PT1583774E - Métodos para prevenção e tratamento de doença de alzheimer (da) - Google Patents
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Description
ΡΕ1583774 1
DESCRIÇÃO
"MÉTODOS PARA PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE DOENÇA DE ALZHEIMER (DA) " 0 presente invento refere-se a métodos para prevenção e tratamento de doença de Alzheimer (DA). 0 péptido β-amilóide (Αβ) tem um papel central na neuropatologia da doença de Alzheimer (DA) (Roher et al., "β-amyloid-(1-42) is a major component of cerebrovascular amyloid deposits: Implications for the pathology of
Alzheimer disease" PNAS 90: 10836, 1993). As formas familiares da doença foram ligadas a mutações na proteina precursora amilóide (APP) e nos genes de presenilina. As mutações ligadas à doença nestes genes resultam em maior produção da forma de 42 aminoácidos do péptido (Αβ42), que é a forma predominante verificada nas placas amilóides da doença de Alzheimer. Um modelo animal para a doença está comercialmente disponível. O ratinho transgénico PDAPP, que sobreexpressa APP humana mutante (na qual o aminoácido na posição 717 é F em vez de V), desenvolve progressivamente muitas das caracteristicas neuropatológicas da doença de Alzheimer de um modo dependente da idade e do cérebro (Games et al., "Alzheimer-type neuropathology in transgenic mice overexpressing V717F β-amyioid precursor protein" Nature 373: 523, 1995). 2 ΡΕ1583774
Estudos de vacinação com uma vacina "normal", não baseada em mimotopos foram já efectuados. Animais trans-génicos foram imunizados com Αβ42 agregado, antes do surgimento de neuropatologias do tipo DA (6 semanas) ou num estádio mais tardio (11 meses). A imunização de animais jovens preveniu o desenvolvimento da formação de placas, distrofia neuritica e astrogliose. 0 tratamento de animais mais velhos reduziu marcadamente as neuropatologias semelhantes a DA. Esta abordagem de vacinação experimental induziu o desenvolvimento de anticorpos contra Αβ42 capazes de atravessar a barreira hemato-encefálica e ataca as placas amilóides (Schenk et ai., "Immunization with amyloid-β attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse" Nature 400: 173, 1999) . As placas são subseguentemente removidas através de vários mecanismos, incluindo fagocitose medida pelo receptor Fc (Bard et ai., "Peripherally administered antibodies against amyloid β-peptides enter the central nervous System and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease" Nature Med. 6: 916, 2000). Esta vacina foi também capaz de atrasar défices de memória (Janus et al., "Αβ peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease" Nature 408: 979, 2000).
Uma terapia de imunização altamente promissora para DA tem estado em ensaios clínicos desde 1999. Presume-se que a imunização despoleta o sistema imunitário para atacar as placas e eliminar estes depósitos do cérebro 3 ΡΕ1583774 humano afectado, embora o mecanismo exacto subjacente necessite de ser caracterizado em mais detalhe.
Estes ensaios clinicos foram conduzidos pela companhia farmacêutica Elan em conjunto com a empresa sua parceira, American Home Products (vacina terapêutica AN-1792, QS21 como adjuvante) . Os ensaios de fase I foram terminados com sucesso em 2000. Os ensaios de fase II foram iniciados no fim de 2001 para testar a eficácia num painel de pacientes com DA suave a moderada.
Agora estes ensaios de fase II foram permanentemente descontinuados devidos a neuroinflamação em vários pacientes (Editorial "Insoluble problem?" Nature Med. 8: 191, 2002). Os sintomas incluíram meningoencefalite asséptica levando a paragem imediata deste ensaios em todo o mundo. No pior cenário, mostrar-se-á que os pacientes afectados montaram uma resposta auto-imunitária - um risco inerente em muitas imunoterapias. As complicações auto-imunes podiam ter sido antecipadas dada a ubiquidade de APP, que como é claro possui determinantes antigénicos em comum com o seu produto proteolitico. Mais recentemente, estudos adicionais concentraram-se na natureza dos anticorpos induzidos por imunização com Αβ42 agregado (em humanos e ratinhos) revelando que a maioria dos anticorpos reconhece um pequeno domínio entre o aminoácido 4 e 10 de Αβ42 (Αβ4-10). Os anticorpos de ratinho foram capazes de bloquear fibrilogénese Αβ e destruir as fibras Αβ preexistentes (McLaurin et al., "Therapeutically effective 4 ΡΕ1583774 antibodies against amyloid-β peptide target amyloid-β residues 4-10 and inhibit cytotoxicity and fibrillogenesis" Nature Med. 8: 1263, 2002). De nota, os anticorpos humanos não reagem com APP exposta à superfície de células ou qualquer outro produto proteolítico não agregado do precursor (Hock et al., "Generation of antibodies specific for β-amyloid by vaccination of patients with Alzheimer disease" Nature Med. 8: 1270, 2002) . Foi observada uma clara diferença entre os soros humano e de ratinho: em contraste com os anticorpos humanos, os anticorpos de ratinho detectam Αβ monomérico, oligomérico e fibrilar. Isto é importante e pode ser um pré-requisito para a potência terapêutica uma vez que se acumulam provas de que pequenos oligómeros de Αβ, que não são reconhecidos pelo anti-Αβ humano, são os principais intervenientes tóxicos na doença (Walsh et al., "Naturally secreted oligomers of amyloid B protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo" Nature 416: 535, 2002). Assim, uma potencial nova estratégia é a imunização com uma vacina contendo os aminoácidos 4-10 do β-amilóide (em vez do Αβ42 agregado). Apesar da desconhecida eficácia esta estratégia pode também enfrentar problemas auto-imunes uma vez que os pacientes deverão ser directamente imunizados com um epitopo "próprio" (de células B lineares). WO 00/72880A divulga a utilização de fragmentos N-terminais de Αβ42 numa vacina para a doença de Alzheimer. WO 01/18169A2 divulga um método de imunização 5 ΡΕ1583774 contra doenças formadoras de placas utilizando tecnologias de apresentação.
Apesar destes desenvolvimentos desapontantes em estratégias recentes de vacinação de DA, uma vacina de Αβ é ainda considerada como o modo mais promissor para combater a DA. No entanto, há a necessidade urgente de melhorias e novas estratégias em vacinação de DA. Especialmente, uma tal vacina não deve induzir células T e/ou B auto-reactivas.
Por essa razão, o presente invento proporciona a utilização de um composto consistindo em: um péptido de 5 a 15 aminoácidos compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada de entre o grupo que consiste em DKELRI, DWELRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT e DKELR, contendo o referido péptido um residuo de cisterna adicional no terminal C e um transportador proteico ligado através do referido residuo de cisteina ao referido péptido para a preparação de uma vacina para a doença de Alzheimer (DA).
De acordo com o presente invento é utilizado um mimotopo de Αβ42 para vacinação contra DA. 0 mimotopo induz a produção de anticorpos contra Αβ42 mas não contra o APP nativo. 0 mimotopo pode ser identificado com um anticorpo (monoclonal) e bibliotecas peptidicas (comercialmente disponível) (e.g., de acordo com Reineke et al., 6 ΡΕ1583774 "Identification of distinct antibody epitopes and mimotopes from a peptide array of 5520 randomly generated sequences" J. Immunol. Methods 267: 37, 2002). É utilizado um anticorpo (monoclonal) que não reconhece APP mas detecta apenas diferentes espécies Αβ com ácido aspártico amino-terminal (um exemplo para um tal anticorpo é descrito em Johnson-Wood et al., "Amyloid precursor protein processing and Αβ42 deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer disease" PNAS 94: 1550, 1997). Provou-se que um tal anticorpo é uma ferramenta ideal para identificar mimotopos adequados para vacinas no curso do presente invento. Embora se tenha mostrado que tais anticorpos monoclonais têm efeitos benéficos num modelo de ratinho de DA quando directamente administrados a ratinhos (Bard et al., "Peripherally administered antibodies against amyloid β-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease" Nature Med 6: 916, 2000), estes anticorpos nunca foram propostos para serem utilizados como ferramentas de pesquisa de mimotopos para isolamento de compostos de vacina de DA.
Na arte anterior, todos os esforços foram concentrados no péptido Αβ de ocorrência natural. Tal como mencionado acima, os ensaios clínicos da vacina de péptido Αβ foram parados devido a acontecimentos de neuro-inflamação. De facto, programas de predição de epitopos de células T (BIMAS para epitopos restritos à classe I e TEPITOPE para epitopos restritos à classe II) propõem epitopos de elevado registo (próprios) dentro da sequência. 7 ΡΕ1583774
Isto pode implicar que os acontecimentos neuroinflamatórios são devidos a reacções auto-imunes que tornariam uma tal vacina inadequada para uma aplicação geral.
Em contraste com tais vacinas de Αβ propostas pela arte anterior, não se espera que ocorram reacções auto-imunes durante o tratamento com uma vacina contendo um mimotopo de acordo com o presente invento, porque o anticorpo (monoclonal) utilizado para identificação do mimotopo de acordo com o presente invento não reconhece APP e a sequência do mimotopo é diferente das sequências próprias derivadas de Αβ42 que foram utilizadas em ensaios realizados até agora ou que deverão ser utilizadas em ensaios futuros. 0 anticorpo utilizado para a identificação do mimotopo de acordo com o presente invento detecta a sequência de aminoácidos derivada de Αβ DAEFRH (= epitopo original) com um ácido aspártico amino-terminal livre, assim não reconhece a APP nativa. 0 anticorpo pode ser uma preparação de anticorpo monoclonal ou policlonal ou qualquer parte de anticorpo ou derivado deste, sendo o único pré-requisito que a molécula de anticorpo reconheça especificamente o epitopo DAEFRH, i.e. que não se ligue às formas prolongadas N-terminalmente naturais da proteína precursora amilóide, o que significa que a capacidade de
ligação ao epitopo DAEFRH é pelo menos 100 vezes, de preferência pelo menos 1000 vezes, de maior preferência pelo menos 105 vezes, superior à da molécula APP. O ΡΕ1583774 anticorpo pode ser um anticorpo mostrando a mesma capacidade de ligação à sequência DAEFRH ou superior que o anticorpo descrito por Johnson-Wood et al., 1997. Claro que, também podem ser utilizados anticorpos com uma capacidade de ligação inferior (>10%, >50% ou >80% da capacidade de ligação do anticorpo de Johnson-Wood et al.), embora a capacidade de ligação superior seja mais preferida.
Os compostos de acordo com o presente invento ligam-se aos anticorpos com especificidade comparável à da sequência DAEFRH.
De preferência, os mimotopos de acordo com o presente invento têm um comprimento de entre 5 e 15, 6 e 12 resíduos de aminoácidos, especificamente entre 9 e 11. Os mimotopos de acordo com o presente invento são ligados a transportadores proteicos através de uma cisteína adicional no terminal C. Para além disso, os transportadores proteicos podem consistir ou conter epitopos de células T ajudantes.
De preferência, o transportador farmaceuticamente aceitável é KLH, toxóide do tétano, proteína de ligação à albumina, albumina de soro bovino, um dendrímero (MAP; Biol. Chem. 358: 581) bem como as substâncias adjuvantes descritas em Singh et al., Nat. Biotech. 17: 1075-1081, 1999 (especificamente as na tabela 1 deste documento) e 0'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9): 727- 9 ΡΕ1583774 735, 2003 (especificamente os compostos potenciadores imunitários inatos e os sistemas de distribuição aqui descritos) ou misturas destes. Adicionalmente, a composição de vacina pode conter hidróxido de alumínio.
Uma vacina compreendendo o presente composto (mimotopo) e um transportador farmaceuticamente aceitável podem ser administrados através de qualquer modo de aplicação adequado, e.g. i.v., i.p., i.m., intranasal, oral, subcutâneo, etc. e em qualquer dispositivo de distribuição adequado (0'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9): 727-735, 2003). Tipicamente, a vacina contém o composto de acordo com o presente invento numa quantidade de 0,1 ng a 10 mg, de preferência 10 ng a 1 mg, especialmente 100 ng a 100 yg ou, alternativamente e.g. 100 fmole a 10 pmole, de preferência 10 pmole a 1 pmole, especificamente 100 pmole a 100 nmole. A vacina pode também compreender substâncias auxiliares típicas, e.g., tampões, estabilizadores, etc.
Um método para isolamento de um composto que se ligue a um anticorpo que seja específico para a sequência N-terminal de Αβ42 DAEFRH compreende os passos de: proporcionar um composto peptídico compreendendo péptidos contendo a seguinte sequência de aminoácidos X1X2X3X4X5X6Í em que Χχ é um aminoácido, excepto C, X2 é um aminoácido, excepto C, X3 é um aminoácido, excepto C, X4 é um aminoácido, excepto C, X5 é um aminoácido, excepto C, Χβ é um aminoácido, excepto C, e em que X1X2X3X4X5X6 não é DAEFRH, 10 ΡΕ1583774 contacto da referida biblioteca peptídica com o referido anticorpo e isolamento dos membros da biblioteca peptí-dica que se ligam ao referido anticorpo.
Um método especifico para isolamento de um composto que se ligue a um anticorpo que seja especifico para a sequência N-terminal natural de Αβ42 DAEFRH compreende os passos de: proporcionar uma biblioteca de compostos peptidicos contendo a seguinte sequência de aminoácidos X1X2X3X4X5X6, em que Xi é um aminoácido natural, excepto K e C, X2 é um aminoácido natural, excepto C, X3 é um aminoácido natural, excepto K e C, X4 é um aminoácido natural, excepto K e C, X5 é um aminoácido natural, excepto C, Xe é um aminoácido natural, excepto P e C, e em que X1X2X3X4X5X6 não é DAEFRH, contacto da referida biblioteca peptídica com o referido anticorpo e isolamento dos membros da biblioteca peptídica que se ligam ao referido anticorpo. O isolamento de 5-meros adequados de acordo com o presente invento pode ser alcançado através do modo descrito acima, adaptado a bibliotecas com 5 variáveis de aminoácidos e pode ser de preferência efectuado através da pesquisa de uma biblioteca possuindo as variáveis de aminoácidos Xi a X5 tal como aqui descrito ou através da identificação de 5-meros adequados num membro positivo 11 ΡΕ1583774 pesquisado numa biblioteca de 6-meros (ver acima). Do mesmo modo, podem também ser concordantemente aplicadas bibliotecas de 7-meros, 8-meros, 9-meros, 10-meros, etc. para pesquisar sequências adequadas que se liguem ao presente tipo de anticorpo. Fragmentos de ligação ao anticorpo adequados de tais sequências mais longas podem ser verificados, e.g., através de testes destes fragmentos com um comprimento de 5, 6, 7, 8, 9, etc. residuos de aminoácidos para ligação ao presente invento anticorpo.
Um tal método provou ter sucesso para proporcionar mimotopos Αβ de acordo com o presente invento.
De preferência, os referidos péptidos são proporcionados de forma individualizada na referida biblioteca, especialmente imobilizados numa superfície sólida, tal como possível e.g. com a tecnologia de péptidos MULTIPIN™. A biblioteca pode também ser proporcionada como uma mistura peptídica e os complexos anticorpo:péptido podem ser isolados após ligação do anticorpo. Alternativamente, o anticorpo pode ser imobilizado e a biblioteca peptídica (em suspensão ou solução) é então posta em contacto com os anticorpos imobilizados.
De preferência, a pesquisa de anticorpos (ou dos membros da biblioteca peptídica) compreende um marcador adequado que permite a detecção ou o isolamento do anticorpo ou do complexo anticorpo:péptido quando ligado a um péptido da biblioteca. Sistemas marcadores adequados 12 ΡΕ1583774 (i.e., biotinilação, fluorescência, radioactividade, marcadores magnéticos, marcadores de revelação de cor, anticorpos secundários) estão facilmente disponíveis aos peritos na arte. A biblioteca tem de ser construída para excluir a sequência de Αβ de ocorrência natural (e.g., DAEFRH), uma vez que a vacinação com esta sequência está claramente excluída deste invento.
Uma outra técnica adequada para isolamento dos epitopos de acordo com o presente invento é a pesquisa em bibliotecas peptídicas em fagos tal como descrito e.g. em WO 03/020750. O presente invento refere-se também a uma vacina contra a doença de Alzheimer compreendendo um composto consistindo em: um péptido de 5 a 15 aminoácidos compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada de entre o
grupo que consiste em DKELRI, DWELRI, YAEFRG, EAEFRG DYE FRG, DRELRI, GRE FRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT e DKELR contendo o referido péptido um resíduo de cisterna adicional no terminal C e um transportador proteico ligado através do referido resíduo de cisterna ao referido péptido. Estas sequências são puramente mimitopos de Αβ artificiais. Os péptidos são - para fins de vacinação - ligados a transportadores proteicos adequados através de uma cisterna 13 ΡΕ1583774 adicional no terminal C e administrados de um modo adequado (tal como descrito e.g. em 0'Hagan et ai., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9): 727-735, 2003). O invento é ainda descrito nos seguintes exemplos e figuras dos desenhos, claro que sem estar restrito a estes. A Fig. 1 mostra os membros peptídicos individualizados da biblioteca 4 utilizados para os presentes processos de pesquisa. A Fig. 2 mostra um ensaio de inibição com mimotopos para DAEFRH. A Fig. 3 mostra outro ensaio de inibição com outros mimotopos para DAEFRH.
As Figuras 4 e 5 descrevem os resultados de ensaios de inibição efectuados com péptidos mimotopo de acordo com o presente invento. EXEMPLOS: 1: Criação de anticorpos monoclonais (mAb) para detectar espécies peptidicas derivadas de Άβ42 com o terminal N livre (ácido aspártico livre no terminal N)
Foram vacinados ratinhos com o péptido 6-mero DAEFRH (sequência N-terminal natural de Αβ42) ligado à 14 ΡΕ1583774 proteína albumina de soro bovino BSA (para utilizar o efeito transportador do hapteno) , emulsionado em CFA (primeira injecção) e IFA (injecções de reforço) . Hibridomas produtores de anticorpos específicos do péptido DAEFRH são detectados através de ELISA (placas de ELISA revestidas com péptido DAEFRH). 0 péptido SEVKMDAEFRH (sequência natural prolongada N-terminalmente, derivada de APP, contendo a sequência derivada de Αβ42 DAEFRH) é utilizado como péptido de controlo negativo: os hibridomas que reconhecem o péptido prolongado são excluídos porque não distinguem entre péptidos derivados de Αβ42 com ácido aspártico livre no terminal N e o péptido DAEFRH derivado de APP sem ácido aspártico livre. 2: Construção de bibliotecas peptídicas
Os mimotopos do presente invento foram verificados através de adaptação do método de Reinke et al., 2000, através de pesquisa de bibliotecas peptídicas de ligação a um anticorpo (de preferência um anticorpo monoclonal) que seja específico para a espécie Αβ com ácido aspártico amino-terminal. Outro método está comercialmente disponível como tecnologia de péptidos MULTIPIN™. A tecnologia de péptidos MULTIPIN™ envolve a síntese de péptidos em alfinetes de polietileno especialmente preparados montados em blocos num formato que é compatível com a placa de microtitulação padrão de 8x12 utilizada para muitos ensaios biológicos. Tanto os péptidos 15 ΡΕ1583774 ligados aos alfinetes (péptidos não cliváveis que permanecem ligados covalentemente ao alfinete) como os da fase de solução (os que foram clivados da superfície do alfinete) podem ser produzidos através deste método. Os PepSets, com base no sistema de sintese Multipin, permitem a sintese e pesquisa simultâneas de grandes números de péptidos.
Os PepSets consistem em blocos de 96 péptidos sintetizados individualmente, dois dos quais são sequências de controlo cuidadosamente seleccionadas. Os controlos clivados são avaliados quanto à pureza através de HPLC de fase reversa e o teor peptidico é quantificado através de análise dos aminoácidos. Os controlos não cliváveis positivos e negativos são avaliados através de técnicas de ELISA padrão.
Os péptidos PepSet estão disponíveis com uma variedade de modificações químicas incluindo acetilação, biotinilação, fosforilação e ciclização. Os péptidos da fase de solução (clivados) são enviados como pós liofilizados.
Para a produção de péptidos em fase de solução há uma escolha de terminações C-terminais, incluindo ácido e amida, dependendo da aplicação pretendida do péptido. A ligação clivável é incorporada à superfície do alfinete, como um derivado éster pré-formado do aminoácido C-terminal ou no ligador amida "Rink". Os péptidos com grupos 16 ΡΕ1583774 terminais ácido ou amida são então libertados através de tratamento do péptido ligado ao alfinete com ácido forte. As opções para a escala de sintese são uma escala nominal de 1 micromole ou 5 micromoles. Factores tais como hidrofobicidade e eficiência de clivagem afectarão a recuperação dos péptidos, de modo a que o rendimento esperado seja de 0,5 a 1 micromole (em torno de 1 mg de um péptido 15-mero) quando os péptidos são sintetizados na escala nominal de 1 micromole, ou um rendimento de 2,5 a 5 micromoles para péptidos sintetizados na escala nominal de 5 micromoles.
Os péptidos não cliváveis permanecem covalen-temente ligados aos alfinetes e podem ser utilizados para pesquisar rapidamente péptidos de interesse utilizando técnicas ELISA. Tais péptidos são úteis para os fins de varrimento de epitopos de anticorpos e estudos da relação estrutura-actividade (SAR). A remoção de anticorpos ou outras proteínas ligados regenera os péptidos e permite a sua reutilização noutros ensaios. Os PepSets são utilizados para uma variedade de aplicações incluindo a identificação de péptidos guia de interesse biológico a partir do varrimento de sequências proteicas, optimização dos péptidos guia, e desenvolvimento de novas gerações de análogos. A flexibilidade em termos de estratégia global utilizada em procedimentos de pesquisa é grandemente aumentada através da utilização de uma variedade de desenhos de síntese que em conjunto proporcionam um método sistemático para caracterizar completamente os candidatos guia. 17 ΡΕ1583774
Os resultados compreensivos obtidos a partir de conjuntos sistemáticos de péptidos não só identificam péptidos de interesse, mas também indicam resíduos críticos, a sua capacidade de substituição e o comprimento óptimo do péptido. Consequentemente, uma variedade de péptidos aparentados pode ser ordenada como resultado de tais descobertas. A substituição de L-aminoácidos com D-aminoácidos e outros resíduos invulgares é uma poderosa abordagem para manipular a estrutura e conformação de um péptido. Este método é também um modo rápido para descobrir novos análogos com diferentes propriedades farmacológicas, tais como antagonistas e péptidos com maior estabilidade.
Começando com uma sequência proteica conhecida, todos os epitopos sequenciais do anticorpo podem ser mapeados utilizando a abordagem Multipin. Vários procedimentos alternativos para mapeamento de epitopos sequenciais de células B são agora possíveis. Estes incluem péptidos ligados a alfinetes, péptidos em fase de solução revestidos directamente em placas de microtitulação, e péptidos biotinilados capturados em placas de microtitulação previamente revestidas com avidina ou estreptavidina.
Para os presentes exemplos, o anticorpo descrito no exemplo 1 é utilizado para pesquisa de bibliotecas de péptidos, no entanto, qualquer preparação de anticorpo que reconheça especificamente a sequência DAEFRH, mas não a sequência naturalmente prolongada N-terminalmente da 18 ΡΕ1583774 molécula Αβ (e.g., MDAEFRH, KMDAEFRH, SEVKMDAEFRH ou a proteína (precursora) amilóide, APP, completa), tal como e.g. descrito por Johnson-Wood et al., 1997.
Foram construídas quatro bibliotecas para este fim: 2.1: Biblioteca 1
Esta bibli seguintes sequências Posição 1: (17 possibilidades) Posição 2: (17 possibilidades) Posição 3: (17 possibilidades) Posição 4: (17 possibilidades) Posição 5: (17 possibilidades) Posição 6: P (16 possibilidades
oteca de 6-meros contém péptidos com as (posições de aminoácidos 1 a 6): todos os aa naturais excepto D, K e C
todos os aa naturais excepto A, K e C
todos os aa naturais excepto E, K e C
todos os aa naturais excepto F, K e C
todos os aa naturais excepto R, K e C todos os aa naturais excepto Η, K, C e ) A biblioteca 1 é uma mistura de hexapéptidos. Teoricamente estão incluídos todos os péptidos possíveis contendo 17 aminoácidos diferentes (ver abaixo). A mistura não contém qualquer resíduo de lisina ou cisteína. Para além disso, a mistura não contém: 19 ΡΕ1583774 ácido aspártico na posição especifica 1, alanina na posição especifica 2, ácido glutâmico na posição especifica 3, fenilalanina na posição especifica 4, arginina na posição especifica 5, e histidina na posição especifica 6. A síntese é efectuada num Sintetizador Applied Biosystems 431A seguindo o protocolo de FastMoc, com uma escala de síntese de 0,25 mmol. A síntese começa com o peso de 1 mmol de todos os aminoácidos desejados (grupos amino e cadeias laterais protegidas). Depois, foi produzida uma mistura de Asn, Gin, Gly, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Vai. Específicos da posição, são adicionados os seguintes aminoácidos:
Ala, Glu, Phe, Arg, His (posição/mistura D , Asp, Glu, Phe, Arg, His (posição/mistura 2) , Asp, Ala, Phe, Arg, His (posição/mistura 3) , Asp, Ala, Glu, Arg, His (posição/mistura 4) , Asp, Ala, Glu, Phe, His (posição/mistura 5) , Asp, Ala, Glu, Phe , Arg (posição/mistura
Pro) . A Mistura 6 foi utilizada para carregar a resina (resina de 2-cloro-tritilcloreto, 1,49 mmol/g, Alexis Germany): 20 ΡΕ1583774 1 mmol de mistura 6 de resíduos de aminoácidos 611 mg de resina (= 0,91 mmol de grupos reactivos) 15 ml de diclorometano 5,5 equivalentes = 5 mmol de diisopropiletilamina (871 μΐ). A mistura é agitada num balão durante 1 h. Depois, é adicionado 1 ml de metanol e a mistura é agitada durante mais 10 min. A resina carregada é extraída através de uma frita e lavada duas vezes com dimetilformamida, diclorometano, isopropanol, metanol e éter (30 ml de cada). A secagem é efectuada de um dia para o outro num vácuo elevado. A quantidade pesada é de 737 mg.
Uma alíquota de 5,66 mg é tratada durante 30 min com 1 ml de piperidina a 20% em DMF para definir a densidade da resina. Depois, a mistura é centrifugada. O grupo protector Fmoc livre é medido fotometricamente no sobrenadante (301 nm, coeficiente de extinção = 7800 M (e-1)). Concordantemente, a densidade da resina é de 0,49 mmo1/g.
Todos os passos seguintes são efectuados no sintetizador, utilizando as outras misturas (colocadas em 5 cartuchos diferentes). São utilizados 515 mg de resina carregada (correspondendo a 0,25 mmol: as misturas de aminoácidos são utilizadas num excesso de 4 vezes). O grupo 21 ΡΕ1583774 protector Fmoc N-terminal é clivado no final da sintese. Após lavagem com etanol e secagem de um dia para o outro, a clivagem dos péptidos da resina é alcançada através de TFA/H20 (95:5, v:v) . A solução de TFA é concentrada num Speed Vac até 1/5 do volume e precipitada e lavada em éter dietilico e liofilizada.
Os péptidos 6-mero EIDYHR, ELDYHR e EVDYHR são exemplos de mimotopos que podem ser detectados através do anticorpo monoclonal produzido de acordo com o exemplo 1 acima. 2.2: Biblioteca 2
Esta biblioteca de β-meros contém péptidos com as seguintes sequências (posições de aminoácidos 1 a 6):
Posição 1: D (fixada)
Posição 2: todos os aa naturais excepto A, K e C (17 possibilidades)
Posição 3: todos os aa naturais excepto E, K e C (17 possibilidades)
Posição 4: todos os aa naturais excepto F, K e C (17 possibilidades)
Posição 5: todos os aa naturais excepto R, K e C (17 possibilidades)
Posição 6: todos os aa naturais excepto Η, K, C, e P (16 possibilidades). 22 ΡΕ1583774 A biblioteca de péptidos 2 foi construída de acordo com o método descrito acima (em 2.1) para a biblioteca 1.
Os péptidos 6-mero DIDYHR, DLDYHR e DVDYHR são exemplos de mimotopos que podem ser detectados através do anticorpo monoclonal produzido de acordo com 1. acima. 2.3: Biblioteca 3
Uma terceira biblioteca peptidica é utilizada numa abordagem adicional para definir sequências de mimotopos. Esta biblioteca contém a sequência original e permite a detecção de mimotopos mais intimamente aparentados com o epitopo original.
Esta biblioteca < ie 6 -meros contém péptidos i com as seguintes sequênci as (posições de ! aminoácidos 1 a 6) : Posição 1: todos os aa naturais excepto K e C (18 possibilidades) Posição 2 : todos os aa naturais excepto K e C (18 possibilidades) Posição 3: todos os aa naturais excepto K e C (18 possibilidades) Posição 4 : todos os aa naturais excepto K e C (18 possibilidades) Posição 5: todos os aa naturais excepto K e C (18 possibilidades) Posição 6: todos os aa naturais excepto K, C e P (17 possibilidades ) · 23 ΡΕ1583774 A biblioteca peptídica 3 foi construída de acordo com o método descrito acima (em 2.1.) para a biblioteca 1.
Os péptidos 6-mero DIDYRR, DLDYRR e DVDYRR são exemplos de mimotopos que podem ser detectados através do anticorpo monoclonal produzido de acordo com 1. acima (D na posição 1 e R na posição 5 são idênticos ao epitopo original). 2.4: Biblioteca 4
Esta biblioteca peptídica 4 consiste em 5x18=90 péptidos, está comercialmente disponível em Mimotopes Ltd. (Paris, França; ver linhas directrizes do fabricante) e é desenhada de acordo com a sequência natural N-terminal de Αβ42 DAEFRH.
Posição 1: D (fixada)
Posição 2: todos os aminoácidos naturais excepto K e C (18 péptidos diferentes)
Posição 3: todos os aminoácidos naturais excepto K e C (18 péptidos diferentes)
Posição 4: all natural amino acids-except of K e C (18 péptidos diferentes)
Posição 5: todos os aminoácidos naturais excepto K e C (18 péptidos diferentes)
Posição 6: todos os aminoácidos naturais excepto K e C (18 péptidos diferentes). 24 ΡΕ1583774
Os membros peptídicos individualizados da biblioteca 4 estão representados na Fig. 1. Os péptidos n°. 1, 24, 48, 56 e 80 têm a sequência original da sequência N-terminal de Αβ42. Todos os outros péptidos são péptidos candidatos que são testados em relação à sua capacidade de ligação a um anticorpo que se ligue a DAEFRH. 2.5: ELISA com bibliotecas peptidicas
Tal como mencionado acima, as bibliotecas peptidicas 1, 2 e 3 são geradas com um sintetizador de péptidos Applied Biosystems 431A seguindo química Fmoc clássica. A biblioteca peptídica 4 comercialmente disponível é gerada de acordo com a descrição do fabricante (ver acima e em www.mimotopes.com). Os 90 péptidos estão ligados C-terminalmente a um alfinete. 0 ELISA com cada uma das bibliotecas peptidicas foi realizado seguindo protocolos padrão: A biblioteca peptídica é dissolvida em DMSO a 100% (concentração final de 10 mg/ml). A solução peptídica é ainda diluída em PBS. A mistura peptídica é revestida de um dia para o outro (4°C) em placas de ELISA (Nunc Maxisorp, Alemanha), a começar com 500 pg/poço e titulada a 100 ng/poço.
As placas são lavadas 3x vezes com PBS/Tween 20 (0,1% v/v).
As placas são bloqueadas com PBS/BSA (2 h à temperatura ambiente) . 25 ΡΕ1583774
As placas são lavadas 3x vezes com PBS/Tween.
As placas são incubadas com mAb específico de DAEFRH biotinilado (10 pg/ml em PBS) durante 4 h à temperatura ambiente.
As placas são lavadas 3χ vezes com PBS/Tween.
As placas são incubadas com estreptavidina-peroxidase de rábano (30 min à temperatura ambiente).
As placas são lavadas 5x vezes com PBS/Tween.
As placas são incubadas com ABTS+H2O2 (0,1% p/v; 10 a 45 min) e a reacção é parada com ácido cítrico seguido de avaliação fotométrica (comprimento de onda 405 nm). 3: Verificação de mimotopos através de ensaio de inibição 3.1. Biblioteca adicional
Para além das 4 bibliotecas descritas acima (ver 2.1., 2.2., 2.3. e 2.4.) uma quinta biblioteca é utilizada para definir sequências de mimotopos. Esta biblioteca de 6-meros está comercialmente disponível em microcolecções EMC (Tubingen, Alemanha) e contém 114 misturas diferentes de hexapéptidos, uma posição por mistura é definida por um de todos os aa naturais excepto C (19 possibilidades), as restantes 5 posições são variáveis:
Misturas 01 a 06 (uma posição fixada, alanina A, restantes 5 variáveis, X):
Mistura 01: AXXXXX
Mistura 02: XAXXXX
Mistura 03: XXAXXX 26
XXXAXX XXXXAX XXXXXA a 12 (uma posição X) : RXXXXX XRXXXX XXRXXX XXXRXX XXXXRX XXXXXR fixada, arginina R, ΡΕ1583774
Mistura 04: Mistura 05: Mistura 06: Misturas 07 restando 5 variáveis, Mistura 07: Mistura 08: Mistura 09: Mistura 10: Mistura 11: Mistura 12:
Concordantemente, as mistura 13 a 114 são desenhadas utilizando todos os aa naturais excepto C. 3.2. Ensaio de inibição
As Figuras 2 e 3 descrevem os resultados de ensaios de inibição realizados com péptidos mimotopo incluídos e obtidos a partir das 5 bibliotecas (tal como descrito). Os péptidos mimotopo competem com o epitopo original pelo reconhecimento pelo anticorpo monoclonal. O epitopo original e os péptidos mimotopo contêm um C adicional no terminal C para ligação a um transportador proteico (se desejado). São utilizados os seguintes péptidos:
Péptido 1737 DAEFRH Péptido 3001 DKELRI ΡΕ1583774 27
Péptido 3002 DWELRI Péptido 3003 YREFFI Péptido 3004 YREFRI Péptido 3005 YAEFRG Péptido 3006 EAEFRG Péptido 3007 DYEFRG Péptido 3008 ELEFRG Péptido 3009 SFEFRG Péptido 3010 DISFRG Péptido 3011 DIGWRG
Procedimento:
Placas de ELISA (Nunc Maxisorp) são revestidas com o epitopo peptídico original DAEFRH (prolongado C-terminalmente com C e ligado a albumina de soro bovino BSA) a uma concentração de péptido-BSA de 0,1 yg/ml (100 μΐ/poço, 12h, O O Após bloqueio com PBS/BSA a 1% (200 μΐ/poço, 12h, o O as placas são lavadas 3* vezes com PBS/Tween. Depois, o anticorpo monoclonal biotinilado (1:2000, 50 μΐ/poço) e os péptidos (50 μΐ/poço) a 50, 5, 05, 0,05, 0,005 e 0,0005 pg/ml são adicionados durante 20 min a 37°C. As placas são lavadas 3x vezes com PBS/Tween e são incubadas com estreptavidina marcada com peroxidase de rábano (HRP) (100 μΐ/poço, 30 min, TA) . As placas são lavadas 5* vezes com PBS/Tween e são incubadas com ABTS+H202 (0, 1% p/v, 10 a 45 min) e a reacção é parada com ácido citrico seguido de avaliação fotométrica (comprimento de onda 405 nm). 28 ΡΕ1583774
Tal como esperado e observado na Fig. 2, o péptido 1737 DAEFRH pode competir com péptido DAEFRH ligado a BSA e ligado à placa e inibe assim o reconhecimento pelo anticorpo monoclonal. Para além disso, mostra-se que o péptido 3003 não é capaz de inibir a ligação do anticorpo monoclonal ao epitopo original. Em contraste, os péptidos 3001, 3002, 3004, 3005, 3006 e 3007 (numa extensão diferente) bloqueiam o reconhecimento do epitopo. Enquanto o péptido 3004 é apenas inibidor a uma elevada concentração (50 yg/ml) , os péptidos 3001, 3006 e 3007 são fortemente inibidores com uma CI50 de menos de 0,5 yg/ml. Os péptidos 3002 e 3005 são inibidores "intermédios" com uma CI50 de mais de 0,5 yg/ml.
Tal como esperado e observado na Fig. 3, o péptido 1737 DAEFRH pode competir com sucesso com o péptido DAEFRH ligado a BSA e ligado à placa pelo reconhecimento pelo anticorpo monoclonal numa experiência independente efectuada adicionalmente. Para além disso, mostra-se que os péptidos 3010 e 3011 não são inibidores nas concentrações testadas, enquanto os péptidos 3008 e 3009 são inibidores (relativamente) fracos com uma CI50 de menos de 5 yg/ml. A Tabela 1 resume brevemente a capacidade inibidora dos mimotopos incluidos e obtidos a partir das bibliotecas (tal como descrito): 29 ΡΕ1583774
Tabela 1: Capacidade inibidora dos mimotopos: Péptido 3001 DKELRI Forte Péptido 3002 DWELRI intermédia Péptido 3003 YREFFI nenhuma Péptido 3004 YREFRI fraca Péptido 3005 YAEFRG intermédia Péptido 3006 EAEFRG forte Péptido 3007 DYEFRG forte Péptido 3008 ELEFRG fraca Péptido 3009 SFEFRG fraca Péptido 3010 DISFRG nenhuma Péptido 3011 DIGWRG nenhuma 4. Ensaio de inibição para mimotopos adicionais pesquisados de acordo com o presente invento
Ensaio de inibição
As Figuras 4 e 5 descrevem os resultados dos ensaios de inibição realizados com péptidos mimotopo incluídos e obtidos a partir das 5 bibliotecas (tal como descrito). Os péptidos mimotopo competem com o epitopo original pelo reconhecimento pelo anticorpo monoclonal. 0 epitopo original e os péptidos mimotopo contêm um C adicional no terminal C (posição 7) para ligação a um transportador proteico (se desejado). 30 ΡΕ1583774
São utilizados os seguintes Péptido 1737 DAEFRH (epitopo Péptido 1234 KKELRI Péptido 1235 DRELRI Péptido 1236 DKELKI Péptido 1237 DRELKI Péptido 1238 DKELR Péptido 1239 EYEFRG Péptido 1241 DWEFRDA Péptido 4D02 SWEFRT Péptido 4003 GREFRN Péptido 4004 WHWSWR péptidos: original + C)
Procedimento:
Placas de ELISA (Nunc Maxisorp) são revestidas com o epitopo peptidico original DAEFRH (prolongado C-terminalmente com C e ligado a albumina de soro bovino BSA) a uma concentração de péptido-BSA de 0,1 yg/ml (100 μΐ/poço, 12h, 4°C) . Após bloqueio com PBS/BSA a 1% (200 μΐ/poço, 12h, 4°C), as placas são lavadas 3χ vezes com PBS/Tween. Depois, o anticorpo monoclonal biotinilado (1:2000, 50 μΐ/poço) e os péptidos (50 μΐ/poço) a diferentes concentrações são adicionados durante 20 min a 37°C. As placas são lavadas 3χ vezes com PBS/Tween e são incubadas com estreptavidina marcada com peroxidase de rábano (HRP) (100 μΐ/poço, 30 min, TA) . As placas são lavadas 5χ vezes com PBS/Tween e são incubadas com ABTS+H2O2 (0,1% p/v, 10 a 45 min) e a reacção é parada com 31 ΡΕ1583774 ácido cítrico seguido de avaliação fotométrica (comprimento de onda 405 nm).
Tal como esperado e observado na Fig. 4, o péptido 1737 DAEFRH pode competir com o péptido DAEFRH ligado a BSA e ligado à placa e inibe assim o reconhecimento pelo anticorpo monoclonal. Para além disso, mostra-se que o péptido 4004 não é capaz de inibir a ligação do anticorpo monoclonal ao epitopo original. Em contraste, os péptidos 4002 e 4003 (numa extensão diferente) bloqueiam o reconhecimento do epitopo. Enquanto o péptido 4003 é apenas inibidor a uma concentração relativamente elevada (10 yg/ml), o péptido 4002 é fortemente inibidor com uma CI5o de menos de 0,4 pg/ml.
Tal como esperado e observado na Fig. 5, o péptido 1737 DAEFRH pode competir com sucesso com o péptido DAEFRH ligado a BSA e ligado à placa pelo reconhecimento pelo anticorpo monoclonal numa experiência independente efectuada adicionalmente. Para além disso, mostra-se que o péptido 1234 é dificilmente inibidor nas concentrações testadas, enquanto os péptidos 1235, 1236, 1237, 1238, 1239 e 1241 (numa extensão diferente) bloqueiam o reconhecimento do epitopo. Os péptidos 1235, 1238 e 1241 são fortes inibidores com uma CI50 de menos de 0,5 yg/ml, enquanto os péptidos 1236 e 1237 são inibidores (relativamente) fracos com uma CI50 de mais de 5 pg/ml. O péptido 1239 é um inibidor intermédio com uma CI50 de mais de 0,5 yg/ml. 32 ΡΕ1583774 A Tabela 2 resume brevemente a capacidade inibi-dora dos mimotopos incluídos e obtidos a partir das bibliotecas (tal como descrito):
Tabela 2: Capacidade inibidora dos mimotopo Péptido 1234 KKELRI nenhuma Péptido 1235 DRELRI forte Péptido 1236 DKELKI fraca Péptido 1237 DRELKI fraca Péptido 1238 DKELR forte Péptido 1239 EYEFRG intermédia Péptido 1241 DWEFRDA forte Péptido 4002 SWEFRT forte Péptido 4003 GREFRN fraca Péptido 4004 WHWSWR nenhuma
Os resultados apresentados nas Figuras 4 e 5 mostram que para além de vários péptidos 6-mero (tal como mostrado aqui e antes), péptidos 5-mero (nomeadamente o péptido 1238 DKELR) e péptidos 7-mero (nomeadamente o péptido 1241 DWEFRDA) podem ser utilizados como epitopos numa vacina de Alzheimer baseada em mimotopos.
Lisboa, 30 de Março de 2010
Claims (9)
- ΡΕ1583774 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um composto consistindo em: um péptido de 5 a 15 aminoácidos compreendendo uma sequência de aminoácidos, seleccionada de entre o grupo que consiste em DKELRI, DWELRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT e DKELR, contendo o referido péptido um residuo de cisteina adicional no terminal C e um transportador proteico ligado através do referido residuo de cisteina ao referido péptido para a preparação de uma vacina para a doença de Alzheimer (DA) .
- 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1 caracterizada por o referido péptido ter um comprimento de 6 a 12 aminoácidos.
- 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizada por o transportador proteico ser KLH.
- 4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizada por a vacina compreender ainda hidróxido de alumínio.
- 5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizada por a vacina conter o composto numa quantidade de 0,1 ng a 10 mg. 2 ΡΕ1583774
- 6. Vacina contra a doença de Alzheimer compreendendo um composto consistindo em: um péptido de 5 a 15 aminoácidos compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada de entre o grupo que consiste em DKELRI, DWELRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT e DKELR, contendo o referido péptido um resíduo de cisteína adicional no terminal C e um transportador proteico ligado através do referido resíduo de cisteína ao referido péptido.
- 7. Vacina de acordo com a reivindicação 6 caracterizada por o transportador proteico ser KLH.
- 8. Vacina de acordo com a reivindicação 6 ou 7 caracterizada por compreender ainda hidróxido de alumínio.
- 9. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8 caracterizada por conter o composto numa quantidade de 0,1 ng a 10 mg. Lisboa, 30 de Março de 2010
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