PT1425042E - Inibidores de via complementar que se ligam a c5a sem impedir a formação de c5b - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

INIBIDORES DE VIA COMPLEMENTAR QUE SE LIGAM A C5 E C5A SEM IMPEDIR A FORMAÇÃO DE C5B

REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório U.S., N° 60/313,137 depositado a 17 de Agosto de 2001.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a inibidores de inflamação que ligam o complemento C5 e C5a sem inibirem a formação de complexos de ataque de formação (MAC) C5b e C5b-9.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O sistema complementar desempenha um papel central na eliminação dos complexos imunológicos e em respostas imunes a agentes infecciosos, antigénio exterior, células infectadas com virus e células tumorais. No entanto, a activação inapropriada ou excessiva do sistema complementar pode levar a consequências prejudiciais e até potencialmente à morte devido a inflamação severa e a resultante destruição do tecido. Estas consequências manifestam-se clinicamente em várias doenças incluindo o choque séptico, lesão isquemia/reperfusão intestinal bem como do miocárdio, rejeição de enxerto, falha de órgão, nefrites, inflamação patológica e doenças auto imunes. Septicemia, por exemplo, é a maior causa de mortalidade resultando em mais de 200,00 mortes por ano somente nos Estados Unidos da América. Apesar 1 dos grandes avanços no passado e diversos anos no tratamento de infecções sérias, a incidência e mortalidade de septicemia continua a aumentar. Assim sendo, a inibição de activação excessiva ou incontrolada da disseminação complementar pode proporcionar benefícios clínicos a pacientes com tais doenças e condições. 0 sistema complementar é composto por um grupo de proteínas que se encontram presentes no soro num estado inactivo. A activação do sistema complementar abrange principalmente duas vias distintas, designadas as vias clássica e a alternativa (V.M. Holers, in Clinicai Immunology, Principies and Practice, ed R.R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391). A via clássica é uma cascata de cálcio/magnésio dependente, que é normalmente activada pela formação de complexos antigénio-anticorpo. Pode também ser activado de um modo de anticorpo-independente pela aglutinação da proteína C-reactiva, complexada com ligante e por muitos patogénicos incluindo bactéria Gram-negativa. A via alternativa é uma cascata de magnésio-depenedente que é activada através da deposição e activação de C3 em certas superfícies susceptíveis (e.g. polissacarídeos de parede celular de levedura e bactéria e certos materiais biopolímeros).

Estudos recentes mostraram que complemento pode também ser activado através da via lectina, que envolve o aglutinamento inicial de lectina de manose de aglutinamento e a subsequente activação de C2 e C4, o que é comum para a via clássica (Matsushita, M et al., J. Exp, Med, 176: 1497-1502 (1992); Suankratay, C. et al., J. Immunol 160: 3006-3013 (1998)): Evidências acumuladas indicam que a via alternativa participa 2 na amplificação da actividade quer da via clássica e a via lectina (Suankratay, C., ibid; Farries, T.C. et ai., Mol. Iimmunol 27: 1155-1161 (1990)) . Activação da via complementar gera fragmentos biologicamente activos e de proteínas complementares, e.g. anafilatoxinas C3a, C4a e C5a e complexos de ataque de formação (MAC), que avaliava as respostas inflamatórias através do envolvimento de quimiotaxia de leucócitos, activação de macrófagos, neutrófilos, plaquetas sanguíneas, mastócitos e células endoteliais, aumento de permeabilidade vascular, citólise e lesão de tecido. O complemento C5a é um doa mais potentes mediadores pró inflamatórios do sistema complementar. O C5a é a forma activada de C5 . Complemento C5 (190 kD, peso molecular) esta presente no soro humano em aproximadamente 80 pg/ml (Kohler, P.F. et al., J. Immunol. 99: 1211-1216 (1967)). É composto de duas cadeias de polipeptídeo, α e β, com pesos moleculares aproximados de 115 kD e 75 kD, respectivamente (Tack, B.F. et al., Biochemistry 18: 1490-1497 (1979)). Biosynthesized como uma cadeia única de pró molécula, C5 é enzimaticamente clivada numa estrutura de cadeia dupla durante processamento e segregação. Após clivagem, as duas cadeias são incluídas conjuntamente por pelo menos uma ligação de dissulfeto bem como interacções não covalentes (Ooi, Y.M. et al., J. Immunol. 124: 2494-2498 (1980)).

Estruturas primárias de aminoácido do C5 humano e murino foram obtidos do ADNc sequenciação de dados (Wetsel, R.A. et al., Biochemistry 27: 1474-1482 (1988); Haviland, D.L. et al., J. Immunol. 146: 362-368 (1991); Wetsel, R.A. et al, 3

Biochemistry 26: 737-743 (1987)). As sequências deduzidas de aminoácido do precursor humano pré-pro-C5 têm 1676 aminoácidos. As cadeias α e ο β de C5 maduro têm 999 e 655 aminoácidos, respectivamente. C5 é glicosilado na cadeia C5 a, em particular a asparagina no resíduo 64. C5 é clivado em fragmentos C5a e C5b durante a activação das vias complementares.

As enzimas convertase são responsáveis pela activação de C5 são complexos multi-subunidade de C4b, C2a e C3b para a via clássica e de (C3b)2, Bb e P para a via alternativa (Goldlust, M.B. et al., J. Immunol. 113:998-1007 (1974); Schreiber, R.D. et al, Proc. Natl. Acad. Sei. 75: 3948-3952 (1978)). C5 é activado por clivagem na posição 74-75 (Arg-Leu) na cadeia-a. Após activação, o 11.2 kD, o péptido aminoácido 74 C5a da porção de amino-terminus da cadeia-α é libertada. Este péptido C5a partilha propriedades de anafilatoxinasimilares às exibidas por C3a, mas é 100 vezes mais potente, numa base molar, ao desencadear respostas inflamatórias. Quer C5a quer C3a são simuladores potentes de neutrófilos e monócitos (Schindler, R. et al., BI ood 76: 1631- 1638 (1990); Haeffner- Cavaillon, N. et al., J. Immunol. 138: 794-700 (1987); Cavaillon, J.M. et al., Eur. J. Immunol . 20: 253-257 (1990)) .

Além disso, o receptor C3a foi recentemente mostrado ser importante para protecção contra choque induzido de endotoxina num rato de laboratório (Kildsgaard, J. et al., J. Immunol. 165: 5406-5409 (2000)).

Em adição às suas propriedades de anafilatoxina, C5a induz migração quimiotáctica de neutrófilos (Ward, P.A. et al., J. 4

Immunol. 102: 93-99 (1969)), eosinófilo (Kay, A.B. et al., Immunol. 24: 969-976 (1973)), basófilos (Lett-Brown, M.A. et al., J. Immunol. 117: 246-252 1976)), e monócitos (Snyderman, R. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 138: 387-390 1971)). A actividade de C5a é regulada pela enzima carboxipeptidase de plasma N (E.C. 3.4.12.7) que remove a arginina carboxterminal do C5a formando o C5a des Arg derivativo (Goetzl, E.J. et al., J. Clin. Invest. 53: 591-599 (1974)). Numa base molar C5 humano des Arg exibe apenas 1% da actividade anafilática (Gerard, C. et al., Proc.Natl. Acad. Sei. 78: 1833-1837 (1981)) e actividade polimorfonuclear quimiotáctica como C5a não modificado (Chenoweth, D.E. et al., Mol. Immunol. 17: 151-161 (1980)). Quer C5a e quer C5b-9 activam células endoteliais para expressarem moléculas de adesão essenciais para sequestração de leucócitos que medem a inflamação de tecido e lesões (Foreman, K. E. et al., J. Clin. Invest. 94: 1147-1155 (1994); Foreman, K.E. et al., Inflammation 20: 1-9 (1996); Rollins, S.A. et al., Transplantation 69: 1959-1967 (2000)). C5 pode também mediar, reacções inflamatórias causando ligeira contracção muscular, aumentando permeabilidade vascular, induzindo basófilo e degranulação de célula mastro e indução de libertação de proteases lisossomas e radicais de libertação oxidativos (Gerard, C. et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 775-808 (1994)). Além disso, C5a modula a expressão de gene de fase critica hepática e aumenta totalmente a resposta imune aumentando a produção de TNFa, IL-lβ, IL-6 e IL-8 (Lambris, J.D. et al., In: The Human Complement System in Health e Disease, Volanakis, J.E. ed.. Mareei Dekker, New York, pp. 83-118). 5 O receptor humano C5a (C5aR) foi clonado (Gerard, N.P. et al., Nature 349: 614-617 (1991); Boulay, F. et al.,

Biochemistry 30: 2993-2999 (1991)). Pertence a uma classificação sete-transmembrana-dominio, G receptores de proteína acoplada. C5aR é expressado em células neutrófilas, monócitas, basófilas, eosinofilas, hepatocitas, músculo suave do pulmão e endoteliais e tecidos glomerulares (Van-Epps, D.E. et al., J. Immunol. 132: 2862-2867 (1984); Haviland, D.L. et al., J. Immunol. 154:1861-1869 (1995); Wetsel, R.A.,

Immunol. Lett. 44: 183-187 (1995); Buchner, R.R. et al., J. Immunol. 155: 308-315 (1995); Chenoweth, D.E. et al., Proc.

Natl. Acad. Sei. 75: 3943-3947 (1978); Zwimer, J. et al.,

Mol. Immunol. 36:877-884 (1999)). Local de ligação agregativo de C5aR é complexo e consiste em pelo menos dois domínios de agregação separáveis. Um agrega o amino término C5a (aminoácidos 1-20) e o núcleo de ligação dissulfureto (aminoácidos 21-61) enquanto o segundo agrega a extremidade do ácido-carboxílico terminal C5a (aminoácidos 62-74) (Wetsel, R.A., Cuff. Opin. Immunol. 7: 48-53 (1995)). C5a desempenha papéis importantes em lesões de tecidos e inflamações. Em bypass cardiopulmonar e hemodiálise C5a é formado como resultado da activação da via complementar alternativa quando o sangue humano contacta com a superficie artificial da máquina coração-pulmão ou máquina de diálise kidney (Howard, R.J. et al, . Arch. Surg. 123: 1496-1501 (1988); Kirklin, J.K. et al., J. Cardiovasc. Surg. 86: 845-857 (1983); Craddock, P.R. et al., N. Engl. J. Med. 2 96: 7 69- 774 (1977)). C5a provoca o aumento de permeabilidade capilar e edema, Bronco constrição, contracção do vaso pulmonar, leucócitos e activação de plaqueta e infiltração nos tecidos. 6 em particular os pulmões (Czermak, B.J. et al. , J. Leukoc. Biol. 64: 40-48 (1998)). A administração de um anticorpo monoclonal anti-C5a foi exibida para reduzir o bypass cardipulmonar e a disfunção endotelial coronária de cardioplegia-induzida (Tofukuji, M. et al., J. Thorac.

Cardiovasc. Surgr. 116: 1060-1068 (1998)). C5a encontra-se também envolvido no síndroma de agonia respiratória aguda (RDS) e falha de múltiplos órgãos (MOF) (Hack, C.E. et al., Am. J. Med. 1989: 86: 20-26;

Hammerschmidt DE et al. Lancet 1980; 1: 947-949; Heideman M. et al. J. Trauma 1984; 4: 1038-1043). O C5a aumenta a produção de monócito de duas importantes citocinas pró-inflamatórias, TNFa e IL-1. O C5 foi também exibido para desempenhar um papel importante no desenvolvimento de lesões de tecido e em particular lesões pulmonares em animais de laboratório de choque séptico. (Smedegard G et al. Am. J. Pathol. 1989; 135: 489-497). Em modelos de infecções usando ratos, porcos e primatas não humanos, os anticorpos anti C5a administrados aos animais antes do tratamento com emdotoxina ou E. coli o que resultou num decréscimo de tecidos danificados, bem como um decréscimo de produção de IL-6 (Smedegard, G. et al., Am. J. Pathol. 135: 489-497 (1989); Hopken, U. et al., Eur. J.

Immunol. 26: 1103-1109 (1996); Stevens, J.H. et al., J. Clin. Invest. 77 : 1812-1816 (1986)) . Ainda mais importante, o bloqueio de C5a com anticorpos policlonais anti-C5a foi exibido para provar de um modo significativo as taxas de sobrevivência num modelo de ligação/perfurada cecal de sépsis em ratos (Czermak, B.J. et al., Nat. Med. 5: 788-792 (1999)). Este modelo partilha muitos aspectos da manifestação clínica de sépsis em humanos. (Parker, S.J. et al., Sr. J. Surg. 88: 7 22-30 (2001)). No mesmo modelo de sépsis, anticorpos anti-C5a foram exibidos para inibirem apoptose de timocitos (Guo, R.F. et al., J. Clin. Invest. 106: 1271-1280 2000)) e previne MOF (Huber-Lang, M. et al. , J. Immunol. 166: 1193-1199 (2001)). Os anticorpos anti-C5a foram também protegidos num modelo factor veneno de cobra de lesões de pulmão em ratos e em lesões do pulmão complexo-induzido imune (Mulligan, M.S. et al. J. Clin. Invest. 98: 503-512 (1996)). A importância de C5a em lesões de pulmão complexo-mediado imuno foi mais tarde confirmada em ratos (Bozic, C.R. et al., Science 2 6: 1103-1109 (1996)). O C5a é fornecido para ser um mediador importante nas lesões de isquemia-reperfusão. Depleção complementar reduziu o tamanho do enfarte em ratos (Weisman, H.F. et al., Science 249: 146-151 (1990))), e tratamento com anticorpos anti-C5a reduziu lesões num rato de laboratório de isquemia-reperfusão de membro traseiro (Bless, N.M. et al.. Am. J. Physiol. 276: L57-L63 (1999)). Lesão reperfusão durante enfarte do miocárdio foi também marcadamente reduzido em porcos que foram tratados com uma IgG monoclonal anti-C5a (Amsterdam, E.A. et al. , Am. J. Physiol. 268 :H448-H457 1995)). Um antagonista C5aR humano recombinante reduz o tamanho do enfarte num suíno de laboratório de revascularização cirúrgica (Riley, R.D. et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 120: 350-358 (2000)). Níveis complementares são elevados em pacientes com artrites reumatóides e lúpus eritematoso sistémico. Os níveis de C5 correlacionam-se com a severidade do estado da doença (Jose, P.J. et al., Ann. Rheum. Dis. 49: 747-752 (1989); Porcel, 8 J.M. et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 74: 283-288 (1995)). Assim sendo, a inibição de C5a e/ou receptor C5a (C5aR) poderá ser útil no tratamento destas doenças crónicas. A expressão de C5aR é regulada em astrócitos reactivos, microglia e células endoteliais num sistema nervoso central humano inflamado (Gasque, P. et al., Am. J. Pathol. 150: 31-41 (1997)). C5a poderá estar envolvido em doenças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer (Mukherjee, P. et al., J. Neuroimmunol. 105: 124-130 (2000)). A Activação de C5aR neuronal pderá induzir apoptose (Farkas I et al. J. Physiol. 1998; 507: 679-687). Assim sendo, inibição de C5a e/ou C5aR poderá também ser útil no tratamento de doenças neurodegenerativas.

Psoriase é agora conhecida como sendo uma doença mediada por células T (Gottlieb, E.L. et al., Nat. Med. 1 : 4 42-447 (1995)). No entanto, neutrófilo e células mestras podem também ser envolvidas na origem da doença (Terui, T. et al., Exp. Dermatol. 9: 1-10; 2000); Werfel, T. et al., Arch. Dermatol. Res. 289: 83-86 (1997)). Níveis elevados de des Arg C5a encontram-se em escalas psoriáticas, que indicam que a activação está envolvida. Células T e neutrófilos são quimo-atraidos por C5a (Nataf, S. et al., J. Immunol. 162: 4018-4023 (1999); Tsuji, R.F. et al., J. Immunol. 165: 1588-1598 (2000); Cavaillon, J.M. et al., Eur. J. Immunol. 20: 253-257 (1990)) . Assim sendo o C5a poderá ser um alvo terapêutico importante para o tratamento de psoriase.

Imunoglobulina G contendo complexos imunes (IC) contribui para a patofisiologia num número de doenças auto-imunes, tais 9 como lúpus eritematoso sistémico, artrites reumatóides, sindroma de Goodpasture e alveolite alérgica extrínseca (Madaio, M.P., Semin. Nephrol. 19: 48-56 (1999); Korganow, A.S. et al., Immunity 10: 451-459 (1999); Bolten, W.K., Kidney Int. 50: 1754-1760 (1996); Ando, M. et al., Curr. Opin. Pulm. Med. 3: 391-399 (1997)). O clássico animal modelo para a resposta inflamatória nestas doenças IC é a reacção Arthus, que caracteriza a infiltração de células polimorfonucleares, hemorragia e exsudação de plasma (Arthus, M., C.R. Soc. Biol. 55: 817-824 (1903)). Estudos recentes mostram que um rato deficiente C5aR é protegido de lesões no tecido induzidas IC (Kohl, J. et al., Mol. Immunol. 36: 893-903 (1999); Baumann, U. et al. , J. Immunol. 164: 1065-1070 (2000)). Os resultados são consistentes com a observação que um pequeno antagonista anti-C5aR péptido inibe a resposta inflamatória causada pela deposição de IC (Strachan, A.J. et al., J. Immunol. 164: 6560-6565 (2000)). Conjuntamente com o seu receptor, C5a desempenha um papel importante na patógenese de doenças IC. Inibidores de C5a e C5aR podem ser úteis para tratar estas doenças. A WO01/15731A1 discute composições e métodos de tratamento de sépsis através do uso de anticorpos para C5a. Estes anticorpos reagem apenas com a região N-terminal do péptido C5a não se cruza com C5. A W086/05692 discute o tratamento do sindroma de agonia respiratória em adulto (ARDS) com um anticorpo especifico para C5a ou o derivado des Arg. Descreve também o tratamento de sépsis através da administração deste anticorpo. Este anticorpo foi produzido em resposta ao derivado dês Arg C5a 10 porque é mais imunogénico, mas irá extrair anticorpos de reacção cruzada com C5a. A Patente U.S. N° 5,853,722 discute os anticorpos anti-C5 que bloqueiam a activação de C5 e assim, a formação de C5a e C5b. A Patente U.S. N° 6,074,642 discute o uso de anticorpos anti-C5 para tratar glomerulonefrite. Estes anticorpos bloqueiam também a criação de C5a e C5b, inibindo o efeito quer de C5a quer a formação de C5b-9. A Patente U.S. N° 5,562.904 discute os anticorpos anti-C5 que bloqueiam completamente a formação de MAC.

Noutras discussões de anticorpos anti-C5, os anticorpos descrevem a activação de bloqueio de C5 e a sua clivagem para formar C5a e C5b (Vakeva, A.P. et al., Circulation 97:2259-2267 (1998); Thomas, T.C. et al., Mol. Immunol. 33: 1389-1401 (1996); Wang, Y. et al., Proc Natl Acad Sei. 93:85 63-8568 (1996); Kroshus, T. et al., Transplantation 60: 1194-1202 (1995); Frei, Y. et al., Mol. Cell Probes 1:141-149 (1987)).

Reacção cruzada de anticorpos monoclonais com des Arg C5, C5a ou C5a foram reportados (Schulze, M. et al., Complement 3: 25-39 (1986); Takeda, J. et al., J. Immunol. Meth. 101: 265-270 (1987); Inoue, K., Complement Inflamm. 6: 219-222 (1989). Foi também reportada a reacção cruzada de anticorpos monoclonais com C5 e C5a inibido C5a-mediado ATP liberta do porquinho-da-india plaquetas (Klos, A. et al., J. Immunol. Meth. 111: 241-252 (1988); Oppermann, M. et al., Complement Inflamm. 8: 13-24 (1991)).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO 11 A activação de C5 normalmente resulta em clivagem de C5 para C5a e C5b. As moléculas de inibição da presente invenção ligam a C5 e C5a com uma elevada afinidade, não inibe a activação de C5 e não evita a formação ou a inibição de actividade de C5b. Um exemplo de tal inibidor é o anticorpo monoclonal designado MAb 137-26, que liga a um epitopo partilhado no C5 e C5a humano. 0 hibridoma que produz o anticorpo monoclonal 137-26 foi depositado na Coleção de Cultura do tipo Americano, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, sob o Acesso N° PTA-3650 a 17 de Agosto de 2001.

As moléculas inibidoras da invenção incluem também: (i) outros anticorpos ou fragmentos, péptidos, Oligonucleotideos ou peptidomiméticos que ligam a C5 e C5a com uma elevada afinidade, mas não inibem a activação de C5 e não evitam a formação ou inibição da actividade de C5b ou (ii) de qualquer anticorpo ligar ao mesmo epitopo como os anticorpos monoclonais 137-26. Fragmentos de anticorpos incluem Fab, F(ab')2, Fv ou uma única cadeia Fv e anticorpos monoclonais e fragmentos da invenção incluindo quimérico Delmmunized™, humanizada ou anticorpos humanos e fragmentos e outras formas aceitáveis para uso humano. As moléculas inibidoras da invenção são úteis para o tratamento de doenças e condições envolvendo produção excessiva ou incontrolada de C5a ou para uso em diagnostico na detecção da presença de, ou quantificação, C5a.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS 12 A Fig. 1 mostra a ligação de MAb 137-26 (anti-C5a, quadrados fechados) e MAb 137-76 (anti-C5 cadeia-β, círculos abertos) para C5a humano purificado em ELISA. Um anticorpo monoclonal irrelevante de isótipo condizente era usado como controlo negativo. 0 eixo Y representa a reactividade dos MAbs com C5a expresso como densidade óptica (OD) a 450 nm e o eixo X representa a concentração das MAbs. MAb 137-26 reage com C5a humano, enquanto que MAb 137-26 e o anticorpo de controlo irrelevante não. A Fig. 2 mostra a ligação de MAb 137-26 (quadrados fechados) e MAb 137-76 (círculos abertos) a C5 humano purificado em ELISA. Um anticorpo monoclonal irrelevante de isótipo condizente foi usado como controlo negativo. O eixo Y representa a reactividade dos MAbs com C5 expresso com densidade óptica (OD) a 450 nm e o eixo X representa a concentração dos anticorpos monoclonais. Tanto o MAb 137-26 como o MAb 137-7 6 reagem com C5 humano, enquanto que o anticorpo irrelevante não. A Fig. 3 mostra a inabilidade de anti-C5a MAb 137-26 para inibir hemólise complemento-mediado de células de sangue vermelho de galinha sensibilizada através da via clássica (CP.) O MAb anti-C2 175-62 efectivamente inibiu a hemólise. Um anticorpo monoclonal irrelevante isotype-matched não teve efeito. O eixo Y representa a percentagem de inibição de hemólise, tal como descrito no texto. O eixo X representa a concentração de anticorpos monoclonais. A Fig. 4 mostra a inabilidade de MAb anti-C5 137-26 para inibir hemólise complemento-mediado das células sanguíneas 13 vermelhas de coelho através da via alternativa (AP). 0 anti-factor D MAb 166-32 efectivamente inibiu a hemólise. Um anticorpo monoclonal irrelevante isotype-matched não teve efeito. 0 eixo Y representa a inibição de percentagem de hemólise, tal como descrito no texto. 0 eixo X representa a concentração de anticorpos monoclonais. A Fig. 5 mostra a inibição da ligação de radioiododado (1251) — C5a humano para neutrófilos humano purificado. 0 controlo positivo, C5a recombinante humano purificado (rHuC5a), inibiu a ligação. Um anticorpo monoclonal irrelevante de isótipo condizente não teve qualquer efeito. 0 eixo Y representa a inibição de percentagem de ligação de 125I-C5a, tal como descrito no texto. 0 eixo X representa a concentração dos agentes de competição. A Fig. 6 mostra o epitopo de ligação de MAb 137-26 em C5a humano mapeado por péptidos sintéticos de sobreposição em membrana de celulose. A Fig. 7A mostra expressão CDllb em neutrófilos humanos estimulados por E. Coll opsonizar um modelo de sangue inteiro anti-coagulado lepirudin. O Anti-C5/C5a MAb 137-26 (círculos fechados) inibiu a expressão CDllb mais efectivamente que o anti-C5a MAb561 (Dr. Jurg Kohl, quadrados fechados) e anti-C5 MAbl37-30 (triângulos fechados). 0 último anticorpo inibiu activação de C5. O MAb irrelevante (triângulos invertidos fechados) não tiveram nenhum efeito. 0 eixo Y representa meio de intensidade de fluorescência (MFI) medido por imunofluorcimetria. 0 eixo Y representa a concentração dos anticorpos (pg/ml) T-0 = a amostra de sangue inteiro como 14 referência ao tempo de 0 minutos. T-10 = ao sangue inteiro incubado apenas com PBS para 10 minutos sem E. coli. Outras amostras, com o sem inibidores, tinham E. Coli adicionado. A Fig. 7B mostra a expressão CDllb nos neutrófilos humanos estimulados por opsonizar E. coli num modelo de sangue inteiro anti-coagulado lepirudin. O Anti-C5/C5a MAb 137-26 (círculos fechados) inibiu a expressão CDllb de um modo mais efectivo que um antagonista C5aR peptidico (Dr. Stephen Taylor) quadrados fechados). O péptido irrelevante não teve efeito (triângulos invertidos fechados) O eixo Y representa a concentração dos anticorpos/péptido (pg/ml). T-0 - referência de amostra de sangue inteiro ao tempo de 0 minutos. T-10 = sangue inteiro incuba apenas com PBS durante 10 minutos sem E. coli. Outras amostras, com ou sem inibidores, têm E. coli adicionado. A A Fig. 7C mostra eclosão oxidativa de neutrófilos humanos estimulados opsonizar E. coli num modelo de sangue inteiro anti-coagulado lepirudin. Tanto o Anti-C5/C5a MAb 137-26 (círculos fechados) como o abti-C5 MAbl37-30 (triângulos fechados) inibiu a eclosão oxidativa de um modo muito mais efectivo que o anti-C5a MAb561 (quadrados fechados). O anticorpo irrelevante (triângulos invertidos fechados) não teve efeito. O eixo Y representa meios de intensidade de fluorescência (MFI) medidos por imunofluorcimetria. O eixo X representa a concentração de anticorpos (pg/ml). T-0 = referência amostra de sangue inteiro ao tempo de 0 minutos. T-10 = sangue inteiro incubado apenas com PBS durante 10 minutos sem E. coli. Outras amostras, com ou sem inibidores, têm E. coli adicionado. 15 A Fig. 7D mostra eclosão oxidativa de neutrófilos humanos estimulados por opsonizar E. coli num modelo de sangue inteiro anti-coagulado lepirudin. 0 anti-C5/C5a MAb 137-2foi muito mais muito mais efectivo que um antagonista (quadrado fechado) na inibição de eclosão oxidativa. 0 péptido irrelevante não teve efeito. 0 eixo Y representa meios de intensidade de fluorescência (MFI) medidos por imunofluorcimetria. 0 eixo X representa a concentração de anticorpos em nM. T-0 = referência amostra de sangue inteiro ao tempo de 0 minutos. T-10 = sangue inteiro incubado apenas com PBS durante 10 minutos sem E. coli. Outras amostras, com ou sem inibidores, têm E. coli adicionado. A Fig. 8 mostra a matança mediada-MAC de Neísseria meningitides num modelo de sangue inteiro anti-coagulado lepirudin. A bactéria foi efectivamente morta pela incubação com sangue total humano na presença de anti-C5/C5a MAbl37-26 (círculos fechados), de um MAb irrelevante (triângulos fechados) ou PBS (quadrados abertos). Em contraste, a bactéria não foi morta quando o sangue total não foi tratado com anti-C5 MAbl37-30 (diamantes abertos) que inibe a activação de C5 e assim a formação de MAC. O eixo-Y representa colonia a formar unidades (CFU) por 100 μΐ de sangue total durante 24 horas a 37°C ágar do sangue. O eixo-X representa diferentes pontos de tempo da colecção de amostras de sangue de toda a experiência da cultura de sangue total.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Vantagens da Invenção 16

Os inibidores da invenção, incluindo anticorpos monoclonais MAbl3 7-26, são vantajosos sobre os conhecidos inibidores de anticorpos monoclonais para o tratamento de inflamação complemento-mediada e danos de tecidos. 0 MAb 137-26 é capaz de ligar a C5 antes de estar activado. Após C5 estar activado para formar C5a, o anticorpo consegue neutralizar C5a que é uma anafilatoxina. Normalmente, uma vez o C5 formado, rapidamente liga ao C5aR nas células, fazendo assim com que desencadeie a cascata de transdução de sinal levando à inflamação. 0 MAbl37-26 não inibe a clivagem de C5 para formar C5 e C5b, mas C5a mantém-se ligado a MAbl37-26 após ser produzido e inibe a ligação de C5a a C5aR. A formação de C5b-9, no entanto, não é afectada, e, na medida em que C5b-9 é necessário para a formação de MAC, que está envolvido na matança da bactéria, a manutenção da produção de C5b-9 é importante para uma resposta imunitária protectora. MAb 137-26 consegue efectivamente neutralizar os efeitos inflamatórios de C5a, mas continua a permitir que outros componentes da cascada complementar, incluindo C3 e C5b-9 mediar funções antibacteriais. Esta propriedade farmacológica é excepcionalmente importante em relação ao tratamento da bactéria sépsis, doenças crónicas IC e psoriases.

Criação e uso da Invenção A. Anticorpos Monoclonais

Anticorpos Monoclonais podem fazer uso do método hibridoma primeiramente descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 17 (1975) ou pode ser feito pela recombinação de métodos de ADN (Pat. U.S. N° 4,816,567).

No método hibridoma, um ratos ou um outro animal hospedeiro apropriado é imunizado tal como descrito abaixo para extrair linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que irão especificamente ligar à proteína usada para a imunização. Animais podem também ser imunizados com ADN construídos para expressar as proteínas codificadas in vivo para induzir anticorpos específicos. De um modo alternativo, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Linfócitos são então fundidos com células mieloma que usam um agente de fusão adequado, tal como glicol polietileno, para formar uma célula hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

As células hibridoma assim preparadas são plantadas e desenvolvem-se num meio de cultura adequado que de preferência contem uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células mieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parental carecerem de hipoxantina guanina-fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT) o meio de cultura para as hibridomas tipicamente irão incluir hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT) tais substâncias evitam o crescimento de células HGPRT-deficientes.

As células de mieloma preferidas são as que fundem de um modo eficiente, suportam uma produção elevada estável de anticorpos pelas células seleccionadas de produção de anticorpos e são sensíveis a um meio tal como o meio HAT. 18

Entre estas linhagens de células mielomas, tais como as derivadas de MOPC-21 e MPC-11 tumores de ratos disponibilizados pelo instituto Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, EUA, e SP2/0 ou x63-Ag8-653 células disponibilizadas pelo American Type Culture Collection, Rockville, Md. EUA. Mieloma humano e linhagens de células heteromieloma rato-humano foram descritos para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987)). A linhagem de células de myeloma de rato NSO pode também ser usada ((European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire UK) .

Meio de cultura em que as células de hibridoma são desenvolvidas é ensaiado para a produção de anticorpos monoclonais direccionados contra o antigénio. A especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células hibridomas pode ser determinado por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA).

Após as células hibridomas que produzem anticorpos da especificidade desejadas estarem identificadas, afinidade, e/ou actividade, os clones podem ser subclonados através da limitação de procedimentos de diluição e desenvolvimento através dos métodos Standard (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para este propósito incluem por 19 adição, as células exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Em hibridomas podem desenvolver-se en vivo como tumores asciticos em animais.

Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequados separados do meio de cultura, fluidos asciticos ou soro através dos procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina tais como, por exemplo, proteína A-sefarose, cromatografia hidroxipatite, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade. A codificação de ADN de anticorpos monoclonais é de imediato isolada e sequenciada usando os procedimentos convencionais ( (Innis M. et ai. In PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic, San Diego, CA (1990), Sanger, F.S, et al. Proc. Nat. Acad Sei. 74:5463-5467 (1977)). As células hibridomas servem como uma fonte de tal AND. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são depois transfectados para células hospedeiras tais como células E. coli, células COS de símios, células de ovários de hamster chinês (CHO), ou células mieloma que de outra maneira não produzem proteínas de imunoglobulina para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Produção recombinante de anticorpos será descrita de um modo mais detalhado abaixo.

Numa outra forma de realização, fragmentos de anticorpo ou anticorpos podem ser isolados da colecções de fago anticorpo gerado usando as técnicas descritas em McCafferty, et al., Nature 348:552-554 (1990). Clackson, et al., Nature 352:624- 628 (1991) and Marks, et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 20 (1991) descreve o isolamento de anticorpos humano e rato, respectivamente, usando as colecções de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de elevada afinidade (nM range) através da mistura de cadeia (Marks, et al., Bio! Technology 10:779-783 (1992)), bem como uma infecção combinatória e recombinação in vivo como estratégia para construir grandes colecções de fagos (Waterhouse, et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Assim, estas técnicas são vias alternativas às técnicas de hibridoma de anticorpos monoclonais tradicionais para isolamento de anticorpos monoclonais. O ADN pode também ser modificado, por exemplo, através da substituição da sequência do código por domínios constantes de cadeia leve e pesada humanos ao invés das sequências murinas homologas (U.S. Pat. No. 4,816,567; Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 81:6851 (1984)), ou juntando de modo covalente à sequencia de código de imunoglobulina toda ou parte da sequencia de código para um polipeptídeo não imunoglobulinado.

Tipicamente, tais polipeptídeos não imunoglobulinados são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo ou são substituídos pelos domínios variáveis de um sítio de combinação-antigénio de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo um sitio de combinação antigénio que tem especificidade para um antigénio e outro sitio de combinação de antigénio que tem especificidade para um antigénio diferente. 21

Outra alternativa é usar uma fusão eléctrica ao invés da fusão química para formar hibridomas. Esta técnica é bastante credível. Ao invés de fusão, um pode também transformar uma célula-B para a tornar imortal usando, por exemplo, vírus de Epstein-Barr ou um gene de transformação. (Ver, por exemplo, "Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity," Zurawaki, V. R. et al, in Monoclonal Antibodies, ed. by Kennett R. H. et al, Plenum Press,N.Y. 1980, pp 19-33.) B. Anticorpos Humanizados e Humanos

Um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos através de uma fonte que não humana. Estes resíduos de aminoácido não humanos são frequentemente referenciados como resíduos "de importação", que são tipicamente obtidos de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente levada a cabo segundo o método de Winter e dos colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen, et al., Science, 23 9:1534-153 6 (1988)), substituindo roedores CDRs ou sequências CDR para as sequências correspondentes de um anticorpo humano. De acordo, em tais anticorpos "humanizados", substancialmente menos que o domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente das espécies não humanas, na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos CDR e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores. 22 A escolha de domínios de variável humana, ambas, leves e pesadas, a ser usada na feitura de anticorpos humanizados é bastante importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método "melhor-adaptação", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é comparado a totalidade da colecção de sequências de domínios de variável humana conhecidas. A sequência humana que é muito próxima à da do roedor é então aceite como o sistema humano (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Ou outro método utiliza um sistema particular derivado da sequência consensual de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias pesadas ou leves. O mesmo sistema pode ser usado para diversos diferentes anticorpos humanizados (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)). É também importante que anticorpos humanos sejam humanizados com retenção de afinidade elevada para o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar este objectivo, de acordo com um método preferido, anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceptuais que usam modelos tridimensionais das sequências humanizadas e parentais. Modelos de imunoglobulina encontram-se comummente disponíveis e são familiares daqueles que são peritos na matéria. Programas de computador encontram-se disponíveis que ilustram e mostram estruturas adaptáveis tridimensionais prováveis de seleccionadas sequências de imunoglobulinas candidatas. A inspecção destas mostragens permite a análise do papel provável dos resíduos no 23 funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a habilidade da imunoglobulina candidata a ligar o seu antigénio. Deste modo, resíduos FR podem ser seleccionados e combinados do recipiente e importar sequências de modo a que a característica do anticorpo desejado, tal como a afinidade aumentada para o alvo antigénio (s), ser alcançado. Em geral, os resíduos CDR são directamente e acima de tudo substancialmente envolvidos na influencia do ligante antigénio.

De um modo alternativo, o investigador consegue produzir animais transgénicos (por exemplo, ratos) que são capazes, sob imunização, de produzir um repertório total de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena. Tais ratos transgénicos são disponibilizados pelos Abgenix, Inc., Fremont, Califórnia, and Medarex, Inc., Annandale, New Jersey. Foi descrito que a remoção de homozigótico do gen da região (JH) de junção de cadeia pesada de anticorpo em ratos mutantes de linha germinal chimerie resulta na completa inibição da produção de anticorpos endógenos. A transferência da matriz de gene de imunoglobulina de linha germinal em tais ratos mutantes de linha germinal irá resultar na produção de anticorpos humanos após alteração do antigénio. Ver e.g., Jakobovits et aL, Proc. atl. Acad. Sei. USA 90:2551 (1993), Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); and Duchosal et al. Nature 355:258 (1992) .

Anticorpos humanos podem também derivar das colecções (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Vaughan, et al.,

Nature Biotech 14:309 (1996)). C. Anticorpos Delmmunised™

Anticorpos Delmmunised™ são anticorpos em que o potencial dos epitopos de célula T foi eliminado, tal como descrito no Pedido de Patente Internacional PCT/GB98/01473. Assim sendo, a imunogenicidade em humanos é esperada para ser eliminada ou substancialmente reduzida quando eles são aplicados in vivo.

Adicionalmente, anticorpos podem ser quimicamente modificados através de conjugação covalente para um polimero para aumentar a sua semivida circulante, por exemplo. Polímeros preferidos e métodos para os agregar a péptidos, são mostrados nas Patentes dos EUA N°s 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; e 4.509,546. Polímeros preferidos são poliois polietilenoglicólicos e glicol polietileno (PEG). PEG é solúvel em água a temperatura ambiente e tem um peso molecular médio entre 1000 e 40,000, preferivelmente entre 2000 e 20,000, ainda mais preferível entre 3,000 e 12,000. D. Geração de Anti-C5/C5a MABs

Anticorpos da presente invenção podem ser gerados através das tradicionais técnicas de hibridoma bem conhecidas na técnica. Brevemente, os ratos são imunizados com C5 purificado de soro humano como um emulsionador imunogénico em adjuvante completo de Freund e injectado subcutaneamente ou intraperitoneamente em valores variáveis entre 10-100 pg. Entre dez a quinze dias mais tarde, os animais imunizados são estimulados com C5 25 adicional emulsionado em adjuvante incompleto de Freund. Os ratos são periodicamente estimulados depois disso numa calendarização de imunização entre uma a duas semanas.

Para cada fusão, suspensões de célula única foram preparadas a partir do baço de um rato imunizado e usado para fusão em células de mieloma SP2/0. As células SP2/0 (1 x 108) foram fundidas num meio contendo 50% de glicol polietileno (M.W. 1450 (Kodak, Rochester, NY) e 5% de dimetilsulfóxido (Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO). As células foram então ajustadas para uma concentração de 1.7 x 105 celulas/ml baço da suspensão no meio DMEM (Gibco, Grand Island, NY), suplementada com 5% de soro bovino fetal e HAT (10 mM de hipoxantina de sódio, 40 μΜ aminopterina e 1.6 mM timidina). Duzentos e cinquenta microlitros a suspensão de célula foram adicionados a cada cavidade cerca de cinquenta placas de microteste de cavidades. Após cerca dez dias sobrenadantes de cultura foram removidos para filtração para reactividade com humano purificado C5 através de ELISA.

Cavidades de placas de microteste de Immulon II (Dynatech Laboratoires, Chantilly, VA) foram revestidas durante a noite com C5 humano a 0.1 pg/ml (50 μΐ/cavidade) . Os sítios de ligação não específicos nas cavidades foram então saturados por incubação com 200 μΐ de 5% BLOTTO (leite seco não gordo) em tampão de salina de fosfato (PBS) durante uma hora. As cavidades foram então lavadas com tampões PBST (PBS contém 0.05% TWEEN®20) . Cinquenta microlitros de sobrenadante de cultura de cada fusão de cavidade foram adicionados à cavidade revestida conjuntamente com 50 μΐ de BLOTTO durante uma hora à temperatura ambiente. As cavidades foram lavadas 26 com PB ST. Os anticorpos de ligação foram então detectados pela reacção com peroxidase de rábano silvestre diluída (HRP) conjugado bode anti-rato IgG especifico Fc) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante uma hora à temperatura ambiente. As cavidades foram então lavadas com PBST. Solução de substrato de peroxidase contendo 0.1% 3,3,5,5, benzidina tetrametil (Sigma, St. Louis, MO) e 0.003% de peróxido de hidrogénio (Sigma, St. Louis, MO) em 0.1M de acetato de sódio pH 6.0 foi adicionado às cavidades para desenvolvimento de cor durante 30 minutos. A reacção foi concluída através da adição de 50 μΐ de 2M H2S04 por cavidade. A densidade óptica (OD) foi lida a 450 nm com um leitor de ELISA (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA).

Hibridomas em cavidades positivas para reactividade de C5 eram uma única célula clonada por um método de limite de diluição. Hibridomas monoclonais foram então expandidos e sobrenadantes culturas recolhidas para purificação através de cromatografia de proteína A. Os anticorpos purificados foram então caracterizados para reagirem como C5 e C5a humano através de ELISA, para determinação de afinidade e constantes ligações cinéticas através de BIAcore, para efeitos em hemólise de complemento-mediada via quer clássica que através de vias alternativas e para inibição de 125I-C5a ligar a neutrófilos de humano purificados.

Anticorpos podem também ser seleccionados através de "panning" uma colecção de scFv humano para aqueles que ligam C5 (Griffiths et. al., EMBOJ. 12:725-734 (1993)). A especificidade e actividade de clones específicos podem ser acedidos através do uso de ensaios conhecidos (Griffiths et. 27 al.; Clarkson et. al., Nature, 352: 642-648 (1991)). Após uma primeira etapa de "panning", um obtém uma colecção de fagos contendo uma pluralidade de anticorpos de cadeia única diferentes mostrados no fago tendo melhorado o ligante para C5. As subsequentes etapas de "panning" providenciam colecções adicionais com afinidades de ligação elevadas. Quando os problemas de avidez são um problema, um fago monovalente mostra mais do que uma cópia de um anticorpo na superfície do fago. Mostragem monovalente pode ser acompanhada com o uso de phagemid e fago de ajuda. Um fago adequado inclui M13 fl e fago filamentoso fd. Proteína de fusão que se mostra com as proteínas de revestimento de vírus é também conhecida e pode ser usada nesta invenção. MAbl37-2 6 que liga quer com C5 quer com C5a com afinidade comparável, foi também caracterizado. MAb 137-26 não inibe a activação de C5, mas inibe com elevada potência a ligação de C51 a C5aR em neutrófilos humanos purificados. Experiências que demonstraram estas propriedades são também explicadas nos Exemplos abaixo.

Para filtrar os anticorpos para anticorpos que ligam a um epítopo no antigénio de interesse (por exemplo, aqueles que bloqueiam a ligação de qualquer dos anticorpos escritos aqui para C5, um ensaio de bloqueamento transversal de rotina tal como o descrito nos Anticorpos, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988), podem ser levados a cabo. De um modo alternativo, mapeamento de epítopo, por exemplo, tal como descrito em Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995) pode ser levado a cabo para determinar se o anticorpo liga um epítopo de interesse. 28 E .

Feitura de Outros Inibidores da Invenção

Outras moléculas adequadas para o uso na invenção podem ser isoladas ou filtradas de colecções compostas através dos meios convencionais, por exemplo, através da determinação se eles ligam a C5/C5a e então efectuando uma filtração funcional para determinar se eles inibem a actividade de C5B. Um sistema automatizado para gerar e filtrar uma colecção composta é descrito nas patentes U.S. n°s 5,901,069 e 5,463,564. Abordagens mais incisivas envolvem uma filtração competitiva contra MAb 137-26 ou fazendo um modelo tridimensional do sitio de ligação e então fazer uma familia de moléculas, que se adequam ao modelo. Estes são então filtrados por aqueles com óptimas caracteristicas de ligação. Em adição. Outras moléculas podem ser identificadas por ensaios de competição ou uma filtração funcional para inibidores com as mesmas propriedades que MAbl37-26. F. Uso dos inibidores da Invenção

As moléculas da presente invenção podem ser administradas por qualquer número de vias e são administradas numa concentração que é terapeuticamente efectiva na indicação ou para o propósito pretendido. Para ir ao encontro deste objectivo, os anticorpos podem ser formulados usando uma variedade de excipientes aceitáveis conhecidos na técnica. Tipicamente, os anticorpos são administrados por injecção. Métodos para realizar esta administração são conhecidos daqueles dos procedimentos na técnica. Poderá também ser possível obter composições que podem ser administradas topicamente ou 29 oralmente, ou que podem ser capazes de transmissões através das membranas mucosas. A dosagem o modo de administração dependerá do individuo e do agente a ser administrado. A dosagem pode ser determinada por experimentação de rotina em rastreios clínicos ou extrapolação de modelos animais em que o anticorpo foi efectivo.

Os anticorpos da presente invenção podem ser usados no tratamento de doenças e condições mediadas por produção excessiva ou não controlada de C5a. As evidências da utilidade dos inibidores da invenção no tratamento destas doenças e condições é indicado abaixo.

Exemplo 1: Reactividade de MAbl37-26 com C5 e C5a humano MAb 13-26 foi testado para reactividade com C5 humano purificado e recombinante C5a (Sigma, St. Louis, MO) Os procedimentos de ELISA são descritos acima. MAb 137-26 ligam de um modo de dose dependente com elevada potência (Fig. 1) . Outro anti-C5 MAb 137-76, especifico para a cadeia-β de C5 humano não liga C5a, porque C5a reside na cadeia-α de C5. Um anticorpo irrelevante isotipo-condizente usado como um controlo negativo também não reage com C5a. Por outro lado, quer MAb 137-26 que 137-76 ligam a C5 (Fig. 2). 0 constante equilíbrio de afinidade e os constantes cinéticos de ligação (associação e não associação) de MAb 137-26 com C5a e C5 foram também determinados por um instrumento BIAcore (Pharmacia Biosensor AB Uppsala, Suécia) Todas as medidas de 30 ligação foram levadas a cabo em salino HEPES-tampão (HBS) (lOmM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% Agente tensioactivo P20= a 25°C. Para medir as constantes taxas de ligação de C5 e C5a para MAbl37-26, anticorpos de IgG(Fc) de coelho anti-rato foram imobilizados para um sensorchip CM5 por acoplamento de amina usando N-hidroxisucinimido e N-etilo-N'-(3-dietiloaminopropilo)cardodiemida. MAbl37-26 foi então capturado para o sensorchip revestido antes da injecção de C5 em diferentes concentrações. Os dados são sumarizados na Tabela 1. MAbl37-26 tem uma afinidade elevada para ambas as soluções-fase C%a e C5. Os resultados indicam também que MAbl37-26 liga a um epitopo partilhado por ambos C5a e C5.

Tabela 1 Constantes cinéticas de C5 e C5a Liga a MAbl37-26

Kon Koff KD (trV1) (S-1) (M) C5 1.42 x 10b 6.97 x 10~b 4.92 x 10“iU C5a 3.7 x 106 2.25 x 10“4 6.09 x 10^11

Kon, constante associação cinética K0ff, constante de não associação cinética KDi constante não associação de equilíbrio = Koff/Kon

Exemplo 2: Hemólise Complemento-Mediado

Para estudar os efeitos de MAb 137-26 da activação de C5 em soro humano, o antibiótico foi testado para a inibição de hemólise mediado pelas vias complementares alternativas e clássicas. 31

Para as experiências de via clássica, galinha RBCs (5 x 107 celulas/ml) em tampão salino gelatina/veronal (GVB++) contendo 0.5 mM MgCl2 e 0.15 mM CaCl2 foram sintetizados com imunoglobulinas RBC de coelho anti-galinha purificado a 8 pg/nl (Inter-Cell technologies, Hoperwell, NJ) durante 15 minutos a 4°C. As células foram então lavadas com GVB++. As células lavadas oram re-suspensas no mesmo tampão a 1.7 x 108 celulas/ml. Em cada cavidade de uma placa microteste 96-cavidade de parte inferior redonda, 50 μΐ de soro humano normal (5.2%) foi misturado com 50 μΐ de GVB++ de um MAnl37-26 seriamente diluído ou um anti-C2 MAb 175-62 como um controlo positivo. Então 30 μΐ da suspensão RBCs de galinha sintetizada lavada foi adicionada às cavidades contendo as misturas. Cinquenta microlitros de soro humano normal (5,2%) foram misturados com 80 μΐ de GVB++ para dar ao soro uma cor de fundo. Um isotipo-condizente anti-HIV-1 gp 120 MAb foi usado como controlo negativo. A concentração de soro humano final usado foi de 2%. A mistura foi incubada a 37°C durante 30 minutos. A placa foi abanada num agitador de placa de microteste durante 15 segundos. A placa foi então centrifugada a 300 x g durante 3 minutos. Sobrenadantes (80 μΐ) foi colectado e transferido para as cavidades numas placas de microteste 96-cavidades de parte inferior lisa para medição de OD a 405 nm por um leitor de placa ELISA. A percentagem de inibição de hemólise é definida como: 100 x [(OD eem MAb “ ODjcordefundodosoro dosoro)J / (OD sem MAb -OD, cordefundo do soro )- (ODc om MAb — ODcor de fundo )· A fig. 3 mostra que MAbl37-26 e o controlo irrelevante MAb G3-519 não inibem a hemólise de via clássica de galinha 32 sintetizada RBCs, enquanto que o controlo positivo, anti-C2 MAb 175-62, efectivamente inibe hemólise. C2 é especificamente envolvido na via complementar clássica.

Para uma via alternativa, RBCs de coelho não sintetizado foi lavado três vezes com tampão salino gelatino/veronal (GVB/Mg-EGTA) contendo 2 mM MgCl2 e 1.6 mM EGTA. EGTA numa concentração de 10 mM foi usada para inibir a via clássica (K. Whaley et al., in A.W. Dodds (Ed.), Complement: A P ractical Approach. Oxford University Press, Oxford, 1997, pp. 19-47). Os procedimentos de ensaio são similares ao ensaio de hemólise de via clássica descrito acima. A concentração final de soro humano usado no ensaio foi de 10%. O anti-factor D MAb 166-32 foi usado como controlo negativo. A Fig. 4 mostra que MAb 137-26 não inibe a hemólise via alternativa de RBCs de coelho não sintetizado , enquanto que o anti-factor D MAbl66-32 inibe fortemente a hemólise. O Factor D é especifico para a via complementar alternativa. O anticorpo de controlo negativo não tem efeito.

Em conjunto, os resultados constatam que MAb 137-26 não inibe a activação de C5 e assim sendo a formação de C51 e C5b não é inibida. MAbl37-26 não inibe a activação das vias complementares clássicas e alternativas.

Exemplo 3: Inibição de 125I-C5a de ligar a Neutrofilos Humanos Purificados por MAb 137-26

Neutrofilos humanos foram purificados de sangue total humano e diluído com Dextran Τ-500/solução salina. A mistura foi 33 incubada a temperatura ambiente durante cerca de 20 minutos ou até uma clara camada de superfície apareça. Esta camada de superfície foi transferida para um tubo centrífugo de propileno de 50-ml. A seguir à centrifugação, a célula pellet foi suspensa em 30 ml de PBSB frio 1% BSA em PBS) . A suspensão de célula foi colocada no topo de 10 ml de histopaque-1077 (Sigma, St. Louis, MO) num tubo centrífugo de 50-ml de propileno. Após outra centrifugação, a célula pellet foi então re-suspensa em 20 ml de 2% de NaCl frio durante 30 segundos para dissolver RBCs. Então, 20 ml de 1.6% de NaCl frio foram adicionados à suspensa célula, re-centrifugada e os neutrófilos resuspensos em PBSB. Os neutrófilos foram mantidos em gelo até serem usados para ligar 125I-C5a. MAbl37-26 foi seriamente diluído em tubos centrífugos com 1.5 ml de Eppendorf com um tampão de ligação (1% BSA em meio RPMI1640) para dar concentrações finais compreendidas entre 640 nM e 0.04 M. Quatro microlitros de 4 nM 125I-C5a (NEN Life Science Products, Inc., Boston, MA) foram adicionados a 36 μΐ de MAb 137-26 diluído para incubação a temperatura ambiente durante 15 minutos. C5a humano recombinante purificado (Sigma, St. Louis, Mo foi usado como controlo positivo, enquanto que um anticorpo monoclonal irrelevante istipo-condizente foi usado como controlo negativo. Para a ligação máxima de 125I-C5a, 36 μΐ do tampão de ligação sem anticorpos ou C5a foram usados ao invés. Cinquenta microlitros da suspensão de nutrófilo foi adicionada a cada tubo para incubação em gelo. No final dos 40-minutos do período de incubação, a mistura de cada tubo foi transferida para o topo de 800 μΐ de um tampão de separação (6% BSA em PBS) noutro tubo Eppendorf. Os tubos foram então centrifugados a 2000 x g 34 durante 3 minutos a temperatura ambiente. Após o sobrenadante ser aspirado, a célula pellet foi resuspensa em 0.5 ml de água desionizada para dissolver as células. A dissolução de célula foi então misturada com 3 ml de fluido de cintilação Ultima Gold (Packard Instrument, Meriden, CT) para contagem radioactiva. A Percentagem de inibição de ligação de 125I-C5a é assim definida: [Cprrw - Cpmi*g] - ICpm^ - CpmbkgJ/ [Cpm™* - Cpmbk!J x 100 em que:

Cpmmax = contagem máxima por minuto sem agentes competitivos; Cpmbkg = cpm de fundo sem adição de 125I-C5a; e;

Cprrica = cpm com agentes competitivos. A Fig. 5 mostra a inibição da ligação de radioiodo (125I)-humano C51 para purificar nutrofilos humanos. A dose para a inibição de 50% (ID50) para MAb 137-26 foi de 0.45 nM em comparação aos 30 nM de C5a.

Exemplo 4: Mapeamento do Epitopo de Ligação de MAbl37-26 em C5a Humano por péptidos SPOTs m Membrana de Celulose O epitopo de ligação de MAb 137-26 em C5a humano foi mapeado por uma técnica que usa péptidos SPOTs sintetizados por Sigma Genosys (os Woodlands, TX) . Sobrepondo péptidos (12-mer) encompassando o C5a humano inteiro foi sintetizado numa membrana de celulose. No ensaio, a membrana foi primeiramente tratada com uma solução de bloqueio TBSTB (10 mM Tris cloreto, 250 mM de cloreto de sódio, 1% de albumina de soro 35 de bovino e 0.05% TWEEN® 20) durante 1 hora à temperatura ambiente para saturar todos os sítios de ligação não específicos. MAb 136-26 a 1 pg/ml na solução de bloqueamento foi então adicionada à membrana durante 1 hora a temperatura ambiente. A membrana foi então lavada a fundo com um tampão de lavagem TBST (10 mM Tris cloreto, 250 mM de cloreto de sódio e 0.05% TWEEN® 20) . A membrana foi então tratada com bode anti-rato HRP-conjugado igG (Fc) anticorpo (diluído 1:5,000 no tampão de bloqueamento) (Jackson Imunoresearch, West Grove, PA) durante 1 hora à temperatura ambiente. A membrana foi então lavada novamente. A ligação de MAbl37-26 aos péptidos SPOTs individuais de C5a foi detectada através de incubação com substrato quimoluminescente Supersignal West Pico (Pierce, Rockford, IL). A intensidade de quimoluminescência foi então detectada por exposição à película Kodak X-OMAT Ar (Rochester, NY) . A Figura 6 mostra a sequencia do ligante epitopo por MAb 137-26.

Exemplo 5: Um modelo de sangue inteiro humano ex vivo para estudar a inflamação de complemento-mediada. O efeito de MAbl37-26 na activação de neutrófilo por E. Coli e na matança de Neisseri meningitidis

De modo a investigar o papel de complemento na complexa rede inflamatória, todos os potenciais mediadores de fluido-fase e celulares precisam de estar presentes e assim sendo estão disponíveis para interagir em simultâneo. Para desenvolver tal condição experimental in vitro, sangue inteiro humano foi usado. Neste modelo, lepirudin (REFLUDAN®), um análogo de hirudina especifico de trombina, foi usado com anticoagulante 36 ao invés de heparina. Ao contrário de heparina, lepirudin não interfere com a activação complementar.

Neste sistem modelo, MAb 137-26 bloqueia os efeitos inflamatórios de C5a formado como resultado de activação de complemento por E. Coli. O anticorpo não inibiu MAC-mediado de matar N. meningitidis. Assim sendo, MAb 137-2 6 neutraliza C5a sem inibir a activação de C5 e a subsequente formação de MAC. Isto é uma caracteristica importante dos anticorpos monoclonais da presente invenção.

Sangue inteiro foi recolhido em tubos de polipropileno contendo lepirudin (50pg/ml). 0 sangue inteiro coagulado foi pré-incubado com PBS ou inibidores anti-C5 durante 4 minutos a 37°C. Para os estudos da expressão CDllb e proliferação oxidativa em neutrófilos, E. coli coador opsonizada LE392 (ATCC 33572) foi adicionado às amostras de sangue inteiro durante 10 minutos a 37°C. A concentração de E. coli era de lxl07/ml de sangue nas experiências CDllb e lxl08/ml nas experiências de proliferação oxidativa. A amostra de linha de base T-0 foi processada imediatamente. Após incubação 100 μΐ de amostras foram usadas na medida da expressão CDllb em neutrófilos através de imunofluorcimetria. A proliferação oxidativa dos neutrófilos activados foi medida através do uso de substrato de diidrorodamina 123 e desempenhado tal como descrito no procedimento do teste de proliferação (ORPEGEN Pharma, Heidelberg, Germany).

As Figuras 7A - 7D ilustram os resultados dos ensaios de fluxo citométrico de activação de neutrófilos para a expressão CD11 e proliferação oxidativa. O Anti-C5/C5a 37 MAbl37-26 inibe de um modo efectivo a activação de neutrófilos induzida por E. coli no modelo de sangue inteiro humano de inflamação. Nestes ensaios, MAbl37-26 é mais potente que o anti-C5a MAb561 (Dr. Jurg Kohl) e um peptidico C5aR antagonista (Dr. Stephen Taylor)

Para os ensaios bactericidas, N. meningitidis H44/76-1 foi produzido durante a noite em BHL-agar, subcultura e produção em fase durante 4 horas. 5000 - 10000 Colonias formam unidades (CFUs) foram adicionados a 1.1 ml de amostras de sangue inteiro anti-coagulado lepirudin pré-incubado durante 5 minutos com PBS ou anticorpo. A cada período de tempo, 100 μΐ de sangue inteiro foi plantado em pratos microbiológicos Petrl contendo agar sangue e incubado durante 24 horas a 37°C. O crescimento bacterial foi expresso como CFU/100 μΐ de todo o sangue adicionado. A amostra T-0 foi imediatamente obtida após a adição da bactéria. A Figura 6 mostra que MAbl37-26 não inibe a matança MAC-mediada de Neisseria meningitides. Em contraste, MAbl37-30inibe a matança de Neisseria meningitides pelo sangue inteiro humano. Este anticorpo inibe a activação de C5. 38

LISTA DE SEQUÊNCIA <110> TANOX, INC.

C5A

<120> INIBIDORES DE VIA COMPLEMENTAR QUE SE LIGAM A C5 SEM IMPEDIR A FORMAÇÃO DE C5B <130> P2 62 7 2EP-PCT <140> EP02768574.2 < 141 > 2002-08-17 <150> US60313137 <151> 2001-08-17 <160> 7 < 17 0 > Patentln ver < 210 > 1 < 211 > 74 <212> PRT <213> Homo sapiens < 2 2 0 > < 2 21 > PEPTÍDEO <222> (D · · (74) < 2 2 3 > C5a Humano <400> 1 39

Thr Leu Gin Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser 15 10 15

Vai Vai Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Vai Asn Asn Asp Glu 20 25 30

Thr Cys Glu Gin Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile 35 40 45

Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Vai Vai Ala Ser Gin Leu Arg Ala Asn 50 55 60

Ile Ser His Lys Asp Met Gin Leu Gly Arg 65 70 <210> 2 <211> 12

<212> PRT <213> homo sapien <220> <221> peptídeo <222> (1) . . (12) <223> Fragmento de C5a humano de aa 29 a aa 40 <400> 2

Thr Leu Gin Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser 15 10 15

Vai Vai Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Vai Asn Asn Asp Glu 20 25 30

Thr Cys Glu Gin Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile 35 40 45

Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Vai Vai Ala Ser Gin Leu Arg Ala Asn 50 55 60

Ile Ser His Lys Asp Met Gin Leu Gly Arg 65 70 40

< 210 > 2 <211> 12 <212> PRT <213> homo sapien < 2 2 0 > < 2 21 > peptídeo <222> (D · · (12) < 2 2 3 > Fragmento de C5a humano de aa 2 9 a aa <400> 2 Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gin Arg Ala 1 5 10 < 210 > 3 < 211 > 12 <212> PRT <213> Homo sapiens < 2 2 0 > < 2 21 > PEPTÍDEO < 2 2 2 > (D · · (12) < 2 2 3 > Fragmento de C5a humano de aa 32 a aa <400> 3 Glu Thr Cys Glu Gin Arg Ala Ala Arg Ile 1 5 10 < 210 > 4 < 211 > 12 <212> PRT 41 <213> Homo sapiens < 2 2 0 > < 2 21 > <222> < 2 2 3 > PEPTÍDEO (D · · (12) Fragmento de C5a humano de aa 35 a aa 46 <400> 4 Glu 1 Gin Arg Ala Ala 5 Arg Ile Ser Leu Gly 10 Pro Arg <210> 5 < 211 > 12 <212> PRT <213> Homo sapiens < 2 2 0 > < 2 21 > PEPTÍDEO < 2 2 2 > (D ·· (12) < 2 2 3 > Fragmento de C5a humano de aa 38 a aa 49 <400> 5

Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile Lys 1 5 10 <210> 6 < 211 > 12 <212> PRT <213> Homo sapiens < 2 2 0 > 42 < 2 21 > PEPTIDEO <222> (1) ·· (12) < 2 2 3 > Fragmento de C5a humano de aa 41 a aa 52 <400> 6 Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile Lys Ala Phe 1 5 10 < 210 > 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens < 2 2 0 > < 2 21 > PEPTÍDEO <222> (D · · (12) < 2 2 3 > Fragmento de C5a humano de aa 4 4 a aa 55 < 4 0 0 > 7 Gly Pro Arg Cys Ile Lys Ala Phe Thr Glu Cys 1 5 10 43

REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo ou fragmento do mesmo que liga a C5 e C5a, mas não impede a activação de C5, e não evita a formação. 2. Um anticorpo ou fragmento de acordo com a reivindicação 1, que liga a C5a livre com afinidade melhor ou igual do que C5 . 3. Um anticorpo ou fragmento de acordo com a reivindicação 1, que inibe a ligação de C5a a C5aR. 4 . Um anticorpo ou fragmento do mesmo que liga ao mesmo epitopo de C5 tal como o anticorpo monoclonal 137-2 6 que é produzido da hibridoma depositada com o ATCC e designado PTA- 3650 . acordo com qualquer uma das o anticorpo é um anticorpo 5 . Um fragmento de anticorpo de reivindicações da 1 à 4, em que monoclonal. 6. Um fragmento de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações da 1 à 4, que é seleccionado do grupo que consiste em Fab, (ab'>2r Fv e cadeia única Fv. 7. Um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 5, em que o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo em que os potenciais epítopos de células-T foram eliminados, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano. 44 8. 0 anticorpo monoclonal 137-26 produzido do hibridoma depositado com o ATCC e designado PTA-3650. 9. A linha celular hibridoma que é citada na reivindicação 8 . 10. Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações da 1 a 5, o fragmento de acordo com a reivindicação 6, ou o anticorpo de acordo com a reivindicação 7 ou 8 e um transportador, excipiente, estabilizador farmacologicamente aceitável. 11. O uso do anticorpo ou fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações da 1 à 8 para a produção de um medicamento para inibir a activação de C5a. 12. O uso do anticorpo ou fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações da 1 à 8 para o tratamento de uma doença ou condição que é mediada por produção não controlada ou excessiva de C5a. 13. O uso de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que o medicamento é para ser administrado por infusão intravenosa, injecção de bolus intravenosa, intraperitonial, intradérmico, intramuscular, subcutânea, intranasal, endotraqueal, intraspinal, intracranial ou oralmente. 14. O uso de acordo com a reivindicação 12, em que a doença ou condição é o síndroma de dificuldade respiratória aguda (ARDS). 45 15. 0 uso de acordo com a reivindicação 12, em que a doença ou condição é a lesão isquemia-reperfusão do miocárdio. 16. 0 uso de acordo com a reivindicação 12, em que a doença ou condição é a sépsis. 17. O uso de acordo com a reivindicação 12, em que a doença ou condição é uma doença auto imune. 18. O uso de acordo com a reivindicação 17, em que a doença auto imune é artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico ou psoriase. 19. 0 uso de acordo com a reivindicação 12, em que a doença ou a condição é lesão de tecido ou uma resposta inflamatória induzida por complexos imunes (IC) 20. Método de diagnóstico compreendendo o valor de C5 ou C5a que se encontra presente numa amostra com o anticorpo ou fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações da 1 a 8 . 21. Método de diagnostico da reivindicação 20, em que o anticorpo é o anticorpo monoclonal 137-26 que é produzido a partir da hibridoma depositada com o ATCC e designado PTA-3650 . 22. Um processo ex vivo para identificação de um inibidor que liga a C5 e C5a, mas não evita a activação de C5, e não evita a formação ou inibe a activação de C5b, o processo compreende: 46 (i) a determinação se um composto de teste liga a C5 e C 5 a; e (ii) a determinação se o composto de teste inibe a actividade de C5b. 23. Um processo de preparação de uma composição farmacêutica compreendendo o processo da Reivindicação 22 e além disso a combinação do composto de teste com um transportador, excipiente, estabilizador ou diluente farmacologicamente aceitável. 47 1/11

Fig. 1 Reactividade de MAbl37-26 com C5a em ELISA O o 2.4" 2.2 -1 0-18 ~ 1J-1 1.4 -1.2' 10-oi- 0.5 -04· 0.2 &$> *- MAb 137-26 -o- MAbl3?-?6 MAb Irrelevante β~~ τ~γ·-τ^- Ϊ&-3 • '^|< « <jy n“ m t >,twrrn.T.. CL1

Concentração Anticorpo ( pg/ml) o «s o ·'© 2/11

Fig. 2 Reactividade de MAbl37-26 com C5a em ELISA 2 4 · 2 2 2.0 1.8-!.& t :4 -Í.-S · f .0 -0.8 -0.5 0,4-02-0 0 - -—MAb 137*26 O.....MAb 137-76 •o.'.!··" MAb Irrelevante

M ·./ *—......®—-- ιε-3 E3" .,l....frrrr-ry^r^r^^ Õ--Ô-1 cu

Concentração Anticorpo ( pg/ml) 3/11

Fig. 3 Não inibição de Hemólise de Complemento CP por MAbl37-26 w- 80> MAb 137-26 -n- MAbl ?5-S2 Ό MAb Irrelevante

dP 80.· o i(0

O A 40'

•H

C / 20 0.0 i f.......i—(.....rr “1-1--r-—r-τ > > j is Λ v“.— -I--"

Concentração Anticorpo ( pg/ml) 4/11

Fig. 4 Não inibição de Hemólise de Complemento AP por MAbl37-26 100-1 — 00 MAbl 37-26 MAb 166-32 -"-Ο.....MAb Irrelevante dp .60 ·

O 40- 20 · i(0

O

H

XI

H c i- •ΐ'ττη- 0.01 0 1 “ττττ^·

Concentração Anticorpo ( pg/ml) ioc; 4 80 5/11

Fig. 5 Inibição de Ligante 125I-C51 a Neutrófilos Humanos através de MAbl37-26

Competição com: * WAblSí-ae Hwman C5a - MAb I ire levante

Inibição (%) ¢0 40 zo4 V 0 - 1- 0.1 "•‘Γ ΙΟ 100 1000

Concentração Anticorpo ( pg/ml) 6/11

Fig. 6 Epítopo de Ligação de MAbl37-26 em C5a humano

^TLQKKÍEEÍMKYKHSWKKCCYDGACV^rjDfcTCEQRAARrSlGPRCÍKAFTECCWASQ

l^TOKDMQtQR-C Péptido

Reactividade de MAbl37-26

MNÒEPGEQRMR EYCEQHÃÁHÍSi ... *

EQRAARI&LGPR AARÍSLGPRCiK SSLGPRCiSAFT *t

fiFRCSÍAFTECC 7/11

Fig. 7A Anti-C5/C5a MAbl37-26 inibe a expressão CD11B em neutrófilos humanos estimulado por E. coli num modelo de sangue inteiro

MAb irrelevante s And -C5a MAb561 (deJ.Kohl) Antl -CS/CSa MAb 137-26 * A Antl -CS MAb137 -30 λ NSo MAb

ΓΪΤ-0mh.sem E.ooM *T-10 mln.sem E.coS 8/11

Fig. 7B Anti-C5/C5a MAbl37-26 inibe a expressão CD11B em neutrófilos humanos estimulado por E. coli num modelo de sangue inteiro * * :—ψ·~~ _____---- s. -m Λ \ \ 4Ô3-I m \ \ ---- -·=» "‘HM1 2 .0- I .......Ύ..... • r f i 0 ' ÍS $ £00 1t»S S5>S} 1 ψ Péptido irrelevante 2

Antl-C5a MAb 137-26) ® C5aR péptldbo antagonista (da S. Taylor) ^ Nem MAb ou pâptldo O T-10 mln.sem E.Col jj T-0 mln.sem E.Coll 9/11 50“ áf* m·* 'ÍSf-* £50 > ' Ô

Fig. 7C Anti-C5/C5a inibe a proliferação oxidativa em neutrófilos humanos estimulado por E. coli num modelo de sangue inteiro

^ MAb irrelevante m Anl -C5a MAb561 (de J. KohQ » Anl -C5/C5a MAb137-26 & Anl -C5 MAb137 -30 , Nfio MAb pT-0 mh,sem E.ooÈ oT-10 mln.sem E.ooÈ 10/11

Fig. 7D Anti-C5/C5a inibe a proliferação oxidativa em neutrófilos humanos estimulado por E. coli num modelo de sangue inteiro

^Péptido irrelevante .v Antl -C5aMAb 137-26) *C5aR péptldlco antagonista (de S.Taybi) Δ Nem MAb ou pãptldo © T-10 mln, sem E.Col pT-0 mh.sem E. Col 11/11

Sangue Inteiro CFU /100 μΙ