PT1313762E - Gene supressor - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "GENE SUPRESSOR" A invenção refere-se a membros de uma família de genes que codificam para polipéptidos capazes de inibir a actividade pro-apoptose da p53.

Os genes supressores de tumor codificam para proteínas que funcionam para inibir o crescimento ou a divisão celular e são, portanto, importantes no que diz respeito à manutenção da proliferação, crescimento e diferenciação das células normais. As mutações nos genes supressores de tumor resultam na progressão anormal do ciclo celular em que os pontos de controlo do ciclo celular normal, os quais suspendem o ciclo celular quando, por exemplo, o DNA é danificado, são ignorados e as células danificadas dividem-se de um modo descontrolado. Os produtos dos genes supressores de tumor funcionam em todas as partes da célula (por exemplo, superfície celular, citoplasma, núcleo) para evitar a passagem de células danificadas através do ciclo celular (i.e., Gl, S, G2, M e citocinése).

Alguns genes supressores de tumor foram isolados e sequenciados. Estes incluem, apenas a título de exemplo, o gene de Retinoblastoma (Rb), mutações que são ligadas a cancros tais como o ósseo (osteocarcinoma), bexiga, do pulmão e cancro da mama, assim como o retinoblastoma e o Tumor de Wilms - 1 gene (WT-1), mutações que estão ligadas ao nefroblastoma e à neurofibromatose. A família de genes supressores de tumor, MAD (Mothers against dpp (gene decapentapélgico)) e MADR (genes 2 relacionados com MAD) foram identificados em algumas espécies. Estes genes codificam para proteinas envolvidas nas vias de transdução de sinal necessárias para a sinalização dos receptores de serina/treonina. 0 MADR1 é essencial na sinalização da via dpp. 0 MADR2 é outro MADR e as mutações neste gene foram associadas ao cancro colorectal (6% de cancros colorectais esporádicos). A sequência do gene MADR2, também conhecida como Smad2, é divulgada no documento WO 98/07849.

De um modo discutível, o gene supressor de tumor que foi o sujeito da pesquisa mais intensa é o p53. O p53 codifica para uma proteína que funciona como um factor de transcrição e é um regulador chave do ciclo de divisão celular. Foi descoberto em 1978 (Lane e Crawford, 1979) como uma proteína que mostrou ligar-se com afinidade ao antigénio T grande do SV40. O gene p53 codifica para um polipéptido de 393 aminoácidos com um peso molecular de 53 kDa.

Os genes regulados pela actividade transcricional do p53 contêm uma sequência de reconhecimento do p53 nas suas regiões 5' . Estes genes são activados quando os níveis celulares do p53 são elevados devido a, por exemplo, danos no DNA. Os exemplos de genes que respondem ao p53 incluem, mdm2 (Momand et al, 1992), Bax (Miyashita e Reed, 1995) e PIG-3 (Polyak et al, 1997). O Bax e o PIG-3 estão envolvidos numa das funções mais importantes do p53, a indução da apoptose. A apoptose, ou morte celular programada, é um processo natural que remove células danificadas. É importante relativamente a muitos processos celulares, incluindo a remoção de células pré-cancerosas, o desnvolvimento e homeostase de células/tecidos. 3

Como mencionado acima, uma das funções de supressão de tumor mais importantes do p53 é a sua capacidade para induzir a apoptose. A capacidade para sobre-regular a expressão de alguns dos genes pró-apoptose, tais como o Bax, proporcionam alguma evidência de como o p53 induz a apoptose. No entanto, ao comparar a expressão do Bax em murganhos transgénicos p53(-/-) e p53(+/+) e em murganhos wild-type, torna-se claro gue a expressão do Bax regulada pelo p53 em resposta a danos no DNA apenas ocorreu num número limitado de tecidos. Assim, permanece por clarificar o porquê da expressão do p53 poder induzir apenas a expressão do Bax de um modo especifico num tipo de célula. Foi recentemente demonstrado que a mutação no p53 pode alterar a especificidade do promotor. Foi demonstrado que dois dos genes p53 mutantes, derivados de tumor, são defeituosos na transactivação do promotor Bax, mas competentes para transactivar outros promotores dos genes alvo do p53, tais como o mdm2 e o p21wafl. Estas observações sugeriram que ser capaz de transactivar genes como o Bax, é muito importante para a função supressora de tumor do p53. É conhecido que o p53 pode induzir a apoptose através de vias de transcrição dependentes e independentes. De um modo adicional, a apoptose induzida pelo p53 pode ser bloqueada pelo oncogene bcl-2. No entanto, o bcl-2 não inibe a função de transactivação do p53. Até agora, muito pouco se sabe acerca dos mecanismos moleculares de como o bcl-2 inibe a apoptose induzida pelo p53. A 53BP2 é uma proteina de ligação ao p53, inicialmente descoberta por Iwabuchi et al. (1994). A 53BP2 foi isolada numa sonda hibrida-2 de levedura e verificou-se que 4 consistia em 528 aminoácidos da terminação C da proteína. Contém uma sequência rica em prolina, quatro repetições anquirina e um domínio SH3. Subsequentemente, foi identificada como uma proteína que interaqe com o Bcl-2 (Naumovski e Cleary, 1996). Foi isolada uma versão mais longa desta proteína e denominada como bBP2/53BP2. Com base nos dados de translação in vivo, os autores (Naumovski e Cleary, 1996) previram que a proteína bBP2/53BP2 consistia em 1005 aminoácidos.

Numa tentativa de compreender como a função apoptótica do p53 pode ser regulada in vivo, foram gerados anticorpos para a 53BP2 e foi demonstrado que, na maioria das células testadas, o nível de expressão da 53BP2 é reduzido. Também foi observado que a bBP2/53BP2 endógena codifica, de um modo inesperado, para uma proteína maior que os 1005 aminoácidos previstos por Naumovski e Cleary. Esta proteína é denominada ASP-2 ou ASP-2/53BP.

Foi demonstrado que a metade c-terminal da bBP2/53BP2 não tem qualquer efeito significativo sobre a actividade do p53. No entanto, a ASP-2/53BP estimula a função de transactivação do p53. De um modo mais interessante, a ASP-2/53BP pode aumentar especificamente a função de transactivação do p53 nos promotores derivados dos genes pró-apoptose, tais como o Bax e o PIG-3.

Utilizando a sequência de DNA da ASP-2, foi realizada uma pesquisa BLAST e foi identificado um clone denominado como KIAA0771 com homologia significativa com a sequência de ácido nucleico que codifica para a bBP2/53BP2, sugerindo que a sequência identificada de novo é um membro de uma família de genes que codificam para proteínas estimuladoras 5 da apoptose (ASP's). Este membro da família é referido como ASP-1.

Foi dado um nome à sequência nova de ácido nucleico ASP-1, (Apoptosis Stlmulating Protein 1- Proteína Estimuladora da Apoptose 1) , a qual codifica para um polipéptido que tem homoloqia de sequência com a bBP2/53BP2.

Foi identificado um requlador da ASP-2 que inibe o efeito estimulador do p53 pela ASP-2. Este requlador foi denominado I-ASP. 0 I-ASP foi divulgado na técnica como RAI (RellA-associated Inhlbitor - Inibidor associado ao RellA) de Yang J.P. et al., JBC 274: 15562 (1999) e WO 00/32628 como inibidor do NF-KB. Foi verificado que nos tumores que expressavam ASP-1 e ASP-2, a expressão do I-ASP é sobre-regulada quando comparada com os controlos normais equiparáveis. Tal sugere que a função de supressão de tumor do p53 pode ser regulada de um modo positivo e negativo pela ASP e pelo I-ASP in vivo.

De seguida, a expressão "polipéptido da invenção" refere-se a I-ASP. O âmbito da invenção é definido, exclusivamente, pelas reivindicações, tendo a descrição um propósito meramente ilustrativo.

De acordo com um aspecto da invenção, é proporcionado um anticorpo, ou uma sua parte ligante, que se liga a, pelo menos, uma parte do polipéptido da invenção.

Numa forma de realização preferida da invenção, a referida parte ligante é seleccionada do grupo que consiste em: 6 fragmentos F(ab')2, Fab, Fv e Fd; anticorpos compreendendo regiões CDR3.

Numa forma de realização preferida da invenção, o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal.

Ainda numa outra forma de realização preferida da invenção, o referido anticorpo é humanizado.

De um modo alternativo, o referido anticorpo é um anticorpo quimérico produzido por métodos recombinantes para conter a região variável do referido anticorpo com uma região invariante ou constante de um anticorpo humano.

Os anticorpos quiméricos são anticorpos recombinantes nos quais todas as regiões V de um anticorpo de murganho ou rato são combinadas com regiões C de anticorpo humano. Os anticorpos humanizados são anticorpos híbridos recombinantes que fundem as regiões determinantes da complementaridade da região V de um anticorpo de roedor com as regiões framework das regiões V do anticorpo humano. As regiões C do anticorpo humano também são utilizadas. As regiões determinantes da complementaridade (CDRs) são as regiões inseridas no domínio N-terminal de ambas as cadeias, pesada e leve, do anticorpo, onde se restringe a maior parte da variabilidade da região V. Estas regiões formam arcos à superfície da molécula do anticorpo. Estes arcos proporcionam a superfície de ligação entre o anticorpo e o antigénio. A produção de anticorpos é bem conhecida na técnica. Vários livros de texto laboratoriais estão disponíveis para o operador especializado. Por exemplo, Antibodies, Lane & Harlow, Cold Spring Harbour Laboratories. 7

De acordo com um aspecto adicional da invenção, é proporcionado um método para determinar a expressão do mRNA e/ou o polipéptido de acordo com a invenção.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, é proporcionado um método para identificar agentes capazes de modular a actividade do polipéptido de acordo com a invenção, compreendendo: i) proporcionar uma célula ou uma linha celular que expresse o polipéptido de acordo com a invenção; ii) expor a célula a, pelo menos, um agente a ser testado; e iii) monitorizar o efeito do(s) agente(s) sobre a actividade do polipéptido.

De acordo com ainda outro aspecto da invenção, é proporcionado um método para identificar agentes capazes de modular a actividade do polipéptido de acordo com a invenção, compreendendo: i) proporcionar, pelo menos, o polipéptido de acordo com a invenção; ii) expor o polipéptido a, pelo menos, um agente a ser testado; e iii) monitorizar a ligação do(s) referido(s) agente(s) através do referido polipéptido.

Numa forma de realização preferida adicional da invenção, o referido agente é um antagonista, o qual inibe a actividade do polipéptido de acordo com a invenção. De um modo preferido, o referido agente é um polipéptido.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, é proprocionada uma molécula de ácido nucleico antisense, em que a referida molécula compreende a sequência antisense da sequência sense, de acordo com a invenção. De um modo preferido, a referida molécula de ácido nucleico antisense compreende a sequência antisense da sequência sense representada na Figura 2 ou uma sua parte.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula antisense, de acordo com a invenção.

Numa forma de realização preferida da invenção, o referido ácido nucleico antisense é combinado com, pelo menos, um agente quimioterapêutico. De um modo preferido, o referido agente é um agente anti-cancerigeno seleccionado do grupo que consiste em: cisplatina; carboplatina; ciclosfosfamida; melfalano; carmuslina; metotrexato; 5-fluoroacilo; citarabina; mercaptopurina; daunorubicina; doxorubicina; epirubicina; vinblastina; vincristina; dactinomicina; mitomicina C; taxol; L-asparaginase; G-CSF; um enediino tal como a caliqueamicina ou esperamicina; clorambucilo; ARA-C; vindesina; bleomicina; e etoposida. Outros agentes que podem ser combinados com os anteriores incluem agentes que actuam na neovascularização do tumor ou são imunomoduladores. De um modo preferido, o agente que actua na neovascularização do tumor é seleccionado do grupo que consiste em combrestatina A4, angiostatina e endostatina. De um modo preferido, o imunomodulador é seleccionado do grupo que consiste em a-interferão, γ-interferão e factor alfa de necrose do tumor (TNFa). 9

Numa forma de realização preferida da invenção, o referido agente é a cisplatina. A invenção envolve, assim, a detecção de polipéptidos I-ASP, genes que codificam para I-ASP, modificações funcionais e variantes dos anteriores, fragmentos úteis dos anteriores, assim como terapêuticas com ela relacionadas. A expressão deste gene afecta a apoptose através da ligação ao p53 e a polipéptidos relacionados.

Como aqui utilizado relativamente aos ácidos nucleicos, o termo "isolado" significa: (i) amplificado in vitro através de, por exemplo, reacção em cadeia de polimerase (PCR); (ii) produzido por via recombinante por clonagem; (iii) purificado, tal como por clivagem e separação em gel; ou (iv) sintetizado por, por exemplo, sintese quimica. Um ácido nucleico isolado é de tal modo que seja manipulável por técnicas recombinantes de DNA bem conhecidas na arte. técnicas

Assim, uma sequência de aminoácidos contida num vector em que os locais de restrição 5' e 3' são conhecidos ou para os quais as sequências primer da reacção em cadeia de polimerase (PCR) foram divulgadas, considera-se isolada mas uma sequência de ácido nucleico existente no seu estado natural no seu hospedeiro natural não se considera como tal. Um ácido nucleico isolado pode ser substancialmente purificado, mas não necessita de o ser. Por exemplo, um ácido nucleico que é isolado no interior de um vector de clonagem ou um vector de expressão não é puro na medida em que pode compreender apenas uma pequena percentagem do material na célula na qual reside. Tal ácido nucleico é isolado, no entanto, como o termo é aqui utilizado, porque é prontamente manipulável por técnicas correntes, 10 conhecidas dos peritos comuns na arte. Um ácido nucleico isolado, como aqui utilizado, não é um cromossoma que ocorre naturalmente.

Como aqui utilizado relativamente aos polipéptidos, o termo "isolado" significa separado do seu ambiente natural e presente em quantidade suficiente para permitir a sua identificação ou utilização. Isolado, quando referente a uma proteina ou polipéptido, significa, por exemplo: (i) produzido, selectivamente, por clonagem de expressão ou (ii) purificado por cromatografia ou electroforese. As proteínas ou polipéptidos isolados podem ser, mas não necessitam de o ser, substancialmente puros. O termo "substancialmente puro" significa que as proteínas ou os polipéptidos são essencialmente isentos de outras substâncias com as quais podem ser encontrados na Natureza ou em sistemas in vivo numa extensão prática e apropriada para a sua utilização pretendida. Os polipéptidos substancialmente puros podem ser produzidos por técnicas bem conhecidas na arte. Como uma proteína isolada pode ser comisturada com um veículo farmaceuticamente aceitável numa preparação farmacêutica, a proteína pode compreender apenas uma pequena percentagem em peso da preparação. A proteína é, não obstante, isolada na medida em que ela foi separada das substâncias com as quais pode estar associada em sistemas vivos, i.e., isolada de outras proteínas.

Um aspecto da invenção é que as sequências de ácidos nucleicos que codificam para polipéptidos I- -ASP e que hibridam com uma molécula de ácido nucleico como aqui proporcionada, sob condições estringentes. 0 termo "condições estringentes" como aqui utilizado refere- -se a parâmetros com os quais a arte é familiar. Os parâmetros da 11 hibridação de ácidos nucleicos podem ser encontrados em referências que compilam tais métodos, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, ou Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York. De um modo mais especifico, as condições estringentes como aqui utilizadas, referem-se, por exemplo, à hibridação a 65 °C em tampão de hibridação (3,5 x SSC, Ficoll 0,02%, polivinilpirrolidona 0,02%, Albumina de Soro Bovino 0,02%, NaH2P04 (pH 7) 2,5 mM, SDS 0,5%, EDTA 2 mM) . O SSC é cloreto de sódio 0,15 M/citrato de sódio 0,015 M, pH 7; o SDS é dodecilsulfato de sódio; e o EDTA é ácido etilenodiaminotetracético. Após hibridação, a membrana para a qual o DNA é transferido é lavada com 2 x SSC à temperatura ambiente e depois com 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS a temperaturas até 68 °C.

Existem outras condições, reagentes e demais que podem ser utilizados, os quais resultam num grau semelhante de estringência. O operador especializado está familiarizado com tais condições e, assim, as mesmas não são aqui dadas. Deve ser entendido, no entanto, que o operador especializado deve ser capaz de manipular as condições de modo a permitir a identificação clara de homólogos e alelos de ácidos nucleicos I-ASP. O operador especializado também está familiarizado com a metodologia para células e bases de dados de identificação para a expressão de tais moléculas que são frequentemente isoladas, seguida do isolamento da molécula de ácido nucleico pertinente e sequenciação. 12

De um modo geral, os homólogos e os alelos tipicamente partilham, pelo menos, 90% da identidade nucleotidica e/ou, pelo menos, 95% da identidade dos aminoácidos para o nucleótido e sequências de aminoácidos divulgados, respectivamente, nalguns casos partilha, pelo menos, 95% da identidade do nucleótido e/ou, pelo menos, 97% da identidade dos aminoácidos e ainda noutros casos partilha, pelo menos, 98% da identidade do nucleótido e/ou, pelo menos, 99% da identidade dos aminoácidos. A homologia pode ser calculada utilizando várias ferramentas de software disponíveis ao público, desenvolvidas por NCBI (Bethesda, Maryland) e que podem ser obtidas através da Internet (ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/pub/).

As ferramentas exemplificativas incluem o sistema BLAST, disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov, de um modo preferido, utilizando as definições base. Os alinhamentos Pairwise e Clustal (definição de matriz BLOSUM30) assim como a análise hidropática Kyle-Doolittle podem ser obtidos utilizando o software de análise de sequências MacVector (Oxford Molecular Group). Os complementos Watson-Crick dos ácidos nucleicos anteriores também são englobados pela invenção.

Na detecção de ácidos nucleicos que codificam para proteínas I-ASP com homologia de sequência com os ácidos nucleicos aqui descritos, pode ser realizado um Southern Blot, utilizando as condições anteriores, juntamente com uma sonda detectável (por exemplo, radioactiva, quimioluminescente). Após lavagem da membrana para a qual o DNA é finalmente transferido, o sinal da sonda pode ser detectado, tal como por colocação da membrana contra um filme de raio X ou placas de visualização com fósforo, para 13 detectar o sinal radioactivo, ou por processamento da membrana para detectar o sinal quimioluminescente. A invenção também inclui ácidos nucleicos degenerados, os quais incluem codões alternativos para aqueles presentes nos materiais naturais. Por exemplo, os residuos de serina são codificados pelos codões TCA, AGT, TCC, TCG, TCT e AGC. Cada um dos seis codões é equivalente para os propósitos de codificação de um residuo de serina. Assim, deverá ser evidente para um operador comum, especialista na arte, que qualquer dos tripletos nucleotidicos que codificam para a serina pode ser empregue para dirigir o dispositivo de sintese da proteína, in vitro ou in vivo, para incorporar um resíduo de serina no alongamento de um polipéptido. De um modo semelhante, as sequências de tripleto de nucleótidos que codificam para outros resíduos de aminoácidos incluem, mas não se limitam a: CCA, CCC, CCG e CCT (codões de prolina) ; CGA, CGC, CGG, CGT, AGA e AGG (codões de arginina) ; ACA, ACC, ACG e ACT (codões de treonina) ; AAC e AAT (codões de asparagina) ; e ATA, ATC e ATT (codões de isoleucina). Outros resíduos de aminoácidos podem ser codificados de um modo semelhante por sequências múltiplas de nucleótidos. Assim, a invenção engloba ácidos nucleicos degenerados que diferem dos ácidos nucleicos biologicamente isolados na sequência do codão devido à degenerescência do código genético. A invenção também proporciona moléculas de ácido nucleico ou polipéptidos modificados, os quais incluem adições, substituições e delecções de um ou mais nucleótidos ou aminoácidos. Como aqui utilizado, o termo "um ou mais" significa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 14 30 ou mais até um número que não varie substancialmente a função da molécula para aquelas moléculas nas quais a função é desejada como sendo substancialmente semelhante ao ácido nucleico ou polipéptido oriqinal. Uma variação substancial da função seria, por exemplo, uma proteína negativa dominante ou uma proteína que tenha perdido uma ou mais das suas funções.

Em formas de realização preferidas, estas moléculas de ácido nucleico modificados e/ou os polipéptidos para os quais codificam retêm, pelo menos, uma actividade ou função da molécula de ácido nucleico não modificada e/ou dos polipéptidos, tal como a ligação ao p53, antigenicidade, actividade transcricional, etc. Em certas formas de realização, as moléculas de ácido nucleico modificado codificam para polipéptidos modificados, de um modo preferido, polipéptidos contendo substituições de aminoácidos conservadoras como é aqui descrito. As moléculas de ácido nucleico modificado são estruturalmente relacionadas com as moléculas de ácido nucleico não modificadas e nas formas de realização preferida são suficientemente estruturalmente relacionadas com as moléculas de ácido nucleico não modificado de modo que as moléculas de ácido nucleico modificado e não modificado hibridam sob condições altamente estringentes conhecidas do especialista na técnica.

Por exemplo, podem ser preparadas moléculas de ácido nucleico modificado que codificam para polipéptidos contendo variações num único aminoácido. Cada uma destas moléculas de ácido nucleico pode ter uma, duas ou três substituições de nucleótido exclusivas das alterações nucleotídicas correspondentes à degenerescência do código 15 genético como aqui descrito. De um modo semelhante, as moléculas de ácido nucleico modificadas que codificam para polpéptidos contendo duas alterações de aminoácido podem ser preparadas com, por exemplo, 2-6 alterações nucleotidicas. Várias moléculas de ácido nucleico modificado como estas são prontamente previstas por um especialista na técnica, incluindo, por exemplo, as substituições de nucleótidos em codões que codificam para os aminoácidos 2e3, 2e4, 2e5, 2e6e assim por diante. No exemplo anterior, cada combinação de dois aminoácidos é incluída no conjunto de moléculas de ácido nucleico modificado, assim como todas as substituições nucleotidicas que codificam para as substituições de aminoácido. As moléculas adicionais de ácido nucleico que codificam para polipéptidos contendo substituições adicionais (i.e., 3 ou mais), adições ou delecções (por exemplo, por introdução de um codão stop ou de um local(is) de splice) também podem ser preparadas e são englobadas pela invenção como é prontamente previsível para um especialista na técnica. Qualquer um dos ácidos nucleicos ou polipéptidos anteriores pode ser testado por esperimentação de rotina para a retenção da relação estrutural ou actividade para os ácidos nucleicos e/ou polipéptidos aqui divulgados. A invenção também proporciona fragmentos isolados de I-ASP ou os seus complementos de comprimento suficiente para representar uma sequência única inserida no genoma humano e para identificar um ácido nucleico que codifica para polipéptidos I-ASP. Estes fragmentos podem ser considerados únicos na medida em que um único fragmento é tal que é uma "assinatura" para o ácido nucleico maior. Um fragmento único, por exemplo, é suficientemente longo para garantir 16 que a sua sequência exacta não é encontrada em moléculas fora dos ácidos nucleicos I-ASP definidos acima, i.e., que identifica especificamente as sequências I-ASP. Um único fragmento inclui uma sequência de nucleótidos contíguos, que não é idêntica a qualquer sequência presente em bases de dados disponíveis publicamente (por exemplo, GenBank) até a data de depósito deste pedido de patente, embora certos fragmentos possam conter como uma porção do fragmento algumas sequências previamente conhecidas depoistadas no GenBank. De um modo semelhante, complementos de sequências e fragmentos de sequências publicamente conhecidas e seus complementos podem ser uma porção de, mas não o total, de fragmentos únicos de I-ASP. Assim, um único fragmento exclui, por definição, sequências que consistem apenas em EST e/ou sequências de genes depositadas em bases de dados disponíveis publicamente até à primeira data de depósito das sequências contidas neste pedido de patente. Assim, um único fragmento deve conter uma sequência de nucleótidos diferente da sequência exacta daquelas do GenBank ou seus fragmentos. A diferença pode ser uma adição, delecção ou substituição relativamente à sequência GenBank ou pode ser uma sequência inteiramente separada da sequência GenBank.

Os fragmentos das moléculas de ácido nucleico I-ASP, incluindo fragmentos únicos, podem ser utilizados como sondas em ensaios de hibridação em blot (por exemplo, Southern, Northern) para identificar tais ácidos nucleicos, em ensaios de protecção da nuclease para medir a transcrição ou podem ser utilizados em ensaios de amplificação, tais como os que empregam PCR. Como é conhecido pelos especialistas na técnica, sondas grandes tais como 200, 250, 300 ou mais nucleótidos são preferidas 17 para certas utilizações tais como Southern e Northern blots, enquanto que fragmentos inferiores são preferidos para utilizações tais como PCR. Os fragmentos também podem ser utilizados para produzir proteinas de fusão para gerar anticorpos ou determinar a ligação dos fragmentos de polipéptidos, ou para gerar componentes de imunoensaio. De um modo semelhante, os fragmentos podem ser empregues para produzir fragmentos não fundidos dos polipéptidos I-ASP tais como os fragmentos N-terminais ou C-terminais, ou os vários dominios proteicos aqui divulgados, úteis, por exemplo, na preparação de anticorpos, em imunoensaios e como parceiros de ligação competitiva dos polipéptidos I-ASP e/ou outros polipéptidos que se ligam aos polipéptidos p53 ou rei, por exemplo, em aplicações terapêuticas. Os fragmentos podem ser adicionalmente utilizados como moléculas antisense, como aqui descrito, para inibir a expressão de ácidos nucleicos e polipéptidos I-ASP, particularmente para propósitos terapêuticos como descrito aqui em maior detalhe.

Tal como é reconhecido pelos especialistas na técnica, a dimensão do fragmento único irá depender da sua conservação no código genético. Assim, algumas regiões de moléculas de ácido nucleico I-ASP e os seus complementos irão requerer segmentos mais longos para serem únicas, enquanto que outras irão requerer apenas segmentos curtos, tipicamente entre 12 e 32 nucleótidos (por exemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 e 32 bases de comprimento). Esta divulgação pretende englobar cada um e todo o fragmento de cada sequência, começando no primeiro nucleótido, o segundo nucleótido e assim por diante, até 8 nucleótidos de comprimento até à extremidade e terminando em qualquer local desde o 18 nucleótido número 8, 9, 10 e assim por diante para cada sequência, até ao último nucleótido (desde que a sequência seja única como descrita acima). Muitos segmentos dos ácidos nucleicos I-ASP, ou seus complementos, que têm 25 ou mais nucleótidos de comprimento, serão únicos. Os especialistas na técnica são bons conhecedores dos métodos para seleccionar tais sequências, tipicamente com base na disponibilidade do fragmento único para distinguir selectivamente a sequência de interesse de ácidos nucleicos não I-ASP. Uma comparação da sequência do fragmento com as de bases de dados conhecidas, tipicamente, é tudo o que é necessário, embora a hibridação de confirmação in vitro e a análise de sequenciação possam ser realizadas.

Um fragmento pode ser um fragmento funcional. Um fragmento funcional de uma molécula de ácido nucleico da invenção é um fragmento que retém alguma propriedade funcional da maior molécula de ácido nucleico, tal como a codificação para um polipéptido funcional, ligando a proteínas (por exemplo, p53), regulação da transcrição de ácidos nucleicos operacionalmente ligados, codificação para epitopos reconhecidos imunologicamente e semelhantes. Um especialista comum na técnica pode determinar prontamente, utilizando os ensaios aqui descritos e os bons conhecedores da técnica poderão determinar se um fragmento é um fragmento funcional de uma molécula de ácido nucleico utilizando não mais do que a experimentação de rotina.

Como mencionado acima, a invenção engloba oligonucleótidos antisense que se ligam selectivamente a uma molécula de ácido nucleico que codifica para um polipéptido I-ASP, para modular a ligação ao p53, actividade transcricional ou apoptose, por exemplo. Isto é desejável em virtualmente 19 qualquer condição médica em que é desejável uma actividade de modulação do p53, tal como cancro e condições que envolvem apoptose aberrante.

Como aqui utilizado, o termo "oligonucleótido antisense" ou "antisense" descreve um oligonucleótido que é um oligoribonucleótido, oligodesoxiribonucleótido, oligonucleótido modificado ou oligodeseoxiribonucleótido modificado, o qual hibrida sob condições fisiológicas com o DNA, compreendendo um determinado gene ou com um transcrito de mRNA desse gene e, deste modo, inibe a transcrição desse gene e/ou a tradução desse mRNA. As moléculas antisense são designadas como interferindo com a transcrição ou a tradução de um gene alvo aquando da hibridação com o gene ou transcrito alvo. Os especialistas na técnica reconhecerão que o comprimento exacto do oligonucleótido antisense e o seu grau de complementaridade com o seu alvo vai depender do alvo especifico seleccionado, incluindo a sequência do alvo e as bases particulares que compreendem essa sequência. É preferido que o oligonucleótido antisense seja construído e configurado de modo a ligar-se selectivamente ao alvo sob condições fisiológicas, i.e., para hibridar substancialmente mais à sequência alvo do que a qualquer outra sequência na célula alvo sob condições fisiológicas. Com base nas sequências de ácidos nucleicos I-ASP aqui proporcionadas, ou nas sequências genómicas alélicas ou homólogas e/ou de cDNA, um especialista na técnica pode facilmente escolher e sintetizar qualquer número apropriado de moléculas antisense para utilização de acordo com a presente invenção. Por exemplo, pode ser preparado um "gene walk" compreendendo uma série de oligonucleótidos de 15-30 nucleótidos abrangendo o comprimento de um ácido nucleico I-ASP, seguido de testes 20 para a inibição da correspondente expressão do I-ASP. Opcionalmente, podem ser deixados intervalos de 5-10 nucleótidos entre os oligonucleótidos para reduzir o número de oligonucleótidos sintetizados e testados.

De modo a serem suficientemente selectivos e potentes para a inibição, tais oligonucleótidos antisense devem compreender, pelo menos, 10 e, de um modo mais preferido, pelo menos 15 bases consecutivas, as quais são complementares ao alvo, embora em certos casos os oligonucleótidos modificados tão curtos como com 7 bases em comprimento, foram utilizados com sucesso como oligonucleótidos antisense (Wagner et al., Nature Biotechnol. 14:840-844, 1996). De um modo mais preferido, os oligonucleótidos antisense compreendem uma sequência complementar de 20-30 bases. Embora os oligonucleótidos seleccionados possam ser antisense para qualquer região do gene ou dos transcritos de mRNA, em formas de realização preferidas os oligonucleótidos antisense correspondem aos locais N-terminal ou 5' a montante, tais como os locais de iniciação da tradução, iniciação da transcrição ou promotores. Adicionalmente, as regiões não traduzidas 3' podem ser transformadas em alvo. O direccionamento para locais de splicing do mRNA também foi utilizado na técnica mas pode ser menos preferido se ocorrer o splicing do mRNA alternativo. Adicionalmente, o antisense é direccionado, preferencialmente, para locais em que a estrutura secundária do mRNA não é esperada (ver, por exemplo, Sainio et al., Cell Mol. Neurobiol. 14(5):439-457, 1994) e onde não se espera que as proteinas se liguem. Finalmente, embora as sequências I-ASP de cDNA sejam aqui divulgadas, um especialista comum na técnica pode facilmente derivar o correspondente DNA genómico para estes cDNAs. Assim, a 21 presente invenção também proporciona oligonucleótidos antisense que são complementares ao DNA genómico I-ASP. De um modo semelhante, são permitidos antisense para cDNAS alélicos ou homólogos e DNAs genómicos, sem experimentação indevida.

Num conjunto de formas de realização, os oligonucleótidos antisense da invenção podem ser compostos por desoxiribonucleótidos "naturais", ribonucleótidos ou qualquer sua combinação. Isto é, a extremidade 5' de um nucleótido natural e a extremidade 3' de outro nucleótido natural pode ser ligada covalentemente, como em sistemas naturais, através de uma ligação fosfodiéster internucleósido. Estes oligonucleótidos podem ser preparados pelos métodos reconhecidos na técnica, os quais podem ser realizados manualmente ou por um sintetizador automático. Eles também podem ser produzidos recombinantemente através de vectores.

Em formas de realização preferidas, no entanto, os oligonucleótidos antisense da invenção também podem incluir oligonucleótidos "modificados". Isto é, os oligonucleótidos podem ser modificados de várias formas as quais não evitam que os mesmos hibridem com o seu alvo mas potenciam a sua estabilidade ou direccionamento para o alvo ou, por outro lado, potenciam a sua eficácia terapêutica. 0 termo "oligonucleótido modificado" como aqui utilizado descreve um oligonucleótido no qual (1) pelo menos dois dos seus nucleótidos são covalentemente ligados através de uma ligação internucleósido sintética (i.e., uma ligação diferente da ligação fosfodiéster entre a extremidade 5' de um nucleótido e a extremidade 3' do outro nucleótido) e/ou 22 (2) um grupo químico normalmente não associado com ácidos nucleicos foi covalentemente ligado ao oligonucleótido. As ligações internucleósido sintéticas preferidas são de fosforotioatos, alquilfosfonatos, fosforoditioatos, ésteres de fosfato, alquilfosfonotioatos, fosforamidatos, carbamatos, carbonatos, triésteres de fosfato, acetamidatos, ésteres de carboximetilo e péptidos. 0 termo "oligonucleótido modificado" também engloba oligonucleótidos com uma base e/ou um açúcar covalentemente modificado. Por exemplo, os oligonucleótidos modificados incluem oligonucleótidos contendo esqueletos de açúcar que estão ligados covalentementeaos grupos de baixo peso molecular além do grupo hidroxilo na posição 3' e além do grupo fosfato na posição 5' . Assim, os oligonucleótidos modificados podem incluir um grupo de ribose 2'-0-alquilada. De um modo adicional, os oligonucleótidos modificados podem incluir açúcares tais como a arabinose ao invés da ribose. A presente invenção, assim, contempla preparações farmacêuticas contendo moléculas antisense modificadas, que são complementares, e hibridam com, sob condições fisiológicas, ácidos nucleicos que codificam para polipéptidos I-ASP, juntamente com veículos farmaceuticamente aceitáveis.

Os oligonucleótidos antisense podem ser administrados como parte de uma composição farmacêutica. Uma tal composição farmacêutica pode incluir os oligonucleótidos antisense em combinação com quaisquer veículos fisiologicamente e/ou farmaceuticamente aceitáveis padrão, conhecidos na arte. As composições devem ser estéreis e conter uma quantidade terapeuticamente eficaz dos oligonucleótidos antisense numa unidade de peso ou volume adequada para a administração a 23 um doente. As características do veículo võ depender da via de administração. Veículos fisiologicamente e farmaceuticamente aceitáveis incluem diluentes, agentes de preenchimento, sais, tampões, agentes estabilizantes e outros materiais que são bem conhecidos na arte.

Como aqui utilizado, um "vector" pode ser um qualquer número de ácidos nucleicos no interior do qual uma sequência desejada pode ser inserida por restrição e ligação para transporte entre diferentes ambientes genéticos ou para expressão numa célula hospedeira. Os vectores são tipicamente compostos por DNA embora também possam estar disponíveis vectores de RNA. Os vectores incluem, mas não se limitam a, plasmideos, fagemídeos e genomas virais. Um vector de clonagem é aquele que é capaz de replicar numa célula hospedeira e, tipicamente, é ainda caracterizado por um ou mais locais de restrição para a endonuclease e em que o vector pode ser cortado de um modo determinável e em que a sequência de DNA desejada pode estar ligada de tal modo que o novo vector recombinante retém a sua capacidade para replicar numa célula hospedeira. No caso dos plasmideos, a replicação da sequência desejada pode ocorrer tantas vezes quantas o plasmídeo aumentar em número de cópias no interior da bactéria hospedeira ou apenas uma única vez por hospedeiro antes do hospedeiro se reproduzir por mitose. No caso do fago, a replicação pode ocorrer activamente durante uma fase lítica ou passivamente durante uma fase lisogénica. Um vector de expressão é aquele no qual pode ser inserida uma sequência de DNA desejada, por restrição e ligação, de tal modo que é operacionalmente unida a sequências reguladoras e pode ser expressa como um transcrito de RNA. Os vectores podem conter ainda uma ou mais sequências marcadoras 24 adequadas para a utilização na identificação de células que foram ou não transformadas ou transfectadas com o vector. As sequências marcadoras incluem, por exemplo, genes que codificam para proteínas que aumentam ou diminuem quer a resistência quer a sensibilidade aos antibióticos ou outros compostos, genes que codificam para enzimas cujas actividades são detectáveis por ensaios padrão conhecidos na arte (por exemplo, β-galactosidase, luciferase ou fosfatase alcalina) e genes que afectam visivelmente o fenótipo de células transformadas ou transfectadas, hospedeiros, colónias ou placas (por exemplo, várias proteínas fluorescentes, tais como a proteína verde fluorescente, GFP). Os vectores preferidos são aqueles capazes de replicação e expressão autónoma dos produtos dos genes estruturais presentes nos segmentos de DNA aos quais são operacionalmente unidos.

Como aqui utilizado, a sequência codificante e as sequências reguladoras são referidas como sendo "operacionalmente" unidas quando estão ligadas covalentemente de tal modo a colocar a expressão ou a transcrição da sequência codificante sob a influência ou controlo das sequências reguladoras. Se for desejado que as sequências codificantes sejam traduzidas numa proteína funcional, duas sequências de DNA são referidas como sendo operacionalmente unidas se a indução de um promotor nas sequências reguladoras 5' resultar na transcrição da sequência codificante e se a natureza da ligação entre as duas sequências de DNA não (1) resultar na introdução de uma mutação frame-shift, (2) interferir com a capacidade da região promotora para dirigir a transcrição das sequências codificantes, ou (3) interferir com a capacidade do transcrito de RNA correspondente para ser traduzido numa 25 proteína. Assim, uma região promotora seria operacionalmente unida a uma sequência codificante se a região promotora for capaz de efectuar a transcrição dessa sequência de DNA de tal modo que o transcrito resultante possa ser traduzido na proteína ou polipéptido desejado. A natureza exacta das sequências reguladoras necessárias para a expressão dos genes pode variar entre espécies ou tipos de células, mas deve incluir, de um modo geral, de acordo com o necessário, sequências 5' não transcritas e sequências 5' não traduzidas, envolvidas com a iniciação da transcrição e da tradução, respectivamente, tais como a TATA box, sequência capping, sequência CAAT e semelhantes. Em particular, tais sequências reguladoras 5' não transcritas incluirão uma região promotora que inclui uma sequência promotora para o controlo da transcrição do gene unido operacionalmente. As sequências reguladoras podem também incluir sequências enhancer ou sequências activadoras a montante, de acordo com o desejado. Os vectores da invenção podem incluir, opcionalmente, sequências 5' líder ou de sinal. A escolha e a concepção de um vector apropriado está contemplada na capacidade e poder de um especialista comum na arte.

Os vectores de expressão contendo todos os elementos necessários para a expressão estão disponíveis comercialmente e são conhecidos dos especialistas na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al.r Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold spring Harbor Laboratory Press, 1989. As células são geneticamente manipuladas através da introdução nas células de DNA heterólogo (RNA) que codifica para um polipéptido I-ASP oupara um seu fragmento ou variante. Esse DNA heterólogo 26 (RNA) é colocado sob controlo operável dos elementos de transcrição para permitir a expressão do DNA heterólogo na célula hospedeira.

Os sistemas preferidos para a expressão do mRNA em células de mamifero são aqueles tais como o pcDNA3.1 e o pRc/CMV (disponíveis na Invitrogen, Carlsbad, CA) que contêm um marcador selectivo tal como um gene que confere resistência a G148 (que facilita a selecção de linhas celulares tarnsfectadas de um modo estável) e sequências enhancer-promotoras do citomegalovírus (CMV) humano. De um modo adicional, é adequado para a expressão em linhas celulares de primata ou caninas o vector pCEP4 (Invitrogen), o qual contém uma origem de replicação do vírus Epstein Barr (EBV), facilitando a manutenção do plasmídeo como um elemento extracromossómico multicópia. Outro vector de expressão é o plasmídeo pEF-BOS contendo o promotor do Factor de Alongamento do Polipéptido Ια, o qual estimula de um modo eficiente a transcrição in vitro. 0 plasmídeo é descrito por Mishizuma e Nagata (Nuc. Acids Res. 18:5322, 1990) e a sua utilização em experiências de transfecção é divulgada por, por exemplo, Demoulin (Mol Cell. Biol. 16:4710-4716, 1996). Ainda outro vector de expressão preferido é um adenovírus, descrito por Stratford-Perricaudet, o qual é defeituoso para as proteínas EI e E3 (J. Clin. Invest. 90:626-630, 1992). A utilização do adenovírus como um recombinante Adeno.PlA é divulgada por Warnier et al., e injecção intradérmica em murganhos para a imunização contra PIA (Int. J. Câncer, 67:303-310, 1996). O isolamento das moléculas de ácido nucleico I-ASP também torna possível para o operador diagnosticar um distúrbio caracterizado pela expressão (ou sua ausência relativa) 27 destas moléculas. Estes métodos envolvem a determinação da expressão dos ácidos nucleicos I-ASP e/ou polipéptidos daí derivados. Na situação anterior, tais determinações podem ser realizadas através de um qualquer ensaio padrão de determinação do ácido nucleico, incluindo a reacção em cadeia da polimerase, de acordo com o exemplificado nos exemplos abaixo, ou através da experimentação com sondas de hibridação marcadas. A invenção também envolve agentes tais como polipéptidos que se ligam a polipéptidos I-ASP e a complexos de polipéptidos e parceiros de ligação, tais como o p53. Tais agentes de ligação podem ser utilizados, por exemplo, em ensaios de detecção para detectar a presença ou a ausência de polipéptidos I-ASP e complexos de polipéptidos I-ASP e seus parceiros de ligação e em protocolos de purificação para isolar polipéptidos I-ASP e complexos de polipéptidos I-ASP e seus parceiros de ligação. Tais agentes também podem ser utilizados para inibir a actividade natural do polipéptidos I-ASP ou dos seus parceiros de ligação, por exemplo, através da ligação a tais polipéptidos ou aos seus parceiros de ligação ou a ambos. A invenção, consequentemente, engloba agentes de ligação a péptidos os quais, por exemplo, podem ser anticorpos ou fragmentos de anticorpos com a capacidade de ligar selectivamente a polipéptidos I-ASP. Os anticorpos incluem anticorpos policlonais e monoclonais, preparados de acordo com a metodologia convencional.

De um modo significativo, como é bem conhecido na arte, apenas uma pequena porção de uma molécula de anticorpo, o paratopo, está envolvida na ligação do anticorpo ao seu 28 epitopo (ver, em geral, Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7a Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). As regiões pFc' e Fc, por exemplo, são efectoras da cascata do complemento, mas não estão envolvidas na ligação ao antigénio. Um anticorpo do qual a região pFc' foi clivada enzimaticamente, ou que tenha sido produzido sem a região pFc', designado um fragmento F(ab')2, retém ambos os locais de ligação ao antigénio de um anticorpo intacto. De um modo semelhante, um anticorpo do qual a região Fc tenha sido clivada enzimaticamente, ou que tenha sido produzido sem a região Fc, designado como um fragmento Fab, retém um dos locais de ligação ao antigénio de uma molécula intacta de anticorpo. Prosseguindo adiante, os fragmentos Fab consistem numa cadeia leve de anticorpo covalentemente ligada e uma porção da cadeia pesada do anticorpo, denominada Fd. Os fragmentos Fd são a principal determinante da especificidade do anticorpo (um único fragmento Fd pode estar associado com até dez cadeias leves diferentes, sem alterar a especificidade do anticorpo) e os fragmentos Fd retêm a capacidade de ligação ao epitopo em isolamento.

Inseridas na porção de ligação ao antigénio de um anticorpo, como é bem conhecido na arte, existem regiões determinantes de complementaridade (CDRs), as quais interactuam directamente com o epitopo do antigénio e regiões framework (FRs), as quais mantêm a estrutura terciária do paratopo (ver, em geral, Clark, 1986; Roitt, 1991). Em ambas, cadeia pesada do fragmento Fd e cadeia leve das imunoglobulinas IgG, existem quatro regiões framework (FR1 até FR4) separadas, respectivamente, por 29 três regiões determinantes de complementaridade (CDR1 até CDR3) . As CDRs e, em particular, as regiões CDR3 e, mais particularmente, a cadeia pesada CDR3, são grandemente responsáveis pela especificidade dos anticorpos.

Está agora bem estabelecido na arte que as regiões não CDR de um anticorpo de mamífero podem ser substituídas com regiões semelhantes de anticorpos conspecíficos ou heteroespecíficos enquanto retêm a especificidade epitópica do anticorpo original. Tal é mais claramente manifestado no desenvolvimento e utilização de anticorpos "humanizados" nos quais as CDRs não humanas são covalentemente unidas à FR humana e/ou às regiões Fc/pFc' para produzir um anticorpo funcional. Ver, por exemplo, as patentes U.S. 4, 816, 567, 5,225,539, 5,585, 089, 5, 693,762 e 5, 859, 205.

Assim, por exemplo, o Número de Publicação Internacional do PCT WO 92/04381 explica que a produção e utilização dos anticorpos RSV de murina humanizados, nos quais, pelo menos uma porção das regiões FR de murina foram substituídas pelas regiões FR de origem humana. Tais anticorpos, incluindo os fragmentos de anticorpos intactos com capacidade de ligação ao antigénio, são frequentemente referidos como anticorpos "quiméricos".

Os anticorpos monoclonais totalmente humanos também podem ser preparados, por exemplo, por imunização de animais não humanos transgénicos para genes de imunoglobulina humana. Ver, por exemplo, as patentes U.S. 5,814,318, 5,877,397, 6, 091,001, 6, 114,598.

Assim, como é evidente para um especialista comum na arte, a presente invenção também proporciona fragmentos F(ab')2/ 30

Fab, Fv e Fd; os anticorpos quiméricos nos quais as regiões Fc e/ou FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve foram substituídos por sequências humanas ou não humanas, homólogas; os anticorpos de fragmento F(ab')2 quiméricos nos quais as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou cadeia leve da CDR3 foram substituídos por sequências homólogas humanas ou não humanas; os anticorpos do fragmento Fab quimérico nos quais as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou cadeia leve da CDR3 foram substituídos por sequências homólogas humanas ou não-humanas; e os anticorpos do fragmento Fd quimérico nos quais as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 foram substituídos por sequências homólogas humanas ou não-humanas. A presente invenção também inclui os designados anticorpos de cadeia simples.

Assim, a invenção envolve polipéptidos de tamanho e tipo numerosos que se ligam especificamente a polipéptidos I-ASP e complexos de ambos polipéptidos I-ASP e seus parceiros de ligação. Estes polipéptidos podem ser derivados também de outras fontes além da tecnologia de anticorpos. Por exemplo, tais agentes de ligação a polipéptidos podem ser proporcionados por bases de dados de péptidos degenerados, os quais podem ser prontamente preparados em solução, na forma imobilizada ou como bases de dados de fagos. As bases de dados combinatórias também podem ser sintetizadas a partir de péptidos contendo um ou mais aminoácidos. As bases de dados podem, adicionalmente, ser sintetizadas por porções peptóides e não peptídicas sintéticas. A apresentação de fagos pode ser particularmente eficaz na identificação de péptidos ligantes, úteis de acordo com invenção. De um modo breve, é preparada uma base de dados de fagos (utilizando, por exemplo, os fagos ml3, fd ou 31 lambda), apresentando inserts desde 4 a cerca de 80 resíduos de aminoácidos, utilizando procedimentos convencionais. Os inserts podem representar, por exemplo, um array enviesado ou completamente degenerado. Pode, depois, seleccionar-se inserts que contêm fagos, os quais se ligam ao polipéptidos I-ASP. Este processo pode ser repetido através de vários ciclos de re-selecção do fago que se liga ao polipéptido I-ASP. Ciclos repetidos levam ao enriquecimento de determinadas sequências transportadoras de fagos. A análise de sequências de DNA pode ser conduzida para identificar as sequências dos polipéptidos expressos. A porção linear mínima da sequência que liga ao polipéptido I-ASP pode ser determinada. O procedimento pode ser repetido, utilizando uma base de dados pré-concebida contendo inserts contendo parte ou toda a porção linear mínima mais um ou mais resíduos degenerados adicionais a montante ou a jusante. Também podem ser utilizados métodos de detecção de dupla hibridação em leveduras para identificar polipéptidos que ligam aos polipéptidos I-ASP. Assim, os polipéptidos I-ASP da invenção, ou seus fragmentos, podem ser utilizados para detectar bases de dados de péptidos, incluindo bases de dados de apresentação de fagos, para identificar e seleccionar parceiros de ligação peptídicos dos polipéptidos I-ASP da invenção. Tais moléculas podem ser utilizadas, de acordo com o descrito, para ensaios de detecção, para protocolos de purificação, para interferir directamente com os I-ASP em funcionamento e para outros propósitos que se tornarão evidentes para os especialistas comuns na arte. A invenção proporciona ainda métodos eficientes de identificação de agentes farmacológicos ou compostos condutores para agentes activos ao nível de uma função 32 celular modulável do I-ASP. Em particular, tais funções incluem a ligação do p53 e a apoptose. De um modo geral, os métodos de detecção envolvem o ensaio para compostos que interferem com a actividade do I-ASP, tais como a ligação ao p53, etc., embora os compostos que potenciam a actividade do I-ASP também possam ser sujeitos a ensaios utilizando os métodos de detecção. Tais métodos são adaptáveis à detecção de compostos automatizada, com elevada produtividade. As indicações terapêuticas alvo para agentes farmacológicos detectadas pelos métodos de detecção, são limitadas apenas na medida em que a função celular alvo é sujeita a modulação por alteração da formação de um complexo compreendendo um polipéptido I-ASP ou um seu fragmento e um ou mais alvos de ligação intracelulares so I-ASP mais naturais, tais como o p53. As indicações de alvos incluem a apoptose. É proporcionada uma larga variedade de ensaios para agentes farmacológicos, incluindo ensaios de ligação in vitro de proteina-proteina marcada, ensaios de mudança da mobilidade electroforética, imunoensaios, ensaios com base celular tais como detecções de dois ou três híbridos, ensaios de expressão, etc. Por exemplo, as detecções de híbridos são utilizadas para examinar rapidamente o efeito dos ácidos nucleicos transfectados na ligação intracelular dos polipéptidos I-ASP ou dos seus fragmentos a alvos intracelulares específicos. Os ácidos nucleicos transfectados podem codificar, por exemplo, bases de dados combinatoriais de péptidos ou moléculas antisense. Os reagentes convenientes para tais ensaios, por exemplo, proteínas de fusão GAL4, são conhecidos na técnica. Um ensaio com base celular exemplificativo envolve a transfecção de uma célula com um ácido nucleico que codifica 33 para um polipéptido I-ASP fundido com um domínio GAL4 de ligação ao DNA e um ácido nucleico que codifica para um domínio p53, o qual interactua com o I-ASP fundido com um domínio de activação da transcrição, tal como VP16. A célula também contém um gene repórter ligado operativamente a uma região reguladora da expressão genética, tal como um ou mais locais de ligação GAL4. A activação da transcrição do gene repórter ocorre quando os polipéptidos de fusão ASP e p53 se ligam de tal modo que o domínio de ligação ao DNA GAL4 e o domínio de activação transcricional VP16 são aproximados para permitir a transcrição do gene repórter. Os agentes que modulam uma função celular mediada pelo I-ASP são então detectados através de uma alteração na expressão do gene repórter. Os métodos para determinar alterações na expressão de um gene repórter são conhecidos na arte.

Os fragmentos I-ASP utilizados nos métodos, quando não são produzidos por um ácido nucleico transfectado, são adicionados a uma mistura do ensaio como um polipéptido isolado.

Os polipéptidos I-ASP são preferencialmente produzidos de um modo recombinante, embora tais polipéptidos possam ser isolados dos extractos biológicos. Os polipéptidos I-ASP produzidos recombinantemente incluem proteínas quiméricas compreendendo uma fusão de uma proteína I-ASP com outro polipéptido, por exemplo, um polipéptido capaz de proporcionar ou potenciar a ligação proteína-proteína, a ligação específica de ácidos nucleicos na sequência (tal como GAL4), aumentando a estabilidade do polipéptido I-ASP sob as condições do ensaio, ou proporcionando uma porção detectável, tal como uma proteína verde fluorescente ou um epitopo Flag. 34 A mistura do ensaio é compreendida por um alvo de ligação ao I-ASP intracelular natural tal como o p53 ou um seu fragmento capaz de interagir com o I-ASP. Enquanto podem ser utilizados alvos de ligação ao I-ASP naturais, é frequentemente preferido utilizar porções (por exemplo, péptidos ou fragmentos de ácido nucleico) ou análogos (i.e. agentes que mimetizam as propriedades de ligação ao I-ASP do alvo de ligação natural para efeitos do ensaio) do alvo de ligação ao I-ASP desde que a porção ou análogo proporcione afinidade e avidez de ligação ao fragmento I-ASP mensurável no ensaio. A mistura do ensaio também compreende um agente farmacológico candidato. De um modo típico, é realizada uma pluralidade de misturas de ensaio em paralelo com diferentes concentrações do agente, para obter uma resposta diferente para as várias concentrações. De um modo típico, uma destas concentrações serve como controlo negativo, i.e., para a concentração zero de agente ou para a concentração zero de agente abaixo dos limites de detecção do ensaio. Os agentes candidatos englobam várias classes químicas, embora tipicamente sejam compostos orgânicos. De um modo preferido, os agentes farmacológicos candidatos são pequenos compostos orgânicos, i.e., aqueles contendo um peso molecular de mais de 50, embora menos de cerca de 2.500, de um modo preferido, menos de cerca 1.000 e, de um modo mais preferido, menos de cerca de 500. Os agentes candidatos compreendem grupos químicos funcionais necessários para interacções estruturais com polipéptidos e/ou ácidos nucleicos e, tipicamente, incluem pelo menos um grupo amina, carbonilo, hidroxilo ou carboxilo, de um modo preferido, pelo menos, dois dos grupos químicos funcionais e, de um modo mais preferido, pelo menos três dos grupos 35 químicos funcionais. Os agentes candidatos podem compreender uma estrutura de carbono cíclica ou heterocíclica e/ou estruturas aromáticas ou poliaromáticas substituídas com um ou mais dos grupos funcionais acima identificados. Os agentes candidatos também podem ser biomoléculas tais como péptidos, sacarídeos, ácidos gordos, esteróis, isoprenóides, purinas, pirimidinas, derivados ou análogos estruturais dos compostos acima ou suas combinações e semelhantes. Quando o agente é um ácido nucleico, o agente tipicamente é uma molécula de DNA ou RNA, embora os ácidos nucleicos modificados, como aqui definidos, também sejam contemplados.

Os agentes candidatos são obtidos a partir de uma larga variedade de fontes, incluindo bases de dados de compostos sintéticos ou naturais. Por exemplo, estão disponíveis vários meios para a síntese aleatória e direccionada de uma larga variedade de compostos orgânicos e biomoléculas, incluindo a expressão de oligonucleótidos aleatórios, bases de dados combinatoriais orgânicas sintéticas, bases de dados de apresentação de fagos de péptidos aleatórios e semelhantes. De um modo alternativo, as bases de dados de compostos naturais na forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetais e animais estão disponíveis ou são prontamente produzidos. De um modo adicional, as bases de dados produzidas natural ou sinteticamente e os compostos podem ser prontamente modificados através de meios químicos, físicos e bioquímicos convencionais. Adicionalmente, agentes farmacológicos conhecidos podem ser sujeitos a modificações químicas direccionadas ou aleatórias, tais como acilação, alquilação, esterificação, amidificação, etc. para produzir análogos estruturais dos agentes. 36

Pode ser incluída na mistura uma variedade de outros reagentes. Estes incluem reagentes tais como sais, tampões, proteínas neutras (por exemplo, albumina), detergentes, etc., os quais podem ser utilizados para facilitar a ligação óptima proteína-proteína e/ou proteína-ácido nucleico. Um tal reagente pode também reduzir as interacções não-específicas ou o ruído de fundo dos componentes da reacção. Outros reagentes que melhoram a eficiência do ensaio, tais como a protease, inibidores, inibidores da nuclease, agentes antimicrobianos e semelhantes, também podem ser utilizados. A mistura dos materiais de ensaio anteriores é incubada sob condições sob as quais, mas para a presença do agente farmacológico candidato, o polipéptido I-ASP se liga especificamente ao alvo de ligação celular, uma sua porção ou um seu análogo. A ordem da adição de componentes, temperatura de incubação, tempo de incubação e outros parâmetros do ensaio podem ser prontamente determinados. Tal experimentação envolve meramente a optimização dos parâmetros do ensaio, não a composição fundamental do ensaio. As temperaturas de incubação estão, tipicamente, entre 4 °C e 40 °C. Os tempos de incubação são preferencialmente minimizados para facilitar a detecção rápida, com elevada produtividade e, tipicamente, estão entre 0,1 e 10 horas.

Após a incubação, a presença ou ausência de ligação específica entre o polipéptido I-ASP e um ou mais alvos de ligação é detectada por qualquer método conveniente disponível para o utilizador. Para ensaios do tipo ligação livre celular, é normalmente utilizado um passo de separação para separar os componentes ligados dos não 37 ligados. 0 passo de separação pode ser conseguido de vários modos. De um modo conveniente, pelo menos um dos componentes está imobilizado num substrato sólido, a partir do qual os componentes não ligados podem ser facilmente separados. 0 substrato sólido pode ser constituído por uma larga variedade de materiais e uma larga variedade de formas, por exemplo, placa de microtitulação, microesfera, vareta de nível, partícula de resina, etc. 0 substrato é, preferencialmente, escolhido para as proporções máximas de sinal para ruído, primariamente para minimizar a ligação do ruído de fundo, assim como para facilitar a separação e custo. A separação pode ser realizada por exemplo, por remoção de uma esfera ou vareta de nível a partir de um reservatório, esvaziando ou diluindo um reservatório tal como um poço de placa de microtitulação, lavando uma esfera, partícula, coluna cromatográfica ou filtro com uma solução de lavagem ou solvente. Por exemplo, quando o substrato sólido é uma placa de microtitulação, os poços podem ser lavados várias vezes com uma solução de lavagem, a qual tipicamente inclui aqueles componentes da mistura de incubação que não participam em ligações específicas tais como sais, tampão, detergente, proteína não específica, etc. Quando o substrato sólido é uma esfera magnética, as esferas podem ser lavadas uma ou mais vezes com uma solução de lavagem e isoladas utilizando um íman. A detecção pode ser realizada de qualquer modo conveniente para ensaios com base em células, tais como detecções de dois ou três híbridos. 0 transcrito resultante do ensaio de transcrição de um gene repórter do polipéptido I-ASP interactuando com uma molécula alvo, tipicamente, codifica 38 para um produto directa ou indirectamente detectável, por exemplo, actividade da β-galactosidase, actividade da luciferase e semelhantes. Para os ensaios de ligação livre em células, um dos componentes compreende normalmente, ou está acoplado a, um marcador detectável. Pode ser utilizada uma larga variedade de marcadores, tais como aqueles que proporcionam a detecção directa (por exemplo, radioactividade, luminescência, densidade óptica ou electrónica, etc.) ou detecção indirecta (por exemplo, epitopo marcador, tal como o epitopo FLAG, enzima marcador, tal como a peroxidase de armorácio, etc.). 0 marcador pode estar ligado a um parceiro de ligação ao I-ASP, ou incorporado na estrutura do parceiro de ligação.

Pode ser utilizada uma variedade de métodos para detectar o marcador, dependendo da natureza do marcador e de outros componentes do ensaio. Por exemplo, o marcador pode ser detectado enquanto ligado ao substrato sólido ou subsequentemente à separação do substrato sólido. Os marcadores podem ser directamente detectados através de densidade óptica ou electrónica, emissões radioactivas, transferências de energia não radioactivas etc., ou indirectamente detectados com conjugados de anticorpo, conjugados de estrepavidina-biotina, etc. Os métodos para detectar os marcadores são bem conhecidos na arte. A invenção proporciona agentes específicos de ligação ao I-ASP, métodos de identificação e de produção de tais agentes e a sua utilização no diagnóstico, terapia e desenvolvimento farmacêutico. Por exemplo, os agentes farmacológicos específicos para o I-ASP são úteis numa variedade de aplicações diagnósticas e terapêuticas, especialmente quando a doença ou o prognóstico da doença 39 está associado com a utilização indevida de uma via envolvendo I-ASP, por exemplo, a apoptose, etc. Os novos agentes específicos de ligação ao I-ASP incluem anticorpos específicos para o I-ASP e outros agentes de ligação intracelulares identificados com ensaios tais como detecções de dois híbridos e agentes de ligação intracelulares não naturais, identificados em detecções de bases de dados químicas e semelhantes.

De um modo geral, a especificidade da ligação do I-ASP a um agente de ligação é demonstrada por constantes de equilíbrio de ligação. Os alvos que são capazes de se ligar selectivamente a um polipéptido I-ASP têm, preferencialmente, constantes de equilíbrio de, pelo menos, cerca de 107 M"1, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 108 M”1 e, do modo msais preferido, pelo menos, cerca de 109 M"1. A larga variedade de ensaios com base em células e isentos de células podem ser utilizados para demonstrar a ligação específica a I-ASP. Os ensaios com base em células incluem detecções com um, dois ou três híbridos, ensaios nos quais a transcrição mediada por I-ASP é inibida ou aumentada, etc.. Os ensaios isentos de células incluem ensaios de ligação I-ASP-proteína, imunoensaios, etc. Outros ensaios úteis para agentes de detecção que se ligam a polipéptidos I-ASP incluem transferência da energia de ressonância da fluorescência (FRET) e análise da mudança da mobilidade electroforética (EMSA).

Podem ser empregues várias técnicas para introduzir os ácidos nucleicos da invenção em células, dependendo se os ácidos nucleicos são introduzidos in vitro ou in vivo num hospedeiro. Tais técnicas incluem a transfecção de precipitados de ácido nucleico-CaP04, a transfecção dos 40 ácidos nucleicos associados com DEAE, transfecção com um retrovirus incluindo o ácido nucleico de interesse, transfecção mediada por lipossoma e semelhantes. Para certas utilizações, é preferido direccionar o ácido nucleico a determinadas células. Em tais casos, um veiculo utilizado para distribuir um ácido nucleico da invenção numa célula (por exemplo, um retrovirus, ou outro vírus; um lipossoma) pode ter associada uma molécula de direccionamento. Por exemplo, uma molécula tal como um anticorpo específico para uma proteína de membrana de superfície na célula alvo ou um ligando para um receptor na célula alvo pode estar ligada ou incorporada no veículo de distribuição do ácido nucleico. Por exemplo, quando são empregues lipossomas para distribuir os ácidos nucleicos da invenção, as proteínas que se ligam a uma proteína de membrana de superfície, associadas com a endocitose, podem ser incorporadas na formulação do lipossoma para direccionar e/ou facilitar a recolha. Tais proteínas incluem proteínas ou seus fragmentos de cápside, tróficos para um determinado tipo de célula, anticorpos para proteínas que são submetidas a internalização na ciclização, proteínas que direccionam a localização intracelular e aumentam o período de vida médio intracelular e semelhantes. Os sistemas de distribuição polimérica também foram utilizados com sucesso para distribuir ácidos nucleicos no interior das células, como é conhecido pelos especialistas na arte. Tais sistemas permitem mesmo a distribuição oral dos ácidos nucleicos.

Quando administradas, as composições terapêuticas da presente invenção são administradas em preparações farmaceuticamente aceitáveis. Tais preparações podem conter, de um modo usual, concentrações farmaceuticamente 41 aceitáveis de sal, agentes de tamponização, agentes conservantes, veículos compatíveis, agentes potenciadores imunitários suplementares, tais como adjuvantes e citocinas e, opcionalmente, outros agentes terapêuticos, tais como agentes quimioterapêuticos.

Os agentes terapêuticos da invenção podem ser administrados por qualquer via convencional, incluindo injecção ou por infusão gradual ao longo do tempo. A administração pode, por exemplo, ser oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavitária, subcutânea ou transdérmica. Quando os anticorpos são utilizados terapeuticamente, uma via de administração preferida é por aerossol pulmonar. As técnicas para preparar sistemas de distribuição por aerossol contendo anticorpos são bem conhecidas para os especialistas na arte. De um modo geral, tais sistemas devem utilizar componentes que não prejudiquem significativamente as propriedades biológicas dos anticorpos, tais como a capacidade de ligação ao paratopo (ver, por exemplo, Sciarra and Cutie, "Aerosols", em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edição, 1990, pp. 1694-1712; incorporada por referência). Os especialistas na arte podem determinar prontamente os vários parâmetros e condições para produzir aerossóis de anticorpo sem recurso a experimentação indevida. Quando se utilizam as preparações antisense da invenção, é preferida a administração intravenosa lenta.

As composições da invenção são administradas em quantidades eficazes. Uma "quantidade eficaz" é aquela quantidade de uma composição que, isolada, ou em conjunto com doses adicionais, produz a resposta desejada. No caso de tratar uma determinada doença, tal como o cancro, a resposta 42 desejada é a inibição do progresso da doença. Tal pode envolver apenas o abrandamento temporário do progresso da doença, embora de um modo mais preferido, envolva a interrupção permanente do progresso da doença. Tal pode ser controlado por métodos de rotina ou pode ser controlado de acordo com os métodos de diagnósticos da invenção aqui discutidos.

Tais quantidades vão depender, evidentemente, da condição particular a ser tratada, da gravidade da condição, dos parâmetros individuais do doente incluindo a idade, condição fisica, dimensão e peso, a duração do tratamento, a natureza da terapia concorrente (se alguma), a via especifica de administração e factores semelhantes compreendidos pelo conhecimento e competências do profissional de saúde. Estes factores são bem conhecidos para os especialistas comuns na arte e podem ser destinados a não mais do que experimentação de rotina. É geralmente preferido que uma dose máxima dos componentes individuais ou suas combinações seja utilizada, isto é, a dose segura mais elevada de acordo com o parecer médico. Deve ser entendido pelos especialistas comuns na arte, no entanto, que um doente pode insistir numa dose inferior ou numa dose tolerável por razões médicas, razões psicológicas ou por virtualmente quaisquer outras razões.

As composições farmacêuticas utilizadas nos métodos anteriores são preferencialmente estéreis e contêm uma quantidade eficaz de anticorpo para produzir a resposta desejada numa unidade de peso ou volume adequada para a administração a um doente. A resposta pode, por exemplo, ser medida por determinação da transdução de sinal aumentada ou inibida pela composição, através de um sistema 43 repórter como aqui descrito, por medição dos efeitos a jusante, tais como a expressão genética ou por medição dos efeitos fisiológicos da composição, tais como a regressão de um tumor, o decréscimo dos sintomas de uma doença, a modulação da apoptose, etc. De um modo semelhante, os efeitos das moléculas antisense de I-ASP podem ser prontamente determinados por medição da expressão dos genes individuais em células às quais é adicionada uma composição antisense. São conhecidos outros ensaios para um especialista comum na arte e podem ser empregues para medir o nivel de resposta.

As doses de anticorpo administrado a um indivíduo podem ser seleccionadas de acordo com diferentes parâmetros, em particular, de acordo com o modo de administração utilizado e com o estado do indivíduo. Outros factores incluem o período de tratamento desejado. No caso de uma resposta num indivíduo ser insuficiente para as doses iniciais aplicadas, podem ser empregues doses superiores (ou doses efectivamente por uma via de distribuição diferente, mas localizada) na extensão permitida pela tolerância do doente.

De um modo geral, as doses de anticorpo são formuladas e administradas em doses compreendidas entre 1 ng e 1 mg e, de um modo preferido, entre 10 ng e 100 ng, de acordo com qualquer procedimento padrão na arte. Outros protocolos para a administração das composições do anticorpo são conhecidos do especialista comum na arte, nos quais a quantidade da dose, horário das injecções, locais das injecções, modo de administração (por ex., intratumoral) e semelhantes variam dos anteriores. A administração das composições do anticorpo a mamíferos além de humanos, por 44 exemplo, para efeitos de teste ou efeitos terapêuticos veterinários, é realizada sob, substancialmente, as mesmas condições que as descritas acima. Um indivíduo, como aqui utilizado, é um mamífero, preferencialmente um humano e, incluindo um primata não humano, vaca, cavalo, porco, ovelha, cabra, cão, gato ou roedor.

Quando administradas, as preparações farmacêuticas da invenção são aplicadas nas quantidades farmaceuticamente aceitáveis e em composições farmaceuticamente aceitáveis. 0 termo "farmaceuticamente aceitável" significa um material não tóxico que não interfere com a eficácia da actividade biológica dos ingredientes activos. Tais preparações podem, de um modo rotineiro, conter sais, agentes de tamponização, agentes conservantes, veículos compatíveis e, opcionalmente, outros agentes terapêuticos. Quando utilizados em medicina, os sais devem ser farmaceuticamente aceitáveis, mas os sais não farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados, de um modo conveniente, para preparar os seus sais farmaceuticamente aceitáveis e não estão excluídos do âmbito da invenção. Tais sais farmacologicamente e farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a, aqueles preparados a partir dos ácidos seguintes: clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico e semelhantes. Também podem ser preparados sais farmaceuticamente aceitáveis como sais de metais alcalinos ou alcalino-terrosos, tais como os sais de sódio, potássio ou cálcio.

As composições de anticorpo podem ser combinadas, se desejado, com um veículo farmaceuticamente aceitável. 0 termo "veículo farmaceuticamente aceitável" como aqui 45 utilizado significa um ou mais agentes de preenchimento sólidos ou liquidos compatíveis, diluentes ou substâncias de encapsulação que são adequadas para a administração num humano. 0 termo "veiculo" denota um ingrediente orgânico ou inorgânico, natural ou sintético, com o qual o ingrediente activo é combinado para facilitar a aplicação. Os componentes das composições farmacêuticas também são capazes de ser co-misturados com as moléculas da presente invenção e entre si, de um modo tal que não há interacção que prejudique substancialmente a eficácia farmacêutica desej ada.

As composições farmacêuticas podem conter agentes de tamponização adequados, incluindo: ácido acético num sal; ácido citrico num sal; ácido bórico num sal; e ácido fosfórico num sal.

As composições farmacêuticas também podem conter, opcionalmente, agentes conservantes adequados tais como: cloreto de benzalcónio; clorobutanol; parabenos e timerosal.

As composições farmacêuticas podem, de um modo conveniente, ser apresentadas numa forma de unidade de dosagem e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na arte de farmácia. Todos os métodos incluem o passo de colocar o agente activo em associação com um veiculo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as composições são preparadas por, uniformemente e intimamente, colocar o composto activo em associação com um veiculo liquido, um veiculo sólido finamente dividido, ou ambos e depois, se necessário, modelar o produto. 46

As composições adequadas para a administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas, tais como cápsulas, comprimidos, pílulas, cada um contendo uma quantidade pré-determinada do composto activo. Outras composições incluem suspensões em líquidos aquosos ou líquidos não aquosos, tais como xarope, elixir ou uma emulsão.

As composições adequadas para a administração parenteral compreendem, de um modo conveniente, uma preparação estéril aquosa ou não aquosa, de anticorpos, a qual é preferencialmente isotónica com o sangue do receptor. Esta preparação pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos, utilizando agentes de dispersão ou humidificantes adequados e agentes de suspensão. A preparação injectável estéril também pode ser uma solução ou uma suspensão injectável estéril num diluente não tóxico parenteralmente aceitável, por exemplo, como uma solução de 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregues estão a água, solução de Ringer e solução isotónica de cloreto de sódio. De um modo adicional, são empregues, de um modo convencional, óleos fixantes, estéreis como um solvente ou meio de suspensão. Para este efeito, qualquer óleo moderadamente fixante pode ser empregue, incluindo os mono- ou diglicéridos sintéticos. De um modo adicional, ácidos gordos tais como o ácido oleico podem ser utilizados na preparação de injectáveis. A formulação adequada do veículo para administrações orais, subcutâneas, intravenosas, intramusculares, etc. pode ser encontrada em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA. 47

Num outro aspecto da invenção, os anticorpos são utilizados na produção de um medicamento para modular a apoptose. 0 medicamento pode ser colocado num frasco e ser incorporado num kit para ser utilizado para tratar um indivíduo. Em certas formas de realização, outros medicamentos que modulam as mesmas respostas ou que afectam de um modo favorável as composições de anticorpo, também podem ser incluídos no mesmo kit, tais como agentes quimioterapêuticos. Os kits podem incluir instruções ou outro material impresso sobre como administrar as composições de anticorpo e quaisquer outros componentes do kit. É descrita, de seguida, uma forma de realização da invenção, apenas a título de exemplo, e com referência aos exemplos, figuras e tabela seguintes; A Figura 1 representa células Saos2 que foram transfectadas com qualquer vector, p53 (5 pg), I-ASP (10 pg) ou p53 + I-ASP e depois incubadas durante 16 horas. As células foram sujeitas a lise em tampão de lise NP40 e 1000 pg de lisado sujeito uma imunoprecipitação realizada com anticorpos policlonais para o I-ASP ligar às esferas de Proteína G. A presença de p53 foi detectada por western blotting dos imunocomplexos, utilizando anticorpo CM1 de p53 policlonal, Figura IA. As células Saos2 foram transfectadas quer com ASP-1 (8 pg) ou ASP-2 (4 pg) , I-ASP (5 pg) e p53 (50 ng) . 40 pL dos lisados correspondentes foram corridos num gel a 10%, o ASP-1 foi detectado com anticorpo V5, o ASP-2 com DX.5410, o I-ASP com anticorpo anti-I-ASP de murganho, o p53 com DOÍ e o PCNA com anticorpo anti-PCNA, Figura 1D. A Figura 1B mostra a indução da apoptose induzida pelo p53 por ASP-1 e ASP-2 e a inibição da apoptose induzida pelo 48 p53 por I-ASP; A Figura 1C apresenta a activação do promotor de resposta do p53, do Bax por ASP-1 e ASP-2 e a inibição e transactivação pelo I-ASP. A Figura 2 representa a sequência de DNA do I-ASP; A Figura 3 representa a sequência da proteína do I-ASP; A Figura 4 mostra que a função apoptótica do p53 é altamente regulada pelos membros da família ASP, in vivo. As linhas de células U20S e MCF-7, que expressam p53 wild type, foram transfectadas com plasmídeos expressando proteinas de acordo com o indicado, juntamente com um marcador de superfície celular CD20 (A-E). As células transfectadas foram retidas e analisadas por FACS. Os gráficos de barras representam a percentagem de células transfectadas com conteúdo em DNA sub-Gl, característico da apoptose. Os plasmideos que expressam RNA antisense do ASP-1, ASP-2 e I-ASP são marcados como α-ASP-l, a-ASP-2 e a-I-ASP, respectivamente. A oncoproteína virai E6 do HPV16 humano está indicada como E6. Nas figuras 4B e 4D, as células foram transfectadas com os plasmídeos, de acordo com o indicado. Subsequentemente, as células U20S e MCF-7 transfectadas foram incubadas com meio contendo cisplatina a concentrações de 5 e 3 pg/mL, respectivamente. 30 horas depois, as células foram colhidas e analisadas de acordo com o acima descrito. Para F e G, ambas as células U20S e MCF-7 foram transfectadas com plasmídeos expressando proteínas de acordo com o indicado. A co-expressão do ASP ou do p53 e do Bax ou mdm2 endógeno foi visualizada após fixação celular, por dupla marcação imunofluoresecente, de acordo com o indicado na figura 4G. Para a figura 4F, foram examinadas 200 células U20S ou MCF-7, transfectadas quer 49 apenas com vector quer com plasmídeos ASPP, relativamente a sobre-expressão da proteína Bax endógena. Os gráficos de barras representam o valor médio de, pelo menos, três experiências independentes. A Figura 5A ilustra um modelo que descreve a interacção dos membros da família ASP com p65, IkB e p53; as figuras 5C e 5D são representações gráficas da capacidade do IkB afectar a função de transactivação do p53 nos promotores Bax e mdm2 na presença e ausência do ASP-2. A Figura 6A é uma representação gráfica da capacidade do p65 wild type e do mutante de delecção Δρβ5 para transactivar um plasmídeo repórter NFkB; a figura 6B é uma representação gráfica da indução da apoptose em células que expressam e co-expressam o p53, ASP-2, p65 e Δρβ5. A figura 7A ilustra o efeito potenciador do I-ASP na função de transformação da E7; a figura 7B ilustra o efeito potenciador do I-ASP na resistência celular à cisplatina; e A Tabela 1 representa um resumo da expressão do mRNA do ASP-1, ASP-2 e I-ASP em 40 pares de amostras de RNA normais e tumorais emparelhadas, derivadas de tumores mamários de Grau I e II, expressando p53 wild type.

Exemplo 1

Uma sequência recentemente isolada, Inibidor Associado a reL (RAI), foi identificada como uma proteína p65 de ligação a reL A, a qual contém 315 aminoácidos. A RAI não tem o domínio α-helicoidal do ASP-1 ou ASP-2 mas contém a região rica em prolina, as repetições de anquirina e o 50 domínio SH3. Os resíduos de contacto p53 do ASP-2 também são conservados na RAI. Para investigar a actividade da RAI que designámos de I-ASP, clonámos a sequência codificante num vector de expressão de mamífero pcDNA3. Também sintetizámos um péptido encontrado (RLQPALPPEAQSVPELEE) em I-ASP, o qual não possui semelhança de sequência com o ASP-1 e o ASP-2. Um anticorpo de murganho específico para este péptido I-ASP único não intereage quer com o ASP-1 quer com o ASP-2 (dados não apresentados). Utilizando este anticorpo específico de murganho anti-I-ASP para imunoprecipitar ο I-ASP transfectado em células Saos-2, fomos capazes de demonstrar que o I-ASP também pode interactuar com o p53 (figura IA) . Tal como o mutante ASP-2, 53BP2/ASP-2 (600-1128), a expressão do I-ASP não induziu a apoptose por si só. Quando o I-ASP foi co-expresso com o p53, tinha um efeito inibidor pequeno sobre a função apoptótica do ρ53. O efeito mais significativo do I-ASP sobre a função apoptótica do p53 foi observado quando o ASP-1 ou o ASP-2 foram co-expressos. Em concordância com a nossa previsão, a co-expressão do I-ASP inibiu a função apoptótica aumentada do p53 efectuada pelo ASP-1 e ASP-2 (figura 1B). De um modo semelhante, a co-expressão do I-ASP juntamente com o ASP-1 ou o ASP-2 foi capaz de abolir completamente a capacidade de ambos ASP-1 e ASP-2 para estimular a função de transactivação do p53 no promotor Bax (figura 1C) . A co-expressão do I-ASP não alterou significativamente os níveis de expressão quer do p53, quer do ASP (figura 1D) . Estes resultados indicaram que a função pro-apoptótica in vivo do ASP-1 e do ASP-2 pode ser regulada pelo inibidor natural I-ASP. Assim, o equilíbrio entre os níveis de expressão do ASP-1, ASP-2 e I-ASP podem determinar o destino da célula, i.e., se uma célula vive ou morre. 51

Exemplo 2

Ao contrário do ASP-1 e do ASP-2, o nível de expressão do I-ASP foi geralmente baixo nas amostras testadas de tecido de tunor mamário e normal. No entanto, a sobre-expressão do I-ASP foi detectada em 8 dos tecidos tumorais quando comparada com os seus controlos normais equivalentes (Tabela 1) . 0 fenómeno mais surpreendente foi a correlação da expressão normal do ASP-1 e do ASP-2 com a sobre-expressão do I-ASP. 7 dos tumores com sobre-expressão de I-ASP não tiveram qualquer subregulação da expressão do ASP-1 e do ASP-2 (Tabela 1) . Este resultado suporta a discussão relativa à importância biológica do I-ASP como o inibidor natural do ASP-1 e ASP-2 in vivo.

Exemplo 3

Para estudar os papéis que os membros da família ASP endógenos desempenham na regulação da apoptose induzida pelo p53 endógeno, foram introduzidos o ASP-1 e o ASP-2 nas linhas celulares U20S e MCF7, as quais expressam o p53 wild type. Quando expressos nestas células, o ASP-1 e o ASP-2 induziram a apoptose (figura 4A). A ocoproteína virai E6, a qual é derivada do vírus do papiloma humano e a qual se pode ligar e direccionar especificamente para o p53 para a degradação, inibiu a apoptose induzida pelo ASP-1 ou ASP-2, demonstrando que o ASP-1 e o ASP-2 podem induzir a apoptose dependente do p53.

Também foi estudada a função negativa dominante da 53BP2 e do I-ASP na inibição da apoptose induzida pelo p53 endógeno em resposta aos danos no DNA. Antes da exposição à cisplatina, as células U20S e MCF7 foram transfectadas com 52 plasmídeos que codificam para a E6 do HPV16, I-ASP ou 53BP2. A percentagem de células transfectadas a morrer de apoptose em resposta ao tratamento com cisplatina foi depois determinada por análise FACS (figura 4B) . 0 tratamento com cisplatina induziu mais de 20% das células transfectadas a morrer por apoptose. A expressão da E6 reduziu a percentagem das células apoptóticas para baixo de 15%, sugerindo que a cisplatina induz a apoptose dependente do p53 nas células U20S. De um modo concordante, a expressão do I-ASP e da 53BP2 foi capaz de inibir a apoptose induzida por cisplatina numa extensão semelhante à E6. Estes resultados sugerem que a função apoptótica do p53 endógeno pode ser regulada pela expressão dos membros da família ASP.

Para demonstrar ainda que os membros endógenos da família ASP desempenham papéis significativos na regulação da função apoptótica do p53, foi utilizada uma abordagem antisense. Foram clonados fragmentos das extremidades 5' dos cDNAS do ASP-1, ASP-2 e do I-ASP num vector de expressão de mamíferos numa orientação antisense e foi testada a capacidade do RNA antisense para inibir especificamente a síntese proteica dos membros da família ASP in vitro (dados não apresentados). A expressão do ASP-1 antisense apenas inibiu a apoptose induzida pelo ASP-1 mas não pelo ASP-2. De um modo semelhante, a expressão do ASP-2 antisense apenas inibiu a apoptose induzida pelo ASP-2 mas não pelo ASP-1. O efeito específico do ASP-1 e do ASP-2 antisense foi adicionalmente suportado pela observação de que a co-expressão do ASP-1 e do ASP-2 antisense não influenciou a apoptose mediada pelo Bax sob as mesmas condições (figura 4C) . Deste modo, permitiu investigar o papel do ASP-1 e do ASP-2 endógenos na regulação da função 53 apoptótica do p53 endógeno em resposta aos danos no DNA. As células U20S e MCF-7 foram transfectadas com os vários plasmídeos de expressão antes do tratamento com cisplatina. A análise FACS demonstrou que cerca de 20-30% das células transfectadas de controlo foram sujeitas a apoptose. A expressão da E6 reduziu a percentagem de células apoptóticas para metade, indicando que a cisplatina pode induzir a apoptose através de ambas as vias dependente e independente do p53, nestas células. A expressão do RNA antisense do ASP-1 e ASP-2 inibiu a apoptose induzida por cisplatina na mesma extensão que a E6 (figura 4D), semelhante aos efeitos observados com a 53BP2 e o I-ASP. Tal sugere que o ASP-1 e o ASP-2 endógenos desempenham papéis importantes na regulação da função apoptótica do p53 em resposta aos danos no DNA.

Suspeita-se que o efeito estimulador do ASP-1 e do ASP-2 endógenos sobre a apoptose induzida pelo p53 em resposta à cisplatina possa estar subestimado devido aos níveis elevados do I-ASP detectados nestas células (dados não apresentados) , o que pode evitar que o ASP-1 e o ASP-2 potenciem a função apoptótica do p53. Para estudar o papel anti-apoptótico do I-ASP, ambas as células U20S e MCF-7 foram transfectadas com I-ASP antisense. O I-ASP antisense induziu a apoptose dependente do p53 que foi revogada pela co-expressão da E6. A remoção da função anti-apoptótica do I-ASP pelo I-ASP antisense também potenciou a função apoptótica do ASP-1 e do ASP-2 (figura 4E). Ao contrário do ASP-1 e do ASP-2 antisense, a expressão do I-ASP antisense não inibiu a apoptose induzida pela cisplatina. Foi detectado, de um modo consistente, um ligeiro aumento nas células apoptóticas (figura 4D). Esses resultados demonstraram que o ASP-1 e o ASP-2 estimulam 54 especificamente a função apoptótica do p53 in vivo. 0 I-ASP endógeno funciona como um inibidor ASP e pode bloquear a apoptose induzida pelo p53 endógeno.

As moléculas de ácido nucleico antisense foram derivadas dos cDNAs do ASP-1, ASP-2 e I-ASP e foram amplificadas por PCR nos respectivos clones plasmidicos, utilizando primers que cobre as seguintes regiões nucleotidicas (relativas à ATG inicial): -74 a 923/ -253 a 839 e -37 a 536 para ASP-1, ASP-2 e I-ASP, respectivamente. Os segmentos amplificados foram purificados com o kit de purificação PCR QIAquick (QIAGEN) e ligados no vector pcDNA3.1/V5-HÍS TOPO (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os plasmideos contendo DNA antisense do ASP-1, ASP-2 e I-ASP foram produzidos por meio do kit de purificação de plasmideos QIAGEN, de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 4

Foi bem documentado que o p53 e o p65RelA de NF kappaB desempenham papéis muito importantes na regulação da apoptose, em resposta ao stress. No entanto, sabe-se muito pouco sobre como estas duas vias apoptóticas podem trabalhar em conjunto, in vivo. Foram feitas tentativas no sentido de compreender se existe uma intercomunicação entre o p53 e o NF-kappaB. A primeira evidência proveio da observação recente de que o p53 pode induzir a actividade de ligação ao DNA do p65 Rei A. De um modo mais importante, o Ikb, o inibidor do p65 Rei A, pode inibir a função apoptótica do p53. No entanto, não ficou claro como o p53 pode induzir a actividade de ligação ao DNA do p65 e como o Ikb pode inibir a função apoptótica do p53. 55

De um modo interessante, foi descoberto muito recentemente que ambos ASP-2 e I-ASP podem interactuar com o p65 rei A, um componente do NF-kappaB, num ensaio de hibridação com levedura. 0 I-ASP também pode inibir a função de transactivação do p65, embora de um modo menos eficaz que o Ikb. A região necessária para o ASP-2 e o I-ASP interactuar com o p65 rei A é muito semelhante à necessária para o p53. Deste modo, é possível que possa haver alguma concorrência entre o p53 e o p65 rei A para interactuar com o ASP-2 e o I-ASP. Como os membros da família ASP são parceiros comuns entre o p53 e o p65, foi especulado que os membros da família ASP podem associar a função apoptótica do p53 e o NF-kappaB. Neste modelo de trabalho (figura 5A), o p53 pode induzir a actividade de ligação ao DNA do p65 por interacção com o I-ASP nuclear e permitir a ligação do p65 ao DNA. De um modo adicional, o Ikb pode inibir a apoptose induzida pelo p53 por ligação ao p65 e a libertação do I-ASP. A concentração nuclear aumentada do I-ASP pode depois interactuar com o p53 e evitar que o ASP-2 ou o ASP- -1 estimulem a função de transactivação do p53. Se esta hipótese estiver correcta, pode ser esperado que a expressão do Ikb deva ter um efeito profundo sobre a apoptose induzida pelo p53, na presença do ASP-1 ou ASP-2.

Os resultados apresentados na figura 5B são consistentes com esta noção. Nas células que expressam Ikb, 7,2% das células morrem de apoptose, comparativamente com 4,6% das células transfectadas com um só vector. 0 efeito do Ikb sobre a apoptose induzida pelo p53 foi também mínimo, pois a percentagem de células apoptóticas detectadas em células que expressam p53 versus p53 + Ikb foi de 12% e de 11%, respectivamente. Tal pode ser devido a um nível muito baixo de expressão de ASP-1 e ASP-2 em células Saos-2. Em 56 concordância com os resultados apresentados acima, a co-expressão do ASP-2 produziu um aumento significativo da apoptose induzida pelo p53. A percentagem de células apoptóticas em células transfectadas p53+ASP-2, foi de 30%. De um modo interessante, está aqui implícito, a co-expressão do Ikb mostrou o efeito mais profundo. A co-expressão do Ikb foi capaz de reduzir a quantidade de células apoptóticas induzidas pelo p53 e ASP-2 de 30% para 16%. Este resultado sugeriu que o Ikb pôde inibir a apoptose induzida pelo p53 ao evitar que o ASP-2 estimulasse a função do p53. Também foram obtidos resultados semelhantes quando o Ikb foi co-expresso com o p53 e o ASP-1.

Foi demonstrado que o ASP-2 pode aumentar a função apoptótica do p53 ao estimular especificamente a função de transactivação do p53 nos promotores dos genes pró-apoptóticos, tais como o Bax. Assim, também foi investigado o efeito do Ikb na função de transactivação do p53 sobre os promotores Bax e mdm2 na presença ou ausência do ASP-2, ver Figuras 5C e D. Como apresentado anteriormente, a co-expressão do ASP-2 e do p53 estimulou a função de transactivação do p53 em cerca de 8 vezes. Sob as mesmas condições, a expressão do Ikb não apresentou qualquer inibição detectável sobre a actividade de repórter no promotor Bax, sugerindo que o Ikb não inibe a actividade de transcrição do promotor Bax, de um modo não específico, nas células Saos-2. A co-expressão de 50 ng de Ikb com p53 apenas mostrou uma inibição muito ligeira na função de transactivação do p53. No entanto, quando o Ikb, o ASP-2 e o p53 são co-expressos, o Ikb foi capaz de inibir a estimulação da função de transactivação do p53 mediada pelo ASP-2, de um modo dramático (figura 5D). 57

Foi demonstrado que o ASP-1 e o ASP-2 podem estimular, de um modo especifico, a função de transactivação do p53 no promotor Bax, mas não no promotor mdm2. Consequentemente, se o Ikb estava, de facto, a inibir a função de transactivação do p53 através do ASP-2 de um modo especifico, não seria capaz de apresentar uma inibição significativa da actividade de promotor do mdm2. Sob as mesmas condições, também foi testada a capacidade do Ikb para inibir a função de transactivação do p53 sobre a actividade de promotor do mdm2. Como apresentado na figura 5D, a co-expressão do ASP-2 teve um efeito muito reduzido na função de transactivação do p53 no promotor mdm2. De um modo mais importante, o Ikb quase não inibiu a função de transactivação do p53 no promotor mdm2, mesmo na presença do ASP-2. Os resultados aqui apresentados sugerem, pela primeira vez, o Ikb pode inibir a função apoptótica do p53 ao evitar que o ASP-1 ou o ASP-2 estimulem a função de transactivação do p53.

Para investigar adicionalmente o papel da familia ASP na associação com a via do p53 e NFkb, também foi estudado o efeito da interacção do ASP-2 e do p65 relA na função apoptótica do p53. Com base no modelo de trabalho na figura 5A, a interacção p65/ASP pode facilitar a entrada nuclear da proteina ASP, assim permitindo a interacção p53/ASP e a libertação do I-ASP nuclear para ligar ao p65 nuclear. Os residuos 176-406 do p65 ligam-se ao ASP-2 e ao I-ASP.

Como um factor de transcrição, o p65 pode transactivar muitos genes alvo. Como a apoptose induzida pelo p53 requer p65 e também está correlacionada com a crescente actividade de ligação ao DNA do NFkB, sugeriu que a actividade de ligação ao DNA do p65 possa ser essencial para cooperar com 58 ο ρ53 para induzir a apoptose. Ser capaz de se ligar a ambos p53 e p65, coloca a familia ASP de proteínas num papel central. Uma possibilidade é que o ASP ao ligar-se ao p65 possa ser o mediador para a actividade de ligação ao DNA do p65, induzida pelo p53. No entanto, a co-expressão do p53 não induziu a actividade de transcrição do p65 no seu repórter. A co-expressão do p53 e do ASP-2 também não apresentaram qualquer efeito significativo sobre a função de transactivação do p65. Este resultado sugeriu que o ASP não era o mensageiro que entrega os sinais do p53 para o p65. Não obstante, o ASP pôde permitir que o p65 cooperasse com o p53 para induzir a apoptose. Foi testado se a acção do ASP necessitava da actividade de ligação ao DNA do p65 NFkB. Foram removidos cem aminoácidos de p65 da terminação N que contém a região de ligação ao DNA do p65. 0 constructo Δρ65 assim gerado era transcricionalmente inactivo quando testado no plasmídeo NFkB repórter. Se a interacção ASP-p65 for a mediadora das vias do p53 e do NFkB, ο Δρ65 teria um efeito semelhante na função apoptótica do p53 como o p65 de comprimento total. Por outro lado, ο Δρ65 seria inactivo pois é defeituoso no que diz respeito a transactivar qualquer um dos seus genes alvo (figura 6A) . 0 resultado apresentado na figura 6B mostrou que não só apenas ambos p65 e Δρ65 estimularam a função apoptótica do p53 na presença do SP-2, mas também ο Δρβ5 foi ainda mais activo que o p65 no aumento da função apoptótica do p53. Tal pode ser devido ao facto do Δρ65 ser mais nuclear que o p65. Os dados obtidos do Δρ65 indicam fortemente que o p65 pode influenciar a função apoptótica do p53, independentemente da actividade de ligação ao DNA do p65. Consequentemente, a interacção do ASP-2-p65 pode ser o mecanismo de acção. 59

Exemplo 5 Exemplo 6

Até agora, foi demonstrado que o I-ASP pode inibir a apoptose induzida pelo p53 em várias linhas celulares e que o seu nivel de expressão é sobreregulado em células de carcinoma mamário in vivo. Todos estes dados sugerem que o I-ASP pode ser um oncogene. Como a função de supressão de tumor do p53 está melhor associada à sua capacidade para induzir a apoptose, é provável que a inibição da apoptose induzida pelo p53 possa remover a função de supressão de tumor do p53. Para testar a função oncogénica do I-ASP, os fibroblastos de embrião de rato foram transfectados com plasmideos que expressam I-ASP e a oncoproteina, E7. A expressão do I-ASP aumentou a função de transformação da E7 significativamente (figura 7A). Tal demonstrou que o I-ASP é de facto um oncogene.

Como a maioria dos fármacos quimioterapêuticos são agentes danificadores do DNA e indutores da apoptose através de vias dependentes do p53, concluiu-se que a capacidade do I-ASP para inibir a apoptose induzida pelo p53 pode tornar as células mais resistentes ao efeito citotóxico dos fármacos quimioterapêuticos, tais como a cisplatina. As células MCF-7 (uma linha de células de cancro mamário humano) foram transfectadas com um plasmideo expressando I-ASP. A resistência celular ao efeito citotóxico da cisplatina foi comparada entre células MCF-7 que expressaram I-ASP e as que não expressaram I-ASP. Os resultados na figura 7B mostra que a expressão do I-ASP pode aumentar a resistência celular em cerca de 2,5 vezes. Um tal aumento na resistência celular à cisplatina é, biologicamente, muito 60 significativo no que diz respeito ao tratamento do cancro. Consequentemente, o elevado nivel de expressão do I-ASP não só explica porquê o p53 wild type não é funcional em algumas das células tumorais humanas. Também pode prever a resposta do tumor aos tratamentos. Finalmente, a utilização de células com sobre-expressão de I-ASP pode permitir a identificação futura de fármacos quimioterapêuticos mais eficazes.

Referências

Iwabuchi, K., Li, B., Bartel, P., e Fields, S. (1993). "Use of the two-hybrid system to identify the domain of p53 involved in oligomerization." Oncogene _8, 1693-1696.

Lane, D.P., e Crawford, L.V. (1979). "T-antigen is bound to host protein in SV40-transformed cells." Nature 278, 261-263.

Ludwig, R.T., Bates, S., e Vousden, K.H. (1996). "Differential activation of target cellular promoters by p53 mutants with impaired apoptotic function." Mol. Cell. Biol. 16, 4952-4960.

Miyashita, T., e Reed, J.C. (1995). "Tumor supressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene." Cell. 80, p293-299.

Momand, J., Zambetti, G.P., Oslon, D.C., George, D., e Levine, A.J. (1992). "The mdm-2 oncogene product forms a complex with p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation." Cell 69, 1237-1245. 61

Naumovski, L., e Cleary, M.L. (1996). "The p53-binding protein 53BP2 also interacts with bcl2 and impedes cell cycle progression at G2/M." Mol. Cell. Biol. 1_6, 3884-3892.

Polyak, K., Xia, Y., Zweier, J.L., Kinzler, K.W. e Vogelstein, B. (1997). "A model for p53-induced apoptosis." Nature 389, 300-305.

Tabela 1. Expressão do mRNA de ASPP em amostras de tumor mamário humano (graus I e II) expressando p53 wild type.

Tumor ASP-1 ASP-2 I-ASP 1 1 + - 2 i + - 3 i + — 4 i + — 5 i + — 6 i + — 7 i i — 8 + + t 9 — 10 — 11 + — 12 i i — 13 i i — 14 i + — 15 i — 16 i — 17 + + T 18 + — 62

Tumor ASP-1 ASP-2 I-ASP 19 + — 20 + + t 21 + + — 22 + + — 23 + — 24 + + — 25 + + T 26 + — 27 i — 28 + + t 29 + + — 30 + — 31 + + — 32 + + t 33 + — 34 + — 35 + + — 36 + + — 37 + + — 38 + + T 39 + — 40 + t 63

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS < ? 1 o Líidssfig ínstfcâe fer Câncer Research

<12Q> Genes Supressores <130> P38Q80WO <Ηΰ> PCT/GSO1/0S524 c14t> 2001 -08-m «SSQ» 0018018.1 <15f> 2000-08-04 <?7Q> ipseenílrs vsísisn 3,1 <2'0> 1 <211*4894

<213* DNA <2~\$>Homo saplens <4S0?> 1 gagccccgca fccecgecgea getgccgcct cgeogçggçe gggceggaga gfcacggcg gc €0 gggagegcgg ecfctaggagg cggeeggagc ggtgggcaca gctcggogcg gagcgtec fcg 120

fccaggcggcg gecgagggcg tcgeggaçtct tceeegegat gatgccgatg afcafcfcaae fcg ISO ttttctfcgag eaaeaafcgaa cagattttaa eagaagttcc tataacaccg gaaacaac et 240 gcogagatgt tgtagsattt tgcaaggâac etggagaagg cagctgccat ttagctga ag 300 tgtggagggg aaatgaacgt cceataceet ttgatcatat gatgtacgaa câtcttca ga 3S0 tatggggtee aeggagggaa gaagtgaaat ttttecttcg acaegaggae tececaac tg 420 agsaeagtga aeaaggfcggc cgtcagaeec aagagcaacg aactcagaga sâtgtâat a& 4S0 atgtaectgg ag&taaacgt actgaatatg gggttgggta tccacgtgtt gaaettac ca 54 0 eageagca tctcagagpct eeaagatatg geagetaggc aaeagcagca gat· 64 ga 600 tgttggttgc caaggaac&g cgtttaeafct fctefcaaagca acaggagcgc ogtcagca gc 660 sgtctafctte tgaaaátgaa aagcttcaga aattgaaaga acgagttgaa geccagga ga 720 &caaqctgaa gaaaattcgt gcaatgagag gacaagtcga cfcaeagc&ae ateatgaa cg " ?80 gcaafcctgtc tgctgaaata g&aaggtfcca gtgccafcqtt ccaggaaaag a&gcagqa ag 640

taeagactgc aattfctaagg gfctgatcage tt&gteagca afctggaagafc ttaa&gaa ag 9QQ gaaaactgaa tgggttccag tcttacaafcg gaaaafctg&c gggaccagcg gcggtgga gt 9so fcaaaàâgact gtaccaagaa ctacagafctc gfcaaccaacfc taaccaggaa caaa&ttc a a 1020 aacttcagca gcag&aggaa ctcttaaata agegcaacat ggaggtggcc atgatgga ca 1080 agcgaatoag fcgaacfcgcgt gaacgtctet. atgggaaaaa aafctcagctg aaccgtgt ga I140~ atggcacgtc atcaccaeag tccectctga gcacatcggg cagggtcgct gcfcgtggg gc 1200 cttatatcca ggttcccagfc gecggaagcfc ttcctgtgct gggggaccct ataaagcc CC 1260 agtctctcag tattgcctca aatgctgctc atggaagatc caaatecgct aatgatgg aa 1.3 2 0 actggccaac attaaaacag aattctagçt cticcgtgaa accagtgcag gtggcegg tg 1380 cagactggaa ggatecgagc gtggaggggt ctgtcaagca gggcactgtc tccagcca gc 1440 ctgtgccctt efccagcacfcg ggacccacgg agaagccggg catcgagatt ggtaaagt gc 1600 cacctceeat ccegggtgta ggcaagçagc tgcctccaag ctatgggaca tacccaag

tC 1S6Q ctacacctct gggtcetggg tcgacaagct ccctggaaag gaggaaggaa ggcagctt gc 1620 65 ccsg-gcecag tgcaggcctg ccaagtegae agaggcccac cctgctgccc gcç&cagg ca 1680 gçaçccçcca gccaggetcc tçacaacaga fctcagcagag gatttccgfca cdgccaag tc 1740

ccaçgtacce gccagcggga ccscctgcat fctecagetgg ggacagcaag cctgaact ec ISOO csetfâcagt ggccattagg eettteetgg ctgataaagg gfceaaggcea c&gtctec ca 1860 ggaaaggacc ccagacagtg a&fcfccaagtfc caatatacte catgtacetd o&gcáage ca 1020 caccacetaa gaactaeeag ccggcagcac acagcgcett aaataagtca gttaaagc ag 1980 tgtatggtaa gcccgtttta ccttcgggtt caacctcstcc atcgecgctg ccgtttcfc feC 2040 acgggtcact gtccacgggc acaccacagc ctcagccacc ttcagaaagt actgagaa ag " 2100 agcctgagca ggatggcccc gccgcccccg cagatggcag caccgtggag agcctgcc ac 2160 ggccacfccag ccccaccaag ctcacsgcfíca tcgtgcattc gcfíactgege taecagag fcg 2220 atgcagacet: ggaggceetc cgeaggaagc tggccaacgc gccccggccc ctgaaaaa gc 2280 gcagcfcccafc cacagagccc gagggccccg gregggcccaa catccagaag ctgcfegfea cd 2340 agcgcttcaa caooctggcc ggfcggcafcgg agggc&ecce ttfcctacoag cccagccc dt 2400 cccaggacfcfe catgggcacc ttggcegafcg feggacaatgg aaaeaccaat gccaatgg aa 2460 acctggaaga gctcecccct gcecagceca eagceccact ccccgctgag cctgcccc

g:t 2S2Q catcagatgc caatgataat gagtfcacefct eccccgaacc agaggagctc atetgfcee

Cd 2580 eaaec&ccca ccaaactgcc gageeggcag aggacaataa caacaacgtoí gccaegct oe 2640 66 ccaccacgga gcagâfceecg agtecfcgfcgg gg 2700 fccccfcccage açafccfctcce cstgccagcc g& 2780 ccaacfctgaa gaagccc&ac tcggagcgga cc âsao ceetggaact gctcct&gac gegfcctctgg ca 2880 fcctatgaggt ggaagatccc agca&geoca cg 2 §40 ccgtctgcgc cggccaecat c&cafccgtga ga 3000 atgctgcfcga tagtgatgga tggacgccge fcc 3080 âeetctgcaa acagctggtg gagagtggtg ca 3i20 ttgaaactgc tgcagaeaag tgtgaggaga gt 3180 ttctafcatgg ggtgmgg&a aagctgggtg gt 3240· gggaçtâcga. ggcceagaac agtgacgagc ca 3300 tcçtgaggeg caaggaçgaa agcgagacfcg gg 3380 agggcfeatgt gcceaaaa&c ctgctgggge aa 3420 cactegcctg aacttccttt tggagcaccg tt 3480 aagagattst tgtgctgtfct tccaggaaag et 3540 cacfcttagea gscagcgtsc acaatgfegaa tc 3800 cagtttgccc attaacfcggg agaggtâctt ta 3 $m ctataaatcc aaataaatac ceacttfceaa ctgaggçGce atctecaggg gaagagça aççctcctgc caççtecacg aacaagcg cggggcaegg gcfcgagagte cggtttaa aaggagagtfc cgatctggtg cagaggat acgatgaagg gatcacccca ctgcaeaâ agttcetgct ggattttggt gtcaafígt tgeactgcgc fcgecfccttgt aacagcgt ccgeeatttt tgectcaaee ataagcga tggagg&agg etacatecag tgcfcecca tgatgaacaa aggtgtggcg tatgctct tgtcctteca cgaaggggac gccctcac agtggtggtg ggctcgcctt ggagaccg tgt&tccacg gatcaaaccc cgacagcg oatggtcfctg ceagcfcacca. ggagccac ctgcagcfcag aaaatggtct taatggtg fccctacagtt tccaggtgag gccctttc fccgcctccaa ggactgaatt tfcgccaafc aacaeceacc cctcfetgcca t&aagaag 67 £C 3720 ccataeccec cggttggttg cc&gtgâaga cagâagctct tactgacttg gccccgag gc 3760 eafccaccccc fcecagcagfcg aacactgtcc gccgcfcgfcga ggectgctec eetgcgac cg 3840 eectqcccce egtcaccgaa tcggacactc atcctfctcfcc acacfctccca c&cafcgãfc cc ~33S0 fctctfeocctt catcaccaaa ggagcctotg tatggaaaea tgteeãgfcgfc tgctgece ag 3960 tgtgtatgcc teccagfcaeç cactctgete ggccgeçfcfcg ggggttccgc ttcctgtt cc 4020 agttcaccta aaggcfcgafct gtgeaggccc agcaefcgtgg etggaetgcc gcgccacg gg 4080 caceaggacc ccfcaagacea agtgacaact gggagagcct cagcatatac tcttctcc tc 4140 cgatcfcc&ca gecfcgtc&fcg çfcgctcagtg tggttctcac ccctgcaagc tcaaattc ag 4300 ttcectga&t ggegteaggt getggaggee gfcggcagegg agggfcggteg gggfceggg gc 42iÓ tgggggtgga ctggtgtgag ggcagaccag ggecaggtag aoggggctgt ttggtgcc tg 4320 aaggatggca gacgcctggt gtcaggaggg gççgçç*<?ç* aggageagc* gfitggggc sg 4310 aggagctggg gtcaggggco acceetctct gecgatctcc etgecfcgggc tggctgtg ag 4440 gccacctttg tcccaggcec agcctcaagg eaaggaggge gcttcactga «gigtgaa tt 4soa giCaegt&eag gettfcfcfcata taccaaaagt atfctfcfcfcgac tagaccattc aaagctac cc 4560 gaactatgfct ggaaattttt ttccttetca tfcaaaataea ggcecttagg etetatfct tt 4830 catgtatftg fccgtgtgtaa ttfcatgtaaa aatgtgtgta cagactcacfc gatgcagc se 46S0 tgfcagcccafc cacottggag çactgaetgt acatagtgtg gtgaagaaaa gtgaacgc cc 4740 68 ttgtagagca gcecgaccac aggagcatgg ccgctgccag cccagacgct gctgaegc tg 4S0Ô tgtaaatgtg cacaataaac ccgtctcacc ccgg 4834 <210>2 <211 >4402

<212>0NA <213> Honro sapiens <400>2 gtcacgagcg tcgaagagac aaagccgcgt cagggggecc ggccggggcg ggggagcc cg 60 gggcttgttg gtgccccagc ccgcgçggag ggcecttcgg acccgcgcgc cgccgctg cc 120 gccgccgccg cctcgcaaca ggtccgggcg gcctcgctct ecgetcccct cccccgca tc 180 cgcgaecctc cggggcaect cagctcggcc ggggccgcag tctggccacc cgcttcca tg 240 cggttcgggt ccaagatgat gccgatgtfct cttaccgtgt atctcagtaa caatgagc ag 300 cacttcacag aagttccagfc tactccagaa acaatatgca gagacgtggt ggatctgt gc 360 aaagaacccg gcgagagtga ttgccatttg gctgaagtgt ggtgtggctc tgaacgtc ca 420 gttgcggata atgagcgaat gtttgatgtt cttcaacgat tfcggaagtca gaggaacg aa 480 gttcgcttct tccttcgtca tgaacgcccc ectggcaggg acattgtgag tggaccaa ga 540 tctcaggatc caagtttaaa aagaaatggt gtaaaagttc ctggtgaata tcgaagaa ag 600 gagaacggtg ttaatagtcc taggatggat ctgactcttg ctgaacttca ggaaatgg ea 660 fcctcgccagc agcaacagat tgaagcccag çaacaattgc tggcaactaa ggaacage gc 720 ttaaagtttt tgaaacaaca agatcagcga caacagcaac aagttgctga gcaggaga aa 780 sttaaaaggc taaaagaaafc câ 840 cttaaaggcc açgtggaaea aâ 900 cagafcgaata atttgttcca ta '960 gaâgaãctga cexggcaget .ac 1020 aatcagtctg cagtggctga aa 1080 ttgaafccaag agc&gaatgc at 1140 fccag&agtgg cagtcatggâ ,ag 1200 aaggcagctc tscageaaaá ag 12$o caagccgcgfc ç&gçccçaag cfc 1320 afcgcctcgga tgwçtcaag cc 1380 tfcggfccatfcc «ggctteag* Cfc 1440 ggggctgGtt ç&caaactaa Cfc 1500 tc&aatgçag atcttttocc at 1360 gcfcçfcggafcc aagttgatga gt 1820 ccgfctctcaa fcgtfctgafcgc tg 1800 aggaagaacc agagcagtgà tg 1740 getaaagtac eaccfccctgt agctgagaafc Gaggaagofca gaagagacta ageaatggga gcaaaaaeag agggagctcg agagatgctc a&gaacggca gcttgatcge etctafcaagg caagctaeââ c&acegaggg taagegtgtt aatgagctga agaaaatcta ccagtttcat cegtgtggct gcagtaggtc geetgaattg etggtgaagc ggggecgatg aaaafcacâga aggctctaaa atccateeag aagccaaggc tctgcttcfcg tggagaggfct ccgctgaggg agtagaceag tccaafcgccc agatafccfctg cgggatgctc tccfcacaaaa ccaaaataga agçtaaaaaa agtgagag aactfcgtgga ggaaatfcg tcerfcggetgfc gtcaaaag ggategacag ccaccatg agcfcgeagefc aagaaaea agtgttfcgaa taagegta gggaccggct gtggaaga efcgatgga&a tettcccc cetatatcc* gtcatcta cagccctgec ggatggtt cactgcccaa catgagat tfcggcccfcga ttggagtc tacctcaaag cactggga agaaagagaa gaaagtgc e&ccfcfcccfct tggfcactc aggttgcaaa taaaaatg ttaatttgcc ttattttg 70 oaaactaatc agcc&cettc agacatfcaag ceagacggaa gttctcagca gttgtcaa ca 1960 gttgttccgt ccatgggaac taaãeca&aa çcagcagggc agcagccgag· agtgctgc ta 1930 tcfccccagca tatrcttcggt tggccaag&c cagacccfcfct ctcçaggttc fcaageaag aa 1980 agtccacefcg cfcgcfcgccgt ccggcccttfc aetccccagc cfctççaaaga caoctfcac tt 2040 ccacccttca gaaaacccca gaccgtggca gcaagtteaa tatattccat gtatacgc aa 2100 eagcaggcgc caggaaaaaa cfctocagcag gcfegtgcaga gcgcgttgac eaagactc st' 2160 aceagagggc cacacttttc aagtgtatat ggtaagcctg taattgctgc tgcccaga at 2220 caacageagc acccagagaa catttattee aat&gccagg gcaagcctgg cagfcccag aa 2280 ccfcgaaacag agcctgtttc ttcagttcag gagaaceatg aaaacgaaag aatfecctc gg 2340 ccactcagcc caactaaatfc aetgccttfcc fcfcatctaatc cfcfcaccgaaa ccagagtg at 2400 gctgaccfcag aagccttacg aaagaaaetg tctaacgcac caaggcctct aa&gaaac gt 2460 agttctatta cagagccaga gggfccotaat gggçcaaata fctcagasgct fcttatatc ag 2520 aggacc&eca tageggccat ggagaccate tctgfccccat catacocatc caagtcag ct 2680 fccfcgtgactg coagcteaga aagcceagtá. gaaafcceaga atccatattt aca&gtgg ag 2640 cccgaaaagg aggtggtcte tctggttcet gaatcattgt ccctagagga tgfcgggga at 2700 gccagtacag aga&cagtga catgccagcts. ccttetccag gccttgafcta tgagccfcg ag 2760' ggagteccag acaacagocc aaatcfcecag aâtaacceag aagaaccaaa tccagagg et 2820 ccacatgtge ttgatgtgta ectggaggag taccotceat aeceaceecc aocatacc 71 ca 2880 tctggggagc ctgàagggce cggagaagac tcggtgagca tgesgcccgcc igaaatca ec 2S40 gggcaggfeet ctetgcctce tggfcaaaagg acaaacttgc gtaaaactgg eteagagc gfc 3000 atcgcfceatg gáafcgagggfc gaaatfccaae ccccttgett fcactgctaga tfcegtctt tg 3060 gagggagaafc tfcgaecttgt acagagaâfct atttatgagg ttgafcgaccc aagcctgc ee 3120 aatgatgaag gc&fccaoggc fccttcacaat gctgtgtgtg eaggcc&c&c agaaatcg tt 3180 aagttcctgg tacagfcttgg fcgtaaafcgta &&fcgçfcgetg atagfcgafcgg atggactc ca 3240 ttacattgtg etgcctcatg taacaaogtc caagtgtgta agttfcfcfcggt ggagtçag ga 3300 gccgçtgtgt tfcgccatgac ctacagtgac atgeagactg ctgcagataa gtgegagg aa 3360 atggaggaag gctacactca gtgctcccaa tttctttatg gagttoagga gaagatgg gc 3420 ataatgaata aaggegtcat ttatgcgctt tgggattatg aacctcagaa tgatgatg ag 3480 ctgcccatga «agaaggaga ctgcatgaca atcatccaca gggaagacga agatgaaa tC 3540 gaatggtggt gggcgcgcct fcaatgafcaag gagggatatg ttccaegtaa cttgctgg ga. 3 €00 ctgtaceeaa gaattaaaoe aag&caaagg agcttggcct ga&acttcea cacagaat tt 36fi0 tagtcaatga agaattaate tctgttaaga aqaagfcaata egàttafettfc tggeaaaa afc 3720 tfceacaagae ttattttaat gacaatgtag cfctfaaagcg atgaagaafeg tctctaga sg 37Ô0 agaatgaagg attgaagaat tcaccattaq aggacattta gcgtgatgaa ataaagca tC 3840 tacgtcagea ggccatactg tgttggggea aaggtgtccc gtgtagcacfc cagataaq ta 3000 72 tacagogaca atcefcgfctfcfc ctacaagaat ccsgtetagt aaataggatc atttattg 9S 3Í60 cagfcfcgggaa. atcagefcctc tgtcctgttg agtgttttca gcagctgcte etaa&cça gfc 4020 catcetgcca gaaaggacca gfcgccgteac ategçtgtcfe ctgafctgtc© ceggcacc ag 40eo caggccttgg ggeteactgs aggctcga&g gcacfcgcaca ccfctgtatat fcgteagtg aa 4140 gaacgtttagt fcggt tgteag ftgaac&afcaa ctttatfcata tgagtttttg tagcatet ta 4200 agâattafeac afcatgtttga aafcattgaaa ctaagctaca gfcaseagtaa ttagatgt &g 4260 áatcttgfett gtaggctgaa ttttaatctg tatttattgt cttttgtatc tcagaaafe ta 4320 gaa&cttgefc acagacttac ccgtaatatt tgfccasgatc atagctgact ttaaaaac ag 4380 ttgtaataaa «tttttgatg ct 4402 <210> 3 <211 >.2186 <212> DMA «c213> Momíisspiens <4ôo>a gsggccgcgfc egacccggog fctcagacgcg ggcagctacc ggogctcgct gggefcccg ©g 60 gggccgtcgg geactttgce togcagcfcgg cagcccgtca gccgeatecc c&tgcecc ©c 120 tccagccccc agcccegcgg ggccocgcgc cagcgtceca tecccctcag catgatct tc 180 aagetgeaga açgcctfcctg ggagcacggg gccagccgeg ccatgctccc tgggtccc ec 240 ctctteascc gagcacccce gectaagcfcg caqceccaac cacaaccaca gccccagc ca 300 caatcacaac cacagcccca gctgccccaa cagccccaga cccaacccca aaccccta cc 3S0 73 ccagçetccc acafcccgeafc eeeeaaeaga catggcceee tgtgaacgaa ggaccccc ca 420 aaccceccac egagctggag eetgagecgg agafcagaggg gcfcgctg&câ ccagfcgcfc gg 480 aggçtggcga tgtggatgaa ggaceetgta gcaaggcctc tcagccccac gaggctge ag 540 ccagceetgc cacegsraggc acagtcggtg ecegagctgs aggaggtgge aegggtgfc fcg 808 gcggaaattc cceggcccct eaaacgeagg ggctccafcgg ageaggcccc tgctgtgg çc βδΟ ctgeccccta cecacaagaa acagfcaecsg esgatcstca gccgeetcfcfc. ecatcgtc at '720 ggggggçpag gg«ceggggg gegaagccàg àgctgtcccc catcactgâg ggâtctga gg 780 ccagggcagg geccccfcgct ectgceeeae eageteee&t teeacegcec ggeecegt cc 840

eagagcagcc caeeagagea gcegeagage atggagâtge getetgtget geggaagg cg 90O

ggctcccegc gcaaggcççg ccgegegege eteaaeeetc fcggtgeteefc ectggaeg cg 9SG gcgcfcgaccg gggagctgga ggtggfcgcag caggcggtga aggagatgaa cgacccga gc 1020 cagcccaacg aggagggcat eactgsctfcg cacaaegcca tefegoggcge caactact ct 1880 afcegtggafcfc tcctcatcac cgcgggtgcc aatgtcaaet cccccgacag ccacggct gg 1140 acaccetfcgc actgcgcggc gfccgtgcaac gaeacagtca tetgcatggc gctggtgc ag 1280 caoggcgctg caafccttcge e&ceacgctc agegaeggcg ceacegeefct egagaagt gc 1260 gacccttâcc gcgagggtta tgctgactgc gccacctacc tggcagacgt cgagcaga gfc 1320 at999gctga tgaac&gergg ggcagtgtae getcfcctggg aetacagegc cgagttcg gg 1380 74 gacgagctgt ccttcçgcga gggegagfcog gtcaccgtgc fcgcggaggga cgggcegg ag 1440 gag&ccgact ggtggtgggc cgegefcgcac ggccaggagg gcfcacgtgcc geggaaefc ac 1500 ttcfgggçtgt fcçcccagggfc gaagccfceaa aggagtaaag fcgfcagcagga tagaagga

gg ' ISSO ttfccfcgagge fcgacagaaac aagcattccfc g««fcfcccetc cagaeetctc cctctgtt fet 1020 ttgctgcctt tafcctgcacc ectcaeeetg ctggtggtgg tcctfcgccac cggt-fcefcc tg 1680 ttctcctgga agfcccaggga agaaggaggg ccccagcctt aaattfcagfca atetgect ta 174:0 gç-çttgggrag gtctgggaag ggetggaaat aactggggâc aggaaacçac ttcctttt gc 1800 caaatcagat eccgtccaaa gtgcctecca tgcctaccac catcatcac» tcccccag

ca ISSO agccagecae otgcccagoo gggeçtggga tgggccacca caccactgga tattcctg gg 1020 agtcaetgct gacaecatct etecc&gcag tcttggggtc tgggfcgggaa acattggt

Cfc 108:0 cfcaccaggat cccfcgeceea cctcteecca atfcaagtgcc ttcacacagc actggttt m 2040 tgfcttataaa caaaatag&g aaactggttt aatgtttata aacaaaatag agaaactt tc 2100 gcttataaat aaaagfcagtt tgcaeagaaa fcgaaaaaaaa aaaaaaasaa aaaaaa

21SS <210> 4 <2H:>3S0 <tS1S»Wr <213> Ηατπΰ ssplem «40Q> 4

Kat Txp Kat Lys A»p Pm Vai Ala Arg Pro imx ser pro Thr Arg Leu 1 s 10 15 75

Gin Pro Ma Leu Pro Pro 01¾ Ma 20

Vai Ala Arg Vai Leu Ala Glu Ilé 35 40

Ser Sfefc Glu Gin Ala Pro Ala Vai 53 55

Gin Tyr Gin Gin Ile lie Ser Arg 65 70

Gly Pro Gly Gly Arg Ser Gin Ser 85

Oiti Ser Vai Pro Glu Leu Glu Glti 2 5 30

Pro Arg Pro Leu Lys Arg Arg Gly 45

Ala Leu Pro Pro Tkr His Lys Lys 60

Leu Phe His Arg His Gly Gly Pro 75 80

Cys Pro Pro Ser Leu Arg Asp Leu 53 SS

Arg Pro Gly Gin Gly Pro Leu Leu Leu Pro His Gin Leu Pro Phe His 10Ô 10S 110

Arg Pro Ala Pro Ser Gin Ser Ser Pro Pro Glu Gin Pro Gin Ser Met 115 ISO 125

Glu Mtefc Arg Ser Vai Leu Arg Lys Ala Gly Ser Pro Arg Lys Ala. Arg 130 135 140

Arg Ala Arg Leu Asa Pro Leu Vai Leu Leu Leu Aap Ala Ala Leu Thr 145 150 155 160 76 flly Glu. Um Glu Vai Vai Gin Gin Ala Vai Lye Glu Hat hm hsp Pro 165 170 175

Ser Gin Pro Asn tfLu Glu Gly Ile Thr Ala Leu Hl» As» Ala Xle Cya

180 IBS ISO

Gly Ala Asa Tyr Ser Ile Vai Asp Phe Leu Ile Thr Ala Gly Ala Asn 1SS 200 205

Vai Aan Ser Pro Asp Ser Sis Gly Trp Thr Pro Leu His Cys Ala Ala 210 215 220

Ser Cys Asn Asp Thr Vai Ile Cye Wet Ala Leu Vai Gin His Gly Ala 225 230 235 24Ô

Ala Ile Pfee Ala Thr Thr Leu Ser Asp Gly Ma Thr Ala í%e Glu Lys 245 250 255

Cys Asp Pro Tyr Arg Glu Gly Tyr Ala Asp Cys Ala Thr Tyr Leu Ala 260 265 270

Vai Glu Gin Ser Met Gly Leu Mefc Asn Ser Gly Ala Vai Tyr Ala 280 285

Tyr Ser Ala Glu P.h® Gly Asp Glu Leu Ser Fhe Arg Glu 275 77 290 235 300

Gly Glu Ser Vai Tfcir Vai Leu Arg Arg Aep Gly Pro Glu Glu Thr Aap

3Ô5 310 315 32Q

Trp Trp Tip Ala Ala Leu His Gly Glu Glu Gly Tyr Vai Pro Arg Aen 325 330 335

Tyr Fhe Gly Leu Plie Pro Arg Vai Lya Pro Glu Arg Sor Ly» 340 , 345 350

<21Q> 5 <211 > 1S <m&> prt <2i B» H«wiô aapleas <400:> 5

Arg Leu Gin Pro Ala Leu Pro Pro Glu Ala Gin Ser Vai Pro Glu Leu 15 10 15

Glu Glu

<21 Q> 6 <211> 1593 <212> PRT <21S:» humano <400> 6

Ala Pro His Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ser Pro Arg Pro Gly Arg Arg 15 10 15

Ala Arg Arg Arg Glu Arg Gly Leu Arg Arg Arg Pro Glu Arg Trp Ala 78

Gin Leu Gly Ala Glu Arg Pro Vai Arg Arg Arg Pro Arg Ma Ser Arg 35 40 45

Thr Leu Pxo Ala Sfet Met Pro Met Ile Leu Thr Vai Phe Leu Ser Aen SO 55 «9

Aan Glu Gin Lie Leu Thr Glu Vai Pro lie Thr Fro Glâ ttr Thr cys

65 70: 75 âO

Arg Asp vai Vai Glu Phe cya Lys Glu Pro Gly Glu Gly Ser Çy* Bi©

©5 SO SS

Leu Ala Glu vai Trp Arg Gly hem Glu .Arg Pro Ile .Pr© Phe Asp Hi» :ioo los no

Met Met Tyr Glu Bia Leu Gin He Trp Gly Pro Arg Arg Glu Glu Vai 115 ISO 12S

Lys Phe Phe Leu Arg Bis Glu Asp Ser Pro Thr Glu As» Ser Glu Gl» 130 135 140

Gly Gly Arg 01» Thr Gin Glu Gin Arg Thr Gla Arg As» Vai lis Asn

145 ISO iss 16Q 79

Vai Pr© Gly Asp l»y® Arg Thr Gin Tyr Gly Vai Gly Ίγτ Pr© Arg Vai 165 170 175

GIu Leu Thr Leu Ser Glu Leu Gin Asp Met Ala Ala Arg Gin Gin «Gl» ISO 185 ISO

Gin IIe GIu Asa Gin Gin, Gl» Hat Leu Vai Ala Lys Glu Gin Arg Leu 155 200 S05

Mia Phe Leu Lys Gin Gin Glu Arg Arg Gin Gin Gin Ser 11« Ser GIu 210 215 220

Asa GIu Lys Leu Gin Lya Leu Lys Glu Arg' Vai GIu Ala Gin Glu Asn 22 S 239 235 340

Lys Leu Lya Lys lie Arg Ala Met Arg Oly Gin Vai Asp Tyr Ser Lys 245 350 255

Ile Met Asn Gly As» Leu Ser Ala Glu 11« GIu Arg PM Ser Ala §fet 360 36S 270 ?he Gin Glu Lys lys Gin Glu Vai Gin Thr Ala Xle Leu Arg Vai Asp 375 280 285

Gin Leu Ser Gin. Qln Leu Glu Asp Leu Lys Lya Gly Lye Leu Aen Gly 280 285 300 80 S»hs Glíi Ser Tyr k&ii Gly Lys Leu Thr Gly Pro Ala Ala Vai Glu Leu 305 310 315 320

Lye Arg Leu Tyr Gin. Glu Leu Gin II® Arg htltt Gin Léu hm Gin Glu 325 330 335 01 ií Asn Ser ly® Leu Gin Gin Gin Lye Glu Leu Leu Asn Lys Arg Asn 340 345 350

Met Glu Vai Ala Ket Met Asp Lys Arg Ile Ser Glu Leu Arg Glu Arg 35S 360 365

Leu Tyr Gly Lys Lys Ile Gin Leu Aen Arg Vai Asn Gly Thr Ser Ser 370 375 380

Pro Gin Ser pro Leu Ser Thr ser Gly Arg Vai Ala Ala. Vai Gly Pro 385 390 395 400

Tyr llê Gin Vai Pro Ser Ala Gly Ser Phe Pro Vai Leu Gly &sp Pro 405 410 415

Ile Lya Pro Gin Ser Leu Ser Ile Ale Ser Asn Ale Ale. Eis Gly Arg 420 425 430

Ser lys Ser Ala àen Aep Gly Asn Trp Pro Thr Leu Lys Gin Asa Ser 435 81

Ser Ser Ser Vai hya Pr© Vai 450 455

Pr© Ser val Gl« Gly Ser Vai 465 470

Val Pro Phe Ser Ala Leu Gly 4:05

Gly Lys Val Pr© Pro Pro 21e 500

Ser Tyr Gly Thr Tyr Pr© Ser 515

Ser Ser Lew Gly Arg Arg Lys 530 535

Gly Leu Pr© Ser Arg Gin Arg 545 550 'Thr Fr© Gin Pr© Gly Ser Ser 565

445 Val Ma Gly Ala Aap Trp Lys Asp 460 Gin Gly Thr Val Ser Ser Gin Pr© 475 4S0 Thr Gin 4§0 Lys Pro Gly He GlU 4ã5 Ile Gly Val Gly Lya Gin Leu Pr© Fr© SOS 510 Thr Pr© Leu Gly Pro Gly Ser Thr 525 Gly Ser Leu Fr© Arg Pr© Ser Ala 540 Thr Leu Leu Pro Ala Thr Gly Ser SSS sso Gin 11© Gin Gin Arg Ile Ser Val 570 SIS 82

Pro Pro Ser Pro Thr Tyr Pro Fro Ala Gly Pro Pro Ala Pfee Pro Ala 580 $85 SSO

Oly Asp Ser Lys Pro Glu Leu Pro Leu Thr VeX Ala Ile Arg Pro Phe 595 Í60 605

Leu Ala. Aap Lys Gly Ser krq Pro Gin Ser Pro Arg Ly© Gly Pro SI» 610 615 620

Thr Vai As» Ser Ser Ser Xle Tyr Ser Mefe Tyr Leu £31» Gin Ma Thr 625 630· 635 640

Pro Pro Lys As» Tyr Gls Pro Ala Ala Kis Ser Ala Leu Asn Lys Ser

64S €50 6SS

Vai Lys Ala ¥sl Tyr Gly Lys pro vai Leu Pro Ser Gly Ser Thr Ser 660 S65 670

Pro ser Fro Leu Pro Phe Leu Sis Gly Ser Leu Ser Thr Gly Thr Pro 675 6SÕ 685

Gin Pro Gin Pro Pro Sor Glu Ser Thr Glu Lys Glu Fro Glu Gin Asp 690 695 700

Gly Pro Ala Ala Fro Ala Asp Gly Ser Thr Vai Glu Ser Leu Pro Arg 715 720 705 710 83

Pro Leu Ser Pro Thr Lys Leu Thr Pro 11¾ Vai Bis Ser Pr o Leu Arg 725 730 735

Tyr ôln Ser Asp Ala Asp Leu Glu Ala Leu ftrg Arg Lys Leu Ala Asa 74S 745 750

Ala Pro Arg Pro Leu Lys Lys Arg Ser Ser lis Thr Qiu Pro Glu Gly 755 760 765

Pro Gly Gly Pro Asa. Ile Gin Lys Leu Leu Tyr Gin Arg Phe Asa Thr 770 775 780

Leu Ala Gly Gly Met Glu Gly Thr Pro Phe Tyr Gin pro Ser Pro Ser 785 790 795 800

Gin Aôp Phe Met Gly Thr Leu Ala Asp Vai Asp Asn Gly Asn Thr Asa

805 810 SIS

Ala Asa Gly Asu Leu Glu Glu Leu Pro Pro Ala Gin Pro Thr Ala Pro 830 S25 830

Leu Pro Ala Glu Pro Ala Pro Ser Ser Asp Ala Asn Asp Asn Glu Leu 835 840 845

Pro Sér Pro Glu Pro Glu Glu Leu lie Cys Pro Gin Thr Thr Bis Glu 84

850 S5S

Thr Ala Glu Pro Ala Glu Asp Asn 865 870 Thr Thr Glu Gin n« Pro Ser Pro 885 Glu Glu Gin Vai Pro Pro Ala Pro 900 Ala Thr Ser Thr Asn. Lys Arg Thr 915 920 Arg: Thr Gly Ele Gly Leu Arg Vai 930 93S Leu Λ» Ala Ser Leu Glu Gly Glu 945 §so Tyr Glu Vai Glu Aap Pro Ser Lys 9ê5 8$0 Αβη Asn Asm Vai Ala Thr Vai Frc Ô?S 8S0

V&l Ala Glu Ma Pro Ser Pro Gly 890 S9S

Leu Pro pro Ala Ser Hí» Pro Pro §05 910 ten Leu Lys Lys Pro Asn Ser Glu §25

Arg Phe Asn Pro Lo» Ala leu Leu §40

Fhé Asp· Léu Vâl Gin Arg Ile Ik 9SS 980

Pro Asn Asp Glu Gly IIe Thr Pro 970 97S

Leu Ele Asn Ala Vai Cys Ala Gly Eis fíla Hia Ilé Vai Ly» Phe Leu 985 §80 85

Leu hsp Phe Gly Vai lua» Vai Aon Ala Ala Asp Ser Aap <51 y Trp Ί hr 995 iÕÓO 1005

Pro Leu Hie Cys Ala Ala Ser Cys Asn Ser Vai His Leu Cys Lys 1010 1015 1020 Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Ala Ile Phe Ala Ser Thr Ile Ser 102S 1030 1035 A©p Ile Glu Thr Ala Ala Asp Lys cys Glu Glu Met Glu Glu Gly 1040 1045 1050 Tyx Ilé Glu Cys Ser Gin Pite Leu Tyr Gly Vai Glu Glu Lys Leu 1055 1060 1065 Gly Vai Hfit Asn Lys Gly Vai Alá Tyr Ala Leu Trp Asp Tyr Glu 1070 1075 1060 Ala Gin hsn Ser Asp Glu Leu Ser Phe His Glu Gly Asp Ala Leu 1005 1090 1055 Thr Ile Leu Axg Arg Lys Asp Glu Ser Glu Thr Glu Trp Trp Trp 1100 1105 mo Ala Arcj Leu Gly Asp Arg Glu Gly Tyr Vai Pro Lys Asm Leu Leu ms 1120 1125 Gly Leu Tyr Pro Arg Ile !ye Pro Arg Glu Arg Thr Leu Ala Thr 1130 1135 1140 Ser :Phe Trp Ser Thr Ala Trp ser cys Glu Leu Pro Gly Ala Thr 1145 1150 1155 Glu Ile ile Vai Leu Phe Ser Arg Lys Ala Ala Ala Arg Lys Trp 1160 1165 1170 Ser Trp Cys Ser Leu Glu Thr Ala Ser Thr Met Ile Leu Gin Phe 86 1X75 U80 1185

Pro Gly 1X90

Glu Ala Leu Ser Pro Vai Cys Pro Leu Thr Gly Arg Gly 1195 1200

Thr Phe 1305

Ala Ser Lys Asp ile Leu Pro II e Thr Ile Asn pro Aan 1210 121.5

Lys Tyr 1220

Pro Leu Ser Lys Mia Pro Fr© Leu Leu Pro Leu Arg Ser 1225 1230

Pro lie 1235

Thr Pro Gly Trp Leu Pro Vai Lys Thr Glu Ala Leu Thr 1240 1245

Asp Leu 1250

Ala Pro

Fr© Ser Pr© Pr© Pr© Ala Vai A&» Thr Vai 1255 1200

Arg Arg 1255

Cys Glu Ala Cy» Ser Pr© Ala Thr 1270

Leu Pro Pr© Vai 1275

Thr Glu 1280

Ser Asp Thr Hie Fr© Ph© Ser His Phe Fr© Mia Met Ile 1285 1290

Leu Leu 1295

Pro PM Ile Thr Lys Gly Ala Ser Vai Trp Lys Mis Vai 1300 1305

Gin Cyamo

Cys Cys Pro Vai Cys Mefc Pro Pr© Ser Thr Mis Ser Ala 1315 1320

Arg Pro 1325

Pr© Trp Gly Phe Arg Phe Leu Phe Gin Phe Thr Arg Leu 1330 1335

He Vai 1340

Gin Ala Gin His Cys Gly Trp Thr Ala Ala Pr© Arg Ala 1345 13S0

Pro Gly 1355

Pr© Leu Arg Pr© ser Asp Asn Trp Glu Ser Leu Ser Ile 1360 1365

Tyr ser Ser Pr© Pr© XXe Ser

Gin Pr© vai Met Leu leu Ser Vai 87 1370 1375 13Β0

Vai Leu Thr Pro Ala Ser Ser Asn Ser Vai Pro Mst Gin ger Gly 1385 13S0 13S5

Ala Gly Qly .Arg Gly Ser Qly Gly Trp Leu 01 y Leu Qly Leu Qly 1400 1405 1410

Vai Asp Trp Cys Glu Qly Arg Pro Qly Pro Qly Arg Arg Gly Cya 1415 1430 1435

Leu Vai Pró Glu Qly Trp Gin Thr Pro Gly Vai Arg Arg Qly Arg 1430 1435 1440

Mis Gin Gly Ala Ala Ala Gly Ala <31 u Glu leu Gly Ser Qly Ala 1445 1450 1455

Thr Pro Leu cys Arg Ser Pro Cys Leu Gly Trp Leu Gly Sis Leu 1460 1465 1470

Cys Pro Arg Pro Ser Leu Lys Ala Arg Arg Ala Leu Mie Qly Vai 1475 IMO 14 S5

Asa Cys Thr Tyr Arg Leu Phe Ile Tyr Gin Lys Tyr Phe Leu Thr 1400 1495 1500

Arg Pro Phe Lys Ala Thr Arg Thr &et Leu Glu Ile Phe Phe Phe 1505 1510 1515

Leu Ile Lys Ile Gin Ala Leu Arg Leu Tyr Phe Ser Cys Met Ser 1520 1525 1530

Arg Vai Phe Mefc Lys Cys Vai Tyr Arg Leu Thr Asp Ala Ala Leu 1535 154Ò 1545

Pro Thr Leu Olw Eis Leu Tyr Ile Vai Trp Arq Lvs Vai Asn Ala ISSO 1555 1550

Leu Vai

Arg Ser Met Ala Ala Ala Ser Pro 1565 1570 1575

Jtèp Ala Ala &sg> Ala Vai Het Cys Thr Ile Asn Pro Ser Kis Pro

1580 1585 ISSO <aio>? <21 i> 144§ <212> mi <213> humano <400>?

Vai TÁr Ser Vai GIu. <31 u Thr Lys Pro Arg Gin Gly Ala Arg Pxo Gly X 5 10 15

Arg Gly Ser Pro Gly Leu Vai Gly Ala Pro Ala Arg Ala Glu Gly Pró 2<S 25 30

Ser Asp Pro Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala ser Gin Gin Vai 35 40 45

Arg Ala Ala Ser Leu Ser Ais Pro Leu Pro Arg lie Arg Asp Pro Pro 50 55 60

Gly .His Leu Ser Ser Ala Gly Ala Ala Vai Trp Pro Pro Ala Ser Met 6S 70 75

Arg Pb* Gly Ser Lye Mtefc Mafc Pro Mefc Phe Leu Thr Vai Tyr Leu Ser 85 90 .95

Ase Asn Glu Gin Hi» Phe Thr Glu Vai Pro Vai Thr Pro Glu Thr XI* 89 i m 105 no

Cye Asrg Α$ρ Vai Vai tep Leu Cys Lys Glu Pro Gly Glu ser Asp Cys 115 120 125 HÍ8 Leu Ala eiu Vai Trp Gys Qly Ser Glu Arg Pro Vai Ala Asp Aan 130 13S 140

Glu Arg Mefc Phe Asp Vai Leu Gin Arg Ph& Gly Ser 01» Arg Asn Glu 145 ISO 155 160

Vai Arg Phe Fhe Leu Arg Hin Glu Arg Pro Pro Gly Arg Asp Ile Vai 165 170 l?s B&t Gly Pro Arg S«r Gin Asp Pro Ser Leu Lys Arg Ma Gly Vai Lys ISO 185 190

Vai Pro Gly QIu Tyr Arg Arg Lys Glu Asn Gly Vai Asn Ser Pro Arg 155 200 205

Met Asp Leu Tbr Leu. Ala Glu Leu Gin Glu Met Ala Ser Arg Gin Gin 210 215 220

Gin Gin He Glu Ala Gin Gin Gin. Leu. Leu Ala Tftr Lys Glu Gin Arg 225 230 235 240 90 teu Lys £he Leu Lys Gin Gin Asp Gin Arg Gin Gin. Gin Gin. Vai Ala 243 350· 255

Glu Gin Glu Lys teu Lys .Arg teu Lys Glu Xle Ale Glu Asa Gin Glu 260 265 270

Ala Lys Leu Lys Lys vai Arg .Ala teu Lys GIy Bis Vai Glu Gin Lys 275 280 285

Arg Leu Ser hm Qly- Lye Leu Vai Glu qiu lie Glu Gin Ntet Asn Asa 290 295 300

Leu Fhe Gin Gin Lys Gin Arg Glu Leu Vai teu Ala vai Ser Lys Vai 30S 310 315 320

Glu Glu teu Thr Arg Gin Leu Glu Met Leu Lys Asn Giy Arg ile Asp 325 330 335

Ser His Hls Asp Asn Gin Ser Ala vai Ala Glu teu .Asp Arg Leu Tyr 340 345 350

Lys Glu teu Gin teu Arg Asn Lys Leu Âsn Gin Glu Gin Asa Ala Lys 355 360 365 teu Gin Gla Gin Arg Glu Cys teu Asn Lys Arg Asn Ser Glu Vai Ala 370 375 380 91

Vai Mefc Asp Lys Arg Vai Asn Glu Leu Arg Asp Arg Leu Trp Lys Lys 30S 390 395 400

Lys Ala Ala Leu Gin Gin Lys <&u â»li Leu PtO Vai Ser Ser Aep Gly 405 410' 415

Asa Leu Pro Gin Gin Ala Ala Ser Ala Pro Ser Arg Vai Ala. Ala Vai 420 425 430

Gly Pm Tyr ile Gin Ser Ser Thr Het Pro Arg Mefc Pr© Ser Arg Pro 435 440 44S

Glu Leu Leu vai Lys Pro Ala Leu Pro Asp Gly Ser Leu Vai lie Gin 450 455 450

Ala Ser Glu Gly Pro Mefc Lys Jle Gin T&r Leu Pro Aen Mefc Arg Ser 455 470 475 4S0

Gly Ala Ala Ser Gin Thr Lys Gly Ser Lys lie fíis Pro Vai Gly Pro 485 43Q 495

Asp Trp Ser Pro Ser Asa Ala Asp Leu Phe Pro Ser Gin Gly Ser Ala SCO 505 510

Ser Vai Pro Gin Ser Thr Gly Asn Ala Leu Asp Gin Vai Asp Asp Gly 92 515 520 525

Glu Vai Pro Leu. Arg GXu Lyss Glu Lys Lys Vai Arg Pro Phe Bar Met 530 S3S 540

Phe &ap Ala Vai Ãsp Gin Ser Asn. Ala Pro Pro Ser Phe Gly Thr teu 545 550 555 560

Arg Lys àsn. Gin Ser Ser Glu Asp Ile teu Arg Asp Ala Gin Vai Ala 565 570 575

Mn Lys Asn 'Vai Ala lys Vai Pro Pro Pro Vai Pro Thr Lys Pro Lys 580 SS5 520

Gin Ile Asn teu Pro Tyr Phe Gly Gin Thr Asn Gin Pro Pro Ser Asp 525 SQQ 605

Ile I*ys Pro Asp Gly Ser Ser Gin Gin teu Ser Thr Vai Vai Pro Ser 610 SIS 620

Met Gly Thr Lys Pro lys Pro Ala Gly Gls Gin Pro Arg Vai Leu teu 625 630 635 640

Ser Pro Ser Ile Pro Ser Vai Gly Gin Asp Gin Thr teu Ser Pro Gly 646 650 6.55 93

Ser Lye 61» 61» Ser Pro Pro Ma Ala Ala Vai Arg Fro Phô Tfcr Pro 660 S6S 670 61» Pro Ser lys Aag» fttr Leu leu Pm Fro Phe Arg Lya Pro 61» T&r 675 680 655

Vai Ma Ma Ser Ser Ile Tyr Ser Mefc Tyr Thr 61» 61» 61» Ala Fro 690 635 700

Gly Lya A@n Pbe 61» 61 n Ala Vai 61 a Ser Ala Leu Thr Lysr Thr His 705 710 715 730

Thr Arg Gly Pro Hís Phe Ser Ser Vai Tyr Gly Lys Pro Vai Ile Ala 725 730 735

Ma Ala Gin Aen Gin 61» Gin Bis Pro 61« As» Ile Tyr Ser As» Ser 740 745 750

Gin Gly Lya Pro Gly Ser Pro Glu Pio 61 u Thr 61 u Pro Vai Ser Ser 7SS 760 765

Vai Gl» Glu Mm Hie Glu As» Glu Arg lie Pro Arg Pro Leu Ser Fro 770 77S 750

Thr Lys Leu Leu Pro Phe Leu Ser As» fro Tyr Arg As» 61a Ser Asp 785 700 795 800 94

Ala Asp Leu 01¾¾ Ala Leu Arg Lys Lys Leu Ser Asn Ala Pro Arg pro 805 510 SIS

Leu Lys Lys Axg Ser Ser Ile Thr Glu Pro Glu Gly Pro Aen Gly pro 820 825 830

Aan II© Gin Lys Leu Leu Tyr Gin Arg Thr Thr Ile Ala Ala «et Glu 835 840 845

Thr Ile Ser Vai Pro Ser Tyr Pro Ser Lys Ser Ala Ser Vai Thr Ala 8S0 S5S 8É0

Ser Ser Glu Ser Pro Vai Glu Ile Gin ën Pto Tyr Leu Hi» Vai Glu

a$$ 870 S75 SiO

Pro Glu Lys Glu Vai Vai Ser Leu Vai Pro Glu Ser Leu ser Pro Glu 885 830 895

Asp Vai Gly Asa Ala Ser Thr Glu Asa Ser Aap Met Pro Ala Pro Ser 908 905 910

Pro Gly Leu Asp Tyr Glu Pro Glu Gly Vai Pro Asp Aan Ser Pro ftsn 91S 920 925

Leu Gls Asn Asn Pro Glu Glu Pro Asn Pro Glu Ala Pro Bis Vai Leu 95 530 mõ Αβρ ν&Χ Tyr Le« Glu Glu Tyr Pr© Pro Tyr Pr-0 Pro Pro Pro Tyr Pro 54 s &so 9S5 mo

Ser Gly Glu Pro Glu Gly Pro Gly Glu kap Ser Vai Sor Met Arg Pro MB 970 975

Pro slu lies l&r Gly Gin Vai Sor Leu Pro Pro Gly Lye Arg Thr Asn 980 985 990

Leu Arg Lys Tfer Gly Ser Glu. ftrg Jle Ala Sis Gly Met Arg Vai 1» ys 995 1000 1005

Phe Aan Pro Leu Ala- Leu Leu ioia isis

Leu Asp Ser Ser Leu Glu Gly Glu 1020

Phe Asp Leu Vai Gla Arg Ile 1023 1030

íle Tyr Glu Vai Asp Asp Pro Ser 103 S

Leu Pro Asu Asp Glu Gly lie 1040 1045

Thr Ala Leu His Asn Ala Vai. Cys 1050

Ala Gly His Thx Glu Xle Vai 10SS 1080

Lys Phe Leu Vai Glu Phe Gly Vai 1065

Asn Vai As» Ala Ala Asp Ser 1070 1078

Asp Gly Trp Thr pro Leu His €ys 1000

Ala Ala Ser Cys Asu Asn Vai Glu 'Vai Cys Lys Phe Leu Vai Glu 1QS5 1090 1095 96

Ser Gly Ma Ala Vai Phe Ala Met Thr Tyr Ser Asp Met Gin Thr Π00 1105 mo Ala Ma Asp Lys Cys Glu Glu Met Glu Glu Gly Tyr Thr Gin Cys 1115 1120 1125 ser Gin Phe Leu Tyr Gly vai Gin Glu Lys Mèt Gly Ile Met Asn mo 1135 1140 Lys Gly vai Ile Tyr Ala Leu Trp Asp Tyr Glu Pro Gin Asn Asp 114 5 1150 1155 Asp Glu Leu pro Met Ly» Glu Gly Asp Cys Met Thr Ile Ile Kís 1160 1165 1170 Arg Glu Asp Glu Asp Glu Ile Glu Trp Trp Trp Ala Arg Leu Asn 11.75 iiiO 1185 Asp Lys Glu Gly Tyr Vai Pro Arg Asn Leu Leu Gly Leu Tyr Pro Π90 1155 1200 Arg lie Lyi Pro Arg Glu Arg Ser Leu Ala Asn Phe His Thr Glu ISO 5 1210 1215 Phe Ser Met Lys Asn Ser Leu Leu Arg Arg Ser Asn Thr Ile He 1220 1225 1230 Phe Gly Lys Asm Phe Thr Arg Leu ile Leu Met Thr Met Leu Glu 1235 1240 1245 Ser Asp Glu Glu Cys Leu Lys Arg Met Lys Asp Arg ile His HÍS 1250 1255 12S0 Arg Thr Phe Ser Vai Met Lys Ser Ile Tyr Vai Ser Arg Pro Tyr 1265 1270 1275 Cy@ Vai Gly Ala Lys Vai Ser Arg Vai Ala Leu Arg Vai Tyr Ser 1280 1285 12 so 97

Asp Asn Pro Vai Phe Tyr Lys Asn Pro Vai lie Gly Ser Pfcie He 1255 1300 1305

Gly Gin Leu Gly Asa Gin Leu Ser Vai Lãu Leu Ser vai Phe Ser 1310 1315 1320

Ser Cye Ser Thr Ser Fro Pro Ala Arg Lys Asp Gin Cys Arg His 1325 1330 1335 íl« Ala Vai Ser Asp Cys Pro Arg Bis Gin Gin Ala Leu Gly Leu 1340 1345 1350

Thr Glu Gly Ser Lys Ala Leu His Thr Leu Tyr He Vai Ser Glu 1355 * 1360 1365

Glu Arg Leu Vai vai Ssr Glu Glu Leu Tyr Tyr Met Ser Phe Cys 1370 1375 1380

ser Lie Leu Arg Ile lie His Met Phe Glus lie Leu hym Leu Ser 1385 1300 139S

Tyr Ser Thr Ser Asn Met Asn Leu Vai Cys Arg Leu Asn Phe Asa 1400 1405 1410

Leu Tyr Leu hm. Ser Fbe Vai Ser Gin Lys Leu Glu Thr Cys Tyr 1415 1420 1425

Arg Leu Thr Arg Asm Sle Cys Gin Asp His Ser Leu Ly® Gin Leu 1430 1435 1440

Thr Phe Cys 1445

Lisboa, 28 de Setembro de 2006

Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES Ensaio para diagnosticar cancro, caracterizado pela sobreregulação de um polipéptido numa amostra de tecido isolada, polipéptido esse que é um inibidor da actividade apoptótica do p53, em que o referido polipéptido é codificado por uma molécula de ácido nucleico seleccionada do grupo que consiste em: i) uma molécula de DNA que consiste numa sequência tal como representada pela Figura 2; ii) uma molécula de DNA que híbrida sob condições estrigentes de hibridação com a sequência de ácido nucleico na Figura 2 e que codifica para um inibidor da actividade apoptótica do p53; e iii) uma molécula de DNA que é degenerada como resultado do código genético para as sequências de DNA definidas em (i) e (ii) ; em que o referido ensaio compreende os passos de: a) proporcionar uma amostra de tecido isolada a ser testada; b) proporcionar condições adequadas para a detecção do polipéptido por um agente e detecção da presença do polipéptido pelo agente; e c) comparação da sobreregulação do polipéptido com controlos normais equivalentes.
2. Ensaio de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra de tecido é tecido mamário. 2
3. 3. Ensaio de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que o agente é um anticorpo.
4. 4. Ensaio de acordo com a reivindicação 3, em que o ensaio é um imunoensaio.
5. 5. Ensaio para diagnosticar cancro, caracterizado pela sobreregulação de uma molécula de ácido nucleico numa amostra de tecido mamário isolada, ácido nucleico esse que codifica para um inibidor da actividade apoptótica do p53, em que a referida molécula é seleccionada do grupo que consiste em: i) uma molécula de ácido nucleico que consiste numa sequência como representada pela Figura 2; ii) uma molécula de ácido nucleico que híbrida com a sequência de ácido nucleico na Figura 2 e que codifica para um inibidor da actividade apoptótica do p53; e iii) uma molécula de ácido nucleico que é degenerada como resultado do código genético, para as sequências definidas em i) e ii); em que o referido ensaio compreende os passos de: a) proporcionar uma amostra a ser testada; b) proporcionar condições adequadas para a detecção da referida molécula de ácido nucleico pelo referido agente e detecção da presença da molécula de ácido nucleico pelo agente; e c) comparação da sobreregulação do ácido nucleico com controlos normais equivalentes. 3
6. 6. Ensaio de acordo com a reivindicação 5, em que o agente é uma molécula de ácido nucleico capaz de hibridar com a referida sequência de ácido nucleico.
7. 7. Ensaio de acordo com a reivindicação 6, em que o ácido nucleico é, pelo menos, um oligonucleótido.
8. 8. Ensaio de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que o ensaio é um ensaio de reacção em cadeia de polimerase.
9. 9. Utilização de um anticorpo capaz de se ligar a um polipéptido r como representado pela sequência de aminoácido na Figura 3, para a produção de um medicamento para utilização no tratamento do cancro por indução da apoptose.
10. 10. Utilização de um anticorpo de acordo com a reivindicação 9, em que o cancro é cancro da mama.
11. 11. Utilização de uma molécula de ácido nucleico antisense compreendendo uma sequência antisense de uma sequência sense seleccionada do grupo que consiste em: i) uma molécula de ácido nucleico que consiste numa sequência como representada na Figura 2/ ii) uma molécula de ácido nucleico que consiste numa sequência que híbrida com a sequência de ácido nucleico na Figura 2; e iii) uma molécula de ácido nucleico que consiste numa sequência que é degenerada como um resultado do código genético para as sequências de ácido nucleico definidas em (i) e (ii), para utilização na produção de um medicamento para o tratamento do cancro, por indução da apoptose. 4
12. 12. Método de detecção para a identificação de agentes farmacológicos que interferem com a ligação de um polipéptido com o p53, compreendendo: i) proporcionar um polipéptido codificado por uma molécula de ácido nucleico seleccionada do grupo que consiste em: a) uma molécula de DNA que consiste numa sequência como representada pela sequência de ácido nucleico na Figura 2/ b) uma molécula de DNA que híbrida com a sequência de ácido nucleico na Figura 2 e que codifica para um inibidor da actividade apoptótica do p53; e c) uma molécula de DNA que é degenerada como um resultado do código genético para as sequências de DNA definidas em (i) e (ii) ; ii) proporcionar, pelo menos, um egente candidato/ iii) proporcionar uma preparação que forma uma combinação de (i) e (ii)/ iv) detecção ou medição da actividade do agente no que diz respeito à intereferência com a ligação do referido polipéptido ao p53; e, opcionalmente v) teste do efeito do agente sobre a apoptose de um tipo de célula seleccionado.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o referido polipéptido é codificado pela sequência de ácido nucleico representada na Figura 2. 5
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, em que o referido polipéptido é expresso por uma célula.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a referida célula é uma célula cancerosa.
16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12-15, em que o referido polipéptido é sobre-expresso.
17. 17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-16, em que a referida célula é transformada/ transfectada com uma molécula de ácido nucleico codificando o referido polipéptido.
18. 18. Preparação farmacêutica combinada compreendendo, pelo menos, uma molécula de ácido nucleico antisense da sequência sense seleccionada do grupo que consiste em: i) uma molécula de ácido nucleico que consiste na sequência como representada na Figura 2; ii) uma molécula de ácido nucleico que consiste numa sequência que híbrida com a sequência na Figura 2; e iii) uma molécula de ácido nucleico que consiste numa sequência que é degenerada como resultado do código genético para as sequências de DNA definidas em (i) e (ii) e um agente quimioterapêutico.
19. 19. Preparação de acordo com a reivindicação 18, em que o referido agente quimioterapêutico é um agente anti-cancerígeno seleccionado do grupo que consiste em: 6 cisplatina; carboplatina; ciclosfosfamida; melfalano; carmuslina; metotrexato; 5-fluoroacilo; citarabina; mercaptopurina; daunorubicina; doxorubicina; epirubicina; vinblastina; vincristina; dactinomicina; mitomicina C; taxol; L-asparaginase; G-CSF; um enediino tal como a caliqueamicina ou esperamicina; clorambucilo; ARA-C; vindesina; bleomicina; ou etoposida.
20. 20. Preparação de acordo com a reivindicação 19, em que o referido agente é a cisplatina.
21. 21. Preparação farmacêutica combinada compreendendo um anticorpo capaz de se ligar a um polipéptido codificado por uma molécula de ácido nucleico, seleccionada do grupo que consiste em: i) uma molécula de ácido nucleico que consiste na sequência como representada na Figura 2; ii) uma molécula de ácido nucleico que consiste numa sequência que híbrida com uma sequência de ácido nucleico na Figura 2; e iii) uma molécula de ácido nucleico que consiste numa sequência que é degenerada como resultado do código genético para as sequências de DNA definidas em (i) e (ii) e um agente quimioterapêutico.
22. 22. Preparação de acordo com a reivindicação 21, em que o referido agente quimioterapêutico é seleccionado do grupo que consiste em: cisplatina; carboplatina; ciclosfosfamida; melfalano; carmuslina; metotrexato; 7 5-fluoroacilo; citarabina; mercaptopurina; daunorubicina; doxorubicina; epirubicina; vinblastina; vincristina; dactinomicina; mitomicina C; taxol; L- asparaginase; G-CSF; um enediino tal como a caliqueamicina ou esperamicina; clorambucilo; ARA-C; vindesina; bleomicina; ou etoposida.
23. 23. Preparação de acordo com a reivindicação 22, em que o referido agente quimioterapêutico é a cisplatina. Lisboa, 28 de Setembro de 2006