ITMI20131667A1 - Metodo per pre-trattare le cellule ematiche prima della separazione. - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

“Metodo per pre-trattare le cellule ematiche prima della separazione”

Campo dell’ invenzione

La presente invenzione si riferisce ad un metodo per la separazione di cellule ematiche; in particolare, ad un metodo di pre-trattamento delle cellule ematiche prima della loro separazione.

Stato dell’arte.

Attualmente esistono diverse tecniche per la separazione delle cellule ematiche al fine di recuperare una popolazione cellulare di interesse, come ad esempio una popolazione di cellule staminali.

Tuttavia, la maggior parte delle tecniche note per la separazione delle cellule ematiche prevede almeno una fase di centrifugazione che può costituire una fonte di stress per le cellule ed un possibile danneggiamento delle stesse. Tali cellule così danneggiate saranno meno efficaci nel momento in cui verranno trapiantate nel paziente.

Pertanto, resta l’esigenza di realizzare un metodo per mezzo del quale sia possibile ottenere una buona separazione di cellule ematiche che garantisca il recupero di cellule staminali di migliore “qualità” e limiti il danneggiamento dovuto al processo di separazione.

Uno scopo della presente invenzione è quindi quello di realizzare un metodo efficiente per la separazione di cellule ematiche ed ottenere una qualità migliore delle stesse. Sommario dell’ invenzione

In un primo aspetto, pertanto, la presente invenzione si riferisce ad un metodo per la separazione di cellule ematiche come quello indicato nella rivendicazione 1.

La Richiedente della presente domanda ha infatti sorprendentemente riscontrato che un metodo per separare le cellule ematiche, caratterizzato dal fatto che detto metodo comprende una fase preliminare di pre-trattamento delle cellule ematiche usando una miscela di ossigeno-ozono, è in grado di ottenere cellule ematiche efficienti in grado di poter essere recuperate per un loro successivo utilizzo dopo la fase di separazione, congelamento e scongelamento.

Infatti, detta fase preliminare di pre-trattamento del sangue permette di ottenere una qualità migliore delle cellule ematiche ed una moltiplicazione delle stesse, in particolare di cellule staminali, qualunque sia la successiva tecnica di separazione delle cellule ematiche usata ed in particolare dopo le fasi di crioconservazione e di scongelamento. Le cellule staminali provenienti dal sangue pre-trattato con detta miscela di ossigenoozono prima della separazione, risultano essere più numerose, vitali e più attive, aumentandone quindi la loro efficacia quando vengono trapiantate nel paziente.

Detta miscela di ossigeno-ozono utilizza adeguate quantità e concentrazioni di tali componenti della miscela; preferibilmente detta miscela di ossigeno-ozono comprende da circa 40% a circa 60% in peso di ossigeno (02) e da circa 60% a chea 40% in peso di ozono (03), più preferibilmente da circa 45% a circa 55% in peso di ossigeno e da circa 55% a circa 45% in peso di ozono, rispetto al peso totale della miscela. Il più preferibilmente, detta miscela comprende ossigeno ed ozono in un rapporto di circa 1 : 1 peso/peso.

Preferibilmente, in detta miscela di ossigeno-ozono, la concentrazione di ozono è da circa 20 pg/ml a circa 60 pg/ml, più preferibilmente da circa 40 pg/ml a circa 50 pg/ml. Infatti, da una parte, quando la concentrazione di ozono in detta miscela di ossigenoozono è inferiore a 20 pg/ml non si ottengono risultati efficaci mentre, dall’altra parte, quando la concentrazione di ozono in detta miscela di ossigeno-ozono è superiore a 60 pg/ml non è consentita la pratica della grande autoemoinfusione, ovvero il prelievo e la ri-infusione di un quantitativo notevole di sangue miscelato con una quantità prestabilita di ossigeno-ozono, ad esempio circa 200-250 cc.

Una volta che le cellule ematiche sono state pre-trattate con detta miscela di ossigenoozono, esse possono essere separate mediante una qualsiasi tecnica di separazione cellulare.

Tale fase di separazione delle cellule è necessaria per poter somministrare al paziente solamente la frazione necessaria per correggere il problema specifico o per crioconservare solo la popolazione cellulare d’interesse, come ad esempio cellule staminali da cordone ombelicale.

Per separare le diverse popolazioni cellulari ottenute si possono applicare diverse strategie, molte delle quali sono basate sulle loro caratteristiche fisiche: cellule più grandi o più dense possono essere separate da cellule più piccole o a densità inferiore.

Preferibilmente, detta fase di separazione delle cellule ematiche avviene per mezzo della tecnica di centrifugazione, secondo la quale viene dapprima prelevato dal donatore il sangue intero e poi fatto fluire in un sistema di centrifugazione che, accelerando il processo di sedimentazione, permette di separare le cellule fra loro e di separare queste cellule dal plasma.

La centrifugazione è una tecnica che sfrutta la forza generata da una centrifuga e viene impiegata in laboratorio per purificare complessi macromolecolari, micelle, cellule e grosse strutture cellulari, materiale extracellulare, ecc., in base alla diversa densità di questi rispetto al mezzo in cui sono sospesi o dispersi.

Di solito il materiale da centrifugare è posto in tubi alloggiati nel rotore di una centrifuga. Il rotore viene fatto girare a velocità elevata (fino a 100.000 giri al minuto) per un certo tempo, sottoponendo cosi la sospensione a forze centrifughe pari a molte migliaia di volte la forza di gravità, che causano la sedimentazione delle particelle che presentano anche minime differenze di densità rispetto al mezzo in cui si trovano.

Da un certo quantitativo di materiale cellulare di solito si separano due frazioni, il pellet, che è un materiale compatto che resta sul fondo, ed il surnatante, che è tutto ciò che rimane in sospensione.

In alternativa, preferibilmente, detta fase di separazione delle cellule ematiche avviene per mezzo della tecnica di filtrazione, secondo la quale il sangue intero prelevato dal donatore viene fatto fluire in un modulo filtrante di membrane microporose che permettono la separazione delle molecole proteiche piasmatiche dalle cellule, che non possono attraversare tali membrane.

Ancora, in ulteriore alternativa, detta fase di separazione delle cellule ematiche avviene per mezzo della combinazione delle sopra citate tecniche di filtrazione e di centrifugazione, in cui il sangue fluisce in un cilindro contenente una membrana preferibilmente in policarbonato con pori di piccole dimensioni (qualche micron). La centrifugazione permette di separare i vari costituenti del sangue e la rotazione allontana le cellule dalla membrana impedendo la saturazione del filtro. La soluzione contenente le cellule viene poi fatta fluire in un serbatoio, mentre il plasma (contenente piastrine o meno, a seconda della procedura) va ad una sacca di raccolta.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi del presente ritrovato risulteranno meglio evidenziati dall’esame della seguente descrizione dettagliata di una forma di realizzazione preferita, ma non esclusiva, illustrata a titolo indicativo e non limitativo.

Descrizione dettagliata.

La descrizione dettagliata seguente si riferisce ad una forma particolare di realizzazione dell’invenzione.

Servendosi di una siringa, viene prelevata una quantità prestabilita di miscela di ossigeno-ozono alla concentrazione di interesse e viene addizionata ad una sacca contenente il sangue che verrà sottoposto alla fase di separazione cellulare. Dopodiché viene eseguita la procedura di separazione cellulare.

Esempio 1 (<'>invenzione').

Con una siringa venne prelevata una miscela di ossigeno-ozono con un rapporto ossigeno-ozono di 1:1 ed una concentrazione di ozono di circa 40 pg/ml; tale miscela venne addizionata ad una sacca contenente sangue; la sacca venne quindi agitata per qualche secondo per permettere alla miscela di ossigeno-ozono di distribuirsi uniformemente nel sangue all’ interno della sacca.

Successivamente, una certa quantità del sangue pre-trattato con tale miscela di ossigenoozono venne, dapprima, prelevata da tale sacca con una siringa condizionata con eparina, citrato o altro anticoagulante per evitare la coagulazione del sangue stesso e, successivamente, trasferita dalla siringa in un recipiente, premendo lo stantuffo molto lentamente per evitare la rottura delle cellule.

In un altro recipiente venne messa a temperatura ambiente circa la metà del volume rispetto al sangue di Histopaque<R>1077 (disponibile da Sigma- Aldrich, St.Louis, Mo, Stati Uniti), una soluzione non sterile a base di polisaccarosio e diatrizoato di sodio corretti ad una densità di 1,077 ± 0,001 g/ml. Nel contenitore contenente Histopaque<R>1077 venne aggiunto molto lentamente un volume di sangue diluito con soluzione fisiologica, in modo che le due soluzioni restino separate. Quanto ottenuto venne centrifugato a 1500 rpm per 30 minuti a 25° C ottenendo 4 fasi distinte: al di sotto i globuli rossi, appena sopra l’Histopaque<R>1077, poi un sottile anello di cellule mononucleate e al di sopra di tutto il plasma.

Con l’ausilio di un aspiratore venne aspirato l’anello di cellule, trasferito in un contenitore e portato a 50 mi con soluzione fisiologica. Dopodiché venne risospeso, centrifugato a 1500 rpm per 15 minuti a 25° C; questa operazione venne ripetuta più volte finché non venne eliminato tutto il sumatante.

Le cellule così separate furono lavate e conservate ad una temperatura di -4°C.

Esempio 2 (<'>confronto').

Venne presa una sacca di sangue analoga a quella utilizzate nell’Esempio 1, con la differenza che tale sacca non venne sottoposta alla fase di pre-trattamento con aggiunta di soluzione di ossigeno-ozono.

Le cellule contenute in tale sacca vennero sottoposte alla stessa fase di separazione per centrifugazione descritta nell’esempio 1.

Test di valutazione

La sacca 1 contenente cellule ottenute con il pre-trattamento dell’invenzione descritto nell’Esempio 1 e la sacca 2 contenente cellule ottenute come descritto nell’Esempio 2 di confronto (senza tale pre-trattamento) furono valutate per mezzo di un test di valutazione standard.

I test di valutazione standard si basano solitamente sull’analisi della vitalità cellulare e sulla conta delle cellule CD34+ (marcatore antigenico comune ai progenitori ematopoietici che può essere riconosciuto da anticorpi monoclonali) che potrebbero aver parte nella formazione, nell’ auto-riproduzione e nella differenziazione delle cellule staminali.

La vitalità cellulare di cellule adese od in sospensione contenute nella sacca 1 e nella sacca 2 sopra descritte venne valutata, ad esempio, ponendo le cellule a contatto con una soluzione di colorante Trypan Blue (0,4%) (disponibile ad esempio da Sigma-Aldrich come T-8154) per 5 minuti. In seguito a tale trattamento, le cellule vive non assunsero il colorante ed apparvero rifrangenti, mentre le cellule morte risultarono colorate di blu in quanto persero la capacità di escludere il colorante.

La conta delle cellule CD34+ venne valutata, ad esempio, tramite citofluorimetria a flusso, una tecnologia che permette di analizzare un elevato numero di cellule in breve tempo (50.000 cellule in pochi secondi) e di quantificare numerosi parametri per ogni singola cellula in base alle informazioni fornite da un fascio di luce che attraversa ogni singola cellula e che determina remissione da essa di un segnale fluorescente.

Le cellule della sacca 1 che furono sottoposte al pre-trattamento della presente invenzione mostrarono un considerevole incremento del numero di CD34+ vitali rispetto a quelle della sacca 2 non sottoposte a tale pre-trattamento.

Inoltre, le cellule della sacca 1 e della sacca 2 furono sottoposte anche ad un test di proliferazione, ovvero un saggio che viene utilizzato per verificare un eventuale effetto sul ritmo proliferativo imputabile ad un danneggiamento o alla morte delle cellule. Tale test prevede che le cellule in crescita esponenziale vengano seminate in piastre ed incubate in condizioni di coltura standard; come controlli negativi vengono usate cellule non trattate e cellule trattate con il solo solvente.

In seguito a tale test di proliferazione, le cellule della sacca 1 che furono sottoposte al pre-trattamento della presente invenzione mostrarono anche un migliorato stato ed una migliorata qualità delle cellule stesse (le cellule staminali proliferarono bene) e la presenza di marcatori di staminalità, come ad esempio per cellule staminali ematopoietiche CD14, CD34 e CD45, rispetto a quelle della sacca 2 non sottoposte a tale pre-trattamento.

Pertanto, le cellule provenienti da sangue intero pre-trattato con miscela di ossigenoozono prima della separazione, secondo il metodo della presente invenzione, risultarono essere più numerose, vitali ed attive. La loro efficacia risultò quindi essere aumentata quando furono trapiantate nel paziente.

Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per separare le cellule ematiche, caratterizzato dal fatto che detto metodo comprende una fase preliminare di pre-trattamento delle cellule ematiche usando una miscela di ossigeno-ozono.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta miscela di ossigeno-ozono comprende da circa 40% a circa 60% in peso di ossigeno e da circa 60% a circa 40% in peso di ozono, rispetto al peso totale della miscela.
3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta miscela di ossigeno-ozono comprende da circa 45% a circa 55% in peso di ossigeno e da circa 55% a circa 45% in peso di ozono, rispetto al peso totale della miscela.
4. 4. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta miscela di ossigeno-ozono comprende ossigeno ed ozono in un rapporto di circa 1 : 1 peso/peso.
5. 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui in detta miscela di ossigeno-ozono la concentrazione di ozono è da circa 20 μg/ml a circa 60 μg/ml.
6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui la concentrazione di ozono è da circa 40 μg/ml a circa 50 μg/ml.
7. 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui la fase di separazione delle cellule ematiche, successiva a detta fase preliminare di pretrattamento, avviene per mezzo di una qualsiasi tecnica di separazione delle cellule ematiche.
8. 8. Metodo secondo la rivendicazione 7, in cui detto metodo per separare le cellule ematiche avviene per mezzo della tecnica di centrifugazione.