ES2269430T3 - Gen supresor. - Google Patents

Abstract

Un ensayo para diagnosticar cáncer caracterizado por la regulación al alza de un polipéptido en una muestra de tejido aislada, polipéptido que es un inhibidor de la actividad apoptótica de p53, en el que dicho polipéptido está codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por: i) una molécula de ADN que consiste en una secuencia como se representa en la figura 2; ii) una molécula de ADN que hibrida en condiciones restrictivas de hibridación con la secuencia de ácido nucleico de la figura 2 y que codifica un inhibidor de la actividad apoptótica de p53; y iii) una molécula de ADN que está degenerada como resultado del código genético de las secuencias de ADN definidas en (i) y (ii) en el que dicho ensayo comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra de tejido aislada para ser probada b) proporcionar condiciones adecuadas para la detección del polipéptido por un agente y detectar la presencia del polipéptido por el agente; y c) comparar la regulación al alza del polipéptido con controles normales emparejados.

Description

Gen supresor.

La presente invención se refiere a miembros de una familia de genes, que codifican polipeptidasas capaces de inhibir la actividad proapoptótica de p53.

Los genes supresores de tumores codifican proteínas que funcionan para inhibir el crecimiento o la división celular y son por lo tanto importantes respecto a mantener la proliferación, crecimiento y diferenciación de células normales. Las mutaciones en los genes supresores de tumores dan como resultado una progresión anormal del ciclo celular por la que los puntos de control del ciclo celular normales que detienen el ciclo cuando por ejemplo el ADN esta dañado son ignorados y las células dañadas se dividen de forma incontrolada. Los productos de los genes supresores de tumores funcionan en todas las partes de la célula (por ejemplo, superficie celular, citoplasma, núcleo) para prevenir el paso de células dañadas a través del ciclo celular (es decir, G1, S, G2, M y citocinesis).

Se han aislado y secuenciado diversos genes supresores de tumores. Estos incluyen, sólo como ejemplo, el gen del retinoblastoma (Rb), en el que mutaciones están asociadas a cánceres tales como cáncer de hueso (osteocarcoma), de vejiga, de células pequeñas de pulmón y de mama, así como retinoblastoma y el gen del tumor de Wils-1, mutaciones que están asociadas a nefroblastoma y neurofibromatosis.

La familia de genes supresores de tumores, MAD (madres contra dpp (gen decapentapélgico)) y MADR (genes relacionados con MAD) se han identificado en diversas especies. Estos genes codifican proteínas implicadas en rutas de transducción de señal requeridas para la señalización del receptor serina/treonina. El MADR1 es esencial para la señalización de la ruta dpp. El MADR2 es otro MADR y mutaciones en este gen se han relacionado con cáncer colorrectal (6% de los cánceres colorrectales). La secuencia del gen MADR2, también conocido como Smad2, se describe en el documento WO 98/07849.

Podría decirse que el gen supresor de tumores que ha sido objeto de la investigación más intensa es el p53. El p53 codifica una proteína que funciona como un factor de transcripción y es un regulador clave del ciclo de división celular. Fue descubierto en 1978 (Lane y Crawford, 1979) como una proteína que se demostró que se unía con afinidad al antígeno mayor T de SV40. El gen p53 codifica un polipéptido de 393 aminoácidos con un peso molecular de 53 kDa.

Los genes regulados por la actividad de transcripción de p53 contienen una secuencia de reconocimiento de p53 en sus regiones 5'. Estos genes son activados cuando los niveles celulares de p53 son elevados debido a, por ejemplo, daño del ADN. Ejemplos de genes que responden a p53 incluyen mdm2 (Momand y col., 1992), Bax (Miyashita y Reed, 1995) y PIG-3 (Polyak y col., 1997). Bax y PIG-3 están implicados en una de las funciones más importantes de p53, la inducción de la apoptosis. La apoptosis, o muerte celular programada es un proceso natural que elimina las células dañadas. Es de importancia respecto a muchos procesos celulares, incluyendo la eliminación de células precancerosas, el desarrollo de células/tejidos y la homeostasis.

Como se ha mencionado anteriormente, uno de las funciones de supresión de tumores más importantes de p53 es la capacidad de inducir la apoptosis. La capacidad para regular al alza la expresión de algunos de los genes proapoptóticos tales como Bax proporcionó alguna prueba de cómo p53 induce la apoptosis. Sin embargo, comparando la expresión de Bax en ratones transgénicos p53(-/-) y p53(+/+) y el tipo salvaje, es evidente que la expresión de Bax sólo estaba regulada por p53 en un número limitado de tejidos en respuesta a daño del ADN. Por lo tanto, sigue estando poco claro por qué la expresión de p53 sólo podría inducir la expresión de Bax de una forma específica del tipo celular. Recientemente se demostró que una mutación en p53 puede cambiar la especificidad promotora. Se demostró que dos de los genes mutantes de p53 derivados de tumores eran defectuosos en la transactivación del promotor de Bax pero competentes para transactivar otros promotores de genes diana de p53 tales como mdm2 y p21wafl. Estas observaciones sugirieron
que para ser capaz de transactivar genes como Bax, es muy importante para el tumor la función de supresión de p53.

Es sabido que p53 induce la apoptosis a través de rutas transcripcionales dependientes e independientes. Además, la apoptosis inducida por p53 puede ser bloqueada por el oncogén bcl-2. No obstante, bcl-2 no inhibe la función de transactivación de p53. Hasta ahora se sabe muy poco sobre los mecanismos moleculares de cómo bcl-2 inhibe la apoptosis inducida por p53.

La 53BP2 es una proteína de unión a p53 inicialmente descubierta por Iwabuchi y col. (1994). Se aisló 53BP2 en una detección sistemática de levadura doble híbrida y se descubrió que consistía en 528 aminoácidos a partir del extremo C-terminal de la proteína. Contiene una secuencia rica en prolina, cuatro repeticiones anquirina y un dominio SH3. Seguidamente se identificó como una proteína que interactuaba con Bcl-2 (Naumovski y Cleary, 1996). Una versión más larga de esta proteína se aisló y se denominó bBP2/53BP2. Basándose en los datos de traducción in vitro, los autores (Naumovski y Cleary, 1996) predijeron que la proteína bBP2/53BP2 consistía en 1005 aminoácidos.

En un intento de entender cómo la función apoptótica de p53 puede ser regulada in vivo, se generaron anticuerpos para 53BP2 y se demostró que en la mayoría de las células sometidas a prueba, el nivel de expresión de 53BP2 es bajo. También se observó que la bBP2/53BP2 endógena inesperadamente codifica una proteína mayor que los 1005 aminoácidos predichos por Naumovski y Cleary. Esta proteína se denomina ASP-2 o ASP-2/53BP.

Se ha demostrado que la mitad C-terminal de la bBP2/53BP2 no tiene un efecto significativo sobre la actividad de p53. Sin embargo, la ASP-2/53BP estimulaba la función de transactivación de p53. De forma más interesante, la ASP-2/53BP puede incrementar específicamente la función de transactivación de p53 en los promotores derivados de genes proapoptóticos tales como Bax y PIG-3.

Usando la secuencia de ADNc de ASP-2, se realizó una investigación BLAST y se identificó un clon denominado KIAA0771 con homología significativa con la secuencia de ácido nucleico que codifica bBp2/53BP2, lo que sugiere que la secuencia recientemente identificada es un miembro de una familia de genes que codifican proteínas estimulantes de la apoptosis (ASP). Este miembro de la familia es referido como ASP-1.

Se ha nombrado la nueva secuencia de ácido nucleico ASP-1 (proteína estimulante de la apoptosis 1), que codifica un polipéptido que tiene homología de secuencia con bBP2/53BP2.

Se ha identificado un regulador de ASP-2 que inhibe el efecto estimulador de p53 de ASP-2. Se ha denominado a este regulador I-ASP. I-ASP fue descrito en la técnica como RAI (inhibidor asociado a Rel1A) por Yang JP y col., JBC 274:15662 y documento WO 0032628.como un inhibidor de NF-KB. Se ha descubierto que en tumores que expresan ASP-1 y ASP-2, la expresión de I-ASP está regulada al alza comparada con los controles normales emparejados. Esto sugiere que la actividad de supresión de tumores de p53 puede estar regulada positiva y negativamente por ASP y I-ASP in vivo.

De aquí en adelante, la expresión "polipéptido de la invención" se referirá a I-ASP.

El alcance la invención está definido exclusivamente por las reivindicaciones, la descripción tiene propósito ilustrativo.

Según un aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo, o parte unión del mismo, que se una al menos a una parte del polipéptido de la invención.

En una realización preferida de la invención, dicha parte de unión está seleccionada del grupo constituido por: fragmentos F(ab')_{2}, Fab, Fv y Fd; comprendiendo los anticuerpos regiones CDR3.

En una realización preferida de la invención, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En una realización adicional más de la invención, dicho anticuerpo está humanizado.

De forma alternativa, dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico producido por procedimientos recombinantes para contener la región variable de dicho anticuerpo con una región invariante o constante de un anticuerpo humano.

Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos recombinantes en los que todas las regiones V de un anticuerpo de ratón o rata están combinadas con regiones C de anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos híbridos recombinante que fusionan las regiones determinantes de complementariedad a partir de una región V de un anticuerpo de roedor con las regiones marco a partir de las regiones V del anticuerpo humano. Las regiones C del anticuerpo humano también se usan. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) son las regiones en el interior del dominio N-terminal tanto de la cadena pesada como de la ligera del anticuerpo al que se restringe la mayoría de la variación de la región V. Estas regiones forman bucles en la superficie de la molécula de anticuerpo. Estos bucles proporcionan la superficie de unión entre el anticuerpo y el antígeno.

La producción de anticuerpos es bien conocida en la técnica. Están disponibles varios libros de texto de laboratorio para el experto. Por ejemplo, Antibodies, Lane y Harlow, Cold Spring Harbour Laboratories.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un procedimiento para determinar la expresión de ARNm y/o el polipéptido según la invención.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un procedimiento para la detección sistemática de agentes capaces de modular la actividad del polipéptido según la invención, que comprende:

i) proporcionar una célula o línea celular que expresa el polipéptido según la invención;

ii) exponer a la célula a al menos un agente para el que se realiza la prueba; y

iii) monitorizar el efecto del agente o agentes sobre la actividad del polipéptido.

Según otro aspecto adicional de la invención, se proporciona un procedimiento para hacer un barrido para buscar agentes capaces de modular la actividad del polipéptido según la invención, que comprende:

i) proporcionar al menos el polipéptido según la invención;

ii) exponer al polipéptido a al menos un agente para el que se realiza la prueba; y

iii) monitorizar la unión de dicho agente o agentes por dicho polipéptido.

En una realización preferida adicional de la invención, dicho agente es un antagonista que inhibe la actividad del polipéptido según la invención. Preferiblemente, dicho agente es un polipéptido.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona una molécula de acido nucleico no codificante en el que dicha molécula comprende la secuencia no codificante de la secuencia codificante representada en la figura 2 o parte de la misma.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula no codificante según la invención.

En una realización preferida de la invención, dicho ácido nucleico no codificante está combinado con al menos un agente quimioterapéutico. Preferiblemente, dicho agente es una agente anticancerígeno seleccionado del grupo constituido por: cisplatino; carboplatino; ciclosfosfamida; melfalán; carmuslina; metotrexato; 5-fluorouracilo; citarabina; mercaptopurina; daunorrubicina; doxorrubicina; epirrubicina; vinblastina; vincristina; dactinomicina; mitomicina C; taxol; L-asparaginasa; G-CSF; una enedina tal como caliqueamicina o esperamicina; clorambucil; ARA-C; vindesina; bleomicina y etopósido. Otros agentes que pueden combinarse con los anteriores incluyen agentes que actúan sobre la neovasculatura o los inmunomoduladores tumorales. Preferiblemente, el agente que actúa sobre la neovasculatura tumoral se selecciona del grupo constituido por combrestatina A4, angiostatina y endostatina. Preferiblemente, el inmunomodulador se selecciona del grupo constituido por \alpha-interferón, \gamma-interferón y factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha).

En una realización preferida de la invención, dicho agente es cisplatino.

La invención implica por lo tanto la detección de polipéptidos I-ASP, genes que codifican I-ASP, modificaciones y variaciones funcionales de los anteriores, fragmentos útiles de los anteriores, así como la terapéutica relacionada con ellos. La expresión de este gen afecta a la apoptosis uniéndose a p53 y polipéptidos relacionados.

Como se usa en este documento respecto a ácidos nucleicos, el término "aislado" significa: (i) amplificado in vivo, por ejemplo, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR); (ii) producido de forma recombinante por clonación; (iii) purificado, como por escisión y separación en gel; o (iv) sintetizado por, por ejemplo, síntesis química. Un ácido nuclei-
co aislado es aquel que es fácilmente manipulable por técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica.

Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos contenida en un vector en la que los sitios de restricción 5' y 3' son conocidos o para la que se han descrito secuencias cebadoras para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es considerada aislada, pero una secuencia de ácido nucleico que existe en su estado nativo en su anfitrión natural no lo es. Un ácido nucleico puede ser sustancialmente purificado, pero no necesita serlo. Por ejemplo, un ácido nucleico que es aislado en un vector de clonación o de expresión no es puro en el sentido de que puede comprender sólo un pequeño porcentaje del material en la célula en la que reside. Tal ácido nucleico es aislado, sin embrago, como se usa el término en este documento, porque es fácilmente manipulable por técnicas convencionales conocidas para aquellos exper6tos habituales en la técnica. Un ácido nucleico aislado como se usa en este documento no es un cromosoma que aparece de forma natural.

Como se usa en este documento respecto a polipéptidos, "aislado" significa separado de su ambiente nativo y presente en cantidad suficiente para permitir su identificación o uso. Aislado cuando se refiere a una proteína o polipéptido significa, por ejemplo: (i) producido de forma selectiva por expresión o clonación o (ii) purificado como por cromatografía o electroforesis. Las proteínas o polipéptidos aislados pueden ser sustancialmente puros, aunque no necesitan serlo. El término "sustancialmente puro" significa que las proteínas o los polipéptidos están esencialmente libres de otras sustancias con las que se pueden encontrar en la naturaleza o en sistemas in vivo en un grado práctico y apropiado para el uso que se pretende. Los polipéptidos sustancialmente puros pueden producirse por técnicas bien conocidas en la técnica. Ya que una proteína aislada se puede mezclar con un portador farmacéuticamente aceptable en una preparación farmacéutica, la proteína puede comprender sólo un pequeño porcentaje en peso de la preparación. La proteína está aislada no obstante ya que ha sido separada de las sustancias con las que puede estar asociada en sistemas vivos, es decir, aislada de otras proteínas.

Un aspecto de la invención son aquellas secuencias de ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos I-ASP y que hibridan con una molécula de ácido nucleico como se proporciona en este documento en condiciones restrictivas. El término "condiciones restrictivas" como se usa en este documento se refiere a parámetros con los que la técnica es familiar. Se pueden encontrar parámetros de hibridación de ácidos nucleicos en referencias que recopilan tales procedimientos, por ejemplo Molecular cloning: A laboratory Manual, J. Sambrook, y col., ed. Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, y col., ed., John Willey & Sons, Inc., Nueva York. Más específicamente, condiciones restrictivas, como se usa en este documento, se refiere a por ejemplo, hibridación a 65ºC en tampón de hibridación (3,5 x SCC, Ficoll 2%, polivinilpirrolidona 0,02%, albúmina de suero bovino 0,02%, NaH_{2}PO_{4} 2,5 mM (pH 7), SDS 0,5%, EDTA 2 mM). SSC es cloruro de sodio 0,15M/citrato de sodio 0,015M, pH 7; SDS es dodecil sulfato de sodio; y EDTA es ácido etilendiaminotetraacético. Después de la hibridación, la membrana sobre la cual se transfiere el ADN se lava a 2 x SSC a temperatura ambiente y luego a 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS a temperaturas de hasta 68ºC.

Hay otras condiciones, reactivos, etc que se pueden usar que dan como resultado un grado de restricción similar. Al experto le serán familiares tales condiciones, y por lo tanto no se dan en este documento. Se entenderá, sin embargo, que el experto será capaz de manipular las condiciones de una manera que permita la identificación clara de homólogos y alelos de ácidos nucleicos de I-ASP. Al experto le es también familiar con la metodología para detectar selectivamente células y bibliotecas para la expresión de tales moléculas, que son después aisladas de forma rutinaria, seguido por aislamiento de la molécula de ácido nucleico pertinente y su secuenciación.

En general, los homólogos y los alelos típicamente compartirán al menos el 90% de identidad de nucleótidos, y/o al menos el 95% de identidad de aminoácidos. La homología puede calcularse usando diversas herramientas de software disponibles públicamente desarrolladas por NCBI (Bethesda, Maryland) que se pueden obtener a través de Internet (ftp:/nc-bi.nlm.nih.gov/pub/).

Herramientas ejemplares incluyen el sistema BLAST disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov, preferiblemente usando los ajustes dados por defecto. Los alineamientos de Pairwise y ClustalW (ajuste de matriz BLOSUM30) así como el análisis hidropático de Kyle-Doolitle se pueden obtener usando el software de análisis de secuencia MacVector (Oxford Molecular Group). Los complementos de Watson y Crick de los ácidos nucleicos anteriores también están abarcados en la invención.

Al detectar selectivamente ácidos nucleicos que codifican proteínas I-ASP con homología de secuencia con los ácidos nucleicos descritos en este documento, se puede realizar una transferencia de Southern usando las condiciones anteriores, junto con una sonda detectable (por ejemplo, radioactiva, quimioluminiscente). Después de lavar la membrana a la cual se transfiere finalmente el DN, se puede detectar la señal de la sonda, tal como situando la membrana frente a una película de rayos X o placas de obtención de imágenes por fosforescencia para detectar la señal radioactiva, o procesando la membrana para detectar la señal quimioluminiscente.

La invención también incluye ácidos nucleicos degenerados que incluyen codones alternativos a aquellos presentes en los materiales nativos. Por ejemplo, los restos de serina están codificados por los codones TCA, AGT, TCC, TCG, TCT, y AGC. Cada uno de los seis codones es equivalente para los propósitos de codificar un resto de serina. Por lo tanto, resultará evidente para un experto habitual en la materia que cualquiera de los tripletes de nucleótidos que codifican serina se puede emplear para dirigir el aparato de síntesis de proteínas, in vitro o in vivo, para incorporar un resto de serina en un polipéptido en elongación. De forma similar, las secuencias de tripletes de nucleótidos que codifican otros restos de aminoácidos incluyen, pero no se limitan a: CCA, CCC, CCG y CCT (codones prolina); CGA, CGC, CGG, AGA y AGG (codones arginina); ACA, ACC, ACG y ACT (codones treonina); AAC y AAT (codones asparagina); y ATA, ATC y ATT (codones isoleucina). Otros restos de aminoácidos pueden estar codificados de forma similar por múltiples secuencias de nucleótidos. Por lo tanto, la invención abarca ácidos nucleicos degenerados que difieren de los ácidos nucleicos aislados biológicamente en su secuencia de codones debido a la degeneración del código genético.

La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico o polipéptidos modificados que incluyen adiciones, sustituciones y deleciones de uno o más nucleótidos o aminoácidos. Como se usa en este documento, "uno o más" significa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más hasta un número que no cambia sustancialmente la función de la molécula para aquellas moléculas en las que se desea que la función sea sustancialmente similar a la del ácido nucleico o polipéptido original. Un cambio sustancial de función sería, por ejemplo, una proteína dominantemente negativa, o una proteína que ha perdido una o más de sus funciones.

En realizaciones preferidas, estas moléculas de ácidos nucleicos modificadas y/o los polipéptidos que codifican mantienen al menos una actividad o función de la molécula de ácido nucleico y/o polipéptidos no modificados, tal como unión a p53, antigenicidad, actividad de transcripción, etc. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico modificadas codifican polipéptidos modificados, preferiblemente polipéptidos que tienen sustituciones de aminoácidos conservadoras como se describen en otras partes de este documento. Las moléculas de ácido nucleico modificadas están estructuralmente relacionadas con las moléculas de ácido nucleico no modificadas y en realizaciones preferidas, están estructuralmente relacionados de forma suficiente con las moléculas de ácido nucleico no modificadas de tal forma que las moléculas de ácido nucleico modificadas y no modificadas hibridan en condiciones altamente restrictivas conocidas por el experto en la materia.

Por ejemplo, se pueden preparar moléculas de ácido nucleico modificadas que codifican polipéptidos que tienen cambios únicos de aminoácidos. Cada una de estas moléculas de ácidos nucleicos pueden tener una, dos o tres sustituciones de nucleótidos que exclusivas de cambios de nucleótidos correspondientes a la degeneración del código genético como se describe en este documento. De forma similar, se pueden preparar moléculas de ácido nucleico modificadas que codifican polipéptidos que tienen dos cambios de aminoácidos, las cuales tienen, por ejemplo, 2-6 cambios de nucleótidos. El experto en la materia se imaginará fácilmente numerosas moléculas de ácido nucleico modificadas como estas, incluyendo por ejemplo sustituciones de nucleótidos en codones que codifican aminoácidos 2 y 3, 2 y 4, 2 y 5, 2 y 6, y así sucesivamente. En el ejemplo anterior, cada combinación de dos aminoácidos está incluida en el juego de moléculas de ácido nucleico modificadas, así como todas las sustituciones de nucleótidos que codifican para las sustituciones de aminoácidos. También se pueden preparar moléculas de ácido nucleico adicionales que codifican polipéptidos que tienen sustituciones adicionales (es decir, 3 o más), adiciones o deleciones (por ejemplo, por la introducción de un codón de detención o un sitio o sitios de empalme, y están abarcados por esta invención como se será fácilmente imaginado por un experto en la materia. Cualquiera de los ácidos nucleicos o polipéptidos anteriores se puede someter a prueba por experimentación rutinaria respecto a la retención de la relación estructural o actividad para los ácidos nucleicos y/o polipéptidos descritos en este documento.

La invención también proporciona fragmentos de I-ASP aislados o complementos de los mismos de longitud suficiente para representar una secuencia única dentro del genoma humano, e identificar un ácido nucleico que codifica polipéptidos I-ASP. Estos fragmentos se pueden considerar únicos en el sentido de que un fragmento único es aquel que es una "firma" para el ácido nucleico mayor. Un fragmento único, por ejemplo, es lo suficientemente largo como para asegurar que su secuencia precisa no se encuentra en moléculas fuera de los ácidos nucleicos I-ASP definidos anteriormente, es decir, que identifica específicamente las secuencias I-ASP. Un fragmento único incluye una secuencia de nucleótidos contiguos que no es idéntica a ninguna de las secuencias presentes en las bases de datos disponibles públicamente (por ejemplo, Gen Bank) hasta la fecha de presentación de esta solicitud, aunque ciertos fragmentos pueden contener como una porción del fragmento algunas secuencias previamente conocidas depositadas en el GenBank. De forma similar, los complementos de secuencias públicamente conocidas y fragmentos de las secuencias públicamente conocidas y complementos de los mismos pueden ser una porción, pero no la totalidad de los fragmentos únicos de I-ASP. Por lo tanto, un fragmento único excluye, por definición, secuencias constituidas solamente por EST y/o secuencias de genes depositadas en bases de datos disponibles públicamente hasta la fecha más temprana de presentación de las secuencias contenidas en esta solicitud. Por lo tanto, un fragmento único debe contener una secuencia de nucleótidos distinta de la secuencia exacta de aquellas que se encuentran en el GenBank o fragmentos de las mismas. La diferencia puede ser una adición, deleción o sustitución respecto a la secuencia del GenBank o puede ser una secuencia completamente distinta de la secuencia del GenBank.

Se pueden usar fragmentos de moléculas de ácido nucleico I-ASP, incluyendo fragmentos únicos, como sondas en ensayos de transferencia de hibridación (por ejemplo, técnica de Southern, técnica de Northern) para identificar tales ácidos nucleicos, en ensayos de protección de la nucleasa para medir la transcripción, o se pueden usar en ensayos de amplificación tales como aquellos que emplean PCR. Como es sabido para los expertos en la materia, se prefieren sondas grandes tal como de 200, 250, 300 o más nucleótidos para ciertos usos tales como técnicas de Southern y de Northern, mientras que fragmentos más pequeños se preferirán para usos tales como PCR. También se pueden usar fragmentos para producir proteínas de fusión para generar anticuerpos o determinar la unión de fragmentos de polipéptidos, o para generar componentes de inmunoensayo. De forma similar, se pueden emplear fragmentos para producir fragmentos no fusionados de los polipéptidos I-ASP tales como fragmentos N-terminales o C-terminales, o los diversos dominios proteicos descritos en este documento, útiles por ejemplo en la preparación de anticuerpos, en inmunoensayos y como parejas de unión comparativas de los polipéptidos I-ASP y/u otros polipéptidos que se unen a p53 o polipéptidos rel, por ejemplo, en aplicaciones terapéuticas. Se pueden usar fragmentos adicionalmente como moléculas no codificantes, como se describe en este documento, para inhibir la expresión de ácidos nucleicos y polipéptidos I-ASP, particularmente para propósitos terapéuticos como se describe en mayor detalle en este documento.

Como reconocerán aquellos expertos en la materia, el tamaño del fragmento único dependerá de su conservación en el código genético. Por lo tanto, algunas regiones de las moléculas de ácido nucleico y sus complementos requerirán segmentos más largos para ser únicas mientras que otras requerirán tan solo segmentos más cortos, típicamente ente 12 y 32 nucleótidos (por ejemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 y 32 bases de longitud). Esta descripción tiene intención de abarcar todos y cada uno de los fragmentos de cada secuencia, empezando por el primer nucleótido, el segundo nucleótido, y así sucesivamente hasta 8 nucleótidos antes del final, y terminando en cualquier lugar desde el nucleótido número 8, 9, 10 y así sucesivamente para cada secuencia, hasta el último nucleótido de todos (siempre que la secuencia sea única como se ha descrito anteriormente). Muchos segmentos de los ácidos nucleicos I-ASP, o complementos de los mismos que tienen una longitud de 25 nucleótidos o más serán únicos. Aquellos expertos en la materia versados en procedimientos para determinar tales secuencias, típicamente sobre la base de la capacidad del fragmento único para distinguir selectivamente la secuencia de interés de ácidos nucleicos no I-ASP. Una comparación de la secuencia del fragmento con aquellas de bases de datos conocidas es típicamente todo lo que resulta necesario, aunque se pueden realizar hibridación confirmatoria in vitro y análisis de secuenciación.

Un fragmento puede ser un fragmento funcional. Un fragmento funcional de la molécula de ácido nucleico de la invención es un fragmento que mantiene algunas propiedad funcional de la molécula de ácido nucleico mayor, tal como codificar para un polipéptido funcional, unirse a proteínas (por ejemplo, a p53), regular la transcripción de ácidos nucleicos unidos de forma operativa, codificar para epítopos reconocidos inmunológicamente y similares. Un experto habitual en la materia puede determinar fácilmente usando los ensayos descritos en este documento y aquellos bien conocidos en la técnica para determinar si un fragmento es un fragmento funcional de una molécula de ácido nucleico usando nada más que experimentación rutinaria.

Como se ha mencionado anteriormente, la invención abarca oligonucleótidos no codificantes que se unen selectivamente a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido I-ASP, para modular la unión de p53, la actividad transcripcional o la apoptosis, por ejemplo. Esto es deseable en prácticamente cualquier dolencia médica en la que es deseable una modulación de la actividad de p53, tal como cáncer y dolencias que implican apoptosis aberrante.

Como se usa en este documento, "nucleótido no codificante" o "no codificante" describe un oligoncleótido que es un oligorribonucleótido, oligodesoxirribonucleótido u oligodesoxirribonucleótido modificado que hibrida en condiciones fisiológicas con ADN que comprende un gen particular, o con un transcripto de ARNm de ese gen y, por ello inhibe la transcripción de ese gen y/o la traducción de ese ARNm,. Las moléculas no codificantes se diseñan de tal manera que interfieran con la transcripción o la traducción de un gen diana mediante hibridación con el gen o transcripto diana. Aquellos expertos en la materia reconocerán que la longitud exacta del oligonucleótido no codificante y su grado de complementariedad con su diana dependerá de la diana específica seleccionada, incluyendo la secuencia de la diana las bases particulares que comprende dicha secuencia. Se prefiere que el oligonucleótido no codificante se construya y se ordene de tal manera que se una selectivamente con la diana en condiciones fisiológicas, es decir, para hibridar sustancialmente más con la secuencia diana que con cualquier otra secuencia en la célula diana en condiciones fisiológicas. Basándose en las secuencias de ácido nucleico I-ASP proporcionadas en este documento, o en secuencias alélicas u homólogas genómicas y/o de ADNc, un experto en la materia puede fácilmente elegir y sintetizar cualquiera de varias moléculas no codificantes apropiadas para usarlas de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, se puede preparar un "camino génico" que comprende una serie de oligonucleótidos de 15-30 nucleótidos que engloba la longitud de un ácido nucleico I-ASP, seguido de una prueba respecto a la inhibición de la expresión de I-ASP correspondiente. Opcionalmente, se pueden dejar huecos de 5-10 nucleótidos entre los oligonucleótidos para reducir el número de oligonucleótidos sintetizados y sometidos a prueba.

Con el fin de ser suficientemente selectivos y potentes para la inhibición, tales oligonucleótidos no codificantes deberían comprender al menos 10, y más preferiblemente al menos 15 bases consecutivas que sean complementarias con la diana, aunque en ciertos casos, se han usado oligonucleótidos modificados de tan solo 7 bases de longitud con éxito como oligonucleótidos no codificantes 8Wagner y col., Nature Biotechnol. 14:840-844, 1996). Con la mayor preferencia, los oligonucleótidos no codificantes comprenden una secuencia complementaria de 20-30 bases. Aunque se pueden elegir oligonucleótidos que sean no codificantes para cualquier región del gen o transcriptos de ARNm, en las realizaciones preferidas, los oligonucleótidos no codificantes corresponden a sitios N-terminales o sitios en dirección 5' tales como sitios de iniciación de la traducción, iniciación de la transcripción o promotores. Además, se pueden dirigir hacia regiones no traducidas 3'. Se ha usado dirigirse a sitios de empalme de ARNm en la técnica, pero puede ser menos preferido si se da empalme alternativo de ARNm. Además, el no codificante se dirige preferiblemente a sitios en los que no se espera estructura secundaria de ARNm (véase, por ejemplo, Sainio y col., Cell Mol. Neurobiol. 14(5): 439-454, 1994) y en los que no se espera que se unan proteínas. Finalmente, aunque las secuencias de ADNc I-ASP se describen en este documento, un experto habitual en la materia puede derivar fácilmente el ADN genómico correspondiente a estos ADNc. Por lo tanto, la presente invención también proporciona oligonucleótidos no codificantes que son complementarios al ADNc genómico I-ASP. De forma similar, están permitidos sin excesiva experimentación no codificantes para ADNc genómicos u homólogos y ADN genómicos.

En un juego de realizaciones, los oligonucleótidos de la invención pueden estar compuestos por desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos naturales o cualquier combinación de los mismos. Es decir, el extremo 5' de un nucleótido nativo y el 3' de otro nucleótido nativo pueden estar unidos covalentemente, como en los sistemas naturales, por medio de un enlace fosfodiéster internucleósido. Estos oligonucleótidos pueden ser preparados por procedimientos reconocidos en la técnica que pueden llevarse a cabo de forma manual o por un sintetizador automático. También se pueden producir de forma recombinante por vectores.

En realizaciones preferidas, los oligonucleótidos no codificantes de la invención también pueden incluir oligonucleótidos "modificados". Es decir, los oligonucleótidos pueden estar modificados de varias formas que no evitan que hibriden con su diana, pero que potencian su estabilidad o dirección o que potencian de otra manera su eficacia terapéutica.

El término oligonucleótidos "modificados" como se usa en este documento describe un oligonucleótidos en el que (1) al menor dos de sus nucleótidos están unidos covalentemente por medio de un enlace internucleósido sintético (es decir, un enlace distinto de un enlace fosfodiéster entre el extremo 5' de un nucleótido y el extremo 3' de otro nucleótido) y/o (2) un grupo químico normalmente no asociado con ácidos nucleicos se ha adjuntado covalentemente al oligonucleótido. Son enlaces internucleósidos sintéticos preferidos fosforotioatos, fosforoditioatos, ésteres fosfato, alquilfosfonotioatos, fosforoamidatos, carbamatos, carbonatos, triésteres fosfato, acetamidatos, ésteres carboximetílicos y péptidos.

El término "oligonucleótido modificado" abarca también oligonucleótidos con una base y/o azúcar modificados covalentemente. Por ejemplo, oligonucleótidos modificados incluyen oligonucleótidos que tienen azúcares en el esqueleto que están adjuntados de forma covalente a grupos orgánicos de bajo peso molecular distintos de un grupo hidroxilo en la posición 3' y distintos de un grupo fosfato en la posición 5'. Por lo tanto, los oligonucleótidos modificadas pueden incluir un grupo ribosa 2'-O-alquilado. Además, los oligonucleótidos modificados pueden incluir azúcares tales como arabinosa en lugar de ribosa. La presente invención por lo tanto, contempla preparaciones farmacéuticas que contienen moléculas no codificantes modificadas que son complementarias e hibridables en condiciones fisio-
lógicas con ácidos nucleicos que codifican polipéptidos I-ASP, junto con portadores farmacéuticamente aceptables.

Los oligonucleótidos no codificantes pueden ser administrados como parte de una composición farmacéutica. Tal composición farmacéutica puede incluir los oligonucleótidos no codificantes en combinación con cualquier portador convencional fisiológica y/o farmacéuticamente aceptable que son conocidos en la técnica. Las composiciones deben ser estériles y contener una cantidad terapéuticamente eficaz de de los oligonucleótidos no codificantes en una unidad de peso o volumen adecuada para la administración a un paciente. Las características del portador dependerán de la vía de administración. Los portadores fisiológica y farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes, cargas, sales, tampones, estabilizantes, solubilizantess y otros materiales que son bien conocidos en la técnica.

Como se usa en este documento, un "vector" puede ser cualquiera de varios ácidos en el que se puede insertar una secuencia por restricción y ligamiento para el transporte entre diferentes ambientes genéticos o para expresión en una célula anfitriona. Los vectores incluyen, pero no se limitan a plásmidos, fagémidos, y genomas de virus. Un vector de clonación es aquel que es capaz de replicarse en una célula anfitriona, y que típicamente está caracterizado además por uno o más sitios de restricción de endonucleasa por los que se puede cortar el vector de una manera determinada y en el que se puede ligar una determinada secuencia de ADN de tal forma que el nuevo vector recombinante mantiene su capacidad para replicarse en la célula anfitriona. En el caso de plásmidos, la replicación de la secuencia deseada se puede producir muchas veces según el plásmido aumenta en número de copias en el interior de la bacteria anfitriona o sólo una única vez por anfitrión antes de que el anfitrión se reproduzca por mitosis. En el caso de un fago, la replicación se puede producir de forma activa durante una fase lítica o de forma pasiva durante una fase lisogénica. Un vector de expresión es aquel en el que se puede insertar una secuencia deseada de ADN por restricción y ligamiento de tal forma que se junta operativamente a secuencias reguladoras y puede ser expresado como transcripto de ARN. Los vectores pueden contener adicionalmente una o más secuencias marcadoras adecuadas para su uso en la identificación de células que han sido o no transformadas o transfectadas con el vector. Los marcadores incluyen, por ejemplo, genes que codifican proteínas que aumentan o disminuyen la resistencia o sensibilidad a antibióticos u otros compuestos, genes que codifican enzimas cuyas actividades son detectables por ensayos convencionales conocidos en la materia (por ejemplo, \beta-galactosidasa, luciferasa o fosfatasa alcalina), y genes que afectan visiblemente el fenotipo de las células, anfitriones, colonias o placas transformados o transfectados (por ejemplo, diversas proteínas fluorescentes tales como proteína verde fluorescente, GFP). Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma y expresión de los productos estructurales de los genes presentes en los segmentos de ADN a los que están unidos de forma operativa.

Como se usa en este documento, se dice que una secuencia de codificación y secuencias reguladoras se juntan de forma operativa cuando están unidas covalentemente de tal forma que ponga la expresión o transcripción de la secuencia de codificación bajo la influencia o control de las secuencias reguladoras. Si se desea que las secuencias codificadoras se traduzcan en una proteína funcional, se dice que dos secuencias ADN están juntas de forma operativa si la inducción de un promotor en las secuencias reguladoras 5' dan como resultado la transcripción de la secuencia codificadora y si la naturaleza de la unión entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación de desplazamiento de marco, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora de dirigir la transcripción de las secuencias codificadoras, o (3) interfiere con la capacidad del transcripto de ARN correspondiente de ser traducido en una proteína. Por lo tanto, una región promotora se juntaría de forma operativa con una secuencia codificadora si la región promotora fuese capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ADN de tal forma que el transcripto resultante pueda ser traducido en la proteína o polipéptido deseados.

La naturaleza precisa de las secuencias reguladoras que se necesitan para la expresión de genes puede variar entre especies o tipos celulares, pero deben incluir en general, como necesarias, secuencias 5' no transcritas y 5' no traducidas implicadas en la iniciación de la transcripción y la traducción, respectivamente, tales como la caja TATA, la secuencia de tapadera, la secuencia CAAT y similares. En particular, tales secuencias 5' no transcritas reguladoras incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen junto de forma operativa. Las secuencias reguladoras pueden incluir también secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en dirección 5' como se desee. Los vectores de la invención pueden incluir opcionalmente secuencias líderes 5' o señal. La elección y diseño de un vector se realizará según la capacidad y discreción de un experto habitual.

Vectores de expresión que contienen todos los elementos necesarios para la expresión están disponibles comercialmente y son conocidos para aquellos expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Las células generalmente se manipulan por la introducción en el interior de las células de ADN (ARN) heterólogo que codifica un polipéptido I-ASP o un fragmento o variante del mismo. El ADN (ARN) heterólogo se sitúa bajo el control operativo de elementos transcripcionales para permitir la expresión del ADN heterólogo en la célula anfitriona.

Son sistemas preferidos para la expresión de ARNm en células de mamífero aquellos tales como pcDNA3.1 y pRc/CMV (disponibles de Invitrogen, Carlsbad, CA) que contienen un marcador que se puede seleccionar tal como un gen que confiere resistencia G418 (que facilita la selección de líneas celulares transfectadas de forma estable) y las secuencias potenciadoras-promotoras del citomegalovirus humano (CMV). Adicionalmente, es adecuado para la expresión en líneas celulares de primates o caninas el vector pCEP4 (Invitrogen), que contienen un origen de replicación del virus de Epstein Barr (EBV), facilitando el mantenimiento de plásmido como un elemento extracromosómico de copia múltiple. Otro vector de expresión es el plásmido pEF-BOS que contiene el promotor del factor de elongación de polipéptido 1\alpha, que estimula eficazmente la transcripción in vitro. El plásmido está descrito por Mishizuma y Nagata (Nuc. Acids Res. 18:5322, 1990) y su uso en experimentos de transcripción está descrito por, por ejemplo, Demoulin (Mol. Cell. Biol. 16:4710-4716, 1996). Otro vector de expresión también preferido es un adenovirus, descrito por Stratford-Perricaudet, que es defectuoso en proteínas E1 y E3 (J. Clin. Invest./90:626-630, 1992). El uso de adenovirus como un Adeno. P1A recombinante se describe por Warnier y col., en inyección intradérmica en ratones ara inmunización contra P1A (Int. J. Cancer, 67:303-310, 1996).

El aislamiento de las moléculas de ácido nucleico I-ASP también hace posible para el experto diagnosticar un trastorno caracterizado por la expresión (o relativa falta de la misma) de estas moléculas. Estos procedimientos implican determinar la expresión de los ácidos nucleicos I-ASP y/o los polipéptidos derivados de los mismos. En la primera situación, tales determinaciones se pueden llevar a cabo por medio de cualquier ensayo de determinación de ácidos nucleicos convencional incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa como se ha ejemplificado en los ejemplos a continuación, o ensayando con sondas de hibridación marcadas.

La invención también implica agentes tales como polipéptidos que se unen a polipéptidos I-ASP y a complejos de polipéptidos I-ASP y parejas de unión tales como p53. Tales agentes de unión se pueden usar, por ejemplo, en ensayos de detección sistemática para detectar la presencia o ausencia de polipéptidos y complejos de polipéptidos I-ASP y sus parejas de unión y en protocolos de purificación para aislar polipéptidos I-ASP y complejos de polipéptidos I-ASP y sus parejas de unión. Tales agentes también se pueden usar para inhibir la actividad nativa de los polipéptidos I-ASP o sus parejas de unión, por ejemplo, uniéndose a dichos polipéptidos o a sus parejas de unión o a ambos.

La invención, por lo tanto abarca agentes de unión a péptidos que, por ejemplo, pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que tienen la capacidad de unirse selectivamente a polipéptidos I-ASP. Los anticuerpos incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales preparados según la metodología convencional.

De forma significativa, como es conocido en la técnica, sólo una pequeña porción de una molécula de anticuerpo, el paratopo, está implicada en la unión de el anticuerpo a su epítopo (véase, en general, Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundatios of Modern Immunology Wiley & Sons Inc., Nueva York; Roitt I., (1991) Essential Immunology, 7ª ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones pFc' y Fc, por ejemplo, son efectoras de la cascada del complemento, pero no están implicadas en la unión a antígeno. Un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región pFc', o que se ha producido sin la región pFc', designado como fragmento F(ab')_{2} mantiene los dos sitios de unión de un anticuerpo intacto. De forma similar, un anticuerpo del que se ha escindido enzimáticamente la región Fc, o que se ha producido sin la región Fc, designado como fragmento Fab, mantiene uno de los sitios de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo intacta. Procediendo adicionalmente, los fragmentos Fab consisten en una cadena ligera de anticuerpo unida covalentemente y una porción de la cadena pesada denominada Fd. Los fragmentos Fd son el mayor determinante de la especificidad del anticuerpo (un solo fragmento Fd puede asociarse con hasta diez cadenas ligeras diferentes sin alterar la especificidad del anticuerpo) y los fragmentos Fd mantienen la capacidad de unión a epítopo cuando están aislados. Dentro de la porción de unión a antígeno de un anticuerpo, como es bien conocido en la técnica, hay regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que interactúan directamente con el epítopo del antígeno, y regiones marco (FR), que mantienen la estructura terciaria del paratopo (véase, en general, Clark, 1986; Roitt, 1991). Tanto en el fragmento de cadena pesada Fd como en la cadena ligera de inmunoglobulinas IgG, hay cuatro regiones marco (FR1 hasta Fr4) separadas respectivamente por las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 hasta CDR3). Las regiones CDR, y en particular CDR3, y más particularmente la CDR3 de cadena pesada son en gran medida responsables de la especificidad del anticuerpo. Actualmente está bien establecido en la técnica que las regiones distintas de CDR de un anticuerpo de mamífero se pueden reemplazar con regiones similares de anticuerpos conespecíficos o heteroespecíficos mientras se mantiene la especificidad epitópica del anticuerpo original.

Esto se manifiesta más claramente en el desarrollo y uso de anticuerpos "humanizados", en los que se juntan covalentemente CDR no humanas a regiones FR y/o Fc/pFc' para producir un anticuerpo funcional. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 4.816.567, 5.225.539, 5.585.089, 5.693.762 y 5.859.205.

Por lo tanto, por ejemplo, la publicación internacional PCT número WO 92/04381 muestra la producción y uso de anticuerpos RSV murinos humanizados en los que al menos una porción de las regiones FR murinas han sido reemplazadas por regiones FR de origen humano. Tales anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos intactos con capacidad de unión a antígeno, son referidos a menudo como anticuerpos "quiméricos".

También se pueden preparar anticuerpos monoclonales enteramente humanos por ejemplo por inmunización de animales no humanos transgénicos para genes de inmunoglobulinas humanos. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.814.318, 5.877.397, 6.091.001, 6.114.598.

Por lo tanto, como resultará evidente para un experto habitual en la técnica, la presente invención también proporciona para fragmentos F(ab')_{2}, Fab, Fv y Fb, anticuerpos quiméricos en los que las regiones Fc y/o FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera han sido reemplazadas por secuencias homólogas humanas o no humanas; anticuerpos con fragmentos F(ab')_{2} quiméricos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera han sido reemplazadas por secuencias homólogas humanas o no humanas,; anticuerpos con fragmentos Fab quiméricos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera han sido reemplazadas por secuencias homólogas humanas o no humanas, y anticuerpos con fragmentos Fd quiméricos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 han sido reemplazadas por secuencias homólogas humanas o no humanas. La presente invención también incluye los llamados anticuerpos de cadena única.

Por lo tanto, la invención implica polipéptidos de numerosos tamaños y tipos que se unen específicamente a polipéptidos I-ASP, y complejos tanto de polipéptidos I-ASP como de sus parejas de unión. Estos polipéptidos pueden ser derivados también de fuentes distintas a la tecnología de anticuerpos. Por ejemplo, tales agentes de unión a polipéptidos pueden ser proporcionados por bibliotecas de péptidos degenerados que pueden prepararse fácilmente en disolución, de forma inmovilizada o como bibliotecas de exposición de fagos. También se pueden sintetizar bibliotecas combinatorias de péptidos que contienen uno o más aminoácidos: las bibliotecas pueden sintetizarse adicionalmente de peptoides y restos sintéticos no peptídicos.

La exposición de fagos puede ser particularmente eficaz para identificar péptidos de unión útiles según la invención. Brevemente, se prepara una biblioteca de fagos (usando, por ejemplo, m13, fd o fago lamda), exponiendo insertos de 4 a aproximadamente 80 restos de aminoácidos usando procedimientos convencionales. Los insertos pueden representar, por ejemplo, un conjunto completamente degenerado o predispuesto. Se pueden seleccionar entonces los insertos portadores de fagos que se unen al polipéptido I-ASP. Este proceso puede repetirse a lo largo de varios ciclos de reselección de fagos que se unen al polipéptido. Las series repetidas conducen a un enriquecimiento en secuencias particulares portadoras de fagos. Se puede realizar un análisis secuencial de ADN para identificar las secuencias de los polipéptidos expresados. Puede determinarse la porción lineal mínima de la secuencia que se une con el polipéptido I-ASP. Se puede repetir el procedimiento usando una biblioteca predispuesta que contenga insertos que contengan parte o toda la porción lineal mínima más uno o más residuos degenerados adicionales en dirección 5' ó 3' de la misma. También se pueden usar procedimientos de detección sistemática de levadura doble híbrida para identificar los polipéptidos que se unen al el o los polipéptidos I-ASP. Por lo tanto, los polipéptidos I-ASP de la invención, o fragmentos de los mismos, se pueden usar para la detección sistemática de bibliotecas de péptidos, incluyendo bibliotecas de exposición de fagos, para identificar y seleccionar parejas de unión a los polipéptidos I-ASP de la invención. Tales moléculas se pueden usar, como se ha descrito, para ensayos de detección sistemática, para protocolos de purificación, para interferir directamente con el funcionamiento de I-ASP y para otros propósitos que resultarán evidentes para los expertos habituales en la materia.

La invención proporciona además procedimientos eficaces para la identificación de agentes farmacológicos o compuestos guía para agentes activos al nivel de una función celular modulable por I-ASP. En particular, tales funciones incluyen unión a p53 y apoptosis. Generalmente, los procedimientos de detección sistemática implican ensayar respecto a compuestos que interfieren con la actividad de I-ASP como unión a p53, etc, aunque también se puede ensayar respecto a compuestos que potencian la actividad de I-ASP usando los procedimientos de detección sistemática. Tales procedimientos son adaptables a la detección sistemática automática de alta tasa de transferencia de compuestos. Las indicaciones terapéuticas diana de agentes farmacológicos detectados por los procedimientos de detección sistemática están limitadas sólo en el sentido de que la función celular diana esté sujeta a modulación por alteración de la formación de un complejo que comprende un polipéptido I-ASP o un fragmento del mismo y una o más dianas intracelulares de unión de I-ASP, tales como p53. Las indicaciones diana incluyen la apoptosis.

Se proporcionan una amplia variedad de ensayos para agentes farmacológicos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína marcadas in vitro, ensayos de desplazamiento de la movilidad electroforética, inmunoensayos, ensayos basados en células tales como detecciones sistemáticas dobles o triples híbridas, ensayos de expresión, etc. Por ejemplo, las detecciones sistemáticas híbridas se usan para examinar fácilmente el efecto de ácidos nucleicos transfectados sobre la unión intracelular de polipéptidos I-ASP o fragmentos de los mismos a dianas intracelulares específicas. Los ácidos nucleicos transfectados pueden codificar, por ejemplo, bibliotecas de péptidos combinatorias o moléculas no codificantes. En la técnica son conocidos reactivos convenientes para tales ensayos, por ejemplo proteínas de fusión GAL4. Un ensayo ejemplar basado en células implica transfectar a una célula con un ácido nucleico que codifica un polipéptido I-ASP fusionado con un dominio de unión a ADN GAL4 y un ácido nucleico que codifica un dominio p53 que interactúa con I-ASP fusionado con un dominio de activación de la transcripción tal como VP16. La célula también contiene un gen informador unido de forma operativa a una región reguladora de la expresión génica, tal como uno o más sitios de unión a GAL4. La activación de la transcripción del gen informador aparece cuando los polipéptidos de fusión ASP y p53 se unen de tal forma que el dominio de unión a GAL4 y el dominio de activación transcripcional VP16 se aproximan para permitir la transcripción del gen informador. Los agentes que modulan una función celular mediada por polipéptido I-ASP son entonces detectados mediante un cambio en la expresión del gen informador. En la técnica se conocen procedimientos para determinar cambios en la expresión de genes informadores.

Los fragmentos de I-ASP que se usan en estos procedimientos, cuando no son producidos por un ácido nucleico transfectado se añaden a una mezcla de ensayo como un polipéptido aislado. Los polipéptidos I-ASP se producen preferiblemente de forma recombinante, aunque tales polipéptidos pueden aislarse a partir de extractos biológicos. Los polipéptidos I-ASP producidos de forma recombinante incluyen proteínas quiméricas que comprenden una fusión de una proteína I-ASP con otro polipéptido, por ejemplo, un polipéptido capaz de proporcionar o potenciar la unión proteína-proteína, la unión específica a secuencia de ácido nucleico (tal como GAL4), potenciar la estabilidad del polipéptido I-ASP en las condiciones de ensayo o proporcionar un resto detectable, tal como proteína verde fluorescente o un epítopo bandera.

La mezcla de ensayo se compone de una diana natral de unión de I-ASP tal como p53 o un factor de la misma capaz de interactuar con I-ASP. Aunque se pueden usar dianas de unión de I-ASP naturales, frecuentemente se prefiere usar porciones (por ejemplo péptidos o fragmentos de ácidos nucleicos) o análogos (es decir, agentes que mimetizan las propiedades de unión a I-ASP de la diana de unión natural para los propósitos del ensayo) de la diana de unión de I-ASP mientras que la porción o análogo proporciona afinidad de unión y avidez al fragmento I-ASP medible en el ensayo.

La mezcla de ensayo también comprende un agente farmacológico candidato. Típicamente, se ponen en marcha en paralelo una pluralidad de mezclas de ensayo con diferentes concentraciones de agente ara obtener una respuesta diferente a las diversas concentraciones. Típicamente, una de esas concentraciones sirve como control negativo, es decir, a concentración cero del agente o a una concentración del agente por debajo de los límites de detección del ensayo. Los agentes candidatos engloban numerosas clases químicas, aunque típicamente son compuestos orgánicos. Preferiblemente, los agentes farmacológicos candidatos son compuestos orgánicos pequeños, es decir, aquellos que tienen un peso molecular de más de 50 pero de menos de aproximadamente 2500, preferiblemente de menos de 1000, más preferiblemente de menos de aproximadamente 500. Los agentes candidatos comprenden grupos químicos funcionales necesarios para interacciones estructurales con polipéptidos y/o ácidos nucleicos, y típicamente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente al menos dos de los grupos químicos funcionales y más preferiblemente al menos tres de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos pueden comprender una estructura de carbono cíclica o heterocíclica y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales identificados anteriormente. Los agentes candidatos también pueden ser biomoléculas tales como péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroles, isoprenoides, purinas, pirimidinas, derivados o análogos estructurales de los anteriores o combinaciones de los mismos y similares. Cuando el agente es un ácido nucleico, el agente es típicamente una molécula de ADN o ARN, aunque también se contemplan ácidos nucleicos modificados como se definen en este documento.

Los agentes candidatos se obtienen a partir de una amplia variedad de fuentes, incluyendo bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, hay numerosos medios disponibles para la síntesis aleatoria o dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de forma aleatoria de oligonucleótidos, las bibliotecas orgánicas combinatorias, bibliotecas de exposición de fagos de péptidos aleatorios y similares. Alternativamente, ya están disponibles o se producen fácilmente bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales. Adicionalmente, se pueden modificar fácilmente bibliotecas naturales y producidas sintéticamente y compuestos con medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales. Además, se puede someter a agentes farmacológicos conocidos a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias tales como acilación, alquilación, esterificación, acidificación, etc para producir análogos estructurales de los agentes.

También se puede incluir una variedad de otros reactivos en la mezcla. Estos incluyen reactivos tales como sales, tampones, proteínas neutrales (por ejemplo, albúmina), detergentes, etc, que pueden usarse para facilitar la óptima unión proteína-proteína y/o proteína-ácido nucleico. Un reactivo tal puede también reducir las interacciones no específicas o de fondo de los componentes de reacción. Otros reactivos que mejoran la eficacia del ensayo tales como proteasa, inhibidores, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos y similares también pueden usarse.

La mezcla de los materiales de ensayo anteriores es incubada en condiciones por las que, pero por la presencia del agente farmacológico candidato, el polipéptido I-ASP se une específicamente con la diana celular de unión, una porción de la misma o un análogo de la misma. El orden de adición de los componentes, temperatura de incubación, tiempo de incubación y otros parámetros del ensayo se pueden determinar fácilmente. Tal experimentación implica únicamente la optimización de los parámetros de ensayo, no la composición fundamental del ensayo. Las temperaturas de incubación están típicamente entre 4ºC y 40ºC. Los tiempos de incubación típicamente se minimizan para facilitar la detección sistemática rápida, de alta tasa de transferencia, y típicamente están entre 0,1 y 10 horas.

Después de la incubación, la presencia o ausencia de unión específica entre el polipéptido I-ASP y una o más dianas de unión es detectada por cualquier procedimiento conveniente disponible para el usuario. Para ensayos de tipo de unión celular libre, a menudo se usa una etapa de separación para separar componentes unidos de no unidos. La etapa de separación puede llevarse a cabo de diversas formas. Convenientemente, al menos uno de los componentes es inmovilizado sobre un sustrato sólido, a partir del cual se pueden separar fácilmente los componentes no unidos. El sustrato sólido puede estar hecho de una amplia variedad de materiales y en una amplia variedad de formas, por ejemplo, placa de microtitulación, microperla, varilla de nivel, partícula de resina, etc. El sustrato se elige para la máxima señal de proporciones de ruido, principalmente para minimizar la unión de fondo, así como para facilitar la separación y el coste.

La separación puede efectuarse por ejemplo, retirando una perla o una varilla de nivel de un reservorio, vaciando o diluyendo un reservorio tal como un pocillo de placa de microtitulación, aclarando una perla, partícula, columna cromatográfica o filtro con una disolución de lavado o disolvente. La etapa de separación incluye preferiblemente múltiples aclarados o lavados. Por ejemplo, cuando el sustrato sólido es una placa de microtitulación, los pocillos se pueden lavar varias veces con una solución de lavado, que típicamente incluye aquellos componentes de la mezcla de incubación que no participan en uniones específicas tales como sales, tampón, detergente, proteína no específica, etc. Cuando el sustrato sólido es una perla magnética, las perlas se pueden lavar una o más veces con una solución de lavado y aislarse usando un imán.

La detección se puede efectuar de cualquier forma conveniente para ensayos basados en células tales como detecciones sistemáticas híbridas dobles o triples. El trancripto que resulta de un ensayo de transcripción de gen informador de polipéptido I-ASP que interactúa con una molécula diana típicamente codifica un producto directa o indirectamente detectable, por ejemplo, actividad \beta-galactosidasa, actividad luciferasa, y similares. Para ensayos de unión libres de células, uno de los componentes normalmente comprende o está acoplado a una marca detectable. Se puede usar una amplia gama de marcas, tales como aquellas que proporcionan detección directa (por ejemplo, radioactividad, luminescencia, densidad óptica o electrónica, etc) o detección indirecta (por ejemplo, etiqueta epitópica tal como el epítopo FLAG, etiqueta enzimática tal como peroxidasa de rábano, etc). La marca puede estar unido a una pareja de unión de I-ASP o incorporada en el interior de la estructura de la pareja de unión.

Se puede usar una variedad de procedimientos para detectar la marca, dependiendo de la naturaleza de la marca y otros componentes de ensayo. Por ejemplo, la marca puede ser detectada mientras esté unida al sustrato sólido o después de la separación del sustrato sólido. Las marcas pueden detectarse directamente mediante densidad óptica o electrónica, emisiones radioactivas, transferencias de energía no radiantes, etc o detectarse indirectamente con conjugados de anticuerpo, conjugados de estreptavidina-biotina, etc. Procedimientos para detectar las marcas son bien conocidos en la técnica.

La invención proporciona agentes de unión a I-ASP específicos, procedimientos para identificar y preparar tales agentes y su uso en el diagnóstico, terapia y desarrollo farmacéutico. Por ejemplo, los agentes farmacológicos específicos de I-ASP son útiles en una variedad de aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas, especialmente cuando la enfermedad o el pronóstico de la enfermedad está asociado con la utilización inadecuada de una ruta que implica I-ASP, por ejemplo, la apoptosis, etc. Nuevos agentes de unión a I-ASP específicos incluyen anticuerpos específicos de I-ASP y otros agentes naturales de unión intracelular identificados con ensayos tales como detecciones sistemáticas dobles híbridas, y agentes no naturales de unión intracelular identificados en detecciones sistemáticas de bibliotecas químicas y similares.

En general, la especificidad de la unión de I-ASP al unirse con un agente de unión se muestra por constantes de equilibrio de unión. Las dianas que son capaces de unirse selectivamente a un polipéptido I-ASP tienen preferiblemente constantes de equilibrio de unión de al menos aproximadamente 10^{7}M^{-1}, más preferiblemente de al menos aproximadamente 10^{8}M^{-1} y de la forma más preferida de al menos 10^{9}M^{-1}. La amplia variedad de ensayos basados en células y libres de células se puede usar para demostrar unión específica a I-ASP. Los ensayos basados en células incluyen detecciones sistemáticas híbridas simples, dobles y triples, ensayos en los que la transcripción medidas por I-ASP es inhibida o aumentada, etc. Los ensayos libres de células incluyen ensayos de unión I-ASP-proteína, inmunoensayos, etc. Otros ensayos útiles para la detección sistemática de agentes que se unen a polipéptidos I-ASP incluyen transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), y análisis de desplazamiento por movilidad electroforética (EMSA).

Se pueden emplear diversas técnicas para introducir ácidos nucleicos de la invención en células, dependiendo de si los ácidos nucleicos se introducen in vitro o in vivo en un anfitrión. Tales técnicas incluyen transfección de precipitados de ácido nucleico-CaPO_{4}, transfección de ácidos nucleicos asociados con DEAE, transfección con un retrovirus que incluye el ácido nucleico de interés, transfección mediada por liposomas, y similares. Para ciertos usos, se prefiere dirigir el ácido nucleico a células particulares. En tales casos, un vehículo usado para suministrar un ácido nucleico de la invención en una célula (por ejemplo, un retrovirus u otro virus, un liposoma) puede tener una molécula diana adjunta a él. Por ejemplo, una molécula tal como un anticuerpo específico para una proteína de superficie de la membrana de la célula diana o un ligando para un receptor sobre la célula diana puede estar unido o incorporado en el interior del vehículo de suministro del ácido nucleico. Por ejemplo, cuando se emplean liposomas para suministrar ácidos nucleicos de la invención, se pueden incorporar proteínas que se unen a una proteína de superficie de la membrana asociada con endocitosis a la formulación del liposoma para dirigir y/o facilitar la absorción. Tales proteínas incluyen proteínas de la cápsida o fragmentos de las mismas trópicos para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que llevan a cabo la internalización en el ciclo, proteínas que se dirigen a la localización intracelular y potencian la semivida intracelular, y similares. También se han usado con éxito sistemas poliméricos de suministro para suministrar ácidos nucleicos a células, como es sabido por aquellos expertos en la materia. Tales sistemas incluso permiten suministro oral de ácidos nucleicos.

Cuando se administran, las composiciones terapéuticas de la presente invención son administradas en preparaciones farmacéuticamente aceptables. Tales preparaciones pueden contener de forma rutinaria concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes de tamponamiento, conservantes, portadores compatibles, agentes potenciadores inmunes suplementarios tales como adyuvantes y citocinas y opcionalmente otros agentes terapéuticos, tales como agentes quimioterapéuticos.

Los agentes terapéuticos de la invención pueden ser administrados por cualquier vía convencional, incluyendo inyección o por infusión gradual a lo largo del tiempo. La administración puede ser por ejemplo por vía oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavital, subcutánea o transdérmica. Cuando se usan anticuerpos terapéuticamente, una vía de administración preferida es por aerosol pulmonar. Las técnicas para preparar sistemas de suministro en aerosol que contienen anticuerpos son bien conocidas por los expertos en la materia. Generalmente, tales sistemas deben utilizar componentes que no dificulten significativamente las propiedades biológicas de los anticuerpos, tales como la capacidad de unión del paratopo (véase, por ejemplo, Sciarra y Cutie, "Aerosols", en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, 1990, pág. 1694-1712; incorporado por referencia). Aquellos expertos en la materia pueden determinar fácilmente los diversos parámetros y condiciones para producir aerosoles de anticuerpos sin recurrir a experimentación innecesaria. Cuando se usen preparaciones no codificantes de la invención, se prefiere la administración lenta intravenosa.

Las composiciones de la invención son administradas en cantidades eficaces. Una "cantidad eficaz" es aquella cantidad de una composición que sola o junto con dosis adicionales produce la respuesta deseada. En caso de tratar una enfermedad particular, tal como cáncer, la respuesta deseada es inhibir la progresión de la enfermedad. Esto puede implicar únicamente ralentizar la progresión de la enfermedad temporalmente, aunque más preferiblemente implica detener la progresión de la enfermedad permanentemente. Esto se puede controlar por procedimientos rutinarios, o puede controlarse según procedimientos de diagnóstico de la invención descritos en este documento.

Tales cantidades dependerán, por supuesto, de la dolencia particular que se está tratando, la gravedad de la dolencia, los parámetros individuales del paciente, incluyendo edad, estado físico, altura y peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si hay alguna), la vía de administración específica y factores similares en el conocimiento y experiencia del profesional de la salud. Estos factores son bien conocidos por aquellos expertos habituales en la materia y pueden tratarse con experimentación rutinaria sin más. Se prefiere generalmente usar una dosis máxima de los componentes individuales o combinaciones de los mismos, es decir, la dosis segura más alta según juicio médico responsable. Será entendido por aquellos expertos en la materia sin embargo, que un paciente pueda exigir
una dosis menor o dosis tolerable por razones médicas, razones psicológicas o prácticamente cualquier otra razón.

Las composiciones farmacéuticas usadas en los procedimientos anteriores son preferiblemente estériles y contienen una cantidad eficaz de anticuerpo para producir la respuesta deseada en una unidad de peso o volumen adecuada para la administración a un paciente. La respuesta puede por ejemplo medirse determinando la transducción de señal potenciada o inhibida por la composición por medio de un sistema informador como se describe en este documento, midiendo los efectos consiguientes como expresión génica, o midiendo los efectos fisiológicos de la composición, tales como regresión de un tumor, disminución de los síntomas de la enfermedad, modulación de la apoptosis, etc. De forma similar, los efectos de moléculas no codificantes de I-ASP pueden ser fácilmente determinados midiendo la expresión de los genes individuales en células a las que se añade una composición no codificante. Otros ensayos serán conocidos para un experto en la materia y se pueden emplear para medir el nivel de la respuesta.

Las dosis de anticuerpo administradas a un sujeto pueden elegirse de acuerdo con diferentes parámetros, en particular de acuerdo con el modo de administración usado y el estado del sujeto. Otros factores incluyen el periodo de tratamiento deseado. En el caso de que una respuesta en un sujeto sea insuficiente a la dosis inicial aplicada, se pueden emplear dosis más altas (o dosis más altamente efectivas por una vía de suministro diferente, más localizada) para extender los límites de tolerancia de ese paciente.

En general se formulan y se administran dosis de anticuerpos a dosis entre 1 ng y 1 mg, y preferiblemente entre 10 ng y 100 \mug, según cualquier procedimiento convencional en la técnica. Otros protocolos para la administración de composiciones de anticuerpo serán conocidos por un experto habitual en la materia, en los que la cantidad de dosis, el programa de inyecciones, sitios de las inyecciones, modo de administración (por ejemplo, intratumoral), y similares pueden variar respecto a los anteriores. La administración de las composiciones de anticuerpos a mamíferos que no sean humanos, por ejemplo para propósitos de prueba o propósitos veterinarios terapéuticos se lleva a cabo en sustancialmente las mismas condiciones que se han descrito anteriormente. Un sujeto, como se usa en este documento, es un mamífero, preferiblemente un ser humano, e incluyendo un primate no humano, vaca, caballo, cerdo, oveja, cabra, perro, gato o roedor.

Cuando se administran, las preparaciones farmacéuticas de la invención se aplican en cantidades farmacéuticamente aceptables y en composiciones farmacéuticamente aceptables. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de los ingredientes activos. Tales preparaciones pueden contener rutinariamente sales, agentes de tamponamiento, conservantes, portadores compatibles y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Cuando se usan en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables, pero se pueden usar convenientemente sales no farmacéuticamente aceptables para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas y no están excluidas del alcance de la invención. Tales sales farmacológica y farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a aquellas preparadas a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y similares. También se pueden preparar sales farmacéuticamente aceptables como sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, tales como sales de sodio, potasio o calcio.

Se pueden combinar composiciones de anticuerpos si se desea con un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador farmacéuticamente aceptable" como se usa en este documento significa una o más cargas compatibles sólidas o líquidas, diluyentes, o sustancias encapsulantes que son adecuadas para la administración a un ser humano. El término "portador" denota un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el ingrediente activo para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas son capaces de ser mezclados con las moléculas de la presente invención, y unos con otros, de tal manera que no hay ninguna interacción que podría perjudicar sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes de tamponamiento adecuados, incluyendo ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.

Las composiciones farmacéuticas también pueden contener, opcionalmente, conservantes adecuados, tales como cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabenos y timerosal.

Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en forma de unidad de dosificación y pueden prepararse por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de farmacia. Todos los procedimientos incluyen la etapa de asociar el agente activo con un portador que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el compuesto activo con un portador líquido, un portador finamente dividido o ambos, y entonces, si es necesario, modelar el producto.

Se pueden presentar composiciones adecuadas para administración oral como unidades discretas, tales como cápsulas, comprimidos, pastillas, conteniendo cada una una cantidad predeterminada del compuesto activo. Otras composiciones incluyen suspensiones, en líquidos acuosos o líquidos no acuosos como un jarabe, un elixir o una emulsión.

Las composiciones adecuadas para administración parenteral comprenden convenientemente una preparación acuosa o no acuosa de anticuerpos, que es preferiblemente isotónica con la sangre del receptor. Esta preparación puede formularse según procedimientos conocidos que usan agentes dispersantes o humectantes y agentes suspensores. La preparación inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenterelmante aceptable, por ejemplo, una disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes adecuados que se pueden emplear están agua, disolución de Ringer y disolución isotónica de cloruro sódico. Además, se emplean convencionalmente aceites estériles fijados como disolvente o medio de suspensión. Para este propósito se puede emplear cualquier aceite fijado suave incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, se pueden usar ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de inyectables. Las formulaciones portadoras adecuadas para administraciones orales, subcutáneas, intravenosas, intramusculares, etc. Se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutic Science, Mack Publishing Co Easton, PA.

En otro aspecto de la invención, se usan anticuerpos en la fabricación de un medicamento para modular la apoptosis. El medicamento puede situarse en un vial e incorporarse en un kit para ser usado para tratar a un sujeto. En ciertas realizaciones, otros medicamentos que modulan las mismas respuestas o que afectan favorablemente a las composiciones de anticuerpos también pueden estar incluidos en el mismo kit, tales como agentes quimioterapéuticos. Los kits pueden incluir instrucciones u otro material impreso sobre cómo administrar las composiciones de anticuerpos y otros componentes del kit.

Una realización de la invención se describirá ahora, únicamente como ejemplo, y con referencia a los siguientes ejemplos y figuras y tabla;

Figura 1. Células Saos2 fueron transfectadas con vector, p53 (5 \mug), I-ASP (10 \mug) o p53+I-ASP y luego incubadas durante 16 horas. Las células se lisaron en tampón de lisis NP40 y se sometió a 1000 \mug de lisado a inmunoprecipitación realizada con anticuerpos policlonales para I-ASP unidos a perlas de proteína G. La presencia de p53 se detectó por inmunotransferencia de los inmunocomplejos usando anticuerpo policlonal de conejo para p53 CM1, Figura 1A. Células Saos2 fueron transfectadas con ASP-1 (8 \mug) o ASP-2 (4 \mug, I-ASP (5 \mug) y p53 (50 ng). Se pasaron en un gel al 10% 40 \mul de los lisados correspondientes, se detectó I-ASP con anticuerpo V5, ASP-2 con DX.5410, I-ASP con anticuerpo de ratón anti I-ASP, p53 con DO1 y PCNA con anticuerpo anti PCNA, Figura 1D; la Figura 1B muestra la inducción de apoptosis inducida por p53 por ASP-1 y ASP-2 y la inhibición de la apoptosis inducida por p53 por I-ASP; la Figura 1C muestra la activación del promotor de respuesta a p53, Bax, por ASP-q y ASP-2, y la inhibición de la transactivación por I-ASP:

La Figura 2 representa la secuencia de ADN de I-ASP;

La Figura 3 representa la secuencia de proteína de I-ASP;

La Figura 4 muestra que la función apoptótica de p53 está altamente regulada por los miembros de la familia ASP in vivo. Las líneas celulares que expresan el tipo salvaje de p53 U2OS y MCF-7 fueron transfectadas con plásmidos que expresan proteínas como se ha indicado junto con un marcador celular de superficie CD20 (A-E). Las células transfectadas se encerraron y se analizaron por FACS. Los gráficos de barras representan el porcentaje de células transfectadas con contenido en ADN sub-G1, característico de la apoptosis. Los plásmidos que expresan ARN no codificante de ASP-1, ASP-2 e I-ASP son etiquetados como \alpha ASP-1, \alphaASP-2 y \alphaI-ASP, respectivamente. La oncoproteína viral E6 del HPV16 humano se indica como E6. En las figuras 4B y 4D, las células fueron transfectadas con los plásmidos como se ha indicado. A continuación, las células transfectadas U2OS y MCF-7 se incubaron con un medio que contenía cisplatino a concentraciones de 5 y 3 \mug/ml respectivamente. 30 horas más tarde, se cosecharon las células y se analizaron como antes. Para f y G, tanto las células U2OS como MCF-7 fueron transfectadas con plásmidos que expresaban proteínas como se ha indicado. La coexpresión de ASP o p53 y Bax endógena o mdm2 se visualizaron después de la fijación de las células, por marcaje inmunofluorescente doble como se ha indicado en la figura 4G. Para la figura 4F, 200 células U2OS o MCF-7 transfectadas con vector solo o con plásmidos ASPP fueron examinadas respecto a la sobreexpresión de proteína Bax endógena. Los gráficos de barras representan el valor medio de al menos tres experimentos independientes.

La figura 5A ilustra un modelo que describe la interacción de los miembros de la familia ASP con p65, IkB y p53; las figuras 5C y 5D son una representación gráfica de la capacidad de IkB de afectar la función de transactivación de p53 sobre los promotores Bax y mdm2 en la presencia y ausencia de ASP-2.

La figura 6A es una representación gráfica de la capacidad del tipo salvaje p65 y el mutante por deleción \Deltap65 para transactivar un plásmido informador NFkB; la Figura 6B es una representación gráfica de la inducción de la apoptosis en células que expresan y coexpresan p53, ASP-2 y \Deltap65.

La Figura 7A ilustra el efecto potenciador de I-ASP en la función de transformación de E7;

La Figura 7B ilustra el efecto potenciados de I-ASP en la resistencia celular al cisplatino; y

La Tabla 1 representa un resumen de la expresión de ARNm de ASP-1, ASP-2 e I-ASP en 40 pares de muestras de ARN normales y tumorales emparejadas derivadas de tumores de cáncer de mama de grado I y grado II que expresan p53 de tipo salvaje.

Ejemplo 1

Una secuencia aislada recientemente, el inhibidor asociado a reL (RAI) se identifico como una proteína reL A de unión a p65 que contiene 315 aminoácidos. RAI no tiene el dominio en \alpha hélice de ASP-1 o ASP-2 pero sí contiene la región rica en prolina, las repeticiones alanina y el dominio SH3. Los restos de contacto con p53 de ASP-2 también están conservados en RAI. Para investigar la actividad de RAI que se ha llamado I-ASP, se clonó la secuencia de codificación en un vector de expresión de mamífero pcDNA3. También se sintetizó un péptido (RLQPALPPEAQSV
PELEEE) que se encuentra en I-ASP que no tiene similaridad de secuencia con ASP-1 ni ASP-2. Un anticuerpo de ratón específico para este péptido I-ASP único no reaccionaba de forma cruzada ni con ASP-1 ni con ASP-2 (los datos no se muestran). Usando este anticuerpo de ratón específico para I-ASP para inmunoprecipitar el I-ASP en células Saos-2, se pudo demostrar que I-ASP también interactúa con p53 (figura 1A). Como el mutante ASP-2, 53BP2/ASP-2 (600-1128), la expresión de I-ASP no indujo apoptosis por sí misma. Cuando se coexpresaba I-ASP con p53, tenía un pequeño efecto inhibitorio en la función apoptótica de p53. El efecto más significativo de I-ASP sobre la función apoptótica de p53 se observó cuando se coexpresaban ASP-1 y ASP-2. De acuerdo con la predicción, la coexpresión de I-ASP inhibió la función apoptótica potenciada de p53 efectuada por ASP-1 y ASP-2 (figura 1B). De forma similar, la coexpresión de I-ASP junto con ASP-1 o ASP-2 fue capaz de suprimir completamente la capacidad tanto de ASP-1 como de ASP-2 para estimular la función de transactivación de p53 sobre el promotor Bax (figura 1C). La coexpresión de I-ASP no alteró significativamente los niveles de expresión ni de p53 ni de ASP (figura 1D). Estos resultados indicaron que in vivo la función proapoptótica de de ASP-1 y ASP-2 puede ser regulada por el inhibidor natural I-ASP. Por lo tanto el equilibrio entre los niveles de expresión de ASP-1, ASP-2 e I-ASP pueden determinar el destino celular, es decir, si una célula vive o muere.

Ejemplo 8

Ejemplo 2

En contraste con ASP-1 y ASP-2, el nivel de expresión de I-ASP era generalmente bajo en las muestras de tejido humano normal y de tumor de mama. Sin embargo, se detectó sobreexpresión de I-ASP en 8 de los tejidos tumorales comparados con sus controles normales emparejados (tabla 1). El fenómeno más impactante fue la correlación entre la expresión normal de ASP-1 y ASP-2 con la sobreexpresión de I-ASP. 7 de los tumores que sobreexpresaban I-ASP no tenían ninguna regulación a la baja de la expresión de ASP-1 y ASP-2 (tabla 1). Este resultado apoya el argumento para la importancia biológica de I-ASP como el inhibidor natural de ASP-1 y ASP-2 in vivo.

Ejemplo 3

Para estudiar los papeles que juegan los miembros endógenos de la familia ASP en la regulación de la apoptosis inducida por p53 endógena, se introdujeron ASP-1 o ASP-2 en las líneas celulares U2OS y mCF-7 que expresan p53 de tipo salvaje. Cuando se expresaban en estas células, ASP-1 y ASP-2 inducían apoptosis (figura 4). La oncoproteína viral E6, que es derivada de virus de papiloma humano y que puede unirse y dirigirse específicamente a p53 para su degradación, inhibía la apoptosis inducida por ASP-1 o ASP-2, demostrando que ASP-1 y ASP-2 pueden inducir la apoptosis dependiente de p53.

También se estudió la función dominante negativa de 53BP2 e I-ASP de inhibición de la apoptosis inducida por p53 endógena en respuesta a daño del ADN. Antes de la exposición a cisplatino, se transfectaron células U2OS y MCF-7 con plásmidos que codifican para HPV16E6, I-ASP o 53BP2. El porcentaje de células transfectadas que morían por apoptosis en respuesta al tratamiento con cisplatino se determinó mediante análisis FACS (figura 4B). El tratamiento con cisplatino indujo a más del 20% transfectadas a morir por apoptosis. La expresión de E6 reducía el porcentaje de células apoptóticas a menos de del 15%, sugiriendo que el cisplatino induce la apoptosis dependiente de p53 en células U2SO. De acuerdo con esto, la expresión de ASP o 53BP2 fue capaz de inhibir la apoptosis inducida por cisplatino en una extensión similar a E6. Estos resultados sugieren que la función apoptótica de la p53 endógena puede estar regulada por la expresión de miembros de la familia ASP.

Para demostrar adicionalmente que los miembros endógenos de la familia ASP juegan papeles significativos en la regulación de la función apoptótica de p53, se usó un enfoque no codificante. Se clonaron fragmentos de los extremos 5' de ADNc de SP-1, ASP-2 y 1-ASP en un vector de expresión para mamíferos en una orientación no codificante y se sometió a prueba la capacidad del ARN no codificante para inhibir específicamente la síntesis de proteínas de miembros de la familia ASP in vitro (los datos no se muestran). La expresión de ASP-1 no codificante sólo inhibía la apoptosis inducida por ASP-1, pero no por ASP-2. De forma similar, la expresión de ASP-2 no codificante sólo inhibía la apoptosis inducida por ASP-2, pero no por ASP-1. El efecto específico de ASP-1 y ASP-2 no codificantes se vio apoyado adicionalmente por la observación que la coexpresión de ASP-1 y ASP-2 no influía sobre la apoptosis mediada por Bax en las mismas condiciones (figura 4C). Por lo tanto fue posible investigar el papel de ASP-1 y ASP-2 endógenos en la regulación de la función apoptótica de la p53 endógena en respuesta a daño del ADN. Células U2OS y MCF-7 fueron transfectadas con las diversos plásmidos de expresión entes del tratamiento con cisplatino. El análisis FACS mostró que aproximadamente 20-30% de las células transfectadas de control experimentaban apoptosis. La expresión de E6 reducía el porcentaje de las células apoptóticas a la mitad, indicando que el cisplatino puede inducir apoptosis a través tanto de vías dependientes como independientes de p53 en estas células. La expresión de ARN no codificante de ASP-1 o ASP-2 inhibía la apoptosis inducida por cisplatino a la misma extensión que E6 (figura 4D), similar a los efectos vistos con 53BP2 e I-ASP. Esto sugiere que ASP-1 y ASP-2 endógenos juegan papeles importantes en la regulación de la función apoptótica de p53 en respuesta a daño del ADN.

Se sospechaba que el efecto estimulatorio de ASP-1 y ASP-2 endógenos sobre p53 inducía apoptosis en respuesta a cisplatino puede estar infravalorado debido a altos niveles de I-ASP detectados en estas células (los datos no se muestran) que podían evitar que ASP-1 y ASP-2 potenciasen la función apoptótica de p53. Para estudiar el papel antiapoptótico de I-ASP, fueron transfectadas tanto células U2OS como MCF-7 con I-ASP no codificante. I-ASP no codificante inducía apoptosis dependiente de p53 que se suprimía por la coexpresión de E6. La eliminación de la función antiapoptótica de I-ASP por I-ASP no codificante también potenciaba la función apoptótica de ASP-1 y ASP-2 (figura 4E). Al contrario que ASP-1 y ASP-2 no codificantes, la expresión de I-ASP no codificante no inhibía la apoptosis inducida por cisplatino. Se detectó un pequeño aumento en las células apoptóticas (figura 4D). Estos resultados demostraron que ASP-1 y ASP-2 estimulan específicamente la función apoptótica de p53 in vivo. I-ASP endógeno funciona como un inhibidor de ASP y puede bloquear la apoptosis inducida por p53 endógena.

Las moléculas de ácidos nucleicos no codificantes fueron derivadas de los ADNc de ASP-1, ASP-2 e I-ASP y fueron amplificadas por PCR sobre los clones plásmidos respectivos usando cebadores que abarcaban las siguientes regiones de nucleótidos(relativas al ATG inicial): 74 a 923; 253 a 839 y 37 a 536 para ASP-1, ASP-2 e I-ASP, respectivamente. Los segmentos amplificados se purificaron con el kit de purificación QIAquick PCR (QIAGEN) y se ligaron al vector pcDNA3.1/V5 His TOPO (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Los plásmidos que contenían ADN no codificante de ASP-1, ASP-2 e I-ASP se produjeron por medio del kit de purificación de QIAGEN según las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 4

Ha sido bien documentado que p53 y p65RelA de NF kappaB juegan papeles muy importantes en la regulación de la apoptosis en respuesta al esfuerzo. Sin embargo, se sabe muy poco sobre cómo estas dos rutas apoptóticas pueden funcionar juntas in vivo. La primera evidencia surgió a partir de la reciente observación de que p53 puede inducir la actividad de unión a ADN de p65 RelA. De forma más importante, Ikb, el inhibidor de p65 RelA, puede inhibir la función apoptótica de p53. Sin embargo no estaba claro como p53 puede inducir la actividad de unión a ADN de p65 y cómo Ikb puede inhibir la función apoptótica de p53.

De modo interesante, muy recientemente se descubrió que tanto ASP-2 como I-ASP pueden interactuar con p65 relA, un componente de NF-kappaB, en un ensayo híbrido de levadura. I-ASP puede inhibir también la función de transactivación de p65, aunque menos eficazmente que lkb. La región que ASP-2 e I-ASP requieren para interactuar con relA es muy similar a la requerida para p53. Por lo tanto es posible que pueda haber alguna competencia entre p53 y p65 relA para interactuar con ASP-2 e I-ASP. Ya que los miembros de la familia ASP resultan ser la pareja común entre p53 y p65, se especula que los miembros de la familia ASP pueden conectar la función apoptótica de NF-kappaB. En este modelo de trabajo (figura 5A), p53 puede inducir la actividad de unión a ADN de p65 interactuando con el I-ASP nuclear y permitir que p65 se una a ADN. Además, lkb podría inhibir la apoptosis inducida por p53 uniéndose a p65 y liberando I-ASP. La concentración nuclear aumentada de I-ASP puede entonces interactuar con p53 y evitar que ASP-2 o ASP-1 estimulen la función de transactivación de p53. Si esta hipótesis es correcta, se esperaría que la expresión de lkb debiera tener un profundo efecto sobre la apoptosis inducida por p53 en presencia de ASP-1 o ASP-2.

Los resultados mostrados en la figura 5B son coherentes con este concepto. En las células que expresan lkb, el 7,2% de las células murieron por apoptosis, comparado con el 4,6% de las células transfectadas con células transfectadas en el vector solo. El efecto de lkb sobre la apoptosis inducida por p53 fue por lo tanto mínimo ya que el porcentaje de células apoptóticas detectado en p53 frente a células que expresaban p53+lkb fue del 12% y el 11%, respectivamente. Esto puede deberse al nivel muy bajo de la expresión de ASP-1 y ASP-2 en células Saos-2. De acuerdo con los resultados mostrados anteriormente, la coexpresión de ASP-2 produjo una potenciación significativa de la apoptosis inducida por p53. El porcentaje de células apoptóticas en células transfectadas p53+ASP-2 fue del 30%.De forma interesante, en estas condiciones, la coexpresión de lkb mostró el efecto más profundo. La coexpresión de lkb fue capaz de reducir la cantidad de células apoptóticas inducidas por p53 y ASP-2 desde el 30% hasta el 16%. Este resultado sugiere que lkb podría inhibir la apoptosis inducida por p53 evitando que ASP-2 estimulase la función de p53. Se obtuvieron resultados similares cuando se coexpresaba lkb con p53 y ASP-1.

Se ha mostrado que ASP-2 puede potenciar la función apoptótica de p53 estimulando específicamente la función de transactivación de p53 sobre los promotores de genes proapoptóticos tales como Bax. Por lo tanto se ha investigado el efecto de lkb sobre la función de transactivación de p53 sobre los promotores Bax y mdm2 en presencia o ausencia de ASP-2, véanse las figuras 5C y D. Como se ha mostrado previamente, la coexpresión de ASP-2 y p53 estimulaba la función de transactivación de p53 aproximadamente unas 8 veces. En las mismas condiciones, la expresión de lkb no mostró ninguna inhibición detectable de la actividad informadora del promotor Bax, lo que sugiere que Bax no inhibe la actividad transcripcional del promotor Bax de forma no específica en células Saos-2. La coexpresión de 50 ng de lkb con p53 mostró únicamente una inhibición muy pequeña de la función de transactivación de p53. Sin embargo, cuando se coexpresaron lkb, ASP-2, y p53, lkb fue capaz de inhibir la estimulación mediada por ASP-2 de la función de transactivación de p53 de forma dramática (figura 5D).

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Se ha mostrado que ASP-1 y ASP-2 pueden estimular específicamente la función de transactivación de p53 sobre el promotor Bax pero no el promotor mdm2. Por ello, si lkb estaba inhibiendo realmente la función de transactivación de p53 por medio de ASP-2 específicamente, no sería capaz de mostrar una inhibición significativa de la actividad promotora de mdm2. En las mismas condiciones, se probó la capacidad de lkb de inhibir la función de transactivación de p53 sobre la actividad del promotor mdm2. Como se muestra en la figura 5D, la coexpresión de ASP-2 tuvo muy poco efecto sobre la función de transactivación de p53 sobre el promotor mdm2. De forma más importante, lkb apenas inhibió la función de transactivación de p53 sobre el promotor mdm2 incluso en presencia de ASP-2. Los resultados mostrados en este documento sugieren por primera vez que lkb puede inhibir la función apoptótica de p53 evitando que ASP-1 o ASP-2 estimulen la función de transactivación de p53.

Para seguir investigando el papel de la familia ASP en conexión con la ruta de p53 y NFkb, se estudió el efecto de la interacción entre ASP-2 y p65 relA sobre la función apoptótica de p53. Basándose en el modelo de trabajo de la figura 5A, la interacción p65/ASP puede facilitar la entrada al núcleo de proteína ASP, permitiendo por lo tanto la interacción p53/ASP y la liberación de I-ASP nuclear para unirse con p65 nuclear. Los restos 176-406 de p65 se unen a AWSP-2 e I-ASP.

Como factor de transcripción, p65 puede transactivar a muchos genes diana. Dado que la apoptosis inducida por p53 requiere p65 y se correlaciona también con el aumento de la actividad de unión a ADN de NFkB, se sugirió que la actividad de unión a ADN de p65 puede ser esencial para cooperar con p53 para inducir la apoptosis. Ser capaces de unirse tanto a p53 como a p65 sitúa a la familia de proteínas ASP en un papel central. Una posibilidad es que ASP que se une a p65 puede ser el mediador de la actividad de unión a ADN de p65 inducida por p53. Sin embargo, la coexpresión de p53 no pudo inducir la actividad transcripcional de p65 sobre su informador. La compresión de p53 y ASP-2 tampoco pudo mostrar ningún efecto significativo sobre la función de transactivación de p65. Este resultado sugiere que ASP no era el mensajero que suministra las señales desde p53 a p65. No obstante, ASP podría impedir que p65 cooperase con p53 para inducir apoptosis. Se probó si la acción de ASP necesitaba la actividad de unión a ADN de p65 NFkB. Se eliminaron cien aminoácidos de p65 a partir del extremo N-terminal que contiene la región de ADN de unión a p65. El constructo \Deltap65 así generado resultón transcripcionalmente inactivo cuando se sometió a prueba sobre el plásmido informador de NFkb. Si la interacción ASP-p65 es el mediador de las rutas de p53 y NFkb, \Deltap65 tendría un efecto similar sobre la función apoptótica de p53 al de p65 de longitud completa. En caso contrario, \Deltap65 sería inactivo ya que no es capaz de transactivar ninguno de sus genes diana (figura 6A). El resultado mostrado en la figura 6B mostró que no sólo tanto p65 como \Deltap65 estimulaban la función apoptótica de p53 en presencia de ASP-2, sino que \Deltap65 era incluso más activo que p65 en potenciar la función apoptótica de p53. Esto puede deberse al hecho de que \Deltap65 es incluso más nuclear que p65. Los datos obtenidos a partir de \Deltap65 argumentan firmemente que p65 puede influir sobre la función apoptótica de p53 independientemente de la actividad de unión a ADN de p65. Por lo tanto, la interacción de ASP-2-p65 podría ser el mecanismo de acción.

Ejemplo 5

Ejemplo 6

Hasta ahora se ha demostrado que I-ASP puede inhibir la apoptosis inducida por p53 en diversas líneas celulares y que su nivel de expresión está regulado al alza en células de carcinoma de mama in vivo. Todos estos datos sugieren que I-ASP podría ser un oncogen. Ya que la función de supresión tumoral de p53 está más unida con su capacidad para inducir apoptosis, es probable que la inhibición de la apoptosis inducida por p53 pueda eliminar la función de supresión tumoral de p53. Para probar la función oncogénica de I-ASP, se transfectaron fibroblastos de embrión de rata con plásmidos que expresan I-ASP y la oncoproteína E7. La expresión de I-ASP potenciaba la función transformadora de E7 de forma significativa (figura 7A). Esto demostró que I-ASP es efectivamente un oncogen.

Como la mayoría de los fármacos quimioterapéuticos son agentes que dañan el ADN e inducen la apoptosis por medio de rutas dependientes de p53, se razonó que la capacidad de I-ASP de inhibir la apoptosis inducida por p53 puede hacer a las células más resistentes al efecto citotóxico de fármacos quimioterapéuticos tales como cisplatino. Se transfectaron células MCF-7 (una línea celular de cáncer de mama) con un plásmido que expresa I-ASP. La resistencia celular al efecto citotóxico de cisplatino se comparó entre las células MCF-7 que expresaban I-ASP y las que no expresaban I-ASP. Los resultados de la figura 7 muestran que la expresión de I-ASP puede potenciar la resistencia celular aproximadamente 2,5 veces. Tal incremento en la resistencia celular a cisplatino es muy significativo biológicamente respecto al tratamiento del cáncer. Por lo tanto, el alto nivel de expresión de I-ASP no sólo explica por qué p53 de tipo salvaje no es funcional en algunas de células tumorales humanas. También predice la respuesta tumoral a tratamientos. Finalmente, el uso de células que sobreexpresan I-ASP puede permitir la futura identificación de fármacos quimioterapéuticos más eficaces.

Referencias

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Lane, D. P. y Crawford, L. V. (1979). T-antigen is bound to host protein in SV40-transformed cells. Nature 278, 261-263.

Ludwig, R. T., Bates, S. y Voudsen, K. H. (1996). Differential activation of target cellular promoters by p53 mutants with impaired apoptotic function. Mol. Cell. Biol. 16, 4952-4960.

Miyashita, T., y Reed, J. C. (1995). Tumour supressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene. Cell 80, pág. 293-299.

Momand, J., Zambetti, G. P., Oslon, D. C., George, D., y Levine A. J. (1992). The mdm-2 oncogene product forms a complex with p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation. Cell 69, 1237-1245.

Naumovski, L. y Cleary, M. L. (1996). The p53-binding protein 53BP2 also interacts with bcl2 and impedes cell cycle progression at G2/M. Mol. Cell. Biol. 16, 3884-3892.

Polyak, K., Xia, Y., Zweier, J. L., Kinzler, K. W. y Vogelstein, B. (1997). A model for p53-induced apoptosis. Nature 389, 300-305.

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TABLA 1 Expresión de ARNm de ASPP en muestras de tumor de mama humano que expresan p53 de tipo salvaje (grado I y II)

1

2

<110> Instituto Ludwig de Investigación del Cáncer

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<120> Genes supresores

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<130> P3808WO

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<140> PCT/GB01/03524

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<141> 08-06-2001

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<150> 0019018.1

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<151> 08-04-2000

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<160> 7

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 4834

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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3

4

5

6

7

8

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<210> 2

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<211> 4402

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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9

10

11

12

13

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<210> 3

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<211> 2156

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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14

15

16

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<210> 4

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<211> 350

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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18

19

20

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<210> 5

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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\sa{Arg Leu Gln Pro Ala Leu Pro Pro Glu Ala Gln Ser Val Pro Glu Leu}

\sac{Glu Glu}

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<210> 6

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<211> 1593

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<212> PRT

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<213> ser humano

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<400> 6

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21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

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<210> 7

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<211> 1446

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<212> PRT

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<213> ser humano

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<400> 7

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

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Claims (23)

1. Un ensayo para diagnosticar cáncer caracterizado por la regulación al alza de un polipéptido en una muestra de tejido aislada, polipéptido que es un inhibidor de la actividad apoptótica de p53, en el que dicho polipéptido está codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por:

i) una molécula de ADN que consiste en una secuencia como se representa en la figura 2;

ii) una molécula de ADN que hibrida en condiciones restrictivas de hibridación con la secuencia de ácido nucleico de la figura 2 y que codifica un inhibidor de la actividad apoptótica de p53; y

iii) una molécula de ADN que está degenerada como resultado del código genético de las secuencias de ADN definidas en (i) y (ii)

en el que dicho ensayo comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra de tejido aislada para ser probada

b) proporcionar condiciones adecuadas para la detección del polipéptido por un agente y detectar la presencia del polipéptido por el agente; y

c) comparar la regulación al alza del polipéptido con controles normales emparejados.

2. Un ensayo según la reivindicación 1, en el que la muestra de tejido es tejido mamario.

3. Un ensayo según la reivindicación 1 ó 2 en el que el agente es un anticuerpo.

4. Un ensayo según la reivindicación 3 en el que el ensayo es un inmunoensayo.

5. Un ensayo para diagnosticar cáncer caracterizado por la regulación al alza de un molécula de ácido nucleico en una muestra de tejido mamario aislada, el ácido nucleico que codifica un inhibidor de la actividad apoptótica de p53, en el que dicha molécula se selecciona del grupo constituido por:

i) una molécula de ácido nucleico que consiste en una secuencia como se representa en la figura 2;

ii) una molécula de ácido nucleico que hibrida con la secuencia de ácido nucleico de la figura 2 y que codifica un inhibidor de la actividad apoptótica de p53; y

iii) una molécula de ácido nucleico que está degenerada como resultado del código genético de las secuencias definidas en (i) y (ii)

en el que dicho ensayo comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra para ser probada

b) proporcionar condiciones adecuadas para la detección de dicha molécula de ácido nucleico por dicho agente y detectar la presencia de la molécula de ácido nucleido por el agente; y

c) comparar la regulación al alza del ácido nucleico con controles normales emparejados.

6. Un ensayo según la reivindicación 5, en el que el agente es una molécula de ácido nucleico capaz de hibridar con dicha secuencia de ácido nucleico.

7. Un ensayo según la reivindicación 6, en el que el ácido nucleico es al menos un oligonucleótido.

8. Un ensayo según la reivindicación 6 ó 7 en el que el ensayo es un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa.

9. Uso de un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido como se representa por la secuencia de aminoácidos de la figura 3, para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de cáncer por inducción de apoptosis.

10. Uso de un anticuerpo según la reivindicación 9, en el que el cáncer es cáncer de mama.

11. Uso de una molécula de ácido nucleico no codificante que comprende una secuencia no codificante de una secuencia codificante seleccionada del grupo constituido por:

i) una molécula de ácido nucleico constituida por una secuencia como se representa en la figura 2;

ii) una molécula de ácido nucleico constituida por una secuencia que hibrida con la secuencia de ácido nucleico de la figura 2; y

iii) una molécula de ácido nucleico que consiste en una secuencia que está degenerada como resultado del código genético de las secuencias de ácido nucleico definidas en (i) y (ii), para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer por inducción de apoptosis.

12. Un procedimiento de detección sistemática para la identificación de agentes farmacológicos que interfieren con la unión de un polipéptido con p53 que comprende:

i) proporcionar un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por:

a)

una molécula de ADN constituida por una secuencia como se representa por la secuencia de ácido nucleico de la figura 2;

b)

una molécula de ADN que hibrida con la secuencia de ácido nucleico de la figura 2 y que codifica un inhibidor de la actividad apoptótica de p53; y

c)

una molécula de ADN que está degenerada como resultado del código genético de las secuencias de ADN definidas en (i) y (ii);

ii) proporcionar al menos un agente candidato;

iii) proporcionar una preparación formando una combinación de (i) y (ii);

iv) detectar o medir la actividad del agente respecto a la interferencia con la unión de dicho polipéptido con p53; y opcionalmente

v) probar el efecto del agente sobre la apoptosis de un tipo celular seleccionado.

13. Un procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho polipéptido está codificado por la secuencia de ácido nucleico representada en la figura 2.

14. Un procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, en el que dicho polipéptido es expresado por una célula.

15. Un procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicha célula es una célula cancerosa.

16. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en el que dicho polipéptido es sobreexpresado.

17. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en el que dicha célula es transformada/transfectada con una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido.

18. Una preparación farmacéutica combinada que comprende al menos una molécula de ácido nucleico no codificante de la secuencia codificante seleccionada del grupo constituido por:

i) una molécula de ácido nucleico constituida por la secuencia como se representa en la figura 2;

ii) una molécula de ácido nucleico constituida por una secuencia que hibrida con la secuencia de la figura 2; y

iii) una molécula de ácido nucleico que consiste en una secuencia que está degenerada como resultado del código genético de las secuencias de ADN definidas en (i) y (ii) y un agente quimioterapéutico.

19. Una preparación según la reivindicación 18, en la que dicho agente quimioterapéutico es un agente anticancerígeno seleccionado del grupo constituido por: cisplatino; carboplatino; ciclofosfamida; melfalán; carmuslina; metotrexato; 5-fluorouracilo; citarabina; mercaptourina; danorrubicina; doxorrubicina; epirrubicina; vinblastina; vincristina; dactinomicina; mitomicina C; taxol; L-asparaginasa; G-CSF; una enedina tal como caliqueamicina o esperamicina; clorambucil; ARA-C; vindesina; bleomicina; o etopósido.

20. Una preparación según la reivindicación 19, en la que dicho agente es cisplatino.

21. Una preparación farmacéutica combinada que comprende un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo constituido por:

i) una molécula de ácido nucleico constituida por la secuencia como se representa en la figura 2;

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ii) una molécula de ácido nucleico constituida por una secuencia que hibrida con la secuencia de ácido nucleico la figura 2; y

iii) una molécula de ácido nucleico que consiste en una secuencia que está degenerada como resultado del código genético de las secuencias de ADN definidas en (i) y (ii) y un agente quimioterapéutico.

22. Una preparación según la reivindicación 21, en la que dicho agente quimioterapéutico se selecciona del grupo constituido por: cisplatino; carboplatino; ciclofosfamida; melfalán; carmuslina; metotrexato; 5-fluorouracilo; citarabina; mercaptourina; danorrubicina; doxorrubicina; epirrubicina; vinblastina; vincristina; dactinomicina; mitomicina C; taxol; L-asparaginasa; G-CSF; una enedina tal como caliqueamicina o esperamicina; clorambucil; ARA-C; vindesina; bleomicina; o etopósido.

23. Una preparación según la reivindicación 22, en la que dicho agente quimioterapéutico es cisplatino.