PT1678208E - Remoção de agregados de elevado peso molecular utilizando cromatografia de hidroxiapatite - Google Patents
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Description
1
DESCRIÇÃO "REMOÇÃO DE AGREGADOS DE ELEVADO PESO MOLECULAR UTILIZANDO CROMATOGRAFIA DE HIDROXIAPATITE"
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção refere-se a métodos de remoção de agregados de elevado peso molecular a partir de uma preparação de anticorpo, utilizando cromatografia de hidroxiapatite. Em certas realizações desta invenção, a quantidade de agregados de elevado peso molecular presente na preparação final pode ser reduzida de forma significativa, tal como de 40 % para menos de 1 %.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO É desejável a identificação de métodos úteis para a purificação de proteínas que não destruam, ou reduzam de forma significativa, a atividade biológica da proteína. Os contaminantes devem ser removidos de preparações de anticorpos antes de que estas possam ser utilizadas em aplicações de diagnóstico, em aplicações terapêuticas, em biologia celular aplicada e em estudos funcionais. As preparações de anticorpos colhidas a partir de linhas celulares de hibridoma, por exemplo, contêm frequentemente componentes indesejados, tais como agregados de elevado peso molecular (HMWA) do anticorpo produzido pela linha celular. Esta formação de agregados pode afetar adversamente a segurança do produto, provocando após a administração a ativação do complemento ou anafilaxia. Além disso, a formação de agregados pode dificultar os processos de fabrico, causando a diminuição do rendimento do produto, o alargamento do pico e a perda de atividade.
Os métodos mais comuns de purificação de proteínas são 2 baseados em diferenças no tamanho, na carga, e na solubilidade entre a proteína a ser purificada e os contaminantes. Os protocolos baseados nestes parâmetros incluem a cromatografia de afinidade, a cromatografia de permuta iónica, a cromatografia de exclusão por tamanho, e a cromatografia de interação hidrofóbica. No entanto, estes métodos cromatográficos apresentam por vezes dificuldades técnicas, na separação de espécies agregadas ou multiméricas de anticorpos. Técnicas tais como a cromatografia de permuta iónica e de interação hidrofóbica, por exemplo, podem induzir a formação de agregados devido a um aumento da concentração de proteína, ou as alterações necessárias na concentração de tampão e/ou de pH durante a eluição. Além disso, em vários casos, os anticorpos apresentam diferenças em pontos isoelétricos que são muito pequenas para permitir a sua separação por cromatografia de permuta iónica. Tarditi, J. Immunol. Methods 599: 13-20 (1992). A cromatografia de exclusão por tamanho é complicada e resulta na diluição significativa do produto, o que é um obstáculo em processos de fabrico em grande escala, à base de eficiência. Também pode ocorrer a perda de ligandos em colunas de cromatografia de afinidade, o que resulta em contaminação indesejável do produto eluído. Steindl, J. Immunol. Methods 235: 61-69 (2000). Os requerentes tentaram remover os HMWA de uma preparação de anticorpo anti-GDF-8 utilizando a cromatografia de permuta aniónica, a cromatografia de permuta catiónica, bem como a cromatografia de interação hidrofóbica. No entanto, todos estes métodos não foram capazes de eliminar substancialmente os HMWA da preparação de anticorpo anti-GDF-8. A cromatografia de hidroxiapatite é um método de purificação de proteínas, que utiliza um fosfato de cálcio 3 hidroxilado insolúvel [Caio (P04) e (OH) 2] , o qual forma tanto a matriz como o ligando. Os grupos funcionais consistem em pares de iões de cálcio carregados positivamente (locais-C), e aglomerados de grupos fosfato carregados negativamente (locais-P). As interações entre a hidroxiapatite e as proteínas são complexas e multimodo. No entanto, num método de interação, os grupos amino carregados positivamente em proteínas associadas com os locais-P carregados negativamente e os grupos carboxilo da proteína, interagem por coordenação de complexação de locais-C. Shepard, J. of Chromatography 891: 93-98 (2000). A hidroxiapatite cristalina foi o primeiro tipo de hidroxiapatite usada em cromatografia, mas esteve limitada por dificuldades estruturais. A cromatografia de hidroxiapatite cerâmica (cHA) foi desenvolvida para superar algumas das dificuldades associadas com a hidroxiapatite cristalina, tais como as taxas de fluxo limitadas. A hidroxiapatite cerâmica tem elevada durabilidade, boa capacidade de ligação de proteína, e pode ser utilizada a taxas de fluxo e pressões mais elevadas do que a hidroxiapatite cristalina. Vola et al., BioTechniques 14: 650-655 (1993). A hidroxiapatite tem sido utilizada na separação cromatográfica de proteínas, de ácidos nucleicos, bem como de anticorpos. Na cromatografia de hidroxiapatite, a coluna é equilibrada normalmente, e a amostra é aplicada, em baixas concentrações de tampão fosfato e, as proteínas adsorvidas são então eluídas com um gradiente de concentração de tampão fosfato. Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73: 522-529 (2000). Por vezes, são usados com sucesso gradientes superficiais de fosfato de sódio para eluir proteínas, enquanto que em outros casos, têm sido utilizados com sucesso 4 gradientes de concentração até 400 mM de fosfato de sódio. Veja-se por exemplo, Stanker, J. Immunological Methods 76: 157-169 (1985) (gradiente de eluição de fosfato de sódio de 10 mM a 30 mM), Shepard, J. Chromatography 891: 93-98 (2000) (gradiente de eluição de fosfato de sódio de 10 mM a 74 mM) , Tarditi, J. Chromatography 599: 13-20 (1992) (gradiente de eluição de fosfato de sódio de 10 mM a 350 mM) . Embora sais tais como o NaCl tenham sido incorporados no tampão de ligação para purificar um anticorpo utilizando cromatografia de hidroxiapatite, Giovannini, R. Biotechnology and Bioengineering 73: 522-529 (2000), sais tais como o NaCl e o (NH4)2SO4 não foram reconhecidos como afetando a eluição de proteínas em cromatografia de hidroxiapatite. Karlsson et al., Ion Exchange chromatography, in protein purification, VCH Publishers, Inc. (Janson e Ryden eds., 1989).
Em vários casos, os investigadores não foram capazes de eluir seletivamente os anticorpos a partir de hidroxiapatite, ou descobriram que a cromatografia de hidroxiapatite não resultou num produto suficientemente puro. Junbauer, J. Chromatography 476: 257-268 (1989), Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73: 522-529 (2000). Os requerentes tentaram, sem sucesso, separar agregados de elevado peso molecular de uma preparação de anticorpos usando cromatografia de hidroxiapatite cerâmica, e uma eluição de fosfato de sódio com base em anteriores ensinamentos da técnica (figura 1). Além disso, condições de eluição severas, quando utilizadas numa tentativa de quebrar a ligação firme de uma proteína a uma matriz, são conhecidas por destruir a atividade biológica de uma proteína. Assim, existe uma necessidade de métodos eficientes para a remoção de impurezas, tais como agregados de elevado peso molecular, de preparações de anticorpos, que não destruam a atividade 5 biológica dos anticorpos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os requerentes verificaram surpreendentemente, que o NaCl pode ser utilizado num novo método de cromatografia de hidroxiapatite, para a purificação de imunoglobulinas e a remoção de HMWA de diferentes matérias-primas (figura 2) . Assim, a presente invenção refere-se a métodos de remoção de agregados de elevado peso molecular a partir de preparações de anticorpo, por contacto da preparação referida com uma resina de hidroxiapatite. A preparação de anticorpo pode ser permutada com tampão para um tampão de equilíbrio, e depois permitida fluir através de uma resina de hidroxiapatite.
Numa realização, a invenção refere-se a um método para purificar pelo menos um monómero de anticorpo a partir de uma preparação de anticorpo contendo agregados de elevado peso molecular, que compreende sujeitar a preparação de anticorpo a cromatografia de hidroxiapatite, em que a cromatografia de hidroxiapatite compreende o contacto de uma resina de hidroxiapatite numa coluna com a preparação de anticorpo num tampão de carga, que compreende de 1 a 20 mM de fosfato de sódio e de 0,2 a 2,5 M de NaCl, e permitindo que o anticorpo purificado flua através da coluna. A invenção apresenta um tampão de carga, que contém de 1 a 20 mM de fosfato de sódio e de 0,2 a 2,5 Mde NaCl, em que o tampão de carga tem um pH de 6,4 a 7,6.
Numa realização, o anticorpo purificado contém menos de 5 % de agregados de elevado peso molecular.
Numa outra realização, o anticorpo purificado contém menos de 1 % de agregados de elevado peso molecular.
Numa realização adicional, a preparação de anticorpo contém pelo menos um anticorpo IgG. Mais especificamente, a preparação de anticorpo contém pelo menos um anticorpo 6 escolhido a partir de recetor anti-IL-21, anti-GDF-8, anti-Abeta, anti-CD22, anti-Lewis Y, anti-IL-13, ou anti-IL-22.
Pode ser utilizado pelo menos um método de purificação em combinação com a cromatografia de hidroxiapatite da invenção. Podem ser usados uma variedade de métodos de purificação, incluindo, mas não limitado a, cromatografia de Proteína A, cromatografia de afinidade, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade de metal imobilizado, cromatografia de exclusão por tamanho, diafiltração, ultrafiltração, filtração de remoção virai, cromatografia de permuta aniónica, e/ou cromatografia de permuta catiónica.
Numa realização, são usadas cromatografia de permuta aniónica e de Proteína A em combinação com cromatografia de hidroxiapatite cerâmica.
Numa outra realização, podem ser utilizadas em combinação a cromatografia de permuta aniónica e de Proteína A, por exemplo, por contacto da preparação com um suporte de Proteína A, permitindo que o anticorpo adsorva ao suporte de Proteína A, lavando o suporte de Proteína A e o anticorpo adsorvido com pelo menos um tampão de lavagem de Proteína A, eluindo o anticorpo adsorvido com pelo menos um tampão de eluição de Proteína A, por contacto do eluído de Proteína A com um suporte de permuta iónica, permitindo que o anticorpo flua através do suporte de permuta iónica, lavando o suporte de permuta iónica com pelo menos um tampão de lavagem de permuta iónica, trocando o fluxo de permuta iónica para um tampão de carga que compreende de 1 a 20 mM de fosfato de sódio e de 0,2 a 2,5 M de NaCl, por contacto do fluxo de permuta iónica com uma resina de hidroxiapatite, permitindo que o anticorpo flua através da resina de hidroxiapatite, e lavando a resina de hidroxiapatite com pelo menos um tampão 7 de lavagem de hidroxiapatite.
Objetos adicionais e vantagens da invenção serão apresentados em parte na descrição que se segue, e em parte serão evidentes a partir da descrição, ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os objetos e vantagens da invenção serão realizados e alcançados por meio dos elementos e combinações particularmente apontadas nas reivindicações anexas. É para ser entendido que tanto a descrição geral anterior, como a descrição detalhada que se segue, são apenas exemplares e explicativas e não são restritivas da invenção, tal como reivindicado.
Os desenhos anexos, que são incorporados e constituem parte desta especificação, e em conjunto com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 demonstra a incapacidade da técnica anterior de eluição por gradiente de fosfato de separar os HMWA de uma preparação de anticorpo anti-GDF-8. A figura 2 demonstra que a utilização da eluição por gradiente de NaCl resulta na separação de uma grande porção dos HMWA a partir de uma preparação de anticorpo anti-GDF-8. A figura 3 mostra a separação dos HMWA a partir de uma preparação de anticorpo anti-CD22 utilizando cromatografia CHA. A figura 4 mostra a separação dos HMWA a partir de uma preparação de anticorpo anti-Abeta utilizando cromatografia cHA.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A. Definições A fim de que a presente invenção possa ser mais facilmente compreendida, são definidos primeiro certos termos. Definições adicionais são estabelecidas ao longo da descrição detalhada. 0 termo "anticorpo" refere-se a qualquer imunoglobulina ou um fragmento da mesma, e inclui qualquer polipeptideo que compreende um local de ligação ao antigénio. 0 termo inclui, mas não está limitado a, anticorpos policlonais, monoclonais, monoespecificos, poliespecificos, não específicos, humanizados, humanos, de cadeia simples, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, enxertados, e gerados in vitro. 0 termo "anticorpo" também inclui fragmentos de anticorpos, tais como Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, e outros fragmentos de anticorpos que retêm a função de ligação ao antigénio. Tipicamente, esses fragmentos iriam compreender um domínio de ligação ao antigénio.
Os anticorpos que podem também ser purificados pela invenção incluem as formas quimicamente modificadas, tais como por tratamento de PEG, e proteínas de fusão que compreendem uma porção de imunoglobulina. 0 anticorpo ou fragmento do mesmo, pode ser selecionado a partir de qualquer um dos isótipos de anticorpos conhecidos e suas conformações, por exemplo, monómeros IgA, IgG, IgD, IgE, IgM, dímeros IgA, trímeros IgA ou pentâmeros IgM. 0 termo "preparação de anticorpo" refere-se a qualquer composição que contém um anticorpo e/ou componentes indesejados, tais como agregados de elevado peso molecular de tais anticorpos. A "hidroxiapatite cerâmica" ou "cHA" refere-se a um fosfato de cálcio hidroxilado insolúvel de fórmula [Caio (P04) 6 (OH) 2], que foi sinterizado a temperaturas elevadas para uma forma de cerâmica esférica, macroporosa. O termo "cHA" compreende, mas não está limitado a, hidroxiapatite cerâmica do tipo I e do tipo II. A menos que especificado, 9 "cHA" refere-se a qualquer tamanho de partícula, incluindo, mas não limitado a, 20, 40, e 80 pm. O termo "agregados de elevado peso molecular" ou "HMWA" refere-se a uma associação de pelo menos dois anticorpos. A associação pode ocorrer por qualquer método incluindo, mas não limitado a, reticulação covalente, não covalente, dissulfureto, ou irredutível. Os pelo menos dois anticorpos podem ligar-se ao mesmo ou a diferentes antigénios. Os pelo menos dois anticorpos podem estar na forma de um anticorpo, de um fragmento de anticorpo, ou de outras formas descritas na definição anterior de "anticorpo". O termo "modo de fluxo através" refere-se a uma técnica de separação de preparação de anticorpo, em que pelo menos um anticorpo contido na preparação se destina a fluir através de uma resina ou suporte de cromatografia, enquanto que pelo menos um contaminante potencial ou impureza se liga à resina ou suporte de cromatografia. O modo de fluxo através pode ser usado, por exemplo, em cromatografia de hidroxiapatite e em cromatografia de permuta iónica. O "modo de ligação" refere-se a uma técnica de separação de preparação de anticorpo, em que pelo menos um anticorpo contido na preparação se liga a uma resina ou suporte de cromatografia, enquanto que pelo menos um contaminante ou impureza flui. O modo de ligação pode ser usado, por exemplo, em cromatografia de hidroxiapatite e em cromatografia de permuta iónica. B. Descrição do método A presente invenção proporciona métodos para a remoção de agregados de elevado peso molecular (HMWA) a partir de preparações de anticorpo, utilizando cromatografia de hidroxiapatite no modo de fluxo através. A presente invenção tem aplicação para a purificação em grande escala de 10 preparações de anticorpo.
No modo de fluxo através, uma preparação de anticorpo é permutada com tampão para um tampão de carga que contém de 0. 2 a 2,5 M de NaCl, a um pH de ligeiramente ácido a ligeiramente básico. A preparação de anticorpo é então deixada a fluir através de uma coluna de hidroxiapatite, enquanto que as impurezas, tais como os HMWA, se ligam à coluna. A coluna é, opcionalmente, subsequentemente lavada, para permitir que os anticorpos purificados adicionais fluam através da coluna. Por fim, a coluna pode, opcionalmente, ser removida e, em seguida regenerada, usando uma solução de hidróxido de sódio e fosfato de potássio.
Numa realização da invenção o anticorpo purificado contém menos do que 5 % de HMWA, numa realização menos do que 3 % de HMWA, e em outra realização menos do que 1 % de HMWA. 1. Os anticorpos
As preparações de anticorpo da invenção podem ser isoladas a partir de uma série de fontes, incluindo, mas não limitado a, soro de animais imunizados, liquido ascitico, sobrenadantes de hibridoma ou de mieloma, meios condicionados derivados da cultura de uma linha celular recombinante: que expressa a molécula de anticorpo, e a partir de todos os extratos de células de células produtoras de anticorpos. Numa realização da invenção, são purificados os anticorpos de meios de cultura de células condicionados de uma variedade de linhas celulares recombinantes produtoras de anticorpo. Embora se possa esperar alguma variação de linha celular para linha celular, e entre os diversos produtos do anticorpo, com base na descrição aqui feita, está bem dentro da competência de um perito nesta técnica a adaptação desta invenção a uma combinação particular de proteína de anticorpo e linha celular produtora. 11
Para fins somente de ilustração, esta invenção foi aplicada à purificação de vários anticorpos do isótipo IgG e de pi básico. Mais especificamente, esta invenção foi aplicada a anticorpos monoclonais contra GDF-8, descrito por WO 2004/037861 (daqui em diante "Myo-29"), a anticorpos monoclonais especificamente reativos com o antigénio CD22, descrito pelo pedido de patente US N° 2004-00827641 AI (daqui em diante "anti-CD22"), e a anticorpos monoclonais contra o antigénio Abeta, descrito por WO 02/46237 (daqui em diante "anti-Abeta"). A construção de sistemas recombinantes para a produção dos anticorpos Myo-29 e CD22 e Abeta é descrita nos pedidos mencionados anteriormente. 2. A resina de hidroxiapatite
Estão comercialmente disponíveis várias resinas de cromatografia de hidroxiapatite, e qualquer forma disponível do material pode ser utilizado na prática desta invenção. Numa realização da invenção, a hidroxiapatite está numa forma cristalina. As hidroxiapatites para utilização nesta invenção podem ser aquelas que são aglomeradas para formar partículas, e sinterizadas a temperaturas elevadas numa massa de cerâmica porosa estável. O tamanho de partícula da hidroxiapatite pode variar amplamente, mas um tamanho de partícula típico varia entre 1 pm e 1000 pm de diâmetro, e pode ser de 10 pm a 100 pm. Numa realização da invenção, o tamanho de partícula é de 20 pm. Numa outra forma de realização da invenção, o tamanho de partícula é de 40 mm. Ainda numa outra realização da invenção, o tamanho de partícula é de 80 pm.
Podem ser empregues na preparação de colunas de cHA uma série de suportes cromatográficos, os mais extensivamente utilizados são a hidroxiapatite do tipo I e do tipo II. O tipo I tem uma elevada capacidade de ligação de proteína, e 12 uma melhor capacidade para proteínas ácidas. No entanto, o tipo II tem uma menor capacidade de ligação de proteína, mas tem uma melhor resolução de ácidos nucleicos e certas proteínas. 0 material de tipo II tem também uma afinidade muito baixa para a albumina, e é especialmente adequado para a purificação de muitas espécies e classes de imunoglobulinas. A escolha de um tipo particular de hidroxiapatite pode ser determinada pelo perito na técnica.
Esta invenção pode ser usada com a resina de hidroxiapatite que está solta, carregada numa coluna, ou num cromatógrafo anual contínuo. Numa realização da invenção, é carregada numa coluna a resina de hidroxiapatite cerâmica. A escolha das dimensões da coluna pode ser determinada pelo perito na técnica. Numa realização da invenção, pode ser utilizado para a purificação de pequena escala um diâmetro de coluna de pelo menos 0,5 cm, com uma altura de leito de cerca de 20 cm. Numa realização adicional da invenção, pode ser utilizado um diâmetro de coluna de cerca de 35 cm a cerca de 60 cm. Em ainda outra realização da invenção, pode ser utilizado um diâmetro de coluna de 60 cm a 85 cm. Em certas realizações da invenção, pode ser usada uma suspensão de resina de hidroxiapatite cerâmica em 200 mM de solução de Na2HPC>4 a pH 9,0, para carregar a coluna a uma taxa de fluxo constante de cerca de 4 cm/min, ou com a gravidade. 2. Composições de tampão e condições de carga
Antes de pôr em contacto a resina de hidroxiapatite com a preparação de anticorpo, pode ser necessário ajustar parâmetros tais como o pH, a força iónica e a temperatura e, em alguns casos, a adição de substâncias de diferentes tipos. Assim, é uma etapa opcional realizar uma estabilização da matriz de hidroxiapatite, lavando-a com uma solução (por exemplo, um tampão para ajuste do pH, da força iónica, etc, 13 ou para a introdução de um detergente) , trazendo as caracteristicas necessárias para a purificação da preparação de anticorpo.
Na cromatografia de hidroxiapatite em combinação modo de ligação / fluxo através, a matriz de hidroxiapatite é eguilibrada e lavada com uma solução, o gue trás as caracteristicas necessárias para a purificação da preparação de anticorpo. Numa realização da invenção, a matriz poderá ser equilibrada utilizando uma solução que contém de 0,01 a 2,0 M de NaCl, a um nivel de pH de ligeiramente básico a ligeiramente ácido. Por exemplo, o tampão de equilíbrio pode conter de 1 a 20 mM de fosfato de sódio, numa outra realização pode conter de 1 a 10 mM de fosfato de sódio, numa outra realização pode conter de 2 a 5 mM de fosfato de sódio, numa outra realização pode conter 2 mM de fosfato de sódio, e numa outra realização pode conter 5 mM de fosfato de sódio. O tampão de equilíbrio pode conter de 0,01 a 2,0 M de NaCl numa realização, de 0,025 a 0,5 M de NaCl numa outra realização, 0,05 M de NaCl, e numa outra realização 0,1 M de NaCl. O pH do tampão de carga pode variar de 6,2 a 8,0. Numa realização o pH pode ser de 6,6 a 7,7, e numa outra realização o pH pode ser de 7,3. O tampão de equilíbrio pode conter de 0 a 200 mM de arginina, numa outra realização pode conter 120 mM de arginina, e numa outra realização pode conter 100 mM de arginina. O tampão de equilíbrio pode conter de 0 a 200 mM de HEPES, numa outra realização pode conter 20 mM de HEPES, e numa outra realização pode conter 100 mM de HEPES. A preparação de anticorpo também pode ser permutada por um tampão para um tampão apropriado ou tampão de carga, em preparação para a cromatografia de hidroxiapatite em modo de fluxo através. Numa realização da invenção, a preparação de anticorpo pode ser permutada por um tampão para um tampão de 14 carga que contém de 0,2 a 2,5 M de NaCl, a um pH de ligeiramente ácido a ligeiramente básico. Por exemplo, o tampão de carga pode conter de 1 a 20 mM de fosfato de sódio, numa outra realização pode conter de 2 a 8 mM de fosfato de sódio, numa outra realização pode conter de 3 a 7 mM de fosfato de sódio, e numa outra realização pode conter 5 mM de fosfato de sódio. O tampão de carga pode conter de 0,2 a 2,5 M de NaCl numa realização, de 0,2 a 1,5 M de NaCl numa outra realização, de 0,3 a 1,0 M de NaCl, e numa outra realização, 350 mM de NaCl. O pH do tampão de carga pode variar de 6,4 a 7,6. Numa realização, o pH pode ser de 6,5 a 7,0, e numa outra realização o pH pode ser de 6,8. O contacto de uma preparação de anticorpo com a resina de hidroxiapatite no modo de fluxo através, pode ser realizado numa coluna de leito fixo, numa coluna de leito fluidizado / expandido contendo a matriz de fase sólida, e/ou numa operação de lote simples onde a matriz de fase sólida é misturada com a solução durante um certo tempo.
Depois do pôr em contacto a resina de hidroxiapatite com a preparação de anticorpo é, opcionalmente, realizado um procedimento de lavagem. No entanto, em alguns casos em que uma pureza muito elevada da imunoglobulina não é critica, ou não é requerido fluxo adicional de anticorpo, o procedimento de lavagem pode ser omitido, poupando uma etapa de processo, bem como solução de lavagem. Os tampões de lavagem empregues irão depender da natureza da resina de hidroxiapatite, do modo de cromatografia de hidroxiapatite a ser utilizado, e, por conseguinte, podem ser determinados por um vulgar perito na técnica. No modo de fluxo através, o fluxo de anticorpo purificado obtido após uma lavagem opcional da coluna pode ser agrupado com outras frações de anticorpos purificados.
No modo de fluxo através, uma matriz de fase sólida pode 15 ser opcionalmente limpa, isto é, removida e regenerada, após eluição ou fluxo do anticorpo. Este procedimento é geralmente realizado regularmente para minimizar a acumulação de impurezas na superfície da fase sólida, e/ou para esterilizar a matriz para evitar a contaminação do produto com microrganismos.
Os componentes do tampão podem ser ajustados de acordo com o conhecimento da pessoa de habilidade vulgar na técnica. São fornecidos na tabela 2 exemplos de gamas de composição do tampão, e exemplos para o modo de fluxo através. Nem todos os tampões ou etapas são necessários, mas são fornecidos somente para ilustração. Por exemplo, pode não ser necessário dispor de duas etapas distintas de equilíbrio, e pode não ser necessário remover, regenerar, ou armazenar a resina de hidroxiapatite. Pode ser utilizado um rastreio de elevado rendimento, como descrito no exemplo 11, para otimizar de forma eficiente as condições do tampão para a cromatografia em coluna de cHA.
Tabela 2. Exemplos de gamas de composição do tampão para o modo de fluxo através
Tampão Gama de composição Exemplo de composição Equilíbrio 1 10 mM a 500 mM de fosfato de sódio 1,0 M de NaCl pH 6,4 a 7,4 0,3 M de fosfato de sódio 1,0 M de NaCl pH 6, 8 Equilíbrio 2 1 a 20 mM de fosfato de sódio 0,2 a 2,5 M de NaCl pH 6,4 a 7,6 5,0 mM de fosfato de sódio 350 mM de NaCl pH 6, 8 Carregar tampão 1 a 20 mM de fosfato de sódio 0,2 a 2,5 M de NaCl pH 6,4 a 7,6 5,0 mM de fosfato de sódio 350 mM de NaCl pH 6, 8 16
Tampão Gama de composição Exemplo de composição Lavagem 1 a 20 mM de fosfato de sódio 0,2 a 2,5 M de NaCl pH 6,4 a 7,6 5,0 mM de fosfato de sódio 350 mM de NaCl pH 6,8 Remoção 10 mM a 500 mM de fosfato de sódio 1,0 M de NaCl pH 6,4 a 7,4 0,3 M de fosfato de sódio 1,0 M de NaCl pH 6,8 Regeneração 0,5 a 1,0 M de fosfato de potássio 1,0 M de NaOH 0,5 M de fosfato de potássio 1,0 M de NaOH Armazenamento 10 a 50 mM de NaOH 20 mM de NaOH
Numa realização da invenção, a carga na resina de cHA pode ser, por exemplo, a um desafio de carga de < 20 mg/ml, e um nivel de agregado de partida na carga de ^ 40 % HMWA. Em certas realizações da invenção, pode ser usado um desafio de carga de 1,8 a 10,4 mg/ml, com um nivel de agregado de partida na carga de cerca de 15 %.
Numa realização adicional da invenção, a resina cHA é carregada a um desafio de carga de pelo menos 20 mg/ml, e um nivel de agregado de partida na carga de ^ 4 0 % HMWA. Em certas realizações da invenção, pode ser usado um desafio de carga de 30 a 40 mg/ml, com um nivel de agregado de partida na carga de cerca de 27 %. 3. Etapas opcionais adicionais
Embora tenha sido descoberto que a cromatografia de hidroxiapatite pode ser utilizada isoladamente para separar IgG monomérica de agregados, como mencionado anteriormente, o método de purificação da invenção pode ser usado em combinação com outras técnicas de purificação de proteínas. 17
Numa realização da invenção, pode ser desejável uma ou mais etapas que precedem a etapa de hidroxiapatite, para reduzir o desafio de carga dos contaminantes ou impurezas. Numa outra realização da invenção, pode ser desejável uma ou mais etapas de purificação após a etapa de hidroxiapatite, para remover contaminantes ou impurezas adicionais. 0 procedimento de purificação de cHA descrito pode opcionalmente ser combinado com outras etapas de purificação, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia de Proteína A, cromatografia de afinidade, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade de metal imobilizado, cromatografia de exclusão por tamanho, diafiltração, ultrafiltração, filtração de remoção virai e/ou cromatografia de permuta iónica.
Numa realização, antes da etapa de purificação de cHA, os meios de colheita podem, opcionalmente, ser inicialmente purificados por uma etapa de cromatografia de Proteína A. Por exemplo, pode ser utilmente empregue o PROSEP-A” (Millipore, Reino Unido), que consiste em Proteína A acoplada covalentemente a um vidro de porosidade controlada. Outras formulações de Proteína A úteis incluem Proteína A Sepharose FAST FLOW™ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) , Proteína A TOYOPEARL™ 650M (TosoHaas Co., Filadélfia, PA), e colunas MABSELECT™ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
Como etapa opcional antes da purificação de cHA, pode ser empregue cromatografia de permuta iónica. Neste aspeto, vários substituintes aniónicos ou catiónicos podem ser ligados a matrizes, a fim de formar suportes aniónicos ou catiónicos para cromatografia. Substituintes de permuta aniónicos incluem grupos dietilaminoetilo (DEAE), trimetilaminoetilo acrilamida (TMAE), aminoetilo quaternário (QAE) e amina quaternária (Q). Substituintes de permuta 18 catiónica incluem carboximetilo (CM), sulfoetilo (SE) , sulfopropilo (SP), fosfato (P) e sulfonato (S) . Resinas de permuta iónica celulósicas, tais como DE23, DE32, DE52, CM- 23, CM-32 e CM-52 estão disponíveis a partir de Whatman Ltd. Maidstone, Kent, Reino Unido. Também são conhecidos permutadores iónicos com base em Sephadex e de reticulação. Por exemplo, Sephadex-DEAE, -QAE, -CM, e -SP, e Sepharose-DEAE, -Q, -CM e -S, e Sepharose, estão todos disponíveis a partir de Amersham Biosciences, Piscataway, NJ. Além disso, o copolímero etileno glicol - metacrilato derivado tanto de DEAE como de CM, tal como o TOYOPEARL™ DEAE-65 0S ou M, e o TOYOPEARL CM-650S ou M, estão disponíveis a partir de Toso Haas Co., Filadélfia, PA.
Numa realização da invenção, pode ser utilizada a cromatografia de permuta iónica em modo de ligação ou em modo de fluxo através.
Em certas realizações, a etapa de cromatografia de Proteína A é realizada em primeiro lugar, a etapa de permuta aniónica é realizada em segundo lugar, e a etapa de cHA é conduzida em terceiro lugar. C. Exemplos São oferecidos os seguintes exemplos apenas para fins ilustrativos.
Exemplo 1: Purificação de um anticorpo anti-GDF-8 0 processo de purificação descrito em seguida foi desenvolvido para um anticorpo monoclonal anti-GDF-8 (aqui referido como "Myo-29"). 0 anticorpo Myo-29 é um anticorpo do subtipo IgGl, e tem um pi de aproximadamente 8,1. 0 processo de purificação foi constituído por três etapas de cromatografia (afinidade de Proteína A, permuta aniónica, e hidroxiapatite), uma etapa de inativação virai, e uma etapa de ultrafiltração / diafiltração, para concentrar e permutar 19 o produto para um tampão final. Todas as etapas foram realizadas de 18 a 25 °C, com exceção da etapa de cromatografia de Proteína A, a qual foi realizada de 2 a 8 °C. 0 processo de purificação pode ser normalizado para qualquer escala. As taxas de fluxo lineares indicadas são independentes do diâmetro da coluna, e as razões de carga são em massa por unidade de volume. A etapa de cromatografia de proteína A pode ser repetida várias vezes em cada lote, para acomodar as quantidades variáveis de título da cultura celular no bioreactor de colheita. Cada ciclo é considerado uma unidade de operação separada, e o conjunto de eluição é guardado para a próxima etapa. A etapa de Proteína A tem uma capacidade de aproximadamente 35 gramas de Myo-29 por litro de MabSelect. As etapas a jusante do processo (por exemplo, a cromatografia de permuta aniónica e a cromatografia de hidroxiapatite cerâmica) são dimensionadas para acomodar aproximadamente 15 gramas de Myo-29 por litro de resina de permuta aniónica, e cerca de 10 gramas de Myo-29 por litro de resina de hidroxiapatite cerâmica. 1. Remoção de células da cultura O anticorpo Myo-29 foi expresso em células de ovário de hamster chinês (CHO), e foi cultivado num bioreactor tanque agitado de 2500 1. Para a colheita do fluido da cultura, as células foram removidas usando um dispositivo de microfiltração Prostak (Millipore, Billerica, MA) . Os meios condicionados claros (CCM) foram recolhidos para a primeira etapa cromatográfica, cromatografia de Proteína A.
2. Etapa de purificação de cromatografia de afinidade de Proteína A
Uma coluna MabSelect de 17,7 1 (30 cm de diâmetro x 25 cm de altura) de resina de Proteína A recombinante (Amersham 20
Biosciences, Piscataway, NJ) foi equilibrada com 5 volumes de coluna de um tampão de equilíbrio (10 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 7,5) . O CCM foi aplicado à coluna a uma taxa de fluxo de 2,5 cm/min, e um desafio de carga de 35 g de Myo-29 por litro de resina. Depois de carregar a coluna, esta foi lavada com 5 volumes de coluna de um tampão de lavagem de elevado teor salino (20 mM de Tris, 1,0 M de NaCl, pH 7,5) e, em seguida, com 10 volumes de coluna de um tampão de lavagem de baixa concentração de sal (10 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 7,5) . O Myo-29 foi eluído por aplicação de 6 volumes de coluna de um tampão de eluição (100 mM de arginina, 50 mM de NaCl, pH 3,0) . O conjunto de eluição foi então guardado a um pH de 3,6 ± 0,5 durante 1,5 ± 0,5 horas, como medida profilática para facilitar a inativação de potenciais contaminantes virais adventícios. O conjunto de eluição foi então neutralizado para pH 7,3 com 2 M de tampão HEPES a pH 8,0, para prevenir a degradação de porções ácido lábeis de Myo-2 9.
Os efluentes da coluna foram monitorizados através de vários parâmetros, incluindo a inspeção visual de absorção de UV e os perfis cromatográficos de condutividade, e a recuperação do produto usando HPLC de Proteína A para a titulação de carga, e a absorvância a 280 nm para a concentração do conjunto de eluição. A coluna foi removida com 6 M de cloridrato de guanidina, e em seguida lavada com tampão de lavagem da remoção (10 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 7,5). A coluna foi armazenada em etanol a 16 %. 3. Etapa de purificação de cromatografia de permuta aniónica
O eluído da coluna de Proteína A foi ainda purificado por cromatografia de permuta aniónica sobre uma coluna de 75 1 (80 cm de diâmetro x 15 cm de comprimento) de resina de Q 21 SEPHAROSE FF (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de um primeiro tampão de equilíbrio (20 mM de HEPES, 1000 mM de NaCl mM, pH 7,3) e em sequida com 5 volumes de coluna de um segundo tampão de equilíbrio (100 mM de arginina, 50 mM de NaCl, 100 mM de HEPES, pH 7,3). O eluído da coluna de Proteína A foi aplicado na coluna equilibrada a uma taxa de fluxo de 2,5 cm/min, e uma razão de carga de 15 gramas de Myo-2 9 por litro de resina. Após a carga, a coluna foi lavada com 5 volumes de coluna do segundo tampão de equilíbrio. O fluxo da coluna de permuta aniónica foi recolhido. O fluxo da coluna recolhido foi monitorizado através de vários parâmetros, incluindo a inspeção visual de absorção de UV e os perfis cromatográficos de condutividade, e a recuperação do produto usando a absorvância a 280 nm. A coluna de permuta aniónica foi removida com tampão de remoção (20 mM de HEPES, 1 M de NaCl, pH 7,3) e regenerada com tampão de regeneração (500 mM de NaOH, 1 M de NaCl, pH 13,3). A coluna foi armazenada em NaOH a 0,01 M. 4. Filtração de retenção de virus O objetivo desta etapa opcional foi a remoção de partículas semelhantes a retrovírus que podem estar presentes na cultura celular de CHO, e para proporcionar segurança adicional através da remoção de potenciais contaminantes virais adventícios. 0 eluído da coluna de permuta aniónica foi recolhido e passado através de um filtro Planova de 35 nm de uso único (Asahi-Kasei Corp., Nova Iorque, NY). O produto restante no módulo foi recuperado por passagem de tampão de lavagem da coluna de permuta aniónica (100 mM de arginina, 50 mM de NaCl, 100 mM de HEPES, pH 7,3) através do dispositivo. A recuperação do produto após a filtração de retenção de vírus foi avaliada pela absorvância a 280 nm, e análise de 22 SDS-PAGE do conjunto Planova em comparação com os dados históricos de desempenho.
5. Etapa de purificação de cromatografia de cHA
A solução filtrada virai foi ainda purificada com uma coluna de hidroxiapatite (60 cm x 20 cm) carregada com resina cHA do tipo II, de 40 μπι de tamanho de partícula (BioRad, Hercules, CA) . A coluna foi equilibrada com 3 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 1 (0,3 M de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 6,8). Foi realizada uma segunda etapa de equilíbrio com 4 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 2 (5 mM de fosfato de sódio, 50 mM de NaCl, pH 7,2). Os meios parcialmente purificados foram carregados na resina num tampão de carga de 1:1 (v/v) (10 mM de fosfato de sódio, pH 7,2), e a uma taxa de fluxo de 2,5 cm/min. A coluna de cHA foi lavada com 3 volumes de coluna de tampão de lavagem (5 mM de fosfato de sódio, 50 mM de NaCl, pH 7,2). O anticorpo Myo-29 foi eluído da resina de cHA utilizando 6 volumes de coluna de um tampão de eluição (5 mM de fosfato de sódio, 350 mM de NaCl, pH 6,8). A etapa de purificação de cHA foi monitorizada por inspeção visual de absorção de UV e os perfis cromatográficos de condutividade, a recuperação do produto através da absorvância a 280 nm, a remoção dos HMWA conforme determinada por análise de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), e a remoção de Proteína A conforme determinada por um ensaio imunoenzimático (ELISA). A coluna de cHA foi removida com tampão de remoção (0,3 M de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 6,8) e regenerada com tampão de regeneração (0,5 M de fosfato de potássio, 1,0 M de NaOH, pH 13,3). A coluna foi armazenada em NaOH a 0,02 Μ. A tabela 4 demonstra que a cromatograf ia de cHA remove eficazmente impurezas de HMWA de preparações de anticorpos. 23
Além disso, a cromatografia de cHA é capaz de remover outras impurezas, tais como a Proteína A.
Tabela 4. Remoção de HMWA e rendimentos de monómero de ___anticorpo___
Amostra % de carga de HMWA % de pico de HMWA Carga de ProA (ppm) Pico de ProA 1 14, 6 1,0 17 BLOQ* 2 16, 4 0,7 20 BLOQ 3 1—1 LO T—1 1,6 23 BLOQ 4 16, 0 0, 9 13 BLOQ *BLOQ = Abaixo do limite de quantificação de 1 ng/ml. 6. Ultrafiltração / diafiltração e filtração final 0 conjunto de eluição de cHA foi passado através de um sistema de ultrafiltração de fluxo tangencial utilizando 2 cassetes de PLCTK Pellicon (Millipore, Billerica, MA) , compostas por uma membrana de celulose regenerada compósito com um limite de peso molecular nominal de 30.000. Os objetivos desta etapa foram a concentração e permuta por tampão do conjunto de produto de cHA para o tampão de formulação. O conjunto de produto de cHA foi enriquecido com uma solução de sacarose a 50 % (p/v) para trazer a concentração de sacarose para 2 %. o anticorpo Myo-29 foi concentrado para aproximadamente 20 gl-1, em seguida diafiltrado com aproximadamente > 9 volumes de lavagem de tampão de formulação (0,01 M de L-histidina, 2 % de sacarose, pH 6,0). Após a conclusão da diafiltração, o produto foi adicionalmente concentrado para aproximadamente 60 gl-1, e recuperado a partir do aparelho por drenagem por gravidade e um sopro de ar para baixo, seguido por lavagem dos canais de retenção com tampão de formulação, o alvo de concentração de Myo-29 na substância de fármaco é > 35 g/i. 24 A substância de fármaco de Myo-29 foi finalmente filtrada através de um filtro de 0,22 micron, equilibrada com tampão de formulação (0,01 M de L-histidina, 2 % de sacarose, pH 6,0), aliquotada em frascos, e em seguida armazenada a -80 °C.
Exemplo 2: Purificação de cHA de uma preparação de anticorpo anti-GDF-8 usando resina do tipo I O anticorpo Myo-29 também foi purificado com sucesso usando uma resina de cHA do tipo I, tamanho de partícula de 40 μΜ, carregado numa coluna de 3,1 1. A coluna foi equilibrada com 3 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 1 (0,3 M de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 6,8) . Foi realizada uma segunda etapa de equilíbrio com 4 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 2 (5 mM de fosfato de sódio, 50 mM de NaCl, pH 7,2) . Os meios parcialmente purificados a partir de uma etapa de purificação de permuta aniónica foram carregados na resina a um desafio de carga de 35 mg/ml, e a uma taxa de fluxo de 1,5 cm/min. A coluna de cHA foi lavada com 3 volumes de coluna de tampão de lavagem (5 mM de fosfato de sódio, 50 mM de NaCl, pH 7,2) . O anticorpo Myo-29 foi eluído da resina de cHA utilizando 6 volumes de coluna de um tampão de eluição (3 mM de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 7,2). A coluna de cHA foi removida com tampão de remoção (0,3 M de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 6,8) e regenerada com tampão de regeneração (0,5 M de fosfato de potássio, 1,0 M de NaOH, pH 13,3) . A coluna foi armazenada em NaOH a 0,02 M. A etapa de purificação de cHA foi monitorizada por inspeção visual de absorção de UV e os perfis cromatográficos de condutividade, a recuperação do produto através da absorvância a 280 nm, a remoção de HMWA conforme determinada 25 por análise de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), e a remoção de Proteína A conforme determinada por um ensaio imunoenzimático (ELISA). Tal como mostrado na tabela 5, a purificação de cHA utilizando a resina de tipo I foi capaz de diminuir a percentagem de HMWA de 27 % para 0,9 % no primeiro ciclo, e diminuir ainda mais a percentagem de HMWA para 0,6 % no segundo ciclo. Além disso, a resina do tipo I acomodou um desafio de carga maior do gue a resina do tipo II, enguanto continuava a produzir rendimento de monómero suficiente. Finalmente, a purificação de cHA utilizando a resina do tipo I é capaz de diminuir a guantidade de impureza de Proteína A.
Tabela 5. Remoção de HMWA e rendimentos de monómero de
anticorpo usando resina do tipo I
Amostra % de HMWA % de Rendimento de monómero Proteína A (ppm) carga de cHA 27,0 N/A 169 pico de cHA (ciclo n° 1) 0, 9 86, 6 BLOQ* pico de cHA (ciclo n° 2) 0, 6 86, 6 BLOQ *BLOQ = Abaixo do limite de quantificação de 1 n i—1 £
Exemplo 3: Purificação de cHA de uma preparação de anticorpo anti-CD22 e de uma preparação de anticorpo anti-Abeta usando resina do tipo I O processo de purificação de cHA descrito no exemplo 2 foi também capaz de remover suficientemente os HMWA tanto de uma preparação de anticorpo anti-CD22 como de anti-Abeta. O processo utilizado foi idêntico ao descrito no exemplo 2, com a exceção de que o monómero de anticorpo purificado foi eluído com gradiente de 15 volumes de coluna de tampão de eluição (3 mM de fosfato de sódio, 1,5 M de NaCl, pH 7,2). 26
Tal como demonstrado na tabela 6, a purificação de cHA utilizando a resina do tipo I foi capaz de diminuir os HMWA na preparação de anticorpo anti-CD22 para 0,5 %, e na preparação de anticorpo anti-Abeta para abaixo do limite de deteção. Além disso, a etapa de purificação de cHA foi capaz de remover contaminantes de Proteína A da preparação de anticorpo.
Tabela 6. Remoção de HMWA e rendimentos de monómero de anticorpo usando resina do tipo I na purificação de preparações de anticorpos anti-CD22 e anti-Abeta
Amostra % de HMWA % de rendimento de monómero Proteína A (ppm) Carga de anti-CD22 3,7 N/A 30 Pico de anti-CD22 0,5 87 BLOQ* Carga de anti-Abeta 1,87 N/A 40 Pico de anti-Abeta O o 89 BLOQ *BL0Q = Abaixo do limite de quantificação de 1 ng/ml
Exemplo 4: Purificação de cHA em modo de fluxo através, de um anticorpo anti-GDF-8 0 anticorpo Myo-29 também foi purificado com sucesso usando um protocolo de purificação de cHA em modo de fluxo através. Uma coluna Vantage de 1,6 x 20 cm (Millipore, Billerica, MA) foi carregada em 200 mM de fosfato de sódio dibásico a pH 9,0 usando Macro-Prep de hidroxiapatite cerâmica do tipo II, resina de 40 μΜ de tamanho de partícula (BioRad, Hercules, CA). A coluna foi equilibrada com 3 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 1 (300 mM de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 6,8), e 3 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 2 (350 mM de NaCl, 5 mM de fosfato de sódio, pH 6,8) . A preparação de anticorpo Myo-29 foi permutada por tampão para um tampão de carga que contém 27 350 mM de NaCl, 5 mM de fosfato de sódio, pH 6,8 e, em seguida, carregada na coluna de cHA. A coluna foi lavada com tampão de lavagem (350 mM de NaCl, 5 mM de fosfato de sódio, pH 6,8), removida com tampão de remoção (300 mM de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 6,8), e em seguida regenerada com tampão de regeneração (500 mM de fosfato de potássio, 1,0 M de NaOH, pH 13,3) . Todas as taxas de fluxo foram mantidas de 2,5 a 3 cm/min. Os efluentes da coluna foram analisados por SEC-HPLC utilizando um sistema de HPLC.
Um resumo da recuperação de Myo-2 9 e da remoção de HMWA da preparação de anticorpo é apresentada na tabela 7. A preparação continha inicialmente 14,4 % de HMWA (carga), que foi reduzida para 0,2 % de HMWA (fluxo), utilizando o método de purificação de cHA da invenção.
Amostra % de recuperação % de HMWA na de Myo-29 amostra Carga N/A 14,4 Fluxo 79,6 0,2 Lavagem 12,2 1,9 Pós-lavagem 1,5 5, 6 Remoção 10,3 84,3
Exemplo 5: Purificação de cHA em modo de fluxo através, de um anticorpo anti-GDF-8 usando resina do tipo I
Uma coluna Vantage de 1,1 x 21 cm (Millipore, Billerica, MA) foi carregada em 200 mM de fosfato de sódio dibásico a pH 9,0 usando Macro-Prep de hidroxiapatite cerâmica do tipo I, resina de 40 μΜ de tamanho de partícula (BioRad, Hercules, CA) . A coluna foi equilibrada com 3 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 1 (300 mM de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 6,8), e 3 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 28
2 (1,0 M de NaCl, 3 mM de fosfato de sódio, pH 7,2). A preparação de anticorpo Myo-29 foi permutada por tampão para um tampão de carga que contém 1,0 M de NaCl, 3 mM de fosfato de sódio, pH 7,2 e, em seguida, carregada na coluna de cHA a um desafio de carga de 2 6 mg/ml. A coluna foi lavada com tampão de lavagem (1,0 M de NaCl, 3 mM de fosfato de sódio, pH 7,2), removida com tampão de remoção (300 mM de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 6,8), e em seguida regenerada com 5 volumes de coluna de tampão de regeneração (500 mM de fosfato de potássio, 1,0 M de NaOH, pH 13,3). As taxas de fluxo foram mantidas a menos de 90 cm/h para a carga e lavagem, e a menos de 240 cm/h para o resto do processo de purificação. Os efluentes da coluna foram analisados por SEC-HPLC utilizando um sistema de HPLC. A preparação de anticorpo inicialmente continha 27,2 % de HMWA (carga), que foi reduzida para 6,1 % de HMWA (fluxo). Além disso, a recuperação do monómero de anticorpo foi de 72 O, o ·
Exemplo 6: Purificação de cHA de uma preparação de anticorpo anti-CD22 A cromatografia de purificação de HA cerâmica também mostrou ser útil na purificação de uma preparação de anticorpo anti-CD22 . Uma coluna Vantage de 1,6 x 20 cm (Millipore, Billerica, MA) foi carregada em 200 mM de fosfato de sódio dibásico a pH 9,0 usando Macro-Prep de hidroxiapatite cerâmica do tipo II, resina de 40 μΜ de tamanho de partícula (BioRad, Hercules, CA) . A coluna foi equilibrada com 3 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 1 (300 mM de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 6,8), e 3
volumes de coluna de tampão de equilíbrio 2 (50 mM de NaCl, 5 mM de fosfato de sódio, pH 6,8) . Uma preparação de anticorpo anti-CD22 foi permutada por tampão para 50 mM de NaCl, 5 mM 29 de fosfato de sódio, pH 6,8 e, em seguida, carregada na coluna de cHA. A coluna foi lavada com 3 volumes de coluna de tampão de lavagem (50 mM de NaCl, 5 mM de fosfato de sódio, pH 6,8), e em seguida eluida por gradiente com 5 mM de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 6,8, em 15 volumes de coluna. A coluna foi removida com tampão de remoção (300 mM de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 6,8), e em seguida regenerada com tampão de regeneração (500 mM de fosfato de potássio, 1,0 M de NaOH) . Todas as taxas de fluxo foram mantidas de 2,5 a 3 cm/min. Os efluentes da coluna foram analisados por SEC-HPLC utilizando um sistema de HPLC.
Tal como mostrado na figura 3, a purificação de cHA foi bem sucedida na remoção de HMWA da preparação de anticorpo anti-CD22. A percentagem de HMWA na carga foi de 1,7 %, enquanto que a percentagem de HMWA no eluido de cHA foi de 0,0 %.
Exemplo 7: Purificação de cHA de vim anticorpo anti-Abeta A cromatografia de purificação de HA cerâmica também mostrou ser útil na purificação de uma preparação de anticorpo anti-Abeta. Uma coluna Vantage de 1,6 x 20 cm (Millipore) foi carregada em 200 mM de fosfato de sódio dibásico a pH 9,0 usando Macro-Prep de hidroxiapatite cerâmica do tipo II, resina de 40 μΜ de tamanho de partícula (BioRad, Hercules, CA). A coluna foi equilibrada com 3 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 1 (300 mM de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 6,8), e 5 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 2 (50 mM de NaCl, 5 mM de fosfato de sódio, pH 6,8) . Uma preparação de anticorpo anti-Abeta foi permutada por tampão para 50 mM de NaCl, 5 mM de fosfato de sódio, pH 6,8 e, em seguida, carregada na coluna. A coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de tampão de lavagem (50 mM de NaCl, 5 mM de fosfato de sódio, pH 6,8), e 30 em seguida eluída por gradiente com 5 mM de fosfato de sódio, 1.0 M de NaCl, pH 6,8, em 15 volumes de coluna. A coluna foi removida com tampão de remoção (300 mM de fosfato de sódio, 1.0 M de NaCl, pH 6,8), e em seguida regenerada com tampão de regeneração (500 mM de fosfato de potássio, 1,0 M de NaOH) . Todas as taxas de fluxo foram mantidas de 2,5 a 3 cm/min. Os efluentes da coluna foram analisados por SEC-HPLC utilizando um sistema de HPLC.
Tal como mostrado na figura 4, a purificação de cHA foi bem sucedida na remoção de HMWA da preparação de anticorpo anti-Abeta. A percentagem de HMWA na carga foi de 2,6 %, enquanto que a percentagem de HMWA no eluido de cHA foi de 0,0 %.
Exemplo 8: Avaliação da atividade do anticorpo Myo-29 purificado O anticorpo anti-GDF-8 foi purificado de acordo com o método descrito no exemplo 1, o Myo-29 foi testado para a atividade de ligação usando um ensaio imunoenzimático (ELISA). O ensaio ELISA competitivo pode ser adaptado para testar a atividade de ligação de outros anticorpos purificados. Veja-se, por exemplo, Antibodies: A laboratory manual, Harlow e Land (eds.), 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Um recetor GDF-8, ActRIIβ.Fc (2 pg/ml) foi adsorvido numa placa de micro-titulação de 96 poços num volume de 100 μΐ/poço. A placa foi então incubada de 2 a 8 °C durante a noite. A placa foi lavada duas vezes com tampão de lavagem (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,05 % de Tween 20), e bloqueada com uma solução de 4 % de albumina de soro bovino (BSA), para minimizar a ligação não especifica. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante 1,5 a 3,0 horas, e lavada duas vezes com tampão de lavagem (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,05 % de Tween 20). 31 0 padrão de referência de anticorpo Myo-29 foi diluído em série 4 vezes em diluente de ensaio (0,5 % de BSA, 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KC1), resultando num total de 8 pontos de padrão. As amostras de teste continham frações de anticorpo Myo-29 purificadas por uma etapa de cromatografia de Proteína A, bem como frações purificadas após uma etapa adicional de purificação de cHA. Estas amostras de teste também foram diluídas em série 2 vezes em diluente de ensaio, para resultar em 8 pontos que caíam dentro da gama da curva padrão. Os padrões e as amostras de teste foram adicionados aos poços de ensaio apropriados, a 50 μΐ/poço. Foi então adicionado a cada poço a 50 μΐ/poço, o concorrente com biotina, GDF-8 marcado com biotina (50 ng/ml). A placa foi incubada durante a noite num agitador de placas à temperatura ambiente. A placa foi lavada quatro vezes com tampão de lavagem (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,05 % de Tween 20) e o GDF-8 marcado com biotina ligado foi detetado com a adição de 100 μΐ/poço de peroxidase de rábano conjugada com estreptavidina (1:5000, Southern Biotech, Birmingham, Alabama). A placa foi incubada de 50 a 70 minutos no agitador de placas à temperatura ambiente, e depois foi revelada por adição de 100 μΐ/poço de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (BioFX, Owings Mills, MD). A absorvância de cada poço é determinada a 450 nm com um leitor de placas de ELISA (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . A quantidade de Myo-2 9 ativo na amostra de teste é indiretamente proporcional ao sinal gerado no ensaio. A reação foi parada pela adição de 100 μΐ/poço de 0,18 M de H2S04.
Uma concentração de Myo-29 capaz de ligação com o GDF-8 com biotina em amostras de teste foi interpolada a partir da curva padrão, que tinha sido ajustada usando uma equação 32 logística de 4 parâmetros. 0 valor da bioatividade (% de proteína ativa) de uma amostra de teste foi então calculado, dividindo a concentração de proteína ativa (determinada por ELISA) pela concentração total de proteína (determinada por A28o) r e multiplicando esta razão por 100. Se a mesma amostra foi purificada em lotes separados, foram calculadas as médias do valor da bioatividade. Os valores da bioatividade são apresentados na tabela 8.
Tabela 8. Atividade de ligação do anticorpo anti-GDF-8 (% de _proteína ativa)
Amostra Purificação pós-Proteina A Purificação pós-cHA 1 88 108 2 86 104 3 94 108
Tal como demonstrado na tabela 8, o Myo-29 mantém a sua capacidade para se ligar a GDF-8 depois de ser purificado pelo processo descrito no exemplo 1. A atividade de ligação de Myo-29 purificado é um pouco mais baixa nas frações de pico de eluente a partir da purificação de Proteína A. No entanto, a atividade de ligação excede a referência de anticorpo Myo-29 após uma etapa adicional de purificação de cHA, tal como descrito no exemplo 1.
Exemplo 9: Purificação de cHA em modo de combinação ligação / fluxo através, de um anticorpo anti-GDF-8 A cromatografia de purificação de HA cerâmica em modo de combinação ligação / fluxo através, também mostrou ser útil na purificação de uma preparação de anticorpo anti-GDF-8. A experiência detalhada em seguida foi realizada num sistema ÀKTAFPLC (General Electric). Uma coluna Vantage de 1,1 x 21 cm (Millipore) foi carregada em 200 mM de fosfato de sódio dibásico a pH 9,0 usando Macro-Prep de hidroxiapatite 33 cerâmica do tipo II, resina de 40 μΜ de tamanho de partícula (BioRad, Hercules, CA). A coluna foi equilibrada com 3 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 1 (300 mM de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 6,8), e 5 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 2 (50 mM de NaCl, 2,0 mM de fosfato de sódio, 100 mM de arginina, 100 mM de HEPES, pH 7,3). Uma preparação de anticorpo anti-GDF-8 foi carregada na coluna com um desafio de carga de 20 mg/ml. A coluna foi lavada com tampão de equilíbrio 2, removida com tampão de remoção (300 mM de fosfato de sódio, 1,0 M de NaCl, pH 6,8), e em seguida regenerada com tampão de regeneração (500 mM de fosfato de potássio, 1,0 M de NaOH, pH 13,3). A taxa de fluxo para a carga e lavagem foi de 1,5 cm/min. As taxas de fluxo para o resto do processo de purificação foram mantidas de 2,5 a 3,0 cm/min. Os efluentes da coluna foram analisados por SEC-HPLC utilizando um sistema de HPLC.
Os resultados demonstraram que o funcionamento da resina cHA do tipo II no modo de combinação ligação / fluxo através, é eficaz na remoção de HMWA de preparações de anticorpos. A preparação continha inicialmente 27 % de HMWA (carga), que foi reduzida para 1,1 % de HMWA (fluxo), utilizando o método de purificação de cHA da invenção.
Exemplo 10: Purificação de cHA em modo de combinação ligação / fluxo através, de um anticorpo anti-GDF-8 usando resina do tipo I O procedimento descrito no exemplo 9 foi repetido usando a resina cHA do tipo I em vez da resina cHA do tipo II. As condições de tampão foram idênticas às usadas no exemplo 9, com a exceção do tampão de equilíbrio 2, o qual era composto de 5,0 mM de fosfato de sódio, 100 mM de NaCl, 120 mM de arginina, 20 mM de HEPES, a um pH de 7,3.
Como mostrado na tabela 9, o funcionamento da resina cHA 34 do tipo I no modo de combinação ligação / fluxo através, é eficaz na remoção de HMWA a partir de preparações de anticorpo, mantendo os rendimentos de monómero de anticorpo. Além disso, o modo de combinação ligação / fluxo através, é eficaz na remoção de impurezas de Proteína A. Finalmente, a resina cHA do tipo I permitiu um desafio de carga aumentado de 55 mg/ml.
Tabela 9. Remoção de HMWA e rendimentos de monómeros de anticorpo da resina cHA do tipo I operada na combinação modo de ligação / fluxo através
Amostra % HMWA % Rendimento de monómero Proteína A (ppm) Execução 1 Carga 27,0 NA 236 Pico 0, 9 75 3, 3 Execução 2 Carga 27,2 NA — Pico 0,7 78 —
Exemplo 11: Rastreio de elevado rendimento de condições de tampão de cHA
Foi realizado um rastreio de elevado rendimento para otimizar as condições de tampão utilizadas para purificar uma preparação de anticorpo Myo-029, usando uma resina cHA do tipo I. O rastreio variou os níveis de fosfato de sódio, de cloreto de sódio, de arginina e de Myo-02 9 na resina cHA do tipo I, e examinou a extensão da ligação de Myo-02 9 e do agregado de elevado peso molecular (HMWA) à resina.
Foi adicionada a cada poço de uma placa de filtro de 96 poços resina cHA do tipo I (50 μΐ) . cada poço, rotulado de Al, A2. . . Hll, H12 nas tabelas 10-12, foi equilibrado em tampão de equilíbrio constituído por HEPES a 20 mM, pH 7,2, e uma combinação única de fosfato (tabela 10), de cloreto de sódio (tabela 11), e de arginina (tabela 12). 35
Tabela 10. Níveis de fosfato em cada poço
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1 mM 1 mM 1 mM 6 mM 5 mM 4 mM 1 mM 1 mM 1 mM 3 mM 2 mM 1 mM B 1 mM 1 mM 1 mM 6 mM 5 mM 4 mM 1 mM 1 mM 1 mM 3 mM 2 mM 1 mM C 1 mM 1 mM 1 mM 6 mM 5 mM 4 mM 1 mM 1 mM 1 mM 3 mM 2 mM 1 mM D 1 mM 1 mM 1 mM 6 mM 5 mM 4 mM 1 mM 1 mM 1 mM 3 mM 2 mM 1 mM E 2 mM 3 mM 4 mM 8 mM 10 mM 16 mM 2 mM 3 mM 4 mM 5 mM 6 mM 8 mM F 2 mM 3 mM 4 mM 8 mM 10 mM 16 mM 2 mM 3 mM 4 mM 5 mM 6 mM 8 mM G 2 mM 3 mM 4 mM 8 mM 10 mM 16 mM 2 mM 3 mM 4 mM 5 mM 6 mM 8 mM H 2 mM 3 mM 4 mM 8 mM 10 mM 16 mM 2 mM 3 mM 4 mM 5 mM 6 mM 8 mM 36
Tabela 11. Níveis de NaCl em cada poço 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 25 ti 25 ti 25 ri 25 ti 25 ti 25 ti 150 ti 025 ii 500 ti 500 ti 400 ii 300 ti B 25 ti 25 ti 25 ri 25 ri 25 ti 25 ti 250 ti 625 ii 500 mM 500 ti 400 ii 300 ti c 50 ti 100 li 200 mM 150 ii 100 ii 1200 ii 1250 ii 1250 ii 2500 ri 000 ti 800 ti 1000 ti D 50 ti 100 irM 200 ri 150 ri 100 ii 1200ri 1250 ri 1250 ii 2500 ii 600 ti 800 ii 1000 mM E 25 ti 25 ti 25 mM 25 mM 25 ii 25 ii 750 ii 625 mM 500 ti 500 ti 400 ri 300 ti F 25 ti 25 ti 25 ri 25 ri 25 ti 25 ti 250 ti 025 ri 500 ti 500 ti 400 ii 300 ti G 50 ti 100 irM 200 ti 50 ii 100 ii 200 ti 1250 ii 1250 ii 2500 irM 600 ii 800 ti 1000 ti H 50 ti 100 ri 200 ii 50 ii 100 ii 200 mM 1250 ii 1750 mM 2500 ii 600 nM 800 ii 1000 li
Tabela 12. Níveis de arqinina em cada poço
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 350 mM 300 ti 200 mM 12 ti 12 mM 12 mM 12 mM 12 mM 12 mM 75 mM 50 mM 25 mM B 450 mM 500 mM 000 mM 40 mM 120 mM 200 mM 40 mM 120 mM 200 mM 125 mM 150 mM 300 mM c 350 mM 300 mM 200 mM 12 mM 12 mM 12 mM 12 mM 12 mM 12 mM 75 mM 50 mM 25 mM D 450 mM 500 mM 000 mM 40 mM 120 mM 200 mM 40 mM 120 mM 200 mM 125 mM 150 mM 300 mM E 350 mM 300 mM 200 mM 12 mM 12 mM 12 mM 12 mM 12 mM 12 mM 75 mM 50 mM 25 mM F 450 mM 500 mM 600 mM 40 mM 120 mM 200 mM 40 mM 120 mM 200 mM 125 mM 150 mM 300 mM G 350 mM 300 mM 200 mM 12 mM 12 mM 12 mM 12 mM 12 mM 12 mM 75 mM 50 mM 25 mM H 450 mM 500 mM 600 mM 40 mM 120 mM 200 mM 40 mM 120 mM 200 mM 125 mM 150 mM 300 mM 37
Após ter sido adicionado a cada poço o tampão de equilíbrio único, foi adicionada a cada poço uma mistura de Myo-02 9 e agregado. 0 nível de agregado no desafio de carga foi de 25 %. Os constituintes do tampão foram mantidos ao mesmo nível que durante o equilíbrio. 0 material foi agitado durante 20 minutos, permitindo que o equilíbrio tenha sido atingido. O sobrenadante foi removido de cada poço da placa de filtro. Foi feita uma outra etapa de adição de preparação de anticorpo, e a placa foi agitada, e o sobrenadante removido. Foram realizadas até sete etapas. A proteína que não se tinha ligado em cada etapa foi analisada, para determinar a concentração de proteína total (por absorvância a A280 nm). A quantidade de monómero e de agregado foi medida por HPLC de exclusão por tamanho. Qualquer diminuição em agregado indicou uma condição favorável para purificação. As tabelas 13 e 14 mostram a percentagem de agregado e de monómero, por poço, num conjunto das quatro primeiras etapas.
Tabela 13. Nível de agregado (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 8 % 6 % 3 % 4 % 7 % 16 % 3 % 3 % 3 % 5 % 3 % 3 % B 12 % 15 % 17 % 3 % 3 % 5 % 3 % 4 % 4 % 6 % 5 % C 7 % 6 % 3 % 4 % 4 % •J o 5 % 4 % 4 % 6 % 6 % 4 % D 13 % 14 % 14 % 6 % 4 % 7 % 5 % 6 % 4 % 8 % 8 % 7 % E 11 % 10 % 6 % 4 % 19 % 11 % 5 % 6 % 7 % 9 % 8 % 6 % F 15 % 19 % 20 % 4 % 3 % 10 % 6 % 8 % 10 % 10 % 10 % 17 % G 10 % 9 % 6 % 6 % 3 % 7 % 8 % 14 % 17 % 10 % 16 % 22 % H 16 % 18 % 20 % 4 % 5 % 17 % 9 % 15 % 17 % 12 % 17 % 18 % 38
Tabela 14. Recuperação de monómero (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 51 % 44 % 24 % 3 % 3 % 2 % 43 % 34 % 25 % 53 % 32 % 11 % B 64 % 70 % 78 % 4 % 24 % 43 % 42 % 40 % 38 % 57 % 42 % 44 % C 49 % 43 % 27 % 4 9- 15 6 % 23 % 60 % 62 % 62 % 58 % 60 % 48 % D 65 % 68 % 75 % R s- O o 35 % 54 % 61 % 64 % 64 % 63 % 63 % 62 % E 61 % 58 % 44 % S 9-O o 3 % 5 % 58 % 62 % 64 % 66 % 65 % 63 % F 70 % 76 % 88 % 5 % 33 % 63 % 59 % 63 % 68 % 67 % 68 % 74 % G 57 % 57 % 50 % 4 % 7 % 65 % 72 % 82 % 85 % 70 % 80 % 83 % H 71 % 75 % 85 % 5 % 48 % 75 % 69 % 82 % 88 % 71 % 80 % 87 % O rastreio de elevado rendimento foi capaz de prever qualitativamente a recuperação de monómero e a remoção de HMWA, num esquema de purificação em coluna. Por exemplo, as condições do poço C8 (20 mM de HEPES, 1 mM de fosfato, 1750 mM de NaCl, e 12 mM de arginina, pH 7,2) foram testadas numa coluna carregada com resina cHA do tipo I. Os níveis de agregado foram reduzidos a 2,5 % e o rendimento de monómero foi de 72 %, após purificação em coluna. As condições do poço D5 (20 mM de HEPES, 5 mM de fosfato, 100 mM de NaCl, e 120 mM de arginina, pH 7,2) foram também testadas numa coluna carregada com resina cHA do tipo 1. Os níveis de agregado foram reduzidos a 0,7 % e o rendimento de monómero foi de 73 %, após purificação em coluna. Finalmente, as condições equivalentes ao poço 03 (100 mM de HEPES, 1 mM de fosfato, 120 mM de NaCl, e 200 mM de arginina, pH 7,2, onde o elevado nível de HEPES contribui força iónica de forma semelhante ao NaCl), foram testadas numa coluna carregada com resina cHA do tipo 1. Os níveis de agregado foram reduzidos a 4 %, com uma recuperação de monómero de 69 %, após purificação em coluna. Estes resultados demonstram que o rastreio de elevado rendimento subestima o desempenho da coluna, tal como medido 39 tanto pela recuperação de monómero como por remoção de HMWA. No entanto, o rastreio de elevado rendimento é capaz de prever qualitativamente tanto o rendimento como a pureza.
Todos os números que expressam quantidades de ingredientes, condições de reação, e assim por diante, utilizados na especificação e nas reivindicações, são para ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Por conseguinte, a menos que indicado em contrário, os parâmetros numéricos apresentados na especificação e nas reivindicações anexas são aproximações, que podem variar dependendo das propriedades desejadas procuradas serem obtidas pela presente invenção. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao âmbito das reivindicações, cada: parâmetro numérico deverá ser interpretado tendo em vista o número de algarismos significativos e abordagens de arredondamento comuns.
As realizações específicas aqui descritas são oferecidas apenas a título de exemplo, e não se destinam a ser limitativas em qualquer forma. 40
REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora tenha sido tomado muito cuidado na compilação das referências, não se poderão excluir erros e omissões e o EPO nega qualquer responsabilidade neste sentido.
Documentos de Patente citados na descrição • WO 2004037861 A [0036] • US 200400827641 AI [0036] • WO 0246237 A [0036]
Literatura não relacionada com patentes referida na descrição: • TARDITI . J. Immunol. Methods, 1992, vol. 599, 13-20 [0003] • STEINDL . J. Immunol. Methods, 2000, vol. 235, 61-69 [0003] • SHEPARD . J. of Chromatography, 2000, vol. 891, 93-98 [0004] • VOLA et al. BioTechniques, 1993, vol. 14, 650-655 [0005] GIOVANNINI. Biotechnology and Bioengineering, 2000, vol. 73, 522-529 [0006] [0007] STANKER. J. Immunological Methods, 1985, vol. 76, 157- 169 [0006] SHEPARD. J. Chromatography, 2000, vol. 891, 93-98 [0006] TARDITI. J. Chromatography, 1992, vol. 599, 13-20 [0006] GIOVANNINI, R. Biotechnology and Bioengineering, 2000, vol. 73, 522-529 [0006]
Ion Exchange Chromatography. KARLSSON et al. Protein Purification. VCH Publishers, Inc, 1989 [0006] 41 • JUNBAUER. J. Chromatography, 1989, vol. 476, 257-268 [0007] • Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1988 [0086]
Claims (29)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a purificação de pelo menos um monómero de anticorpo a partir de uma preparação de anticorpo contendo agregados de elevado peso molecular, que compreende sujeitar a preparação de anticorpo a cromatografia de hidroxiapatite, em que a cromatografia de hidroxiapatite compreende o contacto de uma resina de hidroxiapatite numa coluna com a preparação de anticorpo num tampão de carga, que compreende de 1 a 20 mM de fosfato de sódio e de 0,2 a 2,5 M de NaCl, e permitindo que o anticorpo purificado flua através da coluna.
2. O método da reivindicação 1, que compreende ainda submeter a preparação de anticorpo a (a) cromatografia de afinidade de Proteína A, e (b) cromatografia de permuta iónica.
3. O método da reivindicação 2, em que a cromatograf ia de afinidade de Proteína A é realizada em primeiro lugar, e a cromatografia de hidroxiapatite é realizada por último.
4. 0 método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o tampão de carga tem um pH de 6,4 a 7,6.
5. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o tampão de carga compreende de 3 mM a 5 mM de fosfato de sódio.
6. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o tampão de carga compreende de 0,35 M a 1 M de NaCl.
7. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, 2 em que o tampão de carga tem um pH de 6,8 a 7,2.
8. 0 método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo IgG, IgA, IgD, IgE, IgM.
9. 0 método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é monoclonal, policlonal, quimérico, humanizado, ou um fragmento do mesmo.
10. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo recetor anti-IL-21, anti-GDF-8, anti-Abeta, anti-CD22, anti-Lewis Y, anti-IL-13, ou anti-IL-22.
11. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo tem um pi básico.
12. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a resina é hidroxiapatite cerâmica do tipo I ou do tipo II.
13. 0 método da reivindicação 12, em que a resina é hidroxiapatite cerâmica do tipo I.
14. O método de qualquer uma das reivindicações de 2 a 13, em que a cromatografia de permuta iónica é cromatografia de permuta aniónica.
15. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a coluna é lavada para permitir que o anticorpo purificado adicional flua através da coluna. 3
16. Um método para a purificação de pelo menos um monómero de anticorpo a partir de uma preparação de anticorpo que contém agregados de elevado peso molecular, que compreende: (a) pôr em contacto a preparação de anticorpo com um suporte de proteína A, (b) permitir que o anticorpo adsorva ao suporte de proteína A, (c) lavar o suporte de Proteína A e anticorpo adsorvido com pelo menos um tampão de lavagem de Proteína A, (d) eluir o anticorpo adsorvido com pelo menos um tampão de eluição de Proteína A, (e) pôr em contacto o eluído de Proteína A com um suporte de permuta iónica, (f) purificar parcialmente o anticorpo ao longo do suporte de permuta iónica, (g) trocar o anticorpo parcialmente purificado para um tampão de carga que compreende de 1 a 20 mM de fosfato de sódio e de 0,2 a 2,5 M de NaCl, (h) pôr em contacto o anticorpo parcialmente purificado no tampão de carga com uma resina de hidroxiapatite, (i) permitir que o anticorpo flua através da resina de hidroxiapatite, e (j) lavar a resina de hidroxiapatite com pelo menos um tampão de lavagem de hidroxiapatite.
17. O método da reivindicação 16, em que o tampão de carga tem um pH de 6,4 a 7,6.
18. O método de qualquer uma das reivindicações 16 ou 17, em que o tampão de carga compreende 5 mM de fosfato de sódio.
19. O método de qualquer uma das reivindicações de 16 a 18, 4 em que o tampão de carga compreende 350 mM de NaCl.
20. 0 método de qualquer uma das reivindicações de 16 a 19 em que o tampão de carga tem um pH de 6,8.
21. 0 método de qualquer uma das reivindicações de 16 a 20 em que o anticorpo é um anticorpo IgG, IgA, IgD, IgE ou IgM.
22. 0 método de qualquer uma das reivindicações de 16 a 21 em que o anticorpo é monoclonal, policlonal, quimérico humanizado, ou um fragmento do mesmo.
23. 0 método de qualquer uma das reivindicações de 16 a 22, em que o anticorpo é um anticorpo recetor anti-IL-21, anti-GDF-8, anti-Abeta, anti-CD22, anti-Lewis Y, anti-IL-13, ou anti-IL-22.
24. 0 método de qualquer uma das reivindicações de 16 a 23, em que o anticorpo tem um pi básico.
25. 0 método de qualquer uma das reivindicações de 16 a 24, em que a resina é hidroxiapatite cerâmica do tipo I ou do tipo II.
26. 0 método da reivindicação 25, em que a resina é hidroxiapatite cerâmica do tipo I.
27. 0 método de qualquer uma das reivindicações de 16 a 26, em que a cromatografia de permuta iónica é cromatografia de permuta aniónica.
28. 0 método de qualquer uma das reivindicações de 16 a 27, 5 que compreende ainda filtrar o anticorpo parcialmente purificado antes da aplicação na resina de hidroxiapatite, reduzindo assim os contaminantes virais.
29. 0 método de qualquer uma das reivindicações de 16 a 28, que compreende ainda submeter o fluxo através de hidroxiapatite a pelo menos um de ultrafiltração ou diaf iltração.
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