ES2339447T3 - Procedimiento para prevenir y tratar la enfermedad de alzehimer (ad). - Google Patents
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Abstract
Utilización de un compuesto, constituido por - un péptido de 5 a 15 aminoácidos que incluye una secuencia aminoácida, seleccionada de entre el grupo constituido por DKELRI, DWELRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT y DKELR, conteniendo dicho péptido un residuo adicional de cisteína en el extremo C y - un soporte proteico acoplado mediante dicho residuo de cisteína a dicho péptido, para la preparación de una vacuna destinada a la enfermedad de Alzheimer (AD).
Description
Procedimientos para prevenir y tratar la
enfermedad de Alzheimer (AD).
La presente invención se refiere a
procedimientos para prevenir y tratar la enfermedad de Alzheimer
(AD).
El péptido amiloide-\beta
(A\beta) juega un papel central en la neuropatología de la
enfermedad de Alzheimer (AD) (Roher et al, 1993:
"\beta-amyloid-(1-42) is a major
component of cerebrovascular amyloid deposits: Implications for the
pathology of Alzheimer disease", PNAS 90:10836). Las formas
familiares de la enfermedad se han relacionado con mutaciones en la
proteína precursora amiloide (APP) y en los genes de la presenilina.
Las mutaciones relacionadas con la enfermedad en estos genes dan
lugar al aumento en la producción de la forma de 42 aminoácidos del
péptido (A\beta42), que es la forma predominante que se encuentra
en las placas amiloides de la enfermedad de Alzheimer. Está
disponible comercialmente un modelo animal para la enfermedad. El
ratón transgénico PDAPP, que sobre-expresa la APP
humana mutante (en la cual el aminoácido se encuentra en la posición
717 es F en vez de V), desarrolla progresivamente muchas de las
características neuropatológicas de la enfermedad de Alzheimer en
una forma cerebral dependiente y que depende también de la edad
(Games et al., 1995: "Alzheimer-type
neuropathology in transgenic mice overexpressing V717F
\beta-amyioid precursor protein", V717F, Nature
373:523).
Ya se han realizado estudios de vacunación con
una vacuna "normal", no mimotópica. Se inmunizaron animales
transgénicos con la A\beta42 agregada, antes del inicio de las
neuropatologías de tipo AD (6 semanas) o a una edad más avanzada
(11 meses): la inmunización de animales jóvenes previno el
desarrollo de la formación de las placas, de la distrofia neurítica
y de la astrogliosis. El tratamiento de los animales viejos
disminuyó de forma importante las neuropatologías de tipo AD. El
enfoque de la vacunación experimental indujo el desarrollo de
anticuerpos contra A\beta42 capaces de atravesar la barrera
hematoencefálica y de atacar las placas amiloides (Schenk et
al, 1999: "Immunization with
amyloid-\beta-attenuates
Alzheimer-disease-like pathology in
the PDAPP mouse", Nature 400:173). Las placas son eliminadas
posteriormente mediante diversos mecanismos, que incluyen la
fagocitosis mediada por el receptor Fc (Bard et al 2000:
"Peripherally administered antibodies against amyloid
\beta-peptides enter the central nervous system
and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease",
Nature Med 6:916). Esta vacuna pudo asimismo retrasar los déficits
de memoria (Janus et al, 2000: "A\beta peptide
immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model
of Alzheimer's disease", Nature 408:979).
Desde finales del año 1999, se han realizado
estudios clínicos muy prometedores para AD. Se cree que la
inmunización moviliza el sistema inmune para atacar las placas y
limpia estos depósitos del cerebro humano afectado, aunque el
mecanismo preciso que subyace necesita caracterizarse más
detalladamente.
Estos ensayos clínicos se realizaron por la
compañía farmacéutica Elan conjuntamente con su socio corporativo,
American Home Products (vacuna terapéutica AN-1792,
QS21 como adyuvante). Los ensayos clínicos de Fase I finalizaron
con éxito en 2000. Los ensayos clínicos de Fase II comenzaron al
final del 2001 para ensayar la eficacia en un conjunto de pacientes
con una AD de media a moderada.
Ahora, estos ensayos clínicos de Fase II, se han
discontinuado permanentemente debido a la neuroinflamación en
diversos pacientes (Editorial 2002 "Insoluble problem?" Nature
Med 8:191). Los síntomas incluían meningoencefalitis aséptica, que
llevaron a la detención inmediata de estos ensayos clínicos por todo
el mundo. En el peor caso, los pacientes afectados mostrarán haber
expresado una respuesta inmune: un riesgo inherente a muchas
inmunoterapias. Las respuestas autoinmunes podrían haberse
anticipado dada la ubicuidad de APP, la cual transporta
determinantes antigénicos en común con el producto proteolítico.
Más recientemente, estudios adicionales se concentraron en la
naturaleza de los anticuerpos agregados inducidos por la
inmunización de A\beta42 (en el hombre y en los ratones),
revelando que la mayoría de los anticuerpos reconocen un pequeño
dominio entre los aminoácidos 4 y 10 de A\beta42
(A\beta4-10). Los anticuerpos murinos pudieron
bloquear la fibrilogénesis A\beta y rompió las fibras A\beta
preexistentes (McLaurin et al, 2002 "Therapeutically
effective antibodies against amyloid-\beta
peptide target amyloid-\beta residues
4-10 and inhibit cytotoxicity and
fibrillogenesis", Nature Med 8:1263). De hecho, los anticuerpos
humanos no reaccionan con la APP expuesta en la superficie de las
células o con cualquier otro producto proteolítico no agregado del
precursor (Hock et al 2002 "Generation of antibodies
specific for \beta-amyloid by vaccination of
patients with Alzheimer disease", Nature Med 8:1270). Se observó
una clara diferencia entre los sueros humanos y murinos: en
contraste con los sueros humanos, los anticuerpos murinos detectan
A\beta monoméricos, oligoméricos y fibrilares. Esta es importante
y puede constituir un prerequisito para la potencia terapéutica, ya
que se acumula la evidencia de que los pequeños oligómeros de
A\beta, que no son reconocidos por los
anti-A\beta humanos, constituyen los mayores
protagonistas tóxicos en la enfermedad (Walsh et al, 2002:
"Naturally secreted oligomers of amyloid B protein potently
inhibit hippocampal long-term potentiation in
vivo", Nature 416:535). Así, una nueva estrategia potencial
es la inmunización con una vacuna que contiene los aminoácidos
4-10 del \beta-amiloide (en vez
del A\beta42 agregado). A pesar de la eficacia no conocida, esta
estrategia puede también encarar los problemas autoinmunes, puesto
que los pacientes será inmunizados directamente con un "auto"
epítopo (células B lineales).
El documento WO 00/72880 A da a conocer la
utilización de fragmentos N-terminales de A\beta42
en una vacuna para la enfermedad de Alzheimer.
El documento WO 01/18169 A2 da a conocer un
procedimiento para llevar a cabo una inmunización contra
enfermedades que formen placas, utilizando tecnologías de
exposición.
A pesar de estos decepcionantes desarrollos en
recientes estrategias de vacunación de AD, una vacuna A\beta se
considera todavía como la forma más prometedora para combatir la AD.
Sin embargo, es necesario urgentemente mejorar y obtener nuevas
estrategias en para vacunación de AD. Especialmente, dicha vacuna no
inducirá células T y/o B.
Por tanto, la presente invención proporciona la
utilización de un compuesto constituido por
- -
- un péptido de 5 a 15 aminoácidos que incluye una secuencia aminoácida, seleccionada de entre el grupo constituido por DKELRI, DWELRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT y DKELR, conteniendo dicho péptido un residuo adicional de cisteína en el extremo C y
- -
- un soporte proteico acoplado mediante dicho residuo de cisteína a dicho péptido
para la preparación de una vacuna para la
enfermedad de Alzheimer (AD).
\vskip1.000000\baselineskip
Según la presente invención, se utiliza un
mimotopo A\beta42 para la vacunación contra AD. El mimotopo induce
la producción de anticuerpos contra A\beta42 pero no contra la
APP original. El mimotopo puede identificarse con un anticuerpo
(monoclonal) y bibliotecas peptídicas (disponibles comercialmente)
(por ejemplo, según Reineke et al. 2000 "Identification of
distinct antibody epitopes and mimotopes from a peptide array of
5520 randomly generated sequences", J. Immunol Methods 267:37).
Se utiliza un anticuerpo (monoclonal) que no reconoce a APP pero
detecta sólo distintas especies A\beta con ácido aspártico amino
terminal (un ejemplo de dicho anticuerpo se describe en
Johnson-Wood et al 1997: "Amyloid precursor
protein processing and Ab42 deposition in a transgenic mouse model
of Alzheimer disease", PNAS 94:1550). Se ha demostrado que dicho
anticuerpo constituye una herramienta ideal para identificar
mimotopos vacunales apropiados durante la presente invención. Aunque
dichos anticuerpos monoclonales mostraran que tenían efectos
beneficiosos en un modelo murino de AD cuando se administraron
directamente a los ratones (Bard et al., 2000:
"Peripherally administered antibodies against amyloid
\beta-peptide enter the central nervous system and
reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease", Nature
Med 6:916), nunca se ha propuesto utilizarlos como herramientas de
búsqueda de mimotopos para aislar compuestos vacunales AD.
En la técnica anterior, se concentraron todos
los esfuerzos en el péptido A\beta que se encuentra naturalmente.
Tal como se menciona anteriormente, los ensayos clínicos de la
vacuna del péptido A\beta se detuvieron debido a eventos
neuroinflamatorios. En realidad, los programas de predicción de los
epítopos de las células T (BIMAS para los epítopos que se
restringen al tipo I y TEPITOPE para los restringidos al tipo II),
proponen, dentro de la secuencia, (auto) epítopos con un índice (de
valoración o capacidad funcional) elevado. Esto podría implicar que
los episodios neuroinflamatorios se deben a reacciones autoinmunes
que harían que dicha vacuna no fuera apropiada para una aplicación
general.
Al contrario que dichas vacunas A\beta
propuestas por la técnica anterior, no se espera que tengan lugar
reacciones autoinmunes durante el tratamiento con una vacuna que
contenga un mimotopo según la presente invención, porque el
anticuerpo (monoclonal) que se utilice para la identificación
mimotópica según la presente invención no reconoce a APP y la
secuencia mimotópica es distinta de las auto secuencias derivadas de
A\beta42 que se han utilizado hasta ahora en ensayos clínicos, o
se utilizarán en ensayos futuros.
El anticuerpo utilizado para la identificación
mimotópica según la presente invención, detecta la secuencia
aminoácida DAEFRH derivada de A\beta (epítopo original) con un
ácido aspártico amino terminal libre, que por lo tanto no reconoce
la APP original. El anticuerpo puede ser una preparación de un
anticuerpo policlonal o monoclonal o de cualquier parte de
anticuerpo o su derivado, siendo el único prerequisito que la
molécula de anticuerpo reconozca específicamente el epítopo DAEFRH,
es decir, que no se una a las formas naturales prolongadas
N-terminalmente de la proteína precursora del
amiloide, lo que significa que la capacidad de unión al epítopo
DAEFRH es por lo menos 100, preferentemente por lo menos 1.000
veces, más preferentemente por lo menos 10^{5} veces, más alta
que a la molécula APP. El anticuerpo puede ser un anticuerpo que
muestra la misma capacidad de unión o una más alta para la
secuencia DAEFRH como el anticuerpo descrito por
Johnson-Wood et al., 1997. Por supuesto,
también pueden utilizarse anticuerpos con una capacidad de unión más
baja (>10%, >50% o >80% de la capacidad de unión de
Johnson-Wood et al, anticuerpo), aunque es
más preferida la capacidad de unión más alta.
Los compuestos según la presente invención se
unen a los anticuerpos con una especificidad comparable a la de la
secuencia DAEFRH.
Preferentemente, los mimotopos según la presente
invención presentan una longitud comprendida entre 5 y 15, 6 y 12
residuos aminoácidos, específicamente entre 9 y 11. Los mimotopos
según la presente invención están acoplados a soportes proteicos
mediante una cisteína adicional en el extremo C. Además, los
soportes proteicos podrían estar formados por o contener epítopos
de células T auxiliadoras.
Preferentemente, el transportador
farmacéuticamente aceptable es KLH, el toxoide tetánico, proteína
unida a albúmina, albúmina sérica bovina, un dendrímero (MAP, Biol.
Chem. 358:581), así como substancias adyuvantes que se describen en
Singh et al., Nat. Biotech, 17 (1999),
1075-1081 (especialmente las contenidas en la tabla
1 de este documento) y O'Hagan et al, Nature Reviews, Drugs
Discovery 2(9) (2003), 727-735
(específicamente los compuestos innatos potenciadores de la
inmunidad y los sistemas de suministro que en ella se describen), o
sus mezclas. Además, la composición vacunal puede contener hidróxido
de aluminio.
Una vacuna que comprende el presente compuesto
(mimotopo) y el transportador farmacéuticamente aceptable puede
administrarse mediante cualquier modo de aplicación apropiado, por
ejemplo, vía intravenosa, intraperitonal, intramuscular,
intranasal, oral, subcutánea, etc., y en cualquier dispositivo
apropiado de suministro (O'Hagan et al., Nature Reviews,
Drug Discovery 2(9) (2003), 727-735).
Típicamente, la vacuna contiene el compuesto según la presente
invención en una cantidad comprendida entre 0,1 ng y 10 mg,
preferentemente entre 10 ng y 1 mg, en particular de 100 ng a 100
\mug o, alternativamente, por ejemplo, entre 100 fmol y 100
\mumol, preferentemente entre 10 pmol y 1 \mumol, en
particular, entre 100 pmol y 100 nmol. La vacuna puede incluir
asimismo substancias típicas auxiliares, por ejemplo, tampones,
estabilizantes, etc.
Un procedimiento para aislar un compuesto que se
une a un anticuerpo que es específico para la secuencia DAEFRH de
la A\beta42 N-terminal natural, comprende las
etapas siguientes:
- -
- proporcionar una biblioteca de compuestos peptídicos que comprende péptidos que contienen la secuencia aminoácida siguiente: X_{1}X_{2}X_{3}X_{4}X_{5}X_{6}, siendo X_{1} un aminoácido, excepto de C, X_{2} es un aminoácido, excepto de C, X_{3} es un aminoácido, excepto de C, X_{4} es un aminoácido, excepto de C, X_{5} es un aminoácido, excepto de C, X_{6} es un aminoácido, excepto de C, y donde X_{1}X_{2}X_{3}X_{4}X_{5}X_{6} no es DAEFRH,
- -
- poner en contacto dicha biblioteca peptídica con dicho anticuerpo y
- -
- aislar los elementos de la biblioteca peptídica que se unen a dicho anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
Un procedimiento específico para aislar un
compuesto que se une a un anticuerpo que es específico para la
secuencia DAEFRH de la A\beta42 N-terminal
natural, comprende las etapas siguientes:
- -
- proporcionar una biblioteca de compuestos peptídicos que comprende péptidos que contienen la secuencia aminoácida siguiente: X_{1}X_{2}X_{3}X_{4}X_{5}X_{6}, siendo X_{1} un aminoácido natural, excepto de K y C, X_{2} es un aminoácido natural, excepto de C, X_{3} es un aminoácido natural excepto de K y C, X_{4} es un aminoácido natural excepto de K y C, X_{5} es un aminoácido natural, excepto de C, X_{6} es un aminoácido natural, excepto de P y C, y donde X_{1}X_{2}X_{3}X_{4}X_{5}X_{6} no es DAEFRH,
- -
- poner en contacto dicha biblioteca peptídica con dicho anticuerpo y
- -
- aislar los elementos de la biblioteca peptídica que se unen a dicho anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se describe anteriormente, y adaptados
a las bibliotecas con 5 variables aminoácidas, pueden obtenerse
aislamientos pentamonoméricos apropiados según la invención,
preferentemente mediante, preferentemente, el cribado de una
biblioteca que tenga las variables aminoácidas X1 a X5 tal como se
describe en la presente memoria, o identificando pentamonómeros
apropiados en un elemento positivo cribado en una biblioteca de
hexamonómeros (véase anteriormente). De la misma forma, y de
acuerdo con esto, pueden realizarse aplicaciones en bibliotecas
7-mer, 8-mer, de
9-mer, de 10-mer, etc, para cribar
secuencias apropiadas que se unan al tipo de anticuerpo que se
encuentra presente. Pueden encontrarse fragmentos de dichas
secuencias más largas, apropiados para la unión a los anticuerpos,
por ejemplo, ensayando estos fragmentos que tengan una longitud de
5, 6, 7, 8, 9 ... residuos aminoácidos para unirse al anticuerpo
presente.
Dicho procedimiento se ha mostrado exitoso para
proporcionar mimotopos A\beta según la presente invención.
Preferentemente, dichos péptidos se suministran
de forma individual a dicha biblioteca, inmovilizada especialmente
en una superficie sólida, tal como por ejemplo es posible con la
tecnología peptídica MULTIP-ID^{TM}. La
biblioteca puede también suministrarse con una mezcla peptídica y
los complejos peptídicos de los anticuerpos pueden aislarse después
de la unión de los anticuerpos. Alternativamente, el anticuerpo
puede inmovilizarse y la biblioteca peptídica (en suspensión o
solución) puede ponerse entonces en contacto con los anticuerpos
inmovilizados.
Preferentemente, los anticuerpos de cribado (o
los elementos de esta biblioteca) comprenden un marcador apropiado
que permite la detección o aislamiento del anticuerpo o del complejo
peptídico del anticuerpo cuando se une a un péptido de la
biblioteca. Sistemas marcadores apropiados (biotinilación,
fluorescencia, radioactividad, marcadores magnéticos, marcadores
que desarrollan colores, anticuerpos secundarios), están fácilmente
para el experto en la técnica.
La biblioteca tiene que construirse para excluir
la secuencia A\beta que se encuentra naturalmente (por ejemplo,
DAEFRH), pues la vacunación con esta secuencia está claramente
excluida de la invención.
\newpage
Otra técnica apropiada para aislar los epítopos
según la presente invención es llevar a cabo el cribado en
bibliotecas fago-peptídicas tal como se describen,
por ejemplo, en WO 03/020750.
La presente invención también se refiere a una
vacuna contra la enfermedad de Alzheimer que comprende un compuesto
constituido por:
- -
- un péptido de 5 a 15 aminoácidos que incluye una secuencia aminoácida, seleccionada de entre el grupo constituido por DKELRI, DWELRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT y DKELR, conteniendo dicho péptido un residuo adicional de cisteína en el extremo C y
- -
- un soporte proteico acoplado mediante dicho residuo de cisteína a dicho péptido. Estas secuencias son A\beta-mimotopos puramente artificiales. Los péptidos son -con propósitos de vacunación- unidos a soportes proteicos apropiados mediante una cisteína adicional en el extremo C y administrados de una forma apropiada (por ejemplo, descrito en O'Hagan et al. Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735).
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se describe además en los
siguientes ejemplos y figuras, por supuesto, sin estar limitada a
los mismos.
La figura 1 muestra los elementos peptídicos
individualizados de la biblioteca 4 utilizados para el presente
procedimiento de cribado.
La figura 2 muestra un ensayo de inhibición con
mimotopos para DAEFRH.
La figura 3 muestra otro ensayo de inhibición
con otros mimotopos para DAEFRH.
Las figuras 4 y 5 describen los resultados de
los ensayos de inhibición llevados a cabo con péptidos mimotopos
según la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se vacunaron ratones con el péptido DAEFRH
hexamonomérico (secuencia A\beta42 N-terminal
natural) unido a la albúmina BSA sérica proteica bovina (para
utilizar el efecto transportador hapteno), emulsificado en CFA
(primera inyección) e IFA (inyecciones de "recuerdo").
Hibridomas productores de anticuerpos péptido-DAEFRH
específicos, se detectan mediante ELISA (placas ELISA revestidas
con el péptido DAEFRH). El péptido SEVKMDAEFRH) (secuencia natural
prolongada N-terminalmente, derivada de APP, que
contiene la secuencia DAEFRH derivada de A\beta42), se utiliza
como hibridomas peptídicos de control negativo que reconocen el
péptido prolongado, se excluyen porque no distinguen entre los
péptidos derivados de A\beta42 con el ácido aspártico libre en el
extremo N y el péptido DAEFRH derivado de APP sin el ácido aspártico
libre.
Los mimotipos de la presente invención se han
encontrado adaptando el procedimiento de Reinke et al, 2000,
cribando bibliotecas peptídicas para unirlas a un anticuerpo
(preferentemente un anticuerpo monoclonal), que es específico para
los tipos A\beta con el ácido aspártico
amino-terminal. Otro procedimiento se encuentra
comercialmente disponible como tecnología peptídica
MULTIPIN^{TM}.
La tecnología peptídica MULTIPIN^{TM} implica
la síntesis de péptidos sobre pernos polietilénicos especialmente
preparados, montados sobre bloques, en un formato que es compatible
con la placa estándar de 8 x 12 microlitros utilizada para muchos
ensayos biológicos. Tanto los péptidos unidos a los pernos (péptidos
no fragmentables que permanecen unidos covalentemente al perno) y
los péptidos en fase de solución (aquéllos que se han fragmentado
en la superficie del perno), pueden obtenerse mediante este
procedimiento.
Bloques de péptidos sintetizados
individualmente, dos de los cuales constituyen secuencias control
cuidadosamente seleccionadas, basados en el sistema de síntesis
MULTIPIN, permiten la síntesis simultánea y el cribado de grandes
cantidades de péptidos.
Los PepSets (conjuntos peptídicos) consisten en
bloques de 96 péptidos sintetizados individualmente, dos de los
cuales constituyen secuencias control cuidadosamente seleccionadas.
Los controles fragmentados se ensayan con respecto a la pureza,
mediante HPLC de fase inversa y contenido peptídico cuantificado
mediante análisis de aminoácidos. Mediante técnicas ELISA estándar,
se evalúan controles positivos y negativos no fragmentables.
Los PepSets están disponibles con diversas
modificaciones químicas que incluyen la acetilación, biotinilación,
fosforilación y ciclización. Los péptidos en fase de solución
(fragmentados) se mandan como polvos liofilizados.
Para la producción de péptidos en fase de
solución, se seleccionan extremos C-terminales,
incluyendo ácidos y amidas, dependiendo de la aplicación que se
desee para el péptido. El enlace capaz de fragmentarse es
incorporado a la superficie del perno, como un derivado del éster
preformado del aminoácido C-terminal, o sobre el
engarce amídico "Rink". Los péptidos con grupos ácidos o
amídicos, son liberados a continuación, tratando el péptido unido
al perno con ácido fuerte. Las opciones para la escala de la
síntesis son una escala nominal de 1 micromol o de 5 micromoles.
Los factores tales como la hidrofobicidad y la eficiencia de
fragmentación afectará a la recuperación peptídica, de forma que el
rendimiento peptídico esperado sea de 0,5 a 1 micromol (alrededor
de 1 mg de un péptido de 15 monómeros) cuando los péptidos se
sintetizan en la escala nominal de 1 micromol, o de 2,5 a 5
micromoles para los péptidos sintetizados sobre la escala nominal de
5 micromoles.
Los péptidos no fragmentables permanecen
covalentemente unidos a los pernos y pueden utilizarse para cribar
rápidamente péptidos de interés utilizando técnicas ELISA. Dichos
péptidos son útiles para el rastreo de epítopos de anticuerpos y
estudios de relación estructura-actividad (SAR). La
eliminación de los anticuerpos unidos o de otras proteínas,
regenera los péptidos y permite su reutilización en otros ensayos.
Los conjuntos de péptidos (PepSets) se utilizan para diversas
aplicaciones que incluyen la identificación de indicios peptídicos
de interés biológico a partir del cribado a través de secuencias
proteicas, la optimización de indicios peptídicos, y el desarrollo
de nuevas generaciones de análogos. La flexibilidad de la estrategia
total que se utiliza en los procedimientos de rastreo, se potencia
en gran manera utilizando diversos diseños sintéticos que
proporcionan conjuntamente un procedimiento sistemático para
caracterizar completamente los candidatos indiciales.
Los amplios resultados obtenidos de los
conjuntos peptídicos sistemáticos no sólo identifican péptidos de
interés, sino que también indican residuos críticos, su capacidad de
reemplazamiento y la longitud peptídica óptima. Consecuentemente,
como resultado de dichos hallazgos, puede clasificarse un conjunto
de péptidos relacionados. El reemplazamiento de los
L-aminoácidos con los D-aminoácidos
y otros residuos inusuales, constituye un poderoso enfoque para
manipular la estructura y la conformación de un péptido. Este
procedimiento es también una forma rápida de descubrir nuevos
análogos con distintas propiedades farmacológicas, tales como
antagonistas y péptidos con un aumento en la estabilidad.
Empezando con una secuencia proteica conocida,
pueden llevarse a cabo la elaboración de mapas de todos los
epítopos secuenciales de los anticuerpos utilizando el enfoque
Multipin. Actualmente, son posibles diversos procedimientos
alternativos para elaborar los mapas epitópicos secuenciales de las
células B. Estos incluyen péptidos unidos al perno, péptidos en
fase de solución que revisten directamente placas de
microtitulación, y péptidos biotinilados capturados sobre placas de
microtitulación revestidas previamente con avidina o
estreptavidina.
Para los presentes ejemplos, el anticuerpo que
se describe en el ejemplo 1 se utiliza para cribar bibliotecas
peptídicas; cualquier preparación de anticuerpos reconociendo
específicamente, sin embargo, la secuencia DAEFRH, pero no la
secuencia de la molécula A\beta, la cual secuencia se prolonga
N-terminalmente de forma natural (por ejemplo,
MDAEFRH, KMDAEFRH, SEVKMDAEFRH o la proteína APP (precursora)
amiloide completa, tal como por ejemplo se describe por
Johnson-Wood et al, 1997.
Con este propósito, se han construido cuatro
bibliotecas:
Esta biblioteca hexamérica contiene péptidos con
las siguientes secuencias (posiciones aminoácidas 1 a 6):
- Posición 1: todos los aminoácidos naturales, excepto D, K, y C (17 posibilidades)
- Posición 2: todos los aminoácidos naturales, excepto A, K, y C (17 posibilidades)
- Posición 3: todos los aminoácidos naturales, excepto E, K y C (17 posibilidades)
- Posición 4: todos los aminoácidos naturales, excepto F, K, y C (17 posibilidades)
- Posición 5: todos los aminoácidos naturales, excepto R, K, y C (17 posibilidades)
- Posición 6: todos los aminoácidos naturales, excepto H, K y C (16 posibilidades)
\vskip1.000000\baselineskip
La biblioteca 1 es una mezcla de hexapéptidos.
Teóricamente, se incluyen todos los péptidos posibles que contienen
17 aminoácidos distintos (véase a continuación). La mezcla no
contiene ningún residuo de lisina y cisteína. Además, la mezcla no
contiene:
- ácido aspártico en la posición específica 1,
- alanina en la posición específica 2,
- ácido glutámico en la posición específica 3,
- fenilalanina en la posición específica 4,
- arginina en la posición específica 5, e
- histidina en la posición 6.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis se lleva a cabo en un Sintetizador
Applied Biosystems 431A según el protocolo FastMoc, con una escala
sintética de 0,25 mmol.
La síntesis empieza pesando 1 mmol de todos los
aminoácidos deseados (grupos amino y cadenas laterales protegidas).
Entonces, se produjo una mezcla de Asn, Gln, Gly, lle, Leu, Met,
Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val. Se añadieron los siguientes
aminoácidos específico-posicionales:
- Ala, Glu, Phe, Arg, His,(posición/mezcla 1),
- Asp, Glu, Phe, Arg, His (posición/mezcla 2)
- Asp, Ala, Phe, Arg, His (posición/mezcla 3)
- Asp, Ala, Glu, Arg, His (posición/mezcla 4)
- Asp, Ala, Glu, Phe, His (posición/mezcla 5), y
- Asp, Ala, Glu, Phe, Arg (posición/mezcla 6, sin Pro)
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla 6 se utilizó para cargar la resina
(resina 2-cloro-tritilcloruro, 1,49
mmol/g, Alexis, Alemania):
- mezcla 6 de 1 mmol de residuo aminoácido
- 611 mg de resina (=0,91 mmol de grupos reactivos)
- 15 ml de diclorometano
- 5,5 equivalentes = 5 mmol de diisopropiletilamina (871 \mul)
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla se agitó en un matraz durante 1 hora.
A continuación, se añadió 1 ml de metanol, agitándose la mezcla
durante otros 10 minutos. La resina que se cargó se extrajo mediante
fusión parcial y se lavó dos veces con dimetilformamida,
diclorometano, isopropanol, metanol y éter (30 ml de cada uno de
ellos). Se llevó a cabo el secado durante la noche a alto vacío. La
cantidad que se pesó fue de 737 mg.
Una alícuota de 5,66 mg se trató durante 30
minutos con 1 ml de piperidina al 20% en DMF, para definir la
densidad de la resina. A continuación, se centrifugó la mezcla. El
grupo protector libre Fmoc se midió fotométricamente en el
sobrenadante (301 nm, coeficiente de extinción = 7800 M
(e-1)) De acuerdo con esto, la densidad de la
resina es de 0,49 mmol/g.
La totalidad de las siguientes etapas se realizó
en el sintetizador, utilizando las otras mezclas (situadas en 5
cartuchos diferentes). Se utilizaron 515 mg de la resina cargada
(que corresponden a 0,25 mmol: se utilizan mezclas de aminoácidos
en exceso en 4 veces). El grupo protector Fmoc
N-terminal es fragmentado al final de la síntesis.
Después de lavar con etanol y secar durante la noche, se lleva a
cabo la fragmentación de los péptidos de la resina mediante
TFA/H_{2}O (95:5, v/v). La solución TFA se concentra en un
recipiente al vacío de velocidad hasta 1/5 del volumen, y se
precipita y se lava en dietiléter, liofilizándose a
continuación.
Los péptidos 6-mer EIDYHR,
ELDYHR, y EVDYHR constituyen ejemplos para mimotopos que pueden
detectarse mediante el anticuerpo monoclonal que se produce
anteriormente según el ejemplo 1.
Esta biblioteca hexamérica contiene péptidos con
las siguientes secuencias (posiciones aminoácidas 1 a 6):
- Posición 1: D (fijada)
- Posición 2: todos los aminoácidos naturales, excepto A, K, y C (17 posibilidades)
- Posición 3: todos los aminoácidos naturales, excepto E, K y C (17 posibilidades)
- Posición 4: todos los aminoácidos naturales, excepto F, K, y C (17 posibilidades)
- Posición 5: todos los aminoácidos naturales, excepto R, K, y C (17 posibilidades)
- Posición 6: todos los aminoácidos naturales, excepto H, K, C y P (16 posibilidades)
\vskip1.000000\baselineskip
La biblioteca peptídica 2 se construyó según el
procedimiento anteriormente descrito (en 2.1) para la biblioteca
1.
Los péptidos 6-mer DIDYHR,
DLDYHR, y DVDYHR constituyen ejemplos para mimotopos que pueden
detectarse mediante el anticuerpo monoclonal que se produce
anteriormente según el ejemplo 1.
En un enfoque adicional, se utiliza una tercera
biblioteca para definir secuencias mimotópicas. Esta biblioteca
contiene la secuencia original, y permite la detección de mimotopos
más estrechamente relacionados con el epítopo original.
Esta biblioteca 6-mer contiene
péptidos con las siguientes secuencias (posiciones aminoácidas 1 a
6):
- Posición 1: todos los aminoácidos naturales, excepto de K y C (18 posibilidades)
- Posición 2: todos los aminoácidos naturales, excepto de K, y C (18 posibilidades)
- Posición 3: todos los aminoácidos naturales, excepto de K y C (18 posibilidades)
- Posición 4: todos los aminoácidos naturales, excepto de K, y C (18 posibilidades)
- Posición 5: todos los aminoácidos naturales, excepto de K, y C (18 posibilidades)
- Posición 6: todos los aminoácidos naturales, excepto de K, C y P (17 posibilidades)
\vskip1.000000\baselineskip
La biblioteca peptídica 3 se construyó según el
procedimiento anteriormente descrito (en 2.1) para la biblioteca
1.
Los péptidos hexaméricos DIDYRR, DLDYRR, y
DVDYRR constituyen ejemplos para mimotopos que pueden detectarse
mediante el anticuerpo monoclonal anteriormente producido según el
ejemplo 1 (D en posición y R en posición 5 son idénticos a los
epítopos anteriores).
Esta biblioteca 4 peptídica está formada por 5 x
18 = 90 péptidos, está comercialmente disponible a partir de
Mimotopes Ltd (Paris, Francia, véase las instrucciones del
fabricante) y se diseña según la secuencia DAEFRH
N-terminal natural de A\beta42.
- Posición 1: D (fijada)
- Posición 2: todos los aminoácidos naturales, excepto K, y C (18 péptidos distintos)
- Posición 3: todos los aminoácidos naturales, excepto K y C (18 péptidos distintos)
- Posición 4: todos los aminoácidos naturales, excepto K, y C (18 péptidos distintos)
- Posición 5: todos los aminoácidos naturales, excepto K, y C (18 péptidos distintos)
- Posición 6: todos los aminoácidos naturales, excepto K, C y P (18 péptidos distintos)
\vskip1.000000\baselineskip
Los elementos peptídicos individualizados de la
biblioteca 4 se muestran en la figura 1. Los péptidos n^{os} 1,
24, 48, 56 y 80 tienen la secuencia original de la secuencia
N-terminal de A\beta42. Todos los demás péptidos
son péptidos candidatos que se ensayan con respecto a su capacidad
de unión para un anticuerpo que se una a DAEFRH.
Tal como se ha mencionado anteriormente, las
bibliotecas 1, 2 y 3 se generan con un sintetizador peptídico
Applied Biosystems 431A siguiendo (el procedimiento) clásico de la
química Fmoc. La biblioteca 4 peptídica disponible comercialmente
se genera según la descripción de los fabricantes (véase
anteriormente y en www.mimotopes.com). Los 90 péptidos se unen
C-terminalmente a un perno.
Se ha llevado a cabo el ELISA con cada una de
las bibliotecas peptídicas siguiendo protocolos estándar:
La biblioteca peptídica se disuelve en DMSO al
100% (concentración final de 10 mg/ml).
La solución peptídica se diluye posteriormente
en PBS.
Se revisten las placas ELISA (Nunc Maxisorp,
Alemania) con la mezcla peptídica durante la noche (4ºC), empezando
con 500 \mug/pocillo, y titulándose hasta 100 ng/pocillo.
Las placas se lavan 3 x veces con PBS/Tween 20
(0,1% v/v).
Las placas se bloquean con PBS/BSA (2 horas a
temperatura ambiente).
Las placas se lavan 3 x veces con PBS/Tween.
Las placas se incuban con mAb DAEFRH específico
biotinilado (10 \mug/ml en PBS) durante 4 horas a temperatura
ambiente.
Las placas se lavan 3 x veces con PBS/Tween.
Las placas se incuban con
estreptavidina-peroxidasa (de 30 minutos a
temperatura ambiente).
Las placas se lavan 5 x veces con PBS/Tween.
Las placas se incuban con ABTS + H_{2}O_{2}
(0,1% p/vol; 10 a 45 minutos), deteniéndose la reacción con ácido
cítrico seguido por evaluación fotométrica (longitud de onda de 405
nm).
\vskip1.000000\baselineskip
Además de las 4 bibliotecas anteriormente
descritas (véase 2.1., 2.2., 2.3., y 2.4), se utiliza una quinta
biblioteca para definir las secuencias mimotópicas. Esta biblioteca
6-mer está disponible comercialmente en
Microcolecciones EMC (Tübingen, Alemania) y contiene 114 mezclas
hexapeptídicas distintas, definiéndose una posición por mezcla por
uno de todos los aminoácidos naturales excepto de C (19
posibilidades), siendo variables las 5 posiciones restantes:
Mezclas 01 a 06 (una posición fija, alanina A,
permaneciendo 5 variables, X):
- Mezcla 01: AXXXXX
- Mezcla 02: XAXXXX
- Mezcla 03: XXAXXX
- Mezcla 04: XXXAXX
- Mezcla 05: XXXXAX
- Mezcla 06: XXXXXA
\vskip1.000000\baselineskip
Las mezclas 07 a 12 (una posición fija, arginina
R, permaneciendo 5 variables, X):
- Mezcla 07: RXXXXX
- Mezcla 08: XRXXXX
- Mezcla 09: XXRXXX
- Mezcla 10: XXXRXX
- Mezcla 11: XXXXRX
- Mezcla 12: XXXXXR
De acuerdo con esto, las mezclas 13 a 114 se
diseñan utilizando todos los aminoácidos naturales, excepto de
C.
Las figuras 2 y 3 describen los resultados de
los ensayos de inhibición llevados a cabo con péptidos mimotopos
incluidos en y obtenidos a partir de las 5 bibliotecas (tal como se
han descrito). Los péptidos mimotopos compiten con el epítopo
original para el reconocimiento mediante el anticuerpo monoclonal.
Los péptidos mimotópicos y epitópicos originales contienen un C
adicional en el extremo C para unirse a un soporte proteico (si se
desea).
Se utilizan los siguientes péptidos:
- Péptido 1737 DAEFRH
- Péptido 3001 DKELRI
- Péptido 3002 DWELRI
- Péptido 3003 YREFFI
- Péptido 3004 YREFRI
- Péptido 3005 YAEFRG
- Péptido 3006 EAEFRG
- Péptido 3007 DYEFRG
- Péptido 3008 ELEFRG
- Péptido 3009 SFEFRG
- Péptido 3010 DISFRG
- Péptido 3011 DIGWRG
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento:
Las placas ELISA (Nunc Maxisorp) son revestidas
con el epítopo peptídico original DAEFRH (prolongado
C-terminalmente con C y unido a la albúmina sérica
bovina BSA) a una concentración de 0,1 \mug/ml del
péptido-BSA (100 \mul/pocillo, 12 horas, 4ºC.
Después de bloquear con PBS/BSA al 1% (200 \mul/pocillo, 12 h,
40ºC), las placas se lavaron 3 X veces con PBS/Tween. Entonces,
durante 20 minutos a 37ºC se añadieron el anticuerpo monoclonal
biotinilado (1:2000, 50 \mul/pocillo) y péptidos (50
\mul/pocillo) a 50, 5, 0,5, 0,05, 0,005 y 0,0005 \mug/ml. Las
placas se lavan 3 x veces con PBS/Tween, y se incuban con
estreptavidina marcada (con peroxidasa de rábano picante (HRP) (100
\mul/pocillo, 30 min, RT). Las placas se lavaron 5 x veces con
PBS/Tween y se incubaron con ABTS + H_{2}O_{2} (0,1% peso/vol,
de 10 a 45 minutos), y la reacción se detiene con ácido cítrico
seguido por evaluación fotométrica (longitud de onda 405 nm).
Tal como se espera y se observa en la figura 2,
el péptido 1737 DAEFRH puede competir con el péptido DAEFRH unido a
la placa y acoplado a BSA, inhibiendo de esta forma el
reconocimiento por el anticuerpo monoclonal. Además, se muestra que
el péptido 3003 no puede inhibir la unión del anticuerpo monoclonal
al epítopo original. Contrariamente a esto, los péptidos 3001,
3002, 3004, 3005, 3006 y 3007 (en grado distinto) bloquean el
reconocimiento del péptido. Mientras que el péptido 3004 es sólo
inhibitorio a una alta concentración (50 \mug/ml), los péptidos
3001, 3006 y 3007 son fuertemente inhibitorios con una IC_{50} de
menos que 0,5 \mug/ml. Los péptidos 3002 y 3005 son inhibidores
"intermediarios" con una IC_{50} de más de 0,5 \mug/ml.
Tal como se espera y se observa en la figura 3,
el péptido 1737 DAEFRH puede competir con éxito con el péptido
DAEFRH unido a la placa y acoplado a BSA, para el reconocimiento del
anticuerpo monoclonal, en un experimento independiente llevado a
cabo adicionalmente. Además, se muestra que los péptidos 3010 y 3011
no son inhibitorios a las concentraciones que se ensayan, mientras
los péptidos 3008 y 3009 son inhibidores (relativamente) débiles
con una IC_{50} menor que 5 \mug/ml.
\newpage
La Tabla 1 resume brevemente la capacidad
inhibitoria de los mimotopos incluidos en y obtenidos a partir de
bibliotecas (tal como se describen):
Las figuras 4 y 5 describen los resultados de
los ensayos de inhibición llevados a cabo con péptidos mimotópicos
incluidos en y obtenidos a partir de 5 bibliotecas (tal como se
describe). Los péptidos mimotópicos competen con el epítopo
original para el reconocimiento por el anticuerpo monoclonal. Los
péptidos mimotópicos y epitópicos originales contienen un C
adicional en el extremo C (posición 7) para unirse a un soporte
proteico (si se desea).
Se utilizan los péptidos siguientes:
- Péptido 1737 DAEFRH (epítopo original + C)
- Péptido 1234 KKELRI
- Péptido 1235 DRELRI
- Péptido 1236 DKELKI
- Péptido 1237 DRELKI
- Péptido 1238 DKELR
- Péptido 1239 EYEFRG
- Péptido 1241 DWEFRDA
- Péptido 4002 SWEFRT
- Péptido 4003 GREFRN
- Péptido 4004 WHWSWR
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento:
Las placas ELISA (Nunc Maxisorp) son revestidas
con el epítopo peptídico original DAEFRH (prolongado
C-terminalmente con C y unido a la albúmina sérica
bovina BSA) a una concentración de 0,1 \mug/ml del
péptido-BSA (100 \mul/pocillo, 12 horas, 4ºC).
Después de bloquear con PBS/BSA al 1% (200 \mul/pocillo, 12h,
40ºC), las placas se lavaron 3 X veces con PBS/Tween. A
continuación se añadieron el anticuerpo monoclonal biotinilado
(1:2000, 50 \mul/pocillo) y péptidos (50 \mul/pocillo) a
concentraciones diferentes durante 20 minutos a 37ºC. Las placas se
lavan 3 x veces con PBS/Twen, y se incuban con estreptavidina
marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (100 \mul/pocillo)
30 min, RT). Las placas se lavaron 5 x veces con PBS/Tween y se
incubaron con ABTS + H_{2}O_{2} (0,1% peso/vol, de 10 a 45
minutos), y la reacción se detiene con ácido cítrico seguido por
evaluación fotométrica (longitud de onda 405 nm).
Tal como se espera y se observa en la figura 4,
el péptido 1737 DAEFRH puede competir con el péptido DAEFRH unido a
la placa y acoplado a BSA, inhibiendo de esta forma el
reconocimiento por el anticuerpo monoclonal. Además, se muestra que
el péptido 4004 no puede inhibir la unión del anticuerpo monoclonal
al epítopo original. Contrariamente a esto, los péptidos 4002 y
4003, (en grado distinto) bloquean el reconocimiento del epítopo.
Mientras que el péptido 4003 es sólo inhibitorio a una relativamente
alta concentración (10 \mug/ml), el péptido 4002 es fuertemente
inhibitorio con una IC_{50} de menos que 0,4 \mug/ml.
Tal como se espera y se observa en la figura 5,
el péptido 1737 DAEFRH puede competir con éxito con el péptido
DAEFRH unido a la placa y acoplado a BSA, para el reconocimiento del
anticuerpo monoclonal, en un experimento independiente llevado a
cabo adicionalmente. Además, se muestra que el péptido 1234 es
duramente inhibitorio a las concentraciones que se ensayan,
mientras los péptidos 1235, 1236, 1237, 1238, 1239 y 1241 (en un
grado distinto) bloquean el reconocimiento epitópico. Los péptidos
1235, 1238 y 1241 son inhibidores intensos, con una IC_{50} menor
que 0,5 \mug/ml, mientras que los péptidos 1236 y 1237 son
inhibidores (relativamente) débiles con una IC_{50} de más de
5 \mug/ml. El péptido 1239 es un inhibidor
intermediario con una IC_{50} de más de 0,5 \mug/ml.
La Tabla 2 resume brevemente la capacidad
inhibitoria de los mimotopos incluidos en las bibliotecas y
obtenidos a partir de las mismas (tal como se describen):
Los resultados que se presentan en las figuras 4
y 5 muestran que además de varios péptidos hexaméricos (tal como se
muestra aquí y anteriormente), pueden utilizarse péptidos
5-mer (principalmente el péptido 1238, DKELR) y
péptidos 7-mer (principalmente el péptido 1241,
DWEFRDA) como epítopos en una vacuna Alzheimer basada en
mimotopos.
Claims (9)
1. Utilización de un compuesto, constituido
por
- -
- un péptido de 5 a 15 aminoácidos que incluye una secuencia aminoácida, seleccionada de entre el grupo constituido por DKELRI, DWELRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT y DKELR, conteniendo dicho péptido un residuo adicional de cisteína en el extremo C y
- -
- un soporte proteico acoplado mediante dicho residuo de cisteína a dicho péptido,
para la preparación de una vacuna destinada a la
enfermedad de Alzheimer (AD).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicho péptido tiene una longitud
comprendida entre 6 y 12 aminoácidos.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque el soporte proteico es KLH.
4. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la vacuna
comprende además hidróxido de aluminio.
5. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la vacuna
contiene el compuesto en una cantidad comprendida entre 0,1 ng y 10
mg.
6. Vacuna contra la enfermedad de Alzheimer que
comprende un compuesto constituido por
- -
- un péptido de 5 a 15 aminoácidos que incluye una secuencia aminoácida, seleccionada de entre el grupo constituido por DKELRI, DWELRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, DRELRI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT y DKELR, conteniendo dicho péptido un residuo adicional de cisteína en el extremo C y
- -
- un soporte proteico acoplado mediante dicho residuo de cisteína a dicho péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Vacuna según la reivindicación 6,
caracterizada porque el soporte proteico es KLH.
8. Vacuna según la reivindicación 6 ó 7,
caracterizada porque comprende además hidróxido de
aluminio.
9. Vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque contiene el
compuesto en una cantidad comprendida entre 0,1 ng y 10 mg.
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