PT2403528E - Anticorpos contra um ligando indutor da proliferação (april) - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"ANTICORPOS CONTRA UM LIGANDO INDUTOR DA PROLIFERAÇÃO (APRIL)" A presente invenção refere-se a anticorpos isolados oufragmentos dos mesmos que se ligam a APRIL humano,polinucleótidos codificando tais anticorpos e célulashospedeiras produzindo tais anticorpos. Os anticorpos podemser utilizados para inibir a proliferação e/ou sobrevivência de células imunes, para tratar cancro e para tratar uma doença inflamatória. APRIL é expresso como uma proteína transmembranar detipo II, mas ao contrário de outros membros da família dasTNF é principalmente processado como uma proteína segregadae clivado no aparelho de Golgi onde é clivado por umafurina convertase para libertar uma forma ativa solúvel(Lopez-Fraga et al., 2001, EMBO Rep 2, 945-51,). APRIL é montado como um homotrímero não ligado covalentemente comhomologia estrutural semelhante na dobra proteica a umasérie de outros ligandos da família das TNF (Wallweber et al., 2004, Mol Biol 343, 283-90). APRIL liga a dois

recetores de TNF: o antigénio de maturação de células B (BCMA) e o ativador transmembranar e modulador de cálcio einterator de ligando de ciclofilina (TACI) (revisto emKimberley et al., 2009, J Cell Physiol. 218(1) :1-8) .Adicionalmente, APRIL foi recentemente mostrado comoligando a proteoglucanos de sulfato de heparano (HSPGs)(Hendriks et al., 2005, Cell Death Differ 12, 637-48). APRIL mostra homologia elevada (30%) com outro membroda superfamília das TNF, o fator de ativação de células Bpertencendo à família das TNF (BAFF ou estimulador deLinfócito B, BLyS), com o qual partilha a ligação aos seusrecetores, BCMA e TACI. BAFF é também conhecido comoligando a um recetor único, o Recetor BAFF, e através disto medeia sinais de sobrevivência cruciais durante o desenvolvimento de células B (revisto em Kimberley et al.,2009, J Cell Physiol. 218(1):1-8). APRIL e BAFF foramsugeridos como formando trimeros mistos (Roschke et al.,2002, J Immunol. 169(8):4314-21). Tais trimeros mistosforam constatados como ocorrendo a uma prevalência maiselevada em pacientes com artrite reumatoide (RA). APRIL é predominantemente expresso por parte desubconjuntos de células imunes tais como monócitos,macrófagos, células dendriticas, neutrófilos, células B, ecélulas T, muitos dos quais também expressam BAFF.Adicionalmente, APRIL pode ser expresso por parte decélulas não imunes tais como osteoclastos, célulasepiteliais e uma variedade de tecidos tumorais (revisto emKimberley et al., 2009, J Cell Physiol. 218(1):1-8). A função de APRIL foi estabelecida utilizando modelosgenéticos de ratinho. Os ratinhos transgénicos hAPRIL têmum desenvolvimento normal, mas mostraram sobrevivência decélulas T potenciada e niveis elevados de anticorpos IgM(Stein et al., 2002, J Clin Invest 109, 1587-98).

Adicionalmente, as respostas de células T de tipo IIindependente foram potenciadas. Os ratinhos transgénicoshAPRIL envelhecidos exibiram crescimento e reorganização dosistema linfático extremos e baço alargado devido ainfiltração de células B CD5 positivas, um fenótipo muitosemelhante a B-CLL humano (Planelles et al., 2004, CancerCell 6, 399-408). Ratinhos deficientes em APRIL foram constatados como tendo níveis diminuídos de IgA nacirculação e após desafio com um antigénio dependente decélulas T (Castigli et al., 2004, Proc Natl Acad Sei USA101,3903-8; Varfolomeev et al., 2004, Mol Cell Biol 24,997-1006). A seguir, APRIL, juntamente com BAFF, foidemonstrado como funcionando em recombinação de comutaçãode classe (CSR) de anticorpos tanto a IgG como a IgA,independentemente da sinalização CD40-CD40L (Litinskiy et al., 2002, Nat Immunol 3, 822-9). Adicionalmente, APRIL foidemonstrado como sendo menos crítico do que BAFF namanutenção de células B, mas foi mostrado como tendo umpapel na sinalização de células B e conduzindo tanto aproliferação como a sobrevivência de células B humanas e deratinho in vitro (revisto em Kimberley et al., 2009, J CellPhysiol. 218 (1) : 1-8) . APRIL foi originalmente identificado com base na suaexpressão em células cancerígenas (Hahne et al., 1998, JExp Med 188, 1185-90). Foram encontrados níveis deexpressão elevados de ARNm de APRIL num painel de célulastumorais bem como tumores primários humanos tais como docólon, e num carcinoma linfoide. Adicionalmente, célulasNIH-3T3 fibroblásticas de ratinho transfetadas com APRILforam mostradas como crescendo mais rapidamente em ratinhosimunodeficientes. De forma mais importante, o bloqueio deAPRIL utilizando um recetor de APRIL solúvel foi mostradocomo inibindo o crescimento tumoral de carcinomas do pulmãoe do cólon (Rennert et al., 2000, J Exp Med 192, 1677-84).

As células B de Leucemia Linfocítica Crónica (CLL)expressam tanto APRIL com recetores de APRIL.Adicionalmente, foi mostrado que APRIL protegeu células deCLL contra apoptose espontânea e induzida por fármacos eestimulou a ativação de NF-κΒ (revisto em Kimberley et al.,2009, J Cell Physiol. 218(1):1-8). Um estudo retrospetivosob 95 pacientes de CLL mostrou níveis aumentados de APRILno soro, o que foi correlacionado com a progressão dadoença e a sobrevivência global dos pacientes, com umprognóstico mais pobre para pacientes com níveis elevadosde APRIL no soro (Planelles et al., 2007, Haematologica 92,1284-5).

De forma semelhante, APRIL (em níveis elevados) foimostrado como sendo expresso em linfoma de Hodgkin, linfomanão Hodgkin (NHL) e Mieloma Múltiplo (MM) (revisto emKimberley et al., 2009, J Cell Physiol. 218(1):1-8). Um estudo retrospetivo em pacientes com DLBCL (NHL) mostrouque a expressão elevada de APRIL em lesões cancerígenas foicorrelacionada com uma taxa de sobrevivência pobre(Schwaller et al., 2007, Blood 109, 331-8). Utilizandolinhas celulares de NHL e MM foi mostrado que o tratamentocom APRIL ou BAFF aumentou a sobrevivência através daativação de NF-κΒ e regulação positiva de proteínas pró-sobrevivência (revisto em Kimberley et al., 2009, J Cell

Physiol. 218(1):1-8). De acordo com este papel pró-sobrevivência de APRIL, as células de MM foram mostradascomo sendo submetidas a apoptose quando cultivadas napresença de TACI-Fc. Já que o recetor de BAFF foi menoseficaz no potenciamento da apoptose, isto indica que APRIL,e não BAFF é primariamente responsável pela sobrevivênciapotenciada nestas células (Abe et al., 2006, Leukemia 20,1313-5). APRIL foi também constatado como sendo sobreexpressonuma série de linhas celulares derivadas a partir detumores sólidos. Com efeito, APRIL foi capaz de estimular aproliferação in vitro de uma série destas linhas celulares(revisto em Kimberley et al., 2009, J Cell Physiol.218 (1) : 1-8) .

Devido ao seu papel na biologia das células B APRILdesempenha também um papel em muitas doenças autoimunes.Com efeito, atacicept (uma preparação comercial de TACI-Fc)encontra-se já em numerosos ensaios clinicos para otratamento de várias doenças autoimunes (revisto em Gattoet al., 2008, Curr Opin Investig Drugs. 9(11):1216-27).Foram relatados niveis aumentados no soro de APRIL e BAFFem vários pacientes com SLE Koyama et al., 2005, Ann RheumDis 64, 1065-7) . Uma análise retrospetiva revelou que os niveis de APRIL no soro tendem a estar correlacionados comtitulos de anticorpos anti-ADNds. Foi obtida evidência deque APRIL pode desempenhar um papel funcional no SLE aotestar o efeito da proteína de fusão TACI-Fc em ratinhos propensos a lúpus (Gross et al., 2000, Nature 404, 995-9),o que preveniu o desenvolvimento da doença e prolongou asobrevivência.

Adicionalmente, a inibição de APRIL e BAFF com TACI-Fcno modelo de ratinho CIA de artrite reumatoide foi tambémconstatado como prevenindo a progressão da doença ereduzindo as pontuações da doença, em comparação comcontrolos (Gross et al., 2001, Immunity 15, 289-302; Wang et al., 2001, Nat Immunol 2, 632-7). Também noutro modelo de artrite, quimeras de ratinho sinóvia-SCID, TACI-Fcmostrou um efeito benéfico (Seyler et al., 2005, J Clin

Invest 115, 3083-92). O tratamento com TACI-Fc resultou na desaparição de Centros Germinais no tecido sinovial,produção de Ig diminuída e produção de IFN-gama diminuída.

Foi posteriormente relatado que o fluido sinovial depacientes com artrite inflamatória teve níveis de APRILsignificativamente aumentados em comparação com os depacientes sofrendo de artrite não inflamatória tal comoosteoartrite (Stohl et al., 2006, Endocr Metab ImmuneDisord Drug Targets 6, 351-8; Tan et al., 2003, ArthritisRheum 48, 982-92). Vários estudos foram focados na presença de APRIL nosoro de pacientes sofrendo de uma gama mais ampla dedoenças reumáticas com base imune sistémicas (atualmenteincluindo também síndrome de Sjõgren, síndrome de Reiter,artrite psoriática, polimiosite, e espondiliteanquilosante) e constataram níveis significativamenteaumentados de APRIL nestes pacientes, sugerindo um papelimportante para APRIL também nestas doenças (Jonsson etal., 1986, Scand J Rheumatol Suppl 61,166-9; Roschke etal., 2002, J Immunol 169, 4314-21).

Finalmente, a expressão aumentada de APRIL foi tambémligada a Esclerose Múltipla (MS) . A expressão de APRIL foiconstatada como sendo aumentada nos astrocitos de afetadospor MS em comparação com controlos normais. Isto está em conformidade com a expressão de APRIL descrita emglioblastomas e no soro de pacientes com glioblastoma(Deshayes et al., 2004, Oncogene 23, 3005-12; Roth et al.,2001, Cell Death Differ 8, 403-10). APRIL desempenha um papel crucial na sobrevivência ecapacidade proliferativa de várias malignidades de célulasB, e potencialmente alguns tumores sólidos. APRIL estátambém a emergir como um agente chave em doençasinflamatórias ou autoimunidade. Consequentemente,estratégias para antagonizar APRIL são um objetivoterapêutico para uma série destas doenças. De facto,estudos clinicos visando APRIL com TACI-Fc (Atacicept)encontram-se atualmente em curso para o tratamento devárias doenças autoimunes. Contudo, TACI- Fc também visaBAFF, um fator envolvido na manutenção de células Bnormais. Anticorpos orientados contra APRIL foram descritosnos documentos W09614328, W02001/60397 WO2002/94192,W09912965, WO2001/196528 e W09900518. Esta invençãodescreve anticorpos visando APRIL especificamente. Osanticorpos nesta invenção bloqueiam totalmente a ligação deAPRIL a TACI e pelo menos parcialmente a BCMA. Algunsanticorpos de acordo com a invenção bloqueiam totalmente aligação tanto a BCMA como a TACI. Tais moléculas são úteisnuma terapêutica para uma série de condições nas quaisAPRIL solúvel circulante é correlacionado com a atividade ea progressão da doença. Já que os niveis de expressão deAPRIL podem ser utilizados como marcadores diagnósticos eprognósticos para diferentes doenças, estes anticorpospodem também ser aplicados em tais testes. A invenção proporciona compostos ligantes selecionadosa partir de anticorpos ou fragmentos de anticorpo que ligama APRIL humano compreendendo: a) uma região variável de cadeia pesada deanticorpo compreendendo as sequências de aminoácidosde CDR1, CDR2 e CDR3 selecionadas a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 9, 10 e 11 respetivamente,ou uma variante de qualquer de tais sequências que compreenda até três modificações de aminoácidos; eb) uma região variável de cadeia leve de anticorpocompreendendo as sequências de aminoácidos de CDR1,CDR2 e CDR3 selecionadas a partir do grupo consistindoem SEQ ID NOs: 12, 13 e 14 respetivamente, ou uma variante de qualquer de tais sequências que compreendaaté três modificações de aminoácidos,em que o composto ligante liga ao epitopo conformacionalSMPSHP de APRIL, e preferivelmente a IRSMP-SHPDRA, e em queo composto ligante bloqueia totalmente a ligação de APRILcom TACI humano e pelo menos bloqueia parcialmente aligação de APRIL com BCMA humano. O composto ligante bloqueia a ligação a TACI e BCMA einclui CDRs de cadeia leve de anticorpos de SEQ ID NOs: 12,13, 14 e CDRs de cadeia pesada de anticorpos de SEQ ID NOs: 9, 10, 11. Nalgumas formas de realização, o composto ligante é um anticorpo quimérico, anticorpo humano,anticorpo humanizado ou um fragmento dos mesmos.

Numa forma de realização, a invenção proporciona umcomposto ligante que liga a APRIL humano compreendendo CDRsde cadeia pesada de anticorpos de SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, ou variantes de quaisquer tais sequências; e CDRs de cadeialeve de anticorpos de SEQ ID NOs: 12, 13 e 14, ou variantesde quaisquer tais sequências.

Noutra forma de realização, a invenção compreende umcomposto ligante que liga a APRIL humano compreendendo umaregião variável de cadeia pesada de anticorpo compreendendoa sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia leve de anticorpo compreendendo asequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo deSEQ ID NOs: 6.

Noutra forma de realização a invenção compreende umanticorpo, em que a cadeia pesada tem a sequência de região variável de SEQ ID NO: 5 e está unida a uma regiãoconstante IgGl e a cadeia leve tem a sequência de SEQ IDNO: 6 e está unida à região constante k. Em particular, aregião constante é de origem de ratinho ou humana. Maisparticularmente, o anticorpo é hAPRIL.OlA.

Noutra forma de realização a invenção compreende umavariante de um composto ligante que liga a APRIL humano, emque qualquer da(s) dita(s) variante (s) pode(m) compreenderaté três modificações de aminoácidos nas CDRs previamenteidentificadas das regiões variáveis tanto de cadeia pesadacomo de cadeia leve.

Noutra forma de realização a invenção compreende umavariante de um composto ligante que liga a APRIL humano, emque qualquer da(s) dita(s) variante (s) pode(m) compreenderaté três modificações de aminoácidos em cada uma das CDRspreviamente identificadas em cada uma das regiões variáveisde cadeia pesada e de cadeia leve.

Noutra forma de realização a invenção compreende umavariante de um composto ligante que liga a APRIL humano, emque qualquer da(s) dita(s) variante (s) pode(m) compreenderaté três modificações de aminoácidos nas sequências de CDRpreviamente identificadas em cada uma das regiões variáveisde cadeia pesada e de cadeia leve. 0 composto ligante da invenção bloqueia totalmente aligação de APRIL com TACI humano e pelo menos bloqueiaparcialmente a ligação com BCMA humano.

Noutra forma de realização a invenção compreende umcomposto ligante que bloqueia totalmente a ligação de APRILcom TACI humano e com BCMA humano.

Noutra forma de realização a invenção compreende umcomposto ligante que liga a APRIL humano, em que o compostoligante liga a APRIL humano com uma KD de cerca de 10 nM oumenor; e bloqueia a ligação de TACI humano e/ou BCMA humanoa APRIL humano com um CI50 de cerca de 2 nM ou menor. O composto ligante da invenção liga ao epitopo conformacional SMPSHP de APRIL humano (preferivelmenteIRSMP-SHPDRA) opcionalmente suportado por TLFR e/ouQDVTFTMGQ.

Nalgumas formas de realização o composto ligante dainvenção é um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo.Noutra forma de realização o composto ligante da invenção éum anticorpo humano ou um fragmento do mesmo.

Noutra forma de realização o composto ligante da invenção éum anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo.

Noutra forma de realização a invenção compreende umcomposto ligante, preferivelmente um anticorpo humanizado,com as CDRs identificadas acima e uma variante de regiãoconstante de cadeia pesada e uma variante de regiãoconstante de cadeia leve, em que cada variante de regiãoconstante compreende até 20 substituições de aminoácidosmodificados conservativamente.

Noutra forma de realização o composto ligante da invenção éum fragmento de anticorpo selecionado a partir de Fab,Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, mAb biespecifico ou umfragmento de diacorpo. A invenção também compreende o composto ligante conformedescrito acima que inibe a proliferação e sobrevivência decélulas B. A invenção também compreende ácidos nucleicos codificando ocomposto ligante anti-APRIL da invenção. A invenção também compreende células e vetores de expressãocompreendendo ácidos nucleicos codificando o compostoligante anti-APRIL da invenção.

Adicionalmente, a invenção compreende um método de produzirum composto ligante da invenção compreendendo: (a) cultivara célula hospedeira compreendendo um ácido nucleicocodificando um anticorpo ou fragmento de anticorpo dainvenção em meio de cultura sob condições em que asequência de ácidos nucleicos é expressa, desta formaproduzindo polipéptidos compreendendo as regiões variáveis de cadeia leve e pesada; e (b) recuperar os polipéptidos apartir da célula hospedeira ou medio de cultura. A invenção também compreende composições compreendendo umcomposto ligante da invenção em combinação com um portadorou diluente farmaceuticamente aceitável. A invenção também compreende um método de inibir aproliferação e/ou sobrevivência de uma célula imune,compreendendo administrar a um individuo em necessidade domesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um compostoligante da invenção. Numa forma de realização, o métodopode ser utilizado para tratar cancro. Noutra forma derealização, o método pode ser utilizado para tratar umadoença autoimune ou inflamatória.

Nalgumas formas de realização, a invenção compreende ummétodo de inibir a proliferação e/ou sobrevivência de umacélula imune, compreendendo administrar a um indivíduo emnecessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficazde um composto ligante da invenção, e compreendendo adicionalmente medir a proliferação e/ou sobrevivência exvivo de células B numa amostra derivada a partir doindivíduo, em que uma inibição da proliferação e/ousobrevivência da célula B indica que o tratamento deve sercontinuado.

Noutras formas de realização, a invenção compreende ummétodo de inibir a proliferação e/ou sobrevivência de umacélula imune, compreendendo administrar a um indivíduo emnecessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficazde um composto ligante da invenção, e compreendendo adicionalmente medir a proliferação e/ou sobrevivência exvivo de células B numa amostra derivada a partir doindivíduo, em que um aumento da proliferação e/ousobrevivência de células B prevê a probabilidade de que otratamento seja exitoso. A invenção em determinadas formas de realização tambémcompreende um composto ligante anti-APRIL da invenção, ligado a um agente terapêutico tal como uma toxinabacteriana ou uma radiotoxina. Exemplos não limitantes deagentes citotóxicos incluem taxol, citocalasina B,mitomicina, etopósido e vincristina ou outrosantimetabolitos, agentes alquilantes, antibióticos eantimitóticos. A invenção também compreende um método deinibir a proliferação e/ou sobrevivência de uma célulaimune, compreendendo colocar em contacto uma célula imunecom um composto ligante da presente invenção.

Nalgumas formas de realização o método compreendeadministrar adicionalmente um segundo agente terapêutico oumodalidade de tratamento. Nalgumas formas de realização, oscompostos ligantes anti-APRIL podem ser combinados com umtratamento que seja considerado como sendo padrão decuidado do cancro ou doença autoimune ou inflamatória. 0raciocinio para tais combinações é que a inibição imuneaumentada concomitante por anti-APRIL irá induzir oufacilitar a resposta clínica inicial a tratamento de padrãode cuidado, induzir resposta clinica duradoura e controloimune da doença a longo prazo.

Noutra forma de realização os compostos ligantes dapresente invenção são utilizados diagnosticamente.

Ainda noutra forma de realização os compostos ligantes dainvenção são utilizados para medir a proliferação e/ousobrevivência de células B ex vivo numa amostra derivada apartir do individuo, em que uma inibição da proliferaçãoe/ou sobrevivência da célula B indica que o tratamento como composto ligante conforme definido acima no presentedocumento deve ser continuado.

Noutra forma de realização os compostos ligantes de acordocom a invenção são anticorpos ou fragmentos de anticorpoisolados que ligam a APRIL humano. 0 termo "anticorpo" refere-se a qualquer forma deanticorpo que exiba a atividade biológica desejada, talcomo inibição da ligação de um ligando ao seu recetor, ou ao inibir a sinalização induzida por ligando de um recetor.Consequentemente, "anticorpo" é utilizando no sentido maisamplo e abrange especificamente, mas não está limitado a,anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais decomprimento completo), anticorpos policlonais, e anticorposmultiespecificos (por exemplo, anticorpos biespecificos). "Fragmento de anticorpo" e "fragmento de ligação aanticorpo" significam fragmentos de ligação a antigénio eanálogos de um anticorpo, tipicamente incluindo pelo menosuma porção das regiões variáveis ou de ligação a antigénio(por exemplo uma ou mars CDRs) do anticorpo parental. Umfragmento de anticorpo retém pelo menos alguma daespecificidade de ligação do anticorpo parental.Tipicamente, um fragmento de anticorpo retém pelo menos 10%da atividade de ligação parental quando essa atividade éexpressa numa base molar. Preferivelmente, um fragmento deanticorpo retém pelo menos 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ou100% ou mais da afinidade de ligação do anticorpo parentalpara o alvo. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem,mas não são limitados a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, eFv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorposde cadeia simples, por exemplo, sc-Fv, unicorpos(tecnologia a partir da Genmab); nanocorpos (tecnologia apartir da Domantis); anticorpos de dominio (tecnologia apartir da Ablynx); e anticorpos multiespecificos formados apartir de fragmentos de anticorpos. São revistas variantes de anticorpo manipuladas emHolliger e Hudson, 2005, Nat. Biotechnol. 23, 1126-1136.

Um "fragmento Fab" é composto por uma cadeia leve e asregiões CH1 e variável de uma cadeia pesada. A cadeiapesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligaçãodissulfeto com outra molécula de cadeia pesada.

Uma região "Fc" contém dois fragmentos de cadeiapesada compreendendo os dominios CH1 e CH2 de um anticorpo.Os dois fragmentos de cadeia pesada são mantidos juntos por duas ou mais ligações dissulfeto e por interaçõeshidrofóbicas dos domínios CH3.

Um "fragmento Fab'" contém uma cadeia leve a umaporção de uma cadeia pesada que contém o dominio VH e odominio CH1 e também a região entre os dominios CH1 e CH2,de tal forma que pode ser formada uma ligação dissulfetointer-cadeia entre as duas cadeias pesadas dos doisfragmentos Fab' para formar uma molécula F(ab')2·

Um "fragmento F(ab')2M contém duas cadeias leves eduas cadeias pesadas contendo uma porção da regiãoconstante entre os dominios ChI e CH2, de tal forma que éformada uma ligação dissulfeto inter-cadeia entre as duascadeias pesadas. Um fragmento F(ab')2 é consequentementecomposto por dois fragmentos Fab' que são mantidos juntospor uma ligação dissulfeto entre as duas cadeias pesadas. A "região Fv" compreende as regiões variáveis a partirtanto da cadeia pesada como leve, mas carece das regiõesconstantes.

Um "anticorpo Fv de cadeia simples" (ou "anticorposcFv") refere-se a fragmentos de anticorpos compreendendoos dominios VH e VL de um anticorpo, em que estes dominiosestão presentes numa cadeia polipeptídica simples. De ummodo geral, o polipéptido de Fv compreende ainda um ligantepolipeptidico entre os dominios VH e VL que permite que oscFV forme a estrutura desejada para ligação ao antigénio.Para uma revisão de scFv, veja-se Pluckthun,1994, THEPHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburge Moore eds. Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315;veja-se também, Publicação de Pedido de Patente

Internacional N° WO 88/01649 e Patente U.S. N°s 4.946, 778e 5.260.203.

Um "diacorpo" é um pequeno fragmento de anticorpo comdois sitios de ligação a antigénio. Os fragmentoscompreendem um dominio variável de cadeia pesada (VH)conectado a um dominio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL ou VL-VH) . Ao utilizar umligante que é demasiado curto para permitir oemparelhamento entre os dois dominios na mesma cadeia, osdominios são forçados a emparelhar com os dominioscomplementares de outra cadeia e criar dois sitios deligação a antigénio. Os diacorpos são descritos maiscompletamente em, por exemplo, documento EP 404.097;documento WO 93/11161; e Holliger et ai., 1993, Proc. Natl.Acad. Sei. USA 90, 6444-6448.

Um "fragmento de anticorpo de dominio" é um fragmentode imunoglobulina imunologicamente funcional contendosomente a região variável de uma cadeia pesada ou a regiãovariável de uma cadeia leve. Nalguns casos, duas ou maisregiões VH são ligadas covalentemente com um ligantepeptidico para criar um fragmento de anticorpo de dominiobivalente. As duas regiões VH de um fragmento de anticorpode domínio bivalente podem visar os mesmos ou diferentesantigénios.

Conforme utilizado no presente documento hAPRIL.OlA éum anticorpo de ratinho em que a cadeia pesada tem asequência de região variável de SEQ ID NO: 5 e está unida auma região constante IgGl e a cadeia leve tem a sequênciade região variável de SEQ ID NO: 6 e está unida à regiãoconstante κ. O anticorpo hAPRIL.03A (não de acordo com ainvenção reivindicada) é um anticorpo de ratinho, em que acadeia pesada tem a sequência de região variável de SEQ IDNO: 7 e está unida a uma região constante IgGl e a cadeialeve tem a sequência de região variável de SEQ ID NO: 8 eestá unida à região constante κ.

Um fragmento de anticorpo da invenção pode compreenderuma porção suficiente da região constante para permitir adimerização (ou multimerização) de cadeias pesadas que têmcapacidade de ligação dissulfeto reduzida, por exemplo ondepelo menos uma das cisternas de dobradiça normalmenteenvolvidas na ligação dissulfeto inter-cadeia pesada é alterada conforme descrito no presente documento. Noutraforma de realização, um fragmento de anticorpo, por exemploum que contém a região Fc, retém pelo menos uma das funçõesbiológicas normalmente associadas com a região Fc quandopresente num anticorpo intato, tal como ligação FcRn,modulação da semivida de anticorpos, função ADCC(citotoxicidade celular dependente de anticorpo), e/ouligação de complemento (por exemplo, onde o anticorpo temum perfil de glicosilação necessário para a função ADCC ouligação de complemento). 0 termo anticorpo "quimérico" refere-se a anticorposnos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idênticaou homóloga a sequências correspondentes em anticorposderivados a partir de uma espécie particular ou pertencendoa uma classe ou subclasse particular de anticorpos,enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogoàs sequências correspondentes em anticorpos derivados apartir de outra espécie ou pertencendo a outra classe ousubclasse de anticorpos, bem como fragmentos dos taisanticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada(veja-se por exemplo, a patente. U.S. N. ° 4.816.567 eMorrison et ai., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6851-6855).

Conforme utilizado no presente documento, o termo"anticorpo humanizado" refere-se a formas de anticorpos quecontêm sequências a partir de anticorpos não humanos (porexemplo, murinos) bem como anticorpos humanos. Taisanticorpos contêm sequência minima derivada a partir deimunoglobulina não humana. Geralmente, o anticorpohumanizado irá compreender substancialmente todos de pelomenos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quaistodas ou substancialmente todas as ansas hipervariáveiscorrespondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ousubstancialmente todas as regiões FR são as de umasequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção deuma região constante (Fc) de uma imunoglobulina,tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. As formashumanizadas de anticorpos de roedores compreenderãoessencialmente as mesmas sequências de CDR dos anticorposde roedor parentais, embora possam ser incluídasdeterminadas substituições de aminoácidos para aumentar aafinidade, aumentar a estabilidade do anticorpo humanizado,ou por outros motivos. Contudo, já que as ansas de CDR nãoresultam uniformemente num anticorpo com as mesmaspropriedades de ligação que o anticorpo original, podemtambém ser introduzidas alterações dos resíduos estruturais(FR) , resíduos envolvidos no suporte das ansas de CDR, emanticorpo humanizados para conservar a afinidade de ligaçãoa antigénio (Rabat et al., 1991, J. Immunol. 147, 1709). O termo "anticorpo" também inclui anticorpos"totalmente humanos", isto é, anticorpos que compreendemsomente sequências proteicas de imunoglobulina. Umanticorpo totalmente humano pode conter cadeias de hidratosde carbono de ratinho se produzido num ratinho, numa célulade ratinho, ou num hibridoma derivado a partir de umacélula de ratinho. De forma semelhante, "anticorpo deratinho" ou "anticorpo de rato" refere-se a um anticorpoque compreende somente sequências de imunoglobulina deratinho ou de rato, respetivamente, um anticorpo totalmentehumano pode ser gerado num ser humano, num animaltransgénico tendo sequências de linha germinal deimunoglobulina humana, através de exibição em fagos ououtros métodos biológicos moleculares. Igualmente, podemtambém ser fabricadas imunoglobulinas recombinantes emratinhos transgénicos. Veja-se Mendez et ai., 1997, NatureGenetics 15,146-156. Veja-se também as tecnologias Abgenixe Medarex.

Os anticorpos da presente invenção incluem tambémanticorpos com regiões Fc modificadas (ou bloqueadas) para proporcionar funções efetoras alteradas. Veja-se, porexemplo, Patentes U.S. N.° 5.624.821; W02003/086310;W02 005/120571; W02006/0057702; Presta, 2006, Adv. DrugDelivery Rev. 58:640-656. Tal modificação pode serutilizada por potenciar ou suprimir várias reações dosistema imune, com possíveis efeitos benéficos emdiagnóstico e terapêutica. Alterações da região Fc incluemalterações de aminoácidos (substituições, eliminações einserções), glicosilação e desglicosilação, e adição demúltiplas Fc. As alterações a Fc podem também alterar asemivida dos anticorpos em anticorpos terapêuticos, e umasemivida mais longa resultaria em dosagem menos frequente,com a conveniência aumentada concomitante e diminuição dautilização do material. Veja-se Presta, 2005, J. AllergyClin. Immunol.116, 731 a 734-35.

Os anticorpos da presente invenção incluem tambémanticorpos com regiões Fc intatas que proporcionam funçõesefetoras completas, por exemplo anticorpos de isotipo IgGl,que induzem citotoxicidade dependente de complemento (CDC)ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) nacélula visada.

Os anticorpos podem também ser conjugados (por exemplo,ligados covalentemente) a moléculas que melhoram aestabilidade do anticorpo durante o armazenamento ouaumentam a semivida do anticorpo in vivo. Exemplos demoléculas que aumentam a semivida são albumina (porexemplo, albumina sérica humana) e polietilenoglicol (PEG).Podem ser preparados derivados de anticorpo ligados aalbumina e PEGuilados utilizando técnicas bem conhecidas natécnica. Veja-se, por exemplo, Chapman, 2002, Adv. DrugDeliv. Rev. 54, 531-545; Anderson e Tomasi, 1988, J.Immunol. Methods 109, 37-42; Suzuki et al., 1984, Biochim.Biophis. Acta 788, 248-255; e Brekke e Sandlie, 2003,Nature Rev. 2, 52-62.

Os anticorpos utilizados na presente invenção ligarão habitualmente com pelo menos uma KD de cerca de 10“3 M, maishabitualmente pelo menos 10“6 M, tipicamente pelo menos IO"7M, mais tipicamente pelo menos 10”8 M, preferivelmente pelomenos cerca de 10“9 M, e mais preferivelmente pelo menos 10”10 M, e ainda mais preferivelmente pelo menos 10”11 M. Veja-se, por exemplo, Presta, et al., 2001, Thromb. Haemost. 85,379-389; Yang, et al., 2001, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 38,17-23; Carnahan, et al., 2003, Clin. Cancer Res. (Suppl.) 93982s-3990s. As afinidades de anticorpos podem serdeterminadas utilizando análise padrão. O termo "região hipervariável", conforme utilizado nopresente documento, refere-se aos resíduos de aminoácido deum anticorpo que são responsáveis pela ligação a antigénio.A região hipervariável compreende resíduos de aminácido apartir de uma "região de determinação de complementaridade"ou "CDR" definida por alinhamento de sequências, porexemplo os resíduos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) nodomínio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; veja-seKabat et al., 1991, Sequences of proteins of ImmunologicalInterest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutesof Health, Bethesda, Md. e/ou os resíduos a partir de uma"ansa hipervariável" (HVL) , conforme definidoestruturalmente, por exemplo, os resíduos 26-32 (Ll), 50-52(L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável decadeia pesada; veja-se Chothia e Leskl, 1987, J. Mol. Biol.196, 901-917. Resíduos "estruturais" ou "FR" são aquelesresíduos do domínio variável que não os resíduos da regiãohipervariável como aqui definido.

Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado eseparado e/ou recuperado a partir de um componente do seuambiente natural. Componentes contaminantes do seu ambientenatural são materiais que poderiam interferir comutilizações diagnósticas ou terapêuticas para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormonas, e outros solutosproteinicos ou não proteinicos. Nalgumas formas derealização, o anticorpo será purificado (1) até mars do que95% em peso de anticorpo conforme determinado através dométodo de Lowry, e mais preferivelmente mars do que 99% empeso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15residuos de N-terminal ou sequência de aminoácidos internaatravés da utilização de um sequenciador de copo rotatório,ou (3) até à homogeneidade através de SDS-PAGE sobcondições redutoras ou não redutoras utilizando azul deCoomassie ou, preferivelmente, coloração de prata.Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro decélulas recombinantes já que pelo menos um componente doambiente natural do anticorpo não estará presente.Vulgarmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparadoatravés de pelo menos uma etapa de purificação.

Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é umamolécula de ácido nucleico que é identificada e separada apartir de pelo menos uma molécula de ácido nucleicocontaminante com a qual está vulgarmente associada na fontenatural do ácido nucleico do anticorpo. Uma molécula deácido nucleico isolada é outra que não na forma ouconfiguração na qual é encontrada na natureza. Moléculas deácido nucleico isoladas são como tal distinguidas damolécula de ácido nucleico conforme existe em célulasnaturais. Contudo, uma molécula de ácido nucleico isoladainclui uma molécula de ácido nucleico contida em célulasque vulgarmente expressam o anticorpo onde, por exemplo, amolécula de ácido nucleico se encontra numa localizaçãocromossómica diferente da de células naturais. 0 termo "anticorpo monoclonal" conforme utilizado nopresente documento refere-se a um anticorpo obtido a partirde uma população de anticorpos substancialmente homogéneos,isto é, os anticorpos individuais compreendendo a populaçãosão idênticos exceto para possiveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades minimas.Os anticorpos monoclonais são altamente específicos,estando direcionados contra um sitio antigénico único. Alémdisso, em contraste com preparações de anticorposconvencionais (policlonais) que incluem tipicamentediferentes anticorpos direcionados contra diferentesdeterminantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal estádirecionado contra um único determinante no antigénio. 0modificador "monoclonal" indica o carácter do anticorpocomo sendo obtido a partir de uma população de anticorpossubstancialmente homogéneos, e não deve ser interpretadocomo necessitando a produção do anticorpo por nenhum métodoparticular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais paraserem utilizados de acordo com a presente invenção podemser fabricados através do método de hibridoma primeiramentedescrito por Kohler et al., 1975, Nature 256, 495, ou podemser fabricados através de métodos de ADN recombinante(veja-se, por exemplo, o documento de patente U.S. N°.4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" também podem serisolados a partir de bibliotecas de anticorpos em fagosutilizando as técnicas descritas em Clackson et al., 1991,Nature 352, 624-628 e Marks et al., 1991, J. Mol. Biol.222, 581-597, por exemplo. Os anticorpos monoclonais nopresente documento incluem especificamente anticorpos"quiméricos".

Conforme utilizado no presente documento, o termo"célula imune" inclui células que são de origemhematopoiética e que desempenham um papel na respostaimune. Células imunes incluem linfócitos, tais como célulasB e células T; células natural killer; células mieloides,tais como monócitos, macrófagos, eosinófilos, mastócitos,basófilos, e granulócitos.

Conforme utilizado no presente documento, um"imunoconjugado" refere-se a um anticorpo anti-APRIL, ou umfragmento do mesmo, conjugado com uma fração terapêutica, tal como uma toxina bacteriana, um fármaco citotóxico ouuma radiotoxina. Podem ser conjugadas frações tóxicas comos anticorpos da invenção utilizando métodos disponíveis natécnica.

Conforme utilizado no presente documento, uma"variante" de sequência refere-se a uma sequência quedifere da sequência divulgada em um ou mais resíduos deaminoácido mas que retém a atividade biológica da molécularesultante. "Variantes modificadas conservativamente" ou"substituição de aminoácidos conservativa" refere-se asubstituições de aminoácidos que são conhecidas para osperitos na especialidade e podem ser feitas geralmente semalterar a atividade biológica da molécula resultante. Osperitos na especialidade reconhecem que, em geral,substituições de um único aminoácido em regiões nãoessenciais de um polipéptido não alteram substancialmente aatividade biológica (veja-se, por exemplo, Watson, et al.,Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub.Co., p. 224 (4a Edição 1987)). Tais substituiçõesexemplares são preferivelmente realizadas de acordo com asestabelecidas abaixo conforme segue:

Substituições de Aminoácido Conservativas Exemplares

Conforme utilizado no presente documento, o termo"cerca de" refere-se a um valor que se encontra dentro deum intervalo de erro aceitável para o valor particularconforme determinado por um perito na especialidade, quedependerá em parte de como o valor é medido ou determinado,isto é, as limitações do sistema de medição. Por exemplo,"cerca de" pode significar dentro de 1 ou mais de 1 desviopadrão segundo a experiencia na técnica. Alternativamente,"cerca de" ou "compreendendo essencialmente de" podesignificar um intervalo de até 20%. Além disso,particularmente em relação a sistemas ou processosbiológicos, os termos podem significar até uma ordem demagnitude ou ate 5 vezes um valor. Quando sãoproporcionados valores particulares no pedido ereivindicações, a menos que indicado o contrário, osignificado de "cerca de" ou "compreendendo essencialmentede" deve ser assumido como encontrando-se dentro de umintervalo de erro aceitável para esse valor particular.

Liga "especificamente", quando referindo umligando/recetor, anticorpo/antigénio, ou outro par ligante,indica uma reação de ligação que é determinante da presença da proteína, por exemplo, APRIL, numa população heterogéneade proteínas e/outros produtos biológicos.Consequentemente, sob condições designadas, umligando/antigénio especificado liga a um recetor/anticorpoparticular e não liga numa quantidade significativa aoutras proteínas presentes na amostra. "Administração" e "tratamento", conforme aplicado a umanimal, ser humano, sujeito experimental, célula, tecido,órgão, ou fluido biológico, refere-se a contacto de umfarmacêutico exógeno, terapêutico, agente diagnóstico, oucomposição ao animal, ser humano, indivíduo, célula,tecido, órgão, ou fluido biológico. "Administração" ou"tratamento" pode referir-se, por exemplo, a métodosterapêuticos, farmacocinéticos, diagnóstico, de pesquisa, eexperimentais. 0 tratamento de uma célula abrange ocontacto de um reagente com a célula, bem com o contacto deum reagente com um fluido, onde o fluido se encontra emcontacto com a célula. "Administração" e "tratamento"também significa tratamentos in vitro e ex vivo, porexemplo, de uma célula, por parte de um reagente,diagnóstico, composição ligante, ou por parte de outracélula.

Anticorpos Monoclonais

Podem ser fabricados anticorpos monoclonais para APRILhumano de acordo com o conhecimento e a habilidade natécnica de injeção de sujeitos de teste com antigénio APRILhumano e posterior isolamento de hibridomas expressandoanticorpos tendo a sequência desejada de característicasfuncionais. 0 ADN codificando os anticorpos monoclonais éprontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentosconvencionais (por exemplo, utilizando sondas deoligonucleótidos que são capazes de se ligarespecificamente a genes codificando as cadeias pesadas eleves do anticorpo). As células de hibridoma agem como uma fonte preferida do dito ADN. Uma vez isolado, o ADN podeser colocado em vetores de expressão, que, quando sãotransfetados em células hospedeiras, tais como E. colí,células COS simias, células de ovário de hámster chinês(CHO), ou células de mieloma que, de outra forma, nãoproduzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntesede anticorpos monoclonais nas células hospedeirasrecombinantes. A produção recombinante de anticorpos serádescrita em maior detalhe abaixo.

Numa forma de realização adicional, anticorpos oufragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecasde fagos de anticorpos geradas utilizando as técnicasdescritas em McCafferty et al., 1990, Nature, 348, 552-554.Clackson et al., 1991, Nature, 352, 624-628, e Marks etal., 1991, J. Mol. Biol. 222, 581-597 descrevem oisolamento de anticorpos humanos e de ratinho,respetivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaçõessubsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos deafinidade elevada (intervalo nM) através de redistribuiçãode cadeias (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10, 779-783), bem como infeção combinatória e recombinação in vivocomo uma estratégia para construir bibliotecas de fagosmuito grandes (Waterhouse et al., 1993, Nuc. Acids. Res.21,2265-2266). Consequentemente, estas técnicas sãoalternativas viáveis às técnicas de hibridoma de anticorpomonoclonal tradicionais para isolamento de anticorposmonoclonais.

Anticorpos Quiméricos O ADN dos anticorpos pode ser modificado, por exemplo,substituindo a sequência codificante para domíniosconstantes de cadeia pesada e leve humanos em lugar dassequências de ratinho homólogas (Patente U.S. N.°4.816.567; Morrison, et al., 1984, Proc. Nat. Acad. Sei.USA, 81.6851), ou juntando covalentemente à sequência decodificação da imunoglobulina toda ou parte da sequência de codificação para material não imunoglobulínico (porexemplo, domínios proteicos). Tipicamente tal material nãoimunoglobulínico é substituído pelos domínios constantes deum anticorpo, ou é substituído para os domínios variáveisde um sítio de combinação de antigénio de um anticorpo paracriar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo umsítio de combinação de antigénio tendo especificidade paraum antigénio e outro sítio de combinação de antigénio tendoespecificidade para um antigénio diferente.

Anticorpos Humanizados e Humanos

Um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos deaminoácidos a partir de uma fonte que é não humana. Osresíduos de aminoácidos não humanos são frequentementedenominados resíduos "importados", e são recolhidostipicamente a partir de um domínio variável "importado". Ahumanização pode ser geralmente realizada seguindo o métodode Winter e colaboradores (Jones et al., 1986, Nature 321,522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332, 323-327;Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536),substituindo CDRs de roedores ou sequências de CDR pelassequências correspondentes de um anticorpo humano.Consequentemente, tais anticorpos "humanizados” sãoanticorpos em que substancialmente menos de um domíniovariável humano intato foi substituído pela sequênciacorrespondente a partir de uma espécie não humana. Naprática, os anticorpos humanizados são tipicamenteanticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR epossivelmente alguns resíduos de FR são substituídos porresíduos a partir de sítios análogos em anticorpos nãohumanos, por exemplo, de roedores. A escolha de domínios variáveis humanos, tanto levescomo pesados, a ser utilizado na preparação dos anticorposhumanizados é muito importante para reduzir aantigenicidade. De acordo com o método denominado de"melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra toda a biblioteca desequências de dominios variáveis humanas conhecidas. Asequência humana que está mais próxima da do roedor é entãoaceite como a estrutura humana (FR) para o anticorpohumanizado (Sims et al. 1987, J. Immunol. 151,2296; Chothiaet al., 1987, J. Mol. Biol. 196, 901). Outro método utilizauma estrutura particular derivada da sequência de consensode todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular decadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser usadapara vários anticorpos humanizados diferentes (Carter etal. 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 4285; Presta etal., 1993, J. Immnol. 151,2623). É adicionalmente importante que os anticorpos sejamhumanizados com retenção de afinidade elevada para oantigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Paraalcançar este objetivo, de acordo com um método preferido,os anticorpos humanizados são preparados através de umprocesso de análise das sequências parentais e váriosprodutos humanizados conceptuais utilizando modelostridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Osmodelos de imunoglobulinas tridimensionais estão comummentedisponíveis e são familiares àqueles peritos naespecialidade. Estão disponíveis programas informáticos queilustram e exibem estruturas conformacionaistridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulinascandidatas selecionadas. A inspeção destas apresentaçõespermite a análise do papel provável dos resíduos nofuncionamento da sequência de imunoglobulina candidata,isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidadeda imunoglobulina candidata para ligar ao seu antigénio.Desta maneira, os resíduos FR podem ser selecionados e sercombinados a partir do recetor e de sequências importadasde modo que a que a característica de anticorpo desejada,tal como afinidade aumentada para o(s) antigénio (s) alvo,seja alcançada. Geralmente, os resíduos de CDR estão diretamente e muito substancialmente envolvidos nainfluência da ligação ao antigénio. A humanização de anticorpos é uma tarefa demanipulação proteica simples. Quase todos os anticorpos deratinho podem ser humanizados através de enxerto de CDR,resultando na retenção da ligação ao antigénio. Veja-se,Lo, Benny, K.C., editor, em Antibody Engineering: Methodsand Protocols, volume 248, Humana Press, Nova Jérsia, 2004.

Alternativamente, é agora possivel produzir animaistransgénicos (por exemplo, ratinhos) que são capazes, apósimunização, de produzir um repertório completo deanticorpos humanos na ausência de produção deimunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que aeliminação homozigótica do gene da região de junção (JH) dacadeia pesada de um anticorpo em ratinhos mutantesquiméricos e de linha germinal resulta na inibição completada produção de anticorpos endógena. A transferência dacoleção de genes de imunoglobulinas germinais humanos emtais ratinhos mutantes germinais resultará na produção deanticorpos humanos após desafio antigénico. Veja-se, porexemplo, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 90, 2551; Jakobovits et al., 1993, Nature 362, 255-258;Bruggermann et al., 1993, Year in Immunology 7, 33; eDuchosal et al., 1992, Nature 355, 258. Também podem serderivados antigénios humanos a partir de bibliotecas deexibição de fagos (Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol.227.381; Marks et al., J. Mol. Biol. 1991,222, 581-597;Vaughan et al., 1996, Nature Biotech 14, 309).

As variantes da sequência de anticorpos anti-APRILhumanizados são preparadas através da introdução dealterações nucleotidicas adequadas nos ADNs dos anticorposanti-APRIL humanizados, ou através de sintese peptidica.Tais variantes incluem, por exemplo, eliminações a partirde, e/ou inserções em, e/ou substituições de, residuosdentro da sequência de aminoácidos mostrada para os anticorpos anti-APRIL humanizados. Qualquer combinação deeliminação, inserção, e substituição é feita chegar àconstrução final, desde que a construção final possua ascaracteristicas desejadas. As alterações de aminoácidostambém podem alterar processos pós-traducionais dosanticorpos anti-APRIL humanizados, tais como alterar onúmero ou posição de sítios de glicosilação.

Um método útil para a identificação de determinadosresíduos ou regiões dos polipéptidos dos anticorpos anti-APRIL humanizados que são localizações preferidas paramutagénese é denominado "mutagénese dirigida com alanina"conforme descrito por Cunningham e Wells, 1989, Science244, 1081-1085. Aqui, é identificado um resíduo ou grupo deresíduos alvo (por exemplo, resíduos com carga tais comoArg, Asp, His, Lys, e Glu) e substituídos por um aminoácidoneutro ou com carga negativa (mais preferivelmente alaninaou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos como antigénio APRIL. Os resíduos de aminoácidos demonstrandosensibilidade funcional às substituições são entãorefinadas através da introdução de mais ou outras variantesnos, ou para os, sítios de substituição. Consequentemente,enquanto o sítio para introdução da variação na sequênciade aminoácidos é predeterminado, a natureza da mutação perse não necessita ser predeterminada. Por exemplo, paraanalisar o rendimento de uma mutação num local dado, érealizado rastreio por Ala ou mutagénese aleatória no codãoou região alvo e as variantes dos anticorpos anti-APRILhumanizados expressas são rastreadas para a atividadedesej ada.

Vulgarmente, as variantes de sequências de aminoácidosdos anticorpos anti-APRIL humanizados terão uma sequênciade aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade desequência de aminoácidos com as sequências de aminácidosdos anticorpos humanizados originais tanto da cadeia pesadacomo leve, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelomenos 90%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, 98%ou 99%. Identidade ou homologia relativamente a estasequência é definida no presente documento como apercentagem de residuos de aminoácido na sequênciacandidata que são idênticos aos residuos humanizados, apósalinhamento das sequências e introdução de intervalos, senecessário, para alcançar a máxima percentagem deidentidade de sequência, e não considerando quaisquersubstituições conservativas como parte da identidade dasequência. Nenhuma das extensões, eliminações ou inserçõesem N-terminal, C-terminal, ou internas, *** na sequência doanticorpo devem ser interpretadas como afetando aidentidade ou homologia de sequência.

Podem ser rastreados anticorpos tendo ascaracteristicas identificadas no presente documento comosendo desejáveis em anticorpos anti-APRIL humanizados paraatividade biológica inibidora in vitro ou afinidade deligação adequada. Para rastrear anticorpos que ligam aosepitopos BCMA ou TACI em APRIL humano ligados através de umanticorpo de interesse (por exemplo, aqueles que bloqueiama ligação de APRIL), pode ser realizado um ensaio debloqueio cruzado de rotina tal como o descrito emAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Ed Harlow e David Lane (1988). Anticorpos queligam ao mesmo epitopo são propensos a bloqueio cruzado emtais rastreios, mas não todos os anticorpos com bloqueiocruzado ligarão necessariamente precisamente ao mesmoepitopo já que o bloqueio cruzado pode resultar a partir doimpedimento estérico da ligação dos anticorpos por parte deanticorpos ligando a epitopos sobrepostos, ou inclusivepróximos a epitopos não sobrepostos.

Alternativamente, pode ser realizado mapeamento deepitopos, por exemplo, conforme descrito em Champe et al.,1995, J. Biol. Chem. 270, 1388-1394, para determinar se o anticorpo se liga a um epítopo de interesse. Pode tambémser utilizada "Mutagénese por rastreio de alanina",conforme descrito por Cunningham e Wells, 1989, Science244, 1081-1085, ou alguma outra forma de mutagénese pontualde resíduos de aminoácidos em APRIL humano para determinaro epítopo funcional para anticorpos anti-APRIL da presenteinvenção.

Podem ser obtidos anticorpos adicionais ligando ao mesmoepítopo que um anticorpo da presente invenção, por exemplo,através de rastreio de anticorpos criados contra APRIL paraligar ao epítopo, ou através de imunização de um animal comum péptido compreendendo um fragmento de APRIL humanocompreendendo as sequências de epítopo (por exemplo, BCMAou TACI). Pode ser esperado que os anticorpos que ligam aomesmo epítopo funcional exibam atividades biológicassemelhantes, tais como bloqueio da ligação a recetores, etais atividades podem ser confirmadas através de ensaiosfuncionais dos anticorpos.

As afinidades de anticorpos podem ser determinadasutilizando análise padrão. Compostos ligantes preferidostais como por exemplo anticorpos humanizados são aquelesque ligam a APRIL humano com um valor de Kd de não mais doque cerca de lxlO"7; preferivelmente não mais do que cercade lxlO-8; mais preferivelmente não mais do que cerca delxlO"9; e mais preferivelmente não mais do que cerca delxlO"10 ou inclusive lxlO"11 M. O anticorpo humanizado pode ser selecionado a partirde qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG,IgD, IgA, e IgE. Preferivelmente, o anticorpo é umanticorpo IgG. Pode ser utilizado qualquer isotipo de IgG,incluindo IgGi, IgG2, IgG3, e IgG4. São também contempladasvariantes dos isotipos de IgG. O anticorpo humanizado podecompreender sequências a partir de mais de uma classe ouisotipo. A otimização das sequências de domínio constantenecessárias para gerar a atividade biológica desejada é prontamente alcançada através de rastreio dos anticorposnos ensaios biológicos descritos nos Exemplos.

Igualmente, pode ser utilizada qualquer classe de cadeialeve nas composições e métodos no presente documento.Especificamente, capa, lambda, ou variantes dos mesmos sãoúteis na presente composição e métodos.

Os anticorpos e fragmentos de anticorpos da invençãopodem também ser conjugados com cargas úteis citotóxicastais como agentes citotóxicos ou radionucleótidos tais como99Tc, 90Y, 114In, 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, nC, 150, 13N, 18F, 35S,51Cr, 57To, 226Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152Eu, 67CU, 217Ci, 211At,212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th, e 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr e 56Fe. Taisconjugados de anticorpos podem ser utilizados emimunoterapêutica para visar e matar seletivamente célulasexpressando um alvo (o antigénio para tal anticorpo) na suasuperfície. Agentes citotóxicos exemplares incluem ricina,alcaloide da vinca, metotrexato, exotoxina de Pseudomonas,saporina, toxina da difteria, cisplatina, doxorrubicina,toxina de abrina, gelonina e proteína antiviral detintureira.

Os anticorpos e fragmentos de anticorpos da invenção podemtambém ser conjugados com etiquetas fluorescentes ouquimioluminescentes, incluindo fluoróforos tais comoquelatos de terras raras, fluoresceína e os seus derivados,rodamina e os seus derivados, isotiocianato, ficoeritrina,ficocianina, aloficocianina, o-ftalaldeído, fluorescamina, 152

Eu, dansilo, umbeliferona, lucifenna, etiqueta luminal,etiqueta isoluminal, uma etiqueta de éster de acridínioaromático, uma etiqueta de imidazol, uma etiqueta de sal deacridímio, uma etiqueta de éster de oxalato, uma etiquetade aequorina, 2,3-diidroftalazinodionas, biotina/avidina,etiquetas de spin e radicais livres estáveis.

Pode ser empregue qualquer método conhecido na técnica paraconjugar as moléculas de anticorpos ou moléculas proteicasda invenção com as várias frações, incluindo os métodos descritos por Hunter et al., 1962, Nature 144, 945; David et al., 1974, Biochemistry 13,1014; Pain et al., 1981, J.Immunol. Meth. 40, 219; e Nygren, J., 1982, Histochem. and

Cytochem. 30, 407. Métodos para conjugar anticorpos e proteínas são convencionais e bem conhecidos na técnica.Purificação de Anticorpos

Ao utilizar técnicas recombinantes, o anticorpo podeser produzido intracelularmente, no espaço periplásmico, oudiretamente segregado para o meio. Se o anticorpo éproduzido intracelularmente, como primeira etapa, osdetritos particulados, tanto células hospedeiras comofragmentos lisados, são removidos, por exemplo, através decentrifugação ou ultrafiltração. Carter et al., 1992,Bio/Technology 10, 63-167 descrevem um procedimento para isolar anticorpos que são segregados para o espaçoperiplásmico de E. coli. Brevemente, é descongelada pastacelular na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA, efluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante cerca de 30min. Os detritos celulares podem ser removidos através decentrifugação. Quando o anticorpo é segregado para o meio,os sobrenadantes a partir de tais sistemas de expressão sãogeralmente primeiro concentrados utilizando um filtro deconcentração de proteína comercialmente disponível, porexemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou MilliporePellicon. Um inibidor de proteases, tal como PMSF, pode serincluído em qualquer das etapas anteriores para inibir aproteólise e podem ser incluídos antibióticos para preveniro crescimento de contaminantes adventícios. A composição de anticorpos preparada a partir dascélulas pode ser purificada utilizando, por exemplo,cromatografia de hidroxiapatita, eletroforese em gel,diálise, e cromatografia de afinidade, com a cromatografiade afinidade sendo a técnica de purificação preferida. Aadequabilidade da proteína A como ligando de afinidadedepende da espécie e isotipo de qualquer região Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. Pode serutilizada Proteina A para purificar anticorpos que sãobaseados nas cadeias pesadas gama 1, gama 2, ou gama 4humanas (Lindmark et al., 1983, J. Immunol. Meth. 62, 1-13) . A Proteina G é recomendada para todos os isotipos deratinho e para gama 3 humana (Guss et al., 1986, EMBO J 5,1567-1575) . A matriz à qual o ligando de afinidade estáligado é, muito frequentemente, agarose, mas outrasmatrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamenteestáveis, tais como vidro de porosidade controlada oupoli(estirenodivinil)benzeno, permitem taxas de fluxo maisrápidas e tempos de processamento mais curtos que os quepodem ser alcançados com agarose. Onde o anticorpocompreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T.Baker, Phillipsburg, N.J.) é útil para purificação. Outrastécnicas para purificação proteica tais como fracionamentonuma coluna de permuta iónica, precipitação com etanol,HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica,cromatografia em heparina SEPHAROSE™, cromatografia numaresina de permuta aniónica ou catiónica (tal como umacoluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE, eprecipitação com sulfato de amónio, estão tambémdisponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.

Numa forma de realização, a glicoproteína pode serpurificada utilizando adsorção num substrato de lecitina(por exemplo uma coluna de afinidade de lecitina) pararemover glicoproteína contendo fucose a partir dapreparação e como tal enriquecer para glicoproteína isentade fucose.

Formulações Farmacêuticas A invenção compreende formulações farmacêuticas de umcomposto ligante a APRIL. Para preparar composiçõesfarmacêuticas ou estéreis, o anticorpo ou fragmento domesmo é misturado com um portador ou excipientefarmaceuticamente aceitável, veja-se, por exemplo,

Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia:National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA(1984). Podem ser preparadas formulações de agentesterapêuticos e diagnósticos misturando com portadores,excipientes, ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveisna forma de, por exemplo, pós liofilizados, pastas,soluções aquosas ou suspensões (veja-se, por exemplo,Hardman, et al., 2001, The Pharmacological Basis ofTherapeutics de Goodman e Gilman, McGraw-Hill, Nova Iorque,NI; Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice ofPharmacy, Lippincott, Williams, e Wilkins, Nova Iorque, NI;Avis, et al. (eds.), 1993, Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications, Marcel Dekker, NI; Lieberman, etal. (eds.), 1990, Pharmaceutical Dosage Forms: Comprimidos,Marcel Dekker, NI; Lieberman, et al. (eds.), 1990,Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, MarcelDekker, NI; Weiner e Kotkoskie, 2000, Excipient Toxicityand Safety, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, NI). A toxicidade e eficácia terapêutica das composições deanticorpos, administrada por si só ou em combinação com umagente imunossupressor, pode ser determinada através deprocedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ouanimais experimentais, por exemplo, para determinar a DL5o(a dose letal para 50% da população) e a DE50 (a doseterapeuticamente eficaz em 50% da população) . A razão dadose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o indiceterapêutico e pode ser expresso como a razão entre DL50 eDE50. Os dados obtidos a partir destes ensaios de culturascelulares e estudos animais adicionais podem ser utilizadosna formulação de um intervalo de dosagem para utilização emseres humanos. A dosagem de tais compostos estápreferivelmente num intervalo de concentrações circulantesque incluem a DE50 com pouca ou nenhuma toxicidade. Adosagem pode variar dentro deste intervalo dependendo daforma farmacêutica empregue e da via de administração utilizada.

Vias de administração adequadas incluem administraçãoparentérica, tal como administração intramuscular,intravenosa, ou subcutânea e administração oral. Aadministração de um anticorpo utilizado na composiçãofarmacêutica ou para praticar o método da presente invençãopode ser levada a cabo numa variedade de formasconvencionais, tais como ingestão oral, inalação, aplicaçãotópica ou injeção cutânea, subcutânea, intraperitoneal,parentérica, intraarterial ou intravenosa. Numa forma derealização, o composto ligante da invenção é administradopor via intravenosa. Noutra forma de realização, o compostoligante da invenção é administrado por via subcutânea.

Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado deforma local em vez de sistémica, por exemplo, através deinjeção do anticorpo diretamente no sitio de ação,frequentemente num depósito ou formulação de libertaçãosustentada. Além disso, o anticorpo pode ser administradonum sistema de administração de fármaco visada.

Encontra-se disponível orientação relativa à seleçãode doses adequadas de anticorpos, citoquinas, e moléculaspequenas (veja-se, por exemplo, Wawrzynczak, 1996, AntibodyTherapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, ReinoUnido; Kresina (ed.), 1991, Monoclonal Antibodies,

Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nova Iorque, NI;

Bach (ed.), 1993, Monoclonal Antibodies and Peptide Therapyin Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nova Iorque, NI;

Baert, et al., 2003, Nova Ingl. J. Med. 348, 601-608;Milgrom, et al., 1999, Nova Ingl.. J. Med. 341, 1966-1973;Slamon, et al., 2001, Nova Ingl. J. Med. 344, 783-792;Beniaminovitz, et al., 2000, Nova Ingl. J. Med. 342, 613-619; Ghosh, et al., 2003, Nova Ingl. J. Med. 348, 24-32;

Lipsky, et al., 2000, Nova Ingl. J. Med. 343, 1594-1602). A determinação da dose adequada é realizada por partedo clínico, por exemplo, utilizando parâmetros ou fatores conhecidos ou suspeitos na técnica como afetando otratamento ou previstos como afetando o tratamento. De ummodo geral, a dose começa com uma quantidade algo menor doque a dose ótima e é aumentada através de pequenos aumentosposteriores até ser alcançado o efeito desejado ou ótimorelativamente a quaisquer efeitos secundários. Medidasdiagnósticas importantes incluem aquelas de sintomas de,por exemplo, inflamação ou nivel de citoquinasinflamatórias produzidas.

Um protocolo de dose preferido é um envolvendo a dosemáxima ou frequência de dose que evita efeitos secundáriosindesejáveis significativos. Uma dose semanal total égeralmente pelo menos 0,05 mg/kg de massa corporal, maisgeralmente pelo menos 0,2 mg/kg, ainda mais geralmente pelomenos 0,5 mg/kg, tipicamente pelo menos 1 mg/kg, maistipicamente pelo menos 10 mg/kg, ainda mais tipicamentepelo menos 100 mg/kg, preferivelmente pelo menos 0,2 mg/kg,mais preferivelmente pelo menos 1,0 mg/kg, ainda maispreferivelmente pelo menos 2,0 mg/kg, otimamente pelo menos10 mg/kg, mais otimamente pelo menos 25 mg/kg, e ainda maisotimamente pelo menos 50 mg/kg (veja-se, por exemplo, Yang,et al.r 2003, Nova Ingl. J. Med. 349, 427-434; Herold, etal., 2002, Nova Ingl. J. Med. 346, 1692-1698; Liu, et al.,1999, J.

Neurol. Neurosurg. Psych. 67, 451-456; Portielji, etal., 2003, Cancer Immunol. Immunother. 52, 133-144). A dosedesejada de um terapêutico de molécula pequena, porexemplo, um mimético de péptido, produto natural, ouquímico orgânico, é aproximadamente a mesma para umanticorpo ou polipéptido, numa base mol/kg.

Conforme utilizado no presente documento, "inibir" ou"tratar" ou "tratamento" inclui um adiamento dodesenvolvimento dos sintomas associados com doença e/ou umaredução da gravidade de tais sintomas que irão ou sãoesperados como sendo desenvolvidos com tal doença. Os termos incluem adicionalmente melhoria de sintomasexistentes, prevenção de sintomas adicionais, e melhoria ouprevenção das causas subjacentes de tais sintomas.Consequentemente, os termos denotam que foi conferido umresultado benéfico num individuo vertebrado com uma doença.

Conforme utilizado no presente documento, o termo"quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz"refere-se a uma quantidade de um anticorpo anti-APRIL ou umfragmento do mesmo, que quando administrado por si só ou emcombinação com um agente terapêutico adicional a umacélula, tecido, ou individuo para prevenir ou melhorar adoença ou condição a ser tratada. Uma dose terapeuticamenteeficaz refere-se adicionalmente àquela quantidade docomposto suficiente para resultar na melhoria dos sintomas,por exemplo, tratamento, cura, prevenção ou melhoria dacondição médica relevante, ou um aumento da taxa detratamento, cura, prevenção ou melhoria de tais condições.Quando aplicado a um ingrediente ativo individualadministrado por si só, uma dose terapeuticamente eficazrefere-se somente a esse ingrediente. Quando aplicado a umacombinação, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se aquantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultamno efeito terapêutico, quer administrados em combinação, emsérie ou simultaneamente. Uma quantidade eficaz deterapêutico diminuirá os sintomas tipicamente por pelomenos 10%, habitualmente por pelo menos 20%;preferivelmente pelo menos cerca de 30%; maispreferivelmente pelo menos 40%, e mais preferivelmente porpelo menos 50%.

Métodos para coadministração ou tratamento com umsegundo agente terapêutico são bem conhecidos na técnica,veja-se, por exemplo, Hardman, et al. (eds.), 2001, ThePharmacological Basis of Therapeutics de Goodman e Gilman,10a ed., McGrawHill, Nova Iorque, NI; Poole e Peterson(eds.), 2001, Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A

Practical Approach, Lippincott, Williams e Wilkins, Phila.,PA; Chabner e Longo (eds.), 2001, Cancer Chemotherapy and

Biotherapy, Lippincott, Williams e Wilkins, Phila., PA. A composição farmacêutica da invenção pode tambémconter outro agente, incluindo mas não limitado a agentecitotóxico, quimioterapêutico, citostático, anti-angiogénico ou antimetabolito, um agente orientado a tumor,um agente imunoestimulante ou imunomodulador ou umanticorpo conjugado a um agente citotóxico, citostático, oude outra forma tóxico. A composição farmacêutica podetambém ser empregue com outras modalidades terapêuticastais como cirurgia, quimioterapia e radiação.

Utilizações Terapêuticas para o Anticorpo e Fragmentos deAnticorpo da Invenção

Os anticorpos e fragmentos de ligação a antigénio dainvenção, que ligam especificamente a APRIL humano, podemser utilizados para tratar várias doenças nas quais aatividade de APRIL é central para a patologia. Amplamentefalando isto inclui cancro, autoimunidade, doençasinflamatórias e potencialmente esclerose múltipla, umadoença do SNC.

Cancro 0 anticorpo ou fragmentos de ligação a antigénio dainvenção que ligam especificamente a APRIL podem serutilizados para tratar o cancro. Cancros preferidos cujocrescimento e sobrevivência podem ser inibidos pelainvenção incluem quaisquer cancros conhecidos comoexpressando APRIL e dependendo do mesmo para sinaisproliferativos. Exemplos não limitantes de tais cancrosincluem várias malignidades de células B, tais comoLeucemia Linfocítica Crónica (CLL), Mieloma Múltiplo,linfoma de Hodgkin e linfoma não Hodgkin incluindo linfomade Burkitt e linfoma de células B grandes difuso, e tambémpotencialmente vários tumores sólidos tais comoglioblastomas, onde a expressão de APRIL foi relatada.

Os compostos ligantes da invenção podem ser utilizadospor si só ou em combinação com outros agentes anti cancro,tais como reagentes quimioterapêuticos ou outros agentesbiológicos. Adicionalmente a invenção inclui malignidadesrefratárias ou recorrentes ou tratamento de metástasesderivadas a partir de qualquer destas malignidades.

Doença Autoimune

Os compostos ligantes da invenção podem ser utilizadospara tratar várias doenças autoimunes, onde a expressão deAPRIL foi mostrada como desempenhando um papel napatologia. Exemplos de tais doenças são Artrite Reumatoide(RA) , Lúpus Eritematoso Sistémico (SLE) e sindrome deSjogren. Adicionalmente, foram encontrados titulos maiselevados do que o normal no soro de pacientes com esclerosemúltipla e também niveis aumentados encontrados nos seusastrocitos. Consequentemente, APRIL é um fator contribuintepara a patologia da doença e o bloqueio terapêutico deAPRIL em MS pode ser benéfico.

Utilizações Não Terapêuticas para o Anticorpo e Fragmentosde Anticorpo da Invenção

As utilizações não terapêuticas para estes anticorposincluem citometria de fluxo, Western blot, ensaio deimunoabsorção enzimática (ELISA), imunohistoquimica.

Os anticorpos desta invenção podem também serutilizados como um reagente de purificação por afinidadeatravés de imobilização a uma coluna de sefarose. 0 anticorpo pode também ser útil em ensaiosdiagnósticos, por exemplo, para detetar a expressão deAPRIL em células específicas, tecidos, ou soro. Paraaplicações diagnósticas, o anticorpo será tipicamenteetiquetado (ou direta ou indiretamente) com uma fraçãodetetável. Estão disponíveis numerosos marcadores que podemser geralmente agrupados nas seguintes categorias: biotina,fluorocromos, radionucleótidos, enzimas, iodo, e etiquetasbiossintéticas.

Os anticorpos da presente invenção podem ser empreguesem qualquer método de ensaio conhecido, tal como ensaios deligação competitiva, ensaios de tipo sandwich diretos eindiretos, e ensaios de imunoprecipitação. Zola, MonoclonalAntibodies. A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press,Inc. 1987). 0 anticorpo pode também ser utilizado para ensaiosdiagnósticos in vivo. De um modo geral, o anticorpo éetiquetado com um radionuclideo de tal forma que oantigénio ou células expressando o mesmo possam serlocalizadas utilizando imunocintilografia ou tomografia deemissão de positrões.

Legendas para as figurasFigura 1 A Figura 1 mostra a reatividade de APRIL e a atividadede bloqueio de BCMA dos sobrenadantes dos hibridomashAPRIL.OlA e hAPRIL.03A. A Figura IA mostra hAPRIL.OlAe hAPRIL.03A ligando a FLAG-hAPRIL capturado por umanticorpo anti-FLAG. 0 anticorpo Aprily-5 foi utilizadocomo controlo positivo. A Figura 1B demonstra que ossobrenadantes dos hibridomas hAPRIL.OlA e hAPRIL.03A, enão Aprily-5 bloqueiam a ligação de FLAG-hAPRIL a BCMA-Fc.

Figura 2 A Figura 2 mostra diferentes características de ligaçãoe bloqueio de recetores dos anticorpos hAPRIL.OlA ehAPRIL.03A purificados. A Figura 2A confirma a ligaçãode hAPRIL.OlA e hAPRIL.03A a FLAG-hAPRIL, capturado porum anticorpo anti-FLAG. A Figura 2B mostra que somentehAPRIL.OlA liga a FLAG-hAPRIL que é capturado por BCMA-Fc. A Figura 2C mostra que hAPRIL.OlA bloqueiatotalmente FLAG-hAPRIL ligando a BCMA-Fc, enquantohAPRIL.03A bloqueia parcialmente esta interação. AFigura 2D demonstra que hAPRIL.OlA e hAPRIL.03Abloqueiam ambos totalmente FLAG-hAPRIL com TACI-Fc.

Figura 3 A Figura 3 mostra os ELISAs de bloqueio do recetor parahAPRIL.OlA, hAPRIL.03A, e 12 anticorpos anti-APRILmonoclonais comercialmente disponíveis. Isto ilustraque hAPRIL.OlA e hAPRIL.03A são únicos na suacapacidade de bloquear a ligação de APRIL a BCMA(Figura 3A) e TACI (Figura 3B).

Figura 4

A Figura 4 mostra que hAPRIL.OlA e hAPRIL.03A bloqueiama proliferação de células B conduzida por APRIL e acomutação de classe de isotipos mas não afetamprocessos mediados por BAFF. A Figura 4A é um ensaio decélulas B in vitro que demonstra que os anticorposmonoclonais descritos bloqueiam funções de APRILconhecidas tais como a proliferação e a sobrevivênciade células B e a produção de anticorpos IgA comcomutação de classe. É significativa a demonstração deque ambos anticorpos monoclonais bloqueiam a atividadede APRIL de forma mais eficaz do que TACI-Fc, que foiadministrado a concentração equimolar. A Figura 4B mostra que os anticorpos não afetam respostas de células B conduzidas por BAFF, enquanto TACI-Fcbloqueia estes processos.

Figura 5

A Figura 5 mostra os resultados do direcionamento deAPRIL com hAPRIL.OlA e hAPRIL.03A (painel A) ou TACI-Fc(painel B) in vivo, numa resposta de células B independentes de T. Ratinhos transgénicos foramdesafiados com NP-Ficoll, e tratados com hAPRIL.OlA,hAPRIL.03A e TACI-Fc duas vezes por semana. Foramutilizados PBS e IgGl de ratinho como controlos negativos. Os titulos de imunoglobulina (IgA, IgM eIgG) foram medidos através de ELISA. hAPRIL.OlA,hAPRIL.03A e em menor medida TACI-Fc são capazes deinibir respostas de células B mediadas por APRIL nos ratinhos transgénicos hAPRIL e reduzem os níveis deimunoglobulina aos do WT.

Figura 6 A Figura 6 mostra o efeito do direcionamento de APRILcom hAPRIL.01A, hAPRIL.03A e TACI-Fc em populações decélulas B no baço (painel A) ou cavidade peritoneal(painel B) . Ratinhos transgénicos foram desafiados comNP-Ficoll, e tratados com hAPRIL.01A, hAPRIL.03A, TACI-Fc duas vezes por semana. Foram utilizados PBS e IgGlde ratinho como controlos negativos. Após 30 dias detratamento, foram recolhidos baços e células a partirda cavidade peritoneal e analisados através decitometria de fluxo. O tratamento com hAPRIL.01A ouhAPRIL.03A não afetou a (sub)população de células B nobaço. Em contraste, TACI-Fc reduziu fortemente apopulação de células B totais e subpopulações maduras eT2. Na cavidade peritoneal, TACI-FC afetou a razão decélulas BI contra B2, enquanto hAPRIL.01A e hAPRIL.03Anão afetaram estas subpopulações.

Figura 7 A Figura 7 mostra as sequências de região variável dehAPRIL.01A e hAPRIL.03A. As Figuras 7A e 7B mostram assequências de aminoácidos da sequência variável dacadeia pesada e cadeia leve de hAPRIL.01A, respetivamente. As Figuras 7C e 7D mostram as sequências de aminoácidos da sequência variável dacadeia pesada e cadeia leve de hAPRIL.03A, respetivamente.

Exemplos

Exemplo 1: Imunização e seleção de anticorpos anti-APRIL

Imunização de Ratinhos com ADNc de APRIL

Para gerar anticorpos contra a proteína APRIL humana,foi subclonado um ADNc codificando a grelha de leituraaberta de comprimento completo de APRIL no vetor pCI-neo(Promega, Madison, WI) . A expressão do vetor obtido foi verificada através de transfeção transitória de pCI-neo-hAPRIL em 293 células (American Type Culture Collection,Manassas, VA) e immunoblotting com IgGl Aprily-5 anti-hAPRIL de ratinho (1:5.000) (Alexis, San Diego, CA),seguido por IgGl-HRP anti ratinho de cabra (1:2.000)(Southern Biotechnology, Birmingham, AL).

Foram imunizados ratinhos através de imunização porbiobalística utilizando uma pistola de genes Helios(BioRad, Hercules, CA) e balas de ouro revestidas com ADN(BioRad) seguindo as instruções do fabricante. Brevemente,foram revestidas partículas de ouro de 1 mm com ADNc pCI-neo-hAPRIL a vetores de expressão comerciais para Flt3L deratinho e GM-CSF de ratinho numa razão 2:1:1 (ambos daAldevron, Fargo, ND). Foi utilizado um total de 1 mg de ADNde plasmídeo para revestir 500 mg de balas de ouro.

Especificamente, ratinhos BALB/C fêmea de 7-8 semanasde idade foram imunizados nas orelhas com uma pistola degenes, recebendo 4 ou 5 ciclos de um tiro em ambas orelhas.Aproximadamente, foi detetado um título de anti-hAPRIL1:3.200 através de ELISA em soro de ratinho após trêsimunizações com ADN no ELISA, todas as etapas de incubaçãoforam seguidas por uma etapa de lavagem com PBST (PBS comTween 20 a 0,1%) 3 vezes. Foram revestidas imunoplacasMaxisorp de 96 poços (Nunc, Rochester, NI) com anticorpopoliclonal anti-FLAG de coelho (50 ng/poço em PBS) (Sigma,St. Louis, MO) durante a noite a 4 °C e bloqueadas com Sorode cabra/PBST a 10% durante 1 hora à TA. Foram incubadasplacas com sobrenadante (1:4 em PBS) a partir de células293T transfetadas transitoriamente com forma segregadaconduzida por promotor CMV de FLAG-hAPRIL (pCR3-hAPRIL)durante 1 h à TA, seguido por incubações com diluições desoro de ratinho e IgG anti ratinho de cabra conjugada comHRP a 1:2.000 (Southern Biotechnology) durante 1 hora cadaà TA. Após a lavagem final com PBST, foi visualizadaimunorreatividade de anti-hAPRIL com 100 ml de substrato TMB OptiEIA (BD Biosciences, Franklin Lake, NJ). As reaçõesforam paradas com 100 ml de H2SO4 a 0,5 Me foram lidas asabsorvâncias a 460 e 620 nm. Os ratinhos que demonstraramreatividade contra hAPRIL foram imunizados por uma quartavez final e sacrificados quatro dias depois. Forampreparadas populações de células de baço esgotadas deeritrócitos conforme descrito previamente (Steenbakkers etal., 1992, J. Immunol. Meth. 152: 69-77; Steenbakkers etal., 1994, Mol. Biol. Rep. 19: 125-134) e congeladas a -140°C.

Seleção de células B produzindo anticorpo anti-APRIL

Para selecionado clones de células B produzindoanticorpos anti-APRIL, 1,5 x 107 esplenocitos esgotados deeritrócitos foram submetidos a duas rondas de seleção porafinidade negativa sobre 2,3 x 107 microesferas Dynabeads®M-450 ativadas por tosilo (Invitrogen, Carlsbad, CA)revestidos com anticorpo anti-FLAG M2 (Sigma). Foram

Q revestidos 50 mg de anticorpo anti-FLAG M2 por 1x10microesferas em 500 ml de acordo com as instruções dofabricante. As microesferas e a suspensão de esplenocitosforam incubadas durante 30 minutos sobre gelo e ressuspensas em DMEM F12/P/S/BCS a 10% frio. Os esplenocitos não ligados foram separados a partir dasmicroesferas utilizando o Dynal MPC (Magnetic ParticleConcentrator) (Invitrogen) . Para a seleção por afinidadepositiva, os esplenocitos foram incubados com 2,3 x 107microesferas revestidas com anti-FLAG M2 ligado a FLAG-hAPRIL durante 30 minutos sobre gelo. As microesferas e osesplenocitos não ligados foram separados conforme descritoacima com um total de 12 lavagens.

Foram cultivadas células B específicas de antigénioconforme descrito por Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol.Rep. 19: 125-134. Brevemente, foram misturadas células B selecionadas com sobrenadante de células T a 7,5% (v/v) e 50.000 células cuidadoras (nursing cells) EL-4 B5 irradiadas (2.500 RAD) num volume final de 200 ml de DMEMF12/P/S/BCS a 10% em placas de cultura tecidual de fundoplano de 96 poços. No dia oito, os sobrenadantes foramrastreados para a reatividade de hAPRIL através de ELISAconforme descrito acima. Foram identificados 21sobrenadantes reativos a APRIL e testados para a suacapacidade de inibir a interação de APRIL com BCMA-Fc. NoELISA, todas as etapas de incubação foram seguidas por umaetapa de lavagem com PBST (PBS com Tween 20 a 0,1%) 3vezes. Uma imunoplaca Maxisorp de 96 poços foi revestidacom BCMA-Fc (50 ng/poço em PBS) (R&D Systems, Mineápolis,MN) durante a noite a 4 °C e bloqueadas com Soro decabra/PBST a 10% durante 1 hora à TA. FLAG-hAPRIL contendosobrenadantes foram pré-incubados com sobrenadantes decélulas B contendo anticorpo durante 1 hora à TA eposteriormente adicionados à placa revestida com BCMA-Fcdurante 1 hora à TA. Foi detetado FLAG-hAPRIL ligadoatravés de incubação com anticorpo anti-FLAG BioM2-biotinaa 1 mg/ml (Sigma) e Estreptavidina-HRP 1:2.000 (SouthernBiotechnology) durante 1 hora cada um à TA. Após a lavagemfinal com PBST, foi visualizado BCMA-Fc ligado a APRIL com100 ml de substrato TMB OptiEIA (BD Biosciences). Asreações foram paradas com 100 ml de H2S04 a 0,5 Me foramlidas as absorvâncias a 460 e 620 nm.

Subsequentemente, foram imortalizados 8 clones de células Batravés de mini-eletrofusão seguindo procedimentospublicados (Steenbakkers et al., 1992, J. Immunol. Meth.152, 69-77; Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol. Rep. 19,125-34). Especificamente, foram misturadas células B com106 células de mieloma NS-1, e o soro foi removido atravésde lavagem com meio DMEM F12. As células foram tratadas comsolução de pronase durante três minutos e lavadas com meiode fusão. Foram realizadas eletrofusões numa câmara defusão de 50 ml através de um campo elétrico alternado de30s, 2 MHz, 400 V/cm seguido por um pulso quadrado de campo elevado de 10 ms, 3 kV/cm e novamente através de um campoelétrico alternado de 30s, 2 MHz, 400 V/cm. o conteúdo dacâmara foi transferido para meio seletivo de hibridoma ecolocado em placas numa placa de 96 poços sob condições dediluição limitadas. No dia 14 após as fusões, ossobrenadantes de hibridoma foram rastreados parareatividade a APRIL e atividade de bloqueio de BCMA,conforme descrito anteriormente. Foram isolados doishibridomas anti-hAPRIL distintos, denominados hAPRIL.OlA ehAPRIL.03A e subclonados através de diluição limitada parapreservar a sua integridade. Foram confirmadas areatividade a hAPRIL e a atividade de bloqueio de BCMA dosanticorpos hAPRIL.OlA e hAPRIL.03A com sobrenadantes dehibridoma (veja-se a Figura 1) .

Exemplo 2: Purificação e caracterização de anticorpos anti-APRIL Estabilização de hibridomas produtores de anti-APRILe purificação de anticorpos anti-APRIL

Foram obtidas populações de células clonais para cadahibridoma através de múltiplas rondas de diluiçõeslimitantes (seis para hAPRIL.OlA e quatro para hAPRIL.03A).Foram cultivados hibridomas estáveis em meio isento de soroutilizando biorreatores CELLine (Integra-Biosciences, Chur,Suíça) de acordo com as instruções do fabricante. Após 7-10dias de cultura, os sobrenadantes foram recolhidos efiltrados através de uma membrana de nitrocelulose a 0,22mM. Os sobrenadantes foram diluídos 1:1 em tampão deligação de sal elevado (Glicina a 1 M/NaCl a 2M, pH 9,0), eos anticorpos foram purificados com colunas Protein GHiTrap de 5 ml (GE Healthcare, Piscataway, NJ) . Apóslavagem com PBS da coluna, os anticorpos foram eluídos comGlicina a 0,1 M pH 2,7 e neutralizados com Tris a 3 Μ. Otampão foi permutado por PBS utilizando colunas defiltração por gel PD-10 (GE Healthcare). Os anticorposforam concentrados com unidades de filtro centrífugo AmiconUltra-15 (Millipore, Billerica, MA) e quantificados utilizando espetrofotometria.

Utilizando um kit de teste de isotipagem de anticorpomonoclonal de ratinho (Serotec, Raleigh, NC), o (sub)-isotipo dos anticorpos tanto hAPRIL.OlA como hAPRIL.03A foideterminado como sendo IgGl, Capa.

Análise de Ligação

Foram realizadas experiências ELISA à base deproteinas utilizando anticorpos hAPRIL.OAnálA e hAPRIL.03Apurificados para determinar afinidades de ligação aparentes(relatadas como valores CE5o) . A ligação foi comparada aIgGl Aprily-5 anti-hAPRIL (Alexis). Imunoplacas de 96 poçosMaxisorp (Nunc) foram revestidas ou com anticorpopoliclonal anti-FLAG de coelho (Sigma) ou BCMA-Fc (R&DSystems) a 50 ng/poço em PBS durante a noite a 4 °C ebloqueadas com Soro de cabra a 10%/PBST durante lh à TA. Asplacas foram lavadas com PBST 3 vezes e incubadas comsobrenadante (1:4 em PBS) contendo FLAG- hAPRIL durante 1hora à TA. As placas foram novamente lavadas com PBST 3vezes e incubadas com anticorpos hAPRIL.OlA, hAPRIL.03A, eAprily-5 (alta de teste 10 mg/ml com diluições 10 vezes emtriplicado) durante 1 h à TA. Após três lavagens com PBST,foram detetados anticorpos ligados com IgG-HRP anti ratinhode cabra (1:2.000) (Southern Biotechnology) durante 1 horaà TA. A placa foi lavada três vezes com PBST, e areatividade a APRIL foi visualizada com substrato OptiEIATMB (Becton Dickinson). A concentração para a metade daligação máxima é relatada como uma medida de afinidade deligação relativa. Quando FLAG- hAPRIL foi capturado peloanticorpo anti-FLAG (Figura 2A) , os valores de CE5o parahAPRIL.OlA, hAPRIL.03A e Aprily-5 foram calculados como2,2, 1,4, e 1,7 nM, respetivamente. Quando FLAG- hAPRIL foicapturado por BCMA-Fc (Figura 2B), não foi observadaligação do anticorpo hAPRIL.OlA, sugerindo que a interaçãoAPRIL-BCMA bloqueou o epitopo de hAPRIL.OlA. Em contraste,foi observada ligação de hAPRIL.03A ao complexo APRIL-BCMA. A deteção de anticorpos do complexo recetor-ligando podeser útil em ensaios diagnósticos para fins de pesguisa paraseguir a eliminação de APRIL solúvel.

Análise cinética através de interferometria por bioluz(ForteBio)

Para caracterizar adicionalmente as caracteristicasde ligação dos anticorpos, cada um foi perfilado utilizandointerferometria por bioluz no sistema Octet (ForteBio,Menlo Park, CA) para elucidar a cinética de ligação ecalcular as constantes de equilíbrio de ligação. 0 ensaiofoi levado a cabo acoplando anticorpos hAPRIL.OlA ehAPRIL.03A purificados a biossensores reativos a amina(Fortebio) utilizando química de aminas padrão. Foram entãoobservadas liqação a e dissociação a partir dos sensores deAPRIL humano recombinante a duas concentrações, 1 e 2mg/ml. Especificamente, os reatores reativos a amina forampré-humedecidos através de imersão dos mesmos em poçoscontendo MES a 0,1 M pH = 5 durante 2 minutos. Osbiossensores foram então ativados utilizando uma mistura deNHS a 0,1M / EDC a 0,4M durante 5 minutos. Os anticorposhAPRIL.OlA e hAPRIL.03A foram acoplados ao imergir osbiossensores numa solução do anticorpo a 5 mg/ml durante 18minutos. A superfície do biossensor foi extinta utilizandouma solução de etanolamina a 1 M pH 8,5 durante 7 minutos.Os biossensores foram equilibrados em PBS durante 5minutos. Foi observada associação de APRIL recombinante aocolocar os biossensores em poços contendo APRIL a ou 1 ou 2mg/ml e monitorizar a interferometria durante 20 minutos. Adissociação foi medida após transferência dos biossensoresem PBS e monitorização do sinal de interferometria durante20 minutos. As taxas de associação e dissociação observadas(k0bs e kd) foram ajustadas utilizando um modelo de ajusteglobal de ligação 1:1, e foi calculada a constante deequilíbrio de ligação KD (veja-se o Quadro 1).

Quadro 1. Caracteristicas de ligação de anticorpo anti-

hAPRIL humanizado hAPRIL.OlA da invenção e hAPRIL.03A

Bloqueio de Recetor

As capacidades de bloqueio de hAPRIL.OlA e hAPRIL.03Aforam confirmadas utilizando anticorpos purificados. Placasde 96 poços Maxisorp (Nunc) foram revestidas ou com BCMA-Fc(R&D Systems) ou TACI-Fc (R&D Systems) a 50 ng/poço durantea noite a 4 °C e bloqueadas com Soro de cabra a 10%/PBSTdurante lh à TA. Sobrenadantes contendo FLAG-hAPRIL forampré-incubados com hAPRIL.OlA, hAPRIL.03A, e Aprily-5 (altade teste 10 mg/ml com diluições 10 vezes em triplicado)durante 1 h à TA. As placas foram lavadas com PBST 3 vezes,e foi detetado FLAG-hAPRIL ligado através de incubação comanticorpo anti-FLAG BioM2-biotina a 1 mg/ml (Sigma) eEstreptavidina-HRP 1:2.000 (Southern Biotechnology) durante1 hora cada um à TA. Após a lavagem final com PBST, foivisualizado BCMA-Fc ligado a APRIL com substrato TMBOptiEIA (BD Biosciences). Conforme mostrado nas Figuras 2Ce 2D, hAPRIL.OlA bloqueia completamente a ligação de FLAG-hAPRIL a BCMA-Fc e TACI-Fc, enquanto hAPRIL.03A bloqueiacompletamente a ligação de FLAG-hAPRIL a TACI-Fc, enquantosomente bloqueando parcialmente a interação hAPRIL-BCMA-Fc.Aprily-5 não bloqueia a ligação de FLAG-hAPRIL nem a BCMA-Fc nem a TACI-Fc. Foi determinada a concentração deinibição semi máxima (CI5o) para hAPRIL.OlA como 1,2 e 0,4nM para BCMA-Fc e TACI-Fc, respetivamente. A CI5o parahAPRIL.03A para TACI-Fc foi determinada como 1,3 nM.Anticorpos Comerciais

Foram obtidos anticorpos anti-APRIL disponíveiscomercialmente conforme descrito no Quadro 2.

Quadro 2. Anticorpos monoclonais humanos anti-APRIL humano comercialmente disponíveis

Para estudar se as características de bloqueio dehAPRIL.OlA e hAPRIL.03A são únicas, todos os anticorposanti-APRIL comercialmente disponíveis foram testados para asua capacidade de bloquear a interação de FLAG-hAPRIL aBCMA-Fc e TACI-Fc (Figuras 3A e 3B). 0 bloqueio da ligaçãoao recetor foi estudado utilizando um ELISA. Uma placa deELISA foi revestida com 50 com 100 ml de BCMA-Fc a 1 mg/mlou com 100ml de TACI-Fc a uma concentração de 2 mg/ml emtampão de revestimento e foi incubada durante a noite a 4°C. A placa foi então lavada com PBS/Tween a 0,2% eposteriormente incubada durantel hora a 37 °C com 100 ml dePBS/BSA a 5% por poço. A placa foi então lavada quatro vezes com PBS/Tween a 0,2%. Numa placa separada foram pré-misturados anticorpos monoclonais APRIL com sobrenadanteAPRIL e incubados durante 30 minutos sobre gelo. Foidiluido meio condicionado contendo APRIL solúvel 1 em 4 emisturado com um volume igual de PBS contendo os anticorpostitulados em diluições duplas iniciando com 5 mg/ml. 100 mlda mistura pré-incubada foram transferidos para a placa deELISA e incubados durante 2 horas a 37 °C. A placa foi

então lavada quatro vezes com PBS/Tween a 0,2%. Foi entãodiluido anticorpo anti-Flag-HRP em PBS a uma concentraçãode 1:1000 e posteriormente foram adicionados 100 ml domesmo a cada poço e incubados durante 1 hora a 37 °C. A placa foi então lavada quatro vezes com PBS/Tween a 0,2% eposteriormente foram adicionados 100 ml de ABTS a cada poço(o ABTS foi diluido até à razão 10 ml de reagente mars 5 mlde H2O2 realizada imediatamente antes da adição). A cor foideixada desenvolver e posteriormente a DO a 405 nm lida numleitor de placas ELISA: Foi utilizada IgGl humana como proteína de controlo para revestir a placa já que este é omesmo isotipo que as proteínas de fusão Fc e controladapara a adesão de APRIL à placa de forma não específica.Como é aparente a partir da Figura 3, nenhum dos anticorposcomercialmente disponíveis foi capaz de bloquear a ligaçãode FLAG-APRIL ou a TACI-Fc ou BCMA-Fc, enquanto hAPRIL.OlAe hAPRIL.03A inibem (parcialmente) a ligação a TACI-Fc eBCMA-Fc.

Reatividade Cruzada de Espécies A ligação de hAPRIL.OlA e hAPRIL.03A a APRIL deratinho foi também examinada através de BIAcore, mas nãofoi observada ligação de qualquer dos anticorpos. Osanticorpos parecem somente ligar a APRIL humano.

Exemplo 3: Perfilamento Funcional de Anticorpos APRIL anti-Humano de Ratinho Resposta de Células B de Ratinho a APRIL

De forma a mostrar que os anticorpos desta invençãopodem bloquear funcionalmente APRIL in vitro foi utilizado um ensaio de células B de ratinho para examinar duasrespostas conduzidas por APRIL em células B - proliferaçãoe produção de IgA.

Todas as linhas celulares foram mantidas a 37 °C comC02 a 5%. Foram cultivados esplenocitos e células Bpurificadas de ratinho em RPMI-1640 (Gibco) suplementadocom FCS a 8%, Glutamina a 2 mM e Beta-mercaptoetanol a 50mM, e suplementados com penicilina e estreptomicina a umaconcentração de 10 mg/ml. Foram isoladas células B do baçode ratinho a partir de ratinhos de tipo selvagem utilizandocolunas de separação de células ativada por magnetismo(MACS) com microesferas de MACS CD45R/B220 (MiltenyiBiotec, Utrecht, Holanda). As células foram cultivadas emplacas de microtitulação de fundo redondo de 96 poços a umadensidade de 2 x 105/poço num volume final de 200 ml. Paratodos os ensaios foram normalizados meios condicionadoscontendo as várias formas de APRIL solúvel para os niveisde expressão antes da utilização. Para medir aproliferação, as células foram tratadas com anti-IgM(Jackson ImmunoResearch) e APRIL solúvel em meiocondicionado ou como proteína purificada a uma concentraçãofinal de 1 mg/ml. Foi adicionado anticorpo anti-Flag dereticulação ao poço a uma concentração final de 1 mg/ml. Ascélulas foram incubadas a 37 °C e após 48 horas pulsadascom 0.3 mCi (0,011 MBq) de timidina tritiada ([6-3H]Timidina, GE Healthcare, Holanda) durante 18 horas, antesda colheita. Para medir a produção de IgA, foram cultivadascélulas B de ratinho e tratadas com APRIL, conforme acima.Após incubação durante 6 dias, o sobrenadante foi recolhidoe ensaiado para o teor de IgA através de ELISA. Brevemente,placas de ELISA foram revestidas com Ig anti ratinho a 2mg/ml (Southern Biotech), bloqueadas com PBS/BSA a 1% eincubadas com o sobrenadante recolhido. Foi então detetadaIgA ligada com IgA anti ratinho etiquetada com HRP(Southern Biotech, Uithoorn, Holanda). Como controlo, foram tratadas células com LPS a 10 mg/ml (Invivogen) mais TGFBhumano a 1 ng/ml (Sigma-Aldrich). Conforme mostrado naFigura 4A, hAPRIL.OlA e em menor medida hAPRIL.03A sãocapazes de inibir recombinação de comutação de classeinduzida por APRIL conforme foi determinado através dasecreção reduzida de IgA a partir de células do baço deratinho. TACI- Fc como controlo inibiu a secreção de IgA,enquanto IgGl de ratinho e Ig humana não afetaram asecreção de IgA induzida por APRIL a partir de células B dobaço. Adicionalmente, hAPRIL.OlA e hAPRIL.03A foramdemostrados como inibindo a proliferação de células B dobaço de ratinho induzida por APRIL. Para estabelecer aespecificidade dos anticorpos, foi estudado o efeito dehAPRIL.OlA e hAPRIL.03A sobre a secreção e proliferação deIgA induzidas por BAFF. Conforme mostrado na Figura 4B, nemhAPRIL.OlA nem hAPRIL.03A inibiram a secreção eproliferação de IgA induzidas por BAFF, enquanto TACI-Fccomo controlo inibiu ambos processos.

Experiência in vivo para bloquear a função de APRIL

Para demonstrar um efeito de bloqueio in vivo dosanticorpos sobre a função de APRIL foi examinada acapacidade dos anticorpos de bloquear a resposta humoralinduzida por NP-Ficoll em ratinhos. Os ratinhos utilizadosforam ratinhos transgénicos APRIL de 8-10 semanas de idadee membros da mesma ninhada de tipo selvagem (WT), ambos comum fundo C57BL/6. Os ratinhos transgénicos APRIL expressamAPRIL humano sob o promotor Lck-distal, que orienta aexpressão dos transgenes a timócitos maduros e linfócitos Tperiféricos (Stein et al., 2002, J Clin Invest 109, 1587-98). Os ratinhos foram criados nas instalações animais doAcademic Medical Center e a experiência foi aprovada porparte do comité ético institucional. Os ratinhos foramdivididos em vários grupos e tratados conforme segue: cincoratinhos APRIL WT foram tratados com PBS (200 ml) e 5grupos de cinco ratinhos transgénicos APRIL foram tratados com as seguintes moléculas: hAPRIL.OlA ou hAPRIL.03A ouTACI-Fc ou anticorpo de controlo coincidente por subisotipomsIgGl_k (200 mg/ratinho em 200 ml de PBS) ou PBS. Otratamento dos ratinhos foi iniciado 3 dias antes daimunização por NP-Ficoll immunization (dia 0; 100 ml i.p.com 250 mg do agente imunogénico) - as injeções foramcontinuadas duas vezes por semana durante 28 dias. Foirecolhido sangue através da veia caudal no dia -1,3, 7, 14e 28. Foram ensaiados anticorpos específicos anti-(4-hidroxi-nitrofenacetil) (NP) (IgM, IgG and IgA) em 6 ELISAindependentes utilizando soro diluido (1:100 para IgA;1:500 para IgG e 1:2.000 para IgM) conforme previamentedescrito (Hardenberg et al., Immunol Cell Biol, 86(6), 530-4, (2008) ) . Brevemente placas de ELISA de 96 poços(Greiner) foram revestidas com NP-BSA a 5 mg/ml (BiosearchTechnologies) em tampão carbonato de sódio (pH 9,6) durantea noite a 4 °C. Os poços foram blogueados com BSA a 1%durante 1 hora a 37 °C e incubados com soro diluído durante2 horas à temperatura ambiente. Foram utilizados anticorposespecíficos de isotipo conjugados com HRP (IgG, IgA e IgManti ratinho de cabra - da Southern Biotech) comoanticorpos reveladores. Todas as diluições foram realizadasem PBS/BSA a 1%/Tween 20 a 0,05%. Foi utilizado um testeANOVA de um fator para verificar a significânciaestatística entre os grupos TG (PBS) contra TG (hAPRIL.OlA)e TG (PBS) contra TG (hAPRIL.03A). Como é aparente a partirda Figura 5, tanto hAPRIL.OlA como hAPRIL.03A inibiram asrespostas de células B independentes de células T in vivo.TACO-Fc inibiu esta resposta de forma menos eficaz. PBS eIgGl de ratinho como controlo coincidente por isotipo, nãoafetaram a resposta anti-NP de IgA, IgM e IgG.

Para examinar o efeito a logo prazo de hAPRIL.OlA ehAPRIL.03A sobe populações de células B foram tratadosratinhos conforme descrito acima. No dia 30, os ratinhosforam sacrificados e o baço e a cavidade de exsudado peritoneal (PEC) analisados para a expressão de células Batravés de citometria de fluxo. Brevemente, células do baçoe linfócitos a partir da PEC foram separados a partir deglóbulos vermelhos através de uma lavagem com tampão delise de eritrócitos e posteriormente contados. As célulasforam lavadas e ressuspensas em PBS/BSA a 1% e semeadas emplacas de fundo redondo de 96 poços a uma densidade de 5 x105 por poço. A seguir, as células foram coradas com osseguintes anticorpos às concentrações recomendadas: B220-FITC (BD bioscience) e CD3-APC (ebioscience); IgD-FITC (BDbioscience) e IgM-PE (BD bioscience); IgD-FITC (BDbioscience), CD3-APC (ebioscience) e CD43-PE (BDbioscience). Os anticorpos foram incubados durante 40minutos, lavados três vezes com PBS/BSA a 1 % eposteriormente analisados através de citometria de fluxoutilizado o FACSCalibur (Becton Dickenson). As células BB220 + , células B maduras (IgD+IgMint) e células B T2(IgD+IgM+) no baço foram quantificadas (veja-se a Figura6A) . Adicionalmente, as subpopulações BI (CD43 + IgDint) e B2(CD43”IgD+) foram quantificadas na PEC (veja-se a Figura6B). A diminuição das células B como resposta ao tratamentocom TACI-Fc é evidente a partir tanto do baço como da PEC,indicando que a administração a longo prazo de TACI-Fc podeter um efeito prejudicial sobre populações normais decélulas B. Isto não é observado com os anticorposhAPRIL.OlA e hAPRIL.03A, sugerindo que em casos onde APRILmas não BAFF é a causa primária da patologia, os anticorposdesta invenção mostram menos efeitos secundários do queTACI-Fc.

Exemplo 4: Sequências de anticorpos anti-APRILClonagem de ADNcs de imunoglobulinas

Foram utilizados métodos à base de PCR de iniciadoresdegenerados para determinar as sequências de ADNcodificando as regiões variáveis para os anticorpos deratinho que são expressos por parte dos hibridomas hAPRIL.OlA e hAPRIL.03A. 0 ARN total foi isolado a partirde 5xl06 células de hibridoma utilizando TRIZOL(Invitrogen), e foram sintetizados ADNcs específicos degene para as cadeias pesada e leve utilizando o kit desíntese de ADNc iScript Select (Biorad) de acordo com asinstruções do fabricante. Os genes VH e VL foram amplificados através de PCR utilizando um conjunto de Ig-iniciadores à base de Novagen (Novagen, San Diego, CA) eTaq polimerase (Invitrogen). Todos os produtos de PCR quecumpriram o tamanho de amplicão esperado de 500 pb foramclonados num vetor pCR4 TOPO (Invitrogen), e as construçõesforam transformadas em DH5a E. coli (Invitrogen) de acordocom as instruções do fabricante. Os clones foram rastreadosatravés de PCR de colónia utilizando iniciadores diretos ereversos M13 universais, e foram selecionados dois clones apartir de cada reação para análise de sequências de ADN. Assequências foram pesquisadas contra bases de dados de linhagerminal e sequências de região variável IgV redispostasutilizando NCBI Ig-Blast BLASTN 2.2.16 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblas/) . Os resultados de Blast para hAPRIL.OlA e hAPRIL.03A mostraramuma sequência VH em estrutura e uma sequência VL emestrutura para cada anticorpo. As sequências de aminoácidosforam confirmadas através de espetrometria de massa. Assequências são divulgadas na Lista de Sequências anexa,Figura 7 e listadas no Quadro 3.

Quadro 3: Números de ID de sequência para os anticorposanti-APRIL humano de ratinho hAPRIL.OlA (desta invenção) ede hAPRIL.03A (não de acordo

com a invenção reivindicada).

Exemplo 5: Mapeamento de epitopos utilizando o método

Pepscan Síntese de péptldos e rastrelo pepscan

Os péptidos lineares sintéticos e CLIPS foramsintetizados e rastreados utilizando mini cartões PEPSCANde formato de cartão de crédito (placa de 455 poços compoços de 3 ul) conforme descrito por Slootstra et al.(Slootstra et al., 1996, Mol. Diversity 1, 87-96) e

Timmerman et al. (Timmerman et al., 2007, J. Mol. Recognit.20, 283-299). A ligação dos anticorpos (hAPRIL.OlA and hAPRIL.03A) a cada péptido foi testada num imunoensaio deligação enzimática (ELISA) baseado em PEPSCAN. os cartõesde polipropileno com formato de cartão de crédito de 455 poços, contendo os péptidos ligados covalentemente, foramincubados com amostra (por exemplo anticorpos a 1 ug/mldiluído numa solução de PBS contendo soro equino a 5%(vol/vol) e ovalbumina a 5% (peso/vol) ) e Tween 80 a 1%(4°C, durante a noite) . Após lavagem os péptidos foramincubados com uma peroxidase anti anticorpo (diluição1/1000, por exemplo peroxidase anti ratinho de coelho,Southern Biotech) (1 hora, 25°C), e subsequentemente, apóslavagem do substrato de peroxidase foram adicionadossulfato de 2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolina (ABTS) e 2ml/ml de H2C>2 a 3%. Após 1 hora foi medido o desenvolvimento da cor. O desenvolvimento da cor do ELISAfoi quantificado com uma câmara CCD e um sistema de processamento de imagem. A configuração consiste numacâmara CCD e uma lente de 55 mm (Sony CCD Video Camara XC-77RR, lente Nikon micro-nikkor 55 mm f/2,8), um adaptadorde câmara (Sony Camara adaptor DC-77RR) e Software de

Processamento de Imagem. Péptidos de Sintese

Foram sintetizados um total de 4225 péptidos, primariamente péptidos CLIPS. A sequência alvo utilizada,147 aminoácidos, com as ansas de acordo com o alinhamentocom lXU2.pdb sublinhadas:

RAVLTQK&amp;KKQHSViHLWlfr&amp;TSKiDDSSWSVfôWQPALRR&amp;RGtQAQGYQV R}QD.AGWLi.YSG[VL.F<SBVTFTMS'WVBR£SQ;CSiRQETLFRCIRSyF-SBFtDRAY NSCYSAGVFHLHQSÍL3V}- jPRARMLNLSPHGIFLCSFVKL {SEQ ÍD f«21}.

Ansas no lado "superior" da proteína: QKKQHSVLHL (SEQ ID NO:22), ALRRGRGL (SEQ ID NO:23), QAQGYGVRI (SEQ ID NO:24),QDAGVYLL (SEQ ID NO:25), SREGQGRQETV (SEQ ID NO:26),FHLHQGDILSV (SEQ ID NO:27) e ansas no lado "inferior" daproteína: INATSKDDSDVTE (SEQ ID NO:28), VLFQDVTFTMG (SEQ IDNO:2 9), IRSMPSHPDRAYN- SC (SEQ ID NO:30), 11PRARAKL (SEQ IDNO:31), NLSPHGTFLGF (SEQ ID NO:32). As regiõesinterconectadas são maioritariamente lâminas Note-se que oslados "superior" e "inferior" são eleitos arbitrariamente.

Foram utilizados as seguintes topologias de CLIPS: CLIPS T2é acoplado à cadeia lateral de duas cisteinas para formaruma única topologia de ansa, enquanto CLIPS T3 é acoplado àcadeia lateral de três cisteinas para formar uma topologiadupla de ansa, enquanto o primeiro T2 de CLIPS T2T2 éacoplado a duas cisteinas (etiquetadas C), e o segundo T2 éacoplado a duas cisteinas e finalmente T3 de CLIPS T2T3 éacoplado a duas cisteinas e T3 é acoplado a três cisteinas.No total foram sintetizados 20 conjuntos diferentes depéptidos: 191-1 (conjunto 1): Foram sintetizadas todas as sequências 35-mer sobrepostas cobrindo a sequência alvode 147 AA completa. Neste conjunto as diferentes ansas,quando presentes na sequência, conforme definido acimaforam constritas em topologia de ansa dupla ou de tipolâmina ao longo de dois CLIPS T2. 191-2 (conjunto 2) Foram identificadas um total de novelâminas. Todas as combinações 9x9 foram sintetizadas paramimetizar conformações de lâmina dupla. A sequência GSGfoi utilizada com um ligante. 191-3 (conjunto 3) O mesmo que no conjunto 2 conformeexplicado acima mas com um comprimento de lâmina menor.191-6 (conjunto 4) Foram sintetizadas todas as sequênciaslineares 35-mer sobrepostas cobrindo a sequência alvo de147 AA completa. 191-7 (conjunto 5) Foram sintetizadas todas as sequênciaslineares 15-mer sobrepostas cobrindo a sequência alvo de147 AA completa. 191-8 (conjunto 6a) Foram sintetizadas sequênciaslineares curtas (de comprimentos variáveis) cobrindo asregiões de ansa da sequência alvo de 147 AA completa.191-16 (conjunto 6b) Foram selecionados péptidosdiferentes a partir das cinco ansas "inferiores". Estesforam recombinados numa matriz 9x9 nos CLIPS T3 paraformar topologias de ansa dupla com ansas "inferiores" de dois comprimentos diferentes. 191-17 (conjunto 7) Foram sintetizadas todas as 135sequências 15-mer diferentes sobrepostas com uma cisteinana posição 1, 8 e 15. As três cisteinas foram acopladas aum CLIPS T3. 191-18 (conjunto 9) Foram recombinadasversões longas das seis andas "superiores" e versõeslongas das quatro ansas "inferiores" entre si no CLIPST3. 191-19 (conjunto 10) Seis + Seis + Quatro ansas decomprimento diferente da região de ansa "superior" foramtodas recombinadas entre si no CLIPS T3. 191-20 (conjunto 11,17,18,19,20) 33 sequências diferentescobrindo amplamente as ansas "superiores" ou "inferiores"foram recombinadas entre si no CLIPS T3. Estes conjuntosde péptidos encontram-se nos conjuntos 11, 17, 18, 19 e20. O motivo para esta "dispersão" é a disposição doscartões. 191-22 (conjunto 12) Ansas de diferente tamanho a partirde todas as ansas "superiores e "inferiores" foramsintetizadas como ansas simples em CLIPS T2. 191-23 (conjunto 13) Todas as sequências 15-mer de ansasimples sobrepostas cobrindo a proteína alvo completaforam sintetizadas em CLIPS T2. 191-24 (conjunto 14) Seis sequências 9-mer cobrindo asansas "superiores" foram recombinadas ente si numa matrizde ansa tripla 6x6x6 numa combinação de CLIPS T2T3 CLIPS.191-25 (conjunto 15) O mesmo conjunto de péptidossobrepostos que no conjunto 1. Foram sintetizadas todasas sequências 35-mer sobrepostas cobrindo a sequênciaalvo de 147 AA completa. Neste conjunto as diferentesansas, quando presentes na sequência, conforme definidoacima foram constritas em topologia de ansa tripla aolongo de CLIPS T3T2. 191-26 (conjunto 16) Seis sequências 9-mer cobrindo asansas "inferiores" foram recombinadas ente si numa matriz de ansa tripla 6x6x6 numa combinação de CLIPS T2T3 CLIPS.Análise de dados e determinação de epítopos

Cada anticorpo foi testado em todos os 4225 péptidose os seus valores de ligação foram pontuados. As sequênciasde ocorrência repetida clara na maioria dos ligantessuperiores (~1% superior) foram consideradas como candidatos a epítopos. Foram realizadas duas análises desuporte adicionais. Em primeiro lugar, foi investigado sevárias partes podem formar um epítopo descontínuo. Isto foirealizado através da estrutura homóloga lXU2.pdb. Emsegundo lugar, foi investigado se cada uma de várias partesligantes era reconhecida sem suporte da outra parte. Estesdois parâmetros, colocalização na estrutura 3D ereconhecimento independente, foram utilizados para sustentar que foi identificado um epítopo conformacional edescontínuo. Para hAPRIL.OlA foi determinado que liga aIRSMPSHPDRA (SEQ ID NO:33), com a região central sendoSMPSHP (SEQ ID NO:34). Os motivos TLFR (SEQ ID NO:35) e/ouQDVTFTMGQ (SEQ ID NO:36) (a região central é VTFTM (SEQ IDNO :37)) foram mostrados como suportando a ligação dehAPRIL.OlA. hAPRIL.03A foi mostrado como ligando ao motivoVSREGQGRQ (SEQ ID NO:38), com a região central sendo EGQ. 0motivo TFTMGQ (SEQ ID NO:39) foi mostrado como sustentandoa ligação de hAPRIL.03A.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> N.V.Organon <120> ANTICORPOS CONTRA UM LIGANDO INDUTOR DA PROLIFERAÇÃO(APRIL) <130> 2009.099<160> 39 <170> Patentln versão 3.5

<210> 1<211> 363<212> ADN <213> Mus musculus<4 0 0> 1 gaggtccagt tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg60 tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtga tgcactgggt gaagcagaag120 cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt ataatgatgc tcctaaatac180 aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacagtg acttcagaca agtcctccgg cacagcctac240 atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaggggcttg300 ggttacgccc tttactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc360 tea 363

<210> 2<211> 321<212> ADN <213> Mus musculus <400> 2 gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc aagtccacat cagtaggaga cagggtcagc60 gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt aataatgtag cctggtatca acagaaagca120 gggcaatctc ctaaagcact gatttcctcg gcatccaacc gtgacagtgg agtccctgat180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct240 gaagacttgg cagactattt ctgtcagcaa tataacatct atccattcac gttcggctcg300 gggacaaagt tggaaataaa a 321

<210> 3<211> 366<212> ADN <213> Mus musculus<400> 3 caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg60 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttatggta taggagtagg ctggattcgt120 cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtggaatga taataagtac180 tataacacag ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctccaa caaccaggta240 ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaata300 gctgggggta actacgacta tgctatggac cactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc360 tcctca 366 <210> 4

<211> 324<212> ADN <213> Mus musculus<400> 4 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtetacat ctcctgggga gaaggtcacc60 ttgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tctacctact tgtactggta ccagcagaag120 ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccct180 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag240 gctgaggatg ctgcctctta tttctgccat cagtggagta gttacccacc tacgttcggt300 gctgggacca agctggagct gaaa324

<210> 5<211> 121<212> PRT <213> Mus musculus<400> 5

Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thx Phe Thr Ser Tyr20 25 30

Vai Met His Trp Vai Lys Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45

Gly Tyr lie Asn Pro Tyr Asn Asp Ala Pro Lys Tyr Asn Glu Lys Phe50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Vai Thr Ser Asp Lys Ser Ser Gly Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Leu Gly Tyr Ala Leu Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly100 105 HO

Gin Gly Thr Ser Vai Thr Vai Ser Ser115 120

<210> 6<211> 107<212> PRT <213> Mus musculus<400> 6

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Gin Lys Phe Lys Ser Tht Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Asn Asn20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Ala Gly Gin Ser Pro Lys Ala Leu lie35 40 45

Ser Ser Ala Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Val. Gin Ser 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Asn lie Tyr Pro Phe 85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Glu Leu Glu lie Lys100 105

<210> 7<211> 122<212> PRT <213> Mus musculus<400> 7

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu Gin Pro Ser Gin15 10 15

Tht Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser1 Leu Ser Thr Tyr20 25 30

Gly lie Gly Val Gly Trp He Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45

Trp Leu Ala His lie Trp Trp Asn Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gin Val 65 70 75 80

Phe Leu Lys lie Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg lie Ala Gly Gly Asn Tyr Asp Tyr Ala Met Asp His Trp100 105 110

Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 8<211> 108<212> PRT <213> Mus musculus<400> 8

Gin lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Thr Ser Pro Gly15 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Thr20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp35 40 45 lie Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Met Glu 65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gin Trp Ser Ser Tyr Pro 85 80 95

Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys100 105

<210> 9<211> 5<212> PRT <213> Mus musculus <400> 9Ser Tyr Val Met His 1 5

<210> 10<211> 17<212> PRT <213> Mus musculus<4 0 0> 10

Tyr He Asn Pro Tyr Asn Asp Ala Pro Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys15 10 15

Gly

<210> 11<211> 12<212> PRT <213> Mus musculus<4 0 0> 11

Gly Leu Gly Tyr Ala Leu Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr15 10

<210> 12<211> 11<212> PRT <213> Mus musculus<400> 12

Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Asn Asn Val Ala1 5 10

<210> 13<211> 7<212> PRT <213> Mus musculus<400> 13

Ser Ala Ser Asn Arg Asp Ser1 5 <210> 14

<211> 9<212> PRT <213> Mus musculus<4 0 0> 14

Gin Gin Tyr Asn He Tyr Pro Phe Thr1 5

<210> 15<211> 7<212> PRT <213> Mus musculus<4 0 0> 15

Thr Tyr Gly lie Gly Val Gly1 5

<210> 16<211> 16<212> PRT <213> Mus musculus<4 0 0> 16

His lie Trp Trp Asn Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala Leu Lys Ser15 10 15

<210> 17<211> 12<212> PRT <213> Mus musculus<4 0 0> 17 lie Ala Gly Gly Asn Tyr Asp Tyr Ala Met Asp His15 10

<210> 18<211> 12<212> PRT <213> Mus musculus<4 0 0> 18

Ser Ala Ser Sex Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu Tyr15 10

<210> 19<211> 7<212> PRT <213> Mus musculus<4 0 0> 19

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser1 5

<210> 20<211> 9<212> PRT <213> Mus musculus<400> 20

His Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr1 5 <210> 21<211> 147

<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 21

Arg Ala Val Leu Thr Gin Lys Gin Lys Lys Gin His Ser Val Leu His15 10 15

Leu Val Fro lie Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu20 25 30

Val Met Trp Gin Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gin Ala Gin35 40 45

Gly Tyr Gly Val Arg lie Gin Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser50 55 60

Gin Val Leu Phe Gin Asp Val Thr Phe Thr Met Gly Gin Val Val Ser 65 70 75 80

Arg Glu Gly Gin Gly Arg Gin Glu Thr Leu Phe Arg Cys lie Arg Ser 85 90 95

Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly100 105 110

Val Phe His Leu His Gin Gly Asp lie Leu Ser Val lie He Pro Arg115 120 125

Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Fro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe130 135 140

Val Lys Leu 145

<210> 22<211> 10<212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 22

Gin Lys Lys Gin His Ser Val Leu His Leu1 5 10

<210> 23<211> 8<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 23

Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly Leu1 5

<210> 24<211> 9<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 24

Gin Ala Gin Gly Tyr Gly Val Arg lie1 5

<210> 25<211> 8<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 25

Gin Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu1 5 <210> 26<211> 11

<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 26

Ser Arg Glu Gly Gin Gly Arg Gin Glu Thr Val15 10

<210> 27<211> 11<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 27

Phe His Leu His Gin Gly Asp lie Leu Ser Val15 10

<210> 28<211> 13<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 28 lie Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu1 5 10

<210> 29<211> 11<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 29

Vai Leu Phe Gin Asp Vai Thr Phe Thr Met Gly15 10

<210> 30<211> 15<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 30 lie Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser Cys15 10 15

<210> 31<211> 9<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 31

He lie Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu1 5

<210> 32<211> 11<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 32

Asn Leu Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe15 10

<210> 33<211> 11<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 33 lie Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala15 10

<210> 34<211> 6<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 34

Ser Met Pro Ser His Pro1 5

<210> 35<211> 4<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 35

Thr Leu Phe Arg1

<210> 36<211> 9<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 36

Gin Asp Val Thr Phe Thr Met Gly Gin1 5

<210> 37<211> 5<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 37

Val Thr Phe Thr Met1 5

<210> 38<211> 9<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 38

Val Ser Arg Glu Gly Gin Gly Arg Gin1 5

<210> 39<211> 6<212> PRT <213> Homo sapiens<400> 39

Thr Phe Thr Met Gly Gin1 5

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presentepedido de patente foi elaborada apenas para informação doleitor. Não é parte integrante do documento de patenteeuropeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEPnão assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ouomissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 9614328 A [0015] • WO 200160397 A [0015] • WO 200294192 A [0015] • WO 9912965 A [0015] • WO 2001196528 A [0015] • WO 9900518 A [0015] • WO 8801649 A [0029] • US 4946778 A [0029] • US 5260203 A [0029] • EP 404097 A [0030] • WO 9311161 A [0030] • US 4816567 A [0034] [0042] [0053] • US 5624821 A [0037] • WO 2003086310 A [0037] • WO 2005120571 A [0037] • WO 20060057702 A [0037]

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Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um composto ligante selecionado a partir de umanticorpo ou um fragmento de ligação a antigénio do mesmo,que se liga a APRIL humano consistindo em: a) uma região variável de cadeia pesada de anticorpocompreendendo as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2e CDR3 selecionadas a partir do grupo consistindo em SEQID NOs: 9, 10 e 11 respetivamente, ou uma variante dequalquer de tais sequências que compreenda até trêsmodificações de aminoácidos; e b) uma região variável de cadeia leve de anticorpocompreendendo as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2e CDR3 selecionadas a partir do grupo consistindo em SEQID NOs: 12, 13 e 14 respetivamente, ou uma variante dequalquer de tais sequências que compreenda até trêsmodificações de aminoácidos, em que o composto ligante liga ao epítopo conformacionalSMPSHP de APRIL, e preferivelmente a IRSMPSHPDRA, e em queo composto ligante bloqueia totalmente a ligação de APRILcom TACI humano e pelo menos bloqueia parcialmente aligação de APRIL com BCMA humano.
2. 2. O composto ligante de acordo com a reivindicação 1,cujo composto ligante compreende uma região variável decadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos daSEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia levecompreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.
3. 3. O composto ligante de acordo com qualquer dasreivindicações acima, em que o composto ligante bloqueiacompletamente a ligação de APRIL humano com BCMA humano.
4. 4. O composto ligante de acordo com qualquer dasreivindicações acima, em que o composto ligante: a) liga a APRIL humano com uma KD de 10 nM ou menor; e b) bloqueia a ligação de TACI humano e/ou BCMA humano aAPRIL humano com um CI50 de cerca de 2 nM ou menor.
5. 5. O composto ligante de acordo com qualquer das reivindicações acima, em que o composto ligante é: a) um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo; b) um anticorpo humano ou um fragmento do mesmo; c) um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo; ou d) um fragmento de anticorpo selecionado a partir dogrupo consistindo em Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv,F(ab')2, mAb biespecifico e um diacorpo.
6. 6. O composto ligante de acordo com qualquer das reivindicações acima, em que o composto ligante inibe aproliferação e sobrevivência de células B.
7. 7. Um polinucleótido isolado codificando o compostoligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a4 .
8. 8. Um vetor de expressão compreendendo o polinucleótidoisolado de acordo com a reivindicação 7.
9. 9. Um método de produzir um composto ligante de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 4 compreendendo: a) cultivar uma célula hospedeira compreendendo um vetorde expressão compreendendo o polinucleótido de acordo coma reivindicação 7 em meio de cultura sob condições em queo polinucleótido é expresso, desta forma produzindopolipéptidos compreendendo as regiões variáveis de cadeialeve e pesada; e b) recuperar os polipéptidos a partir da célulahospedeira ou medio de cultura.
10. 10. Uma composição compreendendo o composto ligante deacordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 emcombinação com um portador ou diluente farmaceuticamenteaceitável.
11. 11. Composto ligante de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 6 para utilização em terapêutica,
12. 12. Composto ligante de acordo com qualquer dasreivindicações 1 a 6, para utilização em: a) tratamento de cancro; b) tratamento de uma doença autoimune; ou c) tratamento de uma doença inflamatória.
13. 13. O composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 6 para utilização num método dediagnóstico in vivo.
14. 14. Utilização de um composto de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 6 num método de diagnóstico ex vivoou in vitro.