PT1243278E - Utilização de sangue tendo uma concentração aumentada de óxido nítrico para o fabrico de um medicamento - Google Patents
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Description
ΡΕ1243278 1 DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE SANGUE TENDO UMA CONCENTRAÇÃO AUMENTADA DE ÓXIDO NÍTRICO PARA O FABRICO DE UM MEDICAMENTO" A presente invenção relaciona-se com um método para aumentar a concentração de óxido nítrico no sangue.
As plaquetas são dos mais pequenos dos elementos que formam o sangue. Cada milímetro cúbico de sangue contém cerca de 250 milhões de plaquetas, em comparação com apenas alguns milhares de células brancas. Existem cerca de um trilião de plaquetas no sangue de um adulto humano médio. As plaquetas não são células, mas são sim fragmentos das células gigantes da medula chamadas megacariócitos. Quando um megacariócito atinge a maturidade o seu citoplasma quebra-se formando milhares de plaquetas. As plaquetas não têm ADN e têm pouca capacidade para sintetizar proteínas. Quando libertadas no sangue, as plaquetas circulam e morrem em cerca de dez dias. No entanto, as plaquetas possuem um metabolismo activo para satisfazer as suas necessidades de energia.
Dado que as plaquetas contêm uma quantidade generosa de proteína contráctil (actomiosina), são susceptíveis de se contraírem de uma forma parecida com os músculos. Este fenómeno explica o encolhimento de um coágulo de 2 ΡΕ1243278 sangue fresco após apenas alguns poucos minutos. 0 encolhimento tem um papel na formação de um pistão hemostático quando um vaso sanguíneo é cortado. A função principal das plaquetas é a de formarem coágulos sanguíneos. Quando ocorre uma ferida, as plaquetas são atraídas ao local onde activam uma substância (trombina) que inicia o processo de coagulação. A trombina, além de converter o fibrinogénio em fibrina, também torna as plaquetas aderentes. Assim, quando expostas a colagénio e trombina, as plaquetas agregam-se para formar um pistão no orifício de um vaso sanguíneo ferido.
As plaquetas não só tendem a aderir umas às outras, mas também às paredes dos vasos sanguíneos. Dado que promovem a coagulação, as plaquetas têm um papel chave na formação de trombos. As consequências perigosas da formação de trombos são evidentes em muitas perturbações cardiovasculares e cerebrovasculares. A função exacta das plaquetas do sangue em diversos estados de perturbações humanas tem vindo a ser cada vez mais compreendido à medida que os avanços na bioquímica permitem a melhor compreensão das etiologias das doenças.
Por exemplo, têm sido feitas muitas tentativas para explicar o processo de aterogénese, isto é, a criação de placa que estreita as artérias e, alvo de preocupação especial, as artérias coronárias. Recentemente, tem havido 3 ΡΕ1243278 um interesse crescente no possível papel das plaquetas na aterosclerose. A este respeito, foi reconhecido que o óxido nítrico (ON) no sangue inibe a coagulação do sangue por prevenção da agregação das plaquetas do sangue. Ver, p. ex., Snyder et al., "Biological Roles of Nitric Oxide", Scientific American, Maio 1992, páginas 68-77, cujas revelações são aqui incorporadas por referência. À medida que o papel exacto do óxido nítrico tem sido explorado, tem-se tomado conhecimento de que o óxido nítrico serve como uma molécula mensageira importante no cérebro e em outras partes do corpo, governando várias funções biológicas. Nos vasos sanguíneos, o principal factor de relaxamento derivado do endotélio (EDRF) é o óxido nítrico, o qual estimula a vasodilatação. O óxido nítrico também inibe a agregação de plaquetas e é parcialmente responsável pelas acções citotóxicas dos macrófagos.
No cérebro, o óxido nítrico medeia as acções do neurotransmissor excitatório glutamato na estimulação de concentrações cíclicas de GMP. Estudos imuno-histoquímicos localizaram a óxido nítrico sintetase (NOS) em populações neuronais particulares no cérebro e na periferia. Os inibidores de óxido nítrico sintetase bloqueiam o relaxamento fisiológico do intestino induzido por estimulação neuronal, indicando que o óxido nítrico tem as propriedades de um neurotransmissor. A este respeito, o óxido nítrico 4 ΡΕ1243278 parece ser um novo tipo de mensageiro neuronal, na medida em que, ao contrário dos neurotransmissores convencionais, o óxido nítrico não é armazenado em vesículas sinápticas e não actua sobre as proteínas de receptor típicos de membranas sinápticas. Uma função do óxido nítrico pode ser a de proteger os neurónios de agressões isquémicas e neurotóxicas. Ver Bredt et al., "Cloned and Expressed Nitric Oxide Synthase Stucturally Resembles Cytochrome P-450 Reductase", Nature, Vol. 351, Junho de 1991, páginas 714-718. DE-A-1 068 428 revela um método e um dispositivo para a preparação de sangue oxigenado.
Assim, para além das doenças associadas à agregação de plaquetas, crê-se presentemente que um certo número de outros estados de doenças em seres humanos estão associados com níveis inadequados de óxido nítrico no sangue. Estas condições associadas ao óxido nítrico incluem: pressão sanguínea elevada, condições neurológicas tais como a depressão, tumores, infecções bacterianas e fúngicas e impotência. A invenção relaciona-se como uso de uma alíquota de sangue para o fabrico de um medicamento tal como definido na reivindicação 1.
Preferivelmente, o gás ozono tem uma concentração no sangue de desde cerca de 0,5 pg/ml a cerca de 100 pg/ml. 5 ΡΕ1243278
Vantajosamente, a radiação ultravioleta tem um comprimento de onda de cerca de 253,7 nm.
Preferivelmente, o sangue é mantido a uma temperatura de desde cerca de 0°C a cerca de 56°C enquanto é mantido em contacto com o gás ozono e a radiação ultravioleta. A gama de temperatura preferida é de desde 37°C a 43°C, sendo a temperatura mais preferida de 42,5°C. A quantidade de sangue tratado pode ser de 0,01 ml a 400 ml e é preferivelmente de cerca de 10 ml, e o sangue é contactado com o gás ozono e com a radiação ultravioleta preferivelmente durante um período de cerca de 3 minutos. O sangue pode ser sangue humano. O medicamento pode ser para o tratamento de pressão sanguínea elevada, depressão, um tumor, uma infecção bacteriana, uma infecção fúngica ou uma infecção virai. A invenção será agora descrita em maior detalhe.
Os Exemplos 1 e 2 abaixo mostram que uma inibição da agregação de plaquetas do sangue só pode ser atingida quando o sangue é tratado com uma combinação de gás ozono e radiação ultravioleta (UV). O tratamento do sangue apenas com gás ozono produz uma inibição mínima de agregação de 6 ΡΕ1243278 plaquetas do sangue. 0 tratamento do sangue apenas com luz ultravioleta não produz nenhuma inibição de agregação de plaquetas do sangue. Para além disso, os Exemplos 3 e 4 mostram que a inibição da agregação de plaquetas do sangue se dá pela via de um mecanismo mediado pelo óxido nítrico e que o tratamento do sangue com luz ultravioleta e ozono de acordo com a invenção aumenta as concentrações de óxido nítrico no sangue.
Por essa razão, descobriu-se inesperadamente que o tratamento combinado com gás ozono e luz ultravioleta produz um aumento notável na concentração de óxido nítrico do sangue, o que pode ser útil no tratamento de uma variedade de perturbações que são beneficiadas por níveis elevados de óxido nítrico. 0 gás ozono pode ser fornecido por qualquer fonte convencional conhecida na técnica, tal como um ozonizador. 0 gás ozono utilizado em conexão com o método inventivo tem uma concentração de ozono de desde cerca de 0,5 a cerca de 100 pg/ml. Preferivelmente, o gás ozono tem uma concentração de desde cerca de 5 a cerca de 50 μρ/ιηΐ. O gás ozono é preferivelmente fornecido ao sangue por meio de um veículo de oxigénio medicinal, e é preferivelmente contactado com o sangue por quaisquer meios conhecidos na técnica, preferivelmente por borbulhamento da mistura ozo-no/veículo através da amostra de sangue. A radiação ultravioleta pode ser fornecida por qualquer fonte convencional conhecida na técnica, por 7 ΡΕ1243278 exemplo uma pluralidade de lâmpadas ultravioleta de baixa-pressão. A invenção utiliza preferivelmente uma fonte padrão UV-C de radiação ultravioleta. São preferivelmente empregues lâmpadas ultravioleta de baixa pressão que geram um espectro linear em pelo menos cerca de 90% da radiação tem um comprimento de onda de cerca de 253,7 nm. Crê-se que a radiação ultravioleta que tenha comprimentos de onda de emissão correspondentes a fontes padrão de UV-A e UV-B também resulta em resultados aceitáveis. O sangue a ser tratado com UV/ozono é preferivelmente aquecido a uma temperatura de desde cerca de 0°C a cerca de 56°C enquanto está a ser contactado com o gás ozono e com a radiação ultravioleta. Qualquer fonte de calor adequada conhecida na técnica pode ser empregue para aquecer o sangue, preferivelmente uma ou mais lâmpadas infravermelhas. O sangue pode ser aquecido a cerca de 37-43°C, mais preferivelmente cerca de 42,5°C, antes de ser contactado om o gás ozono e com a radiação ultravioleta. Preferivelmente, a temperatura do sangue é então mantida a cerca de 42,5°C durante o tratamento com UV/ozono.
Alternativamente, a amostra de sangue é aquecida enquanto é sujeita a radiação UV, até que o sangue atinja uma temperatura predeterminada (preferivelmente cerca de 42,5°C), ponto esse em que é começado o borbulhamento de gás ozono através do sangue. O tratamento concorrente UV/ozono é então mantido por um período de tempo predeterminado, preferivelmente cerca de 3 minutos. 8 ΡΕ1243278
Um outro método alternativo envolve sujeitar o sangue a UV/ozono ao mesmo tempo que se aquece o sangue a uma temperatura predeterminada (preferivelmente 42,5°C) e depois quer terminando o tratamento logo que a temperatura predeterminada é atingida quer continuando o tratamento com UV/ozono por um outro periodo de tempo, mais preferivelmente cerca de 3 minutos.
Descobriu-se que o aquecimento do sangue a cerca de 42,5°C com as lâmpadas de infravermelhos preferivelmente empregues de acordo com a invenção leva de desde cerca de um minuto e cinquenta segundos a cerca de dois minutos e dez segundos.
Será entendido que a fonte de sangue tratado de acordo com a invenção pode ser sangue de uma fonte externa, tal como um dador de sangue de tipo de sangue compatível, o qual é tratado com UV/ozono e depois administrado a um paciente. Alternativamente, e preferivelmente, o sangue a ser tratado pode ser retirado do paciente humano como uma alíquota, tratado com UV/ozono, depois re-administrado ao paciente do qual a alíquota de sangue foi retirada. Pode ser tratado e depois re-administrado ao paciente todo o sangue removido do paciente ou apenas uma porção.
Em geral, de acordo com a invenção, podem ser tratados de desde cerca de 0,01 a cerca de 400 ml de sangue. As quantidades preferidas estão na gama de cerca de 0,1 a 200 ml, e mais preferivelmente de desde cerca de 1 a 50 ml de sangue. O método envolve mais preferivelmente o 9 ΡΕ1243278 tratamento de cerca de 10 ml de sangue com gás ozono e radiação ultravioleta, depois a administração (ou re-administração) do sangue tratado ao paciente por injecção intramuscular.
Podem ser empregues outras técnicas convencionais conhecidas na técnica para a administração de sangue, tais como injecção interarterial, injecção intavenosa, injecção subcutânea e injecção intraperitoneal. A administração de pequenos volumes de sangue de hospedeiro desta forma é chamada micro-auto-hemoterapia. A invenção pode ser usada num modelo de realização em que o sangue é removido continuamente do corpo de um paciente e circulado através de um dispositivo, o qual trata o sangue com gás ozono e luz ultravioleta, tal como descrito acima, antes de devolver o sangue ao paciente. Este procedimento teria uma utilidade particular, por exemplo, durante a realização de procedimentos operatórios, tal como cirurgia de "bypass" coronário. O sangue é contactado com o gás ozono e com a radiação ultravioleta durante um certo período de tempo suficiente para elevar efectivamente a concentração de óxido nítrico no sangue no paciente. Verificou-se que um período de tratamento de desde cerca de uns poucos segundos a cerca de 60 minutos, preferivelmente de desde 0,5 minutos a cerca de 10 minutos, e mais preferivelmente cerca de 3 minutos, fornece um aumento satisfatório nos níveis de 10 ΡΕ1243278 óxido nítrico do sangue. O sangue é preferivelmente mantido a uma temperatura de cerca de 42,5°C durante o período de tratamento de três minutos. O método deve ser levado a cabo sob condições estéreis conhecidas das pessoas com experiência comum na técnica. O método da invenção pode ser levado a cabo usando dispositivos convencionais para ozonizar o sangue e irradiar o sangue com radiação ultravioleta, conhecidos daqueles com experiência na técnica médica. Preferivelmente, é empregue um dispositivo similar àquele revelado na Patente U. S. No. 4 968 483 para levar a cabo o método da invenção.
As pessoas com experiência na técnica apreciarão que o método de aumentar a concentração de óxido nítrico no sangue, fornecido pela invenção, terá utilidade terapêutica para o tratamento de uma larga gama de estados de doença, os quais podem ser beneficiados pelo aumento dos níveis de óxido nítrico no sangue. O termo "tratar", tal como usado aqui, refere-se ao alívio da prevenção de uma perturbação particular. No caso de condições traumáticas tais como apoplexia, o tratamento preventivo é obviamente preferido. Também, apesar de o termo "humano" ser usado para descrever o hospedeiro preferido, as pessoas com experiência na técnica apreciarão que os métodos da invenção teriam utilidade similar com outros mamíferos.
As doenças seguintes são ilustrativas de 11 ΡΕ1243278 condições conhecidas as quais são potencialmente tratáveis: pressão sanguínea elevada; condições neurológicas tais como depressão; tumores; infecções bacterianas, virais, protozoárias e fúngicas; e impotência. Esta lista é merament técnica apreciarão que outros estados de doença que beneficiem com o aumento da concentração de óxido nítrico no sangue podem ser tratadas com a técnica inventiva.
Pensa-se que a doença vascular periférica está associada com uma redução do factor de relaxamento derivado do endotélio (EDRF), do qual os níveis baixos levam a uma contracção do músculo macio dos vasos sanguíneos, e assim a uma redução do diâmetro do lúmen do vaso e a uma redução do fluxo de sangue o principal EDRF que ocorre naturalmente é o óxido nítrico. Para além disso, o óxido nítrico estabiliza as plaquetas do sangue, reduzindo a sua agregação. Por essa razão, um aumento nos níveis de EDRF (óxido nítrico), tem um efeito benéfico duplo sobre o sistema circulatório: inibe a agregação de plaquetas, tornando o sangue mais fluído, e alarga o diâmetro dos vasos, melhorando o fluxo. 0 inverso, uma redução dos níveis de óxido nítrico, pode estar presente na doença vascular periférica, e nas outras condições descritas acima as quais podem ser beneficiadas pelo aumento da concentração de óxido nítrico no sangue.
Tal como ilustrado nos exemplos abaixo, crê-se que o método aumenta os níveis de óxido nítrico no sangue, os quais podem explicar o modo de acção no tratamento inventivo de doença vascular periférica e outras condições 12 ΡΕ1243278 associadas com a agregação de plaquetas do sangue e deficiência de óxido nítrico.
Os exemplos seguintes são dados para ilustrar a invenção mas não são consideradas como sendo uma limitação sua. EXEMPLO 1
Inibição de Agregação de Plaquetas do Sangue A seguinte experiência foi conduzida para estudar os efeitos do tratamento de ozono/luz ultravioleta sobre a actividade das plaquetas do sangue.
Procedimento Experimental
Foram retiradas amostras (20 ml) de sangue periférico a 10 indivíduos para 13 experiências separadas. Cada amostra foi dividida em duas alíquotas. A primeira alíquota foi tratada de acordo com a técnica inventiva, tal como se segue: A alíquota de 10 ml foi tratada in vitro durante três minutos com gás ozono (concentração de ozono variável de 5-50 pg/ml) e luz ultravioleta (253,7 nm), a uma temperatura de 42,5°C. Foi utilizado um dispositivo tal como revelado na Patente U. S. No. 4 968 483 para levar a cabo o tratamento da amostra de sangue. 13 ΡΕ1243278 A segunda alíquota de 10 ml de cada uma das amostras serviu como controlo não tratado.
As plaquetas foram isoladas, do controlo ou das amostras, tratadas por centrifugação, e a sua capacidade de agregação em resposta a concentrações diferentes de ADP (um estimulante natural das plaquetas) foi medida num agre-gómetro. Uma amostra tanto de sangue tratado com ozono como de sangue não tratado foi usada para a quantificação de números de plaquetas, usando um contador de Coulter. Em algumas das experiências descritas abaixo, as aliquotas de sangue fora tratadas com concentrações de ozono diferentes. Em outras experiências realizadas, o sangue foi tratado na presença e na ausência de radiação UV-luz. A agregação de plaquetas no sangue tratado com ozono foi expressa como uma percentagem da agregação no sangue não tratado, de controlo, da mesma pessoa.
Resultados
Tal como mostrado na Tabela 1, os resultados das experiências indicam que o tratamento de sangue com ozono e luz ultravioleta de acordo com a invenção inibe a agregação de plaquetas do sangue. Para além disso, há uma indicação de que esta inibição está relacionada com a dose de concentração de ozono (ver a Tabela 2). 14 ΡΕ1243278
Efeito de níveis elevados de ozono em plaquetas de sangue estimuladas por ADP
Os níveis elevados de ozono (entre 35 e 50 μρ/ηιΐ) causaram uma inibição mensurável de agregação de plaquetas induzida por ADP (arbitrariamente tomada como inibição de 33,3%) em 11 das 13 experiências (8 dos 10 indivíduos). Tomando todos os dados sobre os 10 indivíduos, a inibição média de agregação de plaquetas foi de 49, 2 +/- 27, 8% (média +/- dp). Não houve uma diferença significativa entre os efeitos inibidores no sangue retirado de machos e fêmeas (inibição média de 48,1% e 50,7%, respectivamente).
Esta inibição parece relacionar-se com a concentração de ADP (estimulador de agregação) sobre a gama de concentração de 0,01 - 0,1 mM ADP, com inibição mais baixa a concentrações mais elevadas de agonista de plaquetas. No entanto, esta relação não se manteve a concentrações de ADP mais elevadas (Tabela 1) e podia ser espúria, apesar de o nível de inibição a 0,01 mM de ADP ser significativamente maior do que a 0,1 mM de ADP (71% vs. 95%, p> 0,01). TABELA 1 O efeito de níveis elevados de ozono sobre a agregação de plaquetas de sangue humano na presença de concentrações variáveis de ADP. 15 ΡΕ1243278
Data Concentração de (indivíduo) ozono ^g/ml) Concentração de ADP {mM) Percentagem de inibição de agregação Contagem de Antes do ozono plaguetas Após o ozono 21.11.91 (Fl) 50 10 100 27.11.91 (Ml) 50 5 83.3 10 71.4 30 75.0 2.12.91 (F2) 50 10 0 30 10 . 0 100 27.3 3.12.91 (M2) 50 0.5 67.1 1. 57.1 5 50.0 30 88 .1 6.12.91 (M3) 50 0.1 0 34 49 0.1 6.2 0.5 4.0 0.5 0 11.12.91 (M4) 50 0 . 05 67.0 46 93 0.1 62.4 1.0 74.3 10 . 0 50.0 12.12.91 (M5) 50 0 .01 67.0 51 121 0.1 7.1 1.0 35.7 13.12.91 (Fl) 50 0 .01 63.4 33 87 0 . 05 22.7 0.1 30.4 0.5 15.4 1.0 20.8 5.0 20.0 10 . 0 27.6 9.01.92 (M6) 50 0 .01 34.2 34 40 0 . 05 31.0 0.1 9.8 0.5 15.4 1.0 26.2 5.0 31.3 10.01.92 (F3) 50 0.001 71.4 49 64 0.005 37.5 0 .01 69.8 0 . 05 33.8 0.1 31.2 0.5 10 .1 1.0 21.8 ΡΕ1243278 16 (continuação)
Data (indivíduo) Concentração de ozono ^g/ml) Concentração de ADP (mM) Percentagem de inibição de agregação Contagem de Antes do ozono plaquetas Após o ozono 13.01.92 (F4) 50 0.005 100 49 52 0 .01 100 0 . 05 95.2 0.1 92.9 0.5 95.8 1.0 91.6 5.0 95.8 10 . 0 80.0 15.01.92 (Fl) 40 0 . 01 90.0 81 66 0 . 05 71.4 0.1 40.7 0.5 87.0 1.0 81.8 5.0 95.5 10 . 0 85.2 50.0 84.0 100 . 0 79.1 21.09.92 (M2) 35 0 . 01 67.1 68 79 0 seguinte é um resumo dos dados mostrados na Tabela 1: ADP mM 0,01 0.05 0 .10 0.50 1.00 5.00 10.0 % de inibição de agregação N = 70,8+/- 53,5+/-20, 9 26,1 6 6 34, 7 + /-28,4 8 37, 6 + /-38,4 7 50,3+/- 28,7 7 60,7+/-35,2 4 60,7+/-30,4 4 0 efeito de niveis elevados de ozono na contagem de pia- quetas do sangue completo:
Dado que qualquer redução aparente de agregação de plaquetas a seguir ao tratamento por ozono de sangue completo pode ser causada por uma perda de plaquetas do sangue durante o tratamento, foram realizadas contagens de plaquetas totais nas amostras de sangue completo tratadas e não tratadas, em 9 experiências, com o sangue de 8 17 ΡΕ1243278 indivíduos. No global, a contagem de plaquetas foi de 115,5 +/- 59,8 % do nível sem tratamento a seguir à ozonização (gama de 82 - 264 %) .
Assim, as contagens de plaquetas totais antes e depois do tratamento de ozono/UV não indicam uma perda grande de plaquetas do sangue como resultado de ozonização.
0 efeito de concentrações diferentes de ozono sobre a inibição de agregação de plaquetas de sangue humano estimu-ladas com ADP
Foram usadas três concentrações de ozono diferentes (5, 25 e 50 pg/ml) em 4 experiências sobre 4 indivíduos. O agrupamento dos dados para as diferentes concentrações de ozono de cada indivíduo e o cálculo da média para os dados das 4 experiências indicou que havia alguma relação de resposta à dose entre a concentração de ozono usada e a inibição de agregação de plaquetas (ver a Tabela 2).
Apesar de, no global, estas diferenças não serem significativas, em dois dos quatro indivíduos houve um efeito de inibição do ozono significativamente maior a 50 . pg/ml do que a 5 pg/ml (ver a Tabela 3). TABELA 2 O efeito de concentrações diferentes de ozono sobre a inibição de agregação de plaquetas na presença de adp 18 ΡΕ1243278
Data (indivíduo) 3.12.9 (M2) 9.01.92 (M6) 10.01.92 (F3)
Concentração de ozono ^g/ml) Concentração de ADP (mM) Percentagem de inibição de agregação Contagem de Antes do ozono plaguetas Após o ozono 15 0 .1 27.3 25 0 .1 100 5 0.5 0 25 0.5 50 0.5 67.1 5 1. 0 0 25 1. 0 28.6 50 1. 0 57.1 5 5.0 0 25 5.0 25.0 50 5.0 50.0 5 30.0 50.0 25 30.0 62.0 50 30.0 88.1 5 0.01 20.11 34 43 25 0.01 28.9 45 50 0.01 34.2 40 5 0.05 0 25 0.05 5.2 50 0.05 31.0 5 0 .1 9.8 25 0 .1 1.4 50 0 .1 9.8 5 0.5 0 25 0.5 0 50 0.5 15.4 5 1. 0 22.5 25 1. 0 13.7 50 1. 0 26.2 5 5.0 0 25 5.0 17.8 50 5.0 31.5 5 0 .001 57.1 49 73 25 0 .001 85.7 90 50 0 .001 71.4 64 5 0.005 37.5 25 0.005 80.0 50 0.005 37.5 5 0.01 66.4 25 0.01 83.2 50 0.01 69.8 ΡΕ1243278 19 (continuação)
Data (indivíduo) 13.01.92 (F4)
Concentração de ozono ^g/ml) 5 25 50 5 25 50 5 25 50 5 25 50 5 25 50 5 25 50 5 25 50 5 25 50 5 25 50 5 25 50 5 25 50 5 25 50
Concentração de ADP (mM) 0.05 0.05 0.05 0 .1 0 .1 0 .1 0.5 0.5 0. 5 1. 0 1. 0 1. 0 0.005 0.005 0.0050.010.01 0.01 0.05 0.05 0.05 0 .1 0 .1 0 .1 0.5 0.5 0. 5 1. 0 1. 0 1. 0 5.0 5.0 5.0 10.0 10.0 10.0
Percentagem de inibição de agregação 44.9 66.9 33.8 29.3 61.0 31.2 39.4 54.5 10.1 21.8 52.9 21.8 100 100 100 100 87.5 100 84.8 97.1 95.2 82.9 91.4 92.9 83.3 95.8 95.8 83.2 89.5 91.6 79.2 91.7 95.8 85.3 80.0 80.0
Contagem de plaquetas
Antes do ozono Após o ozono 49 60 85 52 ΡΕ1243278 20 O seguinte é um resumo do que é mostrado na
Tabela 2:
Concentração de ozono ^g/ml) 5 25 50
Agregação de plaquetas (%) (média +/- 38,5 +/- 56,5 +/- 55,9 +/- dp. n = 4)_30,9_29, 4_26,4 TABELA 3 O efeito de concentrações de ozono diferentes sobre a inibição de agregação de plaquetas em dois indivíduos
Concentração de ozono (fj.q/ml)_ Agregação de plaquetas M2 (%) Diferença de 5 μg/ml Agregação de plaquetas M6 (%) Diferença de 5 μq/ml ns = não significativo 5 15,5+/-20,2 8.7+/-9,6 25 53,9+/- 30,0 ns 11,2+/-10,2 ns 50 65,6+/-14,4 P < 0,01 24,7 + /-9,0 p < 0,02 O efeito da luz ultravioleta sobre a resposta de plaquetas ao ozono: O efeito do ozono na agregação de plaquetas de sangue humano foi investigado a concentrações diferentes de ADP, na presença ou na ausência de luz UV. Os resultados, mostrados na Tabela 4, indicam que, apesar de poder haver alguma resposta de inibição de agregação de plaquetas apenas ao ozono, esta é quase sempre maior na presença de luz UV e o efeito da luz UV foi altamente significativo (p < 0,001) nesta única experiência. Este resultado também se repetiu numa segunda experiência, usando uma única concentração de ADP (0,01 mM) . Os resultados desta segunda experiência são mostrados na Tabela 5. 21 ΡΕ1243278 TABELA 4 0 efeito da luz UV sobre a inibição de agregação de plaquetas induzida por ADP por ozono a uma concentração de 40 μg/ml. (Data da experiência 15.01.92, indivíduo Fl).
Concentração de ADP (mM) Inibição de agregação de plaquetas (56) +UV -UV 0.01 90.0 60.0 0.05 71.4 0 0.1 40.7 40.7 0.5 87.0 0 1.0 81.8 0 5.0 95.5 19.4 10.0 85.2 18.5 50.0 84.0 16.0 100.0 79.1 4.2 Média +/- dp 79,4 +/- 15,1 17,6 +/- 19,6 (p < 0,001) TABELA 5 0 efeito da luz UV sobre a agregação de plaquetas induzida por ADP (0,01 mM) na presença ou na ausência de ozono. (Data da experiência 21. 01.92, indivíduo M2) . Percentagem de inibição de agregação de plaquetas Ozono 35 μg/ml + UV Ozono 35 μg/ml UV Sem ozono. Só UV 83,4 % 11,2 % 0 %
Em resumo, os resultados do Exemplo 1 indicam que o tratamento in vitro de uma alíquota de sangue com gás ozono e luz ultravioleta inibe a agregação de plaquetas do sangue. Foi descoberto que esta inibição de plaquetas está relacionada em termos de dose com a concentração de ozono. Mais ainda, descobriu-se que a inibição de plaquetas 22 ΡΕ1243278 depende criticamente do tratamento combinado de luz ultravioleta e gás ozono, tal como é evidenciado nas Tabelas 4 e 5. 0 tratamento apenas com gás ozono resultou numa inibição minima de agregação de plaquetas, enquanto que o tratamento apenas com luz ultravioleta não produziu nenhuma inibição de agregação de plaquetas. EXEMPLO 2
Medição de Óxido Nítrico
De forma a elucidar o mecanismo pelo qual a ozonização/luz ultravioleta afecta a agregação de plaquetas em sangue tratado, foi medida a concentração de certas formas de azoto oxidadas. A medição directa de óxido nítrico é difícil de conseguir. No entanto, o óxido nítrico é um intermediário num percurso metabólico no qual a arginina é convertida em citrulina. Outros produtos finais estáveis são nitratos e nitritos .
De acordo com isso, os teores de óxido nítrico para várias amostras de sangue tratado com luz ultravioleta e gás ozono, de acordo com o Exemplo 1, foram determinados indirectamente por medição das concentrações de nitrato mais nitrito nas amostras antes e depois do tratamento com ozono/luz ultravioleta, após a conversão de nitrato a nitrito. 23 ΡΕ1243278
Os resultados mostram que há um pequeno aumento nas concentrações de nitrato mais nitrito após o tratamento ilustrado. Este aumento foi consistentemente encontrado em amostras tratadas com gás ozono/luz ultravioleta. Assim os niveis de óxido nítrico podem ser melhorados pelo tratamento com gás ozono/luz ultravioleta, e isto pode ser parte do modo de acção pelo qual uma inibição de agregação de plaquetas do sangue é atingida pela invenção. Este efeito terapêutico seria consistente com a etiologia de doença vascular periférica descrita acima.
Conclusões
Os dados dos Exemplo 1 e 2 sugerem que o tratamento do sangue com gás ozono e luz ultravioleta de acordo com a invenção está realmente a induzir uma inibição da agregação das plaquetas pelas razões seguintes: 1. 0 efeito inibidor é pelo menos parcialmente de pendente da concentração de ADP, sendo o ozono mais inibidor a concentrações de ADP baixas. Isto pode ser interpretado como as concentrações mais elevadas sobreporem-se ao efeito inibidor do ozono por "hiperestimulação" das plaquetas. Isto sugere que a inibição é, pelo menos parcialmente, reversível e não está provavelmente a actuar na destruição da capacidade das plaquetas se agregarem. 24 ΡΕ1243278 2. 0 efeito de inibição parece estar relacionado em termos de dose com a concentração de ozono, com concentrações mais elevadas de ozono a resultarem numa inibição maior da agregação de plaquetas. 3. 0 efeito de inibição é dependente de UV, sugerindo que este é um efeito tóxico não especifico causado pela capacidade oxidativa do gás ozono. EXEMPLO 3 0 sangue venoso (20 ml) retirado a 13 voluntários saudáveis não fumadores, 6 fêmeas e 7 machos, idades 20-50 anos, foi recolhido em anticoagulante de citrato de sódio. Nenhum dos voluntários tinha tomado nenhuma medicação há pelo menos uma semana antes da investigação. O sangue foi dividido em duas aliquotas de 10 ml. Uma aliquota foi tratada com ozono/luz ultravioleta, tal como descrito abaixo, a outra foi uma amostra controlo não tratada.
Tratamento com ozono das amostras de sangue O sangue foi tratado de acordo com a invenção com concentrações diferentes de ozono usando um dispositivo similar àquele descrito na Patente U. S. No. 4 968 483. Ozono em oxigénio medicinal foi borbulhado através da amostra de sangue a uma taxa de 0,3 1/min durante um período fixo de cerca de 3 minutos. O sangue foi aquecido a uma temperatura de 42,5°C e foi exposto a luz ultravioleta 25 ΡΕ1243278 a um comprimento de onda de 253, 7 nm. A concentração de ozono no veículo de oxigénio era variável entre cerca de 5 e 50 μς/ιηΐ, e foi medida usando um monitor de ozono (Humares, Karlsruhe, Alemanha).
Estudos de agregação de plaquetas A agregação de plaquetas foi medida essencialmente pelo método turbidimétrico do ponto final de Born.
Plasma rico em plaquetas (PRP) foi preparado centrifugando 10 ml de sangue (quer sangue tratado com ozono quer sangue de controlo não tratado) à temperatura ambiente durante 20 minutos a 200 x g. Quatro ml de PRP foram diluídos pela adição de 1,0 ml de solução salina de tampão de fosfato. PRP diluído (0,225 ml) foi colocado numa cuvette de um agregómetro contendo uma pequena barra de agitação magnética (modelo do agregómetro 1002, ADG Instruments Ltd., Codicote, Herts., U.K.) e foi equilibrada a 37°C. Após a agitação ter sido iniciada, foi adicionado 0,025 ml de agonista (quer reacção de agregação plaqueta ADP-ADP quer reagente de agregação de plaqueta colagénio-colagénio; ambos de Sigma Chemical Co., Poole, Dorset, U.K.) às concentrações finais indicadas na secção de resultados abaixo. Foi medida a alteração máxima na transmissão de 26 ΡΕ1243278 luz. A agregação de plaquetas nas amostras tratadas com ozono foi expressa como uma percentagem da agregação nas amostras de controlo para cada condição experimental individual .
As contagens de plaquetas de sangue foram realizadas em sangue completo, usando um contador de Coulter, fornecido pelo Department of Hematology, Northern General Hospital, Sheffield, U.K.
Resultados A seguir ao tratamento do sangue completo com 35-50 μρ/ΓηΙ de ozono em oxigénio a um caudal de 0,3 1/min durante 3 min (massa total de ozono reagida: 31,5-45 mg) com exposição a UV, houve um aumento global aparente na contagem de plaquetas, para 1461/57% (média +/- desvio padrão, gama 81-202%) do valor de controlo nos 12 indivíduos investigados. Isto sugere que, sob as condições usadas nestas experiências, o tratamento do sangue completo com ozono não destrói as plaquetas do sangue. Para além disso, seguindo a avaliação visual, não foi observada hemólise marcada no sangue tratado em comparação com as amostras de sangue de controlo, indicando que o regime de tratamento tinha pouco efeito sobre a integridade dos eritrócitos.
As plaquetas de sangue tratado com 35-50 pg/ml de ozono, tal como acima, apresentaram uma redução na sua 27 ΡΕ1243278 capacidade de se agregarem em resposta a ADP (concentrações de 0,001-100 mmol/1). A inibição global de agregação foi 53,1 +/- 31,1 % (média +/- desvio padrão, n = 13). A inibição foi variável entre os indivíduos, variando desde 2,6% a 100%.
Este efeito de inibição do tratamento de ozono/UV era dependente da concentração de ADP, mostrando um nivel de inibição mais elevado de agregação de plaquetas a concentrações baixas de ADP (ver a Tabela 6). O efeito de inibição a 0,01 mmol/1 de ADP foi significativamente maior (p<0,02) do que a 0,1 mmol/1 deste agonista (ver a Tabela 6) .
Com colagénio como indutor de agregação de plaquetas, as plaquetas tratadas com 35-50 μρ/ιηΐ de ozono em oxigénio também apresentaram um nível elevado de inibição de agregação: 74,2 +/- 43,3 % com 1 mg/ml de colagénio e 76,4 +/- 25,2 % com 10 mg/ml de colagénio (n = 5) .
Uma redução da concentração de ozono no oxigénio borbulhado através da amostra de sangue resultou numa redução do efeito do tratamento sobre a inibição da agregação de plaquetas. Esta diferença foi significativa em respostas individuais ao tratamento, apesar de os valores médios globais dos quatro indivíduos investigados não serem significativamente diferentes (ver a Tabela 7). 28 ΡΕ1243278 TABELA 6 0 efeito de concentrações diferentes do agonista de plaquetas ADP sobre a inibição de agregação de plaquetas induzida por ADP por tratamento do sangue in vitro com ozono a uma concentração de 50 μg/ml em oxigénio e radiação uv.
Sujeito Cone. de ADP (mmol/1) Percentagem de Inibição de Agregação de Plaquetas Macho 1 0,5 67,1 1,0 57,1 5,0 50,0 Macho 2 0, 001 71,4 0, 01 69,8 0,1 31,2 1,0 21,8 Fêmea 2 0, 01 63,4 0,1 30,4 1,0 20,8 Média 0,01 70,8 + /- 20,9, n = 6 0,05 53,5 +/- 26,1, n = 6 0,1 34,7 +/- 28,4, n = 81 * significativamente diferente de 0,01 mmol/1, p<0,02 TABELA 7 O efeito de concentrações diferentes de ozono sobre a inibição de agregação de palquetas induzida por ADP por tratamento de sangue completo in vitro com ozono em oxigénio e radiação UV. 1
Percentagem de Inibição de Agregação de Plaquetas Sujeito 5 μg/ml de Ozono 25 μg/ml de Ozono 50 μg/ml de Ozono
Macho 1 15,5 53,9 65,62
Macho 2_8^7_11,2_24,71_ Média (n = 4) 38,5 56,5 55,9 dp_30,9_29,4_26,4_ 2 significativo a p<0,01 * significativo a p<0,02_ 29 ΡΕ1243278 EXEMPLO 4 O Efeito de Tratamento de UV/Ozono do Sangue in Vitro Sobre a Concentração de Óxido Nítrico do Plasma
Esquema Experimental
Sangue (10 ml) anticoagulado com citrato de sódio, de 14 indivíduos normais saudáveis, foi tratado com UV/gás ozono tal como descrito no Exemplo 3, com oxigénio contendo ozono a uma concentração de 20-50 μg/ml. Sangue de controlo de cada indivíduo não foi tratado. Após a remoção dos componentes celulares do sangue por centrifugação a 15 000 x g durante 30 segundos, o plasma foi armazenado a -20 °C. O óxido nítrico, produzido metabolicamente a partir de L-arginina, é instável e reage com o oxigénio para formar nitrato e nitrito. O total nitrato mais nitrito foi medido após a conversão do nitrato a nitrito usando um catalisador de cádmio. O nitrito foi medido colorimetri-camente usando um reagente de Griess por um método baseado naquele publicado por Green, Wagner, Glogowski, Skipper, Wisnok / Tannenbaum em 1982 (Analytical Biochemistry, Vol. 126, páginas 131-138). Todas as amostras tratadas e de controlo foram medidas num único ensaio. 30 ΡΕ1243278
Resultados
Os valores reais da concentração de nitrito variaram largamente entre os indivíduos, variando de desde 0,6 - 27,6 μπιο1/1. Para permitir comparações entre indivíduos, a concentração de nitrito na amostra tratada com ozono foi expressa como uma percentagem da concentração no controlo não tratado correspondente. Um resumo dos resultados é como se segue:
Indivíduo No. Percentagem de Nitrito na Amostra Tratada _com Ozono em Comparação com o Controlo 1 28, 0 2 36,7 3 48,9 4 76, 4 5 110,0 6 133,3 7 157,6 8 162, 9 9 175, 8 10 350, 0 11 845, 5 12 985, 7 13 2075,0 14 3067,0 aritmética 589,5%
Estes valores não formam uma distribuição normal. No entanto, pode ser atinjida uma distribuição aproxima-damente normal após a transformação logarítmica dos dados. A seguir à transformação logarítmica, o nível de nitrito nas amostras de sangue tratadas com UV/ozono é significativamente maior do que nas amostras não tratadas (p<001). 31 ΡΕ1243278
Estudos de Inibição 0 óxido nítrico inibe a agregação das plaquetas -esta é uma das saua actividades fisiológicas. É sabido que o efeito do óxido nitrico nas plaquetas pode ser inibido pela oxi-hemoglobina livre (Salvemini, Radziszewski, Korbut & Vane, Br. J. Pharmacol., Vol. 101, páginas 991-995, 1990) . Por essa razão nós investigámos o efeito da oxi-hemoglobina sobre a acção inibidora de agregação de plaquetas do tratamento de sangue completo com UV/gás ozono.
Esquema Experimental
Plasma rico em plaquetas foi preparado a partir de sangue completo, quer tratado com UV/ozono quer não tratado (controlo) por centrifugação a 200 x g durante 20 minutos à temperatura ambiente. A agregação de plaquetas em resposta a ADP, colagénio ou trombina como estimuladores foi medida num agregómetro. Foi adicionada oxi-hemoglobina ao plasma enriquecido em plaquetas subsequentemente à ozonização e antes de se medir a actividade de agregação de plaquetas. Se o tratamento do sangue com uv/ozono para inibir a agregação de plaquetas actuar pela via de um mecanismo mediado por óxido nítrico, então a adição de oxi-hemoglobina deverá prevenir a inibição de agregação de plaquetas causada por UV/ozonização. Os resultados são mostrados na Tabela 8 abaixo. 32 ΡΕ1243278 TABELA 8
Sujeito Agonista de plaquetas Percentagem de inibição de agregação de plaquetas de UVO/ozono após tratamento Sem Hb 10 μτηοΐ/ΐ de Hb Fêmea a Trombina 100 iu 23 4 Fêmea b Trombina 100 iu 57 0 Trombina 10 iu 97 57 ADP 1 mmol/1 36 0 Macho a Trombina 10 iu 80 79 Colagénio 1 mg/ml 95 80 ADP 1 mmol/1 16 0 ADP 0,1 mmol/1 26 9 Apesar de bastante variável, dois ou três dos sujeitos apresentaram reduções consistentes de inibição de agregação de plaquetas pós terapia de UV/ozono na presença de hemoglobina e o terceiro sujeito apresentou alguma redução com 3 das 4 condições de agregação usadas. As médias globais de agregação de plaquetas foram de 54% sem hemoglobina e 29% na presença deste inibidor de actividade de óxido nítrico.
Conclusões
Os dados acima mostram que a ozonização do sangue eleva o nível de nitrito (o metabolito estável de óxido nítrico) e que essa inibição de agregação de plaquetas causada por ozonização de sangue pode ser anulada pela hemoglobina, um inibidor da actividade do óxido nítrico. Tomados em conjunto, estes dados sugerem fortemente que o tratamento do sangue com UV/ozono aumenta os níveis de óxido nítrico do sangue in vivo, e inibe a agregação de 33 ΡΕ1243278 plaquetas pela via de um mecanismo mediado pelo óxido nítrico.
Sendo assim descrita a invenção, será óbvio que a mesma poderá ser variada em muitas maneiras e que se tem a intenção de incluir todas essas modificações no âmbito das reivindicações seguintes.
Lisboa, 29 de Março de 2007
Claims (9)
- ΡΕ1243278 1 REIVINDICAÇÕES 1. 0 uso de uma alíquota de sangue, o qual tenha sido posto em contacto com uma quantidade de gás ozono e radiação UV efectiva para o aumento da concentração de óxido nítrico, para o fabrico de um medicamento para o tratamento de um estado de doença associado com níveis inadequados de óxido nítrico no sangue. 2. 0 uso da Reivindicação 1, em que o gás ozono tem uma concentração de desde cerca de 0,5 μg/ml a cerca de 100 μg/ml no sangue.
- 3. O uso da Reivindicação 2, em que o gás ozono tem uma concentração de desde cerca de 0,5 μg/ml a cerca de 50 pg/ml.
- 4. O uso de qualquer uma das Reivindicações de 1 a 3, em que a radiação ultravioleta tem um comprimento de onda de cerca de 253,7 nm.
- 5. O uso de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o sangue é mantido a uma temperatura de cerca de 0°C a cerca de 56°C enquanto é posto em contacto com o gás ozono e com a radiação ultravioleta.
- 6. O uso da Reivindicação 5, em que o sangue é mantido a uma temperatura de desde cerca de 37°C a cerca de 43°C enquanto é mantido em contacto com o gás ozono e a radiação ultravioleta. 2 ΡΕ1243278 7. 0 uso da Reivindicação 6, em que o sangue é mantido a uma temperatura de cerca de 42,5°C enquanto é mantido em contacto com o gás ozono e a radiação ultravioleta. 8. 0 uso de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o sangue tratado inclui de desde cerca de 0,01 ml a cerca de 400 ml.
- 9. O uso da Reivindicação 8, em que o sangue tratado inclui cerca de 10 ml de sangue.
- 10. O uso de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o sangue é contactado com o gás ozono e a radiação ultravioleta durante um periodo de cerca de 3 minutos.
- 11. O uso de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o sangue é sangue humano.
- 12. O uso de qualquer uma das reivindicações precedentes em que o estado de doença é seleccionado de entre o grupo que consiste de pressão sanguínea elevada, depressão, um tumor, uma infecção bacteriana, doenças associadas com a agregação de plaquetas e uma infecção por fungos. Lisboa, 29 de Março de 2007
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