PT1163354E - Composições e método para a produção de vírus adenoassociados recombinantes sem auxiliares - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DE VÍRUS ADENOASSOCIADOS RECOMBINANTES SEM AUXILIARES"

Antecedentes da Invenção 0 vírus adeno-associado (AAV) é um parvovírus com replicação deficiente, cujo genoma é cerca de 4,6 Kb em comprimento, incluindo repetições terminais invertidas de 145 nucleótidos (IRTs). Duas grelhas de leitura abertas codificam uma série de polipéptidos rep e cap. Os polipétidos rep (rep78, rep68, rep62 e rep40) estão envolvidos na replicação, libertação e integração do genoma de AAV. As proteínas cap (VP1, VP2 e VP3) formam a cápside do virião. A flanquear as grelhas de leitura abertas nos terminais 5' e 3' estão as repetições terminais invertidas de 145 pb (IRTs), cujas primeiras 125 pb são capazes de formar estruturas duplas Y- ou T-. De importância para o desenvolvimento dos vectores AAV, os domínios rep e cap inteiros podem ser excisados e substituídos por um transgene terapêutico ou repórter [B.J. Cárter, em "Handbook of Parvoviruses", ed. P. Tisser, CRC Press, pp 155-168 (1990) ] . Foi demonstrado que os RTIs representam a sequência mínima necessária para a replicação, libertação, empacotamento e integração do genoma AAV.

Quando este vírus humano não patogénico infecta uma célula humana, o genoma virai integra-se no cromossoma 19, resultando numa infecção latente da célula. A produção de vírus infecciosos e a replicação do vírus não ocorre a não ser que a célula seja 1 co-infectada com um vírus auxiliar lítico, tal como o adenovírus (Ad) ou herpes-vírus. Após infecção com um vírus auxiliar, o pro-vírus AAV é salvo e amplificado, e são produzidos o AAV e o vírus auxiliar. 0 ADNss infectante parental é expandido para ADNs de forma de replicação dupla (FR) de um modo dependente de rep. Os genomas AAV salvos são empacotados em cápsides proteicas pré-formadas (simetria icosaédrica de aproximadamente 20 nm de diâmetro) e libertas como viriões infecciosos que empacotaram quer + ou - genomas ADNss após a lise celular. O AAV possui características únicas que o tornam atractivo como um vector para distribuição de ADN estranho (i. e., um transgene) em células, e vários grupos estudaram a utilização potencial de AAV no tratamento de estados de doença. Tal como utilizado neste pedido, o termo "transgene" significa o ADN requerido para ser administrado a um animal, sendo o ADN ADN não AAV. Contudo, o progresso no sentido de estabelecer AAV como um vector de transdução para a distribuição de ADN na forma de um transgene requerido tem sido lento por várias razões.

Um obstáculo à utilização de AAV para a distribuição do ADN tem sido a falta de esquemas altamente eficientes para encapsulação de genomas recombinantes e produção de viriões infecciosos. Veja-se, R. Kotin, Hum, Gene Ther., _5:793—801 (1994) . Um método que foca este problema envolve a transfecção de um AAV recombinante (rAAV) (que tem o ADN para ser distribuído, mas não tem os genes rep e cap) para células hospedeiras seguida de co-infecção com o tipo selvagem (wt) AAV (que proporciona os genes rep e cap) e adenovírus (que proporciona pelo menos os quatro genes adenovírus: El, E2, E4 e VAI, que foi referido como sendo necessário para a produção de rAAV) [ver, por exemplo, Cárter, referido acima]. Outro método, 2 descrito no documento WO 95/06743 envolve a co-infecção de uma célula hospedeira com um virus híbrido adenovirus/MV contendo sequências funcionais de adenovirus Ela e Elb e o adenovírus Adr e EI. Contudo, nestes métodos a co-infecção é obrigatória e leva a níveis elevados inaceitáveis de AAVwt resultando da recombinação não-homóloga e contaminação de rAAV produzido com AAVwt. A contaminação com outros vírus ou plasmídeos exige a purificação de rAAV. A incubação de células com rVAA na ausência de contaminação de AAVwt ou adenovírus auxiliares produz baixa expressão génica recombinante.

Uma forma de produção de viriões AAV transdutores, amplamente reconhecida para a terapia genética compreende co-transfecção com dois plasmídeos diferentes complementares. Um destes plasmídeos contém um transgene terapêutico ou repórter em sanduíche entre os dois AAVITRs que actuam em cis. Os componentes AAV que são necessários para libertação e empacotamento subsequente do genoma recombinante descendente são proporcionados em trans por um segundo plasmídeo que codifica as grelhas de leitura aberta para as proteínas rep e cap. Neste sistema, as funções Ad auxiliares são fornecidas por um adenovírus wt ou por um adenovírus de replicação deficiente com o gene EI em falta fornecido por células HBKL 293. Foram descritas outras variantes deste método. Ver, por exemplo, Patente U.S. N° 5 658 785 que se refere a uma célula de mamífero transfectada com um genoma rAAV e com genes rep de AAVe cap, e um método para produção de rAAV por infecção desta célula hospedeira com um vírus auxiliar. A patente U.S: N° 5 658 776 diz respeito a sistemas de empacotamento e processos de empacotamento de vectores AAV nos quais o promotor p5 de AAV é substituído por um promotor 3 heterólogo. Alternativamente, a patente U.S. N° 5 622 856 diz respeito a construídos e métodos para a produção de vectores AAV nos quais o promotor homólogo p5 é deslocado para a posição 3" dos genes rep, opcionalmente rodeando os genes rep/cap e reposicionando o promotor p5 com sequências FRT.

Permanece uma necessidade na técnica para composições adicionais e métodos que permitam a produção eficiente de vírus AAV e vírus recombinantes AAV para utilização como vectores para a terapia genética somática sem os problemas de ineficiência, contaminação e purificação presentes nos métodos descritos anteriormente. 0 pedido de Patente Internacional PCT/US 99/05870 (publicada no dia 23 de Setembro de 1999 como documento WO 99/47691), da qual o presente pedido reivindica prioridade de Convenção refere-se a métodos para cultura de uma célula hospedeira de mamífero contendo um transgene rodeado por repetições terminais invertidas AAV, uma sequência rep de AAV e uma sequência cap de AAV e um mínimo de ADN adenovírus necessário para expressar um produto génico Ela, um produto génico Elb e um produto génico E2a. Só os Exemplos 8 e 9 do pedido revelam a replicação dos vectores híbridos competentes Ad/AAV e a sua utilização.

Sumário da Invenção A presente invenção permite a produção eficiente de rAAV contendo o ADN transgene requerido. Particularmente, a presente invenção proporciona tanto composições como métodos que permitem 4 a produção de um rAAV sem produção de AAVwt remontado contaminante durante a produção de rAAV.

De acordo com a invenção é proporcionado um vírus híbrido de replicação competente adenovírus/AAV compreendendo (a) elementos de adenovírus em 5' cis necessários para a replicação e empacotamento; (b) uma deleção da sequência adenoviral na região nativa adenoviral Ela e Elb; (c) um vector virai recombinante adeno-associado (rAAV), (d) uma deleção das sequências adenovirais da região E3; (e) sequências de ácidos nucleicos codificando o adenovírus Ela e adenovírus Elb sob o controlo das sequências reguladoras dirigindo a expressão dos produtos dos genes Ela e Elb, em que as referidas sequências de ácidos nucleicos Ela e Elb estão localizadas no local da região E3; e (f) os elementos adenovirais em 3' cis necessários para a replicação e empacotamento.

Noutro aspecto, a invenção proporciona um método para a produção de vírus adeno-associados recombinantes (rAAV) na ausência de contaminação de vírus auxiliares ou vírus tipo selvagem, compreendendo o passo de cultura de uma célula hospedeira compreendendo (a) uma sequência rep de AAV e uma sequência cap de AAV sob o controlo das sequências reguladoras que dirigem a sua expressão; e (b) um vírus híbrido adenovírus/AAV compreendendo: elementos de adenovírus em 5' cis necessários para a replicação e empacotamento; uma deleção de sequências adenovirais na região nativa adenoviral Ela e Elb; um vector de vírus recombinante adeno associado (rAAV); uma deleção de sequências adenovirais da região E3; sequências de ácidos nucleicos codificando o adenovírus Ela e adenovírus Ellb sob controlo das sequências reguladoras dirigindo a expressão dos produtos dos genes Ela e Elb, em que as referidas sequências de 5 ácidos nucleicos Ela e Elb estão localizadas no sitio da região E3; e os elementos de adenovirus em 3' cis necessários para a replicação e empacotamento; sendo a referida célula hospedeira cultivada sob condições que inibem a replicação de virus híbridos, resultando na produção aumentada de rAAV.

Numa forma de realização preferida, o método da invenção simplifica os passos de purificação porque o rAd/AAV de replicação competente proporciona que a construção rAAV seja empacotado e todas as sequências adenovirais necessárias, não existe um vírus auxiliar utilizado e existe uma sequência de adenovirus insuficiente na célula hospedeira para permitir a recombinação homóloga com um vírus wt contaminante.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção serão ainda descritos na descrição detalhada das formas de realização preferidas desta.

Breve Descrição dos Desenhos A Fig IA é um esquema ilustrativo da produção do plasmídeo de transporte pABrAAV-CMV-EGFP tal como descrito no Exemplo 2. A Fig 1B é um esquema ilustrativo da replicação-combinação do híbrido rAd/AAV por recombinação homóloga entre o plasmídeo de transporte da Fig A e o subadenovírus lOOr, tal como descrito no Exemplo 2. 6

Descrição Detalhada da Invenção

I. El-Expressão do vírus híbrido Adenovírus/AAV A presente invenção proporciona um virus híbrido recombinante adenovírus/AAV (rAd/AAV), no qual um adenovírus é modificado para conter uma construção rAAV para ser empacotada num virião rAAV e sequências adenovirais suficientes para permitir a replicação do vírus híbrido numa célula hospedeira seleccionada. Numa forma de realização preferida, todos os genes adenovirais necessários são proporcionados pelo vírus híbrido rAd/AAV sem as sequências adenovirais do tipo selvagem E3 e pode conter uma deleção não funcional das sequências adenovirais, e. g., o vírus híbrido pode não conter todas as sequências codificantes adenovirais E4 com a excepção das sequências necessárias para expressar a função E4 0RF6. A construção rAAV é inserida na região E3 ou El do adenovírus. Opcionalmente, as sequências codificando os produtos do gene El são inseridas em, e expressas a partir da região E3 tipo selvagem. Noutra forma de realização, a invenção proporciona um rAd/AAV que expressa os produtos do gene El, mas carece de uma ou mais das outras sequências adenovirais necessárias (e. g., E2a e/ou E4 0RF6), que são fornecidas pela célula hospedeira. 0 vírus híbrido da invenção, descrito abaixo em detalhe, é útil para a produção do rAAV numa célula hospedeiro que contém uma sequência rep de AAVe uma sequência cap de AAV sob o controlo de sequências reguladoras que dirigem a expressão deste. 7 A. Sequências do Gene Adenoviral

As sequências mínimas de adenovírus empregues no vírus híbrido rAd/AAV da invenção são as sequências de repetições terminais invertidas (IRTs) que actuam em cis de um adenovírus (que funciona como origem de replicação), de um modo preferido, estas sequências ITR incluem os ITRs 5' e 3' nativas de um adenovírus. Contudo, sempre que pretendido, podem ser executadas modificações a estas sequências nativas. Alternativamente, o vírus híbrido pode ser modificado para conter ITRs derivados de serotipos de adenovírus diferentes, ou para conter dois ITRs idênticos. 0 vírus híbrido rAd/AAV também contém sequências necessárias para empacotar genomas lineares Ad e elementos intensificadores do promotor EI. Convenientemente, estas sequências podem ser proporcionadas por um domínio 5' empacotador/intensificador adenoviral nativo. Adicionalmente, o vírus híbrido rAd/AAV contém o ADN adenoviral necessário para permitir a replicação do vírus híbrido numa célula hospedeira seleccionada. 0 vírus híbrido tem uma deleção de sequências adenovirais na região nativa adenoviral Ela e Elb e uma deleção das sequências adenovirais da região E3.

Em adição a estas funções mínimas adenovirais, o vírus híbrido rAd/AAV pode conter sequências adenovirais adicionais. De um modo muito preferido, todos os outros produtos de genes de adenovírus necessários, E2a, E2b, E4 0RF6, os genes adenovirais intermédios IX e Ixa, e genes adenovirais tardios Ll, L2, L3, L4 e L5 são expressos a partir do vírus híbrido. As sequências de adenovírus podem ser derivadas de um ou mais adenovírus tipo-selvagem ou um adenovírus mutante.

As sequências de ADN codificando os genes adenovirais úteis nesta invenção podem ser seleccionados de entre um ou mais tipos de adenovírus, incluindo os 4 6 tipos humanos presentemente identificados [e. g., Horwitz, citado acima e American Type Culture Collection]. Do mesmo modo, os adenovírus conhecidos por infectar outros animais podem proporcionar as sequências dos genes. A selecção dos tipos de adenovírus para cada sequência de gene EI e E2a não limita esta invenção. As sequências para um número de serotipos de adenovírus, incluindo aquele do serotipo Ad5, estão disponíveis no Genbank. Várias estirpes de adenovírus estão disponíveis a partir de American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, ou estão disponíveis por pedido a partir de uma variedade de fontes comerciais e institucionais. No exemplo da forma de realização que se segue as sequências do gene EI e E2a são as do serotipo do adenovírus 5 (Ad5).

Tal como aqui utilizado "ADN que expressa o produto génico" significa cada sequência de ácido nucleico, produto génico ou qualquer sua porção funcional. Do mesmo modo, estão incluídos quaisquer alelos ou outras modificações da sequência de ácido nucleico (e. g., um gene) ou uma sua porção funcional. Como aqui definido, "porção funcional ou fragmento funcional" é aquela região de sequência codificante ou produto génico que é necessário para proporcionar a função necessária pretendida. Tais modificações podem ser introduzidas deliberadamente recorrendo a engenharia genética convencional ou técnicas de mutagénese para aumentar de algum modo a função do produto génico, assim como suas variantes alélicas que ocorram naturalmente. Como "deleção funcional" refere-se a uma região de sequência codificante ou produto génico que carece das sequências requeridas para proporcionar a função da região. 0 9 termo "deleção funcional" não limita os meios pelos quais a função da região é eliminada. A excisão da região, ou fragmento desta, não é requerida. 0 virus híbrido rAd/AAV da invenção carece das sequências que codificam o produto génico adenoviral E3, permitindo assim que uma sequência heteróloga seja inserida na região nativa E3, que não é essencial para a replicação e infecção. Tal sequência heteróloga pode ser qualquer sequência de ácido nucleico que não é nativo para o adenovírus, ou qualquer sequência de ácido nucleico de uma região não-contígua do mesmo adenovírus. Do mesmo modo, o vírus híbrido rAd/AAV pode carecer das sequências codificantes adenovirais E4 à excepção de E4 0RF6 que é essencial. De forma apropriada, o vírus híbrido rAd/AAV é modificado de tal forma que não excede 105% do tamanho do genoma adenoviral nativo (e. g., 105% de 36 Kb) . Assim, sempre que pretendido, e. g., para permitir a inserção de uma sequência heteróloga pretendida, o rAd/AAV pode ser modificado para conter outras deleções não funcionais de sequências de tipo selvagem para o(s) adenovírus dos quais o híbrido é modificado. Tais deleções não funcionais incluem aquelas que não extinguem a capacidade do vírus híbrido para expressar um produto génico funcional necessário para a replicação do vírus híbrido. A deleção das sequências completas codificantes E4 com a excepção das sequências E4 ORF6 é um exemplo de uma deleção não-funcionais. Outras deleções não funcionais adequadas podem ser prontamente desenhadas.

Assim, numa forma de realização particularmente preferida, todos os genes adenovirais necessários para a replicação do vírus híbrido rAd/WA são proporcionadas pelo próprio vírus híbrido. Tal vírus híbrido contém uma construção rAAV para ser 10 empacotado num virião, carece de sequências adenovirais codificando o adenovirus E3, e carece de todas as sequências codificantes adenovirais E4 com a excepção da função E4 0RF6. Adicionalmente, os produtos dos genes adenovirais Ela e Elb são expressos de uma região diferente da região EI tipo selvagem, e. g., estes produtos de genes são inseridos em, e expressos a partir da região E3 tipo selvagem.

Noutra forma de realização, a rAd/AAV da invenção carece de um ou mais dos outros genes adenovirais necessários para a replicação. Quaisquer produtos dos genes adenovirais que tenham sido removidos do virus híbrido podem ser proporcionados no processo de produção por uma célula de empacotamento seleccionada ou em trans por uma sequência de ácido nucleico controlando a expressão do produto génico pretendido. Num exemplo, o vírus híbrido rAd/AAV contém as funções EI tipo selvagem, mas carece das sequências necessárias para a expressão de E4 0RF6. Nesta situação, o híbrido rAd/AAV é introduzido numa célula hospedeiro que contém as sequências necessárias para expressar E4 0RF6. Noutro exemplo o vírus híbrido rAd/AAV carece das sequências necessárias para a expressão de E2a, cuja função é expressa na célula hospedeira utilizada para a produção do rAAV. Tais células hospedeiras são discutidas em maior detalhe abaixo. A concepção destes e outros vírus híbridos rAd/AAV dentro do âmbito desta invenção inclui sequências apropriadas que estão operacionalmente ligadas ao gene de interesse para promover a sua expressão. Sequências "operacionalmente ligadas" incluem tanto de interesse como sequências de controlo de expressão que quer sequências de controlo de expressão que são contíguas ao actuam em trans ou à distância para controlar o gene de 11 interesse. Tais sequências de expressão de controlo são discutidas em maior detalhe em ligação com o transgene.

Os promotores para cada gene adenoviral podem ser seleccionados independentemente a partir de um promotor constitutivo, um promotor indutivel ou um promotor adenoviral nativo (i. e., um promotor pode ser qualquer que esteja naturalmente associado com a região flanqueadora 5' de um gene adenoviral). Os promotores podem ser regulados por um estado fisiológico do organismo ou célula (i. e., pelo estado de diferenciação ou em células replicantes ou quiescentes) . Ou por factores externos adicionados, por exemplo, os promotores seleccionados podem ser iguais ou podem ser diferentes.

Numa forma de realização, o gene Ela (e subsequentemente o gene Elb) é expresso sob controlo de um promotor constitutivo, incluindo, sem limitação, o promotor/intensificador RSV/LTR, o promotor/intensificador constitutivo precoce imediato de CMV, o promotor SV40, o promotor di-hidrofolato redutase, o promotor citoplasmático β-actina e o promotor da fosfoglicerol cinase (PGK).

Noutra forma de realização, um promotor indutivel é empregue para expressar os produtos do gene El, de modo a controlar a quantidade e tempo de produção celular dos produtos dos genes Ela e Elb, que podem ser tóxicos para a célula após excessiva acumulação [ver, e. g., William S.M. Wold, J. Cell Biochem., 53: 329- 335 (1993); J. Nevins, Current Opinion in

Genetics and Development, 4: 130-134 (1994); E. Harrington et al., Current Opinion in Genetics and Development, _4: 120-129 (1994); G. Evan et al., Current Opinion in Cell Bioloqy, 825-834 (1995); J. Nevins, Science, 258: 424 (1992)]. Promotores 12 indutíveis incluem aqueles conhecidos na técnica e aqueles discutidos acima incluindo, sem limitação, o promotor da metalotionina de carneiro indutivel por zinco (MT); o promotor do virus do tumor mamário de ratinho (MMTV) indutivel por desametasona - (Dex); o promotor T7; o promotor de insecto ecdisona; o sistema repressor pela tetraciclina; o sistema indutivel pela tetraciclina; o sistema indutivel RU486; e o sistema induzido pela rapamicina. Qualquer tipo de promotor indutivel que possa ser útil neste contexto são os que são regulados por um estado fisiológico, e. g., temperatura, fase aguda, um estado particular de diferenciação da célula, ou apenas em células replicantes.

B. Construção Recombinante de AAV

No virus rAd/AAV, as sequências AAV são inseridas na estrutura adenoviral, numa região removida da sequência adenoviral nativa, e depois são rodeadas pelas sequências adenovirais seleccionadas. As sequências AAV estão tipicamente na forma de uma construção rAAV (e. g., uma cassete) que é empacotada num virião rAAV de acordo com o método da invenção. A construção rAAV contém um mínimo de (de 5' para 3') sequências 5' ITR de AVV, um transgene seleccionado sob o controlo de um promotor seleccionado e outras sequências reguladoras convencionais do vector, e sequências 3' ITR de AAV. Cada um destes componentes da construção rAAV é discutido a seguir. Ver também, Pat. U.S. NoS 5 856 152 e 5 871 982. Um especialista na técnica pode facilmente modificar o vírus híbrido rAd/AAV de forma a inserir a construção rAAV na região adenoviral desejada. Numa forma de realização, a construção rAAV está localizada na região E3 adenoviral do vírus híbrido rAd/AAV. Noutra forma de 13 realização adequada, a construção está localizado na região adenoviral EI do virus híbrido rAd/AAV. Contudo, a presente invenção não está limitada a estas realizações exemplificativas.

1. Sequências AAV

As sequências AAV empregues são, de um modo preferido, as sequências de repetição terminais invertidas 5' e 3" que actuam em cis [Ver, e. g., B. J. Cárter, em "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tisser, CRC Press, pp. 155-168 (1990)]. As sequências ITR são de cerca de 145 pb de comprimento. De um modo preferido, substancialmente todas as sequências codificantes para os ITRs são utilizadas na molécula, apesar de ser permitido algum grau de modificações menores destas sequências. A capacidade para modificar estas sequências ITR está incluída na técnica da matéria. [Ver, e. g., textos tais como Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (1989); Cárter et al., citado acima; e K. Fisher et al., J. Virol., 70: 520-532 (1996)]. Um exemplo de tal molécula empregue na presente invenção é um plasmídeo "que actua em cis" contendo o transgene, no qual a sequência do transgene seleccionada e os elementos reguladores associados estão rodeados pelas as sequências ITR de AAV 5' e 3' .

As sequências ITR de AAV podem ser obtidas por qualquer AAV conhecido, incluindo os tipos AAV humanos presentemente identificados. Do mesmo modo, os AAV conhecidos por infectar outros animais podem também proporcionar estes ITRs empregues nas moléculas ou construções desta invenção. Por exemplo, os ITRs podem ser proporcionados pelos AAV tipo 1, AAV tipo 2, AAV 14 tipo 3, AAV tipo 4, AAV tipo 5, AAV 6, outros AAV serotipos ou adenovirus. Várias estirpes AAV estão disponíveis na American Type Culture Collection ou estão disponíveis a pedido de uma variedade de outras fontes comerciais ou institucionais. Nas formas de realização exemplificativas que se seguem um VAA-2 é utilizado por conveniência. Contudo, a selecção da espécie e o serotipo de AAV que proporciona estas sequências está dentro da especialidade do técnico de acordo com os ensinamentos deste pedido e não limita a invenção que se segue. 2. Transgene

De acordo com a presente invenção, a construção rAAV contém uma molécula de ácido nucleico que compreende o transgene pretendido, um promotor, e outros elementos reguladores que controlam e dirigem a expressão do transgene numa célula hospedeira, rodeado pelas sequências AAV. A sequência do transgene é uma sequência de ácido nucleico, heteróloga à sequência AAV, que codifica um polipéptido ou proteína de interesse. A composição da sequência do transgene depende da utilização posterior para o rAAV resultante. Por exemplo, um tipo de sequência de transgene compreende um repórter ou sequência marcadora, que após expressão produz um sinal detectável. Tal repórter ou sequência marcadora inclui, sem limitação, sequências de ADN codificando β-lactamase, β-galactosidase (Lacz), fosfatase alcalina, timidina cinase, proteína verde fluorescente (GFP), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), luciferase, proteínas de ligação à membrana, incluindo por exemplo, CD2, CD4, CD8, a proteína de hemaglutinina influenza, e outras bem conhecidas na técnica, para as quais existem anticorpos de elevada afinidade dirigidos 15 a estes ou podem ser fabricados de forma rotineira, e proteínas de fusão compreendendo uma proteína de ligação à membrana fundida de forma apropriada a um domínio do marcador de antigénio, de entre outros, hemaglutinina ou Myc.

Estas sequências, quando associadas com elementos reguladores que podem conduzir à sua expressão, proporcionam sinais detectáveis por meios convencionais, incluindo ensaios enzimáticos, radiográficos, colorimétricos, fluorescência ou outros espectrográficos, ensaio de selecção celular activado com fluorescência, e ensaios imunológicos, incluindo ELISA, RIA e imuno-histoquímica. Por exemplo, sempre que o transgene é o gene LacZ, a presença de rAAV é detectada por ensaios para a actividade beta-galactosidase. Do mesmo modo, sempre que o transgene é a luciferase, rAAV pode ser medida por produção de luz num luminómetro.

Contudo, desejavelmente, o transgene é um gene não-marcador que pode ser entregue a uma célula ou um animal via rAAV produzido por este método. 0 transgene pode ser seleccionado de uma vasta variedade de produtos de genes úteis na biologia e medicina, tais como proteínas, ácidos nucleicos anti-sentido (e. g., ARNs) , ou ARNs catalíticos. A invenção pode ser utilizada para corrigir ou aliviar deficiências genéticas, em que os genes normais são expressos, mas a um nível inferior ao normal, e podem ainda ser utilizados para corrigir ou aliviar defeitos genéticos em que o produto funcional do gene não é expresso. Um tipo de sequência do transgene preferida é a de um gene terapêutico que expressa um produto génico pretendido numa célula hospedeira. Estas sequências de ácido nucleico terapêutico codificam tipicamente produtos que, após expressão, são capazes de corrigir ou complementar um defeito genético 16 herdado ou não-herdado, ou tratar um distúrbio epigenético ou doença. Contudo, o transgene seleccionado pode codificar qualquer produto pretendido para o estudo. A selecção da sequência do transgene não é uma limitação desta invenção. A escolha da sequência de um transgene está incluída na especialidade do técnico de acordo com os ensinamentos deste pedido. A invenção inclui também métodos de produção de rAAV que podem ser utilizados para corrigir ou melhorar um defeito do gene causado por uma proteína de várias subunidades. Em certas situações, um transgene diferente pode ser utilizado para codificar cada subunidade da proteína. Tal é pretendido quando o tamanho do ADN que codifica a subunidade da proteína é grande, e. q., para uma imunoglobulina ou receptor do factor de crescimento derivado das plaquetas. De modo a que a célula produza a proteína de várias subunidades, uma célula seria infectada com rAAV contendo cada uma das diferentes subunidades. Alternativamente, diferentes subunidades de uma proteína podem ser codificadas pelo mesmo transgene. Neste caso, um simples transgene poderia incluir o ADN codificando cada uma das subunidades com o ADN para cada subunidade separado por um local de entrada de um ribossoma interno (IRES). Tal é pretendido quando o tamanho do ADN codificando cada uma das subunidades é pequeno, de tal modo que o total do ADN codificando as subunidades e o IRES é menor que cinco quilobases.

Produtos de genes úteis incluem hormonas e factores de crescimento e diferenciação incluindo, sem limitação, insulina, glicogénio, hormona do crescimento (GH), hormona da paratiróide (PTH), factor de libertação da hormona de crescimento (GRF), hormona estimuladora do folículo (FSH), hormona luteinizante 17 (LH), gonadotropina coriónica humana (hCG), factor de crescimento do endotélio vascular (VEGF), angiopoietinas, angiostatina, factor de crescimento de colónias de granulócitos (GCSF), eritropoetina (EPO), factores de crescimento de tecidos conectivos (CTGF), factor de crescimento básico de fibroblastos (bFGF), factor de crescimento acidico de fibroblastos (aFGF), factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento transformante Ot (TGFa), factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), factor de crescimento semelhante à insulina I e II (IGF-I e IGF-II), quaisquer dos factores da superfamília dos factores de crescimento transformantes β (TGFP) compreendendo TGFp, activinas, inibitinas, ou quaisquer das proteínas morfogénicas ósseas (BMP) BMPs 1-15, quaisquer factores de diferenciação heregulina/neuregulina/ARlA/neu (NDF) da família dos factores de crescimento, factor de crescimento de nervos (NGF), factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), neurotrofinas NT-3 e NT-4/5, factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de linha celular glial (GDNF), neuturina, agrina, qualquer uma das famílias de semaforinas/colapsina, netrina-1 e netrina-2, factor de crescimento de hepatócitos (HGF), efrinas, noggins, "sonic hedgehog" e hidroxilase da tirosina.

Outros produtos de genes úteis incluem proteínas que regulam o sistema imunitário, incluem, sem limitação, citocinas e linfocinas tais como trombopoietina (TPO), interleucinas (IL) IL-la, IL-Ιβ, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, e IL-17, proteína quimioatractiva dos monócitos (MCP-1), factor inibidor da leucemia (LIF), factor estimulador de colónias granulocíticas-macrofágicas (GM-CSF), ligando Faz, factores de necrose tumoral α e β (TNFa e ΤΝΡβ), interferões (IFN) IFNa, 18 IFNp e IFNy, factor de células estaminais, ligando flk-2/flt3. Os produtos de genes produzidos pelo sistema imunitário estão também compreendidos por esta invenção. Estes incluem, sem limitações, imunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e gE, imunoglobulinas quiméricas, anticorpos humanizados, anticorpos de cadeia simples, receptores de células T, receptores quiméricos de células T, receptores de células T de cadeia simples, moléculas de MHC de classe I e classe II, assim como moléculas MHC modificadas incluindo moléculas MHC de cadeia simples. A utilização de produtos de gene inclui proteínas reguladoras de complemento tais como proteínas reguladoras de complemento, co-factor de proteína de membrana (MCP), factor acelerador de decaimento (DAF), CRI, CR2 e CD59.

Outros produtos de gene úteis incluem qualquer dos receptores para as hormonas, factores de crescimento, citocinas, linfocinas, proteínas reguladoras e proteínas do sistema imunitário. A invenção compreende receptores para a regulação do colesterol, incluindo o receptor LDL, receptor HDL, receptor VLDL, e o receptor macrofágico. A invenção também compreende produtos de genes tais como receptores da superfamília da hormona esteróide incluindo receptores glucocorticóides e receptores de estrogénio, receptores de vitamina D e outros receptores nucleares. Adicionalmente, produtos de genes úteis incluem factores de transcrição tais como jun, fos, max, mad, factores de resposta sérica (SRF), AP-1, AP-2, myb, MRG1, CREM, Alx4, FREAC1, NF-xB, membros da família da leucina "zipper", proteínas em dedo de zinco C2H4, incluindo Zif268, EGR1, EGR2, proteínas em dedo de zinco C6, incluindo os receptores de glucocorticóides e estrogénios, proteínas de domínio POU, exemplificadas por Pitl, proteínas de homeodomínio, incluindo HOX-1, proteínas básicas de hélice-ansa-hélice, incluindo, myc, 19

MyoD e miogenina, caixa ETS contendo proteínas, TFE3, E2F, ATFl, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, Sl, proteínas contendo caixa CCAAT, factor 1 de regulação do interferão (IRF-1), proteína do tumor de Wilms, proteína de ligação ETS, STAT, proteína de ligação GATA, por exemplo, GATA-3 e proteínas da família de cabeça de garfo ou de hélice em asas.

Outros produtos génicos úteis incluem sintetase I de carbamoílo, ornitina transcarbamilase, a sintetase de arginossuccinato, liase de arginossuccinato, arginase, hidrolase de fumarilacetoacetato, hidroxilase de fenilalanina, alfa-1 anti-tripsina, glucose-6-fosfato, receptor de lipoproteína de baixa densidade, desaminase de porfobilinogénio, factor VIII, factor IX, cistationa beta-sintase, descarboxilase cetoácido de cadeia ramificada, albumina, desidrogenase de isovaleril-CoA, carboxilase de propionilCoA, mutase de metilmalonilCoA, desidrogenase de glutarilCoA, insulina, beta-glucosidase, piruvato carboxilase, fosforilase hepática, fosforilase cinase, descarboxilase de glicina (também referido como proteína P) , proteína-H, proteína-T, proteína da doença Menkes, supressores tumorais (e. g., p53), regulador transmembranar da fibrose quística (CFTR), e o produto génico da doença de Wilson PWD.

Outros transgenes úteis incluem polipéptidos que não ocorrem naturalmente, tais como, polipéptidos quiméricos ou híbridos ou polipéptidos tendo uma sequência de aminoácidos que não ocorre naturalmente contendo inserções, deleções, ou substituições de aminoácidos. Por exemplo, imunoglobulinas modificadas de cadeia simples, podem ser úteis em certos doentes imunocomprometidos. Outros tipos de sequências de genes que não ocorrem naturalmente incluem moléculas de anti-sentido e ácidos 20 nucleicos catalíticos, tais como ribozimas, que podem ser utilizados para reduzir a sobre-expressão de um gene. A concepção do transgene para expressão em células de mamífero e hospedeiro devem incluir sequências apropriadas que estão ligadas funcionalmente ao gene de interesse para promover a sua expressão. Sequências de controlo de expressão incluem sequências apropriadas de iniciação de transcrição, terminação, de promotor e amplificador: sinais eficientes de processamento de ARN tais como sinais de excisão e de poliadenilaçâo; sequências que estabilizam o ARNm citoplasmático; sequências que amplificam a eficiência de tradução (i. e., sequência de consenso de Kozak); sequências que amplificam a estabilidade da proteína; e sempre que pretendido, sequências que amplificam a secreção proteica. Um grande número de sequências de controlo de expressão - nativas, constitutivas, indutíveis e/ou específicas do tecido - são conhecidas na técnica e podem ser utilizadas para controlar a expressão do transgene, dependendo do tipo de expressão pretendida. Para células eucarióticas, sequências do controlo de expressão incluem tipicamente um promotor, um amplificador, tal como o derivado de um gene de imunoglobulina, SV40, citomegalovírus, etc. e uma sequência de poliadenilaçâo que pode incluir locais de dador de excisão e receptor. A sequência de poliadenilaçâo é geralmente inserida a seguir às sequências do transgene e antes da sequência 3' ITR de AAV. A construção rAAV útil na presente invenção pode ainda conter um intrão, de preferência localizado entre a sequência do promotor/intensificador e o transgene. Outra possível sequência de intrão é também derivada do SV-40, e é referida como uma sequência de intrão SV-40 T. Outro elemento vector que pode ser utilizado é um local de entrada de ribossoma interno (IRES). Uma sequência IRES é utilizada para produzir mais que um polipéptido 21 de um só transcrito de gene. Uma sequência de IRES seria utilizada para produzir uma proteina que contém mais que uma cadeia polipeptidica. A selecção destes e outros elementos de vectores comuns são convencionais e muitas de tais sequências estão disponíveis [ver, e. g., Sambrook et al., e referências aí citadas, por exemplo, páginas 3.18-3.26 e 16.17-16.27 e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1989].

Numa forma de realização, será pretendida uma expressão constitutiva de elevado nível. Exemplos de tais promotores incluem, sem limitação, o promotor/intensificador do vírus retroviral de sarcoma Rous (RSV)LTR, o promotor/intensificador precoce imediato de citomegalovírus (CMV) [ver, e. g., Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)], o promotor SV40, o promotor da di-hidrofolato redutase, o promotor da β-actina citoplasmática e o promotor da fosfoglicerol cinase (PGK).

Noutra forma de realização, podem ser pretendidos promotores indutíveis. Os promotores indutíveis são aqueles que são regulados por compostos proporcionados externamente, incluindo sem limitação o promotor da metalometionina de carneiro induzido pelo zinco (MT); promotor do vírus indutor do tumor mamário de ratinho induzido por desametasona-(Dex) (MMTV); o sistema promotor da polimerase T7 [documento WO 98/10088]; o promotor da ecdisona de insecto [No et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93: 3346-3351 (1996)]; o sistema repressor da tetraciclina [Gossen et al, Proc, Natl. Acad. Sei. USA, 89: 5547-5551 (1992)]; o sistema indutível da tetraciclina [Gossen et al., Science, 268: 1766-1769 (1995); ver também Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2: 512-518 (1998)]; o sistema indutível RU486 [Wang et al., Nat. Biotech., 15: 239- 243 (1997) 22 e Wang et al., Gene Ther., _4: 432-441 (1997)]; e o sistema indutível rapamicina [Magari et al. J. Clin. Invest., 100: 2865-2872 (1997)]. Outros tipos de promotores indutiveis que podem ser úteis neste contexto são os que são regulados por um estado fisiológico especifico, e. g., temperatura, fase aguda, ou somente em células replicantes. Numa forma de realização preferida, o transgene está sob o controlo do promotor P5 de AAV nativo.

Noutra forma de realização, o promotor nativo para o transgene será utilizado. O promotor nativo pode ser preferido quando é pretendido que a expressão do transgene mimetize a expressão nativa. O promotor nativo pode ser utilizado quando a expressão do transgene tem que ser regulada temporariamente ou em termos de desenvolvimento, ou num modo dependente do tecido, ou em resposta a estímulos transcricionais específicos. Numa outra forma de realização, outros elementos de controlo da expressão, tais como elementos intensificadores, locais de poliadenilação ou sequências de consenso Kozak podem também ser utilizadas para mimetizar a expressão nativa.

Noutra forma de realização do transgene inclui o transgene funcionalmente ligado a um promotor específico de tecido. Por exemplo, se é desejada expansão no músculo esquelético, deve ser utilizado um promotor activo no músculo. Estes incluem os promotores de genes codificando a actina esquelética, miosina de cadeia leve 2A, distrofina, cinase da creatinina muscular, assim como promotores de músculo sintéticos com actividades superiores do que os promotores que ocorrem naturalmente [ver Li et al., Nat. Biotech., 17: 241-245 (1999)]. Exemplos de promotores que são específicos do tecido são conhecidos para o fígado [albumina, Miyatake et al. J. Virol., 71: 5124-32 (1997); 23 promotor central do vírus da hepatite B, Sandig et al., Gene Ther,, _3: 1002-9 (1996); alfa-fetoproteína (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)], osso [osteocalcina, Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997); sialoproteína óssea, Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11: 654-64 (1996)], linfócitos [CD2, Hansal et al., J. Immunol., 161: 1063-8 (1998); cadeia pesada da imunoglobulina; cadeia α do receptor das células T], neuronal [promotor da enolase neuro-específica (NSE), Andersen et al. Cell. Mol, Neurobiol., 13: 503-15 (1993); gene do neurofilamento de cadeia leve, Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88: 5611-5 (1991); o gene vgf neuro-específico, Piccioli et al., Neuron, 15: 373-84 (1995)]; entre outros.

Certamente, nem todos os vectores e sequências de controlo de expressão funcionarão de igual modo a expressar os transgenes desta invenção. Contudo, um especialista na técnica, pode fazer uma selecção entre estas sequências que controlam a expressão sem fugir do âmbito desta invenção. Sequências promotoras/intensificadores adequadas podem ser seleccionadas por um especialista na técnica utilizando a indicação dada por este pedido. Tal selecção é matéria de rotina e não é uma limitação da molécula ou da construção. Por exemplo, podemos seleccionar uma ou mais sequências de expressões de controlo e ligar operacionalmente a sequência a um transgene de interesse, e inserir o "minigene" compreendendo a sequência de controlo de expressão e o transgene num vector AAV. Após seguir um dos métodos de empacotamento de rAAV ensinados nesta especificação, ou como ensinado na técnica, podemos infectar células adequadas in vitro ou in vivo. O número de cópias do transgene na célula pode ser monitorizado por transferência de Southern ou por reacçâo em cadeia da polimerase quantitativa (PCR); o nível da 24 expressão de ARN pode ser monitorizado por transferência de Northern ou por transcriptase reversa quantitativa (RT)-PCR; e o nivel de expressão proteica pode ser monitorizado por transferência de Western, imuno-histoquimica, ensaio imuno-absorvente ligado a enzima (ELISA), radio-imunoensaio (RIA), ou testes de actividade biológica dos produtos de genes dos transgenes. Assim sendo, podemos facilmente determinar se uma sequência de controlo de expressão particular é adequada para um transgene especifico, e escolher a expressão da sequência de controlo mais apropriada para a expressão do transgene pretendido.

C. Produção do vírus híbrido rAd/AAV

Os virus híbridos rAd/AAV da invenção podem ser construídos e produzidos utilizando os materiais e métodos aqui descritos, assim como os conhecidos pelos especialistas na técnica. Tais métodos de modificação utilizados para construir qualquer forma de realização desta invenção são conhecidos pelos especializados na manipulação de ácidos nucleicos incluindo modificação genética, modificação recombinante e técnicas sintéticas. Ver, e. g., Sambrook et al., e Ausubel et al., citados acima; e Pedido de Patente International N° W095/13598. Mais ainda, foram descritos métodos adequados para a produção de uma cassete rAAV numa cápside adenoviral na U.S. Pat. NoS 5 856 152 e 5 871 982.

Porque o vírus híbrido rAd/AAV da invenção é competente na replicação, pode ser produzido por infecção e replicação numa célula hospedeira seleccionada, utilizando técnicas conhecidas dos especialistas da técnica e como aqui descrito. Ver Patente US N° 5 856 152 e 5 871 982, e discussão de métodos de infecção 25 e cultura de uma célula hospedeira com o rAd/AAV descrito a seguir na Parte II.

II. Produção de rAAV 0 método d invenção proporciona a produção de rAAV utilizando um rAd/AAV de replicação competente. Numa forma de realização preferida particular o rAd/AAV utilizado no método da invenção proporciona a cassete rAAV e todas as sequências adenovirais necessárias a célula hospedeira, evitando assim a necessidade de uma segunda infecção ou transfecção com um virus auxiliar. Mais adequadamente, o vírus híbrido rAd/AAV é modificado como aqui descrito de forma que os produtos do gene adenoviral necessários para a replicação do vírus híbrido são expressos pelo vírus híbrido rAd/AAV.

De forma breve, a célula hospedeira seleccionada é infectada com um vírus híbrido rAd/AAV. Assim que o vírus híbrido rAd/AAV é tomado pela célula, o transgene contíguo AAV ITR tem que ser libertado da estrutura do adenovírus proporcionando à célula infectada um gene rep de AAV, que de um modo preferido está presente na célula hospedeira de empacotamento. 0 genoma recombinante AAV é empacotado proporcionando a célula infectada com um gene cap de AAV, que está, de um modo preferido, presente na célula de empacotamento hospedeira.

Independentemente do rAd/AAV utilizado na produção do rAAV, crítico para a produção óptima de rAAV, o método desta invenção inclui um passo que controla (i. e., inibe ou extingue) a capacidade do rAd/AAV para replicar a um tempo seleccionado a 26 seguir à infecção das células hospedeiro. Este passo aumenta a capacidade da construção rAAV transportada pelo rAd/AAV ser salvo e empacotado no virião rAAV. Tal pode ser atingido por uma variedade de meios, que são descritos em maior detalhe aqui.

A. Sequências Rep e Cap de AAV

De forma a empacotar a construção rAAV proporcionada pelo híbrido rAd/AAV num virião rAAV, uma célula hospedeira deve conter sequências necessárias para expressar rep de AAV e cap de AAV ou seus fragmentos funcionais. Por exemplo, as proteínas rep78/52 podem ser suficientes para proporcionar as funções rep necessárias. As sequências rep de AAVe cap são obtidas de uma fonte AAV como definido acima. As sequências rep de AAVe cap podem ser introduzidas na célula hospedeira de qualquer modo conhecido na técnica tal como descrito acima, incluindo, sem limitação, transfecção, electroporação, distribuição por lipossoma, técnicas de fusão de membrana, depósito de alta velocidade revestido por ADN, infecção virai e fusão protoplasto. Numa forma de realização, as sequências rep e cap podem ser transfectadas na célula hospedeira por uma ou mais moléculas de ácidos nucleicos e permanecer estável na célula como um epissoma. Noutra forma de realização as sequências rep e cap são integradas no genoma da célula de forma estável. Uma linha celular hospedeira estável que contenha rep e cap é a B-50, descrita no documento PCT/US98/19463. Outra forma de realização tem as sequências rep e cap expressas de forma transiente na célula hospedeira. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico útil para tal transfecção compreende, de 5' para 3", um promotor, um espaçador opcional interposto entre o promotor e o local de início da sequência do gene rep, uma sequência de gene AAV rep, e uma sequência de gene cap de AAV. 27

As sequências rep e cap, a par das suas sequências de expressão, podem ser fornecidas num único vector, ou cada sequência pode ser fornecida no seu próprio vector. De um modo preferido, as sequências rep e cap são fornecidas no mesmo vector. Alternativamente, as sequências rep e cap podem ser fornecidas num vector que contenha outras sequências de ADN que serão introduzidas nas células hospedeiras.

De um modo preferido, o promotor utilizado nesta construção pode ser qualquer dos promotores constitutivos, indutiveis ou nativos conhecidos pelos especialistas na técnica ou como discutido acima. Numa forma de realização preferida, é empregue uma sequência de promotor P5 de AAV. Apesar de poder ser obtido das fontes de AAV acima mencionadas o promotor do parvovirus P5 é de um modo preferido homólogo do serotipo AAV que proporciona as sequências genéticas rep e cap. Alternativamente, o promotor pode ser um promotor P5 de outro tipo de AAV diferente daquele que proporciona as sequências rep e cap. Os AAVs conhecidos por infectar outros humanos ou outros animais podem também proporcionar o promotor P5. A selecção do AAV para proporcionar quaisquer destas sequências não limita a invenção.

Noutra forma de realização preferida, o promotor para rep é um promotor indutivel. Tal como discutido acima, promotores indutiveis incluem, sem limitação, o promotor metalotionina (MT) , o promotor do vírus do tumor mamário de ratinho induzido por desametasona -(Dex) (MMTV), o sistema promotor da polimerase T; o promotor ecdisona de insecto; o sistema repressor da tetraciclina; o sistema indutivel da tetraciclina; o sistema indutivel RU486; e o sistema indutivel rapamicina. Um promotor preferido para a expressão rep é o promotor T7. 0 vector 28 compreendendo o gene rep regulado pelo promotor T7 e o gene cap, é transfectado ou transformado numa célula com que expressa quer constitutivamente quer indutivelmente a polimerase de T7. Ver documento WO 98/10088, publicada em Março 12, 1998. O espaçador é um elemento opcional na concepção do vector. O espaçador é uma sequência de ADN interposta entre o promotor e o sitio de inicio ATG do gene rep. O espaçador pode ter qualquer concepção pretendida; isto é, pode ser uma sequência aleatória de nucleótidos, ou alternativamente, pode codificar um produto génico, tal como um gene marcador. O espaçador pode conter genes que tipicamente incorporam sítios início/terminação e poliA. O espaçador pode ser uma sequência de ADN não codificante de um procariota ou eucariota, uma sequência repetitiva não codificante, uma sequência codificante sem controlos de transcrição ou sequências codificantes com controlos de transcrição. Duas fontes exemplares de sequências espaçadoras são as sequências em escada de fago λ ou as sequências em escada de levedura, as quais estão disponíveis comercialmente, e. g., da Gibco ou Invitrogen entre outras. O espaçador pode ser de qualquer tamanho suficiente para reduzir a expressão dos produtos dos genes rep78 e rep68, deixando os produtos dos genes rep52, rep40 e cap expressos a níveis normais. O comprimento do espaçador pode desta forma estar na gama de 10 pb a cerca de 10,0 Kpb, de um modo preferido, no intervalo de cerca de 100 pb a cerca de 8,0 Kpb. Para reduzir a possibilidade de recombinação, o espaçador é, de um modo preferido, menor que 2 Kpb em comprimentos; no entanto a invenção não é tão limitada.

Moléculas exemplificativas que proporcionam as proteínas rep e cap de AAV são os plasmídeos, e. g., pMT-Rep/Cap, pP5-Rep/Cap e pMMTV-Rep/Cap. Cada um destes plasmídeos contém um 29 gene marcador selectivo de neomicina e expressa os genes AAV rep/cap controlados ou por o seu promotor P5 nativo (pP5-Rep/Cap), o promotor da metalotionina de carneiro induzido pelo zinco (pMTRRep/Cap) ou o promotor do virus do tumor mamário de ratinho induzido por desametasona (Dex) (MMTV) (pMMTV-Rep/Cap). Embora estas proteínas possam ser proporcionadas à célula por vários meios, os métodos exemplificativos da invenção incluem a utilização de vários plasmideos. Para construção do plasmideo pMT-Rep/Cap, a sequência 0RF6 foi removida do plasmideo pMTE40RF6 [G. P. Gao et al., J. Virol., 70: 8934-8943 (1996)] por digestão com BamHI e substituição com um sequência 4,1 Kb do fragmento rep/cap que foi preparado por amplificação de PCR utilizando o plasmideo pSub201 [Samulski, R. J. et al., J. Virol., 63: 3822-3828 (1989)] como molde. O plasmideo pMMTV-

Rep/Cap foi construído da mesma forma que o pMT-Rep/Cap, excepto que o plasmideo pMMTVE40RF6 [Gao et al., citado acima] foi utilizado como a estrutura do vector. Para construção do P5-Rep/Cap o promotor MT e as sequências ORF6 foram removidas do plasmideo pMTE40RF6 [G. P. Gao et al., J. Virol., 70: 8934-8943 (1996)] por digestão com EcoRI/BamHI e substituídas com um fragmento P5-Rep/Cap de 4,3 Kb que foi isolado de um plasmideo pSub201 [Samulski, R. J. et al, J. Virol., 63: 3822-3828 (1989)] por digestão com Xbal. A construção do plasmideo envolveu métodos genéticos de modificação convencionais, tais como aqueles descritos em Sambrook et al, citado acima. Todas as referências citadas acima estão incorporadas por referência aqui.

Uma variedade de outras construções de plasmideos proporcionando as proteínas rep e cap são conhecidas na técnica e podem ser empregues na célula hospedeira da invenção. Por exemplo, as construções rep/cap podem omitir o espaçador entre o 30 promotor e os referidos genes rep/cap na construção descrito acima. Outras construções da técnica como as descritas na Patente US N° 5 622 856, que coloca o promotor P5 a 3' dos genes rep/cap, podem ser também utilizadas neste contexto. A molécula que proporciona as proteínas rep e cap pode estar em qualquer forma que transfira esses componentes para a célula hospedeira. Como exemplificado aqui, esta molécula está, de um modo preferido, na forma de um plasmídeo, que pode conter outras sequências não-virais como aquelas para genes marcadores. Esta molécula não contém as ITRs do AAV e geralmente não contém as sequências do AAV empacotadoras. Para evitar a ocorrência de recombinação homóloga, outras sequências virais particularmente aquelas dos adenovírus são evitadas neste plasmídeo. Este plasmídeo é desejavelmente construído de modo a ser transfectado de forma estável para uma célula.

Embora a molécula que proporciona rep e cap poder ser transitoriamente transfectada para a célula hospedeira é preferido que a célula hospedeira seja transformada de forma estável com sequências necessárias de modo a expressar as proteínas funcionais rep/cap na célula hospedeira, e. g., como um epissoma ou por integração no cromossoma da célula hospedeira. Dependendo do promotor que controla a expressão de tal célula hospedeira transfectada de forma estável, as proteínas rep/cap podem ser expressas transientemente (e. g., através da utilização de um promotor indutível).

Os métodos empregues para construção das formas de realização desta invenção são técnicas de modificação genética convencional ou de recombinante tal como aquelas descritas nas referências acima. Enquanto esta especificação proporciona 31 exemplos ilustrativos de construídos específicos, utilizando a informação fornecida aqui, um especialista na técnica pode seleccionar e conceber outras construções apropriados utilizando uma escolha de espaçadores, promotores P5, e outros elementos, incluindo pelo menos um sinal de início e de terminação de tradução, e adição opcional de locais de poliadenilação. B. Células hospedeiras A própria célula hospedeira de mamífero pode ser seleccionada de qualquer espécie de mamífero, tal como tipos de células humanas, incluindo, sem limitação, células tais como A54 9, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHk, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, células 293 (que expressam adenoviral EI funcional), Saos, C2C12, células L, HT1080, fibroblastos HepG2 e primários, hepatocitos e células mioblásticas derivadas de mamíferos incluindo humano, macaco, ratinho, rato, coelho e hamster. A selecção da espécie de mamífero que proporciona as células não é uma limitação desta invenção; nem o tipo de célula de mamífero, i. e., fibroblasto, hepatocito, célula tumoral, etc. Os requerimentos para a célula utilizada é que não devem transportar genes virais que resultem na recombinação homóloga de um vírus contaminante durante a produção de rAAV; e tem de ser capaz de transfectar o ADN e expressar o ADN transfectado.

Numa forma de realização preferida a célula hospedeira é tal que tenha o rep e cap transfectado de forma estável na célula, tal como a linha celular B50. Outra linha celular que expressa rep/cap de forma estável tais como as descritas na Patente U.S. N° 5 658 785, podem também ser empregues de forma semelhante. Noutra forma de realização adequada, a célula 32 hospedeira é estavelmente transfectada com as sequências necessárias para expressar quaisquer produtos de gene adenoviral necessários para replicação do virus híbrido rAd/AAV em falta no vírus híbrido.

Por exemplo, quando o vírus híbrido rAd/AAV carece da sequência E4 0RF6 adenoviral, a linha celular seleccionada é modificada para ser transfectada de forma estável com as sequências necessárias para expressão da proteína E4 0RF6. Nesta situação, a linha celular é de um modo preferido uma que contenha as sequências para expressão de rep/cap. Após a infecção da célula por rAd/AAV as funções Ela e Elb expressas pelo vírus híbrido iniciam a expressão das funções rep/cap pela célula hospedeira. Por conseguinte, a expressão de E4 0RF6 é iniciada desejavelmente proporcionando o agente necessário para induzir o promotor que controla a função E4 0RF6 a expressar o produto génico E4 0RF6.

Tal como discutido aqui, esta invenção pode utilizar células das seguintes formas de realização ilustrativas: (a) uma célula transfectada de forma estável com os genes rep e cap de AAV ou (seus fragmentos funcionais) e o produto génico E4 0RF6 do adenovírus; (b) uma célula transfectada de forma estável com os genes rep e cap de AAV ou (seus fragmentos funcionais) e o produto génico E2a do adenovírus e o adenovírus E4 0RF6; (c) uma célula transfectada de forma estável com os genes rep e cap de AAV ou (seus fragmentos funcionais) transportado por um epissoma ou integrados nos cromossomas 33 da célula e expressos transientemente os produtos génicos E2a do adenovírus; (d) uma célula transfectada de forma estável com pelo menos um gene rep e cap de AAV e os produtos génicos E2a do adenovírus (ou seus fragmentos funcionais); e (e) uma célula transfectada de forma estável com o gene AAV rep, o gene cap de AAV, o gene E2a (ou seus fragmentos funcionais) estabilizado como um ou mais epissomas ou como ADN integrado, e que expressa transientemente o transgene contendo a molécula de ácido nucleico.

Quando a célula hospedeira e o vírus híbrido rAd/AAV não proporcionam as sequências rep e/ou cap necessárias e nenhuma das sequências adenovirais requeridas, estas sequências podem ser introduzidas dentro da célula hospedeira por qualquer processo adequado, incluindo, por exemplo, transfecção, electroporação, distribuição por lipossomas, técnicas de fusão de membrana, sedimento coberto de ADN gerado por alta-velocidade, infecção virai e fusão protoplástica.

Por exemplo, se nem a linha celular hospedeira nem o vírus híbrido rAd/AAV da invenção expressam o produto génico E2a, o ADN do adenovírus que expressa o produto génico E2a pode ser providenciado à célula hospedeira na forma de sequência de ácido nucleico que também inclui um promotor dirigindo o controlo da expressão do produto génico E2a e outros componentes reguladores opcionais. 0 promotor para E2a pode ser constitutivo, indutível ou promotor nativo, como discutido acima. Enquanto o promotor em controlo da expressão do produto génico E2a pode ser um promotor constitutivo em certas formas de realização, numa forma de 34 realização preferida, o promotor deverá ser um promotor indutível de forma a controlar a quantidade e o tempo de geração do produto génico E2a (o qual é tóxico para a célula após excessiva acumulação [D. Brough et al., Virology, 190:624-634 (1992) e D. Klessig et al., Virus Res. _1:169—188 (1984)] relativamente à produção dos produtos do gene EI. Uma forma de realização preferida proporciona que o promotor controlando a produção de E2a seja um promotor indutível diferente daquele que controla a expressão de Ela e Elb, e que seja indutível pela exposição a um agente indutor diferente daquele usado pelo promotor indutível de El. A introdução de uma molécula de ácido nucleico (um plasmídeo ou vírus) na célula hospedeira e a preparação de uma célula hospedeira útil a esta invenção pode também ser conseguida usando técnicas conhecidas do especialista e como discutido através da especificação. As técnicas para construção de moléculas de ácido nucleicos incluem ADNc e clonagem genómica, as quais são bem conhecidas e estão descritas em Sambrook et al. e Ausubel et al., citados acima, utilização de sobreposição de sequências de oligonucleótidos dos genomas de adenovírus e de AVV, combinados com reacção de polimerase em cadeia, métodos sintéticos e quaisquer outros métodos adequados que forneçam a sequência de nucleótidos pretendida. Numa forma de realização preferida, as técnicas de transfecçâo convencionais são usadas, por exemplo, transfecçâo ou electroporação por CaP04, e/ou infecção por vectores híbridos adenovírus/AAV dentro das linhas celulares como a linha celular humana de células renais embrionárias HEK 293 (uma linha celular de células renais humanas contendo genes de adenovírus El funcionais que proporcionam proteínas que actuam em trans) e as 35 linhas celulares B50 (uma linha celular HeLa contendo os genes rep e cap estavelmente integrados).

D. Métodos para a Produção de rAAV

Como descrito acima, a invenção proporciona um método para produção de vírus recombinantes adeno-associados (rAAV) na ausência de vírus auxiliares contaminantes ou vírus tipo selvagem. De forma adequada, a célula hospedeira é infectada com o vírus híbrido rAd/AAV numa multiplicidade de infecção (a gama de cerca de 0,5 a cerca de 1000 ou à volta disso, por exemplo, cerca de 1 a cerca de 500, cerca de 10 a cerca de 250, e cerca de 50 a cerca de 200. O método de produção de viriões rAAV envolve a cultura de células hospedeiras de mamífero contendo um vírus híbrido rAd/AAV como descrito aqui, o qual contém um contruído rAAV para ser empacotado num virião rAAV, uma sequência rep de AAV e uma sequência cap de AAV sob o controlo de sequências reguladoras que controlam a expressão deste. Assim, o virião recombinante AAV que controla a expressão do transgene é isolado a partir de uma célula ou cultura de células na ausência de vírus auxiliares contaminantes ou AAV de tipo selvagem.

As técnicas convencionais aplicadas neste método incluem a clonagem de genoma virais de rAAV, e métodos de medida de geração de sinal, e semelhantes. Nenhum passo de purificação é necessário para detectar mensagem ou sinal ou para separar rAAV dos outros vírus. Em geral, na produção, as técnicas de purificação convencionais como a centrifugação por gradiente de cloretos ou cromatografia de coluna são utilizadas para 36 concentrar o rAAV a partir de proteínas celulares no lisado. Por exemplo, as células juntas com o meio da transfecção são colhidas por raspadores e sujeitas a três ciclos de congelação-descongelação em gelo seco-etanol e banho maria a 37 °C. As células podem ser centrifugadas, e. g., por 15 minutos a 4 °C.

Porque o vírus híbrido Ad/AAV da invenção é de replicação competente, a seguir à infecção das células hospedeiras seleccionadas, de modo a optimizar a produção de viriões de rAAV, deve ser pretendido controlar a capacidade do vírus híbrido rAd/AAV para replicar, de modo a aumentar a capacidade da construção AAV de ser libertado e empacotado em viriões rAAV. A capacidade do vírus híbrido rAd/AAV de replicar após a infecção pode ser inibida através de uma variedade de abordagens que serão rapidamente evidentes para os especialistas na técnica.

Por exemplo, numa particular forma de realização, a célula hospedeira é infectada com o vírus híbrido rAd/AAV contendo uma mutação sensível à temperatura num gene adenoviral necessário à replicação adenoviral e/ou ao empacotamento (e. g., o gene E2b adenoviral) a uma MOI de cerca de 100 a cerca de 200. Assim, a célula hospedeira é cultivada a uma temperatura de cerca de 32 °C até cerca de 37 °C e os rAAV isolados como descrito aqui.

Como ilustrado nos exemplos abaixo, este método tem vindo a mostrar que proporciona um rendimento superior de rAAV. Um exemplo de rAd adequado contendo a mutação sensível à temperatura é a sub lOOr, a qual tem sido descrita [Schaack, J. et al., J. Virol., 69: 4079-4085 (1995)].

Adicionalmente, ou alternativamente, a expressão de um ou mais dos genes adenovirais necessários para a replicação do 37 rAd/AAV deve ser controlada. Por exemplo, o adenovírus E4 (ou E4 0RF6) é expresso sob o controlo de um promotor indutível, pelo rAd/AAV ou pela célula hospedeira onde o vírus híbrido rAd/AAV não expressa este produto génico. Noutro exemplo, os produtos dos genes adenovirais EI e E2a são expressos sob o controlo de pelo menos um promotor indutível. Desta forma, este método ainda inclui o passo de contacto das células hospedeiras com pelo menos um agente indutível, que controla a expressão de pelo menos um dos produtos requeridos do gene do adenovírus. Quando cada produto génico adenoviral requerido está sob controlo de um diferente promotor indutível, o método compreende ainda os passos de adicionar à cultura de células hospedeiras um primeiro agente indutor para o primeiro promotor indutível e um segundo agente indutor para o segundo promotor indutível. Esta forma de realização assim permite a expressão controlada de produtos do gene adenoviral, e. g., os genes adenovirais Ela, Elb, E2a, e/ou E4 0RF6. Além disso, esta invenção permite ainda a expressão dos produtos do gene adenoviral (por exemplo, Ela e Elb) numa razão preferida para a expressão de outro produto(s) do gene adenoviral (e. g., E2a) que é óptimo para a produção de rAAV na célula hospedeira em particular sob condições de cultura adequadas para essa célula. A determinação da razão adequada entre os produtos do gene El e os produtos do gene E2a e os produtos rep/cap de AAV pode ser conseguida por um especialista na técnica, tomando em consideração o tipo celular, a força do promotor constitutivo e/ou indutível utilizado, a quantidade do(s) indutores utilizados, e a ordem ou o tempo da indução dos produtos genéticos preferidos. A razão óptima que permite a produção máxima de rAAV pode diferir como estes factores diferem. Por exemplo, quando o gene Ela é controlado por um promotor 38 constitutivo fraco ou de força média, o gene E2a deve ser controlado por um promotor indutivel forte and o agente indutor adicionado precocemente à cultura de forma a obter uma razão adequada. Na situação em que o gene Ela é controlado por um promotor indutivel, assim como o gene E2a, os dois agentes indutores podem ser adicionados em quantidades variadas e em várias sequências de indução para providenciar a produção do sistema óptimo para rAAV. No entanto, esta experimentação de optimização empregue para determinar quantidades preferidas e ordens está bem dentro da especialidade da técnica e é meramente rotineira à luz das revelações aqui realizadas.

Noutra forma de realização do método, o produto génico Ela é expresso sob o controlo de um promotor indutivel e os genes Elb e E2a, bem como outros genes adenovirais (por exemplo, E40RF6 e/ou VAI ARN) que estão presentes, são expressos sob o controlo do seu promotor nativo. Como discutido acima, o produto génico Ela activa os promotores nativos de Elb, E2a e quaisquer outros genes adenovirais. Qualquer promotor indutivel pode ser utilizado desde que expresse baixos níveis basais de Ela quando a célula está não induzida e altos níveis de Ela quando a célula contacta com um agente indutor. Vários promotores indutíveis são conhecidos na técnica e têm sido discutidos ao longo da especificação. Promotores indutíveis específicos incluem, sem limitação, o promotor metalotionina (MT) de carneiro induzido pelo zinco; o promotor do vírus do tumor mamário do ratinho induzido pela dexametasona (Dex); o promotor de insecto ecdisona; o sistema repressor de tetraciclina; o sistema indutor de tetraciclina; o sistema indutor RU486; e o sistema indutor de rapamicina. 39

Os exemplos seguintes ilustram vários métodos preferidos da invenção. Estes exemplos são apenas ilustrativos e não são pretendidos como limitantes do âmbito desta invenção.

Exemplo 1 - Utilização da Linha Celular B-50 e do Vector Híbrido Ad/AAV Para a Produção de uma Linha Celular Auxiliar Independente

Um vector híbrido recombinante Ad/AAV é construído utilizando os métodos descritos na Pat. U.S. N° 5 856 152 excepto que o gene E3 está removido e o gene EI operacionalmente ligado e sob o controlo do promotor RSV ou PGK, é clonado na região E3 do genoma adenoviral. 0 vector híbrido Ad/AAV é empacotado como descrito na Pat. U.S. N° 5 856 152.

Sumariamente descrito, B-50 é uma célula que expressa de forma estável os genes rep tipo 2 e cap de AAV sob o controlo do promotor homólogo p5. Esta linha celular é caracterizada pela integração de múltiplas cópias (pelo menos 5 cópias) de cassetes genéticas P5-rep-cap numa forma concatamérica no cromossoma hospedeiro. Esta linha celular B-50 foi depositada com a American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 em 18 de Setembro, 1997 sob o N° de Acesso CRL-12401 seguindo os requisitos do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos com o Objectivo de Procedimentos em Patentes.

As células B-50 são cultivadas a uma densidade de 2 x 105 células por placa de 60 mm durante 24 horas. Vinte e quatro horas mais tarde, o meio de cultura (DMEM/FBS a 10% suplementado com antibióticos) é substituído por DMEM/FBS a 2%. As células 40 são infectadas com o clone recombinante Ad/AAV contendo EI e o minigene rAAV no MOI apropriado. Este passo de infecção das células B-50 proporciona todos os genes auxiliares requeridos para a produção de rAAV. Assim, não haverá necessidade de outros vírus auxiliares como o sub lOOr.

De vinte e quatro horas a noventa e seis horas após a infecção, os lisados celulares são preparados e o lisado é titulado para a produção de rAAV por qualquer processo conhecido na técnica. Se o rAAV é rAAVLacZ, o lisado pode ser titulado como se segue. As células juntas com o meio de transfecção são cultivadas por raspadores e sujeitas a três ciclos de congelação-descongelação em gelo seco-etanol e banho de água a 37 °C. As células são centrifugadas a 3000 rpm numa centrífuga de bancada durante 15 minutos a 4 °C. Um décimo de cada lisado é usado para infectar células 84-31, uma linha celular complementar dupla E1/E4 que é transduzível por rAAV, por 24 horas. As células 84-31 são depois coradas histoquimicamente com X-GAL. O número de células azuis em cada infecção, é contado e apresentado como Unidades Infecciosas (UI, 1UI foi definida como uma célula azul contada) de rAAVLacZ produzida em cada transfecção.

Exemplo 2 - Produção de rAAV em Células B50 por Replicação Competente de Vírus Híbridos Ad-VAA

Um genoma rAAVCMVGFP em que um gene repórter de Proteína Verde Fluorescente (GFP) é comandado por um promotor CMV e ladeado por ITRs AAV2 foi clonado numa região E3 de um mutante Ad5, vírus sub lOOr. O gene da proteína terminal E2b de sub lOOr foi destruído por uma inserção de 3 pb, originando um fenótipo 41 sensível à temperatura. 0 recombinante híbrido Ad-AAV resultante é genotipicamente de tipo selvagem para os genes El, E2a, E4 e VARNA mas os seus genes E3 são agora substituídos com um genoma rAAVCMVGFP. Assim esta segunda geração de híbridos Ad-VAA possuem todos os genes auxiliares e um genoma rAAV e, teoricamente, uma única infecção de células B-50 com o vírus deve levar à libertação, replicação e empacotamento de genomas rAAV.

A. Construção de um vírus híbrido competente para replicação rAd-VAA

Uma construção plasmídica pAB27 comercialmente disponível foi adquirida a Microbix Biosystems (Ontario, Canadá). Contém os seguintes segmentos do genoma Ad5: u.m. 0-1, 10,6 - 16,1, e 69-100 com uma deleção de 2,7 kb em E3 estendendo-se u.m. 78,3 n 85,8. Um genoma recombinante AAVCMVGFP foi isolado a partir da construção prAAVCMVGFP [um produto Clonetech contendo GFP aumentada, EGFP] como um fragmento Pvu II e clonado no local Seal do plasmídeo pAB27. O plasmídeo de transporte resultante foi designado por pABrAAVCMVEGFP [Fig, IA]. Um mutante da proteína terminal E2B, sub lOOr foi escolhido como estrutura virai para construir o novo híbrido Ad-AAV que é condicionalmente de replicação competente à sua temperatura permissiva de 32 °C. Para introduzir o rAACCMVEGFP no genoma sub lOOr, o ADN sub lOOr virai foi digerido com a endonuclease de restrição Spel e co-transfectado com pABrAAVCMVEGFP em célula 293 pelo método do fosfato de cálcio. As células transfectadas foram cobertas com agar no cimo e cultivadas a 32 °C por 14 dias. As placas virais verdes de sub lOOr-rAAVCMVGFP foram isoladas para mais purificação em placa e expansão para uma 42 prep. virai de grande escala. Veja-se Fig. 1B para ilustração do processo de recombinação homólogo para gerar vírus híbridos SublOOrAAVCMVGFP.

B. Produção de rAAV

As células B50 foram semeadas em placas de 12 poços a uma densidade de 1 x 105 células por poço. Após vinte e quatro horas, as células foram infectadas com o híbrido sub lOOrAAVCMVGFP a 100, 1000, 2000, e 4000 partículas virais por célula. Para cada infecção, triplicados de placas de 12 poços foram preparados para incubação a temperaturas diferentes, 32, 37 e 39,5 °C. Como controlos positivos, foram infectadas em 12 poços células B50 com o auxiliar tipo selvagem Ad5 e sub lOOrAAVCMVGFP a uma MOI descrita acima ou em simultâneo ou com um intervalo de 24 h. Às 72, 96 e 120 horas após a infecção, o total de lisado celular de cada infecção foi colhido. Após ter passado por três ciclos de congelação/descongelação, o lisado foi centrifugado a 3000 rpm e colocado a 4 °C por 15 minutos. O sobrenadante resultante de cada amostra foi colhido e armazenado a -80 °C. Para

quantificação de rAAVCMVGFP produzido em cada infecção, uma parte de cada amostra foi aquecida a 56 °C por 1 hora para inactivação do híbrido infeccioso Ad-AAV sublOOr-AAVCMVGFP e colocado em células 84-31, um clone celular complementar de E1/E4, em diluições seriadas. As Unidades Formadoras de Fluorescência Verde (GFFU) de cada amostra foram contadas num microscópio-UV a 24-48 h após infecção e calculadas como GFFU por linha celular B50 utilizado na infecção inicial sublOOrAAVCWGFP. Uma GFFU foi aqui definida pelo foco de GFP transduzido pelo vírus rAAVCMVGFP numa infecção em diluição limitante. Assim as GFFU por célula representam os rAAVCMVGFP 43 produzidos por cada célula B50 sob o correspondente esquema experimental. C. Optimização da utilização do híbrido rAd-VAA para a produção de AAV em células B50

Uma série de experiências foram concebidas para optimizar as condições de modo a obter o rendimento máximo de rAAV produzido por este novo sistema B50/híbrido e para comparar com o sistema original B50/hibrido. 0 sistema hibrido replicação competente/B50 pode produzir cerca de 1/3 - 1/6 de rAAVCMVGFP produzido na presença de vírus Ad auxiliar na experiência inicial. Os resultados sumariados na Tabela 1 demonstraram a viabilidade da utilização do sistema infeccioso B50/híbrido replicação competente Ad-AAV para a produção de rVAA. 44

Tabela 1

Esquema Experimental Rendimento de rAAVCMVGFP por célula 72 h 96 h 120 h Ad5 Wt + sub 100rAAVCMVGFP Intervalo de 24 h a 37 °G (controlo positivo) 100 pts por cada célula 360 292 260 1000 pts por cada célula 356 288 200 2000 pts por cada célula 136 124 100 4000 pts por cada célula 44 40 24 sub lOOrAAVCMVGFP apenas a 37 °C 100 pts por cada célula 13,2 66 70, 4 1000 pts por cada célula 4, 6 10, 4 9,3 2000 pts por cada célula 0, 5 1, 1 1,3 4000 pts por cada célula 0, 8 1,5 3,7 sub lOOrAAVCMVGFP apenas a 32 °C 100 pts por cada célula 0, 44 10 50 1000 pts por cada célula 0, 6 Ia 12, 8 2000 pts por cada célula 1, 5 2, 0 7,2 4000 pts por cada célula 1, 7 3, 2 3, 6 sub lOOrAAVCMVGFP apenas a 39.5 °C 100 pts por cada célula 0, 1 0, 1 0,2 1000 pts por cada célula 2, 1 2, 4 2,7 2000 pts por cada célula 1, 6 1, 4 0,6 4000 pts por cada célula 1, 8 1, 8 1,2

Os dados apresentados aqui sugerem que, sob as condições experimentais testadas, o sistema híbrido B50/AdVAA de replicação competente pode produzir rAAV. Mas a quantidade máxima produzida desce para 3-6 vezes comparada com o controlo positivo onde as células B50 foram infectadas com o Ad5Wt auxiliar e com o híbrido com um intervalo de 24 h. 0 sistema de 45 infecção único funcionou muito melhor a 32 °C e a 37 °C quando comparado com 39,5 °C.

Foi colocada a hipótese de que, uma vez estando nas células B50, o híbrido Ad-VAA de replicação competente encontra dois possíveis destinos: ou ser replicado ou ser cortado pelas proteínas Rep para a libertação de AAV, replicação e empacotamento. Uma infecção produtiva para rAAV usando este sistema será um equilíbrio delicado em ambas as direcções. Demonstrou-se previamente que, para produção de grandes rendimentos de AAV pelo híbrido B50/Ad auxiliar/El-híbrido Ad-AAV removido, há uma relação temporal crítica entre a expressão do gene Rep/cap induzida pelas proteínas Ad5 El, amplificação transiente dos híbridos Ad-AAV chegados, resolução dos genomas rAAV da estrutura do híbrido e replicação posterior dos genomas AAV. Embora a temperatura permissiva para o mutante sub lOOr seja 32 °C, é sabido que essa sensibilidade à temperatura é algo possível a 37 °C mas bastante específica a 39,5 °C. Esperou-se que, a 37 °C, a replicação de sub lOOrAAVCMVGFP fosse desacelerada mas a expressão de Rep/cap, a libertação de AAV, a replicação e o empacotamento seriam óptimos. Os dados demonstram que o sistema era de facto mais produtivo a 37 °C em comparação com 32 °C. Mas a produtividade de AAV a 39,5 °C foi grandemente diminuída. Neste caso, não houve provavelmente nenhuma replicação do híbrido. Adicionalmente, a maquinaria celular total estava sob alto stresse de temperatura, o que resultou em deficiente expressão de rep/cap, libertação de AAV, replicação e empacotamento. 46

1. Definindo a multiplicidade óptima de infecçao para sublOOrAAVCMVGFP

Baseado nos resultados do Exemplo 2B, a infecçao de células B50 a baixas MOI parece ser benéfica para a produção de AAV. De

acordo com os dados da experiência inicial, parece que, a temperaturas produtivas, 32 e 37 °C, a produção de rAAV desce dramaticamente em relação com a subida da MOI de sub lOOrAA VCMVGFP. Existe uma diferença dramática na produtividade de AAV entre 100 pts/célula e 1000 pts/célula, sugerindo que a MOI óptima para máxima produtividade está naquele intervalo. Para definir a óptima MOI, a segunda experiência desenvolvida foi examinar o efeito de MOI entre 20 e 1000 partículas (pt)/célula ambos 32 e 37 °C (Tabela 2) . De acordo, as células B50 foram cultivadas em placas de 12 poços como descrito acima e infectadas com 20, 40, 100, 200, 400, e 1000 partículas de sub lOOrAA VGFP. As amostras de lisados celulares brutos foram preparados e experimentados para cálculo da produtividade de rAAVCMVGFP por célula da mesma forma como acima. 47

Tabela 2. Optimização de MOI

Esquema Experimental Produção de rAAVCMVGFP (GFFU/célula) 72 h 96 h 120 h 144 h sub lOOrAAVCMVGFP apenas a 32 °c 20 pts/célula 0 0,4 22, 1 26,0 40 pts/célula 0 0,4 17,2 30, 7 100 pts/célula 0,1 2,3 40, 7 86, 7 200 pts/célula 0,1 7,8 26, 5 80, 6 400 pts/célula 0 9, 9 21, 4 22, 7 1000 pts/célula 0,2 id 4,6 8,2 sub lOOrAAVCMVGFP apenas a 37 °c 20 pts/célula 0, 6 2,9 2,5 5, 0 40 pts/célula 0,7 8,8 14,5 16,4 100 pts/célula 4,2 20, 6 27, 7 34, 7 200 pts/célula 10, 1 39, 5 62, 0 11,3 400 pts/célula 6,7 21, 0 27,1 36,3 1000 pts/célula 2,1 9,0 4,2 12, 8 Ad5Wt + sub lOOrAAVCMVGFP Num intervalo de 24 horas, a 37 °C (controlo positivo) 100 pts/célula 46, 3 100,8 119,7 134,4

Os resultados revelaram que tanto 100 como 200 pts/células eram óptimos para a infecção a 32 °C. Mas a situação a 37 °C foi bastante diferente em que a MOI óptima foi limitada de forma restrita a 200 pts/célula. Um aumento ou diminuição de duas vezes da MOI resultou numa redução de 60% na produtividade de AAV. O impacto observado da MOI na produção de AAV observado aqui, e no estudo anterior, demonstrou a importância de atingir um delicado equilíbrio entre a replicação do híbrido e o empacotamento de rAAV em utilização no sistema B50/híbrido para a produção de AAV. É bem sabido que o processo de replicação 48 adenoviral é altamente dependente da MOI, particularmente sob condições permissivas e semi-permissivas. É plausível que com MOIS elevadas, a replicação de vírus híbridos se torne dominante mas a libertação de rAAV, replicação e empacotamento diminui significativamente. Por outro lado, uma amplificação limitada do vírus híbrido é desejável para aumentar o número de genomas de rAAV para libertação e empacotamento. Isto é claramente demonstrado nos resultados apresentados na Tabela 2. Desde que 32 °C é permissivo para sub lOOrAAVCMVGFP, não há diferenças óbvias na produção de AAV entre 100 e 200 pts/célula. Só quando MOI excede 400 ps/célula, a produção de AAV desce dramaticamente. No entanto, quando as infecções acontecem a uma temperatura semi-permissiva de 37 °C, a MOI óptima foi restrita a 200 pts/célula apenas. Aqui, uma replicação do vírus híbrido limitada e dependente da MOI torna-se crítica para um empacotamento máximo de AAV.

2. Definindo a temperatura óptima para a infecção única com sublOOrAAVGFP A partir da experiência inicial, foi determinado que existia muito pouca produção de AAV a 39,5 °C mas a produtividade de AAV a 32 °C e a 37 °C foi comparável. De modo a investigar o potencial impacto de temperaturas de infecção na produtividade de AAV, a experiência de MOI descrita acima foi realizada em duplicado a 32 e 37 °C.

Os dados apresentados na Tabela 1 e 2 também indicam que, a MOIs óptimas, a produção de AAV foi melhor a 37 °C do que a 32 °C. Isto pode também ser explicado pela necessidade de equilíbrio entre a replicação limitada do vírus híbrido e a 49 libertação de AAV, replicação e empacotamento. Aparentemente, a temperatura semi-permissiva de 37 °C, o equilíbrio de dois eventos diferentes conjuga-se em favor do empacotamento de AAV, conduzindo a maior produtividade. 3. Alteração de temperatura de 37 para 32 °C durante o processo de infecção

As células B50 em placas de 12 poços foram infectadas por sublOOrAAVCMVGFP a 100 partículas por célula e 37 °C durante 36 e 60 horas. Depois as placas foram movidas para outra incubadora a 32 °C. O lisado celular bruto foi preparado durante 72, 96, 120, 144 e 168 horas após infecção para titulação da produtividade de AAV em células 84-31. A lógica por detrás desta concepção experimental foi que o vírus sublOOrAAVCMVGFP deverá ter replicação limitada a 37 °C mas a activação do promotor P5 para a proteína Rep/cap deve ser óptima. Uma incubação de 24 horas a 37 °C permitiria a expressão de Rep/cap iniciada com limitado nível de replicação do vírus híbrido e deste modo obter células B50 condicionadas para a libertação de AAV, replicação e empacotamento. Uma vez mudada a infecção para 32 °C, a replicação do vírus híbrido deverá também abrandar de algum modo por efeitos inibitórios das proteínas Rep acumuladas nas células. Os resultados das experiências de alteração de temperatura (Tabela 3) não atingiram a expectativa provavelmente devido ao fracasso em atingir um equilíbrio óptimo entre a replicação do híbrido e a libertação de AAV e replicação. Mas os dados indicaram que uma alteração precoce na temperatura originou uma melhor produção do que o que acontece 50 numa alteração tardia, sugerindo que o tempo da alteração tem um papel decisivo na produção de AAV.

Tabela 3 Alteração de temperaturas e produtividade do rAAV

Desenho experimental Produção de rAAVCMVGFP (GFFU/célula) 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h Sub lOOrGFP, 100 pts/célula (37 °C durante 36 h e depois alterando para 32 °C) 0,36 0,4 6,3 15, 1 50,4 Sub lOOrGFP, 100 pts/célula (37 °C durante 60 h e depois alterando para 32 °C) 1,76 4,4 15, 1 15, 5 16, 6 Ad5TS + SublOOrAAVCMVGFP (100 pts/célula, 24 h de intervalo, 37 °C, controlo positivo) 46, 3 100, 8 119, 7 134,4 88,2 4. Adição de um segundo lote de sub lOOrAAVCMVGFP a células B50 24 horas após a infecção inicial

As células B50 em placas de 12 poços foram infectadas com sublOOrAAVCMVGFP a 100 partículas por célula e 37 °C por 24 horas. Um segundo lote de sublOOrAAVCMVGFP a 100 partículas por célula foi adicionado a 37 °C e outro conjunto foi movido para 32 °C. A produção de AAV em cada condição foi examinada às 72, 96, 120, 144 e 168 horas após a infecção inicial.

No sistema clássico B50/Ad5 auxiliar/híbrido Ad-AAV removido de El, foi essencial ter um intervalo de 24 horas entre a primeira infecção virai Ad auxiliar e a segunda infecção com o híbrido Ad-AAV. Esta relação temporal delicada das duas infecções permite a criação de condições óptimas celulares, como 51 um nível apropriado de proteínas Rep para regular a taxa apropriada de replicação do vírus híbrido e a libertação de AAV, para elevada produção de AAV. Nesse caso, a diferença entre o vírus Ad auxiliar e as infecções híbridas removidas de EI é a presença e ausência de proteínas EI. No entanto, quando o híbrido Ad-AAV competente em replicação é utilizado para produção de AAV nas células B50, não há diferenças entre o vírus Ad auxiliar e o híbrido em termos da sua capacidade para proporcionar todas as funções auxiliares necessárias. Se as células foram infectadas com dois lotes do híbrido com 24 horas de intervalo, o primeiro lote deverá servir como auxiliar tal como a infecção com Ad Wt e o segundo lote será apenas como o híbrido sem EI para distribuir os genomas de rAAV para amplificação, libertação e empacotamento. Pode-se esperar que a produtividade do método 850/ híbrido Ad-VAA de replicação competente seja tão elevada como a do sistema clássico B50/híbrido. Os dados gerados da experiência apoiaram de facto a teoria (Tabela 4) . O facto de apenas um só tipo de adenovírus ter sido utilizado neste novo método de produção, simplifica de alguma forma o processo de purificação e facilita a ampliação do processo. Mais ainda, pode-se introduzir um maior número de mutações mais graves como a deleção E4 na estrutura do híbrido e correspondentes genes Ad nas células B50 estabilizadas. Deste modo, foi desactivado o próprio vírus híbrido de modo a que mesmo que as preps de AAV fossem contaminadas com alguns vírus híbridos defeituosos, os efeitos secundários desses vírus híbridos defeituosos serão minimizados. 52

Tabela 4

Desenho experimental Produção de rAAVCMVGFP (GFFU/célula) 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h sublOOrAAVCMVGFP + sublOOrAAVCMVGFP (em intervalo de 24 h, 100 pts/célula em cada infecção, 37 °C) 0, 76 8, 7 109,2 135,5 88,2 SublOOrAAVCMVGFP + sublOOrAAVCMVGFP (em intervalo de 24 h, 100 pts/célula em cada infecção, 37 °C durante 24 h, alternando para 32 °C após a 2a infecção) 9, 0 45,2 44, 1 54, 6 34, 7 Ad5TS f sublOOrAAVCMVGFP (100 pts/célula, 24 h de intervalo, 37 °C, controlo positivo) 46,3 100, 8 119,7 134,4 88,2

Lisboa, 7 de Março de 2007 53

Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Vírus híbrido adenovírus/AAV de replicação competente compreendendo: (a) elementos adenovirais em 5' cis necessários à replicação e empacotamento; (b) remoção de sequências adenovirais na região Ela e Elb do adenovírus nativo; (c) vector recombinante virai adeno-associado (rAAV); (d) remoção das sequências adenovirais da região E3; (e) sequências de ácidos nucleicos codificando adenovírus Ela e adenovírus Elb sob o controlo de sequências reguladoras controlando a expressão dos produtos génicos Ela e Elb, em que as sequências de ácidos nucleicos de Ela e Elb estão localizadas no local da região E3, e (f) elementos adenovirais em 3' cis necessários para replicação e empacotamento.
2. 2. Vírus híbrido adenovírus/AAV de acordo com a reivindicação 1, o aqui referido vírus híbrido adenovírus/AAV inclui ainda sequências de ácidos nucleicos codificantes do produto génico adenoviral E2a sob o controlo de sequências reguladoras que controlam a expressão numa célula hospedeira. 1
3. 3. Vírus híbrido adenovírus/AAV de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o vírus híbrido adenovírus/AAV inclui ainda sequências de ácidos nucleicos codificantes do produto génico adenoviral E4 ou um fragmento funcional e deste sob o controlo de sequências reguladoras que controlam a expressão deste numa célula hospedeira.
4. 4. Vírus híbrido adenovírus/AAV de acordo com a reivindicação 3, em que o referido fragmento funcional do produto génico E4 é E4 0RF6.
5. 5. Vírus híbrido adenovírus/AAV de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, compreendendo ainda as sequências adenovirais codificantes do ARN VAT.
6. 6. Vírus híbrido adenovírus/AAV de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o referido rAAV compreende as sequências seleccionadas do AAV tipo 1 ou AAV tipo 5.
7. 7. Vírus híbrido adenovírus/AAV de acordo com qualquer das reivindicação 1 a 6, em que o referido vector rAAV está localizado nas regiões adenovirais Ela e Elb do tipo selvagem.
8. 8. Vírus híbrido adenovírus/AAV de acordo com qualquer das reivindicação 1 a 7, em que o vector AAV compreende as terminações terminais invertidas (IRTs) AAV 5' e 3' e um transgene sob o controlo de sequências reguladoras controlando a sua expressão.
9. 9. Vírus híbrido adenovírus/AAV de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, em que as sequências reguladoras de 2 (e) compreendem um primeiro promotor que controla a expressão do produto génico Ela.
10. 10. Virus hibrido adenovirus/AAV de acordo com a reivindicação 9, em que o primeiro promotor é seleccionado do grupo consistindo de um promotor nativo de Ela, um promotor indutivel, um promotor especifico de tecido, e um promotor constitutivo.
11. 11. Virus hibrido adenovirus/AAV de acordo com a reivindicação 9 ou reivindicação 10, em que as sequências reguladoras compreendem um segundo promotor que controla a expressão do produto génico adenoviral Elb.
12. 12. Virus hibrido adenovirus/AAV de acordo com a reivindicação 11, em que o segundo promotor é idêntico ao primeiro promotor.
13. 13. Virus hibrido adenovirus/AAV de acordo com a reivindicação 11, em que o segundo promotor e o primeiro promotor são diferentes.
14. 14. Virus hibrido adenovirus/AAV de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, em que o referido vírus compreende ainda a mutação sensível à temperatura no gene adenoviral E2b.
15. 15. Célula hospedeira de mamífero contendo um vírus híbrido adenovirus/AAV de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14. 3
16. 16. Método para produzir vírus recombinante adeno-associado (rAAV), compreendendo o passo de: Cultivar uma célula hospedeira contendo: (a) uma sequência rep de AAV e uma sequência cap de AAV sob o controlo de sequências reguladoras controlando a sua expressão; e (b) um vírus híbrido adenovírus/AAV compreendendo: elementos adenovirais em 5' cis necessários para replicação e empacotamento; deleção de sequências adenovirais na região nativa E 1 e E lb; um vector de vírus adeno-associados recombinante (rAAV); uma deleção de uma sequência adenoviral da região E3; sequências de ácidos nucleicos que codificam adenovírus Ela e adenovírus Elb sob o controlo de sequências reguladoras da expressão dos produtos génicos Ela e Elb, onde as referidas sequências de ácidos nucleicos de Ela e Elb estão localizadas no local da região E3; e elementos adenovirais em 3' cis necessários para a replicação e empacotamento; 4 a referida célula hospedeira, sendo cultivada sob condições que inibem a replicação do vírus híbrido, resultando num aumento da produção de rAAV.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, compreendendo ainda o passo de isolamento de rAAV a partir da referida célula hospedeira ou cultura de célula hospedeira.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 17, em que a célula hospedeira é transformada de forma estável com a sequência rep de AAV.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 17, em que a célula hospedeira é transformada de forma estável com a sequência cap de AAV.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 17, em que a sequência rep é expressa transientemente na célula hospedeira.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 17, em que a sequência cap é expressa transientemente na célula hospedeira.
22. 22. Método de acordo com qualquer das reivindicações 16 a 21, compreendendo ainda o passo de, antes da cultura, infectar a célula hospedeira com o vírus híbrido adenovírus/AAV a uma multiplicidade de infecção de cerca de 0,5 até cerca de 1000. 5
23. 23. Método de acordo com qualquer um das reivindicações 16 a 22, em que o vírus híbrido adenovírus/AAV é cultivado a uma temperatura de cerca de 32 °C até cerca de 37 °C. Lisboa 7 de Março de 2007 6