PT1616868E

PT1616868E - Métodos para obter paclitaxel a partir de plantas taxus

Info

Publication number: PT1616868E
Application number: PT04016493T
Authority: PT
Inventors: Bruno Gabetta; Gianfranco Zini
Original assignee: Indena Spa
Priority date: 2004-07-13
Filing date: 2004-07-13
Publication date: 2007-12-10
Also published as: WO2006005429A1; RU2373198C2; NO20070192L; RU2007101233A; JP2008505946A; AU2005261970B2; AU2005261970A1; CN1984896A; JP4890455B2; CA2573601C; SI1616868T1; KR20060005958A; CA2573601A1; CN100546986C; DE602004008903D1; IL180643A0; EP1616868A1; DK1616868T3; PL1616868T3; DE602004008903T2

Description

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DESCRIÇÃO

"MÉTODOS PARA OBTER PACLITAXEL A PARTIR DE PLANTAS TAXUS" CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção diz em geral respeito a métodos para obter paclitaxel a partir de plantas que contêm paclitaxel. A invenção diz em particular respeito a métodos para extrair paclitaxel a partir de plantas da família Taxaceae, que inclui as plantas do género Taxus, como a Taxus media, envolvendo uma série de passos de cromatografia em coluna seguidos pela cristalização do paclitaxel.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 paclitaxel é um composto anticancerígeno derivado principalmente a partir da casca da árvore Taxus brevifolia (teixo do Pacífico). Nos anos sessenta, o National Câncer Institute deu início a um estudo de extractos de plantas que apresentavam actividade anticancerígena ou antineoplásica. Constatou-se que o extracto bruto da casca do Taxus brevifolia inibe vários tumores. Em 1971, o paclitaxel foi isolado e descrito por M. C. Wani et ai. (J. Am. Chem. Soc., 93, 2325,(1971)), que definiram a estrutura do paclitaxel utilizando métodos químicos e análise cristalográfica de raios X. Em 1979, Schiff e os seus colaboradores demonstraram o novo mecanismo de acção do paclitaxel. Este mecanismo inclui a ligação a microtúbulos e a prevenção da sua despolimerização sob condições em que a despolimerização ocorreria normalmente. 0 paclitaxel é actualmente utilizado no tratamento do cancro do ovário, da mama e do cancro do pulmão de células pequenas. 2

Apesar de ser um produto natural extraído principalmente a partir da casca do teixo do Pacífico (T. brevifolia) , o paclitaxel também se encontra em outros membros da família Taxaceae, incluindo T. canadensis e T. yunnanensis. 0 paclitaxel também está presente nas partes foliares e raízes de outras espécies de teixo, incluindo o teixo comum (T. baccata), cujas agulhas contêm paclitaxel e análogos, teixos asiáticos (T. wallichiana e T. chinensis) , e árvores de teixo cultivadas para fins ornamentais. Descobriu-se que as variedades que se seguem de cultivares de Taxus também contêm paclitaxel: T.x media «Henryi», T.x media «Runyan», T. cuspidata, T.x media «Halloran», T.x media «Hatfield», T.x media «Hicksii», T.x media «Tauntonii», T.x media «Dark Green Spreader», T.x media «Wardii», T.x media «Browníi», T.x media «Densiformis», T.x media «Nigra», T.x cuspidata «Brevifolia», e T. cuspidata «Spreader».

Todas estas espécies contêm paclitaxel em quantidades muito limitadas. Por exemplo, a casca das árvores T. brevifolia e T. yunnanensis contém cerca de 0,02% de paclitaxel e as agulhas e as raízes dos arbustos T. media Hicksii contêm entre cerca de 0,005% a cerca de 0,1% de paclitaxel.

Por conseguinte, é muito importante desenvolver métodos eficientes para extrair paclitaxel com elevado grau de pureza a partir de material vegetal. A presente invenção fornece métodos para extrair paclitaxel com elevado grau de pureza a partir de materiais vegetais utilizando cromatografia seguida de cristalização do paclitaxel.

RESUMO DA INVENÇÃO 3

Por conseguinte, é um objectivo da presente invenção fornecer métodos para obter paclitaxel com elevado grau de pureza a partir de plantas que contêm paclitaxel. Estes métodos têm as vantagens de assegurar a estabilidade do paclitaxel, permitindo a utilização de vários cultivares de Taxus ou partes destes, independentemente do conteúdo de paclitaxel, e permitindo a recuperação máxima do paclitaxel presente na biomassa. Os métodos descritos na presente invenção fornecem várias vantagens em relação aos métodos anteriores. Por exemplo, é sabido que o paclitaxel pode sofrer reacções de degradação, como a epimerisação na posição 7, a desacetilização na posição 10, e a separação da cadeia lateral na posição 13. Estas reacções de degradação, que afectam tanto a qualidade como o rendimento do paclitaxel isolado, são provocadas pelo aquecimento, especialmente em meios que contêm grandes quantidades de solventes alcoólicos. Nos métodos descritos na presente invenção, utilizam-se alcoóis em quantidades limitadas e em condições diluídas e geralmente não está envolvido nenhum aquecimento durante o procedimento de extracção. Logo, os métodos aqui descritos aumentam a estabilidade do paclitaxel.

Além disso, os métodos aqui descritos podem utilizar vários tipos de partes de plantas como materiais iniciais. Mais especificamente, o material inicial utilizado na presente invenção pode ser folhas, troncos, ramos, cascas, raízes isoladas, ou misturas destes, de uma planta que contém paclitaxel. O material inicial pode ser seleccionado independentemente da razão das partes da planta, a natureza da cultivar de Taxus e do conteúdo de paclitaxel. Os métodos da presente invenção fornecem a mesma eficácia do procedimento e asseguram uma constante e elevada qualidade 4 de paclitaxel. Os métodos aqui descritos também permitem rendimentos elevados de paclitaxel.

Estes métodos compreendem a preparação de um extracto de paclitaxel pela extracção de paclitaxel a partir de um material vegetal. 0 paclitaxel é separado do extracto de paclitaxel utilizando sistemas de cromatografia em coluna, em que cada sistema de cromatografia em coluna compreende uma fase estacionária e um solvente de eluição, e a cristalização do paclitaxel contido em pelo menos uma fracção obtida no passo final de cromatografia. Em alguns modos de realização, o paclitaxel é cristalizado a partir de todas as fracções obtidas a partir do passo final de cromatografia. Os cristais de paclitaxel resultantes podem ser secos. Conforme descrito acima, podem-se utilizar várias biomassas como material vegetal inicial. Se forem utilizadas plantas inteiras de Taxus media como biomassa, o material vegetal é normalmente composto por cerca de 40 a cerca de 60 por cento do peso (p/p) em partes aéreas e por cerca de 60 a cerca de 40 por cento (p/p) de raízes. Adicionalmente, a fase estacionária e o solvente de eluição podem diferir entre sistemas diferentes.

Nos métodos da presente invenção, o paclitaxel é extraído a partir de um material vegetal para originar um extracto de paclitaxel. O paclitaxel pode ser extraído a partir de um material vegetal utilizando um solvente, como uma combinação de água e um solvente orgânico. São utilizados sistemas de cromatografia em coluna para separar o paclitaxel do extracto de paclitaxel, ao obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel após cada separação cromatográfica e, opcionalmente, submetendo essa dita fracção a pressão reduzida para remover o solvente de 5 eluição. Quando se recolhe mais de uma fracção após cada separação, pelo menos algumas das fracções que contêm paclitaxel podem ser combinadas antes de remover o solvente de eluição desta combinação. Adicionalmente, a cristalização pode ocorrer ao longo de um período de 24 horas e pode ocorrer a temperatura ambiente. A presente invenção fornece ainda um método para extrair paclitaxel a partir de Taxus media ao extrair o material vegetal com uma solução aquosa compreendendo cerca de 40 a cerca de 60 por cento de volume (v/v) de acetona a temperatura ambiente.

Num modo de realização, os métodos da presente invenção compreendem a preparação de um extracto de paclitaxel pela extracção de paclitaxel de um material vegetal e a posterior separação do paclitaxel do extracto de paclitaxel utilizando um primeiro sistema de cromatografia em coluna compreendendo uma primeira fase estacionária e um primeiro solvente de eluição para obter pelo menos uma fracção que contém paclitaxel. 0 paclitaxel é depois separado a partir dessa dita fracção, utilizando um segundo sistema de cromatografia em coluna que compreende uma segunda fase estacionária e um segundo solvente de eluição para obter pelo menos uma fracção que contém paclitaxel. Consequentemente, o paclitaxel é separado a partir dessa dita fracção, utilizando um terceiro sistema de cromatografia em coluna que compreende uma terceira fase estacionária e um terceiro solvente de eluição para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel. Ademais, o paclitaxel é separado a partir dessa dita fracção, utilizando um quarto sistema de cromatografia em coluna que compreende uma quarta fase estacionária e um quarto solvente de eluição para remover pelo menos cefalomanina e para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel. O 6 paclitaxel é depois cristalizado a partir dessa fracção utilizando um solvente de cristalização para obter cristais de paclitaxel.

Num outro modo de realização, os métodos da presente invenção compreendem a preparação de um extracto de paclitaxel pela extracção de paclitaxel a partir de um material vegetal. 0 paclitaxel é depois separado a partir do extracto de paclitaxel utilizando um primeiro sistema de cromatografia em coluna que compreende uma primeira fase estacionária e um primeiro solvente de eluição para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel e removendo o primeiro solvente de eluição dessa mesma fracção para originar um primeiro resíduo. De seguida, o paclitaxel é separado do primeiro resíduo utilizando um segundo sistema de cromatografia em coluna que compreende uma segunda fase estacionária e um segundo solvente de eluição para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel a partir do primeiro resíduo, e removendo depois o segundo solvente de eluição da mesma fracção para originar um segundo resíduo. Subsequentemente, o paclitaxel é separado do segundo resíduo utilizando um terceiro sistema de cromatografia em coluna que compreende uma terceira fase estacionária e um terceiro solvente de eluição para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel a partir do segundo resíduo, e removendo depois o terceiro solvente de eluição da mesma fracção, para originar um terceiro resíduo. 0 paclitaxel é depois separado do terceiro resíduo utilizando um quarto sistema de cromatografia em coluna que compreende uma quarta fase estacionária e um quarto solvente de eluição para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel a partir do terceiro resíduo, e removendo depois o quarto solvente de eluição do terceiro resíduo para originar um 7 quarto resíduo. 0 paclitaxel é depois cristalizado a partir do quarto resíduo utilizando um solvente de cristalização para obter cristais de paclitaxel.

Num outro modo de realização, os métodos da presente invenção compreendem a preparação de um extracto de material vegetal a partir de Taxus media pela extracção do material vegetal com um solvente aquoso compreendendo cerca de 40 até cerca de 60 por cento de v/v de acetona a temperatura ambiente e preparando depois um extracto de paclitaxel pela extracção de paclitaxel a partir do extracto de material vegetal. O paclitaxel é depois separado a partir do extracto de paclitaxel compreendendo a utilização de um primeiro sistema de cromatografia que compreende sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo apenas diclorometano ou uma mistura de diclorometano e metanol para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel. Essa mesma fracção é depois submetida a pressão reduzida para remover o diclorometano e/ou o metanol. O paclitaxel é depois separado dessa mesma fracção utilizando um segundo sistema de cromatografia em coluna compreendendo alumina neutra como a fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo acetona para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel, e submetendo depois a mesma fracção a pressão reduzida para remover a acetona. Subsequentemente, o paclitaxel é separado dessa dita fracção utilizando um terceiro sistema de cromatografia em coluna compreendendo sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo uma mistura de n-hexano e acetona e para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel, e submetendo depois essa dita fracção a pressão reduzida para remover o n-hexano e a acetona. Além disso, o paclitaxel é separado dessa mesma fracção utilizando um quarto sistema de cromatografia em coluna compreendendo sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo acetato de t-butilo para remover pelo menos cefalomanina e para obter pelo menos uma fracção que contém paclitaxel, e submetendo a dita fracção a pressão reduzida para remover o acetato de t-butilo. A dita fracção é cristalizada ao longo de um período de 24 horas utilizando uma mistura de ciclohexano e acetona como o solvente de cristalização a temperatura ambiente para obter cristais de paclitaxel. Subsequentemente, os cristais de paclitaxel são secos sob vácuo durante 48 horas.

Num outro modo de realização, os métodos da presente invenção compreendem a preparação de um extracto de material vegetal a partir de Taxus media pela extracção do material vegetal com um solvente aquoso compreendendo cerca de 40 até cerca de 60 por cento de v/v de acetona a temperatura ambiente e pela posterior preparação de um extracto de paclitaxel extraindo paclitaxel a partir do extracto de material vegetal. O paclitaxel é depois separado a partir do extracto de paclitaxel utilizando um primeiro sistema de cromatografia compreendendo sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo diclorometano e metanol para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel e submetendo essa mesma fracção a pressão reduzida para obter um resíduo, e dissolvendo depois o resíduo em acetona para obter uma composição acetona-resíduo. Subsequentemente, o paclitaxel é separado da composição acetona-resíduo utilizando um segundo sistema de cromatografia em coluna compreendendo alumina neutra como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo acetona para obter pelo menos uma 9 fracção contendo paclitaxel. A dita fracção é submetida a pressão reduzida para remover a acetona. 0 paclitaxel é depois separado da dita fracção utilizando um terceiro sistema de cromatografia em coluna compreendendo sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo n-hexano e acetona para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel, e submetendo a mesma fracção a pressão reduzida para remover o n-hexano e a acetona. 0 paclitaxel é separado da dita fracção utilizando um quarto sistema de cromatografia em coluna compreendendo sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo acetato de t-butilo para remover pelo menos cefalomanina e para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel, e submetendo a mesma fracção a pressão reduzida para remover o acetato de t-butilo. A mesma fracção é cristalizada ao longo de um período de 24 horas utilizando uma mistura de ciclohexano e acetona como o solvente de cristalização a temperatura ambiente para obter cristais de paclitaxel. Os cristais de paclitaxel são secos sob vácuo durante 48 horas.

Num modo de realização, os métodos da presente invenção compreendem a preparação de um extracto de material vegetal a partir do Taxus media pela extracção do material vegetal com uma solução aquosa compreendendo cerca de 40 até cerca de 60 por cento v/v de acetona a temperatura ambiente e pela preparação de um extracto de paclitaxel extraindo paclitaxel do extracto de material vegetal. O paclitaxel é separado a partir do extracto de paclitaxel utilizando um primeiro sistema de cromatografia compreendendo alumina neutra como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo diclorometano e metanol para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel e submetendo a mesma 10 fracção a pressão reduzida para remover o diclorometano e o metanol. O paclitaxel é separado da mesma fracção utilizando um segundo sistema de cromatografia em coluna compreendendo sílica gel como uma fase estacionaria e um solvente de eluição compreendendo diclorometano e metanol para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel, e submetendo a mesma fracção a pressão reduzida para obter um resíduo, e dissolvendo o resíduo em acetona para obter uma composição acetona-resíduo. Subsequentemente, o paclitaxel é separado da composição acetona-resíduo utilizando um terceiro sistema de cromatografia em coluna compreendendo sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo n-hexano e acetona para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel, e submetendo a mesma fracção a pressão reduzida para remover a mistura de n-hexano e acetona. Subsequentemente, o paclitaxel é separado da mesma fracção utilizando um quarto sistema de cromatografia em coluna compreendendo sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo um acetato de t-butilo para remover pelo menos cefalomanina e para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel, e submetendo a dita fracção a pressão reduzida para remover o acetato de t-butilo. De seguida, a dita fracção é cristalizada ao longo de um período de 24 horas utilizando uma mistura de ciclohexano e acetona como o solvente de cristalização a temperatura ambiente para obter cristais de paclitaxel. Os cristais de paclitaxel são secos sob vácuo durante 48 horas.

BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA A Figura 1 é um fluxograma que esboça um modo de realização dos métodos da presente invenção. 11

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Os métodos da presente invenção incluem um método para obter paclitaxel a partir de plantas que contém paclitaxel. A Figura 1 mostra um fluxograma que esboça os passos de um modo de realização dos métodos da presente invenção. 0 Passo A compreende a preparação de um extracto de paclitaxel pela extracção do paclitaxel de um material vegetal contendo paclitaxel. 0 paclitaxel é depois separado dos outros constituintes no extracto de paclitaxel nos Passos B-E utilizando sistemas de separação de cromatografia em coluna. Cada passo marcado com (i) envolve a separação de paclitaxel do extracto de paclitaxel ou da fracção cromatográfica utilizando um sistema de cromatografia em coluna compreendendo uma fase estacionária e um solvente de eluição para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel. Cada passo marcado com (ii) compreende a remoção do solvente de eluição da mesma fracção obtida no passo cromatográfico anterior. Num modo de realização preferido, a dita fracção é submetida a pressão reduzida para remover o solvente de eluição. As legendas (a) e (b) na Figura 1 designam vias de separação alternativas. Por exemplo, se a via (a) for seguida para cada passo de separação, o solvente de eluição não é removido da referida fracção de paclitaxel. Em contraste, se a via (b) for utilizada para cada passo de separação, o solvente de eluição é removido da referida fracção de paclitaxel. Em certos modos de realização, a via (a) pode ser seguida para determinados passos de separação e a via (b) pode ser seguida para outros passos de separação. Por exemplo, no Passo B, pode-se utilizar a via (b) de modo a remover o solvente de eluição da fracção obtida no Passo B, enquanto no Passo C se pode utilizar a via (a) de modo a submeter 12 directamente a fracção à separação no Passo D, sem a remoção do solvente de eluição do Passo C. 0 Passo F envolve a cristalização da mesma fracção obtida a partir do passo final de cromatografia. Num modo de realização especifico, a mesma fracção obtida no Passo E(ii) é cristalizada no Passo F. Apesar de só se apresentarem quatro passos de cromatografia na Figura 1, podem existir passos de cromatografia adicionais antes da cristalização. 0 passo de cristalização pode ser seguido por um passo de secagem. 0 Material vegetal 0 material inicial para utilizar no Passo A da presente invenção é material vegetal contendo paclitaxel. Material vegetal adequado pode ser obtido a partir das partes de plantas da família Taxaceae, isto é, planta Taxus. 0 material vegetal é preparado, preferencialmente, a partir de Taxus media. As variedades apropriadas de Taxus media incluem T.x media «Hill», T.x media «Henryi», T.x media «Runyan», T. cuspidata, T.x media «Halloran», T.x media «Hatfield», T.x media «Hicksii», T.x media «Tauntonii», T.x media «Dark Green Spreader», T.x media «Wardii», T.x media «Brownii», T.x media «Densiformis», T.x media «Nigra», T.x cuspidata «Brevifolia», e T.x cuspidata «Spreader». Além disso, o material vegetal pode ser preparado a partir de várias partes da planta Taxus, como raízes, folhas, ramos, sementes, cascas, troncos frescos ou secos, ou misturas destes. 0 material vegetal é preparado, preferencialmente, a partir de cerca de 40 até cerca de 60 por cento p/p de partes aéreas e de cerca de 40 até cerca de 60 por cento p/p de raízes. O material vegetal é obtido a partir de uma parte de uma planta que contém paclitaxel, por exemplo, 13 através da extracção, do esmagamento ou do corte. Num modo de realização específico, o material vegetal a ser extraído é moído utilizando uma linha de moagem com lâminas equipada, por exemplo, com uma malha de 10 mm. Num modo de realização, o material vegetal é extraído utilizando pelo menos um solvente de extracção. Os solventes adequados incluem solventes aquosos, como solventes orgânicos aquosos, por exemplo, acetona em água. Utiliza-se preferencialmente uma mistura de cerca de 40 até cerca de 60 por cento de volume de acetona e cerca de 60 até cerca de 40 por cento de volume de água. A acetona aquosa pode prevenir a degradação do paclitaxel. A extracção ocorre preferencialmente a temperatura ambiente. A extracção a temperatura ambiente pode prevenir a degradação do paclitaxel.

Extracção de Paclitaxel e Congéneres

Antes do primeiro passo de cromatografia, por exemplo, o Passo B, prepara-se um extracto de paclitaxel como no Passo A. Num modo de realização, o extracto de paclitaxel é preparado pela extracção do paclitaxel a partir do material vegetal comum solvente. Num modo de realização específico, o extracto de paclitaxel é preparado pelo tratamento de um extracto de acetona aquoso do material vegetal. Solventes de extracção adequados incluem sem limitação ésteres alifáticos, como acetato de etilo, ou solventes clorados, como clorofórmio ou diclorometano. Um solvente de extracção preferido é o diclorometano. Num modo de realização especifico, antes de o paclitaxel ser extraído com um dos solventes anteriores, o extracto de acetona aquoso é concentrado sob vácuo para eliminar a acetona. O concentrado pode depois ser diluído com um solvente. Este 14 solvente de diluição pode incluir álcool metílico ou outros solventes alcoólicos hidrossolúveis como álcool etílico ou propílico. 0 paclitaxel é depois extraído a partir do concentrado diluído utilizando um solvente de extracção como o diclorometano e os outros solventes de extracção acima descritos. Forma-se o extracto de paclitaxel.

Num modo de realização, o extracto de paclitaxel é concentrado sob vácuo de modo a eliminar os solventes. 0 extracto de paclitaxel concentrado contém paclitaxel e os seus congéneres, clorofilas, gorduras, lignanas, flavonóides, fenóis e várias impurezas polares. Os congéneres incluem, por exemplo, cefalomanina, N-desbenzoil-N-hexanoil-paclitaxei, N-desbenzoil-N-hexanoil-N-metil-paclitaxel, N-desbenzoil-N-fenilacetil-paclitaxei, N-desbenzoil-N-cinamoil-paclitaxel, e 2-debenzoil-2-tigloil-paclitaxel. Cada um destes pode ser acompanhado pelo respectivo derivado 7-epi, 10-desacetil e 7-0-xilosil. Os derivados posteriores correspondentes do paclitaxel também estão presentes. Estes constituintes ou impurezas não-paclitaxel podem ser removidos utilizando técnicas de cromatografia como as descritas abaixo.

Purificação do Paclitaxel por Cromatografia 0 paclitaxel é separado do extracto de paclitaxel através da aplicação de pelo menos quatro passos de cromatografia em coluna designados na Figura 1 como Passos B-E. Cada um dos Passos B(i)-E(i) inclui a utilização de um sistema de cromatografia compreendendo uma fase estacionária e um solvente de eluição. Cada sistema pode ser a mesma aparelhagem com uma fase estacionária e um solvente de eluição diferentes. As fases estacionárias apropriadas 15 incluem sem limitação alumina neutra e silica gel. Solventes de eluição possíveis incluem sem limitação acetona, diclorometano, metanol, n-hexano, acetato de t-butilo, clorofórmio e acetato de etilo.

Cada passo de cromatografia inclui a utilização de um sistema de cromatografia em coluna compreendendo uma fase estacionária e um solvente de eluição para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel. Pelo menos uma fracção pode incluir uma combinação de múltiplas fracções obtidas a partir de um passo de cromatografia. Por exemplo, pode-se obter mais de uma fracção a partir de um passo de cromatografia. Estas fracções são depois combinadas e o passo seguinte de cromatografia é realizado nas fracções combinadas.

Num modo de realização, o solvente de eluição é removido de pelo menos uma fracção. Pelo menos uma fracção pode ser submetida a pressão reduzida nos Passo B(ii)-E(ii) para remover o solvente de eluição. Δ remoção do solvente pode incluir apenas uma porção do solvente, não implicando necessariamente a totalidade do solvente na dita fracção.

Num modo de realização, o primeiro passo de cromatografia, o Passo B(i), separa normalmente gorduras, clorofilas, fenólicos de baixo peso molecular e impurezas muito polares do paclitaxel. 0 segundo passo de cromatografia, o Passo C(i), separa normalmente impurezas adicionais, especialmente flavonóides e lignanas do paclitaxel. 0 terceiro passo de cromatografia, o Passo D(i), separa normalmente outros taxanos do paclitaxel. Esses taxanos incluem os derivados de taxano acima referidos, especialmente, cefalomanina e quantidades mínimas de outros 16 taxanos, como aqueles acima descritos. 0 quarto passo de cromatografia, o Passo E(i), separa a cefalomanina congénere do paclitaxel. Fases estacionárias apropriadas para remover cefalomanina incluem o sílica gel. Exemplos de solventes de eluição úteis incluem acetato de t-butilo, acetato de i-butilo, formiato de n-butilo, formiato de i-butilo, formiato de t-butilo e formiato de s-butilo. Ver patente norte-americana n.° 6,333,419, cujos conteúdos são aqui incorporados na sua totalidade para referência.

Num modo de realização, o primeiro sistema de cromatografia em coluna compreende uma fase estacionária compreendendo sílica gel e um solvente de eluição compreendendo cloreto de metileno seguido de uma mistura de cloreto de metileno -metanol numa relação v/v de 99:1 ou 98:2. Num outro modo de realização, o segundo sistema de cromatografia em coluna compreende uma fase estacionária compreendendo alumina neutra e um solvente de eluição compreendendo acetona. Ainda num outro modo de realização, o terceiro sistema de cromatografia em coluna compreende uma fase estacionária compreendendo sílica gel e um solvente de eluição compreendendo n-hexano e acetona numa relação v/v de 4:1. Num modo de realização, o quarto sistema de cromatografia em coluna compreende uma fase estacionária compreendendo silica gel e um solvente de eluição compreendendo acetato de t-butilo.

Opcionalmente, também é possível eliminar as impurezas numa ordem diferente. Por exemplo, a remoção de fenólicos sobre alumina pode ser realizada antes da eliminação de clorofilas e gorduras utilizando sílica gel como fase estacionária.

Cristalização de Paclitaxel 17

Após o passo final de cromatografia, a referida fracção que contém paclitaxel que é obtida a partir desse passo é cristalizada no Passo F, utilizando um solvente de cristalização para obter cristais de paclitaxel. Entre os solventes de cristalização apropriados estão o ciclohexano, acetona, n-hexano, i-hexano, h-heptano, acetato de t-butilo e misturas derivadas. Utiliza-se preferencialmente uma mistura de ciclohexano e acetona numa relação de 1:1. Num modo de realização, a cristalização ocorre a temperatura ambiente. Geralmente a cristalização ocorre ao longo de um período de 24 horas. Contudo, a cristalização também pode ocorrer ao longo de outros períodos de tempo. Após a cristalização, os cristais de paclitaxel são secos sob vácuo a uma temperatura, por exemplo, entre cerca de 50 °C até cerca de 60 °C. Os cristais são secos preferencialmente durante 48 horas. EXEMPLO 1

Extraiu-se uma tonelada de material vegetal seco e moído obtido do T. media Hicksii composta por cerca de 500 kg de raízes e cerca de 500 kg de folhas e galhos a temperatura ambiente com 15 000 L de acetona aquosa a 50%. O extracto foi concentrado sob vácuo até um volume 300 L. Depois adicionou-se 150 L de metanol e levaram-se a cabo cinco extracções com 200 L de diclorometano. As camadas orgânicas recolhidas foram concentradas sob vácuo até se obter um resíduo mole, que foi redissolvido em diclorometano cromatografado em coluna sobre 180 kg de sílica gel. Eluiram-se através da coluna e descartaram-se cerca de 2700 L de diclorometano. 18 0 paclitaxel foi depois eluído com uma mistura de diclorometano - metanol 99:1 (v/v). A solução foi depois evaporada sob vácuo de modo a obter um resíduo mole. 0 resíduo foi dissolvido em 8 L de acetona para obter um resíduo de acetona que foi passado através de uma coluna contendo 30 kg de alumina neutra, eluindo com o mesmo solvente. Recolheram-se fracções contendo paclitaxel e concentraram-se sob vácuo até um volume de 8 L. A solução de acetona foi depois colocada numa coluna contendo 180 kg de sílica gel carregada com a mistura de n-hexano - acetona 4:1. A eluição com este eluente forneceu paclitaxel sem a maioria dos outros taxanos, excepto cefalomanina. As fracções contendo paclitaxel foram recolhidas e concentradas sob vácuo até um volume de 5 L. A solução foi depois cromatografada sobre 180 kg de sílica gel carregada com acetato de t-butilo, eluindo com este solvente. As fracções contendo paclitaxel foram recolhidas e evaporadas sob vácuo até se obter um resíduo mole. A eluição adicional das colunas com acetato de t-butilo removeu pelo menos a cefalomanina. O resíduo mole (cerca de 300g) contendo paclitaxel foi dissolvido em 2 L de acetona, diluído com 1,2 L de ciclohexano e deixado a cristalizar. Após filtração e secagem a 50 °C durante 48 horas, obtiveram-se 255 g de paclitaxel com um grau de pureza superior a 99%. EXEMPLO 2

Extraíram-se cem quilogramas de material vegetal seco e moído obtido do/da planta inteira Taxus media «Dark Green Spreader" composta por cerca de 4 0 kg de raízes e cerca de 19

60 kg de folhas e galhos a temperatura ambiente com 1500 L de acetona aquosa a 50%. 0 extracto foi concentrado sob vácuo até um volume 30 L. Depois adicionou-se 15 L de metanol e levaram-se a cabo cinco extracções com 20 L de diclorometano. Os extractos de diclorometano foram recolhidos e concentrados sob vácuo até um volume de 15 L.

Adicionou-se metanol (150 ml) e solução foi passada através de uma coluna contendo 13 kg de alumina neutra, eluindo com diclorometano - metanol 99:1 (v/v). Recolheram-se fracções contendo paclitaxel e concentraram-se sob vácuo até um volume de 5 L. A solução concentrada foi colocada numa coluna contendo 9 kg de sílica gel e eluída com diclorometano - metanol 99:1 (v/v). Após a eluição das impurezas polares, recolheram-se 200 L de fracções contendo paclitaxel, juntaram-se e evaporaram-se sob vácuo de modo a obter um resíduo mole (190 g). 0 resíduo foi dissolvido em 400 ml de acetona para formar um resíduo de acetona que foi cromatografado em coluna sobre 9 kg de sílica gel eluindo com n-hexano - acetona 4:1. As fracções contendo paclitaxel foram recolhidas e novamente purificadas por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com acetato de t-butilo, como descrito no Exemplo 2. Após a cristalização a partir da mistura com ciclohexano - acetona 1:1 e secagem a uma temperatura de 55 °C, obtiveram-se 18,5 g de paclitaxel com um grau de pureza superior a 99%. 20

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A lista de referências citadas pelo requerente serve apenas para a conveniência do leitor. Não faz parte do documento de patente europeu. Apesar do grande cuidado com que se compilaram as referências, não se pode excluir a possibilidade de erros ou omissões e o EPO rejeita qualquer responsabilidade a este respeito.

Patentes citadas na descrição • US 6333419 B [0023]

Literatura não relacionada com patentes citada na descrição • M.C. WANI et al., J. Am. Chem. Soc., 1971, vol. 93, 2325 [0002]

Lisboa, 28/11/2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para obter paclitaxel a partir de plantas contendo paclitaxel que compreende: (a) a preparação de um extracto de paclitaxel pela extracção de paclitaxel a partir de um material vegetal; (b) a separação de paclitaxel do extracto de paclitaxel utilizando um primeiro sistema de cromatografia em coluna compreendendo uma primeira fase estacionária e um primeiro solvente de eluição para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel; (c) a separação de paclitaxel da pelo menos uma fracção obtida no passo (b) utilizando um segundo sistema de cromatografia em coluna compreendendo uma segunda fase estacionária e um segundo solvente de eluição para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel; (d) a separação de paclitaxel da pelo menos uma fracção obtida no passo (c) utilizando um terceiro sistema de cromatografia em coluna compreendendo uma terceira fase estacionária e um terceiro solvente de eluição para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel; (e) a separação de paclitaxel da pelo menos uma fracção obtida no passo (d) utilizando um quarto sistema de cromatografia em coluna compreendendo uma quarta fase estacionária e um quarto solvente de eluição para remover pelo menos cefalomanina e para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel; e (f) a cristalização do paclitaxel contido em pelo menos uma fracção obtida no passo (e) utilizando um solvente de cristalização para obter cristais de paclitaxel. 2 2. 0 método da reivindicação 1, compreendendo ainda a secagem dos cristais de paclitaxel obtidos no passo (f). 3. 0 método da reivindicação 1, em que o material vegetal é obtido a partir de partes de planta. 4. 0 método da reivindicação 3, em que o extracto de material vegetal é preparado pela extracção de material vegetal compreendendo 40 a 60 por cento p/p de partes aéreas e 60 a 40 por cento p/p de raízes.

5. O método da reivindicação 1, em que o material vegetal compreende material vegetal obtido a partir de T.x media «Henryí», T.x media «Runyan», T. cuspidata, T.x media «Halloran», T.x media «Hatfield», T.x media «Hicksii», T.x media «Tauntonii», T.x media «Dark Green Spreader», T.x media «Wardii», T.x media «Brownii», T.x media «Densiformis», T.x media «Nigra», T.x cuspidata «Brevifolia», ou T. cuspidata «Spreader». 6. 0 método da reivindicação 1, em que a segunda fase estacionária compreende alumina neutra. 7. 0 método da reivindicação 1, em que a primeira, terceira ou quarta fases estacionárias compreendem sílica gel. 8. 0 método da reivindicação 1, em que o primeiro, segundo ou terceiro solvente de eluição compreende acetona, diclorometano, metanol, n-hexano, acetato de t-butilo, clorofórmio ou acetato de etilo.

9. O método da reivindicação 1, em que o primeiro solvente de eluição compreende diclorometano e metanol. 3

10. O método da reivindicação 1, em que o segundo solvente de eluição compreende acetona. 11. 0 método da reivindicação 1, em que o terceiro solvente de eluição compreende n-hexano e acetona. 12. 0 método da reivindicação 1, em que o quarto solvente de eluição compreende acetato de t-butilo, acetato de i-butilo, formiato de n-butilo, formiato de i-butilo, formiato de t-butilo ou formiato de s-butilo. 13. 0 método da reivindicação 1, em que o solvente de cristalização compreende ciclohexano e acetona.

14. Um método para obter paclitaxel a partir de plantas que contêm paclitaxel que compreende: (a) a preparação de um extracto de paclitaxel pela extracção de paclitaxel a partir de um material vegetal; (b) a separação de paclitaxel do extracto de paclitaxel compreendendo: (i) a utilização de um primeiro sistema de cromatografia em coluna compreendendo uma primeira fase estacionária e um primeiro solvente de eluição para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel e (ii) a remoção do primeiro solvente de eluição da pelo menos uma fracção obtida no passo (b) (i) para formar um primeiro resíduo; 4 (c) a separação de paclitaxel do primeiro resíduo obtido no passo (b)(ii) compreendendo: (i) a utilização de um segundo sistema de cromatografia em coluna compreendendo uma segunda fase estacionária e um segundo solvente de eluição para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel a partir do primeiro resíduo, e (ii) a remoção do segundo solvente de eluição da pelo menos uma obtida no passo (c)(i) para formar um segundo resíduo; (d) a separação de paclitaxel do segundo resíduo obtido no passo (c)(ii) compreendo: (i) a utilização de um terceiro sistema de cromatografia em coluna compreendendo uma terceira fase estacionária e um terceiro solvente de eluição para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel a partir do segundo resíduo, e (ii) a remoção do terceiro solvente de eluição da pelo menos uma fracção obtida no passo (d) (i) para formar um terceiro resíduo; (e) a separação de paclitaxel do terceiro resíduo obtido no passo (d)(ii) compreendendo: (i) a utilização de um quarto sistema de cromatografia em coluna compreendendo uma quarta fase estacionária e um quarto solvente de eluição para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel a partir do terceiro resíduo, e 5 (ii) a remoção do quarto solvente de eluição do terceiro resíduo obtido no passo (e) (i) para formar um quarto resíduo; e (f) a cristalização de paclitaxel a partir do quarto resíduo obtido no passo (e) (ii) utilizando um solvente de cristalização para obter cristais de paclitaxel. 15. 0 método da reivindicação 14 em que no passo (e) é removida pelo menos cefalomanina do terceiro resíduo. 16. 0 método da reivindicação 14, em que o primeiro solvente de eluição é removido pela submissão da pelo menos uma fracção obtida no passo (b)(i) a pressão reduzida. 17. 0 método da reivindicação 14, em que o segundo solvente de eluição é removido pela submissão da pelo menos uma fracção obtida no passo (c)(i) a pressão reduzida. 18. 0 método da reivindicação 14, em que o terceiro solvente de eluição é removido ao submeter de pelo menos uma fracção obtida no passo (d)(i) a pressão reduzida. 19. 0 método da reivindicação 14, em que o quarto solvente de eluição é removido pela submissão da pelo menos uma fracção obtida no passo (e)(i) a pressão reduzida. 20. 0 método da reivindicação 14, compreendendo ainda a secagem dos cristais de paclitaxel obtidos no passo (f). 21. 0 método da reivindicação 20, em que os cristais de paclitaxel são secos sob vácuo. 6 22. 0 método da reivindicação 14, em que o paclitaxel é extraído partir do material vegetal utilizando um primeiro solvente aquoso. 23. 0 método da reivindicação 22, em que o primeiro solvente aquoso compreende água e acetona. 24. 0 método da reivindicação 14, em que o passo (a) ocorre à temperatura ambiente. 25. 0 método da reivindicação 14, em que se obtém mais de uma fracção no passo (b) (i) e em que pelo menos algumas das fracções são combinadas antes de remover o primeiro solvente de eluição no passo (b)(ii). 26. 0 método da reivindicação 14, em que se obtém mais de uma fracção no passo (c) (i) e em que pelo menos algumas das fracções são combinadas antes de remover o segundo solvente de eluição no passo (c)(ii). 27. 0 método da reivindicação 14, em que se obtém mais de uma fracção no passo (d) (i) e em que pelo menos algumas das fracções são combinadas antes de remover o terceiro solvente de eluição no passo (d) (ii) . 28. 0 método da reivindicação 14, em que se obtém mais de uma fracção no passo (e) (i) e em que pelo menos algumas das fracções são combinadas antes de remover o quarto solvente de eluição no passo (e)(ii). 29. 0 método da reivindicação 14, em que a cristalização do passo (f) ocorre durante um período de 24 horas. 7

30. O método da reivindicação 14, em que a cristalização do passo (f) ocorre à temperatura ambiente. 31. 0 método da reivindicação 14, em que o material vegetal é obtido a partir de partes de plantas. 32. 0 método da reivindicação 31, em que o extracto de material vegetal é preparado pela extracção do material vegetal de partes de plantas compreendendo cerca de 40 a cerca de 60 por cento p/p de partes aéreas e cerca de 60 a cerca de 40 por cento p/p de raizes.

33. O método da reivindicação 14, em que o material vegetal compreende material vegetal obtido a partir de T.x media «Henryi», T.x media «Runyan», T. cuspidata, T.x media «Halloran», T.x media «Hatfield», T.x media «Hicksii», T.x media «Tauntonii», T.x media «Dark Green Spreader», T.x media «Wardii», T.x media «Brownii», T.x media «Densiformis», T.x media «Nigra», T.x cuspidata «Brevifolia» ou T. cuspidata «Spreader».

34. O método da reivindicação 14, em que a segunda fase estacionária compreende alumina neutra.

35. O método da reivindicação 14, em que a primeira, terceira ou quarta fases estacionárias compreendem sílica gel.

36. O método da reivindicação 14, em que o primeiro, segundo ou terceiro solvente de eluição compreende acetona, diclorometano, metanol, n-hexano, acetato de t-butilo, clorofórmio ou acetato de etilo. 8 37. 0 método da reivindicação 14, em que o primeiro solvente de eluição compreende diclorometano e metanol. 38. 0 método da reivindicação 14, em que o segundo solvente de eluição compreende acetona. 39. 0 método da reivindicação 14, em que o terceiro solvente de eluição compreende n-hexano e acetona. 40. 0 método da reivindicação 14, em que o quarto solvente de eluição compreende acetato de t-butilo, acetato de i-butilo, formiato de n-butilo, formiato de i-butilo, formiato de t-butilo ou formiato de s-butilo. 41. 0 método da reivindicação 14, em que o solvente de cristalização compreende ciclohexano e acetona.

42. Um método para obter paclitaxel a partir de Taxus media que compreende: (a) a preparação de um extracto de material vegetal a partir de Taxus media pela extracção do material vegetal com um solvente aquoso compreendendo 40 a 60 por cento v/v de acetona à temperatura ambiente; (b) a preparação de um extracto de paclitaxel pela extracção do paclitaxel a partir do extracto de material vegetal obtido em (a) ; (c) a separação de paclitaxel a partir do extracto de paclitaxel compreendendo: (i) a utilização de um primeiro sistema de cromatografia compreendendo sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo 9 apenas diclorometano ou uma mistura de diclorometano e metanol para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel e (ii) a submissão da pelo menos uma fracção obtida no passo (c)(i) a pressão reduzida para remover o diclorometano e/ou o metanol; (d) a separação de paclitaxel a partir da pelo menos uma fracção obtida no passo (c)(ii) compreendendo: (i) a utilização de um segundo sistema de cromatografia em coluna compreendendo alumina neutral como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo acetona para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel; e (ii) a submissão da pelo menos uma fracção obtida no passo (d)(i) a pressão reduzida para remover a acetona; (e) a separação de paclitaxel a partir da pelo menos uma fracção obtida no passo (d)(ii) compreendendo: (i) a utilização de um terceiro sistema de cromatografia em coluna compreendendo sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo uma mistura de n-hexano e acetona e para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel; e (ii) a submissão da pelo menos uma fracção obtida no passo (e) (i) a pressão reduzida para remover o n-hexano e a acetona; (f) a separação de paclitaxel a partir da pelo menos uma fracção obtida no passo (e)(ii) compreendendo: 10 (i) a utilização de um quarto sistema de cromatografia em coluna compreendendo sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo acetato de t-butilo para remover pelo menos cefalomanina e a obtenção de pelo menos uma fracção contendo paclitaxel; e (ii) a submissão da pelo menos uma fracção obtida no passo (f)(i) a pressão reduzida para remover o acetato de t-butilo; (g) a cristalização da pelo menos uma fracção obtida no passo (f)(ii) ao longo de um período de 24 horas utilizando uma mistura de ciclohexano e acetona como o solvente de cristalização à temperatura ambiente para obter cristais de paclitaxel; e (h) a secagem dos cristais de paclitaxel obtidos em (g) sob vácuo durante 48 horas. 43. 0 método da reivindicação 42, em que a preparação do extracto de paclitaxel no passo (b) compreende ainda: (a) a concentração do extracto de material vegetal sob pressão reduzida para remover a acetona para formar um concentrado; (b) a diluição do concentrado com álcool metílico; (c) a extracção do concentrado com diclorometano para formar um extracto de diclorometano; e (d) a concentração do extracto de diclorometano sob pressão reduzida para formar o extracto de paclitaxel.

44. Um método para obter paclitaxel a partir de Taxus media que compreende: 11 (a) a preparação de um extracto de material vegetal a partir de Taxus media através da extracção do material vegetal com um solvente aquoso compreendendo cerca de 40 a cerca de 60 por cento v/v de acetona à temperatura ambiente; (b) a preparação de um extracto de paclitaxel pela extracção do paclitaxel a partir do extracto de material vegetal obtido em (a); (c) a separação de paclitaxel a partir do extracto de paclitaxel compreendendo: (i) a utilização de um primeiro sistema de cromatografia compreendendo sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo diclorometano e metanol para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel; (ii) a submissão da pelo menos uma fracção obtida no passo (c)(i) a pressão reduzida para obter um resíduo; e (iii) a dissolução do resíduo obtido no passo (c) (ii) em acetona para obter uma composição acetona-resíduo; (d) a separação de paclitaxel a partir da composição acetona-resíduo obtida no passo (c)(iii) compreendendo: (i) a utilização de um segundo sistema de cromatografia em coluna compreendendo alumina neutra como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo acetona para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel; e 12 (ii) a submissão da pelo menos uma fracção obtida no passo (d)(i) a pressão reduzida para remover a acetona; (e) a separação de paclitaxel a partir da pelo menos uma fracção obtida no passo (d)(ii) compreendendo: (i) a utilização de um terceiro sistema de cromatografia em coluna compreendendo sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo n-hexano e acetona para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel; e (ii) a submissão da pelo menos uma fracção obtida no passo (e) (i) a pressão reduzida para remover o n-hexano e a acetona; (f) a separação de paclitaxel a partir da pelo menos uma fracção obtida no passo (e)(ii) compreendendo: (i) a utilização de um quarto sistema de cromatografia em coluna compreendendo sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo acetato de t-butilo para remover pelo menos cefalomanina e para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel; e (ii) a submissão da pelo menos uma fracção obtida no passo (f)(i) a pressão reduzida para remover o acetato de t-butilo; (g) a cristalização da pelo menos uma fracção obtida no passo (f)(ii) ao longo de um período de 24 horas utilizando uma mistura de ciclohexano e acetona como o 13 solvente de cristalização à temperatura ambiente para obter cristais de paclitaxel; e (h) a secagem dos cristais de paclitaxel obtidos em (g) sob vácuo durante 48 horas. 45. 0 método da reivindicação 44, em que o Taxus media compreende T. media Hicksii.

46. Um método para obter paclitaxel a partir de Taxus media que compreende: (a) a preparação de um extracto de material vegetal a partir de Taxus media pela extracção do material vegetal com uma solução aquosa compreendendo cerca de 40 a cerca de 60 por cento v/v de acetona à temperatura ambiente; (b) a preparação de um extracto de paclitaxel pela extracção do paclitaxel a partir do extracto de material vegetal obtido em (a); (c) a separação de paclitaxel a partir do extracto de paclitaxel compreendendo: (i) a utilização de um primeiro sistema de cromatografia compreendendo alumina neutra como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo diclorometano e metanol para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel e (ii) a submissão da pelo menos uma fracção obtida no passo (c)(i) a pressão reduzida para remover o diclorometano e o metanol; (d) a separação de paclitaxel a partir da pelo menos uma fracção obtida no passo (c)(ii) compreendendo: 14 (i) a utilização de um segundo sistema de cromatografia em coluna compreendendo sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo diclorometano e metanol para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel; (ii) a submissão da pelo menos uma fracção obtida no passo (d)(i) a pressão reduzida para obter um resíduo; e (iii) a dissolução do resíduo obtido no passo (d) (ii) em acetona para obter uma composição acetona-resíduo; (e) a separação de paclitaxel a partir da pelo menos uma fracção obtida no passo (d) (iii) compreendendo: (i) a utilização de um terceiro sistema de cromatografia em coluna compreendendo sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo n-hexano e acetona para obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel; e (ii) a submissão da pelo menos uma fracção obtida no passo (e) (i) a pressão reduzida para remover a mistura de n-hexano e acetona; (f) a separação de paclitaxel a partir da pelo menos uma fracção obtida no passo (e)(ii) compreendendo: (i) a utilização de um quarto sistema de cromatografia em coluna compreendendo sílica gel como uma fase estacionária e um solvente de eluição compreendendo um acetato de t-butilo para remover pelo menos cefalomanina e obter pelo menos uma fracção contendo paclitaxel; e 15 (ii) a submissão da pelo menos uma fracção obtida no passo (f) (i) a pressão reduzida para remover o acetato de t-butilo; (g) a cristalização da pelo menos uma fracção obtida no passo (f)(ii) ao longo de um período de 24 horas utilizando uma mistura de ciclohexano e acetona como o solvente de cristalização à temperatura ambiente para obter cristais de paclitaxel; e (h) a secagem dos cristais de paclitaxel obtidos em (g) sob vácuo durante 48 horas. 47. 0 método da reivindicação 46, em que o Taxus media compreende T. media «dark green spreader». Lisboa, 28/11/2007