源缀合抗体可通过使用方便的交联法来制造。
“二抗体”技术提供了用于制造双特异性抗体片段的一个可选方案。所述片段包含由接头连接至VL的VH，接头太短不允许同一链上的两个结构域之间进行配对。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一片段上的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。
多价抗体
多价抗体可被表达该抗体所结合的抗原的细胞更快地内化(和/或同化)。本文描述的抗体可为具有三个或更多个结合位点的多价抗体(例如，四价抗体)，其可通过重组表达编码抗体多肽链的核酸而容易地产生。所述多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。示例性的二聚化结构域包括Fc区或铰链区(或由所述区组成)。多价抗体可包含三个至约八个(例如四个)抗原结合位点(或由所述抗原结合位点组成)。多价抗体任选包含至少一条多肽链(例如，至少两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，所述多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是一条Fc区多肽链，X1和X2表示氨基酸或多肽，并且n为0或1。
缀合的抗体
本文公开的抗体可为与多种分子结合的缀合的抗体，所述分子包括：大分子物质例如聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、经PEG修饰的聚乙烯亚胺(PEI)(PEI-PEG)、聚谷氨酸(PGA)(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物)、透明质酸、荧光物质、发光物质、半抗原、酶、金属和药物。
在某些实施方案中，用这样的部分来修饰抗αvβ5抗体或其抗原结合片段，所述部分将其在循环***中例如在血液、血清或其它组织中的稳定化和/或滞留提高为至少1.5倍、2倍、5倍、10倍或50倍。例如，可使抗αvβ5抗体或其抗原结合片段缔合(或缀合至)聚合物，例如，基本非抗原性的聚合物，例如聚氧化烯或聚氧化乙烯。合适的聚合物将根据重量而不同。可使用具有范围介于约200道尔顿至约35,000道尔顿(或约1,000道尔顿至约15,000道尔顿，以及2,000道尔顿至约12,500道尔顿)的数均分子量的聚合物。例如，可将抗αvβ5抗体或其抗原结合片段缀合至水溶性聚合物，例如，亲水性聚乙烯聚合物，例如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。这样的聚合物例子包括聚氧化烯均聚物，例如聚乙二醇(PEG)(参见例如，Chapman等,NatureBiotechnology,17:780-783(1999))，或聚丙二醇、聚氧乙基化的多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物，只要维持所述嵌段共聚物的水溶性即可。另一些可用的聚合物包括聚氧烯，例如，聚氧乙烯、聚氧丙烯，以及聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆；以及有支链的或无支链的多糖。可通过提高其血清持续时间从而允许更高的循环水平、更低频的使用和降低的剂量，以此来改进治疗性抗体的效力。IgG的半衰期取决于其对新生儿受体FcRn的pH依赖性结合。FcRn表达于内皮细胞表面上，其以pH依赖的方式结合IgG，并保护其免于被降解。一些在pH6.0下而不是在pH7.4下选择性结合FcRn的抗体表现出在多种动物模型中的更长半衰期。在某些实施方案中，本公开的抗体具有处于CH2结构域和CH3结构域之间的界面处的一个或多个突变，例如T250Q/M428L和M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F(该编号根据EU指数)，其提高对FcRn的结合亲和力以及体内IgG1半衰期。在其它实施方案中，本文的抗体具有经修饰的Fc区，包含相对于野生型人Fc区的至少一个修饰，其中所述修饰选自由434S、252Y/428L、252Y/434S和428L/434S组成的组，并且该编号根据EU指数。
还可将抗体或其抗原结合片段缀合至siRNA、miRNA或抗miR，以将所述siRNA、miRNA或抗miR递送至表达αvβ5的细胞(参见例如，Song等,Nat.Biotechnol.,23(6):709-17(2005)；Schneider等,MolecularTherapyNucleicAcids,1:e46(2012))。所述siRNA、miRNA、miRNA模拟物或抗miR可靶向急性肾损伤中所涉及的因子(例如，p53)。例如，可使用αvβ5抗体或其抗原结合片段缀合其上来将以下中的一种或多种靶向至表达αvβ5的细胞：靶向p53的抗microRNA或siRNA、miR-320、miR-16、miR-34a、miR-132、miR-17-3p、miR-362、miR-685、miR-687、miR-207、miR-489、miR-7、miR-132、miR-486、miR-362、miR-467、miR-495、miR-668、miR-694、抗miR-18a、抗miR-135b、抗miR-296、抗miR-127、抗miR-322、抗miR-379、抗miR-487b、抗miR-491、抗miR-324-3p、抗miR-379、抗miR-455-3p和抗miR-210。
上述经缀合的抗体可通过在本文描述的抗体或其低分子量形式上进行化学修饰来制备。用于修饰抗体的方法是本领域公知的(例如，US5057313和US5156840)。
产生抗体的方法
本公开的抗αvβ5抗体(或抗体结合片段)可在细菌或真核细胞中产生。一些抗体例如Fab可在细菌细胞例如大肠杆菌中产生。抗体还可在真核细胞例如经转化的细胞系(例如，CHO、293E、COS)中产生。此外，抗体(例如，scFv)还可在酵母菌细胞例如毕赤酵母属(Pichia)(参见例如，Powers等,JImmunolMethods.251:123-35(2001))、Hanseula或酵母属(Saccharomyces)中表达。为了产生感兴趣的抗体，构建编码该抗体的多核苷酸，将其引入表达载体，然后在合适的宿主细胞中表达。使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化子、培养宿主细胞以及回收抗体。
如果抗体将在细菌细胞(例如，大肠杆菌)中表达，则所述表达载体应具有允许该载体在所述细菌细胞中扩增的特性。此外，当使用大肠杆菌例如JM109、DH5α、HB101或XL1-Blue作为宿主时，所述载体必须具有可允许在大肠杆菌中高效表达的启动子，例如，lacZ启动子(Ward等,341:544-546(1989))、araB启动子(Better等,Science,240:1041-1043(1988))或T7启动子。这样的载体的例子包括例如，M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress***”(QIAGEN)、pEGFP和pET(当使用该表达载体时，宿主优选为表达T7RNA聚合酶的BL21)。所述表达载体可包含用于抗体分泌的信号序列。为了产生于大肠杆菌的周质中，可使用pelB信号序列(Lei等,J.Bacteriol.,169:4379(1987))作为用于抗体分泌的信号序列。对于细菌表达，可使用氯化钙法或电穿孔法来将表达载体引入细菌细胞中。
如果将在动物细胞例如CHO、COS、293、293T和NIH3T3细胞中表达抗体，则表达载体包含在这些细胞中表达所必需的启动子，例如，SV40启动子(Mulligan等,Nature,277:108(1979))、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等,NucleicAcidsRes.,18:5322(1990))或CMV启动子。除了编码免疫球蛋白或其结构域的核酸序列外，重组表达载体还可携带额外的序列，例如调控载体在宿主细胞复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标志物基因。可选择标志物基因有利于选择已经被引入载体的宿主细胞(参见例如，美国专利No.4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常来说，可选择标志物基因将对药物例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性赋予已经被引入该载体的宿主细胞。具有可选择标志物的载体的例子包括pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。
在一个实施方案中，抗体在哺乳动物细胞产生。用于表达抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr–CHO细胞，在Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220中有描述，其与DHFR可选择标志物一起使用，例如，如在Kaufman和Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中的描述)，人胚胎肾293细胞(例如，293、293E、293T)、COS细胞、NIH3T3细胞、淋巴细胞细胞系例如NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞，以及来自转基因动物例如转基因哺乳动物的细胞。例如，所述细胞是***上皮细胞。
在一个用于抗体表达的示例性***中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗αvβ5抗体的抗体重链和抗体轻链二者的重组表达载体引入dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，将抗体重链基因和轻链基因分别可操作地连接至增强子/启动子调控元件(例如，衍生自SV40、CMV、腺病毒等，例如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)，以驱动所述基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许通过使用甲氨蝶呤选择/扩增来选择已经被该载体转染的CHO细胞。培养所选择的转化子宿主细胞，以允许抗体重链和轻链的表达，并从培养基中回收抗体。
抗体还可由转基因动物产生。例如，美国专利No.5,849,992描述了在转基因动物的乳腺中表达抗体的方法。构建这样的转基因，即，其包含乳特异性启动子以及编码感兴趣的抗体的核酸和用于分泌的信号序列。由这样的雌性转基因动物产生的乳包含分泌于其中的感兴趣的抗体。可从所述乳纯化所述抗体，或对于一些应用而言，可直接使用。还提供了包含本文描述的核酸中的一种或多种的动物。
可从宿主细胞内或外(例如，培养基)分离本公开的抗体，并将其纯化为基本纯的和均质的抗体。可使用通常用于抗体纯化的分离和纯化的方法来分离和纯化抗体，并且其不限于任何特定的方法。可通过适当的选择和组合以下方法来分离和纯化抗体，例如，柱色谱、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦、透析和重结晶。色谱包括例如，亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤、反相色谱和吸附色谱(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.EdDanielR.Marshak等,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1996)。可使用液相色谱例如HPLC和FPLC来进行色谱。用于亲和色谱的柱子包括蛋白A柱和蛋白G柱。使用蛋白A柱的柱子的例子包括HyperD、POROS和SepharoseFF(GEHealthcareBiosciences)。本公开还包括使用这些纯化方法高度纯化了的抗体。
抗体的表征
可通过任何标准来测量本文描述的抗体的αvβ5结合性质，例如以下方法中的一种或多种：表面等离子共振(SPR)、BIACORETM分析、酶连接免疫吸附测定(ELISA)、EIA(酶免疫测定)、RIA(放射免疫测定)和荧光共振能量转移(FRET)。
可使用***来分析感兴趣的蛋白质(抗αvβ5抗体)与靶标(例如β5)的结合相互作用。在该方法中，可使用FortéBio公司制造的一些仪器(例如，QKe和QK)变型中的一种来确定蛋白相互作用、结合特异性和表位作图。***提供了通过测量沿着定制探头向下运行并且然后回到传感器的偏振光的变化来监视实时结合的容易的方式。
可使用表面等离子共振(SPR)来分析感兴趣的蛋白质(抗αvβ5抗体)与靶标(例如β5)的结合相互作用。SPR或生物分子相互作用分析(BiomolecularInteractionAnalysis，BIA)在不标记任何反应物的情况下实时检测双特异性相互作用。BIA芯片的结合表面的质量变化(结合事件的表示)导致该表面附近的光的折射率的改变(表面等离子共振(SPR)的光学现象)。折射性的变化产生可检测信号，其被测量为生物学分子之间的实时反应的指示。用于使用SPR的方法在例如以下文献中有描述：美国专利No.5,641,640；Raether(1988)SurfacePlasmonsSpringerVerlag；Sjolander和Urbaniczky(1991)Anal.Chem.63:2338-2345；Szabo等(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705，以及BIAcoreInternationalAB(Uppsala,Sweden)提供的线上资源。可使用来自SPR的信息来提供对生物分子结合靶标的平衡解离常数(Kd)以及动力学参数包括Kon和Koff的精确和定量的测量。
还可通过使用BIACORE色谱技术评估不同抗体彼此之间竞争结合人αvβ5或β5的能力来对表位直接作图(PharmaciaBIAtechnologyHandbook,"EpitopeMapping",第6.3.2段，(1994年5月)；还参见Johne等(1993)J.Immunol.Methods,160:191-198)。
当采用酶免疫测定时，将包含抗体的样品，例如产生抗体的细胞的培养物上清液或纯化的抗体，添加至抗原涂覆的板。添加用酶例如碱性磷酸酶标记的二抗，孵育该板，并且在洗涤后，添加酶底物例如对硝基苯基磷酸盐，并测量吸光度以评价抗原结合活性。
用于评价抗体的另一些一般指导，例如western印迹和免疫沉淀测定，可见于Antibodies:ALaboratoryManual,Harlow和Lane编,ColdSpringHarborpress(1988)。
具有改变的效应功能的抗体
抗体和抗体-抗原复合物与免疫***的细胞的相互作用触发多种应答，在本文中这被称为效应功能。免疫介导的效应功能包括两种主要机制：抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)。这两者都由免疫球蛋白的恒定区介导。因此，抗体Fc结构域是限定与免疫效应机制相互作用的部分。
IgG抗体通过结合细胞表面Fcγ受体家族的成员以及结合补体***的C1q来活化免疫***的效应通路。簇集的抗体与效应蛋白的结合触发多种应答，包括释放炎性细胞因子、调控抗原产生、内吞作用以及细胞杀伤。在一些临床应用中，这些应答对单克隆抗体的效力至关重要。在另一些中，它们激发不期望的副作用，例如，发炎以及携带抗原的细胞的清除。因此，本发明还涉及具有改变的(例如，升高的或降低的)效应功能的αvβ5结合蛋白，包括抗体。
可通过使用许多已知测定中的一种来确定本发明的抗αvβ5抗体的效应功能。抗αvβ5抗体的效应功能可相对于第二抗αvβ5抗体升高或降低。在一些实施方案中，所述第二抗αvβ5抗体可为特异性结合αvβ5的任何抗体。在其它实施方案中，在感兴趣的抗αvβ5抗体被修饰成升高或降低效应功能的情况下，所述第二抗αvβ5抗体可为抗体的未经修饰的版本或亲代版本。
效应功能包括抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，抗体通过该功能结合细胞毒性T细胞、天然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞的Fc受体，导致细胞死亡；以及补体依赖的细胞毒性(CDC)，其通过补体级联活化来诱导细胞死亡(在以下文献中有概述：Daeron,Annu.Rev.Immunol.,15:203-234(1997)；Ward和Ghetie,TherapeuticImmunol.,2:77-94(1995)；以及Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991))。这样的效应功能一般需要与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合的Fc区，并且可使用本领域已知的标准来测定(参见例如，WO05/018572、WO05/003175和U.S.6,242,195)。
可通过使用没有Fc结构域例如Fab、Fab'2或单链Fv的抗体片段来避免效应功能。一个可选方案是使用IgG4亚型抗体，其结合FcγRI，但是其对C1q和FcγRII和FcγRIII的结合不良。IgG2亚型还降低对Fc受体的结合，并且显著的保持对FcγRIIa的H131同种异型和对C1q的结合。因此，需要Fc序列中的另一些变化来消除对所有Fc受体和对C1q的结合。
包括ADCC在内的一些抗体效应功能由Fc受体(FcR)介导，其结合抗体的Fc区。通过改变抗体的Fc区和/或恒定区的氨基酸序列和/或进行翻译后修饰来调节抗体对特定FcR的亲和力，并由此调节该抗体介导的效应活性。
通过它们对免疫球蛋白的特异性来定义FcR；针对IgG抗体的Fc受体被称为FcγR，针对IgE的称为FcεR，针对IgA的称为FcαR，等等。已经鉴定了FcγR的三种亚型：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。FcγRII和FcγRIII二者都具有两种类型：FcγRIIA(CD32)和FcγRIIB(CD32)；以及FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。因为每种FcγR亚型由两个或三个基因编码，并且可变的RNA剪接导致多种转录物，存在多样化的FcγR亚型。例如，FcγRII(CD32)包括亚型IIa、IIb1、IIb2、IIb3和IIc。
以前已经对人抗体和鼠科抗体上的FcγR的结合位点进行了作图，其成为“下铰链区”，由残基233至239组成(EU指数编号，Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991),Woof等,Molec.Immunol.23:319-330(1986)；Duncan等,Nature332:563(1988)；Canfield和Morrison,J.Exp.Med.173:1483-1491(1991)；Chappel等,Proc.Natl.Acad.SciUSA88:9036-9040(1991))。残基233至239、P238和S239是引用为结合中可能涉及的残基中的成员。以前引用的可能涉及结合FcγR的其它其余是：对于人FcγRIG316-K338(人IgG)(Woof等,Mol.Immunol.,23:319-330(1986))；对于人FcγRIIIK274-R301(人IgG1)(Sarmay等,Molec.Immunol.21:43-51(1984))；以及对于人FcγRIIIY407-R416(人IgG)(Gergely等,Biochem.Soc.Trans.12:739-743(1984)和Shields等,JBiolChem276:6591-6604(2001)，LazarGA等,ProcNatlAcadSci103:4005-4010(2006)。对本领域技术人员而言，涉及FcR结合的这些和其它氨基酸残基延伸或区域可从Ig-FcR复合物的晶体结构检查而显而易见(参见例如，Sondermann等2000Nature406(6793):267-73，以及Sondermann等2002BiochemSocTrans.30(4):481-6)。因此，本发明的抗αvβ5抗体包含对上述残基中的一个或多个的修饰(以按需要提高或降低效应功能)。
用于改变单克隆抗体效应功能的另一种方法包括突变单克隆抗体表面上的涉及效应子结合相互作用的氨基酸(Lund,J.等(1991)J.Immunol.147(8):2657-62；Shields,R.L.等(2001)J.Biol.Chem.276(9):6591-604)。
提高抗体效应功能的方法是本领域公知的(参见例如，Kelley等,MethodsMol.Biol.,901:277-93(2012)；Natsume等,DrugDesDevelTher.,3:7-16(2009)；US8,188,231、US7,960,512)。在一个实施方案中，所述αvβ5抗体具有在选自由以下组成的组的位置处的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多氨基酸取代：221、222、223、224、225、227、228、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、246、247、249、255、258、260、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、278、280、281、282、283、284、285、286、288、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、313、317、318、320、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336和337，其中Fc区中的残基编号是如Kabat中的EU指数的编号。在某些实施方案中，所述αvβ5抗体具有选自由以下组成的组的氨基酸取代中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多：D221K、D221Y、K222E、K222Y、T223E、T223K、H224E、H224Y、T225E、T225K、T225W、P227E、P227G、P227K、P227Y、P228E、P228G、P228K、P228Y、P230A、P230E、P230G、P230Y、A231E、A231G、A231K、A231P、A231Y、P232E、P232G、P232K、P232Y、E233A、E233D、E233F、E233G、E233H、E233I、E233K、E233L、E233M、E233N、E233Q、E233R、E233S、E233T、E233V、E233W、E233Y、L234A、L234D、L234E、L234F、L234G、L234H、L234I、L234K、L234M、L234N、L234P、L234Q、L234R、L234S、L234T、L234V、L234W、L234Y、L235A、L235D、L235E、L235F、L235G、L235H、L235I、L235K、L235M、L235N、L235P、L235Q、L235R、L235S、L235T、L235V、L235W、L235Y、G236A、G236D、G236E、G236F、G236H、G236I、G236K、G236L、G236M、G236N、G236P、G236Q、G236R、G236S、G236T、G236V、G236W、G236Y、G237D、G237E、G237F、G237H、G237I、G237K、G237L、G237M、G237N、G237P、G237Q、G237R、G237S、G237T、G237V、G237W、G237Y、P238D、P238E、P238F、P238G、P238H、P238I、P238K、P238L、P238M、P238N、P238Q、P238R、P238S、P238T、P238V、P238W、P238Y、S239D、S239E、S239F、S239G、S239H、S239I、S239K、S239L、S239M、S239N、S239P、S239Q、S239R、S239T、S239V、S239W、S239Y、V240A、V240I、V240M、V240T、F241D、F241E、F241L、F241R、F241S、F241W、F241Y、F243E、F243H、F243L、F243Q、F243R、F243W、F243Y、P244H、P245A、K246D、K246E、K246H、K246Y、P247G、P247V、D249H、D249Q、D249Y、R255E、R255Y、E258H、E258S、E258Y、T260D、T260E、T260H、T260Y、V262A、V262E、V262F、V262I、V262T、V263A、V263I、V263M、V263T、V264A、V264D、V264E、V264F、V264G、V264H、V264I、V264K、V264L、V264M、V264N、V264P、V264Q、V264R、V264S、V264T、V264W、V264Y、D265F、D265G、D265H、D265I、D265K、D265L、D265M、D265N、D265P、D265Q、D265R、D265S、D265T、D265V、D265W、D265Y、V266A、V266I、V266M、V266T、S267D、S267E、S267F、S267H、S267I、S267K、S267L、S267M、S267N、S267P、S267Q、S267R、S267T、S267V、S267W、S267Y、H268D、H268E、H268F、H268G、H268I、H268K、H268L、H268M、H268P、H268Q、H268R、H268T、H268V、H268W、E269F、E269G、E269H、E269I、E269K、E269L、E269M、E269N、E269P、E269R、E269S、E269T、E269V、E269W、E269Y、D270F、D270G、D270H、D270I、D270L、D270M、D270P、D270Q、D270R、D270S、D270T、D270W、D270Y、P271A、P271D、P271E、P271F、P271G、P271H、P271I、P271K、P271L、P271M、P271N、P271Q、P271R、P271S、P271T、P271V、P271W、P271Y、E272D、E272F、E272G、E272H、E272I、E272K、E272L、E272M、E272P、E272R、E272S、E272T、E272V、E272W、E272Y、V273I、K274D、K274E、K274F、K274G、K274H、K274I、K274L、K274M、K274N、K274P、K274R、K274T、K274V、K274W、K274Y、F275L、F275W、N276D、N276E、N276F、N276G、N276H、N276I、N276L、N276M、N276P、N276R、N276S、N276T、N276V、N276W、N276Y、Y278D、Y278E、Y278G、Y278H、Y278I、Y278K、Y278L、Y278M、Y278N、Y278P、Y278Q、Y278R、Y278S、Y278T、Y278V、Y278W、D280G、D280K、D280L、D280P、D280W、G281D、G281E、G281K、G281N、G281P、G281Q、G281Y、V282E、V282G、V282K、V282P、V282Y、E283G、E283H、E283K、E283L、E283P、E283R、E283Y、V284D、V284E、V284L、V284N、V284Q、V284T、V284Y、H285D、H285E、H285K、H285Q、H285W、H285Y、N286E、N286G、N286P、N286Y、K288D、K288E、K288Y、K290D、K290H、K290L、K290N、K290W、P291D、P291E、P291G、P291H、P291I、P291Q、P291T、R292D、R292E、R292T、R292Y、E293F、E293G、E293H、E293I、E293L、E293M、E293N、E293P、E293R、E293S、E293T、E293V、E293W、E293Y、E294F、E294G、E294H、E294I、E294K、E294L、E294M、E294P、E294R、E294S、E294T、E294V、E294W、E294Y、Q295D、Q295E、Q295F、Q295G、Q295H、Q295I、Q295M、Q295N、Q295P、Q295R、Q295S、Q295T、Q295V、Q295W、Q295Y、Y296A、Y296D、Y296E、Y296G、Y296H、Y296I、Y296K、Y296L、Y296M、Y296N、Y296Q、Y296R、Y296S、Y296T、Y296V、N297D、N297E、N297F、N297G、N297H、N297I、N297K、N297L、N297M、N297P、N297Q、N297R、N297S、N297T、N297V、N297W、N297Y、S298D、S298E、S298F、S298H、S298I、S298K、S298M、S298N、S298Q、S298R、S298T、S298W、S298Y、T299A、T299D、T299E、T299F、T299G、T299H、T299I、T299K、T299L、T299M、T299N、T299P、T299Q、T299R、T299S、T299V、T299W、T299Y、Y300A、Y300D、Y300E、Y300G、Y300H、Y300K、Y300M、Y300N、Y300P、Y300Q、Y300R、Y300S、Y300T、Y300V、Y300W、R301D、R301E、R301H、R301Y、V302I、V303D、V303E、V303Y、S304D、S304H、S304L、S304N、S304T、V305E、V305T、V305Y、W313F、K317E、K317Q、E318H、E318L、E318Q、E318R、E318Y、K320D、K320F、K320G、K320H、K320I、K320L、K320N、K320P、K320S、K320T、K320V、K320W、K320Y、K322D、K322F、K322G、K322H、K322I、K322P、K322S、K322T、K322V、K322W、K322Y、V323I、S324D、S324F、S324G、S324H、S324I、S324L、S324M、S324P、S324R、S324T、S324V、S324W、S324Y、N325A、N325D、N325E、N325F、N325G、N325H、N325I、N325K、N325L、N325M、N325P、N325Q、N325R、N325S、N325T、N325V、N325W、N325Y、K326I、K326L、K326P、K326T、A327D、A327E、A327F、A327H、A327I、A327K、A327L、A327M、A327N、A327P、A327R、A327S、A327T、A327V、A327W、A327Y、L328A、L328D、L328E、L328F、L328G、L328H、L328I、L328K、L328M、L328N、L328P、L328Q、L328R、L328S、L328T、L328V、L328W、L328Y、P329D、P329E、P329F、P329G、P329H、P329I、P329K、P329L、P329M、P329N、P329Q、P329R、P329S、P329T、P329V、P329W、P329Y、A330E、A330F、A330G、A330H、A330I、A330L、A330M、A330N、A330P、A330R、A330S、A330T、A330V、A330W、A330Y、P331D、P331F、P331H、P331I、P331L、P331M、P331Q、P331R、P331T、P331V、P331W、P331Y、I332A、I332D、I332E、I332F、I332H、I332K、I332L、I332M、I332N、I332P、I332Q、I332R、I332S、I332T、I332V、I332W、I332Y、E333F、E333H、E333I、E333L、E333M、E333P、E333T、E333Y、K334F、K334I、K334L、K334P、K334T、T335D、T335F、T335G、T335H、T335I、T335L、T335M、T335N、T335P、T335R、T335S、T335V、T335W、T335Y、I336E、I336K、I336Y、S337E、S337H和S337N，其中Fc区中残基的编号是如Kabat中的EU指数的编号。在一个具体实施方案中，所述αvβ5抗体包含以下突变中的一个、两个或三个：S239D、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、S239D/I332E/G236A、S298A、A330LI332E、E333A和K334A。
寡糖特别是IgG1的CH2结构域中天冬酰胺-297处的N-连接寡糖的存在对与FcγR以及C1q的结合是重要的。降低抗体的岩藻糖含量改进效应功能(参见例如，US8,163,551)。在某些实施方案中，所述αvβ5抗体具有降低的岩藻糖基化和提高效应功能的氨基酸取代(例如，以下突变中的一个、两个或三个：S298A；E333A和K334A)。还可通过在存在α-甘露糖苷酶I抑制剂(例如，几夫碱)的存在下，在约60ng/mL至200ng/mL(例如，60ng/mL、75ng/mL、100ng/mL、150ng/ml)的抑制剂浓度下制备和表达本文描述的抗αvβ5抗体，从而实现效应功能。在α-甘露糖苷酶I抑制剂的存在下表达的抗体主要包含寡甘露糖型多糖，并且一般显示出提高的ADCC活性和对FcγRIIIA的亲和力，但是降低的C1q结合。
本公开的具有升高的效应功能的抗αvβ5抗体包括相对于亲代或非变体抗αvβ5抗体具有升高的对一种或多种Fc受体(FcR)的结合亲和力的抗体。因此，具有升高的FcR结合亲和力的抗αvβ5抗体包括与亲代或非变体抗αvβ5抗体相比，表现出对一种或多种Fc受体的结合亲和力升高为1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍或更高的抗αvβ5抗体。在一些实施方案中，相对于亲代或非变体抗体，具有升高的效应功能的抗αvβ5抗体以约10倍的亲和力结合FcR。在其它实施方案中，相对于亲代或非变体抗体，具有升高的效应功能的抗αvβ5抗体以约15倍的亲和力或以约20倍的亲和力结合FcR。FcR受体可为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII及其亚型，以及FcεR、FcμR、FcδR和/或FcαR中的一种或多种。在具体实施方案中，具有升高的效应功能的抗αvβ5抗体表现出对FcγRIIa的结合亲和力升高为1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍或更高。
为了降低效应功能，我们可使用不同亚型的序列区段组合(例如，IgG2与IgG4组合)，以得到比任一单独的亚型更大降低的对Fcγ受体的结合(Armour等,Eur.J.Immunol.,29:2613-1624(1999)；Mol.Immunol.,40:585-593(2003))。此外，可去除N-连接糖基化位点作为降低效应功能的方法。许多具有改变的和/或降低的对一些或所有Fc亚型的亲和力(并且从而具有改变的和/或降低的效应功能)的Fc变体是本领域已知的。参见例如，US2007/0224188；US2007/0148171；US2007/0048300；US2007/0041966；US2007/0009523；US2007/0036799；US2006/0275283；US2006/0235208；US2006/0193856；US2006/0160996；US2006/0134105；US2006/0024298；US2005/0244403；US2005/0233382；US2005/0215768；US2005/0118174；US2005/0054832；US2004/0228856；US2004/132101；US2003/158389；还参见US7,183,387；6,737,056；6,538,124；6,528,624；6,194,551；5,624,821；5,648,260。在某些实施方案中，取代第232、234、235、236、237、239、264、265、267、269、270、299、325、328、329和330位(根据Kabat编号)的氨基酸，以降低效应功能。降低效应功能的取代的非限制性例子包括以下的一种或多种：K322A；L234A/L235A；G236T；G236R；G236Q；H268A；H268Q；V309L；A330S；P331S；V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S；E233P/L234V/L235A/G236Q+A327G/A330S/P331S；和L235E+E318A/K320A/K322A。
本发明的具有降低的效应功能的抗αvβ5抗体包括相对于亲代或非变体抗αvβ5抗体具有降低的对一种或多种Fc受体(FcR)的结合亲和力的抗体。因此，具有降低的FcR结合亲和力的抗αvβ5抗体包括与亲代或非变体抗αvβ5抗体相比，表现出对一种或多种Fc受体的结合亲和力降低1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍或更高。在一些实施方案中，相对于亲代或非变体抗体，具有降低的效应功能的抗αvβ5抗体以低约10倍的亲和力结合FcR。在其它实施方案中，相对于亲代或非变体抗体，具有降低的效应功能的抗αvβ5抗体以低约15倍的亲和力或以低约20倍的亲和力结合FcR。FcR受体可为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII及其亚型，以及FcεR、FcμR、FcδR和/或FcαR中的一种或多种，在一些具体实施方案中，具有降低的效应功能的抗αvβ5抗体表现出对FcγRIIa的结合亲和力降低1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍或更高。
在CDC中，抗体-抗原复合物结合补体，导致补体级联活化和膜攻击复合物的生成。典型的补体活化通路由补体***的第一组件(C1q)与结合于其同源抗原的抗体(适当的亚型)结合起始；因此，补体级联活化部分地由免疫球蛋白对C1q蛋白的结合亲和力所调控。为了活化补体级联反应，C1q需要结合至少两分子的IgG1、IgG2或IgG3，而仅需要结合一分子的IgM，以附接至抗原性靶标(Ward和Ghetie,TherapeuticImmunology2:77-94(1995)p.80)。为了评价补体活化，可进行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等J.Immunol.Methods,202:163(1996)中所描述。
在与C1q结合中涉及IgG分子的多个残基，包括CH2结构域上的Glu318、Lys320和Lys322残基，位于相同β链附近的转角上的氨基酸残基331，位于下铰链区中的Lys235和Gly237残基，以及位于CH2结构域的N端区中的残基231至238(参见例如，Xu等,J.Immunol.150:152A(摘要)(1993),WO94/29351；Tao等,J.Exp.Med.,178:661-667(1993)；Brekke等,Eur.J.Immunol.,24:2542-47(1994)；Burton等；Nature,288:338-344(1980)；Duncan和Winter,Nature332:738-40(1988)；Idusogie等JImmunol164:4178-4184(2000)；U.S.5,648,260，和U.S.5,624,821)。
具有改进的C1q结合的抗αvβ5抗体可包含人IgGFc区的第326、327、333和334位氨基酸中的一个、两个、三个或四个处的氨基酸取代，其中IgGFc区中的残基的编号是如Kabat中的EU指数的编号。在一个实施方案中，所述抗αvβ5抗体包括以下氨基酸：K326W/E333S，已知其提高IgG1抗体与C1q的结合(SteurerW.等,JImmunol.,155(3):1165-74(1995))。
具有降低的C1q结合的抗αvβ5抗体可包含人IgGFc区的第270、322、329和331位氨基酸中的一个、两个、三个或四个处的氨基酸取代，其中IgGFc区中的残基的编号是如Kabat中的EU指数的编号。作为IgG1中的一个例子，人IgG1CH2结构域的COOH端区中的两个突变K322A和P329A不活化CDC通路，并且示出导致C1q结合降低多于100倍(US6,242,195)。
因此，在某些实施方案中，本发明的抗αvβ5抗体表现出相对于第二抗αvβ5抗体升高或降低的与补体蛋白的结合。在某些实施方案中，相对于第二抗αvβ5抗体，本发明的抗αvβ5抗体表现出与C1q的结合升高或降低约1.5倍或更高、约2倍或更高、约3倍或更高、约4倍或更高、约5倍或更高、约6倍或更高、约7倍或更高、约8倍或更高、约9倍或更高、约10倍或更高或约15倍或更高。
因此，在本发明的某些实施方案中，可对这些残基中的一个或多个进行修饰、取代或去除，或将一个或多个氨基酸残基***以提高或降低本文提供的抗αvβ5抗体的CDC活性。
在其它实施方案中，本发明提供了这样的抗αvβ5抗体，即，其表现出降低的与一个或多个FcR受体的结合，但是维持其结合补体的能力(例如，维持于与天然的、非变体的或亲代的抗αvβ5抗体相似的程度，或在一些实施方案中，维持于小于其的程度)。因此，本发明的抗αvβ5抗体可结合并活化补体，同时表现出降低的与FcR例如FcγRIIa(例如，表达血小板上的FcγRIIa)的结合。这样的具有降低的或不与FcγRIIa(例如，表达于血小板上的FcγRIIa)结合但可结合C1q并且在至少一定程度上活化补体级联反应的抗体将降低血栓栓塞事件的风险同时保持可能的期望的效应功能。在一些可选实施方案中，本发明的抗αvβ5抗体表现出降低的与一种或多种FcR的结合，但是维持其结合一种或多种其它FcR的能力。参见例如，US2007-0009523、2006-0194290、2005-0233382、2004-0228856和2004-0191244，其描述了生成具有降低的与FcRI、FcRII和/或FcRIII结合的抗体的氨基酸修饰，以及导致升高的与一种FcR结合但降低的与另一种FcR的结合的氨基酸取代。
因此，可通过改变恒定区以及特别是Fc区的性质来调节涉及抗αvβ5抗体的恒定区的效应功能。在某些实施方案中，将具有升高或降低的效应功能的抗αvβ5抗体与具有效应功能并且可为包含介导效应功能的天然恒定区或Fc区的非变体的、天然的或亲代的抗体进行比较。
天然的Fc区或恒定区序列包含与天然发现的Fc区或恒定链区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。优选地，用于评估相对效应功能的对照分子包含与测试抗体或变体抗体同型/同亚型的Fc区。变体的或改变的Fc区或恒定区包含这样的氨基酸序列，即，其由于至少一个氨基酸变型(例如，翻译后修饰、氨基酸取代、***或缺失)而与天然的重链区序列不同。因此，变体的恒定区可包含一个或多个氨基酸取代、缺失或***，从而导致翻译后修饰，包括例如，改变的糖基化模式。亲代抗体或Fc区是，例如，具有正常效应功能的用于构建具有改变的例如升高的效应功能的恒定区(即，Fc)的变体。
可通过工程化或产生具有变体恒定区、Fc区或重链区的抗体来生成具有改变的(例如，升高的)效应功能的抗体。可使用重组DNA技术和/或细胞培养物和表达条件来产生具有改变的功能和/或活性的抗体。例如，可使用重组DNA技术来工程化区(例如，Fc区或恒定区)中的一个或多个氨基酸取代、缺失或***，以影响包括效应功能在内的抗体功能。作为另一选择，可通过操作宿主细胞和细胞培养物以及产生抗体的条件来实现翻译后修饰的变化，例如，糖基化模式。
本发明的某些实施方案涉及这样的抗αvβ5抗体，即，其包含选自SEQIDNO:3的VHCDR1、SEQIDNO:4的VHCDR2和SEQIDNO:5的VHCDR3的一个或多个(即，1个、2个或3个)重链CDR序列；或选自以下的一个或多个(即，1个、2个或3个)重链替选CDR序列：SEQIDNO:21的VHCDR1、SEQIDNO:24的VHCDR2和SEQIDNO:5的VHCDR3；或SEQIDNO:22的VHCDR1、SEQIDNO:25的VHCDR2和SEQIDNO:5的VHCDR3；或SEQIDNO:23的VHCDR1、SEQIDNO:26的VHCDR2和SEQIDNO:7的VHCDR3的，其中所述抗体还包含变体区，其赋予相对于天然的或亲代的Fc区升高或降低的效应功能。在其它实施方案中，所述抗αvβ5抗体包含所述CDR(或替代的CDR)中的至少两个，并且在其它实施方案中，所述抗体包含所述重链CDR(或替选CDR)序列中的所有三个。这些抗αvβ5抗体抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用，抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用，抑制TGF-β信号转导，抑制TGF-β活化，和/或抑制αvβ5与包含其RGD基序的配体之间的相互作用。
本发明的另一些实施方案涉及这样的抗αvβ5抗体，即，其包含选自SEQIDNO:6的VLCDR1、SEQIDNO:7的VLCDR2和SEQIDNO:8的VLCDR3的一个或多个(即，1个、2个或3个)轻链CDR序列；或选自SEQIDNO:28的VLCDR1、SEQIDNO:29的VLCDR2和SEQIDNO:30的VLCDR3的一个或多个(即，1个、2个或3个)轻链替选CDR序列，所述抗体还包含变体区，其赋予相对于天然的或亲代的Fc区升高或降低的效应功能。在其它实施方案中，所述抗αvβ5抗体包含所述轻链CDR(或替代的CDR)中的至少两个，并且在其它实施方案中，所述抗体包含所述轻链CDR(或替选CDR)序列中的所有三个。这些抗αvβ5抗体抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用，抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用，抑制TGF-β信号转导，抑制TGF-β活化，和/或抑制αvβ5与包含其RGD基序的配体之间的相互作用。
在本发明的另一些实施方案中，所述具有升高或降低的效应功能的抗αvβ5抗体包含SEQIDNO:11的所有三个轻链CDR序列(CDR1、2和3)或所有三个轻链替选CDR，并且包含SEQIDNO:9的所有三个重链CDR序列(CDR1、2和3)或所有三个重链替选CDR。在某些实施方案中，所述具有升高或降低的效应功能的抗αvβ5抗体包含：SEQIDNO:9的一个、两个或三个CDR(或替选CDR)中的三个或更少、两个或更少，或者一个氨基酸取代，以及SEQIDNO:11的一个、两个或三个CDR(或替选CDR)中的三个或更少、两个或更少，或者一个氨基酸取代。这些抗αvβ5抗体抑制αvβ5与玻连蛋白之间的相互作用，抑制αvβ5与TGF-β的LAP之间的相互作用，抑制TGF-β信号转导，抑制TGF-β活化，和/或抑制αvβ5与包含其RGD基序的配体之间的相互作用。
具有改变的糖基化的抗αvβ5抗体
多糖的去除产生了将大大降低与跨物种的Fc受体家族中的所有成员的结构变化。在经糖基化的抗体(包括抗αvβ5抗体)中，附接至Fc二聚物的CH2结构域中的保守N-连接位点的多糖(寡糖)被封闭于CH2结构域之间，这些糖残基与相对的CH2结构域上的特定氨基酸残基接触。不同的糖基化与抗体的不同生物学性质相关(Jefferis和Lund,1997,Chem.Immunol.,65:111-128；Wright和Morrison,1997,TrendsBiotechnol.,15:26-32)。某些特定的多糖形式赋予了潜在有利的生物学性质。多糖缺失使结构域之间的间距发生变化，并且提高了它们相对于彼此的移动性，并且被期望对与Fc受体家族的所有成员的结合都有抑制效果。例如，对多个经糖基化的抗体的体外研究已经证实，CH2多糖的去除改变的Fc结构，使抗体与Fc受体和补体蛋白C1Q的结合大大降低。另一种已知的降低效应功能的方法是抑制产生或去除Fc的CH2结构域中第297位(EU编号)的N-连接多糖(Nose等,1983PNAS80:6632；Leatherbarrow等,1985Mol.Immunol.22:407；Tao等,1989J.Immunol.143:2595；Lund等,1990Mol.Immunol.27:1145；Dorai等,1991Hybridoma10:211；Hand等,1992CancerImmunol.Immunother.35:165；Leader等,1991Immunology72:481；Pound等,1993Mol.Immunol.30:233；Boyd等,1995Mol.Immunol.32:1311)。还已知，不同的多糖形式可很大程度地影响治疗性的性质，包括药代动力学、药效动力学、受体相互作用和组织特异性靶向(Graddis等,2002,CurrPharmBiotechnol.3:285-297)。特别地，对于抗体而言，除了抗体的效应功能(例如，与补体复合物C1的结合以诱导CDC，以及与FcγR受体的结合负责调解ADCC通路)外，寡糖结构还可影响与蛋白酶抗性、抗体的由FcRn受体介导的血清半衰期、吞噬作用和抗体反馈(Nose和Wigzell,1983；Leatherbarrow和Dwek,1983；Leatherbarrow等,1985；Walker等,1989；Carter等,1992,PNAS,89:4285-4289)。
因此，另一种调节抗体效应功能的方法包括改变抗体恒定区的糖基化。改变的糖基化包括例如，糖基化残基数量的减少或增多、糖基化残基的图样或位置的变化，以及糖结构的变化。人IgG上发现的寡糖影响其效应功能的程度(Raju,T.S.BioProcessInternational2003年4月.44-53)；人IgG寡糖的微异质性可影响生物学功能，例如CDC和ADCC、对多种Fc受体的结合以及对C1q蛋白的结合(WrightA.&MorrisonSL.TIBTECH1997,1526-32；Shields等JBiolChem.2001276(9):6591-604；Shields等JBiolChem.2002；277(30):26733-40；Shinkawa等JBiolChem.2003278(5):3466-73；Umana等NatBiotechnol.1999Feb；17(2):176-80)。例如，IgG结合C1q和活化补体级联反应的能力可依赖于位于两个CH2结构域之间的碳水化合物部分(其通常锚定于Asn297处)的存在、不存在或修饰(Ward和Ghetie,TherapeuticImmunology2:77-94(1995))。
可通过标准技术来鉴定包含Fc的多肽(例如，抗体，如IgG抗体)中的糖基化位点。糖基化位点的鉴定可通过实验来进行，或基于序列分析或造模数据。已经描述了共有基序，即，由多种糖基转移酶识别的氨基酸序列。例如，N-连接糖基化基序的共有基序常常为NXT或NXS，其中X可为除脯氨酸以外的任何氨基酸。还已经描述了一些定位潜在的糖基化基序的算法。因此，为了鉴定抗体或包含Fc的片段内潜在的糖基化位点，例如通过使用公共获取数据库(例如，由生物序列分析中心(CenterforBiologicalSequenceAnalysis)提供的网站)(参见用于N-连接糖基化位点的NetNGlyc服务和用于O-连接的糖基化位点的NetOGlyc服务)来检查抗体序列。
体内研究已经证实了无糖基抗体的效应功能的降低。例如，无糖基抗CD8抗体不能耗尽小鼠中带有CD8的细胞(Isaacs,1992J.Immunol.148:3062)，并且无糖基的抗CD3抗体不诱导小鼠或人中的细胞因子释放综合征(Boyd,1995见上文；Friend,1999Transplantation68:1632)。
重要的是，虽然去除CH2结构域的多糖表现出对效应功能具有显著影响，但是抗体的其它功能性质和物理性质保持未受改变。特别地，已经示出，去除多糖对血清半衰期以及对抗体的结合几乎没有影响(Nose,1983见上文；Tao,1989见上文；Dorai,1991见上文；Hand,1992见上文；Hobbs,1992Mol.Immunol.29:949)。
虽然存在对无糖基方法的体内验证，但是存在关于具有无糖基mAb的残余效应功能的报道(参见了，Pound,J.D.等(1993)Mol.Immunol.30(3):233-41；Dorai,H.等,(1991)Hybridoma10(2):211-7)。Armour等示出了FcγRIIa和FcγRIIb蛋白的残余结合(Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-1624；Mol.Immunol.40(2003)585-593)。因此，在一些例子中，效应功能特别是补体活化的进一步降低可对于保证完全消除活性很重要。出于该原因，设想IgG2和IgG4以及G1/G4杂合体的无糖基形式可用于本发明的具有降低的效应功能的方法和抗体组合物中。
可对本发明的抗αvβ5抗体进行修饰或改造，以引发降低的效应功能(与第二αvβ5特异性抗体相比)，同时任选保留Fc部分的其它有价值的属性。
因此，在某些实施方案，本发明涉及具有降低的效应功能的无糖基的抗αvβ5抗体，其特征是，在抗体的Fc部分的CH2结构域中的保守N-连接位点处的修饰。对Fc二聚物的CH2结构域中的保守N-连接位点的修饰可导致无糖基的抗αvβ5抗体。这样的修饰的例子包括：Fc二聚物的CH2结构域中的保守N-连接位点的突变、附接至CH2结构域中的保守N-连接位点的多糖的去除以及对糖基化的阻止。例如，可通过将重链CH2结构域中典型的N-连接Asn位点改变成Gln残基来制造无糖基的抗αvβ5抗体(参见例如，WO05/03175和US2006-0193856)。
在本发明的一个实施方案中，所述修饰包括重链糖基化位点处的阻止该位点处的糖基化的突变。因此，在本发明的一个实施方案中，通过对重链糖基化位点的突变，即，突变N298Q(使用KabatEU编号为N297)来制备无糖基的抗αvβ5抗体，并将其表达于合适的宿主细胞中。例如，可按照来自Amersham-Pharmacia(Piscataway,NJ,USA)的稀有位点诱变试剂盒的制造商建议的方案来实现该突变。
可将经突变的抗体稳定地表达于宿主细胞(NSO或CHO细胞)，然后进行纯化。作为一个例子，可使用蛋白A和凝胶过滤色谱来进行纯化。对本领域技术人员应显而易见的是，还可使用另一些表达和纯化的方法。
在本发明的另一个实施方案中，所述无糖基的抗αvβ5抗体具有降低的效应功能，其中所述抗体或抗体衍生物的Fc部分的CH2结构域中的保守N-连接位点处的修饰包括去除CH2结构域多糖，即，去糖基化。这些无糖基的抗αvβ5抗体可通过常规方法生成，然后进行酶促去糖基化。用于对抗体进行酶促去糖基化的方法是本领域技术人员公知的(Williams,1973；Winkelhake&Nicolson,1976J.BiolChem.251:1074-80.)。
在本发明的另一个实施方案中，可通过使产生抗体的宿主细胞生长于包含例如衣霉素等糖基化抑制剂的培养基中来实现去糖基化(Nose&Wigzell,1983)。即，该修饰为减少或防止所述抗体的Fc部分的CH2结构域中的保守N-连接位点处的糖基化。
在本发明的其它实施方案中，可使用重组X多肽(或包含这样的多肽的细胞或细胞膜)作为生成抗αvβ5抗体或抗体衍生物的抗原，然后可使所述抗体或抗体衍生物去糖基化。
在一些可选实施方案中，可通过Taylor等(WO05/18572和US2007-0048300)中描述的方法来产生无糖基的抗αvβ5抗体或具有降低的糖基化的抗αvβ5抗体。例如，在一个实施方案中，可通过改变第一氨基酸残基(例如，通过取代、***、缺失，或通过化学修饰)来产生无糖基的抗αvβ5抗体，其中所改变的第一氨基酸残基通过位阻或电荷或这二者来抑制第二残基的糖基化。在某些实施方案中，通过氨基酸取代来修饰所述第一氨基酸残基。在其它实施方案中，所述氨基酸取代选自由以下组成的组：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Asn、Gln、Trp、Pro、Ser、Thr、Tyr、Cys、Met、Asp、Glu、Lys、Arg和His。在其它实施方案中，所述氨基酸取代是非传统氨基酸残基。所述第二氨基酸残基可在糖基化基序例如包含氨基酸序列NXT或NXS的N-连接糖基化基序的旁边或在其内部。在一个示例性的实施方案中，所述第一氨基酸残基是氨基酸299，并且所述第二氨基酸残基是氨基酸297，根据Kabat编号。例如，所述第一氨基酸取代可为，T299A、T299N、T299G、T299Y、T299C、T299H、T299E、T299D、T299K、T299R、T299G、T299I、T299L、T299M、T299F、T299P、T299W和T299V，根据Kabat编号。在一些具体实施方案中，所述氨基酸取代是T299C。
还可通过修饰本发明的抗体以使所述抗体包含封闭部分来降低效应功能。示例性的封闭部分包括具有足够的空间体积和/或电荷而使得发生降低的糖基化的部分，例如通过封闭糖苷酶使多肽糖基化的能力来进行。此外或作为另一选择，所述封闭部分可降低效应功能，例如，通过抑制Fc区结合受体或不同蛋白的能力来进行。在一些实施方案中，本发明涉及包含变体Fc区的αvβ5结合蛋白，例如抗αvβ5抗体，所述变体Fc区包含第一氨基酸残基和N-糖基化位点，所述第一氨基酸残基受到侧链化学修饰以达到比未经修饰的第一氨基酸残基升高的空间体积或升高的静电荷，从而降低所述N-糖基化位点处的糖基化水平，或以其它方式改变所所述N-糖基化位点处的糖基。在这些实施方案的某些中，与对照的非变体Fc区相比，所述变体Fc区赋予降低的效应功能。在其它实施方案中，具有增加的空间体积的侧链是选自由以下组成的组的氨基酸残基的侧链：Phe、Trp、His、Glu、Gln、Arg、Lys、Met和Tyr。在其它实施方案中，具有增加的静电荷的侧链化学是选自由Asp、Glu、Lys、Arg和His组成的组的氨基酸残基侧链。
因此，在一个实施方案中，可通过用带电的侧链化学例如D、E、K或R取代T299，来调节糖基化和Fc结合。所得的抗体将具有降低的糖基化，以及因不利的静电相互作用所致的降低的对Fc受体的Fc结合亲和力。
在另一个实施方案中，与它的无糖基化的抗体同类物相比，既被无糖基化又能够形成半胱氨酸加合物的T299C变体抗体可表现出更低的效应功能(例如，FcγRI结合)(参见例如，WO05/18572)。因此，糖基化基序旁边的第一氨基酸的改变可抑制所述抗体在第二氨基酸残基处的糖基化；当所述第一氨基酸是半胱氨酸残基时，所述抗体可表现出甚至进一步降低的效应功能。此外，于其它亚型中的其它无糖基化的影响相比，抑制IgG4亚型的抗体的糖基化可对FcγRI的结合具有更重大的影响。
在其它实施方案中，本发明涉及表现出降低的与一种或多种FcR受体的结合并且任选还表现出升高的或正常的与一种或多种Fc受体和/或补体的结合的具有改变的糖基化的抗αvβ5抗体-例如，与天然的对照抗αvβ5抗体相比，至少维持相同的或相似的与一种或多种Fc受体和/或补体的结合亲和力的具有改变的糖基化的抗体)。例如，与其中Man5GlcNAc2N-多糖结构不是主要的抗αvβ5抗体群体比，具有主要以Man5GlcNAc2N-多糖作为存在的多糖结构的抗αvβ5抗体(例如，其中Man5GlcNAc2N-多糖结构以比该Ig组合物的次主要的多糖结构多至少约5个摩尔百分比的水平存在)可表现出改变的效应功能。具有主要为该多糖结构的抗体表现出降低的与FcγRIIa和FcγRIIb的结合、升高的与FcγRIIIa和FcγRIIIb的结合，以及升高的与C1复合物的C1q亚基的结合(参见US2006-0257399)。当其为主要的多糖结构时，该多糖结构赋予升高的ADCC、升高的CDC、升高的血清半衰期、升高的B细胞的抗体产生，以及降低的巨噬细胞的吞噬作用。
一般而言，糖蛋白上的糖基化结构将根据表达宿主和培养条件而变化(Raju,TS.BioProcessInternational2003年4月.44-53)。这样的差异可导致效应功能和药代动力学的二者的变化(Israel等,Immunology,1996；89(4):573-578；Newkirk等,P.Clin.Exp.,1996；106(2):259-64)。例如，半乳糖基化可根据细胞培养条件而变化，这可根据其特定半乳糖模式而赋予一些免疫球蛋白组合物免疫原性(Patel等,1992.BiochemJ.285:839-845)。由非人哺乳动物细胞产生的糖蛋白的寡糖结构倾向于更多地与人糖蛋白的寡糖结构密切相关。此外，可将蛋白质表达宿主***工程化或选择成表达主要的Ig糖型，或者作为另一选择，蛋白表达宿主***可天然地产生具有主要多糖结构的糖蛋白。产生具有主要糖型的糖蛋白的工程化的蛋白表达宿主***的例子包括基因敲除/突变(Shields等,2002,JBC,277:26733-26740)；基因工程(Umana等,1999,NatureBiotech.,17:176-180)或二者的组合。作为另一选择，某些细胞天然表达主要的糖型--例如，鸡、人和乳牛(Raju等,2000,Glycobiology,10:477-486)。因此，对具有改变的糖基化(例如，主要为一种特定多糖结构)的抗αvβ5抗体或抗体组合物的表达可通过本领域技术人员选择许多表达宿主***中的至少一种来得到。可用于产生本发明的抗αvβ5抗体的蛋白质表达宿主***包括动物、植物、昆虫、细菌细胞等。例如，US2007-0065909、2007-0020725和2005-0170464描述了在细菌细胞中产生无糖基化的免疫球蛋白分子。作为另一个例子，Wright和Morrison在CHO细胞系中产生了缺乏糖基化的抗体(1994JExpMed180:1087-1096)，并且示出，在该细胞系中产生的抗体不能进行补体介导的细胞溶解。本领域中发现了用于产生糖蛋白的表达宿主***的另一些例子包括：CHO细胞：RajuWO99/22764和PrestaWO03/35835；杂交瘤细胞：Trebak等,1999,J.Immunol.Methods,230:59-70；昆虫细胞：Hsu等,1997,JBC,272:9062-970，以及植物细胞：Gerngross等,WO04/74499。就指定的细胞或提取物已经导致指定的基序的糖基化而言，本领域认可的用于确定所述基序是否已经被糖基化的技术是可用的，例如，使用凝胶电泳和/或质谱分析。
例如在US6,350,861和US5,714,350、WO05/18572和WO05/03175中描述了另一些用于改变抗体的糖基化位点的方法；可使用这些方法来产生本发明的具有改变的、降低的或无糖基化的抗αvβ5抗体。
具有降低的效应功能的无糖基抗αvβ5抗体可为包含修饰的抗体或可为可被缀合成包含官能部分的抗体。这样的部分包括封闭性部分(例如，PEG部分、半胱氨酸加合物等)、可检测部分(例如，荧光部分、放射性同位素部分、不透射线部分等,包括诊断性部分)、治疗性部分(例如，细胞毒性剂、消炎剂、免疫调节剂、抗传染剂、抗癌剂、抗神经退行剂、放射性核素等)，和/或结合性部分或诱饵(例如，使抗体预靶向肿瘤，然后结合由互补结合性部分或捕获物以及如上文所述的可检测部分或治疗性部分构成的第二分子)。
适应症
本文描述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段可用于治疗、预防或减轻需要其的受试者(例如，人受试者)中的急性肾损伤的症状或严重程度。这些抗体和抗体片段还可用于预防需要其的受试者中慢性肾疾病的发展。在某些实施方案中，所述抗体和抗体片段可用于在可引起或引起了急性肾损伤的损坏后预防受试者中慢性肾病的发展。此外，本文描述的抗体或其抗原结合片段可用于在需要其的受试者中保护肾免于受到急性或慢性肾损伤的方法中。此外，本文描述的抗体或其抗原结合片段可用于治疗患有可至少部分地归因于药物或化学物质的使用所致的肾机能不全或肾衰竭的患者的方法中。
急性肾损伤通常基于损伤的类型而分为两大类。第一类是缺血性急性肾损伤(或者称为肾灌注不足)，并且第二类是肾毒性急性肾损伤。前者由对肾的受损的血流(肾灌注不足)和氧递送导致；而后者由对肾的毒性损伤导致。这两类损伤都可导致称为急性肾小管坏死(ATN)的二级症状。
缺血性急性肾损伤的最常见因素是血管内容积减小、降低的心输出量、全身性血管扩张和肾血管收缩。血管内容积减小可由出血(例如，手术后、产后或创伤后)；胃肠损失(例如，通过腹泻、呕吐、鼻饲损伤)；肾损失(例如，由利尿剂、渗透性利尿、尿崩症引起)；皮肤和粘膜损失(例如，烧伤、高热)；肾病综合征；硬变；或毛细血管泄漏引起。降低的心输出可由于心原性休克、心包疾病(例如，限制性、狭窄性、堵塞性)、充血性心力衰竭、瓣膜性心脏病、肺病(例如，肺动脉高血压、肺栓塞)或败血症所致。全身性血管扩张可为硬变、过敏或败血症的结果。最后，肾血管收缩可由早期败血症、肝肾综合征、急性高钙血症、药物相关(例如，去甲肾上腺素、加压素、非甾醇消炎药、转换血管紧张素的酶抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂)或放射性造影剂的使用引起。本文描述的抗体或其抗原结合片段可用于治疗或减轻由以上提及任何缺血性急性肾损伤的原因引起的急性肾损伤或任何其它肾损伤的症状或严重程度。此外，本文描述的抗体或其抗原结合片段可用于预防在暴露于以上提及任何缺血性急性肾损伤的原因后的急性肾损伤或任何其它肾损伤的发展。
肾毒性急性肾损伤常常与暴露于肾毒素例如肾毒性药物有关。肾毒性药物的例子包括抗生素(例如，氨基糖苷类例如庆大霉素)、化疗剂(例如，顺铂)、钙调磷酸酶抑制剂(例如，他克莫司、环孢霉素)、头孢菌素类例如先锋霉素、环孢菌素、杀虫剂(例如，百草枯)、环境污染物(例如，三氯乙烯、二氯乙炔)、两性霉素B、puromcyin、氨基核苷(PAN)、放射照相造影剂(例如，醋碘苯酸盐、泛影酸盐、碘达胺、碘格利酸盐、碘酞酸盐、碘羟拉酸盐、甲泛影酸盐、甲泛葡胺、碘海醇、碘帕醇、碘喷托、碘普胺和碘佛醇)、非甾醇消炎剂、抗逆转录病毒剂、免疫抑制剂、肿瘤药物或ACE抑制剂。肾毒素可为例如，创伤性损伤、挤压性损伤、违禁药物、枪伤或重金属。本文描述的抗体或其抗原结合片段可用于治疗或减轻由以上提及任何肾毒性急性肾损伤的原因引起的急性肾损伤或任何其它肾损伤的症状或严重程度。此外，本文描述的抗体或其抗原结合片段可用于预防在暴露于以上提及任何肾毒性急性肾损伤的原因后的急性肾损伤或任何其它肾损伤的发展。
在某些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段可用于预防暴露于例如缺血或肾毒素/肾毒性药物等损伤后的ATN的发展。在某些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段可用于治疗或减轻缺血或暴露于肾毒素/肾毒性药物后的ATN的症状或严重程度。
在某些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段可用于预防缺血或暴露于肾毒素/肾毒性药物后的肾小球过滤的降低。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段可用于预防缺血或暴露于肾毒素/肾毒性药物后的肾小管上皮损伤和/或坏死。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段可用于降低微血管的渗透性、改进血管张力，和/或降低内皮细胞的炎症。在其它实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段可用于在缺血或暴露于肾毒素/肾毒性药物后恢复肾中血流。在其它实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段可用于预防慢性肾衰竭。
本文描述的抗体或其抗原结合片段还可用于治疗或预防由于伴有灌注不足的手术而导致的急性肾损伤。在某些具体的实施方案中，所述手术是心脏手术、大血管手术、大创伤或与治疗枪伤有关的手术。在一个实施方案中，所述心脏手术是冠状动脉旁路移植术(CABG)。在另一个实施方案中，所述心脏手术是瓣膜手术。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段还可用于治疗或预防在器官移植例如肾移植或心移植后的急性肾损伤。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段还可用于治疗或预防在降低的有效动脉容积和肾灌注不足后的急性肾损伤。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段还可用于治疗或预防正在服用干扰膀胱的正常排空的药剂(例如，抗胆碱能药)的受试者中的急性肾损伤。在某些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段还可用于治疗或预防患有输尿管堵塞的受试者中的急性肾损伤。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段还可用于治疗或预防正在服用引起晶尿症的药物的受试者中的急性肾损伤。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段还可用于治疗或预防正在服用引起或导致肌红蛋白尿症的药物的受试者中的急性肾损伤。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段还可用于治疗或预防正在服用引起或导致膀胱炎的药物的受试者中的急性肾损伤。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段还可用于治疗或预防患有良性甲状腺肥大或***癌的受试者中的急性肾损伤。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段还可用于治疗或预防患有肾结石的受试者中的急性肾损伤。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段还可用于治疗或预防患有腹部的恶性病(例如，卵巢癌、结直肠癌)的受试者中的急性肾损伤。
在某些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段还可用于治疗或预防急性肾损伤，其中败血症不引起或导致急性肾损伤。
急性肾损伤通常发生于初始损伤(例如，缺血或肾毒素损伤)后的数小时至数天内。因此，本文描述的抗体或其抗原结合片段可在损伤之前施用，或在损伤(例如本文描述的手术或肾毒素损伤)后1小时至30天内施用(例如，0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、15天、20天、25天、28天或30天)。
可基于例如危险损伤衰竭丧失ESRD(RiskInjuryFailureLossESRD，RIFLE)标准或急性肾损伤网络(AcuteKidneyInjuryNetwork)标准来确定受试者患有急性肾损伤后具有发展急性肾损伤的风险(Bagshaw等,Nephrol.Dial.Transplant.,23(5):1569-1574(2008)；Lopes等,Clin.KidneyJ.,6(1):8-14(2013))。
在某些实施方案中，本公开的方法涉及：测量血清、血浆或尿肌酸酐或血脲氮(BUN)中的一种或多种的水平；测量与健康对照受试者相比的血清或尿嗜中性粒细胞明胶酶相关的载脂蛋白(NGAL)、血清或尿白细胞介素-18(IL-18)、血清或尿半胱氨酸蛋白酶抑制剂C或尿KIM-1的水平，以评估所述受试者是否患有急性肾损伤，或是否具有发展成急性肾损伤的风险。
可在多种动物模型中评估本发明的抗体的效力。急性肾损伤的动物模型包括在例如以下文献中公开的那些：Heyman等,Contrin.Nephrol.,169:286-296(2011)；Heyman等,Exp.Opin.DrugDisc.,4(6):629-641(2009)；Morishita等,Ren.Fail.,33(10):1013-1018(2011)；WeiQ等,Am.J.Physiol.RenalPhysiol.,303(11):F1487-94(2012)。
可通过一些可用的诊断工具来测量治疗效力，包括：体检、血液检验、测量***性血压和毛细血管血压、蛋白尿(例如，白蛋白尿)、微观和宏观血尿、评估血清肌酸酐水平、评估肾小球过滤速率、肾活组织检查的组织学评价、尿白蛋白肌酸酐比率、白蛋白***率、肌酸酐清除率、24小时尿蛋白质分泌和肾成像(例如，MRI、超声)。
药物组合物
可将本文描述的抗αvβ5抗体或其抗原结合片段配制为用于施用至受试者例如以治疗本文描述的疾病的药物组合物。通常来说，药物组合物包含药学可接受载剂。本文所用的“药学可接受载剂”包括任何和所有生理学相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。所述组合物可包含可药用盐，例如，酸加成盐或碱加成盐(参见例如，Berge,S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。
药物配制是一种良好建立的技术，并且还在例如以下文献中有描述：Gennaro(编),Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版，Lippincott,Williams&Wilkins(2000)(ISBN:0683306472)；Ansel等,PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,第7版，LippincottWilliams&WilkinsPublishers(1999)(ISBN:0683305727)；和Kibbe(编),HandbookofPharmaceuticalExcipientsAmericanPharmaceuticalAssociation,第3版(2000)(ISBN:091733096X)。
所述药物组合物可为多种形式。其包括例如，液体、半固体和固体剂型，例如，液体溶液剂(例如，可注射或可灌注溶液剂)、分散剂或混悬剂、片剂、丸剂、粉末剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式可取决于预期的施用和治疗应用的模式。通常来说，本文描述的药剂的组合物是可注射或可灌注溶液的形式。
在一个实施方案中，用赋形剂材料来配制本文描述的抗αvβ5抗体，例如，柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、吐温-80和稳定剂。可以以合适的浓度将其提供于例如缓冲的溶液中，并且可将其储存2℃至8℃下。在一些其它实施方案中，所述组合物的pH介于约5.5至7.5之间(例如，5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5)。
所述药物组合物还可包含降低配制时所述αvβ5抗体或其抗原结合片段的聚集的试剂。聚集降低剂的例子包括选自由以下组成的组中的一种或多种氨基酸：甲硫氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸。可将这些氨基酸添加至所述制剂中，达到约0.5mM至约145mM的浓度(例如，0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM、25mM、50mM、100mM)。所述药物组合物还可包含糖(例如，蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇或木糖醇)和/或张力改良剂(例如，氯化钠、甘露醇或山梨醇)和/或表面活性剂(例如，聚山梨醇酯-20或聚山梨醇酯-80)。
可通过肠胃外模式(例如，静脉内的、皮下、腹膜内或肌内注射)来施用这样的组合物。本文所用短语“肠胃外施用”和“以不经肠胃的方式施用”意为除小肠施用和局部施用以外的施用模式，通常通过注射来进行，并包括但不限于：静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内的注射和灌注。在一个实施方案中，经皮下施用所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段组合物。在一个实施方案中，经静脉内施用所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段组合物。在一个实施方案中，经动脉内施用所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段组合物。
可将所述组合物配制为溶液剂、微乳剂、分散剂、脂质体剂或其它适于以高浓度稳定储存的有序结构。可通过将本文描述的药剂以需要的量按需要与上文列举的成分中的一种或组合一起并入合适的溶剂中，然后过滤灭菌。一般而言，通过将本文描述的药剂并入包含基础分散介质的以及来自以上列举的所需的其它成分的无菌媒介物中，来制备分散剂。在用于制备无菌的可注射溶液剂的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，得到由本文描述的药剂加来自其之前经无菌过滤的溶液的任何附加的期望成分组成的粉末。可例如通过使用包衣(例如卵磷脂)，通过维持在分散剂的情况下所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持溶液剂的适当的流动性。可通过在所述组合物中并入延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶来导致可注射组合物的延长的吸收。
在某些实施方案中，可将所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段与将保护所述化合物免于快速释放的载剂一起制备，例如，受控释放制剂，包括埋植剂和微胶囊化的递送***。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、骨胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多用于制备这样的制剂的方法是被授予专利的，或公知的。参见例如，SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson,编,MarcelDekker,Inc.,NewYork(1978)。
在一个实施方案中，所述药物制剂包含用药学可接受载剂配制的约0.5mg/mL至500mg/mL(例如，0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、250mg/mL、300mg/mL、350mg/mL、400mg/mL、450mg/mL、500mg/mL)浓度的抗αvβ5抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，将所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段配制于无菌的蒸馏水或磷酸盐缓冲盐水中。所述药物制剂的pH介于5.5至7.5之间(例如，5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.3、7.4、7.5)。
施用
可通过多种方法将所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段施用至受试者，例如，需要其的受试者，例如，人受试者。对于许多应用，施用路线是以下中的一种：静脉注射或灌注(IV)、皮下注射(SC)、动脉内、腹膜内(IP)或肌内注射。还可使用吸入递送。还可使用其它肠胃外施用模式。这样的模式的例子包括：动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心脏内、皮内、经气管、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内以及硬膜外和胸骨内注射。在一些情况下，施用可经口施用。
还可根据个体的情况来定制所述抗体或其抗原结合片段的施用路线和/或模式。
可将所述抗体或其抗原结合片段施用为固定的剂量，或以mg/kg计的剂量。还可选择剂量以及降低或避免产生针对抗αvβ5抗体的抗体。调节给药方案以提供期望的应答，例如，治疗性应答或组合的治疗效果。一般而言，可使用所述αvβ5抗体或其抗原结合片段(以及任选第二药剂)的剂量，以给受试者提供生物有效量的药剂。例如，可施用以下范围中的剂量：0.1mg/kg至100mg/kg、0.5mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至100mg/kg、0.5mg/kg至20mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg或1mg/kg至10mg/kg。还可使用其它剂量。在某些实施方案中，对需要用抗αvβ5抗体或其抗原结合片段治疗的受试者施用1mg/kg至30mg/kg剂量的抗体。在一些实施方案中，对需要用抗αvβ5抗体或其抗原结合片段治疗的受试者施用以下剂量的抗体：1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、7mg/kg10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、28mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg或50mg/kg。在一个具体实施方案中，以1mg/kg至3mg/kg的剂量经皮下施用所述抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，以4mg/kg至30mg/kg的剂量经静脉内施用所述抗体或其抗原结合片段。
组合物可包含约1mg/mL至100mg/ml或约10mg/mL至100mg/ml或约50mg/mL至250mg/mL或约100mg/mL至150mg/ml或约100mg/ml至250mg/ml的抗αvβ5抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，组合物中的所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段主要为单体形式，例如，至少约90％、92％、94％、96％、98％、98.5％或99％为单体形式。如例如通过A280nm下的UV检测，某些抗αvβ5抗体或其抗原结合片段组合物可包含小于约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.3％或0.1％的聚集物。如例如通过A280nm下的UV检测，某些抗αvβ5抗体或其抗原结合片段组合物可包含小于约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.3％或0.1％的片段。
本文所用的剂量单元形式或“固定剂量”是指适于作为用于待治疗的受试者的剂量的物理离散单元；每个单元包含经计算以产生期望的治疗效果的预定量的抗αvβ5抗体，联合所需要的药物载剂并且任选联合其它试剂。可给予单一剂量或多个剂量。作为另一选择或此外，可通过持续灌注来施用所述抗体。
可例如以一定时间(治疗路线)内的周期性间隔来施用抗αvβ5抗体或其抗原结合片段的剂量，从而足以覆盖至少2剂、3剂、5剂、10剂或更多剂，例如，每日一次、两次或三次，或者每周约一至六次、七次、八次、九次或十次，或者每周一次、每两周一次(隔周一次)、每三周一次或每月一次。优选在导致AKI的损伤(例如，缺血性或肾毒性)的0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、1天、2天、3天、5天、7天、12天、15天、20天、25天或30天内施用所述剂量。可影响有效治疗受试者所需的剂量和时序的因素包括例如，疾病或病症的严重程度、制剂、递送路线、以前的治疗、总体健康状况和/或受试者的年龄，已经存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的化合物对受试者的治疗可包括单一治疗，或者优选可包括系列治疗。
如果受试者具有发展成本文描述的病症的风险，则可在所述疾病完全开始之前施用所述抗体或其抗原结合片段，例如，作为预防措施。这样的预防性治疗的持续时间可为单一剂的所述抗体或其抗原结合片段，或者所述治疗可继续进行(例如，多剂)。例如，可用所述抗体或其抗原结合片段治疗具有患该病症的风险或倾向于患该病症的受试者，持续数小时、数天、数周或以月计，以预防该病症的发生或爆发。例如，可在损伤的一月、一周、6天、5天、4天、3天、2天、1天、0.5小时、0.4小时、0.3小时、0.2小时、0.1小时之前或基本损伤的同时，对预期暴露于可导致急性肾损伤的损伤的受试者施用本文描述的抗体或其抗原结合片段。
药物组合物可包含“治疗有效量”的本文描述的药剂。可基于所施用药剂的效果或者如果使用了多于一种药剂则基于这些药剂的组合效果来确定这样的有效量。药剂的治疗有效量还可根据例如以下因素变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及所述化合物引发个体中的期望应答的能力，所述期望应答例如，至少一个疾病参数的改善或该病症的至少一种症状的改善。治疗有效量还是这样的量，其中治疗有益效果胜过所述组合物的任何有毒或有害效果。
在某些实施方案中，以以下浓度经皮下施用所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段：约1mg/mL至约500mg/mL(例如、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL，4mg/mL，5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、225mg/mL、250mg/mL、275mg/mL、300mg/mL、325mg/mL、350mg/mL、400mg/mL、450mg/mL)。在一个实施方案中，以50mg/mL的浓度经皮下施用所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，以约1mg/mL至约500mg/mL的浓度经静脉内施用所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段。在一个具体实施方案中，以50mg/mL的浓度经静脉内施用所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段。
可将所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂组合施用至需要其的患者(例如，患有急性肾损伤或具有发展成急性肾损伤的风险的患者)。例如，所述第二治疗剂可为一种或多种以下物质的拮抗剂(例如，抗体、多肽拮抗剂和/或小分子拮抗剂)：其它整联蛋白受体(例如，αvβ5、αvβ6、α1β1、α4β1、αvβ8、αvβ1等)；细胞因子(例如，IL-1α、IL-6、IL-12)；趋化因子(例如，CXCR4、MIP-1α)；或被视为可用于治疗或预防急性肾损伤的化学部分(例如，AP214、THR-184、QPI-1002、US2003/0017150中公开的一种芳族阳离子肽)。在某些实施方案中，所述第二治疗剂是抗凋亡/坏死剂(例如，半胱天冬酶抑制剂(例如，非选择性半胱天冬酶抑制剂、选择性半胱天冬酶3和7抑制剂、选择性半胱天冬酶1抑制剂)、二甲胺四环素、鸟苷、皮斐松-α、聚ADP-核糖聚合酶抑制剂(PARP)抑制剂)；消炎剂(例如，鞘氨醇1磷酸盐类似物、腺苷2A激动剂、α-MSH、IL-10、贝特类药物、PPAR-γ激动剂、二甲胺四环素、活化的蛋白C、iNOS抑制剂)；抗败血症剂(例如，胰岛素、活化的蛋白C、丙酮酸乙酯)；生长因子(例如，重组***、肝细胞生长因子)；血管扩张剂(例如，一氧化碳释放化合物和胆红素内皮素拮抗剂、非诺多泮和ANP)；自由基清除剂(例如，去铁胺)；或化合物例如，嗜中性粒细胞明胶酶相关的载脂蛋白、IL-6、C5a拮抗剂、IL-10和刺激α-黑素细胞的激素。
所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段和所述第二治疗剂可同时或序贯施用。在某些实施方案中，所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段和所述第二治疗剂可各以亚治疗剂量或治疗剂量来施用。
用于治疗的装置和试剂盒
可用医疗装置来施用包含所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段的药物组合物。可将所述装置设计成具有例如便携性、室温储存和容易使用的特征，以使其可用于紧急状况，例如，在没有医疗工具或和其它医疗设备的情况下由未受训练的受试者或由本领域的应急人员来使用。所述装置可包含例如，一种或多种用于储存包含抗αvβ5抗体或其抗原结合片段的药物制备物的壳体，并且可配置成递送一个或多个单元剂量的所述抗体。还可将所述装置配置成施用第二治疗剂，作为还包含所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段的单一的药物组合物，或作为两种分离的药物组合物。
可用注射器来施用所述药物组合物。还可用无针的皮下注射装置来施用所述药物组合物，例如US5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。公知的埋植剂和模块的例子包括：US4,487,603，其公开了一种用于以受控的速率分散药物的可埋植的微灌注泵；US4,486,194，其公开了一种用于经皮肤施用药剂的治疗装置；US4,447,233，其公开了一种用于以精确的灌注速率递送药物的药物灌注泵；US4,447,224，其公开了一种用于连续药物递送的可变流可埋植灌注装置；US4,439,196，其公开了一种具有多室隔区的渗透性药物递送***；以及US4,475,196，其公开可一种渗透性药物递送***。许多其它装置、埋植剂、递送***和模块也是已知的。
可将抗αvβ5抗体或其抗原结合片段提供于试剂盒中。在一个实施方案中，所述试剂盒包括(a)装有包含抗αvβ5抗体的组合物的容器，以及任选地(b)信息材料。所述信息材料可为与本文描述的方法或所述药剂用于治疗益处的用途有关的描述性材料、指导性材料、营销材料或其它材料。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包括用于治疗或预防急性肾损伤的第二治疗剂。例如，所述试剂盒包括装有包含所述抗αvβ5抗体的组合物的第一容器，以及装有所述第二治疗剂的第二容器。
所述试剂盒的所述信息材料在其形式上没有限制。在一个实施方案中，所述信息材料可包含关于所述化合物的生产、所述化合物的分子量、浓度、有效日期、批次或生产地点的信息等。在一个实施方案中，所述信息材料涉及施用所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段的方法，例如，以合适的剂量、剂型或施用方式(例如，本文描述的剂量、剂型或施用方式)来施用，以治疗患有本文描述的免疫病症或具有所述病症的风险的受试者。所述信息还可以以多种格式来提供，包括打印的文本、计算机可读材料、视频记录或音频记录，或提供了关联互联网上的大量材料的链接或网址的信息。
除了所述抗体外，所述试剂盒中的组合物还可包含其它成分，例如，溶剂或缓冲剂、稳定剂，或防腐剂。可以以任何形式提供所述抗体，例如，液体、干燥或冻干形式，优选为基本纯的和/或无菌的。当所述药剂提供于液体溶液中时，所述液体溶液优选为水性溶液。在某些实施方案中，所述液体溶液中的所述抗体或其抗原结合片段为约25mg/mL至约250mg/mL(例如，40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、75mg/mL、85mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、200mg/mL)的浓度。当所述抗体或抗原结合片段提供为冻干制品时，所述抗体或抗原结合片段为约75mg/小瓶至约200mg/小瓶(例如，100mg/小瓶、108.5mg/小瓶、125mg/小瓶、150mg/小瓶)。一般通过添加合适的溶剂来重构冻干粉末。所述试剂盒中可任选提供溶剂，例如，无菌水或缓冲剂(例如，PBS)。在某些实施方案中，所述冻干制品为108.5mg/小瓶，并且以75mg/mL的浓度重构于液体溶液中。
所述试剂盒可包括一个或多个用于包含所述药剂的一种或多种组合物的容器。在一些实施方案中，所述试剂盒包括用于所述组合物和信息材料的分离的容器、分割器或隔区。例如，可将所述组合物装在瓶子、小瓶或注射器中，并且可将所述信息材料装在塑料套或袋子中。在其它实施方案中，将所述药剂的分离的元件装在单一的未分开的容器中。例如，可将所述组合物装在瓶子、小瓶或注射器中，其上贴有标签形式的信息材料。在一些实施方案中，所述试剂盒包括多个单个的容器，每个容器包含一个或多个药剂单元剂型(例如，本文描述的剂型)。所述容器可装有组合单元剂量，例如，包含所述抗αvβ5抗体或其抗原结合片段以及所述第二药剂二者的单元，例如，以期望的比率。例如，所述试剂盒包括多个注射器、安瓿、箔包、泡罩包或医疗装置，例如，每一个都装有单一的组合物单元剂量。所述试剂盒的容器可为气密的、防水的(例如，不透潮湿或蒸发的变化形式)，和/或不透光的。
所述试剂盒任选地包括适用于施用所述组合物的装置，例如，注射器或其它合适的递送装置。所述装置可提供成预装了所述药剂中的一种或两种，或者可为空的，但适于进行装载。
实施例
提供了以下实施例以更好地描述所要求的发明，并且这些实施例不应被解释为对本发明的范围的限制。对所提及的具体材料而言，其仅出于举例说明的目的，而不意图限制本发明。本领域技术人员可在不使用创造性能力并且不脱离本发明的范围的情况下开发出相当的工具或反应物。
实施例1：抗整联蛋白αvβ5抗体在大鼠单侧缺血夹闭模型的效力
目的：
在释放夹闭前18小时和释放夹闭后30小时经皮下注射施用后，确定ALULA在大鼠肾单侧缺血夹闭模型中的剂量应答效力。
单侧夹闭缺血模型方案
用5％的异氟烷/O2混合物麻醉动物，并用1％至2％的该混合物维持麻醉状态。使用诱导室来进行诱导，并且在手术期间使用环封式麻醉。用剃刀剃掉腹部的毛，并用无菌的肥皂和水洗涤，用毛巾擦干，并用必妥碘擦拭。将动物放置于无菌的一次性吸收毛巾上，其下为由直肠温度计恒温控制的暖化垫。持续监视动物的脉冲、血氧定量、呼吸速率和血压。使用3cm的中线切口打开腹部。使每个肾分开，并使用无菌的棉签将肾动脉和静脉周围的脂肪和***切离。移除右肾，并缝扎该肾的动脉和静脉。
通过使用无创性夹钳在每个肾基部夹闭该肾的动脉和静脉保持30分钟来起始左肾的缺血。对于假手术，如上文来分离肾，但是不夹闭。在缺血期间，用饱含无菌盐水的纱布海绵覆盖切口。
在缺血时期结束时，移除夹钳，并观察肾以确保快速重建血流。通过将2cc无菌盐水引入腹腔中来给动物补充水分。用3-0线缝合肌肉层；用手术型3-0线缝合皮肤。
在夹闭前18小时以及然后在夹闭后30小时，通过皮下注射来施用300μl注射体积的ALULA抗体或对照抗体(同型阴性mAB-1E6)。将以下ALULA剂量用于研究I：10mg/kg/体重；3mg/kg/体重；和1mg/kg/体重。将以下ALULA剂量用于研究II：10mg/kg/体重；3mg/kg/体重；1mg/kg/体重；0.3mg/kg/体重；和0.1mg/kg/体重。
在手术后0小时、24小时和72小时测量血清肌酸酐，并将结果报道为mg/分升。
动物：
种/株系：SpragueDawley大鼠
来源：HarlanLaboratories
P.O.Box29176
Indianapolis,Indiana46229-0176
USA
饮食：给动物提供自由采食的市售啮齿类食物，以及自由获得饮水。
环境：(i)适应环境至少5天。
(ii)将所有动物关在贯穿整个培养期间具有环境控制的饲养条件的限制接近的设施中，并且根据批准的标准操作规程(SOP)来维持这些动物。
取血样
在研究开始时，取0.15mL静脉血样品用于基线肌酸酐测量，并在手术后0小时、24小时和72小时取静脉血样品用于病理学血清肌酸酐水平评价。
研究终止
手术后72小时，终止研究，并用戊巴比妥过剂量来麻醉大鼠，然后进行颈脱位。
组织收集
在安乐死后，收集每个个体大鼠的左肾，并切成2个纵向部分。将一个部分固定于10％的缓冲***中，并根据病理形态学评估的标准程序进行处理用于石蜡包埋。将每个肾的第二部分立即冷冻于液氮中。
肌酸酐测量
在基线以及在夹闭后第1、2和3天测量所有大鼠的血清肌酸酐。取0.15ml静脉血样品，并离心。移除血清，储存于+4℃下，并储存用于分析。在来自BeckmanInc的肌酸酐分析仪2(CreatinineAnalyzer2)上测量肌酸酐浓度。用已知对照来标准化机器，并使用苦味酸反应来运行样品。
病理形态学检查方法
根据标准程序处理肾组织样品以用于石蜡包埋，并且制备五微米切片，并将所述切片固定在显微镜玻片上。用苏木精-伊红对切片进行染色。
对玻片进行随机编号，以使病理学家不知晓动物治疗。
分别评估肾皮质和髓质的三种病理形态学特征：肾小管坏死、肾小管扩张以及存在肾小管“脱落物”(管腔内的坏死性碎屑)。根据已建立的评分***来进行病理学变化的分级(K.J.Kelly等,J.Clin.Invest.,108:1291–1298(2001)；WeiQ.等,AmJNephrol.,25(5):491-9(2005))：
0级＝无病理学变化
1级＝特征涉及1％至10％的面积
2级＝特征涉及10％至25％的面积
3级＝特征涉及25％至75％的面积
4级＝特征涉及多于75％的面积
结果
来自研究I的基线、手术后的24小时、48小时和72小时的肌酸酐测量(以mg/dL计)概括于以下的表中。未治疗的缺血大鼠在24小时的2.5至3.0的值是常见的。该模型具有快速的恢复期，使得难以在48至72小时后的时刻实现统计学显著性。
组1：抗体：同型阴性mAb-1E6；剂量：10mg/kg/BW
大鼠 BW g 基线 BW g 24h BW g 48h BW g 72h
1 310 0.5 291 2.8 284 1.6 279 1.6
2 309 0.3 288 3.1 272 1.9 275 1.3
3 316 0.5 307 3.9 289 4.6 275 4.1
4 309 0.5 301 1.8 292 1.4 282 0.9
5 315 0.5 310 3.8 289 3.0 285 2.9
6 321 0.4 311 3.4 298 2.9 301 2.4
平均值 313 0.4 301 3.1 287 2.5 282 2.2
组2：抗体：ALULA；剂量：10mg/kg/BW
大鼠 BW g 基线 BW g 24h BW g 48h BW g 72h
1 310 0.4 293 2.3 279 1.7 280 1.3
2 315 0.5 303 1.6 291 1.2 296 0.8
3 313 0.3 285 1.8 282 1.6 278 1.1
4 318 0.4 304 0.8 304 0.7 304 0.8
5 312 0.4 309 1.0 304 0.8 308 0.7
6 315 0.5 295 0.7 293 0.8 293 0.7
平均值 313 0.4 298 1.3 292 1.1 293 0.9
组3：抗体：ALULA；剂量：3mg/kg/BW
大鼠 BW g 基线 BW g 24h BW g 48h BW g 72h
1 315 0.5 291 1.3 291 0.7 289 0.7
2 320 0.5 286 1.7 287 1.1 287 0.9
3 307 0.4 278 1.4 280 0.6 281 0.8
4 318 0.3 299 1.3 288 0.9 290 0.5
5 316 0.5 292 1.3 287 0.8 293 0.8
6 320 0.2 316 1.0 310 1.1 313 0.8
平均值 316 0.4 293 1.3 290 0.8 292 0.7
组4：抗体：ALULA；剂量：1mg/kg/BW
大鼠 BW g 基线 BW g 24h BW g 48h BW g 72h
1 311 0.3 287 1.4 290 1.0 294 0.7
2 314 0.4 296 1.2 293 0.9 295 0.7
3 306 0.5 283 1.5 277 1.0 277 0.9
4 316 0.5 285 1.5 278 1.1 282 1.0
5 313 0.3 285 1.1 286 0.8 288 0.6
6 314 0.5 290 1.3 293 1.0 293 0.9
平均值 312 0.4 287 1.3 286 0.9 288 0.8
来自研究II的基线、手术后的24小时、48小时和72小时的肌酸酐测量(以mg/dL计)概括于以下的表中。
组1：抗体：同型阴性mAb-1E6；剂量：3mg/kg/BW
大鼠 BW g 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 329 0.5 310 2.5 301 1.5 297 1.1
2 339 0.5 328 3.0 317 1.7 312 1.0
3 339 0.5 326 2.1 319 1.5 309 1.4
4 334 0.3 321 3.3 308 1.9 302 1.5
5 341 0.3 340 2.5 333 1.5 331 1.3
平均值 336 0.4 325 2.6 315 1.6 310 1.2
组2：抗体：ALULA；剂量：3mg/kg/BW
大鼠 BW g 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 316 0.4 296 0.9 289 0.9 286 0.9
2 331 0.4 311 1.3 307 1.0 303 0.6
3 336 0.4 316 1.3 309 1.3 305 0.7
4 340 0.3 338 0.9 333 0.6 329 0.4
5 342 0.3 336 1.0 335 0.9 335 0.8
平均值 333 0.3 319 1.0 314 0.9 311 0.6
组3：抗体：ALULA；剂量：1mg/kg/BW
大鼠 BW g 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 322 0.4 295 0.8 293 0.7 293 0.5
2 330 0.4 310 1.6 302 0.8 311 1.0
3 337 0.4 317 1.6 309 0.6 307 0.6
4 340 0.4 313 0.8 306 0.5 305 0.4
5 336 0.4 328 2.1 323 1.8 321 1.4
平均值 333 0.4 312 1.3 306 0.8 307 0.7
组4：抗体：ALULA；剂量：0.3mg/kg/BW
大鼠 BW g 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 331 0.3 319 2.7 308 2.3 301 1.4
2 337 0.4 316 1.2 311 1.1 311 0.5
3 334 0.5 315 1.4 305 0.8 301 0.8
4 337 0.5 309 0.9 309 0.8 308 0.7
5 338 0.3 328 0.9 316 0.7 315 0.6
平均值 335 0.4 317 1.4 309 1.1 307 0.8
组5：抗体：ALULA；剂量：0.1mg/kg/BW
大鼠 BWg 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 339 0.5 317 2.9 306 1.8 302 1.4
2 340 0.4 321 1.3 318 0.7 316 0.5
3 335 0.4 325 1.2 320 0.9 318 0.8
4 338 0.4 322 2.4 308 1.5 306 0.7
5 337 0.4 318 1.3 313 0.8 307 0.7
平均值 337 0.4 320 1.8 313 1.1 309 0.8
来自研究I和研究II的数据示出，与对照抗体相比，ALULA降低肌酸酐水平，即使在最低剂量下亦如此。
实施例2：损伤前单次施用抗整联蛋白αvβ5抗体在大鼠单侧缺血夹闭 模型的效力
目的
为了建立在夹闭之前18小时、12小时或6小时进行一次皮下注射后单克隆抗αvβ5抗体ALULA在大鼠肾单侧缺血夹闭模型中的剂量应答效力。
方法
单侧夹闭缺血模型方案
用5％的异氟烷/O2混合物麻醉动物，并用1％至2％的该混合物维持麻醉状态。使用诱导室来进行诱导，并且在手术期间使用环封式麻醉。用剃刀剃掉腹部的毛，并用无菌的肥皂和水洗涤，用毛巾擦干，并用必妥碘擦拭。将动物放置于无菌的一次性吸收毛巾上，其下为由直肠温度计恒温控制的暖化垫。持续监视动物的脉冲、血氧定量、呼吸速率和血压。使用3cm的中线切口打开腹部。使每个肾分开，并使用无菌的棉签将肾动脉和静脉周围的脂肪和***切离。移除右肾，并缝扎该肾的动脉和静脉。
在夹闭前18小时、12小时或6小时，通过皮下注射来施用300μl注射体积的ALULA抗体或对照抗体(同型阴性mAB-1E6)。在该研究中，使用3mg/kg/体重剂量的ALULA和对照抗体。
通过使用无创性夹钳在每个肾基部夹闭该肾的动脉和静脉保持30分钟来起始左肾的缺血。对于假手术，如上文来分离肾，但是不夹闭。在缺血期间，用饱含无菌盐水的纱布海绵覆盖切口。
在缺血时期结束时，移除夹钳，并观察肾以确保快速重建血流。通过将2cc无菌盐水引入腹腔中来给动物补充水分。用3-0线缝合肌肉层；用手术型3-0线缝合皮肤。
在手术后0小时、24小时、48小时和72小时测量血清肌酸酐，并将其报道为mg/分升。
动物：
种/株系：SpragueDawley大鼠
来源：HarlanLaboratories
P.O.Box29176
Indianapolis,Indiana46229-0176
USA
饮食：给动物提供自由采食的市售啮齿类食物以及自由获得饮水。
环境：(i)适应环境至少5天。
(ii)将所有动物关在贯穿整个培养期间具有环境控制的饲养条件的限制接近的设施中，并且根据批准的标准操作规程(SOP)来维持这些动物。
取血样
在研究开始时，取0.15mL静脉血样品用于基线肌酸酐测量，并在手术后0小时、24小时、48小时和72小时取静脉血样品用于病理学血清肌酸酐水平评价。
研究终止
手术后72小时，终止研究，并用戊巴比妥过剂量来麻醉大鼠，然后进行颈脱位。
肌酸酐测量
在基线以及在夹闭后第1、2和3天测量所有大鼠的血清肌酸酐。取0.15ml静脉血样品，并离心。移除血清，储存于+4℃下，并储存用于分析。在来自BeckmanInc的肌酸酐分析仪2(CreatinineAnalyzer2)上测量肌酸酐浓度。用已知对照来标准化机器，并使用苦味酸反应来运行样品。
结果
来自该研究的基线、手术后的24小时、48小时和72小时的肌酸酐测量(以mg/dL计)概括于以下的表中。未治疗的缺血大鼠在24小时的2.5至3.0的值是常见的。该模型具有快速的恢复期，使得难以在48至72小时后的时刻实现统计学显著性。
组1：抗体：mAb-1E6；剂量：3mg/kg/BW；施用：夹闭前18小时
大鼠 BWg 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 272 0.5 251 2.7 249 2.3 252 1.8
2 274 0.4 259 3.4 250 4.9 死亡 死亡
3 278 0.4 268 2.3 250 1.9 246 1.5
4 267 0.5 250 2.4 241 1.8 240 1.1
5 299 0.3 285 2.8 269 2.5 263 2.4
6 291 0.3 282 2.6 265 2.1 262 1.9
平均值 280 0.4 265 2.7 254 2.5 252 1.7
组2：抗体：ALULA；剂量：3mg/kg/BW；施用：夹闭前18小时
大鼠 BWg 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 269 0.4 252 1.0 252 0.8 250 0.7
2 280 0.5 252 1.2 246 0.7 253 0.8
3 273 0.3 265 2.5 250 2.3 243 2.0
4 265 0.4 247 1.5 240 1.2 243 0.7
5 292 0.4 270 1.1 269 1.3 268 0.7
6 286 0.3 269 1.0 266 0.8 266 0.6
平均值 277 0.3 259 1.3 253 1.1 253 0.9
组3：抗体：ALULA；剂量：3mg/kg/BW；施用：夹闭前12小时
大鼠 BWg 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 271 0.5 255 1.3 246 0.9 248 0.8
2 266 0.4 246 1.5 239 1.1 236 0.9
3 283 0.5 264 1.2 258 1.0 259 0.8
4 269 0.4 257 2.8 243 2.1 237 1.7
5 298 0.5 281 1.2 276 0.9 281 0.7
6 288 0.3 280 1.2 275 0.8 275 0.8
平均值 279 0.4 263 1.5 256 1.1 256 0.9
组4：抗体：ALULA；剂量：3mg/kg/BW；施用：夹闭前6小时
大鼠 BWg 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 261 0.4 248 1.8 239 1.0 246 0.9
2 255 0.4 240 1.2 237 0.9 241 0.7
3 274 0.4 259 2.2 252 1.9 251 1.5
4 276 0.4 269 1.9 252 1.3 244 1.1
5 302 0.4 266 1.0 265 0.7 266 0.6
6 299 0.4 288 1.1 280 0.8 275 0.6
平均值 277 0.4 261 1.5 254 1.1 253 0.9
这些数据示出，当在损伤前施用仅一剂所述抗体时，ALULA即降低肌酸酐水平(与对照抗体相比)。
实施例3：损伤后单次施用抗整联蛋白αvβ5抗体在大鼠单侧缺血夹闭 模型中的效力
目的
为了建立在释放夹闭后12小时、8小时或4小时进行一次皮下注射后单克隆抗αvβ5抗体ALULA在大鼠肾单侧缺血夹闭模型中的剂量应答效力。
方法
单侧夹闭缺血模型方案
用5％的异氟烷/O2混合物麻醉动物，并用1-2％的该混合物维持麻醉状态。使用诱导室来进行诱导，并且在手术期间使用环封式麻醉。用剃刀剃掉腹部的毛，并用无菌的肥皂和水洗涤，用毛巾擦干，并用必妥碘擦拭。将动物放置于无菌的一次性吸收毛巾上，其下为由直肠温度计恒温控制的暖化垫。持续监视动物的脉冲、血氧定量、呼吸速率和血压。使用3cm的中线切口打开腹部。使每个肾分开，并使用无菌的棉签将肾动脉和静脉周围的脂肪和***切离。移除右肾，并缝扎该肾的动脉和静脉。
通过使用无创性夹钳在每个肾基部夹闭该肾的动脉和静脉保持30分钟来起始左肾的缺血。对于假手术，如上文来分离肾，但是不夹闭。在缺血期间，用饱含无菌盐水的纱布海绵覆盖切口。
在缺血时期结束时，移除夹钳，并观察肾以确保快速重建血流。通过将2cc无菌盐水引入腹腔中来给动物补充水分。用3-0线缝合肌肉层；用手术型3-0线缝合皮肤。
在释放夹闭后12小时、8小时或4小时，通过皮下注射来施用300μl注射体积的ALULA抗体或对照抗体(同型阴性mAB-1E6)。在该研究中，使用3mg/kg/体重剂量的ALULA和对照抗体。
在手术后0小时、24小时、48小时和72小时测量血清肌酸酐，并将其报道为mg/分升。
动物：
种/株系：SpragueDawley大鼠
来源：HarlanLaboratories
P.O.Box29176
Indianapolis,Indiana46229-0176
USA
饮食：给动物提供自由采食的市售啮齿类食物以及自由获得饮水。
环境：(i)适应环境至少5天。
(ii)将所有动物关在贯穿整个培养期间具有环境控制的饲养条件的限制接近的设施中，并且根据批准的标准操作规程(SOP)来维持这些动物。
取血样
在研究开始时，取0.15mL静脉血样品用于基线肌酸酐测量，并在手术后0小时、24小时、48小时和72小时取静脉血样品用于病理学血清肌酸酐水平评价。
研究终止
手术后72小时，终止研究，并用戊巴比妥过剂量来麻醉大鼠，然后进行颈脱位。
肌酸酐测量
在基线以及在夹闭后1、2和3天测量所有大鼠的血清肌酸酐。取0.15ml静脉血样品，并离心。移除血清，储存于+4℃下，并储存用于分析。在来自BeckmanInc的肌酸酐分析仪2(CreatinineAnalyzer2)上测量肌酸酐浓度。用已知对照来标准化机器，并使用苦味酸反应来运行样品。
结果
来自该研究的基线以及手术后的24小时、48小时和72小时的肌酸酐测量(以mg/dL计)概括于以下的表中。未治疗的缺血大鼠在24小时的2.5至3.0的值是常见的。该模型具有快速的恢复期，使得难以在48至72小时后的时刻实现统计学显著性。
组1：抗体：mAb-1E6；剂量：3mg/kg/BW；施用：释放夹闭后12小时
大鼠 BWg 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 283 0.3 265 3.9 255 3.9 251 3.2
2 305 0.5 287 3.4 270 3.4 270 2.0
3 297 0.5 274 2.4 264 2.2 256 1.8
4 314 0.5 301 3.7 284 3.3 278 2.1
5 324 0.4 306 3.6 301 3.4 295 2.3
6 310 0.5 286 2.1 276 1.9 276 1.3
平均值 305 0.4 286 3.1 275 3.0 271 2.1
组2：抗体：ALULA；剂量：3mg/kg/BW；施用：释放夹闭后12小时
大鼠 BWg 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 296 0.4 281 1.4 277 0.8 270 0.7
2 297 0.4 272 1.5 272 0.8 276 0.7
3 304 0.5 284 2.5 270 1.8 268 1.3
4 311 0.5 288 1.2 286 1.1 284 1.0
5 324 0.4 297 2.4 294 1.7 291 1.3
6 310 0.4 285 1.3 285 0.8 288 0.7
平均值 307 0.4 284 1.7 280 1.1 279 0.9
组3：抗体：ALULA；剂量：3mg/kg/BW；施用：释放夹闭后8小时
大鼠 BWg 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 307 0.5 292 3.7 282 3.4 268 2.4
2 284 0.4 261 1.9 262 1.7 266 1.3
3 304 0.5 289 3.1 281 1.9 278 1.1
大鼠 BWg 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
4 304 0.5 297 1.8 291 1.8 293 0.9
5 334 0.4 319 3.3 314 2.1 308 1.7
6 326 0.5 294 1.5 299 1.1 293 0.8
平均值 306 0.4 292 2.5 288 2.0 284 1.3
组4：抗体：ALULA；剂量：3mg/kg/BW；施用：释放夹闭后4小时
大鼠 BWg 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 281 0.5 256 2.1 255 1.8 255 1.7
2 269 0.4 258 1.9 238 1.6 246 1.3
3 300 0.5 289 3.1 275 3.3 265 2.7
4 299 0.4 276 3.2 251 2.9 250 2.1
5 301 0.5 288 2.3 279 1.9 272 1.8
6 306 0.5 291 1.8 285 1.2 278 1.1
平均值 292 0.4 276 2.4 263 2.1 261 1.7
这些数据示出，当在损伤后施用仅一剂所述抗体时，ALULA即出乎意料地降低肌酸酐水平(与对照抗体相比)。
实施例4：ALULA通过夹闭前治疗时程分析在治疗大鼠单侧缺血夹闭 模型的肾缺血中的效力
目的：
为了评价单克隆抗体ALULA在皮下(SQ)注射后在大鼠肾单侧缺血夹闭模型中的效力，在夹闭前6小时施用一次ALULA或同型对照mAb，并在夹闭后24小时和72小时处死动物。
方法：
该研究中使用的方法基本与实施例3中使用的方法相同。
研究设计：
在夹闭前6小时，通过皮下注射施用300μl注射体积的ALULA抗体或对照抗体。在研究开始时，取0.15mL静脉血样品用于基线肌酸酐测量，并在手术后24小时、48小时和72小时取静脉血样品用于病理学血清肌酸酐水平评价。
结果：
来自该研究的基线、手术后的24小时、48小时和72小时的肌酸酐测量(以mg/dL计)概括于以下的表中。未治疗的缺血大鼠在24小时的2.5至3.0的值是常见的。
组1：抗体：同型阴性mAb-IgG2b；剂量：3mg/kg/BW
大鼠 BWg 基线 BWg 24小时
1 268 0.3 248 2.5
2 262 0.4 258 3.4
3 260 0.5 244 2.4
4 256 0.5 238 2.4
5 260 0.5 241 2.2
6 251 0.3 237 2.4
平均值 259 0.4 244 2.5
组2：抗体：抗αvβ5mAb，ALULA；剂量：3mg/kg/BW
大鼠 BWg 基线 BWg 24小时
1 255 0.3 242 1.4
2 263 0.5 240 1.2
3 255 0.5 238 1.1
4 266 0.4 251 1.2
5 262 0.4 248 1.7
6 260 0.4 239 1.1
平均值 260 0.4 243 1.2
组3：抗体：同型阴性mAb-IgG2b；剂量：3mg/kg/BW
大鼠 BWg 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 267 0.4 251 2.8 241 2.2 238 1.5
2 258 0.3 240 2.6 239 1.7 239 1.1
3 261 0.5 241 3.3 238 2.6 233 1.3
4 257 0.4 243 3.9 234 3.2 233 2.7
5 256 0.5 239 2.5 243 1.8 241 1.2
6 248 0.5 237 2.2 235 1.6 234 1.1
平均值 257 0.4 241 2.8 238 2.1 236 1.4
组4：抗体：抗αvβ5mAb，ALULA；剂量：3mg/kg/BW
大鼠 BWg 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 243 0.3 241 1.3 239 1.0 236 0.7
2 252 0.4 246 1.5 241 0.9 239 0.6
3 262 0.4 242 1.4 236 0.9 232 0.7
4 252 0.4 237 1.9 235 1.3 233 1.0
5 252 0.5 241 1.5 240 0.8 238 0.6
6 263 0.4 260 1.2 258 0.9 257 0.5
平均值 254 0.4 244 1.4 241 0.9 239 0.6
这些数据示出，当在损伤前6小时施用仅一剂所述抗体时，ALULA即早至损伤后24小时降低肌酸酐水平(与对照抗体相比)。
实施例5：通过夹闭前治疗，不同Fc版本的人源化ALULA在大鼠单 侧缺血模型中预防肾缺血的效力
目的：
该研究测试了与鼠科ALULAmAb(鼠科IgG2b)或同型对照mAb相比，在释放夹闭前6小时进行皮下(SQ)注射施用后，表达为具有两种不同的鼠科Fc尾(IgG2a或无糖基IgG1)的嵌合mAb的人源化ALULA(含有鼠科ALULA的所有六个CDR)在大鼠肾单侧缺血夹闭模型中的效力。该研究比较了所述人源化ALULA无糖基IgG1mAb与含有鼠科IgG2aFc尾的人源化ALULA抗体(预期鼠科IgG2aFc具有大鼠中的完全效应功能)的活性。将原始的鼠科ALULA纳入作为对照。
方法：
该研究中使用的方法基本与实施例3中使用的那些方法相同。
研究设计：
研究设计：
在夹闭前6小时，通过皮下注射来施用300μl注射体积的ALULA抗体或对照抗体。在研究开始时，取0.15mL静脉血样品用于基线肌酸酐测量，并在手术后24小时、48小时和72小时取静脉血样品用于病理学血清肌酸酐水平评价。
结果：
来自该研究的基线、手术后的24小时、48小时和72小时的肌酸酐测量(以mg/dL计)概括于以下的表中。未治疗的缺血大鼠中在24小时的2.5至3.0的值是常见的。
组1：抗体：同型阴性mAb-IgG2b；剂量：1mg/kg/BW(夹闭前6小时)。
大鼠 BWg 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 284 0.4 261 2.7 252 1.3 250 0.5
2 272 0.4 254 3.0 244 1.1 239 0.8
3 279 0.4 260 4.0 243 2.1 234 1.6
4 273 0.5 265 3.5 251 2.3 239 1.9
5 288 0.4 274 2.5 269 1.1 264 0.8
6 277 0.5 270 4.8 261 2.4 250 1.8
平均值 278 0.4 264 3.4 253 1.7 246 1.2
组2：抗体：ALULAIgG2b；剂量：1mg/kg/BW(夹闭前6小时)。
大鼠 BWg 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 277 0.4 260 2.3 246 2.0 246 1.6
2 276 0.5 264 1.5 254 1.0 245 0.6
3 290 0.5 271 1.7 260 0.8 259 0.8
4 271 0.4 257 1.9 247 1.5 243 1.0
5 287 0.4 264 1.2 264 0.5 263 0.5
6 276 0.4 264 1.5 254 1.3 252 0.9
平均值 279 0.4 263 1.6 254 1.1 251 0.9
组3：抗体：嵌合人源化ALULA无糖基IgG1；剂量：1mg/kg/BW(夹闭前6小时)。
大鼠 BWg 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 281 0.5 255 1.2 248 0.6 251 0.6
2 278 0.4 265 1.3 257 0.8 258 0.6
3 277 0.4 248 1.1 239 0.5 245 0.6
4 287 0.5 261 1.0 255 0.6 257 0.5
5 274 0.4 263 2.0 245 1.5 238 1.2
6 291 0.5 273 2.4 269 1.7 268 1.7
平均值 281 0.4 260 1.5 252 0.9 252 0.8
组4：抗体：嵌合人源化ALULAIgG2a；剂量：1mg/kg/BW(夹闭前6小时)。
大鼠 BWg 基线 BWg 24h BWg 48h BWg 72h
1 279 0.5 260 1.6 253 0.7 251 0.4
2 269 0.4 265 1.3 247 0.7 243 0.6
3 264 0.4 248 1.1 245 0.6 250 0.6
4 276 0.5 266 2.5 246 2.0 238 1.8
5 274 0.3 257 1.3 252 0.7 248 0.6
6 278 0.4 254 0.9 250 0.8 247 0.7
平均值 273 0.4 258 1.4 248 0.9 246 0.7
以上的血清肌酸酐数据显示，当比较所有三个版本的mAbALULA时，在效价上没有差异。在去除效应功能后没有活性损失的事实表明，不需要该效应功能作为产生效力的作用机制的一部分。
其它实施方案
虽然已经结合其详述描述了本发明，但是前述描述旨在进行举例说明，并且不限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求来限定。其它方面、优点和改变都落在以下权利要求的范围内。

Claims (37)

1.一种用于治疗、预防或减轻有需要的人受试者中的急性肾损伤的严重程度的方法，所述方法包括将有效量的特异性结合αvβ5整联蛋白的抗体或其抗原结合片段施用至所述人受试者。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体竞争。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体的根据Kabat定义的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段还包含由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体的根据Kabat定义的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是由保藏为ATCC保藏号PTA-5817的杂交瘤产生的抗体的人源化形式。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段经静脉内、经皮下或经动脉内施用。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述人受试者已经基于急性肾损伤网络标准或危险/损伤/衰竭/丧失/ESRD标准被鉴定为患有急性肾损伤。
8.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中与健康对照受试者相比，所述人受试者已经被鉴定为具有升高的血清肌酸酐、血浆肌酸酐、尿肌酸酐或血脲氮水平。
9.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中与健康对照受试者相比，所述人受试者已经被鉴定为具有升高的血清或尿嗜中性粒细胞明胶酶相关的载脂蛋白、血清或尿白细胞介素-18、血清或尿半胱氨酸蛋白酶抑制剂C或尿KIM-1水平。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述急性肾损伤是缺血性急性肾损伤。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述人受试者已经被鉴定为具有降低的有效动脉容积。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述人受试者已经被鉴定为具有血管内容积减小。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述血管内容积减小是由出血、胃肠损失、肾损失、皮肤和粘膜损失、肾病综合征、硬变或毛细管泄漏所致。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述人受试者已经被鉴定为具有降低的心输出量。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述降低的心输出量是由心原性休克、心包疾病、充血性心力衰竭、瓣膜性心脏病、肺病或败血症所致。
16.如权利要求10所述的方法，其中所述人受试者已经被鉴定为具有全身性血管扩张。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述全身性血管扩张由硬变、过敏或败血症引起。
18.如权利要求10所述的方法，其中所述人受试者已经被鉴定为具有肾血管收缩。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述肾血管收缩由早期败血症、肝肾综合征、急性高钙血症、药物或放射性造影剂引起。
20.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述急性肾损伤是肾毒性急性肾损伤。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述人受试者已经暴露于肾毒素。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述肾毒素是选自由以下组成的组的肾毒性药物：抗生素、化疗剂、钙调磷酸酶抑制剂、两性霉素B和放射照相造影剂。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述肾毒素是违禁药物或重金属。
24.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述人受试者已经历创伤性损伤或挤压性损伤。
25.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述人受试者已经历器官移植手术。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述器官移植手术是肾移植手术或心脏移植手术。
27.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述人受试者已经历伴有灌注不足的手术。
28.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述人受试者已经历心胸手术或血管手术。
29.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述人受试者已服用干扰膀胱正常排空的药剂。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述药剂是抗胆碱能药。
31.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述人受试者患有良性***肥大。
32.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述人受试者患有癌症。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述癌症是***癌、卵巢癌或结直肠癌。
34.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述人受试者患有肾结石。
35.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述人受试者患有输尿管堵塞。
36.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述人受试者已服用引起或导致晶尿症的药物、引起或导致肌红蛋白尿症的药物或者引起或导致膀胱炎的药物。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中对所述人受试者施用选自由以下组成的组的第二治疗剂：αvβ5整联蛋白抑制剂、αvβ6整联蛋白抑制剂、CXCR4拮抗剂、IL-6抑制剂、IL-1α抑制剂、IL-12抑制剂、MIP-1-α抑制剂、AP214、THR-184、QPI-1002、人碱性磷酸酶、抗凋亡剂、抗坏死剂、消炎剂、抗败血症剂、生长因子、血管扩张剂、自由基清除剂、嗜中性粒细胞明胶酶相关的载脂蛋白、C5a受体拮抗剂和α-黑素细胞刺激性激素。
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